TW201901503A - 整合單細胞及血漿游離rna分析 - Google Patents

Abstract

本發明技術之實施例涉及整合單細胞及血漿游離RNA轉錄組學。實施例允許確定可用於鑑別、判定或診斷個體之病狀或病症之表現區域。本文所描述之方法分析游離RNA分子之某些表現區域。所分析之特異性表現區域先前經判定可預示細胞的某種類型或細胞分類。因此，特異性表現區域處之游離讀段之量可能與組織或器官中之細胞數目相關。組織或器官中之細胞數目可能由於細胞死亡、轉移或其他動力學而變化。組織或器官中之細胞數目之變化隨後可在游離RNA中之某些表現區域中反映。

Description

整合單細胞及血漿游離RNA分析

無

個體健康依賴於體內不同器官系統之正常運作及相互作用。各器官系統由專門實現這類目的之多細胞組織構成。在一次估算中，人體由平均37.2萬億細胞構成。已在人類中識別四種基本組織類型-亦即上皮、結締組織、神經及肌肉組織。人類疾病來源於細胞之不當運作或進展。在癌症中，易損細胞獲得基因組中之損傷基因及表觀遺傳變化。這類變化導致基因表現變化且引起異常增殖或癌細胞行為之其他標誌。

在一個實例中，造血系統之主要功能中之一者為維持血液組織作為整體在循環中之適當轉換且人類血液含有不同類型之血球。離心可將人類全血分離為紅色血細胞（red blood cells）（紅血球（erythrocytes））及白色血細胞（white blood cells）（白血球（leukocytes））。已經由細胞之宏觀或微觀形態、對某些類型之組織化學或免疫組織化學染色的反應性、對某些類型之外部刺激的細胞反應、特徵細胞RNA表現圖譜、或細胞DNA之表觀遺傳修飾表明不同類型之血球之更加詳細的分類。

在另一實例中，人類胎盤為妊娠期間調節母體及胎兒穩態之基本器官。其為來源於胎兒且由樹狀絨毛結構之多個單元構成之盤狀實體器官，其在顯微鏡下內襯有單核及多核細胞（滋養層），負責植入母體子宮且調節母胎界面。異常滋養層植入及進展已與妊娠期間潛在致死性高血壓病症有關，如先兆子癇。

在另一實例中，肝臟為由功能性肝細胞（liver cells）（肝細胞（hepatocytes））、排放膽管細胞（膽管上皮細胞）及專門起代謝功能之其他結締組織類型之細胞構成。已知B型肝炎病毒（Hepatitis B virus；HBV）感染肝細胞，整合至肝臟中之肝細胞基因組且導致慢性肝細胞死亡及炎症（慢性肝炎）。肝炎之重複修復反應用結疤細胞（纖維母細胞）替代肝細胞，因此形成肝硬化。在延長的細胞死亡及再生期間肝細胞基因組中之基因突變之積累導致肝細胞之惡性轉化，亦即肝細胞癌（HCC）。HBV相關之HCC佔一些地區（例如香港）中之肝癌之約80%。

偵測器官系統中之細胞異常及疾病存在通常需要所關注之器官之直接組織取樣（活檢），此可攜帶侵入性程序之感染及出血風險。藉由成像進行之非侵入性評估，諸如超聲波掃描提供器官（諸如血流）之形態及特異性功能資訊。已將肝臟超聲波檢查用於篩選慢性HBV肝炎患者之肝癌且將子宮動脈都卜勒（Doppler）分析用於早期妊娠之先兆子癇預測。然而，此等需要受過良好訓練之操作員進行評估且不直接評估細胞畸變。

需要偵測器官系統中之細胞異常及疾病存在之非侵入性方法。解決此等及其他改善。

本發明技術之實施例涉及整合單細胞及血漿游離RNA轉錄組學。實施例允許測定可用於鑑別、判定或診斷個體中之病狀或病症之表現區域。本文所描述之方法分析某些表現區域之游離RNA分子。所分析之特異性表現區域經先前判定對於某一類型之細胞或細胞群組為指示性的。因此，在特異性表現區域處之游離讀段之量可能與組織或器官中之細胞數目相關。組織或器官中之細胞數目可能由於細胞死亡、癌轉移或其他動力學而變化。組織或器官中之細胞數目之變化隨後可在游離RNA中之某些表現區域中反映。

本發明技術中之實例方法包含分析來自獲自多個第一個體之細胞RNA分子之讀段。基於在各叢集中優先表現且不在其他叢集中優先表現之區域將RNA分子分組為叢集。此等叢集可與某些類型之細胞相關聯。分別地，游離RNA樣品獲自具有不同病狀程度之多個第二個體。分析游離RNA樣品以測定可用於區分不同病狀程度之一個或多個表現區域之一或多組。一個或多個表現區域之一個或多個組可隨後用作表現標記以用於將未來樣品分類為病狀之不同程度。

首先經由細胞分析確定之表現區域之游離RNA樣品的分析可能提供測定個體之病狀程度之較少嘈雜及更精確方法。因為不同類型之細胞可隨病狀程度變化，所以可使用若干表現區域追蹤病狀。與使用針對病狀之單個基因組標記相比較，本文所描述之方法亦可提供較強的信號。另外，本文所描述之方法簡化篩選方法使得需要針對與病狀之相關性分析較少表現區域。

