TWI826032B - 腸道益生菌、腸道益生菌濾液和含丁酸化合物用於製備預防或治療膀胱癌和膀胱炎的產品之用途 - Google Patents

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張剛瑋
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Abstract

本發明提供一種腸道益生菌、腸道益生菌濾液和含丁酸化合物用於製備預防或治療膀胱癌和膀胱炎的產品之用途，其中該腸道益生菌包含丁酸梭菌。本發明發現提升腸道中的丁酸梭菌菌叢有助於提升GPR43蛋白、GPR109B蛋白和FABP4蛋白的表現量，進而達到預防或治療膀胱癌和膀胱炎之功效。本發明除可作為藥品外，亦可作為保健食品以提升國民健康。

Description

腸道益生菌、腸道益生菌濾液和含丁酸化合物用於製備預防或治療膀胱癌和膀胱炎的產品之用途
本發明係有關於製備預防或治療膀胱癌和預防或治療膀胱炎的產品之用途，尤其是包含腸道益生菌、腸道益生菌濾液或含丁酸化合物的產品。
膀胱癌好發於男性，依據衛生福利部2020年所發布之新聞，2017年男性新發癌症人數為59297人，並於10大癌症發生率順位中，膀胱癌排名第九，顯見膀胱癌對於國人身體健康的影響甚鉅。
膀胱癌的致病成因目前仍然不明，其潛在的致病危險因子包含：(1)吸煙；(2)長期接觸特定化學產品，導致尿液含有致癌物質，而致使膀胱黏膜發生病變；(3)膀胱慢性感染；(4)異物長期刺激，例如：膀胱結石或長期使用導尿管；和(5)血吸蟲寄生等。此外，膀胱癌的早期病徵包含血尿、頻尿、小便困難等，皆與尿道炎的症狀相似，從而導致患者容易輕忽而延誤治療時機。
最後，在逐步邁入高齡化社會之過程中，全球泌尿系統癌症的醫療負擔亦同步逐年增加，基於膀胱癌的致病成因不明、且及早發現以及早治療的策略較難落實，故膀胱癌的預防與治療將有其迫切需求。
為滿足上述需求，本發明提供一種腸道益生菌用於製備預防或治療膀胱癌的產品之用途，其中該腸道益生菌包含丁酸梭菌( Butyricicoccus pullicaecorum)。
依據本發明，儘管「腸道」與「膀胱」分屬獨立的器官，改善腸道微生物生態，尤其是丁酸梭菌菌叢，將有助於預防與治療膀胱癌。
較佳的，該預防或治療膀胱癌包含提升短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)相關蛋白之表現量、提升膀胱癌相關蛋白(bladder cancer-associated protein，BLCAP)之表現量、提升Fas配體、降低週期蛋白依賴性激酶1 (cyclin-dependent kinase 1，CDK1)之表現量及/或抑制膀胱癌細胞分裂。
較佳的，該短鏈脂肪酸相關蛋白包含GPR43蛋白、GPR109B蛋白和FABP4蛋白；其中該GPR43蛋白具有抗發炎活性；該GPR109B蛋白則可抑制脂質分解(lipolysis)，以避免釋出脂肪酸來供養癌細胞；該FABP4蛋白的表現量高於正常細胞的水準者，可抑制腫瘤增生。該膀胱癌相關蛋白係膀胱癌中與細胞凋亡相關的腫瘤抑制蛋白；該Fas配體為與調控細胞死亡有關的分子，可誘導細胞死亡；以及該週期蛋白依賴性激酶1可調控細胞分裂。
較佳的，該膀胱癌包含膀胱尿路上皮癌。
在一實施態樣中，該腸道益生菌的口服劑量為20毫克至100毫克，例如：20毫克、40毫克、60毫克、80毫克或100毫克。較佳的，該腸道益生菌的口服劑量為每日口服劑量。此外，所述口服劑量不計入載劑的重量。 在一實施態樣中，上述腸道益生菌的口服劑量或每日口服劑量為該腸道益生菌的乾重。
在一實施態樣中，該腸道益生菌的塞劑劑量為1*10 5菌落形成單位(Colony-forming unit，CFU)至1*10 8CFU，例如：1*10 5CFU、5*10 5CFU、1*10 6CFU、5*10 6CFU、1*10 7CFU、5*10 7CFU或1*10 8CFU。較佳的，該腸道益生菌的塞劑的給藥頻率為每週一次。
較佳的，本發明中的產品包含藥品、保健食品或食品。
依據本發明，該藥品可用於預防或治療膀胱癌；以及該保健食品或食品可提供予膀胱癌高危險群。
在一實施態樣中，該膀胱癌高危險群包含吸菸者、長期接觸化學產品者、膀胱慢性感染者、膀胱遭異物長期刺激者或遭血吸蟲寄生者。
較佳的，長期接觸化學產品者包含於化工廠工作者或使用染髮劑者。更佳的，所述化工廠工作者包含生產線上的工作人員。
較佳的，該膀胱癌高危險群為男性，例如：男性吸菸者、男性長期接觸化學產品者、男性膀胱慢性感染者、男性膀胱遭異物長期刺激者或男性遭血吸蟲寄生者。
本發明另提供一種腸道益生菌濾液用於製備預防或治療膀胱癌的產品之用途，其中該腸道益生菌包含丁酸梭菌( Butyricicoccus pullicaecorum)，且該腸道益生菌濾液包含短鏈脂肪酸，且該短鏈脂肪酸包含丁酸。
