TW201945534A - 用於生物製造之多變量光譜分析及監測 - Google Patents
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Abstract
本公開文本的特徵在於以下方法，該方法包括：獲得生物製造系 統中的溶液的振動光譜，使用第一化學計量模型分析該振動光譜以確定與該溶液相關的第一質量屬性值，使用第二化學計量模型分析該振動光譜以確定與該溶液相關的第二質量屬性值，並且基於該第一質量屬性值和該第二質量屬性值中的至少一個來調節該生物製造系統的純化單元的至少一個參數。
Description
本申請案主張下列美國臨時申請的優先權，將其每個的全部內容通過引用併入本文：2018年3月2日提申的62/637,891；2018年5月18日提申的62/673,845；和2018年9月10日提申的62/729,402。
本公開文本涉及用於整合式連續生物製造系統的系統和方法。
含有編碼重組蛋白的核酸的哺乳動物細胞通常用於生產在治療上或商業上重要的蛋白質。整合式連續生物製造是降低與基於此類蛋白質的療法相關的成本的重要方面。監測系統用於生物製造，以評估各種生物產品和過程條件。
治療性蛋白質物質和其他生物分子的整合式連續生物製造為將來生產拯救生命的藥物和促進依賴於此類生物分子的可用性的療法的廣泛採用提供了巨大的希望。具有各種配置的雙柱和多柱層析系統可用於工業規模的生物製造。在此類系統中，各種溶離劑流的過程監測可用於調節過程相關參數和控制產品屬性，例如，從某些柱中選擇性收集溶離劑流和調節溶液緩衝特性(例如pH)。
本公開文本的特徵在於使用與層析系統和/或生物反應器整合式在線的並與電子控制器(分析由感測器測得的信息)耦合的實時或近實時感測器 確定溶液特性的方法和系統，該溶液特性是例如溶質濃度、感興趣的分析物的電荷分佈、工藝與產品雜質、分子完整性、聚集狀態以及pH。能夠連續監測溶液的紅外光譜，並且使用化學計量模型同時地準確表徵溶液中的各種分析物的定量性化學、物理和/或生物學特性。能夠從流動的溶液中在線獲得光譜，從而在很少或不中斷製造過程的情況下進行量測。此外，化學計量模型可以實時或近實時地提取定量性分析物信息，允許快速反饋和控制生物製造過程相關的參數和操作。
在第一方面，本公開文本的特徵在於以下方法，該方法包括：獲得生物製造系統中的溶液的振動光譜，使用第一化學計量模型分析該振動光譜以確定與該溶液相關的第一質量屬性值，使用第二化學計量模型分析該振動光譜以確定與該溶液相關的第二質量屬性值，並且基於該第一質量屬性值和該第二質量屬性值中的至少一個來調節該生物製造系統的純化單元的至少一個參數。
該方法的實施例可包括以下特徵中的任何一個或多個。
該方法可包括使用生物製造系統來生產基於蛋白質的治療物質、基於核酸的藥品和基因療法藥品中的至少一種。基於蛋白質的治療物質可包含蛋白質、肽、抗體和酶中的至少一種。基於核酸的藥品可包含DNA、質體、寡核苷酸、適配體、DNA酶、RNA適配體、RNA誘餌、微小RNA片段和小干擾RNA片段中的至少一種。
對於由該生物製造系統生產的生物產品，該第一質量屬性和該第二質量屬性可各自獨立地選自產品質量屬性、產品相關雜質和過程(process)相關雜質。
獲得該振動光譜可包括引導輻射入射到該溶液上並量測來自該溶液的衰減全反射輻射。輻射可以通過使溶液通過輻射窗口而入射到溶液上，並且衰減全反射輻射可以在被量測之前通過輻射窗口。該方法可包括當該溶液相對於該輻射窗口流動時量測來自該溶液的衰減全反射輻射。
輻射窗口可形成流動池的一部分。入射的輻射可包括紅外輻射。
第一化學計量模型可包括與第一質量屬性相關的第一組主要振動組分。第一化學計量模型可包括至少三個主要振動組分(例如，至少五個主要振 動組分)。使用該第一化學計量模型分析該振動光譜可包括基於該第一組主要振動組分計算該第一質量屬性值。計算第一質量屬性值可包括將該值確定為第一組主要振動組分的線性函數。
第二化學計量模型可包括與第一質量屬性相關的第二組主要振動組分。第二化學計量模型可包括至少三個主要振動組分(例如，至少五個主要振動組分)。該第一組主要振動組分和該第二組主要振動組分可以沒有共同的成員。使用該第二化學計量模型分析該振動光譜可包括基於該第二組主要振動組分計算該第二質量屬性值。計算第二質量屬性值可包括將該值確定為第二組主要振動組分的線性函數。
該溶液可包括從該生物製造系統的純化單元排出的溶液。該方法可包括純化該純化單元中的該溶液，然後獲得該溶液的該振動光譜。該純化單元可包括層析管柱。
該方法可包括當該溶液在該生物製造系統的第一純化單元與第二純化單元之間流動時，通過量測來自該溶液的輻射來獲得該振動光譜。該第一純化單元和該第二純化單元可各自包括層析管柱。
該方法可包括在該溶液流出該生物製造系統的最終純化單元之後通過量測來自該溶液的輻射來獲得該振動光譜。
該溶液可以是第一溶液，並且該方法可包括：獲得生物製造系統中的第二溶液的振動光譜，使用第一化學計量模型分析第二溶液的振動光譜以確定第二溶液的第一質量屬性值，並且使用第二化學計量模型分析第二溶液的振動光譜以確定第二溶液的第二質量屬性值。該第一溶液可以在該生物製造系統的第一純化單元與第二純化單元之間流動，並且該第二溶液可以在該生物製造系統的該第二純化單元與第三純化單元之間流動。該方法可包括基於該第一溶液的第一質量屬性值和第二質量屬性值與該第二溶液的第一質量屬性值和第二質量屬性值中的至少一個來調節該至少一個參數。
該方法可包括從輻射入射到溶液上的時間開始，在30秒或更短的時間段內獲得振動光譜並確定第一質量屬性值和第二質量屬性值。該時間段可以是10秒或更短(例如，2秒或更短)。
該方法可包括重複以下多個步驟：獲得振動光譜，使用第一化學計量模型分析振動光譜，並且使用第二化學計量模型分析振動光譜，以確定與該溶液的連續部分相關的第一質量屬性值和第二質量屬性值的時間序列。該方法可包括基於第一質量屬性值的時間序列和第二質量屬性值的時間序列中的至少一個來調節至少一個參數。
該方法可包括獲得該溶液的一組(一個或多個)校準光譜代表，並且分析該組校準光譜以確定第一組主要振動組分和第二組主要振動組分。第一化學計量模型可包括與第一組主要振動組分相關的第一組係數，並且第二化學計量模型可包括與第二組主要振動組分相關的第二組係數，並且該方法可包括基於回歸分析確定第一組係數和第二組係數。
該方法可包括使用第三化學計量模型分析該振動光譜以確定與該溶液相關的第三質量屬性值。第三化學計量模型可包括與第三質量屬性相關的第三組主要振動組分。第三化學計量模型可包括至少三個主要振動組分(例如，至少五個主要振動組分)。使用該第三化學計量模型分析該振動光譜可包括基於該第三組主要振動組分計算該第三質量屬性值。計算第三質量屬性值可包括將該值確定為第三組主要振動組分的線性函數。該方法可包括基於第一、第二和第三質量屬性值中的至少一個來調節至少一個參數。
該方法可包括使用第四化學計量模型分析該振動光譜以確定與該溶液相關的第四質量屬性值。第四化學計量模型可包括與第四質量屬性相關的第四組主要振動組分。第四化學計量模型可包括至少三個主要振動組分(例如，至少五個主要振動組分)。使用第四化學計量模型分析振動光譜可包括基於第四組主要振動組分計算第四質量屬性值。計算第四質量屬性值可包括將該值確定為第四組主要振動組分的線性函數。該方法可包括基於第一、第二、第三和第四質量屬性值中的至少一個來調節至少一個參數。
第一質量屬性和第二質量屬性中的至少一個可選自濃度、聚集體、電荷變體分佈、純度、聚糖譜、同一性和完整性。第一質量屬性和第二質量屬性中的至少一個可選自蛋白質片段、核酸片段、核酸變體、空殼體和載體雜質。第一質量屬性和第二質量屬性中的至少一個可選自宿主細胞蛋白、 殘留宿主DNA、殘留管柱配體、雜質濃度、雜質量、殘留輔助病毒、殘留輔助病毒蛋白和殘留輔助病毒DNA。
除非另外明確說明，否則該方法的實施例還可包括本文公開的任何其他特徵，包括結合不同實施例單獨公開的特徵的組合。
另一方面，本公開文本的特徵在於生物製造系統，該生物製造系統包括：生物反應器，其被配置為生產包含生物產品的溶液；純化單元，其被配置為接收該溶液；輻射源，其被配置為引導輻射入射到溶液上；檢測裝置，其被配置為量測來自該溶液的輻射；以及系統控制器，其連接至該生物反應器和該檢測裝置，並被配置為：接收來自該檢測裝置的量測信號，該量測信號對應於有關該溶液的振動光譜的信息；使用第一化學計量模型分析該信息以確定與該溶液相關的第一質量屬性值；使用第二化學計量模型分析該信息以確定與該溶液相關的第二質量屬性值；並且基於該第一質量屬性值和該第二質量屬性值中的至少一個來調節該純化單元的至少一個參數。
該系統的實施例可包括以下特徵中的任何一個或多個。
該系統可包括流動池，該流動池被定位為使該溶液通過該流動池，並且當該溶液處於該流動池中時該輻射源引導該輻射入射到該溶液上。
該生物產品可包括基於蛋白質的治療物質、基於核酸的藥品和基因療法藥品中的至少一種。基於蛋白質的治療物質可包含蛋白質、肽、抗體和酶中的至少一種。基於核酸的藥品可包含DNA、質體、寡核苷酸、適配體、DNA酶、RNA適配體、RNA誘餌、微小RNA片段和小干擾RNA片段中的至少一種。
對於由該生物製造系統生產的生物產品，該第一質量屬性和該第二質量屬性可各自獨立地選自產品質量屬性、產品相關雜質和過程相關雜質。
該檢測器可包括全內反射感測器，該全內反射感測器被配置為量測來自該溶液的衰減全反射輻射。該全內反射感測器可與該流動池的一部分整合式。該控制器和檢測裝置可被配置為當溶液在流動池內流動時量測來自溶液的衰減全反射輻射。入射的輻射可包括紅外輻射。
第一化學計量模型可包括與第一質量屬性相關的第一組主要振動組分。第一化學計量模型可包括至少三個主要振動組分(例如，至少五個主要振動組分)。
該控制器可被配置為使用該第一化學計量模型、通過基於該第一組主要振動組分計算該第一質量屬性值來分析該振動光譜。該控制器可被配置為將該第一質量屬性值計算為該第一組主要振動組分的線性函數。
第二化學計量模型可包括與第一質量屬性相關的第二組主要振動組分。第二化學計量模型可包括至少三個主要振動組分(例如，至少五個主要振動組分)。該第一組主要振動組分和該第二組主要振動組分可以沒有共同的成員。該控制器可被配置為使用該第二化學計量模型、通過基於該第二組主要振動組分計算該第二質量屬性值來分析該振動光譜。該控制器可被配置為將該第二質量屬性值計算為該第二組主要振動組分的線性函數。
該溶液可包括從該純化單元排出的溶液。該控制器可連接至該純化單元並被配置為純化該純化單元中的溶液然後獲得有關該溶液的振動光譜信息。
該純化單元可包括層析管柱。該純化單元可以是系統的第一純化單元，並且該系統可包括被配置為接收該溶液的第二純化單元，其中該檢測裝置被定位為當該溶液在該第一純化單元與該第二純化單元之間流動時量測來自該溶液的輻射。該第一純化單元和該第二純化單元可各自包括層析管柱。
該純化單元可以是該系統的最終純化單元。
該溶液可以是第一溶液，並且該檢測裝置可被配置為量測來自第二溶液的輻射，並且該控制器可被配置為：接收來自該檢測裝置的量測信號，該量測信號對應於有關該第二溶液的振動光譜的信息；使用該第一化學計量模型分析有關該第二溶液的信息以確定該第二溶液的第一質量屬性值；並且使用該第二化學計量模型分析有關該第二溶液的信息以確定該第二溶液的第二質量屬性值。
該純化單元可以是第一純化單元並且該系統可包括第二純化單元和第三純化單元，其中第一溶液可以在第一純化單元與第二純化單元之間流動， 並且第二溶液可以在第二純化單元與第三純化單元之間流動。該控制器可被配置為基於該第一溶液的第一質量屬性值和第二質量屬性值與該第二溶液的第一質量屬性值和第二質量屬性值中的至少一個來調節該至少一個參數。
該檢測裝置和該控制器可被配置為從輻射入射到溶液的時間開始，在30秒或更短的時間段內，量測來自溶液的輻射並確定第一質量屬性值和第二質量屬性值。該時間段可以是10秒或更短(例如，2秒或更短)。
該檢測裝置和該控制器可被配置為重複以下多個步驟：量測來自溶液的輻射，使用第一化學計量模型分析有關溶液的振動光譜的信息，並且使用第二化學計量模型分析振動光譜，以確定與該溶液的連續部分相關的第一質量屬性值和第二質量屬性值的時間序列。該控制器可被配置為基於第一質量屬性值的時間序列和第二質量屬性值的時間序列中的至少一個來調節至少一個參數。
該控制器可被配置為獲得該溶液的一組(一個或多個)校準光譜代表，並且分析該組校準光譜以確定第一組主要振動組分和第二組主要振動組分。第一化學計量模型可包括與第一組主要振動組分相關的第一組係數，並且第二化學計量模型可包括與第二組主要振動組分相關的第二組係數，並且該控制器可被配置為通過進行回歸分析確定第一組係數和第二組係數。
該控制器可被配置為使用第三化學計量模型分析有關溶液的振動光譜的信息以確定與該溶液相關的第三質量屬性值。第三化學計量模型可包括與第三質量屬性相關的第三組主要振動組分。第三化學計量模型可包括至少三個主要振動組分(例如，至少五個主要振動組分)。該控制器可被配置為使用第三化學計量模型、通過基於第三組主要振動組分計算第三質量屬性值來分析有關振動光譜的信息。該控制器可被配置為通過將第三質量屬性值確定為第三組主要振動組分的線性函數來計算該第三質量屬性值。該控制器可被配置為基於第一、第二和第三質量屬性值中的至少一個來調節至少一個參數。
該控制器可被配置為使用第四化學計量模型分析有關振動光譜的信息以確定與該溶液相關的第四質量屬性值。第四化學計量模型可包括與第四 質量屬性相關的第四組主要振動組分。第四化學計量模型可包括至少三個主要振動組分(例如，至少五個主要振動組分)。該控制器可被配置為使用第四化學計量模型、通過基於第四組主要振動組分計算第四質量屬性值來分析有關振動光譜的信息。該控制器可被配置為通過將第四質量屬性值確定為第四組主要振動組分的線性函數來計算該第四質量屬性值。該控制器可被配置為基於第一、第二、第三和第四質量屬性值中的至少一個來調節至少一個參數。
