TW201908485A - 用於增強蛋白質表現之表現卡匣、載體及病毒 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種用於增強蛋白質表現之雙向啟動子表現卡匣，該雙向啟動子表現卡匣包括一第一表現卡匣以及一可操作地反向連結於第一表現卡匣的第二表現卡匣。其中第一表現卡匣依序包括：一第一桿狀病毒啟動子、至少一脈衝序列、一桿狀病毒GP64基因序列以及一終止件；其中第二表現卡匣依序包括：一第二桿狀病毒啟動子、一轉錄因子以及一終止子。使用包含該雙向啟動子表現卡匣該表現載體可將不同的外源蛋白大量表現於桿狀病毒之套膜上，以應用於不同次單位疫苗之製備。

Description

用於增強蛋白質表現之表現卡匣、載體、病毒及疫苗

本發明係關於一種表現卡匣，尤指可加強重組蛋白質表現之表現卡匣；本發明亦關於一種表現載體，尤指包含前述表現卡匣，並可加強重組蛋白質表現之表現載體；本發明亦關於一種基因重組桿狀病毒，尤指包含有前述表現載體之基因重組桿狀病毒。本發明亦關於一種用於加強重組蛋白質表現之用途，尤指藉由前述表現載體以達成加強重組蛋白質表現之用途。本發明亦關於一種包含如前述之基因重組桿狀病毒之疫苗。

昆蟲桿狀病毒感染昆蟲細胞後可產生兩種型式之病毒，一為出芽型病毒(budded virion，BV)，即為胞外病毒(extracellular virus，ECV)或非包涵體病毒(nonoccluded virus，NOV)，另一種為封埋型病毒(occluded body-derived virus，OV)或稱多角體病毒(polyhedra-derived virus，PDVs)。在1983年Smith及Summer等人發現苜蓿尺蠖蛾核多角體病毒(Autographa californica nucleopolyhedrosisvirus，AcMNPV)中的多角體基因刪除後並不會影響病毒其他蛋白表現及病毒感染能力，並利用感染晚期啟動子p10及多角體啟動子(polyhedron)能夠大量表現蛋白之特性，以昆蟲細胞做為生物反應器來生產外源性蛋白。基因重組桿狀病毒表現系統是屬於真核系統，除了大量生產外源性蛋白、轉譯後修飾(post-translational modification)及生產之蛋白質具有生物活性等特點外，最重要的是表現後之蛋白有良好之摺疊構型，與其他真核細胞之蛋白具有高度相似性，保有蛋白原始之特性。

基因重組桿狀病毒表現系統中，常見所選用之細胞為秋行軍蟲 (Spodoptera frugiperda )的蛹期卵巢組織(pupal ovarian tissue)細胞，包含Sf-9及Sf-21兩種細胞，主要是這兩種細胞對於AcMNPV之感受性較高；另外包含BTI-TN-5B1-4細胞(Invitrogen公司之商品為High Five^TM )，細胞來源為粉紋夜蛾(Trichoplusia ni )。至於桿狀病毒系統所用之病毒，目前已發展使用之病毒株為AcMNPV及家蠶核型多角體桿狀病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus，BmNPV)。而兩者之間有所差異，AcMNPV優點是利用細胞大量生產外源性蛋白；BmNPV則適用於幼蟲體內大量生產外源性蛋白。過去研究已證實表現蛋白具有良好之免疫性，具有製備次單位疫苗之潛能。如：腸病毒71型 (Enterovirus 71)疫苗(Chunget al. , 2010)、家禽里奧病毒(avian reovirus)次單位疫苗(Linet al., 2008)及禽流感疫苗(H5N1)疫苗(Wuet al., 2011)。雖然桿狀病毒系統具備諸多優點，但真核表現系統所需要之培養基或添加物皆會提升生產單位成本，且蛋白表現量不如大腸桿菌(E.coli )，因此製備細胞性次單位疫苗或其它免疫製劑或因子，恐怕不符合商業販售之低成本要求。所以，改善真核表現系統之表現量成為發展重點。

鑑於市售之載體在真核系統產量低、不利應用於商業化生產等缺點，本發明之目的在於提供一種用於增加重組蛋白質表現之雙向啟動子表現卡匣(Dual expression cassette)，該雙向啟動子表現卡匣包括一第一表現卡匣以及一可操作地反向連結於第一表現卡匣的第二表現卡匣。其中第一表現卡匣依序包括：一第一桿狀病毒啟動子、至少一脈衝序列(burst sequence，BS)、一桿狀病毒GP64基因序列以及一終止件，且終止件包括，但不限於猿猴空泡病毒40多聚腺苷酸(Simian vacuolating virus 40 poly A，SV40 pA)。其中第二表現卡匣依序包括：一第二桿狀病毒啟動子、一轉錄因子(transcription factor)以及一終止子；該轉錄因子為極晚期轉錄因子(very late factor-1，VLF-1)；該終止子包括，但不限於單純皰疹病毒胸苷激酶聚腺苷化A (herpes simplex virus thymidine kinase polyadenylation，HSV tk pA)。

較佳的，所述之第一桿狀病毒啟動子包括多角體蛋白質啟動子(polyhedron promoter，Pph)。

較佳的，所述之桿狀病毒GP64基因序列依序包括信號胜肽(signal peptide，SP)、跨膜區域(transmembrane domain，TM)和細胞質區域(cytoplasmic domain，CTD)。

較佳的，所述之桿狀病毒GP64基因序列之信號胜肽與跨膜區域之間更包括一多種限制酶切位(multiple cloning site，MCS)。

較佳的，所述之桿狀病毒GP64基因序列之信號胜肽與跨膜區域之間更包括豬環狀病毒二型結構外殼蛋白刪除N端41個胺基酸 [porcine circovirus 2-capsid protein d41，PCV2-Cap(d41)]。

較佳的，所述之第二桿狀病毒啟動子包括P10啟動子。

較佳的，所述之至少一脈衝序列的數量為一個，該脈衝序列與桿狀病毒GP64基因序列之間更包含一第一突變序列(mutant signal 1，ms1)，該脈衝序列與該第一突變序列(BSms1)如SEQ ID No：8所示。

