TW201908481A

TW201908481A - 使腸病毒去活化之改良方法、佐劑吸附及所獲得之劑量減少的疫苗組成物

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Publication number: TW201908481A
Application number: TW106122622A
Authority: TW
Inventors: 拉傑夫德赫爾; 薩哈吉皮薩; 賈格迪許札德; 拉金德拉薩柏爾
Original assignee: 印度商印度血清研究公司
Priority date: 2017-07-10
Filing date: 2017-07-10
Publication date: 2019-03-01
Also published as: TWI711700B

Abstract

本發明關於在胺基丁三醇(tromethamine)緩衝液的存在下藉由甲醛使腸病毒(Enterovirus)滅活以達到D-抗原最大回收的改良方法。沙賓滅活型脊髓灰質炎疫苗(sIPV)於氫氧化鋁上的隨後吸附提供顯著劑量減少的sIPV組合物。

Description

使腸病毒去活化之改良方法、佐劑吸附及所獲得之劑量減少的疫苗組成物

本發明關於使腸病毒滅活的改良方法、佐劑吸附及所獲得之劑量減少的疫苗組合物。

通過使用基於減毒活的沙賓(Sabin)脊髓灰質炎病毒株的口服的脊髓灰質炎疫苗(OPV)已大大地減少脊髓灰質炎病毒的流行。然而，OPV對於後根除時代具有局限性。因此，開發沙賓滅活型脊髓灰質炎疫苗(沙賓IPV；sIPV)在世界衛生組織(WHO)脊髓灰質炎根除戰略中發揮重要作用。使用減毒的沙賓代替野生型沙克(Salk)脊髓灰質炎病毒株將在疫苗生產過程中提供額外的安全性。此外，為了防止可傳播的疫苗衍生的脊髓灰質炎病毒(cVDPVs)的出現，應在脊髓灰質炎根除後停止使用OPV並以IPV取代。這些cVDPVs是可傳播的且可變成神經毒性的(類似於野生型脊髓灰質炎病毒)而引起與疫苗相關的麻痹性脊髓灰質炎。這樣的病毒株潛在地可以在世界重新傳播脊髓灰質炎病毒並使根除成果無效。

IPV通過肌內(IM)或深層皮下(SC)注射遞送。IPV目前可以呈非佐劑化的獨立配製物或以不同的組合使用，該等組合包括DT-IPV(具有白喉和破傷風類毒素)和六價DTPHepB-Hib-IPV疫苗(另外具有百日咳、B型肝炎和流感嗜血桿菌b)。目前可接受的脊髓灰質炎疫苗的標準劑量含有D抗原，諸如40單位的滅活的脊髓灰質炎病毒1型(Mahoney)、8單位的滅活的脊髓灰質炎病毒2型(MEF-1)和32單位的滅活的脊髓灰質炎病毒3型(Saukett)(例如Infanrix-IPV^TM)。現有的獨立IPV製備不包含佐劑。

大多數專家認同全球使用IPV是優選的，因為彼之被證明的保護性追蹤記錄和安全性。然而，當與OPV比較時，IPV的成本價格明顯較高。這主要是因為下述要求：(i)每劑中更多病毒；(ii)額外的下游處理(即濃縮、純化和滅活)和相關的品管(QC)檢驗；(iii)抗原損失或下游回收差及(iv)容量(containment)。到目前為止，中低收入國家的財務上的挑戰一直是IPV創新和實施的主要不利條件。sIPV的生產成本目前估計等同於IPV的生產成本，其比OPV的生產成本高約20倍。根除脊髓灰質炎病毒後，未來全球對於IPV的需求可能從目前的每年8000萬劑水平增加到每年4.5億劑。因此，將需要“擴大”IPV供應的方法。

在常規疫苗供應不足以滿足全球需要或生產常規疫苗的成本阻礙疫苗在開發中國家以其可承受的價格銷售的情況下，需要劑量減少的有效疫苗製劑，其使用較低劑量的IPV抗原以提供對抗感染的保護。相較於現有的市場販售製劑，接受較低劑量的IPV可能更為安全。因此，需要評估以更能承受的價格製備IPV的多種策略。