可參考以下詳細描述及隨附圖式來獲得對本發明實施例之性質及優勢的較佳理解。

術語

「組織 」對應於一群細胞，其共同歸類為一個功能單元。可在單一組織中找到超過一種類型之細胞。不同類型之組織可由不同類型之細胞（例如肝細胞、肺泡細胞或血球）組成，但亦可對應於來自不同生物體（母體與胎兒）的組織或對應於健康細胞與腫瘤細胞。

「生物樣品 」指代取自個體（例如人類，諸如孕婦、患有癌症之個人、或疑似患有癌症之個人、器官移植接受者或疑似患有涉及器官（例如心肌梗塞中之心臟、或中風中之大腦、或貧血中之造血系統）之疾病過程之個體）且含有所關注之一種或多種核酸分子之任何樣品。生物樣品可為體液，諸如血液、血漿、血清、尿液、陰道液、來自（例如睪丸）水囊腫之液體、陰道沖洗液、胸膜液、腹水、腦脊髓液、唾液、汗液、淚液、痰液、支氣管肺泡灌洗液、乳頭排出液、來自身體不同部位(例如甲狀腺、乳房)之抽吸液等。亦可使用糞便樣品。在各種實施例中，游離DNA已富集之生物樣品（例如經由離心方案獲得之血漿樣品）中之大部分DNA可為游離的，例如大於50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%之DNA可為游離的。離心方案可包含例如3,000 g×10分鐘獲得流體部分，及例如30,000 g再離心另外10分鐘以移除殘餘細胞。樣品中之游離DNA可來源於各種組織之細胞，且因此樣品可包含游離DNA之混合物。

「核酸 」可指去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其呈單股或雙股形式之聚合物。所述術語可涵蓋含有已知核苷酸類似物或經修飾主鏈殘基或鍵聯之核酸，其為合成的、天然產生的及非天然產生的，具有與參考核酸類似之結合性質，且以類似於參考核苷酸之方式代謝。這類類似物之實例可包含但不限於硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、膦酸甲酯、對掌性膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸（PNA）。

除非另有指示，否則特定核酸序列亦隱含地涵蓋其經保守性修飾之變異體(例如簡併密碼子取代)及互補序列，以及明確指示之序列。特定言之，簡併密碼子取代可藉由產生一個或多個（或所有）所選擇之密碼子之第三位置經混合鹼基及/或去氧肌苷殘基取代之序列來達成(Batzer等人,《核酸研究（ Nucleic Acid Res .）》 19:5081 (1991)；Ohtsuka等人,《生物化學雜誌（ J . Biol . Chem . ）》 260:2605-2608 (1985)；Rossolini等人,《分子及細胞探針（ Mol . Cell . Probes ）》 8:91-98 (1994))。術語核酸可與基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸及聚核苷酸互換使用。

如本揭示中所使用之術語「截斷值 」或量意謂用於判斷分類之兩個或超過兩個陳述之間的數值或量-例如細胞是否類似於一種類型之細胞。舉例而言，若參數大於截止值，則認為細胞不為所述類型之細胞，或若參數小於截止值，則認為細胞為所述類型之細胞或未確定。 詳細說明

細胞被動或主動地將細胞核酸分子（DNA或RNA）釋放至胞外環境中。此等胞外游離核酸分子可在循環血漿中偵測到。在妊娠中，據估計胎兒衍生之RNA之百分數自早期妊娠中之僅3.7%增加至晚期妊娠中之11.28%（1，2）。因為RNA轉錄為細胞型特異性的，所以吾人推論有可能在不直接取樣組織下藉由分析對所關注之細胞型具有特異性之血漿中的多個游離RNA轉錄物之圖譜推斷細胞型特異性變化及畸變。

在妊娠健康評估之環境中，若干組已探索使用胎兒特異性DNA多態性、器官特異性DNA甲基化（3）、DNA斷裂圖案（4，5）及組織特異性RNA轉錄物（2）分離循環游離胎兒核酸庫中之胎盤比重且獲得胎盤比重之總體變化。然而，此等方法不足以檢查胎盤中之不同胎兒及母體組分之動態且區分細胞水準下之不同妊娠病理中之胎盤的特異性病理變化。

一個困難為確認RNA轉錄物之來源。已展示母體血漿中之胎兒RNA為胎盤衍生的（6），且最近亦已在母體血漿（2）中報告認為來源於其他非胎盤胎兒組織之RNA轉錄物。此等RNA轉錄物之組織來源常常自多個組織樣品之整個組織基因表現圖譜之比較推斷。如上文所述，生物組織由源自不同發育譜系之多個細胞型構成。來自整個組織之表現圖譜因此提供群體之平均化估算，扭曲組織之實際非均相組成且朝向在組織樣品中具有最高細胞數目之細胞偏置，諸如胎盤中之滋養層。先前研究已表明有可能基於單細胞轉錄組RNA圖譜及所鑑別之細胞型特異性基因（7-10）仔細分析複雜生物器官之細胞異質性。因此技術上可實行的為測定器官之代表性組織樣品之個體單細胞的RNA表現圖譜代替分析均質化塊體之組織樣品。