較佳的，該腸道益生菌濾液為以培養基培養該腸道益生菌後，經過濾去除該腸道益生菌後所得的液體。前述培養基可為BCRC培養基967 (BCRC medium 967)或PY-X培養液。
在一實施態樣中，該腸道益生菌濾液係以該培養基培養該腸道益生菌24小時至72小時，例如：24小時、30小時、36小時、42小時、48小時、54小時、60小時、66小時或72小時。
在一實施態樣中，該腸道益生菌濾液係以該培養基於25 ○C至50 ○C培養該腸道益生菌，例如：25 ○C、30 ○C、33 ○C、35 ○C、36 ○C、37 ○C、38 ○C、39 ○C、40 ○C、42 ○C、45 ○C、48 ○C 或 50 ○C。
較佳的，該腸道益生菌濾液所含該丁酸之濃度為0.05 mM至200 mM，例如：0.05 mM、0.1 mM、0.5 mM、1 mM、5 mM、10 mM、25 mM、50 mM、75 mM、100 mM、125 mM、150 mM、175 mM或200 mM。更佳的，該丁酸之濃度為2 mM至4 mM。
較佳的，以該短鏈脂肪酸之總重為基準，該丁酸之含量為80重量百分比至99重量百分比，例如：80重量百分比、85重量百分比、90重量百分比、95重量百分比或99重量百分比。
本發明另提供一種腸道益生菌用於製備預防或治療膀胱炎的產品之用途，其中該腸道益生菌包含丁酸梭菌( Butyricicoccus pullicaecorum)。
依據本發明，該腸道益生菌可提升膀胱組織中的短鏈脂肪酸相關蛋白之表現量，其中該短鏈脂肪酸相關蛋白包含具有抗發炎活性的GPR43蛋白。因此，本發明亦具有預防或治療膀胱炎的功效。
本發明另提供一種腸道益生菌濾液用於製備預防或治療膀胱炎的產品之用途，其中該腸道益生菌包含丁酸梭菌( Butyricicoccus pullicaecorum)，且該腸道益生菌濾液包含短鏈脂肪酸，且該短鏈脂肪酸包含丁酸。
本發明另提供一種含丁酸化合物用於製備預防或治療膀胱癌的產品之用途，其中該產品由活性成分和非活性成分所組成，該活性成分由該含丁酸化合物所組成，以及該非活性成分包含載劑。
較佳的，該含丁酸化合物包含丁酸或丁酸鹽。更佳的，該丁酸包含丁酸鈉。
較佳的，該含丁酸化合物之濃度為0.05 mM至200 mM。
本發明另提供一種含丁酸化合物用於製備預防或治療膀胱炎的產品之用途。
綜上可知，本發明所請的「腸道」益生菌、「腸道」益生菌濾液和含丁酸化合物不僅具有預防或抑制「膀胱癌」之功效，更有預防或治療「膀胱炎」之功效。基於本發明對於「膀胱」具有雙重保護作用，故利於提升國民健康。
以下提供數種操作方式，以便說明本發明之實施方式；熟習此技藝者可經由本說明書之內容輕易地了解本發明所能達成之優點與功效，並且於不悖離本發明之精神下進行各種修飾與變更，以施行或應用本發明之內容。
實施例1：丁酸梭菌對於小鼠膀胱的影響
發明人於台灣專利申請號106134924揭示丁酸梭菌( Butyricicoccus pullicaecorum)可調控短鏈脂肪酸載體蛋白(transporter)和受體(receptor)。為進一步了解丁酸梭菌存活於大腸中，是否將影響與大腸分屬獨立器官的膀胱，故本實驗進一步偵測膀胱樣品切片中的短鏈脂肪酸相關蛋白之表現量。
(一)菌液：
丁酸梭菌( Butyricicoccus pullicaecorum) (BCRC-81109)購自生物資源保存及研究中心(新竹，台灣)，並以BCRC培養基967(BCRC medium 967)在37 °C及厭氧條件下培養3天，以獲得菌液。
(二)實驗動物：
本實施例之實驗動物為4至6週齡的C3H/He雄性小鼠，購自國家實驗室動物中心(台灣)。所有實驗方法均獲國泰綜合醫院之機構動物照護和使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)核准，並盡最大努力以減少實驗動物之需求數量及其潛在的不適。
每個塑膠籠在無菌之條件下飼養3至5隻小鼠，且在各塑膠籠單獨通風的儲架系統(購自Tecniplast，義大利)中，濕度控制在50%±10%，光照時間為各12小時之光暗循環週期，溫度控制在23 °C±2 °C。
(三)實驗方法：
上述小鼠隨機分為兩組：(1)實驗組1：共4隻小鼠，且每隻小鼠每週從肛門注射100微升(µL)的菌液，亦即分別在第1天、第8天、第15天、第22天和第29天各注射一次菌液，共計5次，且該100微升菌液包含1*10 7CFU的丁酸梭菌；(2)控制組1：共4隻小鼠，未經任何施打處置(亦即無施打步驟)。所有實驗動物於第12天收集其糞便，以分析糞便中丁酸梭菌之含菌量，以及於第34天犧牲，並取其膀胱以製作石蠟包埋的切片樣本。
(四)各組糞便中丁酸梭菌相對含菌量分析：