較佳的，所述之至少一脈衝序列的數量為一個，該脈衝序列與桿狀病毒GP64基因序列之間更包含一第二突變序列(mutant signal 2，ms2)，該脈衝序列與該第二突變序列(BSms2)如SEQ ID No：11所示。

依據本發明，「表現卡匣」於此處係指藉由重組技術或合成產生之核苷酸序列，得以在宿主細胞中進行基因表現。表現卡匣可嵌入質體或染色體中。一般而言，表現載體之表現卡匣部分包含一啟動子、一欲轉錄之核苷酸序列及一聚腺苷化。依據本發明，「雙向啟動子表現卡匣」於此處係指一表現卡匣，其所含欲轉錄之核苷酸序列編碼二個或二個以上的基因產物。具體而言，本案於第一表現卡匣之第一桿狀病毒啟動子後反向連結第二表現卡匣之第二桿狀病毒啟動子。

本發明更提供一種包含前述之雙向啟動子表現卡匣之表現載體，藉由在表現載體中皆含GP64基因，方便將目標抗原片段帶至細胞膜上。

此外，前述之表現載體於多角體啟動子下游置入兩個脈衝序列(即BS2)、一個脈衝序列與第一突變序列BSms1、或一個脈衝序列與第二突變序列BSms2等，反向構築p10啟動子表現感染非常晚期轉錄因子Vlf-1，轉錄因子正向調控啟動子PphBS2、PphBSms1、PphBSms2，強化蛋白轉譯效率。

本發明再提供一種包含前述之表現載體之基因重組桿狀病毒，其係由如前述之表現載體轉染(transfection)至昆蟲細胞所形成。

較佳的，所述之昆蟲細胞的種類包括，但不限於Sf-9 (Spodoptera fugiperda )細胞或Hi-5 (BTI-TN-5B1-4)細胞。

本發明更提供一種如前述之表現載體用於增強蛋白質表現之用途，其係將表現載體轉染至昆蟲細胞。

本發明又提供一種包含如前述之基因重組桿狀病毒之疫苗，其用以在受體之中產生免疫反應。較佳的，所述受體為豬。

本發明採用Bac-To-Bac^® Baculovirus Expression System (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)來製備重組桿狀病毒，同時選殖GP64 (包含SP、TM、CTD domain)基因使得載體具備蛋白表面呈現特性。再將外源性基因崁入GP64之SP與TM之間，利用桿狀病毒晚期啟動子polyhedron或p10啟動下游基因表達，表現後之融合蛋白以三聚體呈現於細胞膜上及桿狀病毒套膜上。接著，本發明以Sf-9細胞株作為宿主，將建構完成之Bacmid DNA轉染至該細胞製備重組桿狀病毒。最後，本發明選用Hi-5細胞株作為宿主，將基因重組桿狀病毒感染宿主於細胞內大量表現目標蛋白PCV2-Cap(d41)，感染後之細胞表面呈現GP64PCV2Cap(d41)蛋白，再以快速冷凍解凍方式裂解細胞，產生大量細胞碎片，其碎片中即含有可有效誘發免疫反應之重組蛋白，而該細胞裂解液即為PCV2次單位疫苗。

本發明藉由下述的實施例作為例示說明，將使的本發明之範疇與技術特徵更為清楚，但不應視為侷限本發明之範圍之限制。

製備例1 重組質體

1.DNA來源

本案所使用之PCV2-Cap(d41)片段(如SEQ ID NO. 1所示)(Accession number：AY885225，576 bp)、Vlf-1片段(如SEQ ID NO. 2所示)(Accession number：NC_001623.1的局部片段，1140 bp)、脈衝序列(burst sequence)片段(如SEQ ID NO. 3所示)、Kozak sequence-GP64SP-His6片段(如SEQ ID NO. 4所示)、GP64基因片段(GP64TMCTD，如SEQ ID NO. 5所示)(Accession number：NC_001623.1的局部片段，222 bp)皆委託Invitrogen進行全基因合成，同時將密碼子修飾作為適合昆蟲細胞表現之序列。BSms1與BSms2則以引子對重複聚合酶連鎖反應(primer overlapping PCR)完成片段增幅；其中PCV2-Cap(d41)片段係指豬環狀病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)之Capsid蛋白刪除41個胺基酸，更具體而言，本案係以PCV2-Cap(d41)片段作為表現卡匣即表現載體之表現蛋白分子。

2. BSms1聚合酶連鎖反應

將1微升(μl) [濃度為10微莫耳濃度(μM)] P10 BSms1 F1引子(如SEQ ID No：6所示)、1 μl (10 μM) P10 BSms1 R1引子(如SEQ ID No：7所示)、2.5 μl 10X pfx buffer [50毫莫耳濃度(mM) Mg⁺ ]、2.5 μl 10X enhancer、2 μl dNTP (2.5 mM)、引子對、0.5 μl pfx DNA polymerase，最後加入去離子水至總體積25 μl，放入PCR機器進行反應。設定條件如下：95°C變性作用(denaturation)進行3分鐘，後續以95°C進行30秒，55°C黏合作用(annealing)進行40秒，72°C擴增作用(extension)進行15秒，共進行35個循環；最後以72°C反應5分鐘，以獲得BSms1 (如SEQ ID No：8所示)。

3. BSms2聚合酶連鎖反應

將1 μl (10μM) P10 BSms2 F1引子(如SEQ ID No：9所示)、1 μl (10 μM) P10 BSms2 R1引子(如SEQ ID No：10所示)、2.5 μl (50 mM Mg⁺ ) 10X pfx buffer、2.5 μl (2.5 mM) 10X enhancer、2 μl dNTP、引子對、0.5 μl pfx DNA polymerase，最後加入去離子水至總體積25 μl，放入PCR機器進行反應。設定條件如下：95°C變性作用進行3分鐘，後續以95°C進行30秒，55°C黏合作用進行40秒，72°C擴增作用15秒，共進行35個循環；最後以72°C反應5分鐘，以獲得BSms2(如SEQ ID No：11所示)。