源組織（例如妊娠中之胎盤）之細胞異質性資訊能否有效地保留在血漿RNA中，目前仍為不明確的。若所關注之器官之不同細胞型的信號可經由血漿RNA分析獲得，則此類信號可分別或以組合定量及分析以

偵測（例如妊娠期間胎盤之）細胞病理學及疾病，或具有癌症之器官，或自體免疫疾病中之血球。

血漿中之游離循環RNA之生物特性及降解機制不同於細胞RNA，例如血漿RNA與血漿中之可過濾物質相關且可在某些轉錄物中展示5'優勢（11，12）。個體細胞型特異性標記自組織至血漿之外推並非直接的，例如來自胎兒造血組織之胎兒恆河猴D mRNA無法輕易地在恆河猴D-陰性孕婦之血漿中偵測到，儘管胎兒臍帶血中表現水準較高（13）。另外，已知游離循環RNA之池由不同組織源提供，且造血組織及血球為主要組分。

吾人研發實現這一目標之分析方法。吾人將細胞異質性之單細胞轉錄組RNA資訊集成至血漿RNA分析中，且導出用於定量及監測自身免疫疾病、癌症及產前病狀中之血漿游離中之複雜器官的不同細胞組分之信號的度量。一般概述

圖 1 為使用妊娠及先兆子癇作為實例解釋細胞動態監測及畸變發現中之單細胞及血漿RNA轉錄組之整合分析的圖示。然而，可將方法應用於自身免疫疾病、癌症及其他病狀。圖1提供技術之一般概述。後續論述態樣及其他實施例之其他細節。

在圖式110中，胎兒112展示於懷孕女性114中。胎盤116維持妊娠健康之母胎界面。

圖式120展示胎盤116之一部分且展示器官由起不同作用之多種類型細胞構成。源器官（胎盤）組織在此實例中解離為單個細胞。先兆子癇用作圖式110及120中之病狀，但可將實施例應用於其他病狀，從而產生相似的程序及圖示。舉例而言，圖式110可展示肝臟，且圖式120可展示肝臟組織中之不同細胞。

可獲取胎盤或所關注之其他器官之活檢。來自活檢之細胞隨後可經歷轉錄組圖譜分析，例如在分離單個細胞之後。轉錄組圖譜分析可測定多個基因組區域之表現水準。可使用此等多個區域處之表現水準鑑別在某些區域（例如優先表現叢集之區域）具有相似表現水準之細胞叢。

圖式130展示單細胞轉錄組圖譜可藉由各種技術獲得，諸如微量滴定盤格式化化學方法或基於微流液滴之技術。可取得若干活檢體使得細胞不限於來自單個個體之彼等細胞。在一些實例中，亦可獲得來自分離源之細胞（例如外周血液單核細胞[PBMC]）以與來自活檢之細胞之分析合併。單細胞RNA結果可分別獲得。結果可使用電腦系統合併並隨後去除批次偏差。在癌症中，具有腫瘤之組織細胞可連同血液相關之細胞系譜（諸如淋巴及髓樣細胞）分析。

圖式140展示胎盤細胞可基於轉錄相似性（例如優先表現區域中之相似表現水準）分組為不同叢集。分組為叢集可基於來自某些基因之RNA讀段之相似圖案。圖案可基於來自基因之讀段之絕對或相對（例如分級）量。舉例而言，某一叢集可具有：具有最多數目之讀段之第一基因及讀段數目第二多之第二基因。作為另一實例，圖案可為唯一存在於特定叢集中之具有相似表現水準（絕對量、相對比例或相對等級）之若干基因或可為就特定叢集中之表現水準而言具有獨特順序之若干基因。

共有相似圖案之細胞可在2D或較高維空間中聚集在一起。舉例而言，單細胞轉錄組學資料中基於所有可量測基因之兩個細胞之間的皮爾遜相關係數（Pearson's correlation coefficients）可用於量測表現圖譜之類似性。亦可使用其他統計，例如歐幾里得距離（Euclidean distance）、平方歐氏距離（squared Euclidean distance）、餘弦相似度（Cosine similarity）、曼哈坦距離（Manhattan distance）、最大距離、最小距離、馬哈朗諾比斯距離（Mahalanobis distance）或藉由一組重量調節之前述距離。分組可使用主分量分析（principal component analysis；PCA）或本文中所描述之其他技術進行。各叢集可對應於一種類型之細胞或細胞類別。若使用細胞之超過一種源（例如胎盤及PBMC），則可針對合併之資料集進行群聚分析。

在圖式150中，各細胞型之細胞型特異性標記經鑑別且藉由表現特異性計算上過濾以產生細胞型特異性基因組。圖式150中之各圖片，諸如圖片152、154及156表示特異性基因。可已知此等基因在特定類型之細胞中高度表現。各圖片中之更多紅色資料點代表所關注之基因之越高表現。因此，與其他叢集相比對應於相對更多之紅色資料點之基因表明與特異性叢集更加相關。圖式150中之叢集對應於圖式140中之相同安置之叢集。舉例而言，組154及156中所展示之基因展示與圖式140中之叢集142之相關性。組154及156中所表示之基因可認為係叢集142之優先表現區域。