採用微生物DNA qPCR分析(Microbial DNA qPCR Assays，BP00080A，購自Qiagen GmbH)以定量即時聚合酶鏈鎖反應，來分析實驗組1和控制組1於第12天收集所得糞便中的丁酸梭菌相對含菌量，並以控制組1糞便中的丁酸梭菌含菌量為依據進行正規化，比較結果如圖1。
從圖1可知，實驗組1糞便中丁酸梭菌的相對含菌量約為控制組1的5倍，可知丁酸梭菌確實存活於實驗組1的大腸(colon)中。
(四)免疫組織化學染色：
本實驗採用VECTASTAIN Elite ABC kit (Cat No. PK-6101，Vector Laboratories，美國)依據操作手冊針對短鏈脂肪酸相關蛋白，包含GPR43蛋白、GPR109B蛋白和FABP4蛋白，進行免疫組織化學染色。
首先，切片樣本於脫蠟後，依序於100%、90%和70%的乙醇中進行再濕潤。將再濕潤後的切片樣本浸泡於檸檬酸鹽緩衝液(10 mM，pH 6.0)中，以95 °C至99 °C之溫度煮20分鐘，再於25 °C 下冷卻20分鐘。為了去除內源性過氧化物酶的活性，以及阻斷潛在的非特異性結合位點，將切片樣本浸泡於含有3%過氧化氫的甲醇溶液中反應30分鐘，再於阻斷血清溶液(購自Vector Laboratories)中進行阻斷反應30分鐘。分別提供表1所示之初級抗體於4°C反應16小時。
表1：初級抗體、其與阻斷血清溶液(blocking serum solution)的體積比和供應商資訊
初級抗體 初級抗體與阻斷血清溶液的體積比 目錄號 供應商資訊
抗GPR43抗體 1:50 BS-13536R Bioss (美國)
抗GPR109B抗體 1:500 ABP-56889 Abbkine (中國)
抗FABP4抗體 1:25 15872-1-AP Proteintech (美國)
經Tris緩衝液洗滌數次後，添加二級抗體(生物素化的山羊抗兔IgG抗體，目錄號：BA-1000，購自Vector Laboratories)於25 °C反應半小時，其中，二級抗體添加量與阻斷液的體積比為1比200。所有短鏈脂肪酸相關蛋白以DAB Substrate Kit (目錄號：SK-4100，購自Vector Laboratories)進行呈色。此外，另以蘇木素對細胞核進行染色，並由病理學家進行分析，實驗結果說明如下。
圖2A、圖3A和圖4A分別為控制組1針對GPR43蛋白、GPR109B蛋白和FABP4蛋白的免疫組織化學染色照片；以及圖2B、圖3B和圖4B分別為實驗組1針對GPR43蛋白、GPR109B蛋白和FABP4蛋白的免疫組織化學染色照片；其中，紅框圈選處為膀胱切片組織的移形上皮(transitional epithelium)，箭頭所指處則係位於膀胱切片組織的固有層(lamina propria)。
從圖2A和圖2B、圖3A和圖3B，以及圖4A和圖4B的比較可知，實驗組1的移形上皮所得免疫組織化學染色結果的染色強度比控制組1高，此外，實驗組1的部分固有層亦可觀察到染色結果，並如箭頭所指處所示；可知，實驗組1的GPR43蛋白、GPR109B蛋白和FABP4蛋白的表現量確實高於控制組1。換句話說，儘管「大腸」和「膀胱」分屬獨立器官，存活於實驗組1的「大腸」中的丁酸梭菌確實可提升「膀胱」移形上皮和固有層中的短鏈脂肪酸相關蛋白，亦即GPR43蛋白、GPR109B蛋白和FABP4蛋白的表現量。
基於GPR43蛋白具有抗發炎活性，可知「大腸」中的丁酸梭菌具有提升「膀胱」抗發炎之功效；GPR109B蛋白則可抑制脂質分解(lipolysis)，以避免釋出脂肪酸來供養癌細胞，可知「大腸」中的丁酸梭菌具有預防供養「膀胱」癌細胞之膀胱癌預防或抑制功效；以及高於正常細胞的FABP4蛋白表現量可抑制腫瘤增生，可知「大腸」中的丁酸梭菌具有預防或抑制「膀胱癌」和「膀胱炎」的功效。
實施例2：丁酸梭菌的短鏈脂肪酸含量分析
本實施例的控制組2為PY-X培養液之原液；以及實驗組2係將丁酸梭菌以37 ○C培養於PY-X培養液48小時，藉由孔徑為0.2微米的濾網過濾去除丁酸梭菌後，所獲得的丁酸梭菌濾液。
採用氣相層析質譜儀(Gas chromatography-mass spectrometry)分析丁酸梭菌濾液和PY-X培養液的短鏈脂肪酸含量，結果如表2所示。
表2：各組的短鏈脂肪酸含量分析結果(單位：mM)
短鏈脂肪酸種類 控制組2 實驗組2
乙酸(acetate) 0.51 0.07
丙酸(propanoate) 0.02 0.03
丁酸(butyrate) 0.04 3.05
異丁酸(isobutyrate) 0.04 0.04
戊酸(valerate) ＜ 0.01 ＜ 0.01
異戊酸(isovalerate) 0.02 0.02
己酸(caproate) ＜ 0.01 0.01
庚酸(heptanoate) ＜ 0.01 ＜ 0.01
辛酸(caprylate) ＜ 0.01 ＜ 0.01
壬酸(nonanoate) ＜ 0.01 ＜ 0.01
