TW201944071A - 一種用於診斷胃癌的方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種利用生物標記診斷胃癌的方法，包含步驟(1) 取得一個體的血液檢體；(2 )檢測該檢體中的性荷爾蒙結合球蛋白（sex hormone-binding globulin，SHBG）濃度；及(3) 判斷該檢體中的SHBG含量，其中該檢體中的SHBG濃度高於一對照SHBG濃度，則該個體具有胃癌。

Description

一種用於診斷胃癌的方法

本發明係有關於一種診斷胃癌的方法之領域，特別是關於利用血液中的生物標記來診斷胃癌的方法之領域。

2012年，胃癌是世界前五大癌症之一。男性獲得胃癌的機率是女性的兩倍。GC也是導致癌症死亡的第三大原因，2012年造成約800,000人死亡。目前胃癌的治療策略，在胃癌第一期至第三期的五年存活率約30%，而第四期的五年存活率甚至僅小於5%。

為了降低胃癌造成的社會負擔，在胃癌高發生率的亞洲國家，如日本及南韓，會預先篩檢胃癌。在1960年代，日本已大規模地使用鋇劑造影及內視鏡，在全國進行胃癌篩檢，且宣稱降低了50%的胃癌致死率。而在南韓，也開始建立40歲以上的國民進行兩年一次的胃癌篩檢。

然而鋇劑造影或是內視鏡是屬於侵入式的檢測方法，不但費用昂貴，而且需要有經驗的放射科醫師及內視鏡醫師。因此這些方法不太適合資源有限的國家。

再者，使用這些方法進行胃癌大規模的篩檢，成本效益並不好，特別是一些胃癌發生率並不高的地區。因此發展便宜、簡單、低侵入性、靈敏、及專一的篩檢工具便很重要。而「血液生物標記」便具有上述優勢。

然而，胃癌在臨床可用的血液生物標記數量非常有限。目前並沒有建議使用的早期胃癌診斷之血液生物標記。雖然有一些指數，例如血清胃蛋白酶原、血清癌胚抗原、CA125指數等等可用於胃癌的管理，然而這些生物標記的靈敏度及專一性具高度變異性，常會影響判斷。

目前越來越多研究利用蛋白質體學的方法來發展合適的血液生物標記，因為蛋白質體學可呈現基因體及環境之間的動態關聯，且與疾病的發病機制有直接的關聯。故本發明利用蛋白質體學的技術來研發新穎的血液胃癌生物標記。

本發明的目的在於利用蛋白質體的技術發展一適合的血液胃癌生物標記，且該生物標記經驗證和確認步驟，證實為一有效且靈敏的胃癌早期診斷之血液生物標記。

為達上述目的，本發明採取以下技術予以達成。本發明提供一種胃癌檢測套組，包含：一檢測性荷爾蒙結合球蛋白（sex hormone-binding globulin，SHBG）濃度的試劑及一對照品，其中該對照品來自於一非胃癌樣本。

該檢測SHBG濃度的試劑為ELISA檢測試劑或免疫墨點法檢測試劑。

本發明另提供一種診斷胃癌的方法，包含下列步驟： (1) 取得一個體的血液檢體；(2) 檢測該檢體中的SHBG蛋白表現量；及(3) 比較該檢體中的SHBG蛋白表現量，與一對照品之SHBG蛋白表現量，其中該檢體之SHBG蛋白表現量高於該對照品之SHBG蛋白表現量，則該個體具有胃癌。

該SHBG包含一SEQ ID NO：1胺基酸序列IALGGLLFPASNLR。

該血液檢體包含血漿、血清、全血、或其組合；較佳的，該血液檢體為血漿。

該檢體中的SHBG蛋白表現量為該對照組樣本之SHBG蛋白表現量至少1.5倍。較佳地，該檢體中的SHBG蛋白表現量為該對照組樣本之SHBG蛋白表現量的2倍或更多。

本發明所提供的方法可於本發明所提供的檢測套組中使用。該方法包含步驟：(1) 取得一個體的血液檢體；(2) 利用該檢測SHBG表現量的試劑檢測該檢體中的SHBG蛋白表現量；及(3) 比較該檢體與該對照品中的SHBG表現量，其中該檢體之SHBG表係量高於該對照品之SHBG表現量，則該個體具有胃癌。