圖式150之結果可將圖式140中之特定叢集鑑別為對應於特定類型之細胞。以此方式，特定類型之細胞之優先表現區域的先前知識連同具有相似轉錄圖譜之細胞叢之組合可用於鑑別細胞型之新的優先表現區域。在一些實施例中，不需要得知特定細胞型之來源（例如肝臟、胎兒等），因為仍已知細胞具有相同類型。而且，可足以知曉在後續步驟中測試時，細胞叢之優先表現區域提供對不同病狀程度之足夠辨別力。

圖式160展示在測定不同叢集或細胞型之優先表現區域之後，測試諸如血漿之游離樣品。測試來自多個個體之多個游離樣品。可將個體分組為具有不同病狀程度之群體。就先兆子癇而言，病狀程度可為先兆子癇之嚴重程度或僅先兆子癇之存在。各細胞型中之優先表現基因之表現經定量且合計以計算血漿RNA圖譜中之細胞型特異性標誌之值。

圖式170展示某些基因之表現水準之總體值可用於連續監測血漿中之對應細胞組分之動態變化（在此實例中妊娠進展）或鑑別健康妊娠與患有特異性疾病（在此實例中絨毛外滋養細胞）之間的細胞型特異性畸變（在此實例中早產先兆子癇）。在圖式170中，水平軸線為胎齡，且曲線展示不同群體之量測，其中某些胎齡處較大間距說明表現標記（針對細胞叢所確定之優先表現基因組）可區分群體。因此，此類表現標記可用於鑑別相對於未患有病狀，患有病狀之個體。測定表現標記之實例方法

圖 2 展示實施例，所述實施例包含鑑別表現標記以區分不同病狀程度的方法200。作為實例，病狀程度可為病狀是否存在、病狀之嚴重程度、病狀階段、病狀展望、病狀對治療之反應、或病狀之嚴重程度或進展之另一量測。

病狀可為妊娠相關之病狀。作為實例，妊娠相關之病狀可包含先兆子癇、宮內發育遲緩、侵入性胎盤形成、早產、新生兒之溶血性疾病、胎盤功能不全、胎兒水腫、胎兒畸形、HELLP綜合征、全身性紅斑性狼瘡症（systemic lupus erythematosus；SLE）、或母親之其他免疫疾病。妊娠相關之病狀可包含特徵為母體或胎兒組織中之基因之異常相對表現水準的病症。在一些實施例中，妊娠相關之病狀可為胎齡。

在其他實施例中，病狀可包含癌症。作為實例，癌症可包含肝細胞癌、肺癌、結腸直腸癌、鼻咽癌、乳癌或任何其它癌症。病狀可包含癌症與例如B型肝炎感染之病症的組合。作為實例，癌症程度可為癌症是否存在、癌症階段（例如早期及晚期）、腫瘤尺寸、癌症對治療之反應、或癌症之嚴重程度或進展之另一量測。病狀可包含自體免疫疾病，包含全身性紅斑性狼瘡症（SLE）。

可獲得包含多個細胞之樣品。可分離多個細胞之各細胞以能夠分析特定細胞之RNA分子。樣品可用活檢獲得。胎盤組織樣品可藉由絨毛膜取樣（chorionic villus sampling；CVS）、藉由羊水穿刺術獲得，或自胎盤遞送足月獲得。器官組織樣品（例如對於癌症而言）可用手術活檢獲得。一些樣品可能不會涉及切口或切割，例如從而獲得血液（例如對於血液癌症而言）。

在區塊202處，分析細胞之RNA分子以獲得讀段組。重複對獲自一個或多個第一個體之多個細胞之各細胞的分析，且因此分析獲得多組讀段。分析可以各種方式進行，例如測序或使用探針（例如螢光探針），如可使用微陣列或PCR實施，或本文所提供的其他實例技術。此類程序可涉及增殖程序，例如經由擴增或捕獲。

多個細胞之各細胞之RNA分子可用細胞之唯一碼標記，使得相關讀段包含唯一碼。另外，對於多個細胞之各細胞而言，與對應於細胞之唯一碼相關之讀段組可儲存在電腦系統之記憶體中。電腦系統可為用於RNA分析之專用電腦系統，包含本文所描述之任何電腦系統。

若病狀為妊娠相關之病狀，則第一個體可為分別懷有胎兒之女性個體。多個細胞可包含胎盤細胞、羊膜細胞或絨毛膜細胞。若病狀為癌症，則第一個體可為患有或未患癌症之個體，其中多個細胞可包含來自各種器官之細胞，例如包含肝細胞。若病狀為全身性紅斑性狼瘡症（SLE），則第一個體可為患有或未患SLE之個體，其中多個細胞可包含腎細胞、胎盤細胞或PBMC。

讀段組可包含序列讀段，所述序列讀段包含經由大規模平行定序（包含成對最終定序）隨機獲得之彼等。讀段組亦可經由以下獲得：逆轉錄PCR（RT-PCR）（其使用探針鑑別某一區域之存在）、數位PCR（基於液滴或基於孔之數位PCR）、西方墨點法、北方墨點法、螢光原位雜交（fluorescent in situ hybridization；FISH）、基因表現系列分析（serial analysis of gene expression；SAGE）、微陣列或定序。

在區塊204處，對於讀段組之各讀段，對應於讀段之參考序列中之表現區域藉由電腦系統鑑別。參考序列可為人類參考轉錄組（例如自UCSC refGene或de novo組裝轉錄物下載之資料）及/或人類參考基因組（例如UCSC Hg19）。針對多個細胞之各細胞之讀段組的各讀段重複鑑別參考序列中之表現區域。鑑別對應於讀段之參考序列可包含使用讀段及參考序列之多個表現區域進行比對程序。