第一質量屬性和第二質量屬性中的至少一個可選自濃度、聚集體、電荷變體分佈、純度、聚糖譜、同一性和完整性。第一質量屬性和第二質量屬性中的至少一個可選自蛋白質片段、核酸片段、核酸變體、空殼體和載體雜質。第一質量屬性和第二質量屬性中的至少一個可選自宿主細胞蛋白、殘留宿主DNA、殘留管柱配體、雜質濃度、雜質量、殘留輔助病毒、殘留輔助病毒蛋白和殘留輔助病毒DNA。
除非另外明確說明，否則該系統的實施例還可包括本文公開的任何其他特徵，包括結合不同實施例單獨公開的特徵的組合。
如本文所用，“實時”是指以相對小的延遲或重現週期發生的量測或過程。例如，“實時”量測是這樣的量測，其中開始量測光譜信息與從該信息計算參數值或其他量的時間之間的總經過時間間隔是1分鐘或更短。週期性實時量測是循環/週期性量測，其連續量測之間的時間間隔為1分鐘或更短。
如本文所用，“近實時”量測是這樣的量測，其中開始量測光譜信息與從該信息計算參數值或其他量的時間之間的總經過時間間隔是在1分鐘與5分鐘之間。週期性近實時量測是循環/週期性量測，其連續量測之間的時間間隔在1分鐘與5分鐘之間。
如本文所用，術語“質量(quality)屬性”是指一種參數值，其被用於評估生物製造系統的操作條件、在這種系統中實施的過程的完整性、和/或源自這種過程的產品。質量屬性可以是產品質量屬性，其與生物製造系統所生產產品的純度、完整性、產量及其他特徵有關；它們可以是產品相關的雜質參數，其提供有關在該系統中所生產的產品的信息；並且它們可以是 過程相關的純度參數，其提供有關在該系統中實施的生物製造過程的保真度的信息。
除非另外定義，否則在此所使用的所有技術和科學術語具有與本公開內容所屬領域的普通技術人員通常所理解相同的含義。儘管與本文所述的方法和材料類似或等同的那些方法和材料可以用於本文主題的實踐或測試，但下面描述了合適的方法和材料。本文提及的所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻都通過引用以其整體而併入。如果發生衝突，以包括定義在內的本說明書為主。另外，材料、方法以及實例僅僅是說明性的並不意在是限制性的。
在下面的附圖和說明書中闡述了一個或多個實施例的細節。從說明書、附圖和申請專利範圍中，其他特徵和優勢將變得清楚。
1、100‧‧‧生物製造系統
2、8‧‧‧四管柱週期逆流層析系統
3、4、5、6、9、10、11‧‧‧管柱
7‧‧‧入口
12‧‧‧層析膜
13、16、22、26、102、104‧‧‧流體導管
14、17‧‧‧在線緩衝液調節儲器
15‧‧‧出口
18、23‧‧‧過濾器
19、24‧‧‧斷流槽
20‧‧‧泵系統
21‧‧‧泵
25‧‧‧生物反應器
27‧‧‧過濾系統
106、506‧‧‧流動池
108、208‧‧‧稜鏡
110‧‧‧第一光纖
112‧‧‧輻射源
114‧‧‧第二光纖
116‧‧‧檢測器
120‧‧‧控制器
122‧‧‧流體
124‧‧‧第一表面
126、128、324、328、360‧‧‧表面
130、330、602‧‧‧入射輻射
132、332、336、606‧‧‧反射輻射
200‧‧‧光纖
210‧‧‧第一輻射傳輸芯
214‧‧‧第二輻射傳輸芯
252‧‧‧不透明包層材料
308‧‧‧梯形
362‧‧‧塗層
402、404‧‧‧閥
604‧‧‧折射光線
700‧‧‧量測系統
602、702‧‧‧傳輸輻射
900‧‧‧流程圖
802、804、806、808、810、812‧‧‧步驟
906、908、910、912‧‧‧步驟
圖1是顯示一種系統的實例的示意圖，該系統用於量測生物製造系統中過程溶液的紅外光譜信息。
圖2是顯示光纖的實例的截面示意圖。
圖3是顯示稜鏡的實例的示意圖，該稜鏡形成衰減全反射界面。
圖4是顯示定位於兩個流體導管之間的流動池的實例的示意圖。
圖5是顯示定位於兩個流體導管之間的流動池的另一個實例的示意圖。
圖6是顯示在稜鏡表面折射的入射輻射光線的示意圖。
圖7是顯示量測生物製造系統中的流體的紅外光譜信息的量測系統的實例示意圖。
圖8是顯示示例步驟的流程圖，可進行這些步驟以分析過程流體的振動光譜信息。
圖9是顯示示例步驟的流程圖，可進行這些步驟以基於針對過程流體量測的振動光譜信息來構建和驗證針對處理流體屬性的化學計量模型。
圖10是顯示生物製造系統的實例的示意圖。
圖11是顯示在週期性逆流層析系統中的三柱轉換技術的實例的示意圖。
圖12是顯示蛋白A(Protein A)純化抗體樣品的傅裡葉變換紅外(FTIR)光譜的圖。
圖13是顯示從針對抗體濃度的偏最小二乘(PLS)模型計算的預測抗體濃度值以及相應的所量測的抗體濃度值的圖。
圖14A是顯示蛋白A(Protein A)純化樣品的傅裡葉自去卷積FTIR紅外光譜的實例的圖。
圖14B是顯示針對樣品的聚集值開發的PLS校準模型以及量測的樣品聚集值的圖。
圖15A是顯示一組光譜的圖，該組光譜用於構建針對樣品的宿主細胞蛋白(HCP)含量的PLS模型。
圖15B是顯示針對從圖15A中的光譜確定的樣品HCP含量的PLS模型以及量測的樣品HCP值的圖。
圖16A-16C是顯示針對樣品的電荷變體分佈值的三種不同PLS模型的圖。
圖17是顯示使用針對抗體濃度的偏最小二乘法模型預測的六個樣品的抗體濃度值的表。
圖18A-18D是顯示灌注生物反應器的活細胞密度、細胞活力、收穫效價和比生產率的量測值的圖。
圖19A-19D是顯示對於生產單株抗體產品的生物反應器在不同細胞密度、pH和灌注條件下的葡萄糖濃度、麩醯胺酸濃度、乳酸濃度和銨離子濃度的量測值的圖。
圖20A-20D是顯示生物反應器培養基的葡萄糖濃度、收穫效價、乳酸濃度和銨離子濃度的每日量測值的圖。
圖21A-21F是顯示從紅外光譜信息確定的生物反應器培養基的葡萄糖濃度、麩醯胺酸濃度、IgG濃度、乳酸濃度、銨離子濃度和摩爾滲透壓濃度的量測值的圖。
圖22A-22D是顯示從紅外光譜信息確定的生物反應器培養基的葡萄糖濃度、收穫效價、乳酸濃度和銨離子濃度的多個值的圖。
圖23A-23C是顯示從紅外光譜信息確定的生物反應器培養基在後期的葡萄糖濃度、乳酸濃度和銨離子濃度的多個值的圖。
圖中相同的符號表示相同的元件。
工業規模的生物製造可以在雙管柱和多管柱層析系統中以各種配置進行。在這些複雜系統中，產品產量、質量和廢品率是大量與過程相關的參數和步驟的函數。在製造治療性蛋白質和其他具有商業價值的生物分子期間，產品結果可受這些參數和步驟的強烈影響。因此，適當控制此類參數和步驟是大規模製造的重要方面。例如，在PCT專利申請公開號WO 2014/137903中公開了生物製造系統的特徵和方面，將該申請的全部內容通過引用併入本文。
通過對中間溶液流的過程內在線監測，特別是監測此類流中的中間體和產品的濃度以及此類流的其他特性(例如pH)，來促進對生物製造參數運用適當控制(包括自動控制)。用於溶液監測的習知方法包括諸如UV吸光度量測的技術。然而不幸的是，由於諸如溫度、濕度、環境光強度和局部樣品不均一性等因素，此類方法在超過幾天的量測週期後會發生漂變。
此外，此類方法通常不允許由單次量測(例如，吸光度光譜的量測)實時或近實時地計算或以其他方式確定多個量。取而代之，在進行的量測與從此類量測確定的量之間通常存在1：1的對應關係。因此，例如，為了量測溶液流中兩種不同物質的濃度，將記錄兩種不同的UV吸光度量測值，並且每種量測值將產生這些物質之一的濃度值。由於確定此類值所需的量測與分析時間，可能無法實時或近實時地確定多個量的值。
本文公開了使用紅外光譜量測結合多元化學計量模型來確定有關分析物的定量信息與過程溶液中特性的方法和系統。例如，分析物可包括產品與中間組分、廢產品、殘留試劑和緩衝液組分。特性的例子可包括但不限 於pH水平、鹽度水平、蛋白質/肽聚集水平、生物產品(諸如蛋白質、肽和核酸)的量/濃度、工藝雜質與產品雜質的濃度/量、以及蛋白質的電荷變體分佈。
紅外光譜量測可以快速且高重現性地進行，並且校準的化學計量模型用於在各種生物製造過程條件下且針對各種試劑、產品、副產品和雜質實時或近實時地預測質量屬性。由本文公開的基於化學計量的分析方法所提供的廣泛控制允許更有效地進行生物製造過程，具有更少的浪費、更高的產品產量和更高的產品純度。
由於紅外輻射的波長，紅外光譜量測通常提供有關分析物(例如生物製造系統內的過程流體中的反應產品和副產品)的振動特性的信息。雖然其他量測方式如拉曼光譜也可以產生有關此類分析物的重要信息，但紅外量測在某些情況下可提供某些優勢。通常，例如，紅外光譜信息的量測(例如，在大約30秒或更短時間內)可以比相應的拉曼量測(其可花費10分鐘與15分鐘之間)更快地進行。因此，紅外量測可以更好地適用於實時和近實時的過程監測和控制應用。
迄今為止，由於在水溶液中實施製造過程，並且水在約1640cm-1處具有強吸收，紅外量測在針對生物藥物的生物製造操作中的上游和下游過程監測中的應用非常有限。過程用水本質上干擾基於紅外量測的習知分析計算，有時甚至達不到從此類量測中確定定量信息的程度。但是，即使存在強吸水性，本文公開的化學計量學方法也可以可靠地預測各種參數的定量值。因此，本文公開的方法可以使用紅外光譜量測來進行習知的、高通量的過程監測與控制。
此外，與拉曼量測相比，紅外光譜量測對分析物和過程流體特性的變化更為敏感。結合可以進行此類量測的速率，紅外光譜量測可能更適合於在生物製造過程的主動監測期間更高通量的應用。
此外，紅外光譜量測通常對於在進行量測時發生的環境條件變化不太敏感。例如，相對於拉曼量測，紅外光譜量測通常對於溫度、濕度和環境光的變化不太敏感。因此，基於此類量測的化學計量模型，一旦經校準， 則可以在更多種條件下使用，並且可以更容易地從實驗室轉化為商業化的高通量製造操作。
圖1是顯示一種量測系統100的實施例的示意圖，該量測系統用於量測生物製造系統中過程溶液的紅外光譜信息。系統100包括位於流體導管102與104之間的流動池106。流體122從導管102進入流動池106，沿圖1中箭頭所示的方向流動通過池106，並離開池106進入導管104。
在一些實施例中，如圖1所示，流動池106包括衰減全反射(ATR)界面，以用於量測ATR配置/模式中的紅外光譜信息。在圖1中，ATR界面實施為稜鏡108，該稜鏡形成池106內的內腔的一部分。第一光纖110光學耦合到稜鏡108的第一表面124和光源112。第二光纖114光學耦合到稜鏡108的第二表面126和檢測器116。輻射源112和檢測器116電連接到控制器120。
在操作期間，控制器120激活輻射源112以產生入射輻射130。入射輻射130耦合到第一光纖110中並由第一光纖110通過第一表面124傳遞到稜鏡108中。在進入稜鏡108之後，入射輻射130向流動池106的表面128傳播。
將相對於表面128法線的入射輻射130的入射角度Π以及形成流動池106的材料選擇為使得當入射輻射130到達表面128時，入射輻射在表面128處經歷全內反射，從而產生反射輻射132。反射輻射132通過表面126耦合到第二光纖114中，傳播通過第二光纖114，並由檢測器116檢測。檢測器116將反射輻射132轉換為光譜信息，並將光譜信息發送到控制器120。如下面將更詳細解釋的，控制器120分析光譜信息以確定有關流體122的一種或多種組分的信息和/或與生產流體122的生物製造過程相關的一種或多種過程條件。
輻射源112可包括各種不同的輻射源。在一些實施例中，例如，輻射源112包括一個或多個發光二極管(LED)。通常，輻射源112在電磁波譜的紅外區域中產生入射輻射130。例如，入射輻射130通常包括在750nm與500微米之間的一個或多個波長處的輻射。
在某些實施例中，輻射源112以多個不同的波長產生入射輻射130。例如，輻射源112可以在3個或更多個(例如，5個或更多個、7個或更多個、10個或更多個、15個或更多個、20個或更多個、或者甚至更多個)不同的、 光譜分離的“帶”或“線”(其每個具有在光譜的紅外區域內的中心波長)上產生入射輻射130。
在一些實施例中，輻射源112在紅外光譜區域中的一系列波長上產生寬帶入射輻射130。例如，入射輻射130可以具有在100nm或更大(例如，200nm或更大、500nm或更大、1微米或更大、5微米或更大、10微米或更大、50微米或更大、100微米或更大、200微米或更大、300微米或更大)的半最大帶寬處的全寬。
檢測器116通常可以按各種方式實施。例如，在某些實施例中，檢測器116可以是傅裡葉變換紅外(FTIR)光譜儀，其接收反射輻射132並產生反射輻射的光譜信息。用作檢測器116的一種合適的FTIR光譜儀是Bruker MATRIX-MF® FTIR(可購自Bruker Optics公司，比勒利卡，馬薩諸塞州)，其具有碲鎘汞(MCT)紅外感測器，但也可使用許多其他FTIR光譜儀。
檢測器116也可以使用標準光學元件來實施，該標準光學元件在空間上分散反射輻射132的頻率分量，從而將輻射頻率映射到空間坐標方向上並且然後分析作為位置函數的分散的頻率分量以量測輻射強度。用於在空間上分散反射輻射132的頻率分量的合適的光學元件包括光柵、稜鏡、衍射光學元件和自適應調製器，諸如基於液晶的光學調製器。在反射輻射132的頻率組分已經在空間上分散之後，可使用適用於檢測紅外輻射的各種檢測器量測作為頻率函數的輻射強度，包括基於碲鎘汞、銻化銦、銻化砷、和硒化鉛中的一種或多種的檢測器，和/或具有基於量子阱和/或量子點的感測器特徵的檢測器。
如圖1所示，在一些實施例中，入射輻射130和反射輻射132可以通過光纖110和114傳送至和傳送自ATR界面(例如，稜鏡108)。但是，在某些實施例中，入射輻射130和反射輻射均可以使用單根光纖傳送至和傳送自ATR界面。圖2顯示的是光纖200的截面示意圖，該光纖包括由不透明包層材料252包繞的第一輻射傳輸芯210和第二輻射傳輸芯214。整合式到光纖200一端的是ATR界面(實施為稜鏡208)。將稜鏡208定位為使得表面250可以光學耦合到圖1的流動池106，代替稜鏡108。