該血液檢體包含血漿、血清、全血、或其組合；較佳的，該血液檢體為血漿。

該SHBG包含一SEQ ID NO：1胺基酸序列IALGGLLFPASNLR。

本發明透過蛋白質體學的方法，經過驗證和確認（verification & validation），以ELISA量測SHBG的表現量，確效SHBG為一可早期診斷胃癌的血液生物標記。

本發明另可使用胃部組織做為診斷胃癌的測試檢體。

實驗設計

本發明從76個胃癌患者和86個健康的人取得血液樣本。胃癌患者年紀為40-90；胃癌種類為adenocarcinomatous類型。全部的樣本分成三個獨立的群組：篩選（Discovery）、驗證（verification）、確認（validation）。篩選群組（cohort）：依據病患的年紀、病程、和性別選擇24位病患，並分成四個不同期數的組別（group），每期數組別有6位，每組別男女比為2:1。對照組則有六位男性及三位女性。驗證群組：有24位病患及九位對照組對象，利用西方墨點法驗證候選血液生物標記。確認群組：包含50位病患（其中22位年紀不大於60歲的病患係來自於篩選群組及驗證群組）及68位對照組對象，利用ELISA對在驗證群組驗證過的血液生物標記做確認。實驗概要設計如圖1所示。

蛋白濃度測定

在本實施例，利用Pierce BCA試驗來定量蛋白濃度。每個樣本及BSA皆做三重複。將樣本及BSA分別與100μ L反應試劑混和，然後於37°C環境下培育30分鐘。ELISA讀取機以562 nm波長讀取樣本。利用BSA製作線性標準曲線，將樣本OD值代入該標準曲線公式計算出樣本的欲測蛋白濃度。

白蛋白的免疫消耗（ Immunodepletion of albumin ）

在本實施例，利用HSA CaptureSelect^TM Proteomics Depletion Product來耗竭白蛋白（albumin）。取病患及健康對象400μ g血漿蛋白樣本分別懸浮於50μ L PBS，然後與100μ L HSA抗體混和，再旋轉搖晃培育於4°C一小時。將培育完的混和物移到Multi-spin separation column kit，以13,500g 在4°C離心一分鐘，然後收取白蛋白消耗的血漿樣本。為了確認白蛋白消耗的效率，將原始的樣本與白蛋白消耗後的樣本並排同時跑SDS-PAGE。結果如圖2，可看到白蛋白已完全被耗竭掉。

蛋白質酶解消化

在本實施例，利用In-Solution Tryptic Digestion and Guanidination Kit 將白蛋白消耗後的樣本消化成胜肽。在還原步驟，混和15μ L的消化緩衝液、1.5μ L的還原緩衝液、及3μ L的白蛋白耗竭後樣本。以超純水調整混和物至27μ L然後於95°C培育5分鐘。取3μ L含有碘乙醯胺的烷化緩衝液（alkylation buffer）加入該混和物，並在室溫下避光培育20分鐘。在消化步驟，將1μ L活化胰蛋白酶加入該混和物，然後在37°C培育3小時。接著再加1μ L活化胰蛋白酶並再培育於30°C整夜。最終混和物為32μ L。

之後使用ZipTip C18微量管柱（ZTC18S960， Merck Millipore,，California）進行脫鹽處理，避免蛋白質酶解消化後的樣本裡多餘的鹽類干擾後續的質譜分析。

LC-MS/MS

將胜肽樣本注入捕捉管柱，接著在層析管柱（25 cm x 75μ m i.d. BEH130 C18）中分離；移動相梯度：120分鐘內移動相由0%增加至85%（buffer A：0.1%甲酸水溶液；buffer B：0.1%甲酸乙腈溶液）；流速：300nL/min。