在區塊206處，對於多個表現區域中之每一者，測定對應於表現區域之讀段量。亦針對多個細胞之各細胞之多個表現區域中的每一者重複測定讀段量。作為實例，讀段量可為讀段數目、讀段之總長度、讀段百分比或讀段比例。讀段量可為獨特分子標識符（unique molecular identifiers；UMI）之數目。使用UMI標識原始RNA分子。

測定對應於第一細胞之第一表現區域之讀段量可使用對應於第一細胞之唯一碼以便鑑別對應於第一細胞之讀段，從而確定對應於特定區域（例如來源於所述區域）之讀段，亦可用基於探針之技術測定之讀段。測定讀段量亦可使用第一細胞之讀段組之比對程序的結果。唯一碼可為用分子之實際RNA序列定序之條形碼。條形碼可不同於UMI，因為條形碼用於測定細胞，而UMI用於標識原始RNA分子。來自同一細胞之兩個RNA分子將具有相同條形碼但不同UMI。

在區塊208處，對於多個表現區域中之每一者，表現區域之表現分數使用對應於區域之序列讀段之量確定。因此，確定包含多個表現區域之表現分數之多維表現點。各細胞之多維表現點可包含各表現區域之細胞中之表現分數。舉例而言，多維表現點可為具有基因1之表現分數、基因2之表現分數、基因3之表現分數等之陣列。亦針對多個細胞之各細胞之多個表現區域中的每一者重複測定表現區域之表現分數。表現分數之實例後續提供，但可包含區域之讀段之絕對數目、區域之讀段之比例數目、或其他標準化讀段量。

在區塊210處，使用對應於多個細胞之多維表現點將多個細胞分組為多個叢集。多個叢集可少於多個細胞。將多個細胞分組為多個叢集可包含進行多維表現點之主分量分析且進行降維方法，諸如主分量分析（PCA）或擴散映射，或藉由使用基於力之方法，諸如t-分佈隨機鄰域嵌入（t-SNE）。叢集可使用來自t-SNE或其他曲線之空間參數確定。舉例而言，可確定叢集，其中在曲線中之叢集與另一叢集之間存在最小空間。分組可為表現區域之讀段量或讀段量之圖案的結果。

叢集可進一步分組為子叢集或子組。可進一步劃分叢集，因為先驗知識可表明細胞之子類別存在。另外，可使用統計方法繼續分組叢集、子叢集等。可繼續分組直至叢集內之差異最小化或達到目標值。另外，可繼續分組以獲得叢集之最優數目從而最大化平均輪廓（Peter J. Rousseeuw (1987). 《輪廓：群聚分析之解釋及驗證之圖形輔助（Silhouettes: a Graphical Aid to the Interpretation and Validation of Cluster Analysis.）》 Computational and Applied Mathematics. 20: 53-65）或間隙統計（R. Tibshirani, G. Walther,及T. Hastie (Stanford University, 2001). http://web.stanford.edu/~hastie/Papers/gap.pdf）。使用間隙統計平均具有無規均勻分佈之參考資料集（計算模擬）與所觀察叢集之間的叢集內差異之偏差。

在區塊212處，對於多個叢集之各叢集，測定在指定速率下在叢集之細胞中表現多於其他叢集之細胞的一個或多個優先表現區域組。指定速率可包含自叢集之細胞之平均表現分數及其他叢集之細胞之平均表現分數確定的值。舉例而言，指定速率可等於其他叢集之細胞之許多標準差（例如一個、兩個或三個）。在其他實施例中，指定速率可為z分值，其描述叢集細胞之平均表現分數高於其他叢集細胞之平均表現分數之標準差數目。在一些實施例中，指定速率可為高於其他叢集之細胞之平均表現分數的某一百分比。指定速率可表示截斷值或臨限值以表明來自其他叢集之細胞之平均表現分數的統計學差異。

藉由比較第一叢集之一個或多個優先表現區域之組與已知在第一類型之細胞中優先表現之一個或多個區域鑑別多個叢集之第一叢集以包含第一類型之細胞。舉例而言，可已知基質細胞優先表現某一區域。具有至少一個或多個優先表現區域組中之所述區域之叢集可隨後推論為基質細胞。具有一種類型之細胞之叢集的締合可基於超過一個優先表現區域。在一些實施例中，叢集可能不會與一種類型之細胞相關聯，因為可能不會將細胞型之鑑別用於進一步分析。

細胞之實例類型可包含蛻膜細胞、內皮細胞、血管平滑肌細胞、基質細胞、樹突狀細胞、霍夫包爾氏（Hofbauer）細胞、T細胞、紅血球母細胞、絨毛外滋養細胞、細胞營養層細胞、融合細胞滋養層細胞、B細胞、單核球、肝細胞樣細胞、膽管上皮樣細胞、肌纖維母細胞樣細胞、內皮細胞、淋巴細胞或髓樣細胞。

在區塊214處，分析多個游離RNA分子以獲得多個游離讀段。針對多個游離RNA樣品之各游離RNA樣品重複分析。多個游離RNA樣品來自第二個體之多個群體。多個群體之各群體可具有不同病狀程度。舉例而言，多個群體可包含無病狀之群體、患有處於早期之病狀之群體、患有處於中期之病狀之群體。