在操作期間，由輻射源112產生的入射輻射130耦合到光纖芯210中並且 通過芯210傳播，到達整合式稜鏡208。該入射輻射進入稜鏡208並從稜鏡208的表面250經歷全內反射，從而產生反射輻射132。反射輻射132耦合到芯214中並通過光纖200傳播回來。在與稜鏡208相對的光纖200的末端，反射輻射132耦合至檢測器116並如上所討論的被分析。
通常，前述例子僅代表可用于在系統100中傳輸入射輻射130和反射輻射132的光纖和探針的子集。可以使用很多種光纖和探針，包括某些市售部件。合適的市售探針的一個例子是IN350T®金剛石ATR探針(可購自Bruker Optics)。
另外，在一些實施例中，入射輻射130和/或反射輻射132可以通過自由空間傳播而不是在光纖中傳輸。自由空間傳播能夠允許將另外的光學元件(諸如濾光器、光闌、分束器、反射鏡和透鏡)插入入射輻射130和反射輻射132之一或二者的光路中，從而允許進一步控制兩個光束的特性。
如圖1和2所示，在一些實施例中，ATR界面可實施為具有幾何特徵(例如，頂角)的稜鏡，該幾何特徵被選擇為確保當入射輻射遇到稜鏡材料與流體122之間的界面時發生入射輻射130的全內反射。更一般地，ATR界面也可以按其他方式實施。圖3是顯示ATR界面的另一實例的示意圖，該ATR界面被實施為梯形308(或者可替代地，作為截稜鏡)。梯形308的表面328形成流動池106的內腔的一部分。另外，反射塗層362設置在梯形308的表面360上，該表面與表面328相對。
在操作期間，入射輻射330(例如，來自光纖)穿過表面324耦合到梯形308中。入射輻射330沿著流體122與梯形308的表面328之間的界面入射在第一位置372處。入射輻射在表面328處經歷全內反射，形成反射輻射332。反射輻射332被表面360上的塗層362反射，並且沿著流體122與梯形308的表面328之間的界面再次入射在位置374處。反射輻射334從位置374處出現，由塗層362反射，並沿著流體122與表面328之間的界面入射在位置376處。反射輻射336從位置376處出現並且穿過表面326從梯形308耦合出來(例如，進入光纖)。
梯形308的幾何特徵確保入射輻射330穿過梯形308的表面328與流體122進行多次相互作用，這相對於發生在圖1的例子中的單次相互作用量測， 增加了由反射輻射336承載的光譜信息的信噪比。通常，梯形308可以被配置為使得入射輻射330與通過表面328的流體122之間的相互作用的數量是2次或更多次(例如，3次或更多次、5次或更多次、7次或更多次、10次或更多次，或者甚至更多次)。
通常，用於系統100的ATR界面(諸如稜鏡108和梯形308)是由相對高折射率的材料形成，以確保在稜鏡108和/或梯形308與流體122之間的界面處(例如，表面128和/或328)發生全內反射。可以形成諸如稜鏡108和/或梯形328的ATR界面的合適材料包括但不限於金剛石、鍺、各種鹵化鉈、硒化鋅和矽。
在圖1中，流動池106被實施為連接在導管102與104之間的流通池。流體122，其可以包括生物製造系統內的各個位置處的各種不同過程流體中的任何一種或多種，在量測和分析紅外光譜信息時流動通過池106。流動池106可以被定位在生物製造系統內的各個位置，以允許量測光譜信息，用於產品質量評估和過程控制。例如，在一些實施例中，流動池106可以被定位在生物反應器(例如，灌注生物反應器，如切向流灌注生物反應器)的出口端口。可替代地或另外地，流動池106可以沿著生物製造系統的部件之間的流體流動路徑定位，包括定位於生物反應器與純化單元之間、在兩個純化單元之間，和/或在純化單元之後。生物製造系統通常可包括單個流動池106或多個流動池106，各個流動池被定位於生物製造系統內以量測不同位置處的光譜信息。
在一些實施例中，當流體122不在池106中流動時進行紅外光譜量測。圖4是顯示定位在兩個流體導管102與104之間的流動池106的示意圖。第一閥402電連接至控制器120，被定位於導管102與流動池106之間。第二閥404電連接至控制器120，被定位于流動池106與導管104之間。在操作期間，控制器120打開閥402以允許流體122的一部分進入流動池106。當流體122的這部分已進入流動池106時，控制器120關閉閥402。在閥404保持關閉的情況下，流體122的這部分暫時被截留在流動池106內。如上所討論，通過控制器120量測流體122的紅外光譜信息，其中流體122在流動池106內保持靜止；並且然後控制器120打開閥404以允許流體122的一部分流出池106。在同一 時間或之後，控制器120還可打開閥402以允許流體122的新的部分進入流動池106。以這種方式，可以從流體122的非流動部分量測紅外光譜信息，當流體122通過池106的流速會以另外的方式擾亂或干擾從該流體獲得準確的、可再現的紅外光譜信息時，這可能是有用的。此類情況例如在如下情形時會發生：流動通過池106的流體高度渾濁，導致入射輻射130的散射和/或與流體122中的氣泡及其他與流動相關的不均勻物質的相互作用。
雖然圖1顯示了可以用於系統100的流動池106的一個實例，但更一般地，可以使用具有各種不同幾何形狀的流動池。圖5是顯示定位在導管102與104之間的流動池506的示意圖。ATR界面形成流動池506內的腔或通道壁的一部分。如圖5所示，流體122從導管102流動通過池506並進入導管104。當流體122流動時，或者可替代地當流體122在流動池506內靜止時(例如，如上所述，當連接至控制器120的閥調節流體122進出流動池506的流動時)，通過界面128處的入射輻射130的ATR進行紅外光譜量測。
雖然圖1中的流動池106定義了從導管102通過流動池106並進入導管104的非線性二維流體流動路徑，但由於流體端口502與504的位置在流動池506的任一末端處，流動池506定義了線性一維流體流動路徑。對於在生物製造系統內以相對較高的速率流動的過程流體，流動池506可以提供相對于流動池106的某些優勢。具體而言，流動池506可以允許維持更高的聚集體流體流動速率，從而確保紅外光譜量測不會將流速瓶頸引入連續生物製造過程。
如上所討論，本文公開的某些量測系統被配置為使用基於ATR的幾何結構來進行紅外光譜量測。ATR幾何結構利用了在形成ATR界面(例如，稜鏡108和308)的材料與流體122之間的折射率的失配優勢。圖6是顯示入射在稜鏡108的表面128上的入射輻射130的光線602的示意圖。表面128形成了在形成稜鏡108的材料(通常是在光線602的波長處具有相對高的折射率的材料)與流體122(其通常具有相對較小的折射率)之間的邊界。斯涅爾定律(Snell’s law)描述了在界面處入射角和反射角Πi和Πr與稜鏡和流體的折射率np和nf之間的關係，對應地為：np sin Πi=nf sin Πr [1]
隨著np的值相對於nf的值增加，sin Πr的值增加以維持方程式(1)中的關係。換言之，稜鏡108與流體122之間的折射率失配越大，sin Πr的值越大，其意味著折射角Πr增加。對於np與nf的固定值，可以將入射角Πi選擇為使得sin Πr=1。即，折射光線604在與表面128相切的方向上傳播。此入射角稱為臨界角Πc。
對於大於臨界角的入射角，在表面128處不產生折射光線604。取而代之，入射光線602在表面128處經歷全內折射，產生反射光線606。但是，在表面128處，倏逝場延伸一段短距離(通常稱為穿透深度)超過界面並進入流體122。沒有能量流過界面。儘管如此，倏逝場與流體122(以及流體的組分)相互作用並且通過這種相互作用改變了該場的光譜特性。結果是，通過分析反射光線606的光譜特性的變化，可以提取有關各種組分(諸如分析物和製造副產品)及流體屬性的信息。
在一些實施例中，使用ATR幾何結構量測紅外光譜信息可以提供某些優勢。例如，相對於傳輸模式紅外光譜量測，ATR幾何結構涉及通過倏逝場進入問詢流體的穿透深度，其與傳輸模式試驗中使用的習知吸收路徑長度相比相對較短。通常，路徑長度越長，量測靈敏度的降低程度越大。因此，在某些實施例中，基於ATR的紅外光譜量測能夠以比傳輸模式紅外吸收量測更高的靈敏度進行。
儘管如此，在一些實施例中，可以對通過傳輸模式量測獲得的紅外光譜信息進行基於化學計量學的分析。圖7顯示的是與生物製造系統一起使用的量測系統700的示意圖。系統700通過傳輸模式量測幾何結構來量測流體122的紅外光譜信息。
流體122從導管102流動通過流動池106並進入導管104。控制器120激活輻射源112，該輻射源產生入射輻射130。入射輻射130通過光纖110傳播並通過窗口耦合(該窗口形成流動池106的壁的一部分)，並且進入流動池106內的內腔或通道。一旦進入流動池，則入射輻射130的至少一部分被一種或多種分析物或者流體122的其他組分吸收。入射輻射130的未吸收部分通過流動池106中的第二窗口作為傳輸輻射702出現，並且通過第二光纖114傳播 到檢測器116。由檢測器116產生的、編碼由傳輸輻射602承載的紅外光譜信息的電信號被傳輸至控制器120以進行分析。
用於製造小分子藥物物質的過程分析的預測性的、基於化學計量模型的光譜量測分析已取得了一些成功。但是，此類方法尚未應用於對更大的生物治療藥物(諸如基於抗體的藥物)的開發，因為此類產品尺寸大、複雜且不均一。此外，此類物質的生物製造過程比小分子藥物的更加複雜，並且產生含有廣泛分析物及其他物質的過程溶液。迄今為止，這些複雜性已經建議不要應用化學計量學方法來對大生物分子(諸如基於抗體的藥物和基於核酸的產品)的生物製造進行過程控制。
但是，人們已經發現，儘管存在上述複雜性，但基於化學計量模型的光譜量測分析可以產生與大生物分子的生物製造相關的各種過程相關參數和產品屬性的值。這些參數和屬性可用於實時或近實時地過程反饋與控制。具體而言，來自紅外反射(或吸收)量測的振動光譜信息特別適用於基於化學計量模型的分析，因為光譜信息提供了豐富的數據集，其具有諸如與特定分析物和副產品直接相關的伸縮與彎曲共振的突出特徵。更一般地，光譜信息編碼過程流體組分對入射紅外輻射的響應的複雜集，並且多元數據分析工具可以解碼這些響應，且對於某些參數，可以高準確性地、預測性地使用。
在本節中，討論了用於構建化學計量模型並將其應用於紅外光譜信息的方法和系統。該方法和系統特別適合於產生與在連續生物製造操作期間產生的過程流體相關的各種產品屬性和參數的值，並且可用於監測此類操作並通過調節各種生物製造過程的輸入和特性來進行過程控制。具體而言，該方法可用於實時或近實時地生物製造過程反饋與控制。
如下面將更加詳細描述的，本文討論的多元數據分析方法用於分離由於不同分析物及質量屬性所致的光譜信息響應。由從參考方法(諸如層析或質譜)獲得的數據為各分析物和/或質量屬性構建化學計量模型之後，可以獲得單組光譜信息(例如，紅外吸光度或反射光譜)，並且可以使用化學計量模型處理光譜信息，以預測與來自同一組光譜信息的模型相對應的 各個質量屬性的定量值。因為模型對相同的信息集起作用，所以質量屬性值的預測性確定可以實時或近實時地發生。
本節中討論的基於化學計量模型的分析方法對紅外光譜信息起作用，以確定與過程相關的參數值。該紅外光譜信息可以如前面章節中所述或通過使用其他方法來進行量測。通常，紅外光譜信息對應于振動光譜信息，更具體地，對應於過程流體(和該流體中含有的組分)的振動光譜。振動光譜是二維數據集，其包括作為輻射波長或頻率的函數的強度值，其中波長或頻率的範圍落在電磁波譜的紅外部分以內，並且因此對應於過程流體的組分的不同振動模式的典型波長或頻率。
更一般地，如本文所使用的，振動光譜信息包括代表過程流體的組分的振動響應(例如，不同的振動模式)的任何數據集。振動光譜信息可以被編碼為習知的振動光譜，或處於代表與振動光譜類似的信息內容的不同形式。
圖8是顯示一系列示例步驟的流程圖800，可以進行這些步驟以分析過程流體及其相關組分的振動光譜信息(諸如振動光譜)以確定該流體及其相關組分的各種屬性值。流程圖800中所示的各個步驟可以由系統控制器(諸如控制器120)以自動方式執行以進行分析。
在第一步驟802中，獲得針對待確定的各個屬性值的經校準的與驗證的化學計量模型。在一些實施例中，化學計量模型(其通常由描述過程流體的屬性值與一個或多個波長或頻率處的光譜強度值之間的函數關係的校準係數組成)可以通過從存儲介質中檢索先前存儲的系數值來獲得。可替代地，在某些實施例中，化學計量模型在由控制器120預測性地使用之前得以構建和驗證。
圖9是顯示一系列示例步驟的流程圖，可進行這些步驟以基於針對過程流體量測的振動光譜信息來構建和驗證針對處理流體屬性的化學計量模型。在第一步驟902中，控制器120確定特徵模型自變量的集合。在實踐中，模型變量的集合對應于振動光譜信息內的獨立振動頻率的集合，其預測屬性(針對該屬性構建該模型)。應當理解，雖然以下討論涉及振動光譜信息內的“頻率”，但是考慮到在振動光譜信息中波長與頻率之間的相互關係，該 討論也可等效地指代“波長”。即，依據一組頻率定義化學計量模型的方法等同於依據一組波長定義化學計量模型的方法。
可以按各種方式確定獨立振動頻率的集合。例如，在一些實施例中，可以通過對多個校準數據集進行主成分分析來確定振動頻率的集合，各個校準數據集對應於與具有不同的、已知的感興趣屬性值的過程流體相關的振動光譜信息。主成分分析確定有多少獨立頻率可靠地預測在各個校準數據集上的屬性值以及獨立頻率的值。主成分的集合對應於在步驟902中形成獨立模型變量的頻率的集合。例如，用於進行主成分分析的方法在Bro等人的“Principal component analysis,”Anal.Methods 6：2812-2831(2014)和Chatfield等人的“Principal component analysis,”Introduction to Multivariate Analysis,Springer，第51-87頁(1980)中進行了討論，其各自的全部內容通過引用併入本文。