4. PCR DNA鑑定及定序

PCR完成後將其擴增之DNA以含有SYBR之1%瓊脂糖凝膠(agarose gel)於1X TAE buffer中進行DNA電泳，並以UV light分析其結果，經確認片段大小無誤後再進行定序確認。如圖1所示，M表示DNA marker (Bio-100 bp Ladder)；BSms1表示經Overlapping PCR放大之BSms1基因片段； BSms2表示經Overlapping PCR放大之BSms2基因片段，結果顯示產物符合預期片段大小約115 bp。

5. DNA純化及接合反應

將質體及PCR DNA分別以限制酵素於37°C水浴槽切割1小時，再將反應完畢之DNA於1.5 % agarose gel跑膠分析確定其插入片段(insert)及載體片段(vector)大小，再以Clean/Gel Extraction Kit純化回收DNA。從膠體切下目標大小之DNA，將切下之膠條加入Binding buffer [100毫克(mg)：100 μl]，置於55°C水浴槽進行溶膠，待膠體溶解後將其液體加入至spin column，離心13000 rpm、30秒，去除下清液，再加入700 μl Wash buffer，離心13000 rpm 30秒，去除下清液。之後將spin column以13000 rpm空轉1分鐘，目的是將酒精蒸乾。加入40 μl去離子水 (D3W)至spin column靜置2分鐘，13000 rpm 離心2分鐘，下清液體即為純化之DNA。計算molar ratio (insert：vector比例為1:3)，加入等量之T4 ligase於22°C水浴槽反應15分鐘。

6.轉型作用(transformation)

本案以DH5α菌株作為轉型作用。首先，將DH5α從-80°C取出，置於冰上緩緩解凍，待溶解一半後再加入ligation產物混勻，並放置冰上30分鐘，使DNA能貼附於菌的細胞壁及維持菌體在4°C狀態下，之後放置42°C兩分鐘進行heat shock，將DNA送入菌體中，最後再放至冰上10分鐘使菌體膜上孔洞癒合。取100 μl菌液塗在含有抗生素[含50 μg/ml安比西林(ampicillin)]的LB agar盤，37°C培養16小時。

7.萃取重組質體DNA

轉型作用後之白色菌落以10 ml LB broth (含50 μg/ml ampicillin) 於37°C震盪250 rpm液態培養14小時至16小時。之後取菌液離心3000 rpm 10分鐘，待離心完畢去除上清液，使用Plasmid Miniprep Kit進行質體萃取，首先加入R3 buffer 200 μl 把菌塊懸浮，再加入L7 buffer 200 μl輕輕上下混合，呈現蛋花湯狀，並靜置5分鐘至10分鐘破菌，最後加入N4 buffer 200 μl 輕輕上下混合，以13000 rpm離心10分鐘。取上清液至spin column 離心13000 rpm 1 分鐘 (Labnet)，去除下清液，加入500 μl W10 buffer 離心13000 rpm 30秒，棄下清液，加入600 μl W9 buffer 離心13000 rpm 30秒，然後空轉13000 rpm 10 分鐘將酒精蒸乾，最後將Spin column 放到1.5 ml離心管加入50 μl去離子水 (D3W)室溫靜置2分鐘，並13000 rpm 離心2分鐘，收集到之液體即為重組質體。

製備例2 建構基因重組桿狀病毒載體

1. pFastBac^TM Dual載體

本案使用Invitrogen開發之pFastBac^TM Dual載體，如圖2A所示，包含兩個表現卡匣(expression cassette)，其中一個表現卡匣依序為p10啟動子、多限制酶切位(multiple cloning site，MCS)、末端終止密碼片段為HSV tk pA；另一個表現卡匣依序則是多角體啟動子(Pph) (序列如SEQ ID No：12所示)、MCS、末端終止密碼片段為SV40 pA。下表1列出各區段之特性及其用途。 表1、pFastBac^TM Dual載體各區段之特性及其用途

2. 建構pBV1表現載體

(1) 將pFastBac^TM Dual載體以BamHI與HindIII限制酶於37°C切割1小時後，產物以Gel/PCR DNA fragments extraction kit從膠體中純化DNA作為Vector；GP64TMCTD作為insert。後續經進行接合反應、轉型作用及重組質體篩選純化，以完成pFastBac^TM Dual-GP64TMCTD載體。

(2)將上述pFastBac^TM Dual-GP64TMCTD載體以Bstz17I與NotI限制酶於37°C切割1小時後，產物以Gel/PCR DNA fragments extraction kit從膠體中純化DNA作為Vector，將PH-BS2GP64SP建構至載體。後續經進行接合反應、轉型作用及重組質體篩選純化，以完成pFastBac^TM Dual-GP64載體。

(3) 將pFastBac^TM Dual-GP64載體以NotI與ApaI限制酶於37°C切割1小時後，產物以Gel/PCR DNA fragments extraction kit從膠體中純化DNA作為Vector；PCV2-Cap(d41)作為insert。後續經進行接合反應、轉型作用及重組質體篩選純化，以完成pFastBac^TM Dual-GP64Cap(d41)載體。

(4) 將pFastBac^TM Dual-GP64Cap(d41)載體以HindIII限制酶於37°C切割1小時後，產物以Gel/PCR DNA fragments extraction kit從膠體中純化DNA作為Vector；PH-EGFP-SV40pA作為insert。後續經進行接合反應、轉型作用及重組質體篩選純化，以完成如圖3A所示之pBV1表現載體，其中如圖3B所示pBV1之重要調控片段構築於轉錄啟始點(+1)上游位置BS2約-10 bp至-94 bp；Kozak序列內之ATG為轉錄啟始點(+1)，DNA聚合酶則往下游方向表達GP64SP、PCV2-Cap(d41)等蛋白。下表2列出各區域的序列起點及終點以及片段長度。 表2、pBV1載體資訊

3. 建構pBV2表現載體

將前述所得之pBV1表現載體以SmaI與KpnI限制酶於37°C切割1小時後，產物以Gel/PCR DNA fragments extraction kit從膠體中純化DNA作為Vector；Vlf-1作為insert。後續經進行接合反應、轉型作用及重組質體篩選純化，以完成如圖4A所示之pBV2表現載體，其中如圖4B所示pBV2之重要調控片段構築於轉錄啟始點(+1)上游位置BS2約-10 bp至-94 bp；Kozak序列內之ATG為轉錄啟始點(+1)，DNA聚合酶則往下游方向表達GP64SP、PCV2-Cap(d41)等蛋白。下表3列出各區域的序列起點及終點以及片段長度。 表3、pBV2載體資訊