群體可具有描述第二個體之其他特徵之子群體。舉例而言，子群體可具有與病狀或第二個體相關之相同時間態樣。子群體可為病狀之持續時間、治療病狀之持續時間、自癌症診斷之時間或手術後存活時間。在一些實施例中，子群體可具有相同性別、相同種族、相同地理位置、相同年齡、或第二個體之其他相同特徵。

游離RNA樣品可獲自第二個體之血漿或血清（或包含游離RNA之其他生物樣品）。第二個體可為與第一個體相同之個體。然而，在一些實施例中，第二個體可與第一個體不同。在其他實施例中，第二個體之一些個體與第一個體相同，而第二個體之一些個體不同於第一個體之其餘者。

若病狀為妊娠相關之病狀，則第二個體可為分別懷有胎兒之女性個體。各群體可包含針對與群體相關之相同病狀程度具有不同胎齡之子群體。子群體亦可包含女性個體之相似年齡、胎兒父親之相似年齡、或女性個體之相似生活方式。

若病狀為癌症，則第二個體可包含患有腫瘤之個體且可任選地包含未患腫瘤之個體。癌症之子群體可為患有癌症之個體，其展示相似的分子陽性（例如患有HER2陽性子群體之乳癌）。在一些實施例中，子群體可為伴隨其他臨床併發症（諸如糖尿病）之患有癌症之個體。子群體可具有相似年齡、性別、腫瘤解剖結構、癌轉移狀況或生活方式。

在區塊216處，對於一個或多個優先表現區域之多個組之一個或多個優先表現區域之各組而言，使用對應於一個或多個優先表現區域組之游離讀段量測對應叢集之標誌分數。針對多個游離RNA樣品之各游離RNA樣品之一個或多個優先表現區域的各組重複量測。

標誌分數可以各種方式確定，例如作為對應叢集之一個或多個優先表現區域之表現水準的平均值。平均值可為均值、中值或眾數。

標誌分數可為自以下計算：其中S 為標誌分數，n 為組中之細胞特異性表現區域之總數目，且E 為細胞特異性表現區域之表現水準。

在區塊218處，基於標誌分數將一個或多個優先表現區域組中之一或多者鑑別為一個或多個表現標記以用於分類未來樣品從而區分不同病狀程度。表現標記共同地指代一個或多個優先表現區域組。

優先表現區域可藉由鑑別統計學上不同於叢集中之其他群體之標誌分數的群體及叢集之標誌分數來鑑別。舉例而言，患有病狀之群體之優先表現區域可具有統計學上高於未患有病狀之群體之優先表現區域的標誌分數的標誌分數。統計學差異可藉由設定許多標準差測定，群體之標誌分數高於其他群體之標誌分數。統計學差異可藉由t-測試或另一合適統計測試確定。

一個或多個優先表現區域組之所有或一部分可以用作表現標記。一個或多個優先表現區域之第一組可為區分第一胎齡之不同病狀程度的第一表現標記。

多個叢集之第一叢集之一個或多個優先表現區域的第一組可為區分第一組織之癌症程度之第一表現標記。第一叢集可包含來自第一組織之細胞。第一組織可來自肝臟，且第一叢集可包含肝細胞。組織細胞可包含腫瘤細胞及非腫瘤細胞，在一些實施例中，細胞可不包含腫瘤細胞。在一些實施例中，組織細胞可包含正常細胞及異常細胞，所述異常細胞可能為病理的。在實施例中，第一組織可來自肺部、喉、胃、膽囊、胰臟、腸、結腸、腎、前列腺、乳房、骨、肝臟、血球（包含T細胞、B細胞、嗜鹼性球、單核球、巨噬細胞、巨核細胞、凝血球及自然殺手細胞）以及骨髓、脾、結腸、鼻咽、食道、大腦、或心臟，且第一叢集可為來自對應組織之細胞。

在一些實施例中，細胞分析可包含多個類型之細胞之分析。舉例而言，可分析一個或多個優先表現區域組之胎盤細胞。另外，亦可分析一個或多個優先表現區域之另一組之PBMC。因為來自胎盤及PBMC兩者之RNA分子可存在於血漿游離樣品中，所以胎盤及PBMC中之表現標記可在游離樣品中鑑別以用於分類未來樣品從而區分不同病狀程度。亦可分析白血球。分析血漿中之多種類型之細胞以有助於理解血漿中之組織細胞動力學。舉例而言，使用PBMC或白血球可幫助闡明血球將RNA排入血液循環之潛能。隨著更多單細胞轉錄組學資料可用於更多組織（例如腎、肺、結腸、心臟、大腦、小腸、膀胱、睪丸、卵巢、乳房），可更好地理解及監測血漿RNA相對於細胞來源之動力學。方法亦可允許使游離RNA與細胞型相關聯。經由游離RNA分析藉由理解某些類型之細胞之量的增加及減少，可實現更好地理解潛在病狀及更好地理解如何治療病狀。