癸酸(decanoate) ＜ 0.01 ＜ 0.01
從表2可知，在丁酸梭菌濾液中，短鏈脂肪酸含量最高者為丁酸，並增加了3.05/0.04=76.25倍。可知，丁酸梭菌確實可生產丁酸。此外，如將上述＜ 0.01 mM設為0.01 mM，則以短鏈脂肪酸之總重為基準，實驗組2的丁酸含量至少為93重量百分比。最後，實驗組2的PY-X培養液經以丁酸梭菌於37 ○C培養48小時後，乙酸的濃度已大幅降低，並低於0.1 mM，故研判丁酸梭菌濾液的功效來自於丁酸，而非乙酸。
實施例3：丁酸梭菌濾液對於膀胱尿路上皮癌細胞的影響
(一)膀胱尿路上皮癌細胞
在膀胱癌中，膀胱尿路上皮癌案例佔9成以上。因此，本實施例採用人類膀胱尿路上皮癌細胞株HT1376 (ATCC CRL-1472)，購自美國菌種中心(American Type Culture Collection，ATCC)，並於完全培養基中進行擴增培養，其中該完全培養基為添加10%胎牛血清的伊格爾最低限度必需培養基(Eagle’s Minimum Essential Medium)，並於37 °C和95%的空氣氣氛(含二氧化碳)的加濕培養箱中培養。
(二)實驗方法：
本實施例各組培養條件如表3所示，並採用MTT分析套組(目錄號：M5655，Merck KGaA)來測定膀胱尿路上皮癌細胞株HT1376(以下簡稱HT1376細胞)的生長情況，亦即待各組完成表3所示培養條件後，添加10 μL MTT試劑至各組HT1376細胞，並於黑暗中反應4小時。其後，添加100 μL二甲基亞碸以溶解紫色沉澱物，並以Synergy HT多功能微孔盤式光譜分析儀(BioTek Instruments)讀取各組於波長為540 nm之吸光值，以獲得各組HT1376細胞生長情況，結果如圖5所示。
表3：各組培養條件
組別 培養條件
控制組3-1 (一)培養基：完全培養基 (二)培養天數：0天
控制組3-2 (一)培養基：完全培養基 (二)培養天數：6天
實驗組3-1 (一)培養基： 混合5體積百分比的實施例2的丁酸梭菌濾液和95體積百分比的完全培養基的條件培養基。 (二)培養天數：6天
實驗組3-2 (一)培養基： 混合10體積百分比的實施例2的丁酸梭菌濾液和90體積百分比的完全培養基的條件培養基。 (二)培養天數：6天
從圖5可知，丁酸梭菌濾液確實可抑制膀胱尿路上皮癌細胞生長，並呈現劑量反應。換句話說，丁酸梭菌濾液所含的丁酸應可抑制膀胱尿路上皮癌細胞生長。
實施例4：丁酸鈉對於膀胱尿路上皮癌細胞的之影響
(一)丁酸鈉抑制膀胱尿路上皮癌細胞生長的IC 50濃度測定
本實施例採用MTT分析套組(目錄號：M5655，Merck KGaA)來測定膀胱尿路上皮癌細胞株HT1376(以下簡稱HT1376細胞)的存活率。首先，HT1376細胞在96孔盤中，以每孔1*10 4個細胞培養24小時，再分為6組：將HT1376細胞分別於含有丁酸鈉(sodium butyrate)濃度為0.05 mM、0.5 mM、5 mM、50 mM、100 mM和 200 mM的細胞培養液中培養72小時，每組3重複，以決定丁酸鈉抑制HT1376細胞生長的IC 50濃度，亦即待上述6組於含不同丁酸鈉濃度的細胞培養液中培養72小時後，添加10 μL MTT試劑至各組HT1376細胞，並於黑暗中反應4小時。其後，添加100 μL二甲基亞碸以溶解紫色沉澱物，並以Synergy HT多功能微孔盤式光譜分析儀(BioTek Instruments)讀取各組於波長為540 nm之吸光值，以獲得各組HT1376細胞存活率，結果如圖6所示。
從圖6可知，丁酸鈉確實可抑制膀胱尿路上皮癌細胞生長，並呈現劑量反應，且丁酸鈉抑制膀胱尿路上皮癌細胞生長的IC 50濃度為2.44 mM，亦即約為2.4 mM。
(三)丁酸鈉對於短鏈脂肪酸相關基因之影響
短鏈脂肪酸相關基因包含：GPR43、GPR109B和FABP4。本實驗包含：(1)實驗組4：將HT1376細胞培養於含2.4 mM丁酸鈉的完全培養基中72小時；和(2)控制組4：將HT1376細胞培養於完全培養基(不含丁酸鈉)中72小時，並透過LightCycler 96 (購自Roche Diagnostics GmbH)來進行定量聚合酶連鎖反應，以測定短鏈脂肪酸相關基因之表現，實驗步驟說明如下：
採用RNAzol RT (購自Molecular Research Center)來萃取實驗組4和控制組4的總RNA，並在存有寡聚胸腺嘧啶引子(oligo(dT) primers)的條件下，藉由High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (購自Thermo Fisher Scientific) 依產品說明書所示步驟將該RNA轉換為cDNA。