4. 建構pBV10表現載體

將前述所得之pBV2表現載體以限制酶NdeI與SpeI限制酶於37°C切割1小時後，產物以Gel/PCR DNA fragments extraction kit從膠體中純化DNA作為Vector；BSms1作為insert。後續經進行接合反應、轉型作用及重組質體篩選純化，以完成如圖5A所示之pBV10表現載體，其中如圖5B所示pBV10之重要調控片段構築於轉錄啟始點(+1)上游位置BS2約-10 bp至-94 bp；BSms1約-10 bp至-107 bp；Kozak序列內之ATG為轉錄啟始點(+1)，DNA聚合酶則往下游方向表達GP64SP、PCV2-Cap(d41)等蛋白。下表4列出各區域的序列起點及終點以及片段長度。 表4、pBV10載體資訊

5. 建構pBV11表現載體

將前述所得之pBV2表現載體以限制酶NdeI與SpeI限制酶於37°C切割1小時後，產物以Gel/PCR DNA fragments extraction kit從膠體中純化DNA作為Vector；BSms2作為insert。後續經進行接合反應、轉型作用及重組質體篩選純化，以完成如圖6A所示之pBV11表現載體，其中如圖6B所示pBV11之重要調控片段構築於轉錄啟始點(+1)上游位置BS2約-10 bp至-94 bp；BSms2約-10 bp至-107 bp；Kozak序列內之ATG為轉錄啟始點(+1)，DNA聚合酶則往下游方向表達GP64SP、PCV2-Cap(d41)等蛋白。下表5列出各區域的序列起點及終點以及片段長度。 表5、pBV11載體資訊

製備例3 Sf-9與BTI-TN-5B1-4 (Hi-5)細胞培養

本案使用昆蟲細胞株為Sf-9 (Spodoptera fugiperda )與Hi-5 (BTI-TN-5B1-4)細胞。培養方式可用貼附式和懸浮式，使用Insect-XPRESS™ Protein-free Insect Cell Medium於28°C培養箱中培養。Sf-9細胞約3天繼代一次；Hi-5細胞生長較快，可2天至3天繼代一次。兩種培養方式: 貼附式則培養於flask，待細胞繼代時，再以拍打方式使細胞懸浮，再取3x10⁶ 細胞數至新的T-75 flask。懸浮式則培養於1000 mL錐型瓶放置200 mL培養基震盪培養100 rpm，細胞濃度為1×10⁶ cells/mL。

製備例4製備基因重組桿狀病毒

1.建構基因重組桿狀病毒基因體(bacmid)

本製備例採用Invitrogen公司所開發的bac-to-bac桿狀病毒表現系統進行製備重組桿狀病毒，能更快速篩選並且建構重組桿狀病毒。bac-to-bac 桿狀病毒表現系統主要是利用一勝任細胞(competent cell) (DH10Bac^TM )進行重組桿狀病毒的建構，此菌株的基因體部分包含桿狀病毒載體(shuttle vector)及helper plasmid，再將前述已建構完成之pBV1表現載體、pBV2表現載體、pBV10表現載體以及pBV11表現載體分別以轉型作用送進菌體內進行基因重組。由於以上載體係以pFastBac^TM Dual載體作為基底，即各載體本身含有有Tn7R及Tn7L之基因跳耀點及Bacmid基因體含有mini-attTn7序列，當前述各載體分別送入菌體內時，helper plasmid將會轉譯出轉位酶(transposase)，利用此特性把目標基因與Bacmid進行重組。重組成功後，Bacmid基因體之lacZ基因將會被破壞，無法生產β-半乳糖甘酶(β-galatosidase)，再以5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal)及isopropylthio-β-galactoside (IPTG)進行藍白篩選，放置3天至4天，即可觀察到藍白菌落，最後再把白色菌落以液態培養並抽取重組bacmid。於此步驟中，可分別獲得含有病毒載體Bacmid-BD(陰性對照組)、Bacmid-BV1、Bacmid-BV2、Bacmid-BV10與Bacmid-BV11。雖本發明所述之桿狀病毒基因體Bacmid已有Vlf-1基因，但考量其轉率效率，另將基因重組桿狀病毒載體pBV2、pBV10及pBV11構築表現Vlf-1，調控轉錄啟始點(+1)上游區BS2、BSms1及BSms2片段。

2. 轉型作用

將建構完成之BV1重組Bacmid、BV2重組Bacmid、BV10重組Bacmid及BV11重組Bacmid分別以heat shock方式轉入DH10 Bac^TM (購自Invitrogen公司)，轉型步驟與上述相同，勝任細胞復甦培養時間為3小時至5小時，取菌液30μl至80 μl均勻塗抹在含三種抗生素之LA plate上(50 μg/ml Kanamycin、7 μg/ml Gentamycin、10 μg/ml Tetracycline)，並加入IPTG (40 μg/ml) 及 X-gal (100 μg/ml)培養2天至3天，再挑選其白色菌落進行液態培養。

3. 純化基因重組Bacmid

將增殖培養後的菌落以Plasmid Purification Mini Kit萃取。先將10 mL 菌液以13000 rpm 離心，去除上清液，加入300 μl buffer P1回溶菌塊，再加入300 μl buffer P2上下翻轉混合10次，靜置室溫作用7分鐘，最後加入300 μl buffer P3上下翻轉混合均勻後以13000 rpm離心10分鐘。離心同時架設好QIAGEN-tip 20，先以 1 mL Buffer QBT 加入至平衡管柱內。離心後取上清液加入平衡過之QIAGEN-tip20，接著以2 mL Buffer QC 清洗平衡管柱內之membrane 兩次，再以800 μl Buffer QF使membrane 中之DNA 萃取至1.5 mL 離心管。加入500 μl isopropanol上下混合均勻，並以13000 rpm離心30分鐘，以1 mL 70% wash buffer清洗，以13000 rpm 離心10分鐘後倒掉上清液，於無菌操作台內風乾DNA，最後以20 μl去離子無菌水 (D3W)回溶 Bacmid DNA，並以 PCR 及進行電泳分析，確認萃取之重組Bacmid是否同源重組成功。

