TW201914596A - 腸道益生菌用於製備抑制大腸直腸癌細胞遷移的醫藥組合物的用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種腸道益生菌用於製備預防大腸直腸癌復發的醫藥組合物的用途，其中該醫藥組合物包含該腸道益生菌以及一藥學上可接受之載劑；該腸道益生菌為Butyricicoccus pullicaecorum 。藉由腸道益生菌以達成有效降低大腸直腸癌復發的功效。

Description

腸道益生菌用於製備預防大腸直腸癌復發的醫藥組合物的用途
本發明係涉及一種腸道益生菌的用途，特別是指腸道益生菌用於製備預防大腸直腸癌復發的藥物的用途。
大腸直腸癌(colorectal cancer，CRC)是一種常見的胃腸道腫瘤，全世界每年診斷出數百萬新發生的病例。儘管治療大腸直腸癌患者的方法有所進展，但接受治癒性切除術(curative resection)的患者中，仍然約20-45%的患者腫瘤復發或腫瘤轉移。因此，大腸直腸癌復發與不良之預後有密切相關。
近年來，不同的臨床特徵或血清標誌物被鑑定作為評估術後早期復發和預後較差的危險因子。其中，發炎和血管新生的機制可能是造成較多大腸直腸癌復發的原因，而循環腫瘤細胞(Circulating tumor cell，CTC)的分子標記，可以作為大腸直腸癌復發風險的預後因子。人類糞便中的基因與大腸直腸癌有相關聯，部分基因在癌症生物學或分子醫學中具有其分子意義。而位於大腸直腸癌復發患者的糞便中生長休止基因-2 (growth arrest specific 2，GAS2)被發現大量表現，並且顯示可作為化療的標靶基因。此外，關於胎盤特異性基因8 (Placenta Specific 8，PLAC8)被報導參與大腸直腸癌中的上皮變間質型的轉換(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)。目前基礎醫學對於大腸直腸癌的分子機轉似乎有部分的了解，然而截至目前仍無有效抑制大腸直腸癌、也無有效避免大腸直腸癌復發的藥物或方法。
有鑑於此，如何發展出能有效抑制大腸直腸癌、降低大腸直腸癌復發的藥物，實為各相關學者與業者積極研究開發之目標。
為了克服現有技術之缺點，本發明的目的在於提供一種腸道益生菌用於製備預防大腸直腸癌復發的醫藥組合物的用途，以達成有效降低大腸直腸癌復發的功效。
為達到上述之發明目的，本發明提供一種腸道益生菌用於製備預防大腸直腸癌復發的醫藥組合物的用途，其中該醫藥組合物包含該腸道益生菌以及一藥學上可接受之載劑；該腸道益生菌為丁酸梭菌(Butyricicoccus pullicaecorum )。
較佳的，所述之醫藥組合物的劑型係口服劑型。
較佳的，所述之口服劑型係溶液、乳劑、懸浮液、粉末、錠劑、丸劑、口含錠、片劑、口嚼膠或膠囊。
較佳的，所述之大腸直腸癌，其形成途徑包含活化PLAC8基因與蛋白質、活化增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)基因、活化Ki-67基因或其組合。
本發明所述之「早期大腸直腸癌」，是指美國癌症聯合委員會(American Joint Committee on Cancer，AJCC)大腸直腸癌第1期或第2期。
本發明所述之「晚期大腸直腸癌」，是指AJCC大腸直腸癌第3期或第4期。
較佳的，所述之Butyricicoccus pullicaecorum 的代謝產物包含丁酸或其鹽類。
本發明的醫藥組合物係可利用熟習此技藝者所詳知的技術，將上述的腸道益生菌與一藥學上可接受之載劑製備成一適用本發明之劑型。其中本發明所述之「醫藥上可接受之載劑」包含，但不限於水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氫化合物(hydrocarbons)[諸如石油膠(petroleum jelly)以及白凡士林(white petrolatum)]、蠟(wax)[諸如石蠟(paraffin)以及黃蠟(yellow wax)]、保存劑(preserving agents)、抗氧化劑(antioxidants)、溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤滑劑(lubricant)、吸收增強劑(absorption enhancers)、活性劑(active agents)、保濕劑(humectants)、氣味吸收劑(odor absorbers)、香料(fragrances)、pH調整劑(pH adjusting agents)、閉塞劑(occlusive agents)、軟化劑(emollients)、增稠劑(thickeners)、助溶劑(solubilizing agents)、滲透增強劑(penetration enhancers)、抗刺激劑(anti-irritants)、著色劑(colorants)、推進劑(propellants)表面活性劑(surfactant)，及其他類似或適用本發明之載劑。
本發明亦合理預期餵食實驗動物Butyricicoccus pullicaecorum 亦具有抑制大腸直腸癌復發。