有關分別量化GPR43和GPR109B之cDNA之部份，需混合上述cDNA樣本、QuantiTect SYBR-Green PCR Master mix (購自Qiagen GmbH)、QuantiTect Primer assay (目錄號：Hs_FFAR2_1_SG，用於GPR43；以及目錄號：Hs_HCAR3_1_SG，用於GPR109B，皆購自Qiagen GmbH)和無核酸酶水依下述循環週期進行放大：於95 °C加熱10分鐘後，以95 °C加熱15秒為一週期循環40次，再於60 °C加熱1分鐘。
有關量化FABP4之cDNA之部份，TaqMan Gene Expression Assays係採用FABP4之通用探針組，其序列如表4所示，其中F表示正向(Forward)，R表示反向(Reverse)，並配合LightCycler TaqMan Master (購自Roche Diagnostics GmbH)和無核酸酶水依下述循環週期進行放大：於95 °C加熱10分鐘後，以95 °C加熱10秒為一週期循環60次，再於60 °C加熱20秒。GPR43、GPR109B和FABP4的mRNA濃度皆以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內部控制進行校正，其通用探針組的序列如表4所示。最後，以2-△△Cq方法進行mRNA定量分析，結果如圖7A至圖7C所示；其中，*表示 p＜ 0.05，以及*表示 p＜ 0.01。
表4：反轉錄定量PCR所用引子
基因 簡稱 登記 號碼 序列(5'→3') 通用探針編號
FABP4 NM_ 001442 F: CCACCATAAAGAGAAAACGAGAG (SEQ ID NO.1) R: GTGGAAGTGACGCCTTTCAT (SEQ ID NO.2) #31
GAPDH NM_ 002046 F: CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC (SEQ ID NO.3) R: ACGACCAAATCCGTTGACTC (SEQ ID NO.4) #60
註1：「登記號碼」來源：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene。 註2：「通用探針編號」來源：https://lifescience.roche.com/en_tw/brands/universal-probe-library.html。
從圖7A至圖7C可知，實驗組4因添加2.4 mM丁酸鈉，故相較於控制組4，實驗組4的GPR43的mRNA含量明顯提升11.4倍、GPR109B的mRNA含量明顯提升2.8倍，以及FABP4的mRNA含量明顯提升107.7/1.1=97.9倍，並與本案之實施例1所示染色結果一致。
(四)丁酸鈉對於膀胱癌相關蛋白和基因之影響
膀胱癌相關蛋白(bladder cancer-associated protein，BLCAP)係膀胱癌中與細胞凋亡相關的腫瘤抑制蛋白。
1. BLCAP蛋白的免疫組織化學染色分析：
將本案實施例1中的實驗組1和控制組1的切片樣本針對BLCAP進行免疫組織化學染色。所用初級抗體為抗BLCAP抗體(目錄號：PA5-38639，與阻斷液的體積比為1:10，購自Thermo Fisher Scientific，美國)，其餘步驟同本案實施例1，結果如圖8A和圖8B所示；其中，圖8A為控制組1針對BLCAP的免疫組織化學染色照片；以及圖8B為實驗組1針對BLCAP的免疫組織化學染色照片。
從圖8A和圖8B的比較可知，實驗組1的移形上皮所得免疫組織化學染色結果的染色強度比控制組1高，此外，實驗組1的部分固有層亦可觀察到染色結果，並如箭頭所指處所示；可知，實驗組1的BLCAP的表現量確實高於控制組1。換句話說，儘管「大腸」和「膀胱」分屬獨立器官，存活於實驗組1的「大腸」中的丁酸梭菌仍可提升「膀胱」移形上皮和固有層中的腫瘤抑制蛋白，亦即BLCAP的表現量。
2. BLCAP的基因表現分析：
將本案實施例4中的實驗組4和控制組4針對HT1376細胞中的BLCAP基因進行定量聚合酶連鎖反應，以測定HT1376細胞中的BLCAP的基因表現，實驗步驟同本案實施例4，差別在於BLCAP反轉錄定量PCR所用引子，如表5所示，並配合LightCycler TaqMan Master (購自Roche Diagnostics GmbH)和無核酸酶水依下述循環週期進行放大：於95 °C加熱10分鐘後，以95 °C加熱10秒為一週期循環60次，再於60 °C加熱20秒。HT1376細胞中的BLCAP基因的mRNA含量分析結果如圖8C所示；其中，*表示 p＜ 0.05。
表5：BLCAP反轉錄定量PCR所用引子
基因 簡稱 登記 號碼 序列(5'→3') 通用探針編號