4.轉染 (transfection)

將培養之Sf-9細胞繼代至6孔盤，每孔培養1×10⁶ cells/mL，先於28°C靜置培養1小時。取2 μg前述重組bacmid分別稀釋於200μl Insect-XPRESS™ Protein-free Insect Cell Medium培養基，再加入4μl TransIT^® -Insect Transfection Reagent，混合後靜置室溫30分鐘。之後加入800 μl培養基混合，加入6孔盤中於28°C作用16小時，隔天去除轉染試劑更換新鮮Insect-XPRESS™ Protein-free Insect Cell Medium。持續培養3天後，吸取上清液即可獲得病毒BV1、BV2、BV10及BV11(皆為P1病毒)。

5. 增殖基因重組桿狀病毒

增殖病毒目的是為了提升病毒力價，以方便後續實驗上的使用及病毒保存。首先將3×10⁶ Sf-9細胞種至T25 flask，以MOI 1(multiplicity of infection)之病毒液感染昆蟲細胞，置於28°C培養箱培養3天，待細胞產生螢光時，收集上清液以3000 rpm離心10分鐘，離心目的主要將懸浮之Sf-9細胞分離，並將病毒增殖3代，之後將病毒置於-80°C保存或用4°C作短暫的保存。

6. 病毒力價測定

病毒力價測定方式是感染後發螢光數量作為判定，再使用終點稀釋法測定病毒力價。取15 μl前述病毒液分別加入至135 μl Insect-XPRESS^™ Protein-free Insect Cell Medium培養液，並做序列稀釋10次，稀釋後之病毒液，每管稀釋倍數加入1215 μl (1×10⁵ cells/mL)之Sf-9細胞，混合均勻後取100 μl加入96孔盤，不同稀釋倍率加入12孔，最後置於28°C培養箱，約7天至10天可觀察到細胞產生螢光，計數每個稀釋倍率螢光表現程度，以公式 (Reed-Muench法)推算病毒力價 TCID₅₀ ，再乘以0.69係數換算成pfu (plaque forming units)。

實施例1 鑑定pBV1表現載體、pBV2表現載體、pBV10表現載體及pBV11表現載體

pBV1表現載體建構過程詳見製備例2.2、pBV2表現載體建構過程詳見製備例2.3、pBV10表現載體建構過程詳見製備例2.4、pBV11表現載體建構過程詳見製備例2.5。pBV1表現載體的鑑定以NotI與HindIII切割；pBV2表現載體的鑑定以SmaI與KpnI切割；pBV10表現載體係以pBV2表現載體為基礎，BS置換成BSms1，所以鑑定該區域片段以NdeI與SpeI切割確認即可，但由於片段過小，不易觀察目標片段，因此另透過PCR方式偵測；pBV11表現載體係以pBV2表現載體為基礎，BS置換成BSms2，所以鑑定該區域片段以NdeI與SpeI切割確認即可。由於片段過小，不易觀察目標片段，因此另透過PCR方式偵測。如圖7A所示，pBV1表現載體經切割後，GP64Cap(d41)基因片段符合預期大小885 bp、PphEGFPSV40 pA基因片段符合預期大小1176 bp；pBV2表現載體經切割後，Vlf-1啟動子基因片段符合預期大小約1140 bp。如圖7B所示，pBV10表現載體透過PCR方式偵測，顯示符合預期大小115 bp、pBV11表現載體透過PCR方式偵測，顯示符合預期大小115 bp。如圖7C所示，藉由NCBI網站之nucleotide blast比對顯示，pBV10表現載體之BSms1序列(即圖7C中所示之Sbjct)與定序結果(Query)序列一致。如圖7D所示，藉由NCBI網站之nucleotide blast比對顯示，pBV11表現載體之BSms2序列(即圖7D中所示之Subjct)與定序結果(Query)序列一致。

實施例2 鑑定病毒BV1、BV2、BV10及BV11

將重組成功之桿狀病毒載體Bacmid-BD、Bacmid-BV1、Bacmid-BV2、Bacmid-BV10與Bacmid-BV11轉染至Sf-9昆蟲細胞(詳見製備例4)，轉染後3天以螢光顯微鏡觀察，由於載體上有建構EGFP基因，所以若有螢光表現表示有成功將載體送入細胞中開始產生重組病毒。由圖8結果顯示，Sf-9昆蟲細胞皆發出綠螢光，因此判定病毒載體Bacmid-BD、Bacmid-BV1、Bacmid-BV2、Bacmid-BV10與Bacmid-BV11轉染昆蟲細胞後皆能夠產生重組桿狀病毒。由於本發明所使用之桿狀病毒為AcMNPV，故組裝完成之病毒會以出芽生殖生方式離開細胞，因此上清液即含基因重組桿狀病毒。並將此重組桿狀病毒分別命名為病毒BD、病毒BV1、病毒BV2、病毒BV10與病毒BV11。

實施例3基因重組桿狀病毒之蛋白表現效率

將Hi-5細胞培養於250 mL錐型瓶(詳見製備例3)，細胞密度為10⁶ cells/mL、體積25 mL、28°C、100 rpm震盪培養。再分別以病毒BV1、BV2、BV10、BV11、以MOI 0.1感染Hi-5細胞3天。後續將感染之細胞以1500 rpm離心5分鐘，回溶1/10發酵體積之PBS。再取5X sample buffer dye稀釋成1X裂解細胞，並以蛋白電泳及西方墨點法分析。

進行蛋白質電泳時，組別共包含：Hi-5及FastBacDual陰性對照組；BV1、BV2、BV10、BV11實驗組、及E.coli表現之已純化標準蛋白作為陽性對照組。將重組細胞蛋白質定量後與5X sample buffer dye混合稀釋成1X，以100°C水浴10分鐘使蛋白質徹底變性。接著以10% SDS-PAGE進行電泳，注入1X running buffer，上層膠以60V跑30分鐘，下層膠則以100V跑90分鐘。待膠體跑完後，切下膠條可進行西方墨點法分析蛋白。