本發明的優點在於本創作之藉由Butyricicoccus pullicaecorum 或其代謝產物施予大腸直腸癌細胞，抑制大腸直腸癌細胞的生長與遷移，以達成抑制大腸直腸癌與預防大腸直腸癌復發的機率；同時亦能抑制PLAC8基因與蛋白質表現、與抑制增殖相關基因PCNA和Ki-67的基因表現，
以下配合圖式及本發明之較佳實施例，進一步闡述本發明為達成目的所採取的技術手段。
實施例1、不同時期大腸直腸癌患者糞便中Butyricicoccus pullicaecorum 的變化
(1)取兩名大腸直腸癌第0期(原位癌)患者的糞便(病患05、病患01)、兩名大腸直腸癌早期(AJCC第2期)患者的糞便(病患23、病患15)、三名大腸直腸癌晚期(AJCC第3期或第4期)患者的糞便(病患14、病患12、病患11)利用次世代定序(Next Generation Sequencing，NGS)以16S rDNA進行菌種分析；其中大腸直腸癌晚期的患者中，具有大腸直腸癌早期又復發的患者。
如圖1所示，非括號的百分比代表該名患者糞便中Butyricicoccus pullicaecorum 佔所有微生物群的百分比，括號內的百分比代表該名患者糞便中Butyricicoccus pullicaecorum 佔7位患者總Butyricicoccus pullicaecorum 數量的百分比。診斷為第0期患者糞便中Butyricicoccus pullicaecorum 佔7人中的比例為22%與43%、第2期患者糞便中Butyricicoccus pullicaecorum 佔7人中的比例為16%與8%、第3/4期患者糞便中Butyricicoccus pullicaecorum 佔7人中的比例為5%、1%與8%。值得注意的是，三名晚期患者在糞便中具有最少量Butyricicoccus pullicaecorum 菌群。
(2)取三名大腸直腸癌第2期患者的糞便、十名大腸直腸癌第3期或第4期患者的糞便利用次世代定序(Next Generation Sequencing，NGS)以16S rDNA進行分析，並以Metastats分析來自大腸直腸癌患者腸道微生物群(microflora)的科、屬及種數量；其中大腸直腸癌第3期或第4期的患者中，具有大腸直腸癌第2期又復發的患者。 表1、比較於不同期別大腸直腸癌患者糞便中Butyricicoccus pullicaecorum 菌數的差異
如上表1所示，在操作分類單元(Operational taxonomic unit，OTU)顯示的所有細菌群中，第3期患者糞便中的Butyricicoccus pullicaecorum 僅佔第2期患者糞便的49.0%，差異具有統計學意義(P =0.032)。因此，大腸直腸癌後期患者糞便中Butyricicoccus pullicaecorum 的減少與大腸直腸癌腫瘤生長有關。
實施例2、腸道菌群代謝產物與結腸細胞PLAC8關聯
為了確定在大腸直腸癌第3期患者的糞便中丁酸鹽生產者Butyricicoccus pullicaecorum 顯著減少的原因，實驗以5 mM NaB處理人類大腸癌細胞株SW620(美國典型培養物保藏中心，American Type Culture Collection，ATCC CRL-1831；AJCC第3期，培養基為依據ATCC建議使用；SW620是SW480同一捐贈者在手術治療後一年復發再捐贈培養而得) 24小時，並分析PLAC8的信使核糖核酸(messenger RNA，mRNA)與蛋白質。
(A)分析PLAC8 mRNA實驗分為對照組與實驗組(5 mM NaB)，PLAC8 mRNA於美國國家衛生研究院(NCBI)中Accession number為NM_001130715，所屬領域具通常知識者可自行設計引子對，本發明選用市售羅氏universal probe library (UPL)第56號引子對，由於mRNA分析方法屬習知技藝，在此不再贅述。如圖2所示，相較於對照組(無施予5 mM NaB)，以5 mM NaB處理SW620細胞中PLAC8的mRNA顯著下降。
(B)從國家型核醣核酸干擾設施平臺(National RNAi Core Facility，中央研究院，臺灣)獲得目標基因為PLAC8的特異性慢病毒介導的小髮夾RNA (specific lentivirus-mediated small hairpin RNA) shPLAC8 (Clone ID：TRCN0000435105)、對應控制組載體shLUC (Clone ID：TRCN0000231719)，並分別感染入SW620細胞，成為shLUC-SW620與shPLAC8-SW620細胞。分析PLAC8蛋白質實驗分為第(1)組SW620細胞無施予NaB、第(2)組SW620細胞施予5 mM NaB 24小時、第(3)組shLUC-SW620細胞無施予NaB、第(4)組shLUC-SW620細胞施予5 mM NaB 24小時、第(5)組shPLAC8-SW620細胞無施予NaB、第(6)組shPLAC8-SW620細胞施予5 mM NaB 24小時。之後進行蛋白質分析，PLAC8蛋白質抗體、PARP蛋白質抗體為所屬領域具通常知識者可自行選用，由於蛋白質分析方法屬習知技藝，在此不再贅述。