對於大流行性流感疫苗的情況，使用佐劑以允許減少劑量、增加可利用性及降低疫苗成本。因此，據推測，sIPV的佐劑化疫苗製劑將降低成本並增加全球可使用的sIPV劑的數量。

全球不同的研究團隊業已進行評估通過使用若干佐劑以使疫苗(特別是流感疫苗)劑量減少(dose sparing)，該等佐劑計有鋁、乳液、TLR激動劑(MPL、CpG、poly-IC、咪喹莫特)、dmLT、1,25-二羥維生素D3、CAF01、聚[二(羧基苯氧基)-磷腈](PCPP)和委內瑞拉馬腦炎(VEE)複製子顆粒。大多數正被研究的佐劑類型遇到下述障礙：i)未知安全性或被監管機構分類為具有毒性、ii)對於施用途徑有限制、iii)缺乏製造再現性及iv)佐劑穩定性。

先前已報導乳液佐劑(MF-59、AS03、AF3)為流感和B型肝炎疫苗提供很強的劑量減少作用(>30倍)。這些佐劑通過在注射部位形成貯存庫而發揮作用，使得抗原物質分配釋放並刺激產生抗體的漿細胞。然而，該等佐劑被認為對於廣泛使用的人類預防性疫苗的使用來說毒性太大且通常被保留用於那些對於副作用具有較高耐受性的嚴重和/或晚期病症，例如癌症。

此外，鋁鹽被認為是安全的且已經用於包含sIPV的組合疫苗，並具有最低的開發障礙且能便宜的生產。然而，鋁佐劑對於允許顯著的劑量減少是未知的。

生產針對病原體的疫苗(特別是病毒疫苗)的最關鍵步驟之一是病毒滅活。在病毒滅活的情況下，福馬林是生產疫苗中最常用的滅活劑。甲醛通過-CH₂-鍵不可逆地交聯表面蛋白質的一級胺基與蛋白質或DNA中的其他鄰近氮原子而滅活病毒。使用福馬林進行病毒滅活的潛在問題是涉及一系列化學反應，這些化學反應產生的反應產物可誘導病毒蛋白的交聯與病毒顆粒的聚集。這可能妨礙福馬林的滅活效率且亦可能導致疫苗中抗原的免疫原性遭受部分破壞。因此，先前已經報導脊髓灰質炎病毒的福馬林滅活可能影響病毒免疫原性及抗原性。參見文獻Morag Ferguson et al.,Journal of General Virology(1993),74,685-690。最重要的是，先前公開的甲醛滅活方法特別是於存在磷酸鹽緩衝液的情況下實施，其中與沙賓I/II/III型的表位修飾一起觀察到顯著的D-抗原損失(滅活後D-抗原回收：對於沙賓I型為22%，對於沙賓II型為15%且對於沙賓Ⅲ型為25%)，因而未能保持表位構象。因此，由經福馬林滅活的脊髓灰質炎病毒(在磷酸鹽緩衝液存在下)的接受者產生的抗體可能不會有助於保護性免疫應答。

當滅活特別有恢復能力的脊髓灰質炎病毒時，通過福馬林與紫外線之組合滅活，科學家們試圖克服單獨的紫外線滅活或福馬林滅活的限制。參見文獻例如McLean,et al.,“Experiences in the Production of Poliovirus Vaccines,”Prog.Med.Virol.,vol 1,pp.122-164(1958)。文獻Taylor et al.,J.Immunol.(1957)79：265-75描述使用福馬林與紫外線之組合滅活脊髓灰質炎病毒。文獻Molner et al.,Am.J.Pub.Health(1958)48：590-8描述在使用紫外線-福馬林滅活的脊髓灰質炎疫苗接種的受試者的血液中生成可測量水平的循環性抗體。文獻Truffelli et al.,Appl.Microbiol.(1967)15：516-27報導通過由福馬林、紫外光和β-丙內酯(BPL)組成的三階段滅活方法滅活腺病毒和猿猴病毒40在倉鼠中的致腫瘤性。文獻Miyamae,Microbiol.Immunol.(1986)30：213-23描述通過紫外線和福馬林處理以製備仙台病毒的免疫原。然而，先前討論的有前景的甲醛替代品，如β-丙內酯(BPL)，被報導在與狂犬病疫苗的其他組分結合時會產生免疫複合物反應。此外，已經顯示在小鼠中產生鱗狀細胞癌、淋巴瘤和肝細胞瘤。