齊備歷經SDS-PAGE膠體，把經過甲醇處理過的硝酸纖維膜(Nitrocellulose membrane，NC membrane)膜覆蓋於SDS-PAGE膠體上。(NC膜使用前必須先將膜浸泡於transfer buffer 10分鐘)。當上述步驟完成時，設定電源400 mA轉漬45分鐘。將轉漬好的膜放至blocking buffer (含5%脫脂牛奶)，室溫下搖晃作用1小時，目的降低非專一性的抗體結合。後續加入anti-β actin單株抗體稀釋倍率稀釋為10000X，而anti-His6單株抗體稀釋倍率為5000X，室溫搖晃作用1小時至2小時。待抗體結合後，加入wash buffer (0.3% Tween 20 in PBS buffer)清洗3次，每次20分鐘，洗去非特異的鍵結。再取稀釋5000X之抗體(goat-anti-mouse (H＋L) conjugate HRP，於室溫下搖晃作用50分鐘後，以適量wash buffer清洗3次，每次20分鐘。(Anti-His6單株抗體則已標定HRP酵素，不需要另外加入二抗)。

將含有蛋白之NC membrane，加入enhanced chemiluminescence (ECL) solution (購自Amersham Pharmacia Biotech，New Territories公司) ，分成A與B兩管，各加等量A與B進行混勻，再取200 μl覆蓋在NC membrane上反應適當時間後，再以底片置於NC膜上，將影像呈現在底片上，最後以顯影定影劑進行呈像。

最後將結果以軟體Photo-CaptMW定量，將各組結果數據與陽性對照組作相對定量，計算其蛋白表現量。不同組別之間數據比較主要以t-test函數進行分析，計算得到之P值作為統計學上的依據，若是P＜0.05表現有顯著性差異；P＞0.05表是數據並無顯著性差異，判定不同數據其有效性。經西方墨點法所得之數據，皆由除以β-actin數據作為量化依據。

結果如圖9A及圖9B所示，4種基因重組桿狀病毒具有穩定之蛋白表現能力。以His6單株抗體可於28 kDa及33 kDa偵測到預期大小之Cap(d41)蛋白，其中分別包含Cap(d41)-gp64(TM-CTD)及Cap(d41)-gp64(SP-TM-CTD)兩種型式。從BV1與BV2比較，額外表現有助於調控PCV2-Cap(d41)蛋白表現，且隨著啟動子3’端構築不同片段如：BS、BSms1與BSms2，明顯有著不同表現量差異。特別是將p10啟動子5’端55 bp內之特定區域修飾(將AT序列突變為GC)再構築於Pph啟動子下游，其中以BV11可獲最佳之表現。經軟體定量分析做出標準化之圖表，顯示Cap(d41)蛋白在BV11的表現量較在BV1表現量顯著增加1.3倍。

實施例4 以發酵槽模式分析蛋白質產量

將Hi-5細胞培養於5L發酵槽，細胞濃度10⁶ cells/mL、80 rpm、DO維持50%、pH值6.1、消泡劑Pluronic^® F-127 100 ppm、MOI 0.01、實際發酵體積1000mL以病毒BV11感染3天(如下表6)。結果如圖10A顯示，細胞於感染24小時後存活率大幅下降，於感染72小時僅約50%，如圖10B所示，總細胞數相較於0小時則約增40%。 表6、5L發酵槽運型模式

後續取部分細胞量進行西方墨點法，同時加入一組已純化蛋白作為對照，進行一序列稀釋，從1 μg、2 μg、4 μg、8 μg、16 μg電泳圖上之條帶含量做線性化導出函數，最後將目標蛋白PCV2-Cap(d41)之數據代入函數得到數據。如下表7與圖11結果顯示，BV11定量後總量可得約138 mg。 表7、定量分析PCV2-Cap(d41)蛋白 N.A.表示無偵測到。

圖1是本發明藉由Overlapping PCR放大之BSms1與BSms2基因片段；其中M表示DNA marker，BSms1與BSms2基因片段片段大小分別約115 bp。 圖2是本發明所使用之pFastBac^TM Dual載體之示意圖。 圖3A是本發明所述之pBV1表現載體之示意圖。 圖3B是本發明所述之pBV1表現載體之重要調控片段，構築於轉錄啟始點(+1)上游位置BS2約-10 bp至-94 bp；科札克(Kozak)序列內之ATG為轉錄啟始點(+1)，DNA聚合酶則往下游方向表達GP64SP、PCV2-Cap(d41)等蛋白之示意圖。 圖4A是本發明所述之pBV2表現載體之示意圖。 圖4B是本發明所述之pBV2表現載體之重要調控片段，構築於轉錄啟始點(+1)上游位置BS2約-10 bp至-94 bp；Kozak序列內之ATG為轉錄啟始點(+1)，DNA聚合酶則往下游方向表達GP64SP、PCV2-Cap(d41)等蛋白之示意圖。 圖5A是本發明所述之pBV10表現載體之示意圖。 圖5B是本發明所述之pBV10表現載體之重要調控片段構築於轉錄啟始點(+1)上游位置BS2約-10 bp至-94 bp；BSms1約-10 bp至-107 bp；Kozak序列內之ATG為轉錄啟始點(+1)，DNA聚合酶則往下游方向表達GP64SP、PCV2-Cap(d41)等蛋白之示意圖。 圖6A是本發明所述之pBV11表現載體之示意圖。 圖6B是本發明所述之pBV11表現載體之重要調控片段，構築於轉錄啟始點(+1)上游位置BS2約-10 bp至-94 bp；BSms2約-10 bp至-107 bp；Kozak序列內之ATG為轉錄啟始點(+1)，DNA聚合酶則往下游方向表達GP64SP、PCV2-Cap(d41)等蛋白之示意圖。 圖7A是本發明所述之pBV1表現載體、pBV2表現載體分別經切割後之電泳圖，其中GP64Cap(d41)基因片段符合預期大小885 bp、PphEGFPSV40 pA基因片段符合預期大小1176 bp；pBV2表現載體經切割後，Vlf-1啟動子基因片段符合預期大小約1140 bp。 圖7B是本發明所述之pBV10表現載體、pBV11表現載體分別透過PCR方式偵測之電泳圖，其中pBV10表現載體之大小為115 bp、pBV11表現載體之大小為115 bp。 圖7C是本發明藉由NCBI網站(nucleotide blast)將pBV10表現載體之BSms1序列(Sbjct)與定序結果(Query)序列之比對圖。 圖7D是本發明藉由NCBI網站(nucleotide blast)將pBV11表現載體之BSms2序列(Sbjct)與定序結果(Query)序列之比對圖。 圖8是本發明所述之桿狀病毒載體Bacmid-BD (BD為pFastBac^TM Dual的簡寫)、Bacmid-BV1、Bacmid-BV2、Bacmid-BV10與Bacmid-BV11轉染至Sf-9昆蟲細胞3天後之可見光與螢光圖，圖層比例尺為200 μm。 圖9A是本發明所述之桿狀病毒BD、BV1、BV2、BV10與BV11以MOI0.1感染Hi-5細胞(10⁶ 總細胞)所表現之Cap(d41)蛋白表現效率差異比較之電泳圖；mock表示負對照組未有病毒。 圖9B是將圖9A以軟體定量之數據化柱狀圖。 圖10A是本發明所述之病毒BV11於發酵槽試產分析其存活率之折線圖，其中Hi-5細胞於感染24小時後存活率大幅下降，持續至72小時約50%。 圖10B是本發明所述之病毒BV11於發酵槽試產分析其細胞總數之折線圖，其中總細胞數則呈現小幅度上升，且72小時後約略增加40%。 圖11是本發明所述之病毒BV11於發酵槽試產分析其蛋白表現量之柱狀圖，其中1 L發酵槽可產138 mg PCV2-Cap(d41)抗原蛋白。