接下來，在步驟904中，基於來自步驟902的自變量的集合構建針對感興趣屬性的化學計量模型。通常，化學計量模型可以採用多種函數形式。一種這樣的形式是線性模型，其中感興趣的屬性A值表示為自變量集合的線性函數：A=a1IY1+a2IY2+...+aiIYi+...+anIYn [2]其中Y1...Yn是對應於在步驟902中確定的自變量集合的n個頻率的集合(即，n個主成分的集合)，並且IY1...IYn是來自對應於該n個頻率中的每一個的振動光譜信息的n個強度值的集合。參數a1...an是係數的集合，其有效地加權來自振動光譜信息的各個強度值對預測屬性A值的貢獻。
通常，如方程式(2)所示，針對屬性A的值的化學計量模型是多元模型，其中屬性A的值取決於多個自變量值。化學計量模型中的自變量的數量通常可以根據需要選擇，例如，基於主成分分析的結果來選擇。因此，例如，化學計量模型中的屬性A的值可以表示為一個或多個(例如，兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個、五個或更多個、六個或更多個、七個或更 多個、八個或更多個、十個或更多個、12個或更多個、15個或更多個、20個或更多個、或者甚至更多個)自變量的函數。
在一些實施例中，化學計量模型具有比方程式(2)的線性形式更多的複雜形式。例如，某些化學計量模型可以是非線性的，其中感興趣屬性A的值表示為自變量的集合的非線性函數。化學計量模型的此類函數形式可表示如下：A=f1(IY1)+f2(IY2)+...+fi(IYi)+...+fn(IYn) [3]其中各個函數形式fj(IYj)在IYj中是線性的或非線性的。對於代表A的非線性化學計量模型的方程式(3)，fj(IYj)中的至少一個是IYj的非線性函數。
通常，各個fj(IYj)函數形式在IYj中可以是線性的或非線性的。在fj(IYj)是IYj的非線性函數的情況下，fj(IYj)可以具有各種不同形式中的任何形式，例如但不限於：指數形式、對數形式、多項式形式、冪定律形式、三角形式、雙曲線形式、以及任何前述函數形式的任何組合。通常可以在化學計量模型的構建期間根據需要選擇此類函數形式，以確保模型對屬性A的值的預測能力足夠準確。隨後的討論集中在方程式(2)的線性例子，但是應當理解，類似的原理也適用於非線性化學計量模型。即，非線性化學計量模型類似線性化學計量模型，具有從校準數據集確定的係數，並且然後用於從量測的振動(即紅外)光譜信息預測質量屬性值。
返回到方程式(2)的線性模型，在下一步驟906中，在模型被構建好之後，基於一個或多個校準數據集確定系數值。以下討論假定屬性A的化學計量模型是根據上面的方程式(2)所定義的線性模型。如果模型不同，可在使用下面討論的方法時稍微加以修改以確定系數值。
各個校準數據集對應於具有不同的、已知的屬性A值的過程流體的一組振動光譜信息(例如，振動光譜)。關於方程式(2)，對於各個校準數據集，A和IY1...IYn的值是已知的。因此，在步驟906中，在各個校準數據集上以自洽方式確定系數值a1...an的單個集合，使得方程式(2)盡可能正確地確定各個校準數據集的屬性A的各已知值。
可以使用各種方法來確定所有校準數據集中的系數值a1...an的集合。在一些實施例中，例如，在所有校準數據集中同時使用偏最小二乘回歸分析，從而使得屬性A的各值的平方誤差項的總和最小化。例如，進行偏最小二乘回歸的方法在Haenlein等人的“A Beginner’s Guide to Partial Least Squares Analysis,”Understanding Statistics 3(4)：283-297(2004)和Sellin的“Partial Least Squares Analysis,”Int.J.Educational Research 10(2)：189-200(1986)中進行了描述，其各自的全部內容通過引用併入本文。
接下來，在步驟908中，可以針對一個或多個附加校準數據集可選地驗證在步驟906中確定的系數值a1...an的集合，以驗證針對屬性A的化學計量模型將屬性值預測在可接受的誤差內。此驗證步驟涉及使用化學計量模型以基於過程流體的一組或多組校準數據(各組校準數據是一組振動光譜信息)預測過程流體的屬性A的一個或多個值。由於已知各個過程流體(對其量測了校準數據集)的屬性A的值，因此可以容易地評估由化學計量模型生成的屬性A的預測值的準確性。
在可選步驟910中，系數值a1...an的集合可以存儲在存儲介質中，以便以後由控制器120檢索。流程圖900中所示的過程結束於步驟912。
在一些實施例中，一個或多個校準數據集以及量測的振動光譜信息均可在用於構建化學計量模型和/或從量測的信息生成預測的質量屬性值之前被處理。通常，可以實施各種處理步驟。在一些實施例中，例如，可以對一個或多個校準數據集和/或量測的光譜信息進行基線校正。在某些實施例中，可以對一個或多個數據集和/或量測的信息進行諸如均值歸一化和/或衍生化的處理步驟。例如，此類步驟可以使用商業分析軟體諸如MATLAB®(可購自MathWorks，納蒂克市，馬薩諸塞州)來進行。
在某些實施例中，預測屬性A的值的化學計量模型也可以對量測光譜信息的某些條件是特異性的。例如，該模型可能綁定於被量測了信息的特定過程流體(例如，溶離自特定層析管柱的流體)。因此，在一些實施例中，本文公開的方法包括生成多於一個的化學計量模型以預測屬性A的值。
作為例子，可以生成第一化學計量模型以預測從生物製造系統中的第一層析管柱溶離的過程流體中的A的濃度，並且可以生成第二化學計量模型 以預測從第一個柱下游的第二個層析管柱溶離的不同過程流體中的A的濃度。由於從兩個柱溶離的流體的組成不同，化學計量模型可以是不同的，但是各個都是特異性地生成以準確預測系統中某個量測位置處的屬性A的值。在生成屬性A的多個模型的情況下，可以可選地存儲各個模型。
回到圖8，在針對各個感興趣的屬性獲得校準的化學計量模型之後，在步驟804中獲得過程流體的振動光譜信息。作為例子，使用ATR幾何結構的紅外反射量測(如上所討論)可用于獲得振動光譜信息，其可對應於過程流體及其相關組分的振動光譜。
接下來，在步驟806中，使用在步驟802中獲得的第一化學計量模型分析振動光譜信息，以確定流體的感興趣的第一屬性值。如上面結合流程圖900所討論的，確定各個屬性A的值涉及使用在來自振動光譜信息的各個獨立頻率變量上量測的強度值IY1...IYn的集合以及針對化學計量模型確定的係數a1...an的集合來計算A的值。因為計算是確定性的(例如，無論化學計量模型是如在方程式(2)中是線性的還是更加複雜的)，所以其由控制器120非常快速地進行。
在確定第一屬性值之後，控制傳至決定步驟808。如果要確定過程流體的另外的屬性值，則在步驟812中選擇針對下一個感興趣屬性的化學計量模型，並且控制返回到步驟806，在這裡確定下一個感興趣屬性值。在確定過程流體的總共m個屬性值的情況下，在步驟806中將m個不同的化學計量模型應用于振動光譜信息。
本文公開的方法與系統的顯著優點在於，由於振動光譜信息的豐富性，m個屬性值中的各個可獲得自同一組振動光譜信息。即，不進行新的量測以確定各屬性值。取而代之，振動光譜信息僅被量測一次，並且從同一組振動光譜信息確定多個屬性值，各個屬性值可以基於一組多個自變量來確定。因為信息量測通常是確定屬性值的過程中最耗時的步驟，所以確定多個屬性值的經過時間段可以比與涉及多個量測步驟的方法相關聯的可比時間段明顯短得多。
在一些實施例中，例如，獲得振動光譜信息並使用化學計量模型從振動光譜信息確定一個或多個屬性值的經過時間段是從入射輻射130入射到 與流體122接觸的ATR界面的表面上開始30秒或更短(例如，25秒或更短、20秒或更短、15秒或更短、10秒或更短、5秒或更短、2秒或更短)。
如果在步驟808中確定了所有感興趣的屬性值，則控制傳至步驟810。在步驟810中，控制器120響應於量測的過程流體屬性值調節生物製造系統的一個或多個工藝參數。通常，可以基於所確定的屬性值的性質以及那些屬性值對於生物製造過程的影響來進行各種各樣的調節。在隨後的章節中討論了量測屬性以及對生物製造系統進行相應調節的某些例子。
接下來，在決定步驟812中，如果要繼續確定過程流體的屬性值(例如，用於連續過程監測和控制)，則控制返回到步驟804，並且在適當的時間間隔之後獲得過程流體的新的振動光譜信息。可替代地，如果不繼續確定屬性值，則控制傳至步驟814，在這裡流程圖800的過程結束。
通常，流程圖800中所示的過程可用於從同一組振動光譜信息中確定任意數量的屬性值。例如，在一些實施例中，可以使用不同的化學計量模型從相同的振動光譜信息中確定1個或多個屬性值(例如，2個或更多個屬性值、3個或更多個屬性值、4個或更多個屬性值、5個或更多個屬性值、6個或更多個屬性值、8個或更多個屬性值、10個或更多個屬性值、12個或更多個屬性值、或者甚至更多個屬性值)。
通常，與給定的化學計量模型相關的自變量的集合不同於與用於從同一組振動光譜信息計算不同屬性值的其他化學計量模型相關的自變量的集合。對於各個化學計量模型，與模型相關的自變量的集合可包括兩個或更多個(例如，三個或更多個、四個或更多個、五個或更多個、六個或更多個、八個或更多個、10個或更多個、12個或更多個、15個或更多個、或者甚至更多個)主要振動組分。
但是，因為通常針對各個化學計量模型獨立地確定自變量的集合，所以與不同化學計量模型相關的主要振動組分的集合可能沒有共同的成員。可替代地，在一些實施例中，與不同化學計量模型相關的主要振動組分的集合可以具有1個或多個(例如，2個或更多個、3個或更多個、4個或更多個、5個或更多個)共同的成員。
通常，可以構建化學計量模型以確定與生物製造過程相關的各種各樣不同的質量屬性。這些質量屬性通常分為若干類別，包括但不限於：產品質量屬性，其與生物製造過程的產品的純度、完整性、產量、形態及其他屬性相關；產品相關雜質，其與生物製造過程中產生的過程流體中存在的不同合成副產品的性質有關；以及過程相關雜質，其與系統內的過程條件所造成的副產品和其他不希望的物質有關。
通常可以構建化學計量模型以便應用於大量不同物質的生物製造。與不同類別的物質相關的質量屬性中的一些是不同的，而一些是相似的。例如，在一些實施例中，本文公開的方法可以應用於蛋白質治療物質(諸如抗體、肽、酶以及具有胺基酸鏈的其他物質)的生物製造。對於此類物質，可構建化學計量模型以預測質量屬性值，該質量屬性包括：(a)產品質量屬性，其包括濃度、聚集體、電荷變體分佈、純度、聚糖譜、同一性和完整性；(b)產品相關雜質，諸如蛋白質片段；和(c)過程相關雜質，諸如宿主細胞蛋白、殘留的宿主細胞DNA、殘留的管柱配體(例如蛋白A)以及其他雜質，諸如緩衝液組分、表面活性劑、過程添加劑(諸如胰島素、泊洛沙姆、洗滌劑、聚山梨醇酯80)以及來自生物反應器和層析/分離管柱的其他化合物。
在某些實施例中，本文公開的方法可以應用於核酸藥品的生物製造，該核酸藥品包括：基於DNA的物質，諸如DNA、質體、寡核苷酸、適配體和DNA酶(例如DNase)；和基於RNA的物質，諸如RNA適配體、RNA誘餌、微小RNA和小干擾RNA。對於此類物質，可構建化學計量模型以預測質量屬性值，該質量屬性包括：(a)產品質量屬性，其包括濃度、同一性、完整性和聚集體；(b)產品相關雜質，諸如核酸片段和核酸變體；和(c)過程相關雜質，諸如殘留的柱配體以及其他雜質，諸如緩衝液組分、表面活性劑、過程添加劑(諸如胰島素、泊洛沙姆、洗滌劑、聚山梨醇酯80)、以及來自生物反應器和層析/分離管柱的其他化合物。
在一些實施例中，本文公開的方法可以應用於基因療法藥品的生物製造。對於此類物質，可構建化學計量模型以預測質量屬性值，該質量屬性包括：(a)產品質量屬性，諸如濃度、聚集體、同一性和完整性；(b)產品相 關雜質，諸如空殼體、片段和載體雜質；和(c)過程相關雜質，諸如宿主細胞蛋白、宿主細胞DNA、殘留的輔助病毒、殘留的輔助病毒蛋白、殘留的輔助病毒DNA以及其他雜質，諸如緩衝液組分、表面活性劑、過程添加劑(諸如胰島素、泊洛沙姆、洗滌劑、聚山梨醇酯80)以及來自生物反應器和層析/分離管柱的其他化合物。
可以通過合適的化學計量模型預測性地生成前述的任何質量屬性的值。因此，方程式(2)和(3)中的屬性A可以代表上述的任何質量屬性。
此外，應當注意，可以構建化學計量模型以從單組量測的光譜信息(例如，紅外振動光譜)預測性地生成任何上述的質量屬性的組合的值。通常，上述質量屬性的任意兩種或更多種(例如，三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種、六種或更多種、七種或更多種、八種或更多種、十種或更多種，或者甚至更多種)的組合的值可通過適當構建的化學計量模型從相同的光譜信息生成。
在以下討論中，提供了與基於蛋白質的治療物質的生物製造相關的質量屬性的具體例子。對過程流體122(及其組分)進行光譜量測。從量測的光譜信息確定的質量屬性值可用於各種目的，包括產品質量評估、生物製造過程調節以及過程終止。使用質量屬性值以便由控制器120對生物製造過程進行調節的方面將在後面討論。
(i)抗體濃度值
在某些實施例中，諸如當生物製造過程的期望產品是基於抗體的藥物產品時，生物製造系統內的特定位置處的過程流體的抗體濃度值可以與期望產品的總產量相關。因此，在一些實施例中，本文公開的方法包括獲得並應用化學計量學模型以確定過程流體的抗體濃度值。
在化學計量模型中針對抗體濃度值使用的獨立振動頻率集合可包括特定頻率範圍內的頻率。通過將頻率包括在這些特定範圍內，可以減少與從振動光譜信息確定抗體濃度值相關的預測誤差。
例如，在一些實施例中，化學計量模型中針對抗體濃度值使用的主要振動頻率或組分的集合可以包括在波數範圍1100cm-1到1595cm-1與波數範圍1600cm-1到1700cm-1的至少一個中的振動光譜信息。在某些實施例中， 主要振動頻率或組分的集合包括至少一個對應於在波數範圍1100cm-1到1595cm-1中的振動光譜信息的組分，和至少一個對應於在波數範圍1600cm-1到1700cm-1中的振動光譜信息的組分。