因此，特別希望採用能夠維持沙賓病毒株的抗原結構的結構完整性的有利的甲醛滅活條件及利用可導致顯著劑量減少(即8至10倍減少)的sIPV(沙賓IPV)疫苗組合物的安全且具成本效益的佐劑，使得能降低生產成本、增加疫苗供應且為開發中國家提供可負擔的疫苗。

本案發明人出人意料地發現甲醛滅活後的D-抗原損失可能是由於磷酸鹽緩衝液的存在，此意外地導致脊髓灰質炎病毒的不期望的聚集。本發明提供在TRIS緩衝液的存在下甲醛滅活的改良方法，使得確保最小的表位修飾及隨後最小化D-抗原損失。隨後，可獲得劑量顯著減少的沙賓IPV疫苗組合物，其中對於沙賓1型至少8倍劑量減少且對於沙賓3型至少3倍劑量減少。

本發明的一個重要方面是福馬林滅活和吸附在鋁鹽上的改良方法，該方法包含下述步驟：a)將純化的沙賓IPV產品加入pH介於6.8至7.2之間的TRIS緩衝液(30至50mM)，b)將含有甘胺酸(5gm/l)的M-199培養基加入到(a)的混合物，c)混合時加入0.025%甲醛，d)在磁力攪拌器上，將步驟(c)得到的混合物在37℃下溫育5至13天，e)在第7天將溫育後的混合物進行中度0.22μ過濾並在第13天進行最後過濾，f)將步驟(e)後得到的產物在2至8℃下儲存，g)進行D-Ag ELISA以測定D-抗原單位，h)取所需體積的經高壓滅菌的Al(OH)₃以在50ml容器中得到鋁(Al⁺⁺⁺)的最終濃度為0.8至1.2mg/劑，i)加入具有經調整的D-Ag單位的sIPV產品並使用稀釋劑(10x M-199+0.5甘胺酸%)補充體積，j)調節最終製劑pH並獲得pH介於6至6.5之間的最終製劑， k)將該製劑產物在2至8℃下經隔夜磁力攪拌，且其中步驟(a)的福馬林滅活未在磷酸鹽緩衝液之存在下進行。

本發明的第一個實施方案是在甲醛滅活期間使用的所述緩衝液可選自由TRIS、TBS、MOPS、HEPES和碳酸氫鹽緩衝液組成的組。

該第一個實施方案的優選方面是所述甲醛滅活可在TRIS緩衝液或TBS(TRIS緩衝鹽水)存在下進行，其中該TRIS緩衝液或TBS的濃度選自30mM、40mM和50mM，優選40mM，且該甲醛滅活可在選自6.8、6.9、7、7.1和7.2(優選介於6.8至7.2)之pH下進行，其中所述滅活不使用任何磷酸鹽緩衝液。

本發明的第二個實施方案是經福馬林滅活的sIPV的吸附可在氫氧化鋁上完成，其中該氫氧化鋁的濃度選自1.5mg/劑、1.8mg/劑、2.2mg/劑，優選2mg/劑至2.4mg/劑，且該吸附的pH選自6.2、6.3、6.4和6.5，優選pH為6.5。