接著利用Orbitrap質譜儀捕捉訊號前十大強的胜肽離子。全掃描正離子模式；掃瞄範圍：m/z 350-1600；解析度：240,000。所有Orbitrap測量皆是在lock mass背景下執行，以獲得較高準確度。

蛋白質鑑定

使用PEAKS Studio分析Orbitrap原始資料。在蛋白資料庫Uniprot-Human搜尋並鑑定質譜分析結果的蛋白質。利用非標記定量（Label-free quantification，LFQ）量化蛋白質強度。

蛋白質分離

利用SDS-PAGE分離原始血漿中的蛋白質。

免疫墨點法

在驗證群組（validation cohort）1利用免疫墨點法個別測定血漿四種蛋白質的表現量：Apolipoprotein C1（APOC1）、gelsolin（GSN）、SHBG、及complement component C4-A（C4A）。最後測出每一個樣本中該四種蛋白表現量。

ELISA

用Human SHBG Quantikine ELISA Kit對SHBG做確認。

數據分析

以Mann–WhitneyU -test分析在對照組跟胃癌患者組別的蛋白質來自LFQ及免疫墨點法相對的豐度/強度。利用Kruskal–Wallis分析在四個不同期別患者組別及三個不同年齡組別的墨點訊號。計算透過ELISA測量出來的血漿SHBG表現量的平均標準差。

結果

全部的操作對象分成三個獨立的群組，用於生物標記的尋找。表格1為每個實驗群組受試者 的特徵資料。 表格1 個實驗群組受試者特徵資料

候選生物標記的篩選（ Discovery ）

本發明在Discovery群組中的24位胃癌病患及9位健康對象的血液中檢測生物標記，特別是血漿中的生物標記。每個血漿樣本在經白蛋白消耗後便進行胰蛋白酶消化，之後去鹽處理，然後跑LS-MS/MS。24位胃癌病患及9位健康對象的LS-MS/MS原始資料匯入PEAKS 7軟體﹐以LFQ作分析。結果發現，病患組質譜訊號較高的四個蛋白質（C4A、GSN、SHBG、及APOC1），其熱區圖也有相對較密集的豐度，如圖3所示。

驗證（ Verification ）

對驗證群組（Verification cohort）的血液樣本中APOC1、GSN、SHBG、及C4A做西方墨點法定量，以確認MS的分析結果。本實施例選擇了對照組中SHBG濃度最低的樣本作為比較基準。在四個蛋白質中，只有SHBG蛋白一致地在驗證群組的病患組中有高表現量（如圖4所示）。從圖4A到圖4D可得知只有SHBG蛋白在對照組及病患組有顯著的表現量差異，且病患組中的SHBG表現量為對照組的至少1.5倍，因此挑選SHBG做進一步的確認。將病患依照胃癌期數分成第一期至第四期，如圖4E結果顯示，SHBG在四個期數中的表現量皆高於對照組。因此初步確認了SHBG可做為胃癌檢測的生物標記。

ELISA 確認血液中 SHBG 的表現（ Validation ）

在Discovery群組以及驗證群組的胃癌病患，其SHBG蛋白在血漿中的表現量有一致的高表現量。因此，本實施例在確認群組（Validation cohort）中（對照組：68位；病患組：50位），利用ELISA的絕對定量測量血漿SHBG的濃度。而最近發現女性SHBG的表現量在六十歲前有逐漸下降的趨勢，然後在六十歲時穩定上升，而男性的SHBG表現量則是會隨著年紀增加而上升。本確認實施例將ELISA的結果依照性別及年齡分層，且只有年紀不大於60歲的對象會被算入，這是為了要降低變因。根據驗證群組的資料（平均值及標準差）執行先驗測試（A Priori test）。先驗測試條件設定：calculated Effect size d = 1.1316042；α err prob = 0.05；Power (1-β err prob) = 0.95。這些數值可以確保每個群組至少有22個樣本列入分析，成為一個有效的分析。