(ii)蛋白質聚集的程度
在某些實施例中，諸如當生物製造過程的期望產品是基於蛋白質時，過程流體中蛋白質聚集的程度可以提供有關蛋白質相互作用和產品產量的重要信息。因此，在一些實施例中，本文公開的方法包括獲得並應用化學計量模型以確定過程流體中蛋白質聚集的程度。
在化學計量模型中針對蛋白質聚集程度使用的獨立振動頻率集合可包括特定頻率範圍內的頻率。例如，在一些實施例中，化學計量模型中針對蛋白質聚集程度使用的各個主要振動頻率或組分對應於在波數範圍1393cm-1到1554cm-1、範圍1600cm-1到1635cm-1和範圍844cm-1到1180cm-1的至少一個中的振動光譜信息。
在某些實施例中，化學計量模型中針對蛋白質聚集程度使用的主要振動頻率或組分集合中的至少一個對應於在頻率範圍1393cm-1到1554cm-1中的振動光譜信息，至少一個主要振動頻率或組分對應於在頻率範圍1600cm-1到1635cm-1中的振動光譜信息，並且至少一個主要振動頻率或組分對應於在頻率範圍844cm-1到1180cm-1中的振動光譜信息。
(iii)宿主細胞蛋白質的量
在某些實施例中，控制器120可以使用生物製造系統中的過程流體的宿主細胞蛋白質的量來調節製造過程參數以提高產品產量並減少副產品的形成。因此，本文公開的方法可包括獲得並應用化學計量模型以確定過程流體中的宿主細胞蛋白質的量。
在化學計量模型中針對宿主細胞蛋白質的量使用的獨立振動頻率集合可包括特定頻率範圍內的頻率。例如，在某些實施例中，化學計量模型中針對宿主細胞蛋白質的量使用的各個主要振動頻率或組分可以對應於在波數範圍1500cm-1到1600cm-1、波數範圍1600cm-1到1680cm-1、波數範圍1414cm-1到1489cm-1和波數範圍1174cm-1到1286cm-1的至少一個中的振動光譜信息。
在一些實施例中，化學計量模型中針對宿主細胞蛋白質的量使用的主要振動頻率或組分中的至少一個對應於在波數範圍1500cm-1到1600cm-1中的振動光譜信息，至少一個主要振動頻率或組分對應於在波數範圍1600cm-1到1680cm-1中的振動光譜信息，至少一個主要振動頻率或組分對應於在波數範圍1414cm-1到1489cm-1中的振動光譜信息，並且至少一個主要振動頻率或組分對應於在波數範圍1174cm-1到1286cm-1中的振動光譜信息。
(iv)電荷變體分佈
在某些實施例中，控制器120可以使用生物製造系統中的過程流體的電荷變體分佈來調節製造過程參數。因此，本文公開的方法可包括獲得並應用化學計量學模型以確定過程流體中的電荷變體分佈。
已經確定，此類化學計量模型的主要振動頻率或組分的某些頻率範圍可以產生更準確地預測電荷變體分佈值的化學計量模型。在一些實施例中，例如，化學計量模型中針對電荷變體分佈使用的各個主要振動頻率或組分對應於在波數範圍1118cm-1到1500cm-1、波數範圍1120cm-1到1470cm-1和波數範圍1187cm-1到1839cm-1的至少一個中的振動光譜信息。
在某些實施例中，化學計量模型中針對電荷變體分佈使用的主要振動頻率或組分中的至少一個對應於在波數範圍1118cm-1到1500cm-1中的振動光譜信息，至少一個主要振動頻率或組分對應於在波數範圍1120cm-1到1470cm-1中的振動光譜信息，並且至少一個主要振動頻率或組分對應於在波數範圍1187cm-1到1839cm-1中的振動光譜信息。
可替代地，在一些實施例中，化學計量模型中針對電荷變體分佈使用的主要振動頻率或組分包括：第一組至少三個頻率或組分，這些頻率或組分對應於在波數範圍1118cm-1到1500cm-1中的振動光譜信息；第二組至少三個頻率或組分，這些頻率或組分對應於在波數範圍1120cm-1到1470cm-1中的振動光譜信息；和第三組至少三個頻率或組分，這些頻率或組分對應於在波數範圍1187cm-1到1839cm-1中的振動光譜信息。如前面所討論的，在這些主要振動頻率或組分中，至少一個或多個可能是至少兩個組所共有的，或可替代地，對於任何兩個或更多個組，可能沒有共有的。
整合式的連續生物製造系統通常執行藥品和其他反應器衍生產品的連續捕獲和捕獲後處理(即，純化、精處理和過濾)。在連續操作系統和更習知的基於批次的生物反應器系統二者中，評估生物反應器條件和調節各種工藝參數的方法對於確保高產量是重要的。此外，對於大規模製造操作，並且在相對敏感的內部生物反應器條件下，期望用於監測工藝參數的方法高度自動化、穩健，並且提供可用於自動調節生物反應器條件的信息。
已經顯示在生產條件下使用的特定細胞株和化學培養基顯著影響生物反應器的容積生產率和比生產率。具體而言，在適當選擇細胞株和生物反應器培養基的情況下，活細胞密度(VCD)和容積生產率已經持續相對長的時間段。圖18A-18D是顯示灌注生物反應器在45天時間內的活細胞密度(圖18A)、細胞活力(圖18B)、收穫效價(圖18C)和比生產率(圖18D)的圖。這些數據表明，在測試條件下，該反應器可以按1.5 RV/天的灌注速率以100 x 106個活細胞/mL操作，在初始的反應器條件達到平衡後，活細胞密度、細胞活力、收穫效價和比生產率保持相對穩定。
不同的VCD、pH條件和灌注速率可以調節生物反應器內的條件。具體而言，這些操作參數中的任何一個或多個的變化可以改變各種中間體和培養基組分(諸如乳酸、銨離子、葡萄糖和麩醯胺酸)的水平。由於這些中間體在調節生產速率與影響細胞活力方面的重要性，可以相對頻繁地量測和調節許多此類量的值，以確保生物反應器在確保穩定性和相對高生產率的條件範圍內操作。圖19A-19D是顯示對於生產單株抗體產品的特定生物反應器在不同細胞密度、pH和灌注條件下的葡萄糖濃度(圖19A)、麩醯胺酸濃度(圖19B)、乳酸濃度(圖19C)和銨離子濃度(圖19D)如何變化的圖。
由於這些和其他細胞培養基組分和工藝中間體對細胞活力及生產率的影響，這些和其他組分的值的量測提供了有關內部生物反應器工藝的重要信息，並且能進一步提供用於對偏離特定目標條件太遠的生物反應器條件進行自動調節的數據。圖20A-20D是顯示葡萄糖濃度(圖20A)、收穫效價(圖20B)、乳酸濃度(圖20C)和銨離子濃度(圖20D)的每日在線量測 的圖。圖20A-20D中的數據獲得自每日手動量測，其中對生物反應器培養基進行取樣並對圖20A-20D中的各個量進行單獨分析。
遺憾的是，手動量測前述量的各個值可能非常耗時，這限制了可進行量測的速率。進行量測的速率越慢，可能發生在生物反應器條件的校正調節之前的延遲越長。這樣，如果細胞活力與理想條件相差太顯著，產品產量可能受到不利影響。此外，手動收集和處理樣品以量測這些生物反應器培養基組分的值的頻率導致與所採用的取樣方法相關的耗材的相對多的使用。隨著時間的推移，耗材的附隨成本可能很高。
之前討論的在線紅外量測技術和化學計量方法可以直接應用於對基於生物反應器培養基的組分諸如葡萄糖、麩醯胺酸、乳酸和銨離子的量測。與手動採樣及分析方法相比，可獲得紅外光譜信息的速度以及可獲得紅外光譜信息的非侵入方式使得此類量測非常有優勢。此外，具有驗證模型的化學計量學方法允許從單組紅外光譜信息中提取多個量的值。這樣，葡萄糖、麩醯胺酸、乳酸和銨離子(以及其他培養基組分)的濃度可各自獲得自使用合適的化學計量模型分析的單次量測的紅外光譜，這顯著減少了進行光譜量測的次數，並且進而提高了可響應於量測值來調節生物反應器條件的速率。
本文公開的量測系統可與生物製造系統整合式，以便為各種生物產品的合成和純化方法中的各種組分與步驟提供反饋控制。量測系統通常在製造系統的部件之間在線實施，這樣使得能夠在無需採樣或轉移的情況下實時分析流動或靜止的溶液。在進行紅外光譜量測之前，量測系統還可以更習知地用於從反應容器、容納槽或層析管柱中提取的樣品。
用於製造治療性蛋白質藥物和其他物質的整合式與全連續方法可包括，例如，提供含有基本上無細胞的重組治療性蛋白質的液體培養基，然後將該液體培養基進料到第一多柱層析系統(MCCS1)中。下一步驟涉及使用MCCS1在該液體培養基中捕獲重組治療性蛋白質，然後將含有重組治療性蛋白質的MCCS1溶離物連續進料到第二多柱層析系統(MCCS2)中，並使用MCCS2對該蛋白質進行純化和精處理。來自MCCS2的所得溶離物被認為 是治療性蛋白質藥品。該工藝是整合式的，並且可以從液體培養基連續運行到來自MCCS2的溶離物(即治療性蛋白質藥品)。
生物製造系統通常用於進行上述方法。例如，此類系統可包括MCCS1(其包括入口)和MCCS2(其包括出口)。在這些系統中，第一與第二MCCS彼此流體連通。這些系統還被配置為使得流體可被傳送進入入口、通過第一MCCS和第二MCCS，並通過出口離開該製造系統。
此類系統可以從液體培養基中提供連續的、具有時效性的治療性藥品的生產。例如，在將含有治療性蛋白質的流體(例如，液體培養基)進料到第一MCCS與從第二MCCS的出口溶離治療性蛋白質藥品(含有治療性蛋白質)之間的經過時間可以是例如約4小時與約48小時之間。
圖10是顯示生物製造系統的實例的示意圖。系統1包括第一MCCS，即四管柱週期逆流層析系統(PCCS)2，其中四管柱PCCS 2的四個管柱中的三個(管柱3、4和5)進行從含有重組治療性蛋白質的流體(例如，基本無哺乳動物細胞的液體培養基)中捕獲重組治療性蛋白質的單元操作，並且PCCS 2的管柱中的一個(管柱6)進行滅活溶離物中存在的病毒的單元操作，該溶離物來自含有重組治療性蛋白質的PCCS 2的管柱3、4和5。管柱3、4和5可含有利用蛋白A結合捕獲機制的樹脂。管柱6能夠將pH為約3.75的流體保持約1小時。PCCS 1也具有入口7。入口7可以是，例如，接受流體進入PCCS 1的孔口。
系統1還包括第二MCCS，也就是PCCS 8，其包括三個層析管柱9、10和11以及一個層析膜12。PCCS 8中的管柱9、10和11可含有陽離子交換樹脂。PCCS 8中的層析膜12可含有陽離子交換樹脂。PCCS 8還具有設置在PCCS 8中的管柱9、10和11與PCCS 8中的層析膜12之間的流體導管13。PCCS 8還具有與流體導管13處於流體連通的在線緩衝液調節儲器14，並且配置為使得容納於在線緩衝調節儲器14內的緩衝液被引入存在於流體導管13中的流體中。PCCS 8還包括出口15。出口15可以是例如允許流體從PCCS 8排出的孔口。
系統1還可包括設置在PCCS 2與PCCS 8之間的流體導管16。系統1還可包括與流體導管16處於流體連通的在線緩衝調節儲器17，其被配置為使得 容納於在線緩衝調節儲器17內的緩衝液可被引入存在於流體導管16中的流體中。系統1還可包括設置在流體導管16中的過濾器18，以過濾存在於流體導管16中的流體。系統1還可包括設置在流體導管16中的斷流槽19，並且該斷流槽被配置為容納流體導管16中的任何不能容易地進料到PCCS 8中的流體。
系統1還可包括與入口7處於流體連通的泵系統20。泵系統20可包括用於將流體推入入口7的泵21。系統1還可包括設置在泵21與入口7之間的流體導管22。系統1還可包括設置在流體導管22中的過濾器23，以過濾存在於流體導管22中的流體(例如，液體培養基)。系統1還可包括設置在流體導管22中的斷流槽24，其配置為使得斷流槽24與流體導管22處於流體連通並且能夠存儲存在於流體導管22中不能進入入口7的任何流體。
系統1還可包括生物反應器25和設置在生物反應器25與泵21之間的流體導管26。過濾系統27可以設置在流體導管26中，以過濾(例如，從中除去細胞)存在於流體導管26中的液體培養基。
第一MCCS(PCCS 2)包括入口，通過該入口，流體(例如，基本上無細胞的液體培養基)可被傳送進入第一MCCS。該入口可以是本領域已知的用於此類目的的任何結構。它可包括，例如，允許插入流體導管的螺紋、肋材或密封件，這樣使得在將流體導管插到入口中之後，流體將通過入口進入第一MCCS而沒有大量流體從入口滲出。
第一MCCS包括至少兩個層析管柱、至少兩個層析膜，或者至少一個層析管柱和至少一個層析膜，以及入口。例如，第一MCCS可包括總共四個層析管柱，或者三個層析管柱與一個層析膜，或本文所述的任何其他的例示性MCCS，或者具有本文所述的MCCS的任何例示性特徵(以任意組合)中的一個或多個。
存在於第一MCCS中的一個或多個層析管柱和/或一個或多個層析膜可含有各種樹脂中的一種或多種。例如，包含於在第一MCCS中存在的一個或多個層析管柱和/或一個或多個層析膜中的一個或多個中的樹脂可以是利用捕獲機制(例如，蛋白A結合捕獲機制、蛋白質G結合捕獲機制、抗體或抗體片段結合捕獲機制、底物結合捕獲機制、輔因子結合捕獲機制、適配體 結合捕獲機制、和/或標簽結合捕獲機制)的樹脂。包含於第一MCCS的一個或多個層析管柱和/或一個或多個層析膜中的一個或多個中的樹脂可以是陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂、分子篩樹脂或疏水性相互作用樹脂、或其任意組合。可用於純化重組治療性蛋白質的樹脂的其他例子是本領域已知的，並且可包含於在第一MCCS中存在的一個或多個層析管柱和/或一個或多個層析膜中的一個或多個中。存在於第一MCCS中的一個或多個層析管柱和/或層析膜可含有相同的和/或不同的樹脂(例如，本文所述的或本領域已知的用於重組蛋白質純化的任何樹脂)。
存在於第一MCCS中的兩個或更多個層析管柱和/或層析樹脂可以進行一種或多種單元操作(例如，捕獲重組治療性蛋白質、純化重組治療性蛋白質、精處理重組治療性蛋白質、滅活病毒、調節含有重組治療性蛋白質的流體的離子濃度和/或pH、或過濾含有重組治療性蛋白質的流體)。在非限制性例子中，第一MCCS可進行從流體(例如液體培養基)中捕獲重組治療性蛋白質並且滅活存在於含有重組治療性蛋白質的流體中的病毒的單元操作。第一MCCS可進行本文描述的或本領域已知的兩個或更多個單元操作的任意組合。