本發明的第三個實施方案是所述的福馬林滅活和氫氧化鋁吸附的改良方法可導致滅活後D-抗原回收介於50%至80%之間且氫氧化鋁的吸附百分比可介於85至99%之間。

該第三個實施方案的一個方面是本發明提供福馬林滅活和氫氧化鋁吸附的改良方法，其導致與標準劑量的40 DU-8 DU-32 DU相比，沙賓I型至少8倍的劑量減少且沙賓III型至少3倍的劑量減少。

該第三實施方案的第二方面是本發明提供甲醛滅活和氫氧化鋁吸附的改良方法，其導致疫苗組合物包含i)至少5 D-抗原單位劑量的滅活的1型脊髓灰質炎病毒，ii)至少8 D-抗原單位劑量的滅活的2型脊髓灰質炎病毒，和iii)至少10 D-抗原單位劑量的滅活的3型脊髓灰質炎病毒。

本發明的第四個實施方案是所述鋁鹽佐劑是氫氧化鋁，其在約6.5的pH下的濃度為介於1.5mg/0.5ml劑至2.5mg/0.5ml劑之間，優選為介於2.100mg/0.5ml劑至2.4mg/0.5ml劑之間。

該第四個實施方案的一個方面是三價疫苗(1型、2型和3型)中總鋁含量可為每0.5ml劑中800至1000μg(優選800μg)Al³⁺，其特徵在於至少400μg Al³⁺用於1型、至少200μg Al³⁺用於2型且至少200μg Al³⁺用於3型。

該第四個實施方案的另一方面是所述劑量減少的脊髓灰質炎病毒疫苗組合物可由1型和3型組成且不含2型，其中劑體積可介於0.1至0.4ml之間。

通過本發明之方法製備的所述劑量減少的疫苗組合物可為i)“獨立的sIPV”，其中抗原可包含1型sIPV或2型sIPV或3型sIPV，或1型和2型sIPV，或1型和3型sIPV，或2型和3型sIPV，或1型、2型和3型Sipv，或ii)“包含sIPV的組合疫苗”，其中所述組合疫苗的非IPV抗原可選自但不限於白喉類毒素、破傷風類毒素、全細胞百日咳抗原、無細胞百日咳抗原、B型肝炎表面抗原、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)b抗原、腦膜炎奈瑟氏菌 (Neisseria meningitidis)A抗原、腦膜炎奈瑟氏菌C抗原、腦膜炎奈瑟氏菌W-135抗原、腦膜炎奈瑟氏菌Y抗原、腦膜炎奈瑟氏菌X抗原、腦膜炎奈瑟氏菌B泡或純化的抗原、A型肝炎抗原、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)抗原、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)抗原。

該等非IPV抗原可被吸附到鋁鹽(諸如氫氧化鋁)、鋁鹽(諸如磷酸鋁)或氫氧化鋁和磷酸鋁兩者的混合物上，或者可未被吸附。

脊髓灰質炎病毒可在細胞培養物中生長。該細胞培養物可以是來自猴腎的連續細胞系的VERO細胞系或PMKC。VERO細胞可以方便地在微載體中培養。生長後，可使用超濾、滲濾和層析等技術純化病毒粒子。在給患者施用之前，病毒必須經滅活，該滅活可通過甲醛處理實現。

組合物可存在於小瓶中或可存在於預填充的(ready filled)注射器中。注射器可裝備或不裝備針頭。注射器包含單劑組合物，而小瓶可包括單劑或多劑(例如2劑)。在一個實施方案中，所述劑用於人。在另一個實施方案中，所述劑用於成年人、青少年、幼兒、嬰兒或少於一歲的人且可以通過注射施用。

本發明的疫苗可以單位劑形式或多劑形式(例如2劑)包裝。所述多劑組合物可選自2劑、5劑和10劑。對於多劑形式，小瓶優選於預填充的注射器。可常規地建立有效的劑體積，但用於給人注射的常規劑組合物的體積為0.5 ml。