本文所描述之方法200及其他方法之優勢包含可比其他技術更加有效及精確地鑑別表現標記。本文所描述之方法可允許使用多個區域代替僅一個基因組標記，從而區分不同病狀程度。因此，方法對量測區域之量中之可能的實驗誤差具有更強的穩定性。特定塊體組織包含多個亞型之細胞。舉例而言，白血球包含T細胞、B細胞及嗜鹼性球等，其中嗜鹼性球為主要群體（＞70%）。使用測定白血球與其他組織之間的差異表現基因（例如基因組標記）之習知方式，所得標記將具有T細胞、B細胞及嗜鹼性球之間的相似圖案且可並非任何類型之血球所獨有的。因此，血漿RNA結果中所見之任何變化可能不會有效區分血球類型，此將降低在測定病狀程度中之敏感度及準確度。舉例而言，在患有B細胞淋巴瘤之患者中，預期B細胞將由於B細胞增殖而增加。然而，習知方法將看見白血球之增加信號但無法告知促進信號增加之根源。習知方法將不能夠為診斷提供資訊性線索。但基於單細胞RNA之標記允許吾等追蹤指引來源細胞之動態變化。

實施例亦具有在信號相比於背景較低時區分基因與特定來源之優勢。舉例而言，特定細胞型之組織或器官（例如肝臟）中之基因信號在循環RNA分子中由於血球衍生之RNA以及所述組織或器官中之另一細胞型之占絕對優勢的背景可較為脆弱。使用單細胞RNA結果，方法能夠去除與背景共有重疊信號之基因且具體言之聚集展示針對與疾病相關之細胞型之特異性表現水準的基因。舉例而言，與血球相比，根據肝臟組織之RNA序列資料，ALB轉錄物對肝臟具有特異性。然而，ALB表現水準無法用於區分HCC個體與HBV攜帶者，這歸因於與背景肝細胞及單個標記之脆弱信號相比，ALB表現水準缺乏腫瘤細胞之特異性。在使用單細胞RNA定序方法之情況下，吾人可揭示相對於背景肝細胞之腫瘤細胞特異性轉錄物且聚集更多標記以提高信號雜訊比，如藉由本文件中稍後描述之接收者操作特徵曲線（receiver operating characteristic；ROC）所證明。測定個體內之病狀程度之實例方法

所述方法可包含測定第三個體中之病狀程度。第三個體可為不同於包含於第一個體或第二個體中之任何個體的個體。所述方法可進一步包含自獲自第三個體之生物樣品之游離RNA分子的分析接收多個游離讀段。在一些實施例中，可分析獲自第三個體之生物樣品之多個游離RNA分子以獲得多個游離讀段。游離RNA分子之分析可藉由本文所描述之任何適合方法。對於第一表現標記之各優先表現區域，確定優先表現區域之讀段量。讀段量可為本文所描述之任何量。

比較一個或多個優先表現區域之讀段量與一個或多個參考值。比較可包含比較各優先表現區域之讀段量與各優先表現區域之參考值。其中讀段量超過參考值之優先表現區域之總數目隨後可用於比較且可需要滿足或超過某一數目或百分比。舉例而言，其中讀段量超過對應參考值之優先表現區域之總數目可滿足或超過表現標記中之優先表現區域之數目的50%、60%、70%、80%、90%、或100%以便判定病狀程度。在一些實施例中，比較可包含計算一個或多個優先表現區域之讀段量之總分數，且比較總分數與一個參考值。總分數可自求和多個優先表現區域之讀段量計算，所述多個優先表現區域可包含表現標記之所有優先表現區域。若總分數超過參考值，則可確定病狀程度。

可自先前測試之個體（包含多個第二個體）先前測定一個或多個參考值。參考值可基於未患病狀之個體之平均值，且參考值可為表明統計學上不同值之截斷值。舉例而言，參考值可為超過優先表現區域之讀段之平均量的一個、兩個或三個標準差。

基於一個或多個優先表現區域之讀段量與一個或多個參考值之比較，判定第三個體之病狀程度。讀段量與一個或多個參考值之間的間距可表明在測定病狀程度中之可信度。舉例而言，與當讀段量遠大於參考值時相比，大於參考值之讀段量可表明病狀程度之較低可信度或機率。

在一些實施例中，多個表現標記可用於相等的複數種病狀程度。優先表現區域組之讀段量可與適於複數種病狀程度中之各程度之參考值相比。在一些情況下，讀段量可超過多種病狀程度之參考值。病狀程度可基於參考值或值在各程度的超出程度而判定。其中參考值超出最多之程度可確定為病狀程度。

方法可進一步包含治療第三個體之病狀。若病狀為先兆子癇，則治療可包含增加產前醫師問診頻率、臥床或引產。若病狀為癌症，則治療可包含手術、輻射療法、化學療法、免疫療法、靶向療法、激素療法、幹細胞移植或精確醫學。

在一些實施例中，測定第三個體中之病狀程度可自用於鑑別一個或多個表現標記之方法分別進行。舉例而言，可提供或已知一個或多個表現標記。可隨後如上文所述分析包含來自第三個體之游離RNA分子之生物樣品以測定第三個體之病狀程度。使用時間資訊選擇表現標記之實例方法

如上文所述，子群體之特徵可為患有與病狀或第二個體相關之相同時間態樣。圖 3 展示在測定個體中之病狀程度中使用時間相關之子群體的方法300。病狀可包含妊娠相關之病狀、先兆子癇、癌症、SLE或本文所描述之任何其它病狀。