存在於第一MCCS中的一個或多個層析管柱和/或一個或多個層析膜可以通過切換機制(例如，管柱切換機制)相對於彼此連接或移動。第一MCCS還可包括一個或多個(例如，兩個、三個、四個或五個)泵(例如，自動化的，例如自動蠕動泵)。管柱切換事件可通過檢測經過第一MCCS的流體(例如，進入和/或來自第一MCCS中的一個或多個層析管柱和/或層析膜中的一個或多個的輸入和/或溶離物)中的重組治療性蛋白質的水平、特定的液體(例如緩衝液)體積或特定的經過時間來觸發。柱切換通常是指允許MCCS中至少兩個不同的層析管柱和/或層析膜(例如，MCCS(例如，第一或第二MCCS)中存在的兩個或更多個不同的層析管柱和/或層析膜)在工藝的至少部分期間基本上同時地通過不同步驟(例如，平衡、加載、溶離或洗滌)的機制。
PCCS 2(也就是第一MCCS)可包括四個層析管柱，其中前三個管柱進行從流體(例如液體培養基)中捕獲重組治療性蛋白質的單元操作，並 且PCCS的第四個管柱進行在含有重組治療性蛋白質的流體中滅活病毒的單元操作。PCCS(也就是第一MCCS)可以使用管柱切換機制。PCC系統可利用能夠運行多至例如四個、五個、六個、七個或八個管柱、或者更多管柱的改變的ÄKTA系統(GE Healthcare，皮斯卡塔韋，新澤西州)。
管柱切換事件可通過檢測從PCCS 2或PCCS 8的一個管柱中溶離出的流體中的特定蛋白質或其他物質的濃度來觸發，該流體流動通過在MCCS中的過濾器、包含在MCCS的斷流槽中、或流動通過MCCS中的導管(例如，在MCCS 1與MCCS 2之間)。本文公開的量測系統可用於量測此類蛋白質的濃度，並將該濃度信息傳遞至系統1中的控制器，該控制器在系統1中啟動諸如管柱切換、過濾和流體傳輸的事件。
第一MCCS可配備：一個或多個(例如，兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個)被配置為獲得過程流體的紅外光譜信息的量測系統(例如，系統100)，一個或多個(例如，兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個)閥，一個或多個(例如，兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、或十個)pH計，和/或一個或多個(例如，兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個)電導率計。第一MCCS還可配備執行操作系統的控制器，該操作系統利用軟體(例如，基於Unicorn的軟體(GE Healthcare，皮斯卡塔韋，新澤西州)或實施類似功能的其他軟體)來確定何時應該發生管柱切換(例如，基於來自紅外光譜量測、液體體積或經過時間的濃度信息)並影響(觸發)管柱切換事件。量測系統可任選地放置在第一MCCS中的一個或多個層析管柱和/或一個或多個層析膜中的一個或多個(例如，兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個)的入口處，和/或在第一MCCS中的一個或多個層析管柱和/或一個或多個層析膜中的一個或多個的出口處。
第一MCCS還可以包括一個或多個(例如，兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、十三個、十四個、十五個、十六個、十七個、十八個、十九個、二十個、二十一個、二十二個、二十三個或二十四個)在線緩衝液調節儲器和/或緩衝液儲器。在其他例子中，第一MCCS可包括一個或多個(例如，兩個、三個、四個、五個或六個) 斷流槽，其可容納不能容易地進入第一MCCS中的一個或多個層析管柱和/或層析膜的流體。本文所述的系統可在第一和/或第二MCCS中含有一個或多個斷流槽(例如，本文所述的斷流槽)。本文所述的系統的其他例子不包括在第一MCCS或第二MCCS中的斷流槽，或者在整個系統中不包括斷流槽。該系統的其他例子包括在整個系統中最多一個、兩個、三個、四個或五個斷流槽。
在一些實施例中，第一MCCS可以包括病毒滅活設備。例如，參考圖10，在某些實施例中，第一MCCS包括病毒滅活設備6(即，代替上述管柱6)。病毒滅活設備6被配置為滅活用於生物製造過程的病毒和病毒載體。在一些實施例中，例如，病毒滅活設備6包括混合容器。可替代地，在某些實施例中，例如，設備6包括活塞流滅活系統。這些病毒滅活設備的各個例子有助於從第一MCCS中的過程流體中消除活性病毒和病毒載體。
第二MCCS包括至少兩個層析管柱，至少兩個層析膜，或者至少一個層析管柱與至少一個層析膜，以及出口。例如，第二MCCS可包括總共四個層析管柱，三個層析管柱與一個層析膜，或本文所述的任何其他的例示性MCCS，或者可以具有本文所述的MCCS的任何例示性特徵(以任意組合)中的一個或多個。存在於第二MCCS中的一個或多個層析管柱和/或一個或多個層析膜可具有以下的一種或多種：本文所述的任何形狀、尺寸、體積(床體積)和/或單元操作。包含於在第二MCCS中存在的一個或多個層析管柱和/或一個或多個層析膜中的一個或多個中的樹脂可以是利用捕獲機制(例如，蛋白A結合捕獲機制、蛋白質G結合捕獲機制、抗體或抗體片段結合捕獲機制、底物結合捕獲機制、輔因子結合捕獲機制、標簽結合捕獲機制、和/或適配體結合捕獲機制)的樹脂。有用的樹脂包括，例如，陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂、分子篩樹脂、和疏水性相互作用樹脂。存在於第二MCCS中的一個或多個層析管柱和/或層析膜可含有相同的和/或不同的樹脂(例如，本文所述的或本領域已知的用於重組蛋白質純化的任何樹脂)。
存在於第二MCCS中的一個或多個層析管柱和/或一個或多個層析膜可進行一個或多個單元操作(例如，本文所述的任何單元操作或本文所述的 單元操作的任何組合)。在非限制性例子中，第二MCCS可進行從流體中純化重組治療性蛋白質並且精處理存在於含有重組治療性蛋白質的流體中的重組治療性蛋白質的單元操作。在其他非限制性例子中，第二MCCS可以進行純化存在於流體中的重組治療性蛋白質、精處理存在於流體中的重組治療性蛋白質、以及過濾含有重組治療性蛋白質的流體的單元操作。在另一個例子中，第二MCCS可以進行純化存在於流體中的重組治療性蛋白質、精處理存在於流體中的重組治療性蛋白質、過濾含有重組治療性蛋白質的流體、以及調節含有重組治療性蛋白質的流體的離子濃度和/或pH的單元操作。第二MCCS可進行本文描述的或本領域已知的兩個或更多個單元操作的任何組合。
第二MCCS還可包括一個或多個(例如，兩個、三個、四個或五個)泵(例如，自動化的，例如自動蠕動泵)。
存在於第二MCCS中的一個或多個層析管柱和/或一個或多個層析膜可以通過切換機制(例如，柱切換機制)相對於彼此連接或移動。柱切換事件可以通過經紅外光譜量測檢測重組治療性蛋白質或其他物質的水平，並使用如上所述的化學計量模型對其進行分析以確定經過第二MCCS的流體(例如，進入和/或來自第二MCCS中的一個或多個層析管柱和/或層析膜中的一個或多個的輸入和/或溶離物)中的重組治療性蛋白質的水平、特定的液體(例如緩衝液)體積或特定的經過時間來觸發。
形成第二MCCS的PCCS 8可含有三個管柱(進行從流體中純化重組治療性蛋白質的單元操作)和一個層析膜(進行精處理在流體中存在的重組治療性蛋白質的單元操作)。例如，進行從流體中純化重組治療性蛋白質的單元操作的三個管柱可含有例如陽離子交換樹脂，並且進行精處理的單元操作的層析膜可含有陽離子交換樹脂。PCCS(也就是第二MCCS)可以使用柱切換機制。例如，PCCS可利用能夠運行多至例如四個、五個、六個、七個或八個管柱、或者更多管柱的改變的ÄKTA系統(GE Healthcare，皮斯卡塔韋，新澤西州)
與第一MCCS類似，第二MCCS也可配備：一個或多個(例如，兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個)紅外光譜量測系統， 一個或多個(例如，兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個)閥，一個或多個(例如，兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、或十個)pH計，和/或一個或多個(例如，兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個)電導率計。一個或多個量測系統將量測的流體中的蛋白質或其他物質的濃度信息傳輸到控制器，該控制器使用濃度信息來確定是否觸發柱切換事件。第二MCCS可配備由接收濃度信息的控制器執行的操作系統，其利用軟體(例如，基於Unicorn的軟體，GE Healthcare，皮斯卡塔韋，新澤西州)來確定何時應該發生管柱切換事件(例如，基於紅外光譜量測、液體體積或經過時間)並啟動管柱切換事件。在第二MCCS包括一個或多個紅外光譜量測系統的例子中，量測系統可任選地放置在第二MCCS中的一個或多個層析管柱和/或一個或多個層析膜中的一個或多個(例如，兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個)的入口處，和/或在第二MCCS中的一個或多個層析管柱和/或一個或多個層析膜中的一個或多個的出口處。
第二MCCS還可以包括一個或多個(例如，兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、十三個、十四個、十五個、十六個、十七個、十八個、十九個、二十個、二十一個、二十二個、二十三個或二十四個)在線緩衝液調節儲器和/或緩衝液儲器。在其他例子中，第二MCCS可包括一個或多個(例如，兩個、三個、四個、五個或六個)斷流槽(例如，本文所述的任何斷流槽)，其可容納不能容易地進入第二MCCS中的一個或多個層析管柱和/或層析膜的流體。
第二MCCS包括出口，治療性蛋白質藥品可以通過出口離開系統。出口可包括，例如，允許插入流體導管的螺紋、肋材或密封件，或設計用於容納或儲存治療性蛋白質藥品的小瓶。出口可含有可用於將無菌小瓶或其他此類儲存容器密封在出口上的表面，以允許重組蛋白質藥品直接流入無菌小瓶或儲存容器中。
如本文所公開的一個或多個紅外光譜量測系統也可以被定位為量測流出出口的蛋白質藥品(或另一種物質)的濃度。該信息可被傳輸至MCCS控制器，該控制器可以基於該信息確定該物質的純度。
本文描述的系統還可包括設置在第一MCCS與第二MCCS之間的流體導管。可沿流體導管設置一個或多個紅外光譜量測系統，以確定有關容納於(例如流動通過)導管內的流體的信息(例如濃度信息)。該信息可被傳輸至MCCS控制器，該控制器如上所述可以基於該信息確定是否啟動柱切換事件。
本文所述的任何流體導管可以是例如由例如聚乙烯、聚碳酸酯或塑料製成的管。設置在第一MCCS與第二MCCS之間的流體導管還可以包括以下任何組合中的一個或多個：一個或多個在線緩衝液調節儲器，其與流體導管處於流體連通並且被定位為使得儲存於一個或多個在線緩衝液調節儲器中的緩衝液被添加到存在於流體導管中的流體中；斷流槽(例如，本文所述的任何一個或多個斷流槽)，其與流體導管處於流體連通並且被定位為使得其可以容納存在於流體導管中的不能容易地進料到第二MCCS的任何多餘流體；以及一個或多個過濾器，其被設置於流體導管中使得它們能夠過濾(例如，除去細菌)存在於流體導管中的流體。任何在線緩衝液調節儲器可含有例如體積在約0.5L與50L之間的緩衝液(例如，在溫度為50℃、37℃、25℃、15℃或10℃，或者更低的溫度下)。
本文所述的系統可任選地包括設置在第二MCCS中的最終層析管柱或層析膜與出口之間的流體導管。本文所述的系統還可以包括一個或多個過濾器，其與設置在第二MCCS中的最終層析管柱或層析膜與出口之間的流體導管處於流體連接，使得過濾器可以除去例如沉澱材料、顆粒物或者來自存在於流體導管中的流體中的細菌，該流體導管設置在第二MCCS中的最終層析管柱或層析膜與出口之間。
本文提供的系統的一些例子還包括與第一MCCS的入口處於流體連接的生物反應器。本文描述的或本領域已知的任何例示性生物反應器均可用於本系統中。
本文提供的系統的一些例子還包括泵系統。泵系統可包括以下中的一個或多個：一個或多個(例如，兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個)泵(例如，本文所述的或本領域已知的任何泵)，一個或多個(例如，兩個、三個、四個或五個)過濾器(例如，本文所述的 或本領域已知的任何過濾器)，一個或多個(例如，兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個)UV檢測器，以及一個或多個(例如，兩個、三個、四個或五個)斷流槽(例如，本文所述的任何斷流槽)。本文提供的系統的一些例子還包括設置在泵與第一MCCS的入口之間的流體導管(例如，本文所述的或本領域已知的任何例示性流體導管)。在一些例子中，該特定流體導管可包括一個或多個(例如，兩個、三個或四個)泵(例如，本文所述的或本領域已知的任何泵)和/或一個或多個(例如，兩個、三個或四個)斷流槽(例如，本文所述的任何例示性斷流槽)，其中這些泵和/或斷流槽與存在於流體導管中的流體處於流體連接。
本文所述的系統的一些例子還包括連接到泵與入口之間的流體導管的另外的流體導管，其中另外的流體導管的一端流體地連接到生物反應器，且另一端流體地連接到泵與入口之間的流體導管。該另外的流體導管可包括過濾器，該過濾器能夠從取自生物反應器(例如，ATF細胞保留系統)的液體培養基中除去細胞。
前述生物製造系統允許連續生產治療性蛋白質藥品。例如，本文提供的系統允許重組治療性蛋白質(自起始材料，例如起始液體培養基)的產率百分比大於約70%、大於約80%、大於約82%、大於約84%、大於約86%、大於約88%、大於約90%、大於約92%、大於約94%、大於約96%、或大於約98%。本文所述的系統還可導致重組治療性蛋白質(自起始材料，例如起始液體培養基)的產率百分比為約80%至約90%之間、約82%至約90%之間、約84%至約90%之間、約84%至約88%之間、約84%至約94%之間、約82%至約92%之間、或約85%至約95%之間。