胃癌患者的血液SHBG濃度大約是對照組的兩倍之多（如圖5A所示）。經過年齡分層（20-40歲，以及41-60歲），SHBG濃度在兩個年齡層的病患組別中表現量依舊維持顯著高（如圖5B所示）。而以性別分組的話，SHBG濃度分別在男女病患組別也都有顯著的高表現量（如圖5C所示）。最後確認，相較於對照組，SHBG濃度在每一個胃癌期數也都有顯著的高表現量，但SHBG濃度並不會隨著胃癌期數增加而提高（如圖5D所示）。

經過上述的詳細說明，已充分顯示本發明具有實施的進步性，且為前所未見的新發明，完全符合發明專利要件，爰依法提出申請。惟以上所述僅為本發明的較佳實施例，當不能用以限定本創作實施的範圍，亦即依本創發明專利範圍所作的均等變化與修飾，皆應屬於本發明專利涵蓋的範圍內。

圖1所示為本發明之實驗設計概要。

圖2所示為白蛋白消 耗前後比較圖，N11d、N6Fd、P2d、P42d：白蛋白消耗後樣本；N11、N6F、P2、P42：原始樣本。

圖3所示為C4A、GSN、SHBG、及APOC1相較於參考基準的熱區圖。

圖4所示為APOC1、GSN、SHBG、及C4A在病患組及對照組的西方墨點法結果圖；A：APOC1在病患組及對照組的墨點訊號強度；B：GSN在病患組及對照組的墨點訊號強度；C：SHBG在病患組及對照組的墨點訊號強度；D：C4A在病患組及對照組的墨點訊號強度；E：SHBG在四個胃癌期數別與對照組的西方墨點圖。

圖5所示為確認群組中以ELISA分析SHBG表現量的結果圖；A：胃癌患者與對照組的SHBG表現量比較；B：年齡分層的胃癌患者與對照組的SHBG表現量比較；C：性別分組的胃癌患者與對照組的SHBG表現量比較；D：四個胃癌期數別與對照組的SHBG表現量比較。

＜110＞ 台北醫學大學 ＜120＞ 一種用於診斷胃癌的方法 ＜130＞ 1071007 ＜160＞ 1 ＜170＞ PatentIn version 3.5 ＜210＞ 1 ＜211＞ 14 ＜212＞ PRT ＜213＞ Homo sapiens ＜400＞ 1 Ile Ala Leu Gly Gly Leu Leu Phe Pro Ala Ser Asn Leu Arg 1 5 10

Claims (9)

1. 一種胃癌檢測套組，包含：一檢測性荷爾蒙結合球蛋白（sex hormone-binding globulin，SHBG）蛋白表現量的試劑及一對照組品，其中該對照組品來自一非胃癌樣本。
2. 一種診斷胃癌的方法， 包含下列步驟： (1) 取得一個體的一血液檢體； (2) 檢測該血液檢體中的性荷爾蒙結合球蛋白（sex hormone-binding globulin，SHBG）的表現量；以及 (3) 比較該血液檢體中的SHBG表現量，與一對照品之SHBG表現量，其中該血液檢體之SHBG表現量高於該對照品之SHBG表現量，則該個體具有胃癌，其中該對照品來自一非胃癌個體之樣本。
3. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該SHBG包含一SEQ ID NO：1胺基酸序列IALGGLLFPASNLR。
4. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該血液檢體包含血漿、血清、全血、或其組合。
5. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該步驟(2)之檢測方法包含免疫墨點法及/或ELISA。
6. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該血液檢體中的SHBG表現量為該對照品之SHBG表現量至少1.5倍。
7. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該步驟(1)及(3)之個體為人類。
8. 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中該人類之年齡不大於60歲。
9. 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中該人類之性別為同性別。