圖1：在0.9% NaCl中製備的磷酸鋁凝膠(在不同濃度的磷酸鋁凝膠下pH與ζ電位之關係)。

圖2：在WFI中製備的磷酸鋁凝膠(在不同濃度的磷酸鋁凝膠下pH與ζ電位之關係)。

圖3：在0.9% NaCl中製備的氫氧化鋁凝膠(在不同濃度的氫氧化鋁凝膠下pH與ζ電位之關係)。

圖4：在WFI中製備的氫氧化鋁凝膠(在不同濃度的氫氧化鋁凝膠下pH與ζ電位之關係)。

實施例1 沙賓IPV(sIPV)的純化

1)切向流過濾(TFF)：使用具有100Kda盒(0.5m²)的切向流過濾系統將澄清的收穫池濃縮10倍，然後使用磷酸鹽緩衝液(40mM，pH 7.0)滲濾收穫液3次。

2)柱層析：通過離子交換層析(IEC)進行純化。使用Akta探測器(GE Healthcare)，將10倍TFF濃縮物通過裝在層析柱xk-26中的DEAE Sepharose速流(弱陰離子交換劑)。發現負電荷的雜質與層析柱結合，而使用40mM磷酸鹽緩衝液以收集流過液中的脊髓灰質炎病毒。

3)TRIS緩衝液交換：為了使非常麻煩的滅活方法(13天)中抗原損失最小化，將經純化的病毒池經TFF系統(100KDa，0.1m²)從磷酸鹽緩衝液交換為TRIS緩衝液(40mM，pH 7)。將經純化的病毒池經3倍體積的TRIS緩衝液交換。

實施例2 A)sIPV的滅活

加入具有0.5%甘胺酸的10倍濃縮的M-199以得到最終1倍的濃度。在持續攪拌的同時，將滅活劑福馬林(0.025%)加入到經純化的病毒產物。在37℃連續攪拌下進行滅活13天，其包括在第7天和第13天進行0.22 u的過濾。