本文描述的系統還可導致如下治療性蛋白質藥品的產生，其含有的重組治療性蛋白質的濃度大於約1.0mg/mL，例如，大於約15mg/mL、大於約20mg/mL、大於約25mg/mL、大於約30mg/mL、大於約35mg/mL、大於約40mg/mL、大於約45mg/mL、大於約50mg/mL、大於約55mg/mL、大於約60mg/mL、大於約65mg/mL、大於約70mg/mL、大於約75mg/mL、大於約80mg/mL、大於約85mg/mL、大於約90mg/mL、大於約100mg/mL、大於約125mg/mL、或大於約150mg/mL。
如上所述，在一些實施例中，第一和/或第二MCCS可以是週期性逆流層析系統(PCCS)。PCCS可以例如包括兩個或更多個層析管柱(例如，三個柱或四個管柱)，將其切換以允許從兩個或更多個層析管柱連續溶離重組治療性蛋白質。PCCS可包括兩個或更多個層析管柱，兩個或更多個層析膜，或者至少一個層析管柱與至少一個層析膜。管柱操作通常由加載、洗滌、溶離以及再生步驟組成。在PCCS中，將多個管柱用於以循環方式離散地且連續地運行相同的步驟。由於管柱是串聯操作的，因此經過一個管柱的流和來自該管柱的洗液由另一個管柱捕獲。PCCS的這種獨特特徵允許樹脂的加載接近其靜態結合能力而不是動態結合能力，這在批量模式層析過程中是典型的。
用於含有三個管柱的PCCS中的三管柱切換技術的實例顯示於圖11。一個循環被定義為三個完整的管柱操作，其產生來自柱切換技術中使用的三個管柱中的各個的溶離池。一旦完成循環中的所有步驟，循環重新開始。由於連續循環與溶離，進入PCCS的流體被連續地處理，而重組治療性蛋白質從各個管柱的溶離是離散的和週期性的。
為了從PCCS循環中的一個步驟前進到另一個步驟，正如圖11中所顯示的例示性循環，採用管柱切換策略。管柱切換方法在圖11所顯示的例示性PCCS系統的三管柱中採用每管柱兩個自動切換操作，其中第一個與初始產品穿透有關，而第二個與管柱飽和相符。確定何時應發生管柱切換操作是基於有關在來自PCCS的各個層析管柱的溶離物中重組治療性蛋白質的濃度的信息。
如以上所討論的，本文公開的紅外光譜量測系統可用於確定來自PCCS管柱的溶離物中重組治療性蛋白質的濃度。濃度信息，其作為生物製造系統的反饋控制而發揮作用，被傳輸至MCCS控制器，該控制器在確定開關被授權之後啟動管柱切換。
例如，在管柱加載期間，該PCC控制系統可以使用上面討論的紅外光譜量測系統確定從管柱溶離的治療性蛋白質物質的基線濃度(其通常為零濃度)。在活性物溶離期間，當蛋白質物質穿透時，量測的蛋白質濃度增加(例如，高於基線濃度)。系統繼續監測漸增的蛋白質濃度，並且當濃度 達到預定的閾值時，來自管柱1的流被引導到管柱2上而不是到廢棄物。名義上，這發生在時間t1。
隨著繼續向管柱1內進料，管柱1最終幾乎被蛋白質產品飽和。此時，量測的溶離物中蛋白質濃度已達到另一個預定值，其發生在時間t2。此時，MCCS控制器將入口進料切換到管柱2。
無論進料產品濃度和容量如何，上述管柱切換策略都允許對管柱進行均勻加載。可以基於檢測到的在來自各個管柱的溶離物中的重組蛋白水平實施管柱的類似開關。管柱開關還可以基於通過第一或第二MCCS中的一個或多個層析管柱和/或層析膜的流體(例如，緩衝液)的經過時間或量。
本文公開的量測系統除了提供反饋信息以控制管柱切換事件之外，還可以提供用於調節各種其他生物製造步驟和操作參數的反饋信息。此類調節的一個例子是在生物製造過程的各個階段控制性調節緩衝液濃度。
通常，在本文所述的任何過程中使用兩個或更多個MCCS期間，可採用一個或多個(例如，三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、十三個、十四個、十五個、十六個、十七個、十八個、十九個、二十個、二十一個、二十二個、二十三個或二十四個)不同類型的緩衝液。如本領域已知的，在本文所述的方法中使用的用於兩個或更多個MCCS中的一種或多種類型的緩衝液將取決於：存在於該兩個或更多個MCCS(例如，第一MCCS和第二MCCS)的一個或多個層析管柱和/或一個或多個層析膜中的樹脂，重組治療性蛋白質，和單元操作(例如，本文所述的任何例示性單元操作)-其通過該兩個或更多個MCCS的特定的一個或多個層析管柱和/或一個或多個層析膜進行。在本文所述的任何過程中使用兩個或更多個MCCS期間，所採用的緩衝液的體積和類型也可以由本領域技術人員確定(例如，下面將更詳細地討論)。例如，可以選擇在本文所述的任何過程中使用兩個或更多個MCCS期間所採用的緩衝液的體積和一個或多個類型，以優化重組蛋白質藥物產品中的以下中的一個或多個：重組治療性蛋白質的總產量、重組治療性蛋白質的活性、重組治療性蛋白質的純度水平、以及從含有重組治療性蛋白質的流體中除去生物污染物(例如，不存在活性病毒、分枝桿菌、酵母菌、細菌或哺乳動物細胞)。
調節含有重組治療性蛋白質的流體的離子濃度和/或pH的單元操作可以使用MCCS(例如，第一和/或第二MCCS)來進行，該MCCS包括並利用緩衝液調節儲器(例如，在線緩衝液調節儲器)以將新的或另外的緩衝溶液添加到含有重組治療性蛋白質的流體中(例如在單個MCCS中的管柱之間，或在倒數第二個MCCS(例如第一MCCS)中的最後一個管柱之後並且在將含有重組治療性蛋白質的流體進料到下一個MCCS(例如第二MCCS)的第一個管柱之前。在線緩衝液調節儲器可以是任何尺寸(例如，大於100mL)並且可以含有任何緩衝溶液(例如具有以下中的一個或多個的緩衝溶液：與含有重組治療性蛋白質的流體相比升高或降低的pH；與含有重組治療性蛋白質的流體相比增加或減少的離子(例如鹽)濃度；和/或增加或減少的試劑濃度，該試劑與重組治療性蛋白質競爭地結合於存在於MCCS(例如第一或第二MCCS)的至少一個層析管柱或至少一個層析膜中的樹脂)。
在一些實施例中，MCCS控制器確定添加到過程流體中的緩衝溶液的量是基於有關從如前面所討論的進行紅外光譜量測得到的過程流體組分的濃度信息。例如，用於此類量測的溶質可以是緩衝溶液組分或過程流體組分，其濃度與流體緩衝液組成、過程流體的pH、和/或過程流體的離子強度有關。將組分的濃度信息的量測作為反饋信息提供給MCCS控制器，其使用反饋信息來確定將一種或多種緩衝溶液在何時和以多少量排放到過程流體中。紅外光譜量測系統通常可以定位在生物製造系統中的任何位置，用於量測過程流體以向MCCS控制器提供與緩衝液相關的反饋信息。
在某些實施例中，過程流體的抗體濃度信息可用於控制將細胞培養物引入生物反應器的速率。具體而言，通過確定從生物反應器收穫的過程流體中的抗體濃度值，MCCS控制器可以調節細胞培養物流出到生物反應器中的速率。以這種方式的調節允許控制源自生物反應器的細胞密度和比生產率的容積生產率。對於固定的灌注速率，此類調節允許控制過程流體中的抗體濃度，使得MCCS 1每單位時間將接收大致恒定量的產品。換言之，調節這種性質可用於確保生物反應器內的產品生成速率在特定時間段內保持近似恒定。
在一些實施例中，與過程流體相關的某些質量屬性的確定可由MCCS 控制器使用以確定生物製造系統是否在可接受的參數範圍內操作，或者在操作期間，系統是否在一個或多個可接受的參數範圍之外。
對於一個或多個質量屬性中的各個，可通過校準程序建立可接受的值的範圍。這些範圍有效地為系統建立了操作條件，在該操作條件下生物產品以可接受的速率和純度水平產生，而副產品及其他不希望的物質的產量處於可接受的低水平。當系統在一個或多個範圍之外操作時，產品產量和/或純度可能會降低，不希望的物質產生的速率/量可能會增加，試劑消耗速率可能會增加，和/或其他不希望的效果或情況可能發生。
在系統內的一個或多個位置處為過程流體確定的質量屬性可用於確保系統在這些操作參數的可接受範圍內操作。如果一個或多個質量屬性的確定值落在確立的可接受範圍之外，則MCCS控制器識別出存在潛在的故障狀況。
為了解決故障狀況，MCCS控制器(或連接至MCCS控制器的另一個系統控制器)能夠調節生物製造系統的任何操作參數以修改其操作，從而也調節質量屬性值，使得它們落在可接受的範圍內。這種性質的糾正措施確保了基於由確定的質量屬性值提供的反饋，系統能夠主動地保持在確立的一組或一系列操作條件內。
在某些實施例中，如果MCCS控制器(或連接至MCCS控制器的另一個系統控制器)確定系統離其可接受的操作條件範圍太遠以致於將系統返回到可接受的條件範圍會是困難的或者甚至不可能的，或者會導致其他不希望的後果，則控制器可將控制信號傳輸至生物反應器以中止生產並將其內容物排放到廢棄物中。在此類案例中，生產過程偏離系統的可接受的操作條件範圍太遠，有效的糾正措施是不切實際或不可能的。通過簡單地排出生物反應器的內容物，系統可以通過重新開始生產過程節省相當多的時間，而不是試圖調節可能已經無可挽回地偏離可接受的條件範圍的正在進行的生產過程。
此外，可以基於一種或多種生物反應器培養基組分(例如葡萄糖濃度、麩醯胺酸濃度、乳酸濃度和銨離子濃度)的量測值向MCCS控制器(或另一種系統控制器)提供反饋，然後該控制器可用於調節反應器條件以確保細 胞活力、產品產量以及其他性能指標被維持在目標範圍內。控制器可以基於生物反應器培養基組分的值，以類似於基於產品質量屬性和其他量測的量值實行的調節的方式調節任何一個或多個過程參數。
提供以下實例以進一步說明前述公開文本的各個方面，但除非另有明確說明，否則不只在以另外的方式限制申請專利範圍的任何特徵，或限制實施例的任何方面。
為評估本文公開的方法和系統，使用ATR幾何結構和偏最小二乘多元數據分析的FTIR光譜被用於開發化學計量模型，以使用單組(多屬性產品質量(MAP-Q)振動光譜信息快速且準確地確定多種過程物理和化學屬性。使用離線參考測定(層析和ELISA)分析來自抗體藥物候選物X在多個收穫日的蛋白A純化樣品的濃度、聚集體、電荷變體分佈以及宿主細胞蛋白(HCP)含量，並且相同的樣品經受FTIR ATR量測。使用來自離線參考測定和FTIR ATR紅外光譜信息響應的數據，以通過使用PLS多元數據分析來構建化學計量模型，並且對模型進行交叉驗證以評估其準確性。
蛋白A純化的、內部產生的抗體藥物候選物X的收穫樣品被用於此研究。使用的單株抗體是IgG4亞類，並表達於中國倉鼠卵巢細胞(CHO)哺乳動物表達系統中。從交替切向流灌注生物反應器在不同培養日獲得收穫的樣品(26個樣品)。使用AKTA Explorer系統(可購自GE Healthcare Life Sciences公司，匹茲堡市，賓夕法尼亞州)，用填充了MabSelectSuRe LX樹脂的0.66cm×20cm I.D.(6.8mL)蛋白A柱來純化收穫物。
使用配備有IN350T®金剛石ATR(衰減總反射)光纖探頭和MCT(碲鎘汞)感測器的Bruker MATRIX-MF®FTIR(Bruker Optics公司，比勒利卡市，馬薩諸塞州)光譜儀進行樣品的在線量測。將約50mL的各樣品置於ATR金剛石晶體上，並使用Bruker OPUS採集軟體(可購自Bruker Optics公司，比勒利卡市，馬薩諸塞州)量測波數範圍在400cm-1到4000cm-1中的光譜(掃描速度10kHz，分辨率2cm-1，並且每次運行32次掃描)。首先使用構建在 探針上的空白ATR池記錄參考光譜。獲得所有樣品的單束光譜，並將其與空氣的背景光譜分開，從而以吸光度單位顯示光譜。
對紅外振動信息進行預處理，並使用MATLAB計算軟體(可購自MathWorks公司，納蒂克，馬薩諸塞州)和unscrambler camo軟體(CAMO Software股份有限公司，33300埃及巷，馬格諾利亞市，德克薩斯州)構建各個感興趣的屬性的化學計量偏最小二乘(PLS)模型。在預處理期間，首先使用800-1800cm-1之間的平均吸光度值抵消FTIR光譜，然後進行基線校正和面積歸一化。評估了若干預處理方法，諸如線性偏移減法、直線減法、矢量歸一化、最小-最大歸一化、多元散射校正、一階導數和二階導數，以改善交叉驗證的均方根誤差(RMSECV)和PLS模型的測定係數(R2)。在構建PLS模型時，將各個屬性的離線層析/基於ELISA的參考量測與預處理的FTIR ATR光譜數據相關聯。
為了確保校準模型的驗證，將交叉驗證方法應用於20個蛋白A純化樣品，其中使用k折交叉驗證來驗證樣品的各個FTIR ATR光譜，在交叉驗證中數據集被分成k個子集，並且對k折模型進行了訓練和測試。每次，將k個子集中的一個用作測試集，並且合併其他k-1個子集以形成訓練集。計算所有k次試驗的平均誤差。優化了對應於各個屬性值的波數(或頻率)範圍，以實現最佳的多元統計。
還使用了離線層析和ELISA測定來測試樣品的抗體濃度、聚集體、電荷變體分佈以及宿主細胞蛋白(HCP)含量以產生參考值。在Agilent 1100 HPLC系統(可購自Agilent Technologies公司，聖克拉拉市，加利福尼亞州)上通過蛋白A層析使用0.21×3cm I.D.(0.1mL)POROS蛋白A ID管柱(可購自Applied Biosystems公司，福斯特市，加利福尼亞州)量測了抗體濃度，然後在280nm下對溶離物進行UV量測。在Agilent 1100 HPLC系統上通過尺寸排阻層析(SEC)使用配備有0.60×4cm I.D.TSK膠G3000SWXL防護柱的0.78×30cm I.D.TSK膠G3000SWXL分析型SEC柱(可購自Tosoh Bioscience公司，普魯士王市，賓夕法尼亞州)分析了樣品中抗體的聚集形式的百分比。將150mM氯化鈉中的40mM磷酸鈉溶離緩衝液以等度模式使用，然後使用光電二極管陣列檢測器檢測在280nm下的UV吸光度。使用來自Cygnus technologies 公司(可購於倫瑟姆市，馬薩諸塞州)的中國倉鼠卵巢細胞HCP ELISA試劑盒根據製造商的手冊量測樣品的HCP含量。以三種稀釋度製備樣品，然後對各樣品進行多次量測。