請參閱圖3所示，以NaB處理SW620細胞或shLUC-SW620細胞，PLAC8的蛋白質皆顯著下降，且PARP蛋白質也皆呈現裂解PARP (cleaved PARP)形態；shPLAC8-SW620細胞無論有無施予NaB皆不表現PLAC8蛋白質，且皆未觀察到裂解PARP。因此，Butyricicoccus pullicaecorum 代謝產物丁酸鹽可抑制PLAC8蛋白質的表現。
實施例3、Butyricicoccus pullicaecorum 代謝產物與大腸直腸癌細胞生長的關係
以5 mM NaB施予一次於人類大腸癌細胞株SW480(ATCC CRL-1459；AJCC第2期；捐贈者當初在大腸直腸癌第2期時捐贈培養出來的)與SW620細胞持續24、48及72小時，並使用細胞計數器在不同的培養時間間隔後進行計數，並以第0小時細胞數做為基數以分析相對生長速率。
請參閱圖4所示，與沒有NaB處理的細胞相比，在NaB處理後，SW480和SW620細胞的數量都顯著減少，其中SW480細胞於第48小時相對生長率為34.7%、第72小時相對生長率為6.0%；其中SW620細胞於第48小時相對生長率為18.5%、第72小時相對生長率為2.8%，比SW480細胞更為顯著抑制。因此，Butyricicoccus pullicaecorum 代謝產物丁酸鹽可抑制大腸直腸癌細胞的生長，尤其是具晚期移轉性的癌細胞更為顯著。
實施例4、Butyricicoccus pullicaecorum 代謝產物與大腸直腸癌細胞遷移的關係
取SW620細胞培養於聚對苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate，PET)膜且具有孔洞尺寸為0.4 mm的插入小室(Millipore PIHT12R48)進行細胞遷移實驗，實驗分為對照組(無施予NaB)與實驗組(施予5 mM NaB)，分別於第30分鐘與第60分鐘以結晶紫染色後進行計數遷移的細胞數。遷移細胞的數量以平均值 ± 標準差進行統計。
如圖5所示，在5 mM NaB的存在下，通過插入小室的遷移細胞數明顯減少，尤其於第60分鐘的細胞相較於對照組具有顯著遷移的差異。因此，Butyricicoccus pullicaecorum 代謝產物丁酸鹽可抑制晚期大腸直腸癌細胞的遷移。
實施例5、Butyricicoccus pullicaecorum 代謝產物與大腸直腸癌細胞增殖相關基因的關係
(1) 取SW620細胞，實驗分為對照組(未施予NaB)、實驗組(施予5 mM NaB) 24小時，以對照組為基準分析實驗組PCNA與Ki-67 mRNA表現量。請參閱圖6所示，當用5mM NaB施予SW620細胞時，增殖相關基因PCNA和Ki-67的mRNA的表限量顯著下降。
(2) 取shPLAC8-SW620細胞，實驗分為對照組(未施予NaB)、實驗組(施予5 mM NaB) 24小時，以對照組為基準分析實驗組PCNA與Ki-67 mRNA表現量。請參閱圖7所示，當用5mM NaB施予shPLAC8-SW620細胞時，增殖相關基因PCNA和Ki-67的mRNA的表限量沒有顯著增減。
因此，Butyricicoccus pullicaecorum 代謝產物丁酸鹽可透過PLAC8、增殖相關基因抑制大腸直腸癌細胞的生長遷移。
根據本發明可作之不同修正及變化對於熟悉該項技術者而言均顯然不會偏離本發明的範圍與精神。雖然本發明已敘述特定的較佳具體事實，必須瞭解的是本發明不應被不當地限制於該等特定具體事實上。事實上，在實施本發明之已述模式方面，對於熟習該項技術者而言顯而易知之不同修正亦被涵蓋於下列申請專利範圍之內。
圖1為本發明之不同時期大腸直腸癌患者糞便中Butyricicoccus pullicaecorum 含量之圓餅圖。 圖2為本發明之有無施予丁酸鈉(sodium butyrate，NaB)於SW620細胞PLAC8 mRNA含量之柱狀圖；**表示P ＜0.01。 圖3為本發明之有無施予NaB於SW620細胞、shLUC-SW620細胞、shPLAC8-SW620細胞PLAC8、PARP、甘油醛-3-磷酸脫氫酶 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)之蛋白質電泳圖。 圖4為本發明之施予NaB於SW480細胞、SW620細胞於不同時間點之相對生長率柱狀圖。 圖5為本發明之有無施予NaB於SW620細胞於不同時間點之相對遷移細胞數的折線圖。 圖6為本發明之施予NaB於SW620細胞PCNA與Ki-67 mRNA表現比率的柱狀圖。 圖7為本發明之施予NaB於shPLAC8-SW620細胞PCNA與Ki-67 mRNA表現比率的柱狀圖。

Claims (4)

  1. 一種腸道益生菌用於製備預防大腸直腸癌復發的醫藥組合物的用途，其中該醫藥組合物包含該腸道益生菌以及一藥學上可接受之載劑；該腸道益生菌為Butyricicoccus pullicaecorum 。
  2. 如請求項1所述之用途，其中該醫藥組合物的劑型係口服劑型。
  3. 如請求項2所述之用途，其中該口服劑型係溶液、乳劑、懸浮液、粉末、錠劑、丸劑、口含錠、片劑、口嚼膠或膠囊。
  4. 如請求項1所述之用途，其中該大腸直腸癌形成途徑包含活化PLAC8基因與蛋白質。
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