B)在TRIS緩衝液和磷酸鹽緩衝液中sIPV的滅活

在37℃下使用0.025%甲醛滅活13天。

當在磷酸鹽緩衝液存在下特別地進行甲醛滅活方法時，對沙賓1型觀察到顯著的D-抗原損失。然而，發現在TRIS緩衝液存在下甲醛滅活導致最小的D-抗原損失。

對於sIPV 1、2和3型的D-抗原含量保存，發現40mM濃度的TRIS緩衝液是最有效的。

C)通過ELISA測定D-抗原含量 第1天：平板塗覆

1.吸取100μl特異性牛抗脊髓灰質炎抗體至每個孔槽的PBS。

2.將微量滴定板密封並在室溫培育過夜。

第2天：封閉

1.將該板清洗3次(洗滌/稀釋緩衝液0.05%吐溫(Tween)20於1倍PBS中)。

2.每孔槽吸取加入300μl封閉緩衝液(PBS中1%BSA)。

3.將該板密封並在37±1℃下培育45分鐘。

樣品添加：

1.將該板清洗3次。

2.對除了A行孔槽的所有孔槽加入100μl樣品稀釋液。

3.對2和3列的前兩個孔槽加入100μl標準品。

4.對4至12列的前兩個孔槽加入100μl樣品。

5.預先稀釋樣品至合適的濃度。

6.對1列的前兩個孔槽加入100μl樣品稀釋液。

7.通過從每個孔槽轉移100μl到同列的相鄰孔槽並從最後一個孔槽丟棄100μl，將該列連續兩倍稀釋。

8.在37℃下培育2小時。

9.令該板在4℃下保持過夜。

第3天：加入單株抗體

1.將該板清洗3次。

2.加入100μl經稀釋(1：240)的特異性單株抗體。

3.將該板密封並在37℃下培育2小時。

共軛物：

1.將該板清洗3次。

2.加入100μl經稀釋的共軛物(1型1：2400，2型1：1500，3型1：4800)。

3.將該板密封並在37℃下培育1小時。

加入受質：

1.加入100μl TMB受質到所有孔槽。

2.令混合物在室溫下經培育10分鐘。

3.通過加入100μl 2M H₂SO₄終止反應。

4.在450/630nm下讀取該板。

5.使用KC4軟體計算D-抗原濃度。

實施例3 sIPV的吸附

1.使用經高壓滅菌的1%Al(OH)₃和AlPO₄儲存液以製備製劑。

2.取所需體積的Al(OH)₃/AlPO₄以在100ml的玻璃瓶中獲得所需的鋁濃度。

3.加入已知D-Ag單位的滅活的脊髓灰質炎病毒樣品並使用稀釋液進行體積補充。

4.使用1N HCl/NaOH將最終製劑的pH調節至6.5。

5.在2至8℃下將該製劑產物保持於磁力攪拌器上過夜。

實施例4 預製劑研究

在0.9%鹽水和WFI中製備不同濃度的Al(OH)₃和AlPO₄以檢驗尺寸和ζ電位隨pH的變化。

觀察到在WFI和鹽水存在下，隨pH從5增加到7.5，AlPO₄的ζ電位降低(負電)(參見圖1和圖2)。

然而，Al(OH)₃在鹽水中的ζ電位保持不變且與pH和Al(OH)₃的鹽濃度無關(參見圖3和圖4)。

實施例5 sIPV在磷酸鋁和氫氧化鋁上的吸附研究

發現沙賓3型脊髓灰質炎病毒使用磷酸鋁(AlPO₄)僅僅吸附50至60%。然而，沙賓3型脊髓灰質炎病毒使用Al(OH)₃顯示至少90%吸附。因此，與磷酸鋁相比，發現氫氧化鋁分別對於沙賓1、2和3型吸附更有效。

實施例6 經鋁吸附的sIPV的免疫原性研究

為了檢測大鼠中經佐劑化的sIPV的免疫反應，進行SNT測試(血清中和測試)。分離血清並用於測試特異性脊髓灰質炎病毒的中和抗體的存在。對照組血清用於驗證該測試。亦進行病毒反滴定以獲得加入挑戰病毒顆粒數量。

動物模型：每組50%雄性和50%雌性Wistar大鼠(8周大，約200gm)。

接種途徑：肌肉內。

體積：0.5ml

抽血：第21天。

出血部位：眼眶後血管叢。

出人意料地發現，與具有40 DU/劑的沙克IPV疫苗和具有5 DU/劑的磷酸鋁佐劑的沙賓IPV相比，具有5 DU/劑的氫氧化鋁佐劑的沙賓1型IPV具有較佳的血清轉化。

與8 DU/劑的沙克IPV疫苗相比，8 DU/劑的具有佐劑的2型sIPV得到相等的血清轉化。

與具有32 DU/劑的沙克IPV疫苗相比，發現10 DU/劑的具有佐劑的3型sIPV產生相等的血清轉化。

佐劑化的沙賓脊髓灰質炎病毒的免疫應答

我們觀察到，如果病毒經Al(OH)₃佐劑化，則顯示極好的劑量減少。

如果我們考慮單劑方案以進行免疫，則分別對於沙賓脊髓灰質炎1、2和3型，5-16-10 D-Ag是最好的組合。

如果我們考慮使用兩劑進行免疫，則2.5-8-5給出極好的免疫性。

沙賓的支持性實驗數據

佐劑化的沙克脊髓灰質炎病毒的免疫應答

如果我們考慮單劑方案以進行免疫，則分別對於沙克脊髓灰質炎1、2和3型，8-2-5 D-Ag是最好的組合。

如果我們考慮使用兩劑進行免疫，則5-2-5給出極好的免疫性。

沙克的支持性實驗數據

沙克(10-2-5)單劑的支持性實驗數據

沙克(10-2-12)單劑的支持性實驗數據

沙克(5-8-10)單劑的支持性實驗數據

沙克(7.5-16-10)單劑的支持性實驗數據

鑒於可應用本發明之原理的許多可能的實施方式，應當認為所描述的實施方案僅是本發明的優選實施例，而不應被認為是對本發明範圍的限制。相反地，本發明的範圍係由所附之申請專利範圍限定。因此，本發明包含在該申請專利範圍的範圍和精神內的所有內容。