BLCAP NM_ 006698 F: CGCCATGGTTCCAAGAAT (SEQ ID NO.5) R: CGCTTTCTTCAACCCTCACT (SEQ ID NO.6) #17
註1：「登記號碼」來源：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene。 註2：「通用探針編號」來源：https://lifescience.roche.com/en_tw/brands/universal-probe-library.html。
從圖8C可知，實驗組4因添加2.4 mM丁酸鈉，故相較於控制組4，實驗組4的BLCAP的mRNA含量明顯提升29.2倍，並與BLCAP的免疫組織化學染色照片的結果一致。
實施例5：丁酸鈉對於膀胱癌細胞凋亡之影響
本實施例採用6孔盤，且每孔為3.6*10 5個HT1376細胞，經培養16小時後，分為：(1)實驗組5：將HT1376細胞培養於含2.4 mM丁酸鈉的完全培養基中72小時；和(2)控制組5：將HT1376細胞培養於完全培養基(不含丁酸鈉)中72小時。
1. HT1376細胞凋亡分析：
各組添加胰蛋白酶後，使各組的HT1376細胞懸浮於0.1 mL的 annexin V結合緩衝液，且該annexin V結合緩衝液含有2 μL具有FITC標定的annexin V和2 μL的Hoechst33342 (500 g/mL)。各組於37 °C反應15分鐘，再以400x g離心5分鐘後，去除上清液，並將所獲得的細胞沉澱物再次懸浮於100 μL的annexin V結合緩衝液，並添加2 μL碘化丙啶(propidium iodide)(500 g/mL)，以獲得測試樣品，並將測試樣品立即裝填至玻片(NC-Slide A2，ChemoMetec)，以螢光影像流式細胞分析儀(fluorescence image cytometer，NucleoCounter NC-3000，ChemoMetec A/S，丹麥)中內建的annexin V分析流程進行分析，結果如圖9A和圖9B所示；其中，圖9A為控制組5細胞凋亡的分析結果，以及圖9B為實驗組5細胞凋亡的分析結果。
從圖9A和圖9B之比較可知，實驗組5因添加2.4 mM丁酸鈉，故相較於控制組5，實驗組5中細胞凋亡晚期的HT1376細胞為22.8%，明顯高於控制組5的10.7%，可知丁酸鈉確實可促進膀胱尿路上皮癌細胞凋亡。
2. Fas配體(Fas Ligand，FasL)分析：
FasL為與調控細胞死亡有關的分子，並會誘發細胞凋亡，故本發明進一步偵測實驗組5和控制組5的FasL訊號，以確認丁酸鈉是否確實具有誘導膀胱尿路上皮癌細胞死亡的功效。
2-1.定量聚合酶連鎖反應：
各組以定量聚合酶連鎖反應分析FasL的mRNA含量，作法同實施例4，所用引子的目錄號為Hs00181225_m1，購自Thermo Fisher Scientific，並配合LightCycler TaqMan Master (購自Roche Diagnostics GmbH)和無核酸酶水依下述循環週期進行放大：於95 °C加熱10分鐘後，以95 °C加熱10秒為一週期循環60次，再於60 °C加熱20秒。FasL的mRNA濃度皆以GAPDH作為內部控制進行校正，並以2-△△Cq方法進行mRNA定量分析，結果如圖10A所示；其中，*表示 p＜ 0.05。
從圖10A可知，實驗組5因添加2.4 mM丁酸鈉，故相較於控制組5，實驗組5的FasL的mRNA含量明顯提升2.9倍，可知丁酸鈉可提升膀胱尿路上皮癌細胞中的FasL含量，以誘發細胞死亡。
2-2.西方墨點法：
各組以西方墨點法偵測FasL，並以GAPDH作為內部控制進行校正，所用初級抗體如表6所示，以及採用鍵結有鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)的抗兔或抗鼠的二級抗體。配合鹼性磷酸酶採用VECTASTAIN ABC-AmP DuoLuX chemiluminescent/fluorescent substrate kits (SK-6005，Vector Laboratories，USA)依產品操作手冊獲得轉印結果，再以FluorChem FC2 system (Cell Biosciences，USA)擷取轉印結果之影像，西方墨點法轉印結果影像如圖10B所示。
表6：西方墨點法所用初級抗體
初級抗體 稀釋比例 目錄號 供應商資訊
抗FasL抗體 1:20 ab15285 Abcam (英國)
抗GAPDH抗體 1:4000 AM4300 Thermo Fisher Scientific
從圖10B可知，實驗組5確實具有FasL訊號，且訊號強度明顯高於控制組5，可知丁酸鈉可提升膀胱尿路上皮癌細胞中的FasL含量，以誘發細胞死亡。
實施例6：丁酸鈉對於膀胱尿路上皮癌細胞生長之影響