使用iCE3TM系統(可購自ProteinSimple公司，聖何塞市，加利福尼亞州)通過毛細管等電聚焦(cIEF)分析樣品中抗體的電荷變體分佈。在甲基纖維素載體兩性電解質中製備了各樣品，並允許在電解條件下基於它們的pI分離電荷變體(酸性與鹼性物質)。使用iCE3TM系統的內置全管柱UV檢測器獲取電荷變體的相對分佈。
在蛋白質分子的紅外光譜中，分子的化學結構起主要的作用，其通過振動鍵的強度和振動原子的質量確定觀察到的振動頻率。但是，由於通常存在於光譜中的許多重疊帶，純粹基於紅外光譜可能難以明確地確定蛋白質的化學結構。
儘管如此，往往可以基於觀察到的光譜帶的變化來檢測分子的化學結構的變化。一個這樣的例子是檢測蛋白質側鏈的質子化態的變化，其對於蛋白質功能往往是必要的。許多蛋白質側鏈的質子化態反映在蛋白質的紅外光譜中，並且經常可以從紅外光譜信息中可靠地推斷出。
蛋白A純化抗體樣品的FTIR ATR光譜顯示於圖12，其中醯胺I(1600-1690cm-1)和醯胺II(1480-1575cm-1)的特徵帶清晰可辨。醯胺I帶由於肽骨架的C=O伸縮振動對蛋白質的α-螺旋、β-折疊、轉角和無序構象及其氫鍵環境敏感。醯胺II起源於N-H彎曲和C-N伸縮振動，並且它是構象敏感的。
在一些情況下，醯胺II帶對應於NH面內彎曲模式和CN伸縮模式的異相組合，來自CO面內彎曲模式和CC與NC伸縮模式的貢獻較小。在蛋白質中，醯胺II帶通常幾乎不受側鏈振動的影響，但蛋白質二級結構與頻率之間的相關性不如醯胺I帶的簡單，這有助於使蛋白質的副產品相關並為該蛋白質提供有價值的結構信息和二級結構預測。
1300-1400cm-1之間的醯胺III帶是由於面內N-H彎曲以及C-N伸縮。醯胺IV帶是由若干個坐標位移的混合物產生的非常複雜的帶，由於O=C-N變形，這些坐標位移主要發生在625-725cm-1。二級結構中氫鍵合的強度和肽在不 同轉換偶極子之間的偶聯影響此區域中的吸收頻率，並且可用於從實驗光譜數據中量化蛋白質。
在生物樣品中，各個構象實體都貢獻於分子的FTIR ATR光譜。醯胺I帶輪廓線是由若干個重疊的組分帶組成的複雜複合物，這些組分帶代表不同的結構元件，例如α螺旋、β折疊、轉角、和無序或不規則結構。
為了提取在那些FTIR帶中編碼的組成結構信息，使用頻率範圍從1100到1595cm-1和1600到1700cm-1中的FTIR光譜信息，從而用二階導數均值中心化的FTIR ATR光譜計算PLS標度，其中排除緩衝液組分和水產生的吸光度。使用具有抗體藥物候選物X的20個蛋白A純化樣品的k折交叉驗證方法構建PLS模型。還分析了模型的過度訓練，並評估了模型的穩健性。
圖13是顯示從針對抗體濃度的PLS模型計算的預測抗體濃度值以及相應的所量測抗體濃度值的圖。PLS模型顯示出FTIR ATR預測值與基於離線層析的參考值之間的優異的相關性。相關係數R2為0.99，且交叉驗證的均方根誤差(RMSECV)為0.55。通過使用開發的校準模型預測6個未知樣品的抗體濃度來評估模型的準確性。未知樣品U-1至U-6的結果顯示於圖17的表中。
蛋白質錯誤折疊的聚集現象可導致FTIR ATR光譜中關鍵醯胺峰的漂移。結果是，使用帶窄化傅立葉自反卷積技術來估計離散子組分吸收帶的FTIR範圍和位置。傅立葉自反卷積減小帶寬，允許使用高斯函數分離重疊的組分帶。
由於不同的疏水性環境，聚集蛋白的振動頻率降至1620-1625cm-1附近，並且往往顯示醯胺II的頻率漂移(約1540cm-1)。因此，選擇1393-1554cm-1和1600-1635cm-1的FTIR區域來開發校準模型。此外，由於蛋白質的C-O-H振動，選擇1180-844cm-1的FTIR區域以提高預測準確性。圖14A顯示蛋白A純化樣品的傅裡葉自去卷積FTIR光譜的實例。
圖14B是顯示針對聚集(實線)和量測的聚集值(點)而開發的PLS校準模型的圖。參考SEC值，PLS校準模型在FTIR預測的聚集值(%)之間顯示出優異的相關性。RMSECV、R2和相對百分比差異(RDP)的值分別為0.04、0.97和5.8。
為諸如HCP的低濃度物質構建穩健的化學計量模型的挑戰之一是培養基中高分子電解質的影響。已知在約1,390cm-1和1005-110cm-1處出現的峰可歸於高分子電解質。圖15A顯示了一組用於構建HCP的PLS模型的均值中心化的、基線校正的且面積平均化的二階導數FTIR ATR光譜。
為了開發用於HCP定量測定的PLS模型，使用範圍在1500-1600cm-1、1600-1680cm-1、1489-1414cm-1和1174-1286cm-1的中紅外(mid-IR)區域頻率。所有光譜均為均值中心化的、基線校正的且面積平均化的，如圖15A所示。
圖15B是顯示用於HCP定量測定的模型(實線)與量測的HCP值(點)的圖。觀察到相當好的相關性，其中R2=0.89，RMSECV=71.1，且RPD=3.05。
為評估用於確定電荷變體分佈的PLS模型，使用20個樣品對樣品的預處理FTIR ATR光譜針對主峰前(酸性)物質、主峰物質和主峰後(鹼性)物質進行k折交叉驗證，以分別構建三個獨立的模型。評估了模型的過度訓練和穩健性。電荷變體的分析在很大程度上取決於C-末端離胺酸修飾，其導致光譜圖案主要在1000到1850cm-1的指紋區域中漂移。因此，使用經過多次散射校正與從1118cm-1到1500cm-1的二階導數分析的均值中心化光譜來構建主峰的PLS模型，顯示於圖16B中(實線)。主峰模型的PLS統計數據包括0.99的R2，0.001的RMSECV，以及12.4的RPD。
對於主峰前物質分析，使用高達10的PLS等級，從1120cm-1到1470cm-1的FTIR區域產生最佳PLS校準模型。該模型顯示於圖16A。RMSECV、R2和RPD的值分別為0.00125、0.9937和12.6。
對於主峰後物質分析，使用從1187cm-1到1839cm-1的FTIR區域構建PLS模型，顯示於圖16C的圖上。從參考cIEF方法中實現了與量測值的優良的相關性。RMSECV、R2和RPD的值為0.00118、99.59和15.7。還通過預測6個未知樣品U-1至U-6的電荷變體分佈來評估模型的準確性，其結果顯示於圖17中。
為了評價使用在線紅外光譜量測和化學計量模型準確確定生物反應器培養基組分與條件的值的有效性，本文公開的方法用於量測葡萄糖濃度、 麩醯胺酸濃度、IgG濃度、乳酸濃度、氨濃度以及摩爾滲透壓濃度。具體地，在反應器培養基上進行在線ATR紅外光譜量測，並且使用針對這些量中的每一個的經驗證的化學計量模型來預測來自紅外光譜量測的各量的值。為了確定紅外衍生值的準確性，還對反應器培養基進行手動取樣，並通過單獨分析確定各量的值。
圖21A-21F是顯示生物反應器培養基的葡萄糖濃度(圖21A)、麩醯胺酸濃度(圖21B)、IgG濃度(圖21C)、乳酸濃度(圖21D)、銨離子濃度(圖21E)、以及摩爾滲透壓濃度(圖21F)的“真實”值(菱形標記)與預測(或紅外衍生的)值(實線)的圖。對於各個量測的量，真實值與預測值之間的良好一致性得以實現。
圖22A-22D是顯示葡萄糖濃度(圖22A)、收穫效價(圖22B)、乳酸濃度(圖22C)和銨離子濃度(圖22D)的真實(菱形標記)值與預測(點標記)值的圖。對於各真實值，從多個紅外光譜量測中確定了多個預測值，並且圖22A-22D中的點標記的分佈表明基於紅外光譜信息預測的值的可變性。儘管在各個圖中出現相對少量的異常值，但是大多數單獨預測的值與各種量的真實值非常一致，並且各組紅外確定的值的分佈與對應的真實值一致。
圖23A-23C是顯示在生物反應器培養基的後期階段(在第42和43天)葡萄糖濃度(圖23A)、乳酸濃度(圖23B)和銨離子濃度(圖23C)的真實(大點)值與預測(即，紅外測定的，小點)值的圖。從圖中可以明顯看出，這些量的紅外測定值與真實值持續保持一致，證明依賴於紅外光譜信息來確定多種不同培養基組分相關量值的基於化學計量學的方法仍然是高度準確的，即使細胞培養和培養基在相對長的時間後繼續產生產品也是如此。
Claims (30)
- 一種方法，其包括：獲得生物製造系統中的溶液的振動光譜；使用第一化學計量模型分析該振動光譜以確定與該溶液相關的第一質量屬性值；使用第二化學計量模型分析該振動光譜以確定與該溶液相關的第二質量屬性值；並且基於該第一質量屬性值和該第二質量屬性值中的至少一個來調節該生物製造系統的純化單元的至少一個參數。
- 如請求項1的方法，其還包括使用該生物製造系統生產以下中的至少一種：基於蛋白質的治療物質，其包含蛋白質、肽、抗體和酶中的至少一種；基於核酸的藥品，其包含DNA、質體、寡核苷酸、適配體、DNA酶、RNA適配體、RNA誘餌、微小RNA片段和小干擾RNA片段中的至少一種；和基因療法藥品。
- 如請求項1的方法，其中對於由該生物製造系統生產的生物產品，該第一質量屬性和該第二質量屬性各自獨立地選自產品質量屬性、產品相關雜質和過程相關雜質。
- 如請求項1的方法，其中獲得該振動光譜包括引導輻射入射到該溶液上並量測來自該溶液的衰減全反射輻射。
- 如請求項7的方法，其還包括當該溶液相對於輻射窗口流動時量測來自該溶液的衰減全反射輻射。
- 如請求項1的方法，其中該第一化學計量模型包括與該第一質量屬性相關的第一組主要振動組分。
- 如請求項6的方法，其中使用該第一化學計量模型分析該振動光譜包括基於該第一組主要振動組分計算該第一質量屬性值。
- 如請求項7的方法，其中該第一組主要振動組分和該第二組主要振動組分沒有共同的成員。
- 如請求項1的方法，其中該溶液包括從該生物製造系統的純化單元排出的溶液。
- 如請求項9的方法，其還包括純化該純化單元中的該溶液，然後獲得該溶液的該振動光譜。
- 如請求項1的方法，其還包括當該溶液在該生物製造系統的第一純化單元與第二純化單元之間流動時，通過量測來自該溶液的輻射來獲得該振動光譜。
- 如請求項1的方法，其還包括在該溶液流出該生物製造系統的最終純化單元之後通過量測來自該溶液的輻射來獲得該振動光譜。
- 如請求項1的方法，其中該溶液是第一溶液，該方法還包括：獲得該生物製造系統中的第二溶液的振動光譜；使用該第一化學計量模型分析該第二溶液的振動光譜，以確定該第二溶液的第一質量屬性值；並且使用該第二化學計量模型分析該第二溶液的振動光譜，以確定該第二溶液的第二質量屬性值，其中該第一溶液在該生物製造系統的第一純化單元與第二純化單元之間流動，並且該第二溶液在該生物製造系統的該第二純化單元與第三純化單元之間流動。
- 如請求項13的方法，其還包括基於該第一溶液的第一質量屬性值和第二質量屬性值與該第二溶液的第一質量屬性值和第二質量屬性值中的至少一個來調節該至少一個參數。
- 如請求項1的方法，其中該第一質量屬性和該第二質量屬性中的至少一個選自：濃度、聚集體、電荷變體分佈、純度、聚糖譜、同一性、完整性、蛋白質片段、核酸片段、核酸變體、空殼體、載體雜質、宿主細胞蛋白、殘留宿主DNA、殘留管柱配體、雜質濃度、雜質量、殘留輔助病毒、殘留輔助病毒蛋白、以及殘留輔助病毒DNA。
- 一種生物製造系統，其包括：生物反應器，其被配置為生產包含生物產品的溶液；純化單元，其被配置為接收該溶液；輻射源，其被配置為引導輻射入射在該溶液上；檢測裝置，其被配置為量測來自該溶液的輻射；和系統控制器，其連接至該生物反應器和該檢測裝置，並被配置為：接收來自該檢測裝置的量測信號，該量測信號對應於有關該溶液的振動光譜的信息；使用第一化學計量模型分析該信息以確定與該溶液相關的第一質量屬性值；使用第二化學計量模型分析該信息以確定與該溶液相關的第二質量屬性值；並且基於該第一質量屬性值和該第二質量屬性值中的至少一個來調節該純化單元的至少一個參數。
- 如請求項16的系統，其還包括流動池，該流動池被定位為使該溶液通過該流動池，並且當該溶液處於該流動池中時該輻射源引導該輻射入射到該溶液上。
- 如請求項16的系統，其中該生物產品包括下列中至少一種：基於蛋白質的治療物質，其包含蛋白質、肽、抗體和酶中的至少一種；基於核酸的藥品，其包含DNA、質體、寡核苷酸、適配體、DNA酶、RNA適配體、RNA誘餌、微小RNA片段和小干擾RNA片段中的至少一種；和基因療法藥品。
- 如請求項16的系統，其中對於由該生物製造系統生產的生物產品，該第一質量屬性和該第二質量屬性各自獨立地選自產品質量屬性、產品相關雜質和過程相關雜質。
- 如請求項17的系統，其中該檢測器包括全內反射感測器，該全內反射感測器被配置為量測來自該溶液的衰減全反射輻射。
- 如請求項20的系統，其中該全內反射感測器與該流動池的一部分整合式。
- 如請求項16的系統，其中該第一化學計量模型包括與該第一質量屬性相關的第一組主要振動組分。
- 如請求項22的系統，其中該控制器被配置為使用該第一化學計量模型、通過基於該第一組主要振動組分計算該第一質量屬性值來分析該振動光譜。
- 如請求項22的系統，其中該第二化學計量模型包括與該第一質量屬性相關的第二組主要振動組分。
- 如請求項24的系統，其中該第一組主要振動組分和該第二組主要振動組分沒有共同的成員。
- 如請求項24的系統，其中該控制器被配置為使用該第二化學計量模型、通過基於該第二組主要振動組分計算該第二質量屬性值來分析該振動光譜。
- 如請求項55的系統，其中該溶液包括從該純化單元中排出的溶液，並且其中該控制器連接至該純化單元並被配置為純化該純化單元中的該溶液，然後獲得有關該溶液的振動光譜的信息。
- 如請求項16的系統，其中該純化單元是該系統的第一純化單元，並且該系統還包括：第二純化單元，其被配置為接收該溶液，其中，當溶液在該第一純化單元與該第二純化單元之間流動時，該檢測裝置被定位為量測來自該溶液的輻射。
- 如請求項28的系統，其中該第一純化單元和該第二純化單元各自包括層析管柱。
- 如請求項16的系統，其中該純化單元是該系統的最終純化單元。
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