Claims

一種製備包含腸病毒顆粒的組合物的方法，其中該方法包含下述步驟：a)製備含有腸病毒顆粒的培養基；b)從該培養基純化該腸病毒顆粒；c)穩定所純化的腸病毒顆粒；d)福馬林(formalin)滅活該腸病毒顆粒，其中在至少部分滅活過程中，不同於磷酸鹽緩衝液的緩衝液係以足以防止或減少該腸病毒顆粒聚集的濃度存在，使得與磷酸鹽緩衝液相比，滅活後D-抗原損失降低8至10倍；及e)吸附腸病毒顆粒在鋁鹽佐劑上，其中在鋁上的吸附百分率為至少95%。
如請求項1所述的方法，其中步驟d)的緩衝液選自：TRIS、TBS、MOPS、HEPES和碳酸氫鹽緩衝液。
如請求項2所述的方法，其中該緩衝液是TRIS緩衝液，其pH為約6.8至7.2且濃度範圍為30mM至70mM且優選為40mM。
如請求項1所述的方法，其中步驟e)的鋁鹽佐劑選自氫氧化鋁或磷酸鋁或該兩者的混合物。
如請求項4所述的方法，其中該鋁鹽佐劑是氫氧化鋁，其在約6.5的pH下的濃度為介於1.5mg/0.5ml劑至2.5mg/0.5ml劑且優選為介於2.100mg/0.5ml劑至2.4mg/0.5ml劑。
如請求項5所述的方法，其中在三價疫苗中總鋁含量為每0.5ml劑0.8至1.2mg且優選為0.8mg Al³⁺，其中對於1型為至少0.4mg Al³⁺，對於2型為至少0.2mg Al³⁺且對於3型為至少0.2mg Al³⁺。
如請求項1至6中任一項所述的方法，其中該包含腸病毒顆粒的組合物是疫苗。
如請求項1至7中任一項所述的方法，其中該腸病毒顆粒是脊髓灰質炎病毒之腸病毒顆粒。
如請求項8所述的方法，其中該腸病毒顆粒包含沙賓(Sabin)血清型1型、2型和3型的脊髓灰質炎病毒。
如請求項8所述的方法，其中該腸病毒顆粒包含沙克(Salk)血清型1型IPV(Mahoney毒株)、2型IPV(MEF-1毒株)和/或3型IPV(Saukett毒株)的脊髓灰質炎病毒。
如請求項1至10中任一項所述的方法，其中該疫苗是劑量減少的滅活型脊髓灰質炎疫苗(IPV)。
如請求項1至11中任一項所述的方法，其中該劑量減少的滅活型脊髓灰質炎疫苗包含：i)劑量少於15 D-抗原單位而非標準劑量42 DU的滅活的1型脊髓灰質炎病毒；和/或ii)劑量少於18 D-抗原單位的滅活的2型脊髓灰質炎病毒；和/或iii)劑量少於15 D-抗原單位而非標準劑量32 DU的滅活的3型脊髓灰質炎病毒。
如請求項1至12中任一項所述的方法，其中該劑量減少的滅活型脊髓灰質炎疫苗可選自：i)沙賓單劑組合物，其具有選自5-16-10的沙賓1型、2型及3型組合；ii)沙賓兩劑組合物，其具有選自5-16-10的沙賓1型、2型及3型組合；iii)沙賓單劑組合物，其具有選自2,5-8-5的沙賓1型、2型及3型組合；iv)沙賓兩劑組合物，其具有選自2.5-8-5的沙賓1型、2型及3型組合；v)沙賓單劑組合物，其具有選自5-8-10的沙賓1型、2型及3型組合；vi)沙賓兩劑組合物，其具有選自5-8-10的沙賓1型、 