＜110＞ 百衛生物科技股份有限公司 ＜120＞ 用於增強蛋白質表現之表現卡匣、載體、病毒及疫苗 ＜130＞ P115154 ＜160＞ 12 ＜170＞ PatentIn version 3.5 ＜210＞ 1 ＜211＞ 576 ＜212＞ DNA ＜213＞ 豬第二型環狀病毒(Porcine circovirus 2) ＜400＞ 1 aacggaatct tcaacaccag gctgtctagg accttcggat acaccatcaa gaggaccacc 60 gtcaggaccc cctcttgggc cgtcgacatg atgaggttca acatcaacga cttcctcccc 120 cctggtggtg gatctaaccc ccgctctgtc cccttcgagt actacaggat ccgcaaggtc 180 aaggtcgaat tctggccctg ctctcccatc acccagggcg acaggggagt cggatcttct 240 gccgtcatcc tggacgacaa cttcgtcacc aaggccaccg ccctgaccta cgacccctac 300 gtcaactact cttctaggca caccatcact cagcccttct cttaccactc tcgctacttc 360 acccccaagc ccgtcctgga ctctaccatc gactacttcc agcccaacaa caagaggaac 420 cagctgtggc tgaggctgca gaccgccgga aacgtcgacc acgtcggact gggaaccgcc 480 ttcgaaaact ctaagtacga ccaggactac aacatccgtg tcactatgta cgtccagttc 540 cgcgaattca acctgaagga ccccccactg aagccc 576 ＜210＞ 2 ＜211＞ 1146 ＜212＞ DNA ＜213＞ 苜蓿尺蠖蛾核多角體病毒(Autographa californica nucleopolyhedrovirus) ＜400＞ 2 accatggtca acggattcaa cgtccgcaac gagaacaact tcaactcctg gaagatcaag 60 atccagtctg cccctcgctt cgaatctgtg ttcgacctgg ccaccgacag gcagaggtgc 120 acccccgacg aagtcaagaa caactctctg tggtctaagt acatgttccc caagcccttc 180 gcccccacca ccctgaagtc ttacaagtct cgcttcatca agatcgtcta ctgctctgtc 240 gacgacgtcc acctcgagga catgtcttac tccctggaca aggaattcga ctccatcgaa 300 aaccagaccc tgctgatcga cccccaagaa ctgtgcaggc gcatgctgga actgcgctct 360 gtcaccaagg aaaccctgca gctgaccatc aacttctaca ccaacatgat gaacctgccc 420 gagtacaaga tccccaggat ggtcatgctg cccagggaca aggaactgaa gaacatccgc 480 gaaaaggaaa agaacctgat gctgaagaac gtcatcgaca ccatcctgaa cttcatcaac 540 gacaagatca agatgctgaa ctccgactac gtccacgaca ggggactgat ccgcggagcc 600 atcgtgttct gcatcatgct gggaaccgga atgaggatca acgaagccag gcagctgtcc 660 gtcgacgacc tgaacgtcct gatcaagagg ggaaagctgc actctgacac catcaacctg 720 aagaggaaga ggtctaggaa caacaccctg aacaacatca agatgaagcc cctggaactg 780 gccagggaaa tctactctag gaaccccacc atcctgcaga tctctaagaa cacctctacc 840 cccttcaagg acttccgcag gctgctggaa gaatctggtg tcgaaatgga aaggcccagg 900 tctaacatga tcaggcacta cctgtcctcc aacctgtaca actctggtgt ccccctgcaa 960 aaggtcgcca agctgatgaa ccacgaatct tccgcctcta ccaagcacta cctgaacaag 1020 tacaacatcg gactggacga aacctcctcc gaggaagaaa acaacaacga cgacgacgac 1080 gcccagcaca accgcaactc ttccggatct agcggagaat ctctgctgta ctaccgcaac 1140 gaataa 1146 ＜210＞ 3 ＜211＞ 84 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列(Artificial sequence) ＜220＞ ＜223＞ 兩脈衝序列的5'非編碼(前導)序列 ＜400＞ 3 ctgttttcgt aacagttttg taataaaaaa acctataaat atctgttttc gtaacagttt 60 tgtaataaaa aaacctataa atat 84 ＜210＞ 4 ＜211＞ 138 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列(Artificial sequence) ＜220＞ ＜223＞ 優化GP64SPHis₆ 基因 ＜400＞ 4 accatggtcc tggtcaacca gtctcaccag ggattcaaca aggaacacac ctctaagatg 60 gtgtccgcca tcgtcctgta cgtcctgctg gccgctgccg cccactctgc cttcgctgct 120 catcaccatc accaccac 138 ＜210＞ 5 ＜211＞ 90 ＜212＞ DNA ＜213＞ 苜蓿尺蠖蛾核多角體病毒(Autographa californica nucleopolyhedrovirus) ＜400＞ 5 tctatgttcc acgtcgtcaa cttcgtcatc atcctgatcg tcatcctgtt cctctactgc 60 atgatccgca accgcaacag gcagtactaa 90 ＜210＞ 6 ＜211＞ 68 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列(Artificial sequence) ＜220＞ ＜223＞ 正向引子(P10 BSms1 F1) ＜400＞ 6 agtccgcata tgctgttttc gtaacagttt tgtaataaaa aaacctataa atatatacgg 60 acctttaa 68 ＜210＞ 7 ＜211＞ 61 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列(Artificial sequence) ＜220＞ ＜223＞ 反向引子(P10 BSms1 R1) ＜400＞ 7 actagtaata attcttattt aactatccgg atccgtgttg ggttgaatta aaggtccgta 60 t 61 ＜210＞ 8 ＜211＞ 97 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列(Artificial sequence) ＜220＞ ＜223＞ BSms1序列，突變位置為ggatccgg ＜400＞ 8 ctgttttcgt aacagttttg taataaaaaa acctataaat atatacggac ctttaattca 60 acccaacacg gatccggata gttaaataag aattatt 97 ＜210＞ 9 ＜211＞ 68 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列(Artificial sequence) ＜220＞ ＜223＞ 正向引子(P10 BSms2 F1) ＜400＞ 9 agtccgcata tgctgttttc gtaacagttt tgtaataaaa aaacctataa atatatacgg 60 acctttaa 68 ＜210＞ 10 ＜211＞ 61 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列(Artificial sequence) ＜220＞ ＜223＞ 反向引子(P10 BSms2 R1) ＜400＞ 10 actagtaata attcttattt aactatccgg atccgcgccg ggttgaatta aaggtccgta 60 t 61 ＜210＞ 11 ＜211＞ 97 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列(Artificial sequence) ＜220＞ ＜223＞ BSms2序列，突變位置為ggcgcggatccgg ＜400＞ 11 ctgttttcgt aacagttttg taataaaaaa acctataaat atatacggac ctttaattca 60 acccggcgcg gatccggata gttaaataag aattatt 97 ＜210＞ 12 ＜211＞ 129 ＜212＞ DNA ＜213＞ 苜蓿尺蠖蛾核多角體病毒(Autographa californica nucleopolyhedrovirus) ＜400＞ 12 atcatggaga taattaaaat gataaccatc tcgcaaataa ataagtattt tactgttttc 60 gtaacagttt tgtaataaaa aaacctataa atattccgga ttattcatac cgtcccacca 120 tcgggcgcg 129