本實施例分為：(1)實驗組6：將HT1376細胞培養於含2.4 mM丁酸鈉的完全培養基中72小時；和(2)控制組6：將HT1376細胞培養於完全培養基(不含丁酸鈉)中72小時。
1.週期蛋白依賴性激酶1的mRNA含量分析：
實驗方法同實施例4的定量聚合酶連鎖反應，所用引子對如表7所示，並配合LightCycler TaqMan Master (購自Roche Diagnostics GmbH)和無核酸酶水依下述循環週期進行放大：於95 °C加熱10分鐘後，以95 °C加熱10秒為一週期循環60次，再於60 °C加熱20秒。週期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase 1，CDK1)的mRNA濃度以GAPDH作為內部控制進行校正。最後，以2-△△Cq方法進行數據分析，結果如圖11A所示；其中，*表示 p＜ 0.05。
表7：CDK1反轉錄定量PCR所用引子
基因 簡稱 登記 號碼 序列((5'→3') 通用探針編號
CDK1 NM_ 001786 F: TGGATCTGAAGAAATACTTGGATTCTA (SEQ ID NO.7) R: CAATCCCCTGTAGGATTTGG (SEQ ID NO.8) #79
註1：「登記號碼」來源：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene。 註2：「通用探針編號」來源：https://lifescience.roche.com/en_tw/brands/universal-probe-library.html。
從圖11A可知，實驗組6因添加2.4 mM丁酸鈉，故相較於控制組6的1.1倍，實驗組6的CDK1的mRNA表現量明顯較低，僅有0.5倍。可知，丁酸鈉確實可抑制膀胱尿路上皮癌細胞生長。
2.HT1376細胞的細胞週期分析：
各組添加胰蛋白酶後，使各組的HT1376細胞懸浮於0.5 mL的磷酸鹽緩衝液(phosphate-buffered saline，PBS)，並以4.5 mL的75%冰乙醇進行固定，固定步驟的時間至少2小時。移除乙醇後，使各組的HT1376細胞再次懸浮於PBS，並於4 °C以500x g離心5分鐘後，去除上清液，以獲得細胞沉澱物，再添加0.5 mL的DAPI溶液(包含0.1%Triton X-100和4',6-二脒基-2-苯基吲哚)於37 °C反應5分鐘，以進行DNA染色。將染色後的HT1376細胞裝填至玻片(NC-Slide A8，ChemoMetec)，以螢光影像流式細胞分析儀(NucleoCounter NC-3000)中內建的Fixed Cell Cycle-DAPI/DNA fragmentation assay protocol進行分析，控制組6的結果如圖11B所示，以及實驗組6的結果如圖11C所示。
從圖11B和圖11C之比較可知，實驗組6因添加2.4 mM丁酸鈉，故相較於控制組6，實驗組6中停留於G2/M期的細胞數量明顯較高，進一步統計後，實驗組6中停留於G2/M期的細胞含量為31%，明顯高於控制組6的9%，可知丁酸鈉確實可抑制膀胱尿路上皮癌細胞分裂生長。
3.HT1376細胞的細胞週期分析：
各組採用MTT分析(目錄號：M5655，Merck KGaA)來測定HT1376細胞的生長情況，亦即添加10 μL MTT試劑至各組HT1376細胞，並於黑暗中反應4小時。其後，添加100 μL二甲基亞碸以溶解紫色沉澱物，並以Synergy HT多功能微孔盤式光譜分析儀(BioTek Instruments)讀取各組於波長為540 nm之吸光值，以獲得各組HT1376細胞生長情況，結果如圖11D所示。
從圖11D可知，實驗組6因添加2.4 mM丁酸鈉，故相較於控制組6所示1.4倍的膀胱尿路上皮癌細胞生長倍數，實驗組6的膀胱尿路上皮癌細胞生長倍數僅有0.8倍，可知丁酸鈉確實可抑制膀胱尿路上皮癌細胞生長。
4.HT1376細胞的細胞增殖分析：
各組採用溴化去氧尿嘧啶(bromodeoxyuridine，BrdU)細胞增殖分析套組(目錄號：K306-200，Biovision，美國)進行細胞增殖分析。本實驗依據產品操作手冊進行，並為三重複。添加終止液後，立即以Synergy HT多功能微孔盤式光譜分析儀(BioTek Instruments)讀取各組於波長為540 nm之吸光值，結果如圖11E所示。
從圖11E可知，以BrdU總添加量為基準，實驗組6因添加2.4 mM丁酸鈉，故相較於控制組6所示2.8%的BrdU吸收率，實驗組6的BrdU攝取量僅有1.2%，可知丁酸鈉確實可鈍化吸收DNA單體。
實施例7：丁酸鈉對於膀胱尿路上皮癌細胞生長之影響註：依據發明人建議，本處實驗僅作扼要說明。
本實施例另採用人類膀胱尿路上皮癌細胞株HT5637(簡稱HT5637細胞)進行測試，並分為：(1)實驗組7：將HT5637細胞培養於含5 mM丁酸鈉的完全培養基中72小時；和(2)控制組7：將HT5637細胞培養於完全培養基(不含丁酸鈉)中72小時。