2型及3型組合；vii)沙克單劑組合物，其具有選自7.5-16-10的沙克1型、2型及3型組合；viii)沙克兩劑組合物，其具有選自7.5-16-10的沙克1型、2型及3型組合；ix)沙克單劑組合物，其具有選自8-2-5的沙克1型、2型及3型組合；x)沙克兩劑組合物，其具有選自8-2-5的沙克1型、2型及3型組合；xi)沙克單劑組合物，其具有選自10-2-5的沙克1型、2型及3型組合；xii)沙克兩劑組合物，其具有選自10-2-5的沙克1型、2型及3型組合；xiii)沙克單劑組合物，其具有選自10-2-12的沙克1型、2型及3型組合；xiv)沙克兩劑組合物，其具有選自10-2-12的沙克1型、2型及3型組合；xv)沙克單劑組合物，其具有選自5-2-5的沙克1型、2型及3型組合；及xvi)沙克兩劑組合物，其具有選自5-2-5的沙克1型、2型及3型組合。
如請求項1至13中任一項所述的方法，其中該用於製備含有沙克或沙賓脊髓灰質炎病毒的劑量減少的滅活型脊髓灰質炎疫苗的方法包含下述步驟：a)製備含有該脊髓灰質炎病毒的培養基；b)從該培養基純化該脊髓灰質炎病毒；c)通過加入含有甘胺酸的M-199培養基穩定所純化的脊髓灰質炎病毒；d)在濃度為介於30mM至60mM的TRIS緩衝液存在下藉由使用0.025%甲醛在37℃下滅活該脊髓灰質炎病毒5至13天以防止或減少該脊髓灰質炎病毒顆粒的聚集，使得與磷酸鹽緩衝液相比，滅活後D-抗原損失減少8至10倍；及e)在濃度為介於2至2.5mg/劑的氫氧化鋁佐劑上吸附滅活的脊髓灰質炎病毒，其中對於1型、2型及3型，氫氧化鋁上的吸附百分比大於95%。
如請求項1至13中任一項所述的方法，其中該用於製備含有沙克或沙賓脊髓灰質炎病毒的劑量減少的滅活型脊髓灰質炎疫苗的方法包含下述步驟：a)製備含有該脊髓灰質炎病毒的培養基；b)從該培養基純化該脊髓灰質炎病毒；c)通過加入含有甘胺酸的M-199培養基穩定所純化的脊髓灰質炎病毒；d)在濃度為介於30mM至60mM的TRIS緩衝液存在下藉由使用0.025%甲醛在37℃下滅活該脊髓灰質炎病毒5至13天以防止或減少該脊髓灰質炎病毒顆粒的聚集，使得與磷酸鹽緩衝液相比，滅活後D-抗原損失減少8至10倍；及e)在濃度為介於2至2.5mg/劑的氫氧化鋁佐劑上吸附滅活的脊髓灰質炎病毒，其中對於1型和3型，氫氧化鋁上的吸附百分比大於95%。
如請求項1至15中任一項所述的方法，其中該劑量減少的沙克或沙賓滅活型脊髓灰質炎疫苗不包含2型。
如請求項1至16中任一項所述的方法，其中包含劑量減少的IPV的多價疫苗可包含源自病原體的一或多種抗原，該病原體選自：流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)b、腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)A型、腦膜炎奈瑟氏菌C型、腦膜炎奈瑟氏菌W型、腦膜炎奈瑟氏菌Y型、腦膜炎奈瑟氏菌X型、腦膜炎奈瑟氏菌B型、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)、A型肝炎、B型肝炎、RSV、C型肝炎、白喉類毒素、破傷風類毒素、全細胞百日咳、無細胞百日咳、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、炭疽、霍亂弧菌(Vibrio cholera)、寨卡(Zika)、埃博拉(Ebola)、基孔肯雅熱(Chikungunya)、登革熱、瘧疾、麻疹、腮腺炎、風疹、BCG、日本腦炎、輪狀病毒、天花、志賀氏桿菌、黃熱病、傷寒、CMV、帶狀皰疹、水痘病毒、HPV、HSV和HIV。