Claims (13)

1. 一種用於增強蛋白質表現之雙向啟動子表現卡匣(expression cassette)，該雙向啟動子表現卡匣包括： 一第一表現卡匣，其依序包括： 一第一桿狀病毒啟動子； 至少一脈衝序列(burst sequence，BS)； 一桿狀病毒GP64基因序列；以及， 一終止件，其包括猿猴空泡病毒40多聚腺苷酸(Simian vacuolating virus 40 polyadenylation，SV40 pA)；以及 一第二表現卡匣，其係可操作地反向連結於第一表現卡匣，且該第二表現卡匣依序包括： 一第二桿狀病毒啟動子； 一轉錄因子(transcription factor)，其中該轉錄因子為極晚期轉錄因子(very late factor-1，VLF-1)；以及， 一終止子，其包括單純皰疹病毒胸苷激酶聚腺苷化A (herpes simplex virus thymidine kinase polyadenylation，HSV tk pA)。
2. 如請求項1所述之雙向啟動子表現卡匣，其中第一桿狀病毒啟動子包括多角體蛋白質啟動子(polyhedron promoter，Pph)。
3. 如請求項1所述之雙向啟動子表現卡匣，其中桿狀病毒GP64基因序列依序包括信號胜肽(signal peptide，SP)、跨膜區域(transmembrane domain，TM)和細胞質區域(cytoplasmic domain，CTD)。
4. 如請求項3所述之雙向啟動子表現卡匣，其中桿狀病毒GP64基因序列之信號胜肽(SP)與跨膜區域(TM)之間更包括一多種限制酶切位(multiple cloning site，MCS)。
5. 如請求項3所述之雙向啟動子表現卡匣，其中桿狀病毒GP64基因序列之信號胜肽(SP)與跨膜區域(TM)之間更包括豬環狀病毒二型結構外殼蛋白(d41)[porcine circovirus 2-capsid protein d41，PCV2-Cap(d41)]。
6. 如請求項1至5中任一項所述之雙向啟動子表現卡匣，其中第二桿狀病毒啟動子包括P10啟動子。
7. 如請求項6所述之雙向啟動子表現卡匣，其中該至少一脈衝序列的數量為一個，該脈衝序列與桿狀病毒GP64基因序列之間更包含一第一突變序列(mutant signal 1，ms1)，該脈衝序列與該第一突變序列(BSms1)如SEQ ID No：8所示。
8. 如請求項6所述之雙向啟動子表現卡匣，其中該至少一脈衝序列的數量為一個，該脈衝序列與桿狀病毒GP64基因序列之間更包含一第二突變序列(mutant signal 2，ms2)，該脈衝序列與該第二突變序列(BSms2)如SEQ ID No：11所示。
9. 一種包含請求項1至8任一項所述之雙向啟動子表現卡匣之表現載體。
10. 一種基因重組桿狀病毒，其係由如請求項9所述之表現載體轉染(transfection)至昆蟲細胞所形成。
11. 如請求項10所述之基因重組桿狀病毒，其中昆蟲細胞的種類包括Sf-9 (Spodoptera fugiperda )細胞或Hi-5 (BTI-TN-5B1-4)細胞。
12. 一種如請求項9所述之表現載體用於增強蛋白質表現之用途，其係將表現載體轉染至昆蟲細胞。
13. 一種包含如請求項10所述之基因重組桿狀病毒之疫苗，其用以在受體之中產生免疫反應。