1.短鏈脂肪酸相關基因分析：
透過LightCycler 96 (購自Roche Diagnostics GmbH)來進行定量聚合酶連鎖反應，以測定短鏈脂肪酸相關基因之表現，實驗步驟同實施例4，結果為實驗組7的GPR43的mRNA含量提升2倍、GPR109B的mRNA含量提升11.8倍，且相較於控制組7具有顯著差異，以及FABP4的mRNA含量明顯提升40.3倍，且相較於控制組7具有顯著差異。
2. 膀胱癌相關蛋白(BLCAP)的基因分析：
透過LightCycler 96 (購自Roche Diagnostics GmbH)來進行定量聚合酶連鎖反應，以測定膀胱癌相關基因之表現，實驗步驟同實施例4，結果為實驗組7的BLCAP的mRNA含量提升8.9倍，且相較於控制組7具有顯著差異。
可知，丁酸鈉確實具有提升「膀胱」抗發炎之功效，以及預防或抑制「膀胱癌」的功效。
無
圖1為各組小鼠糞便中丁酸梭菌的相對含菌量之直條圖。 圖2A和圖2B依序為控制組1和實驗組1針對GPR43蛋白的免疫組織化學染色照片。 圖3A和圖3B依序為控制組1和實驗組1針對GPR109B蛋白的免疫組織化學染色照片。 圖4A和圖4B依序為控制組1和實驗組1針對FABP4蛋白的免疫組織化學染色照片。 圖5為實施例3各組膀胱尿路上皮癌細胞生長情況之直條圖。 圖6為求取丁酸鈉抑制膀胱尿路上皮癌細胞生長的IC 50濃度之曲線圖。 圖7A至圖7C依序為控制組4和實驗組4的GPR43、GPR109B和FABP4的mRNA相對含量直條圖。 圖8A和圖8B依序為控制組1和實驗組1針對針對BLCAP的免疫組織化學染色照片；以及圖8C為控制組4和實驗組4的BLCAP的mRNA相對含量直條圖。 圖9A為控制組5細胞凋亡的分析結果；圖9B為實驗組5細胞凋亡的分析結果。 圖10A和圖10B依序為控制組5和實驗組5的FasL的mRNA相對含量直條圖和西方墨點法轉印結果。 圖11A至圖11E依序為控制組6和實驗組6的CDK1的mRNA相對含量直條圖、細胞週期分析結果、膀胱尿路上皮癌細胞生長情況和BrdU吸收率之直條圖。
無
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Figure 111138056-A0305-02-0024-2
Figure 111138056-A0305-02-0025-3
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Claims (9)

  1. 一種腸道益生菌用於製備預防或治療膀胱癌的產品之用途，其中該腸道益生菌包含丁酸梭菌(Butyricicoccus pullicaecorum)；其中該腸道益生菌的口服劑量為20毫克至100毫克，或該腸道益生菌的塞劑劑量為1*105菌落形成單位(Colony-forming unit，CFU)至1*108CFU。
  2. 如請求項1所述之用途，其中該預防或治療膀胱癌包含提升短鏈脂肪酸相關蛋白之表現量、提升膀胱癌相關蛋白之表現量、提升Fas配體、降低週期蛋白依賴性激酶1之表現量或抑制膀胱癌細胞分裂。
  3. 如請求項1所述之用途，其中該膀胱癌包含膀胱尿路上皮癌。
  4. 如請求項1所述之用途，其中該產品包含藥品、保健食品或食品。
  5. 一種腸道益生菌用於製備預防或治療膀胱炎的產品之用途，其中該腸道益生菌包含丁酸梭菌(Butyricicoccus pullicaecorum)；其中該腸道益生菌的口服劑量為20毫克至100毫克，或該腸道益生菌的塞劑劑量為1*105CFU至1*108CFU。
  6. 如請求項5所述之用途，其中該產品包含藥品、保健食品或食品。
  7. 一種腸道益生菌濾液用於製備預防或治療膀胱炎的產品之用途，其中該腸道益生菌包含丁酸梭菌(Butyricicoccus pullicaecorum)，且該腸道益生菌濾液包含短鏈脂肪酸，且該短鏈脂肪酸包含丁酸，以及該丁酸之濃度為大於1mM至25mM。
  8. 如請求項7所述之用途，其中以該短鏈脂肪酸之總重為基準，該丁酸之含量為80重量百分比至99重量百分比。
  9. 一種含丁酸化合物用於製備預防或治療膀胱炎的產品之用途；其中該含丁酸化合物包含丁酸或丁酸鹽，且該丁酸化合物之濃度為大於1mM至25mM。
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TW201914596A (zh) * 2017-10-12 2019-04-16 國泰醫療財團法人國泰綜合醫院 腸道益生菌用於製備抑制大腸直腸癌細胞遷移的醫藥組合物的用途

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