在區塊302處，自獲自個體之生物樣品之游離RNA分子的分析接收多個游離讀段。可以本文所描述之任何方式接受多個游離讀段。方法可進一步包含獲得包含游離RNA分子之生物樣品並隨後分析游離RNA分子以獲得如本文所述之游離讀段。

在區塊304處，測定與病狀相關之時間參數值。若病狀為妊娠相關之病狀，則時間參數可為胎齡。胎齡可表達為妊娠週、妊娠月、或妊娠之三個月。若病狀為癌症，則時間參數可為癌症之治療持續時間、自癌症診斷之時間、或手術後存活時間。

在區塊306處，使用時間參數值測定在時間參數值時病狀之表現標記。表現標記包含優先表現區域之一或多組。測定可包含分析並非僅優先表現病狀程度之區域之表現區域，但進一步分析在時間參數值處或附近優先表現之一者的表現區域。換言之，表現標記之測定可使用上文所述之子群體。區域之優先表現可視一個或多個特定子群體而定。舉例而言，對於妊娠相關之病狀而言，可在妊娠前三個月而非妊娠後三個月優先表現區域。

在區塊308處，對於表現標記之各優先表現區域而言，可測定對應於優先表現區域之讀段量。讀段量可為本文所描述之任何量。讀段量可藉由與優先表現區域比對測定。

在區塊310處，一個或多個優先表現區域之讀段量可與一個或多個參考值相比。如上文所述，比較可包含比較各優先表現區域之量與優先表現區域之對應參考值，或比較可包含來自多個表現區域之量之總分數與單個參考值。比較可包含本文所描述之任何比較技術。

在區塊312處，基於一個或多個優先表現區域之讀段量與一個或多個參考值之比較，判定個體之病狀程度。作為實例，病狀程度可為病狀是否存在、病狀之嚴重程度、病狀階段、病狀展望、病狀對治療之反應、或病狀之嚴重程度或進展之另一量測。方法可進一步包含病狀程度之可信度或機率。可信度可基於相比於參考值之讀段量之間距或比值。基於所判定之病狀程度，可研發治療計劃以降低對個體之傷害風險。方法可進一步包含根據治療計劃治療個體。II. 胎盤之整合單細胞及血漿游離 RNA 分析

測定細胞中之一個或多個優先表現區域組且隨後鑑別一個或多個優先表現區域組中之一或多者的方法可用於胎盤細胞以測定妊娠相關之病狀程度。

在母體血漿中發現循環游離胎兒核酸使能夠經由偵測病原突變、對偶基因及染色體不平衡研發胎兒非整倍性及單基因性疾病之非侵入性產前診斷（52 ， 53 ）。儘管已證明循環游離胎兒核酸為胎盤衍生的，但仍難以使用游離胎兒核酸及習知塊體組織轉錄組圖譜分析研究胎盤病理學。一個顯著障礙為胎盤中之高細胞異質性，此無法藉由總DNA定量分析、靶向滋養層衍生之轉錄物分析或器官特異性轉錄物監測解決。先前研究已報告妊娠期間多種RNA轉錄物之定量變化（20 ， 21 ）。然而，在使游離核酸之循環庫與其細胞來源連接中存在間隙。亦少量論述妊娠期間胎盤之非滋養層組分之游離核酸動力學。單細胞轉錄組技術之進展使吾人可將妊娠期間胎盤與循環游離核酸之研究聯繫起來。

胎盤在妊娠期間建立子宮胎盤界面及維持胎兒穩態中起到關鍵作用（1 ）。其為由母體及胎兒來源之細胞構成之基因及發育非均相器官，來自胚胎及胚外譜系。組織學上，盤狀人類胎盤由多分葉絨毛單元構成。人類胎盤在植入時展現「控制侵入」之獨特方法。不同類型之滋養層細胞絨毛外滋養細胞細胞（extravillous trophoblast cell；EVTB）在妊娠期間自絨毛遷移以滲入母體蛻膜。其參與重塑子宮螺旋動脈且與母體淋巴球相互作用以防止胎兒之同種異體排斥。包含多核融合細胞滋養層（SCTB）及絨毛狀細胞滋養層（VCTB）之絨毛狀滋養層細胞內襯與母體血液直接接觸之胎盤絨毛之表面。整個胎盤絨毛結構由基質細胞支撐，由胎兒巨噬細胞（霍夫包爾氏細胞）駐存且由胎兒毛細管脈管灌注。

臨床上，胎盤功能異常與多種主要妊娠期併發症（諸如先兆子癇毒血症（PET））有關（2 ）。PET為多系統及潛在致死性妊娠期病狀，其特徵為在妊娠≥ 20週時高血壓及蛋白尿之新的發作。其作為母體及產期發病之主要原因影響懷孕之3-6%。其可發展為具有血小板減少、肝臟紊亂、腎衰竭及癲癇，導致顯著的胎兒生長限制或甚至胎兒死亡。已提出缺陷胎盤植入及全身血管炎症為PET中之主要病理機制（2 ， 3 ）。

儘管胎盤具有臨床意義，但患有胎盤病理之患者與符合健康妊娠年齡之對照之間的直接胎盤組織比較由於直接胎盤生檢之侵襲性之倫理關懷而不可行。實際上，已實行許多臨床方法，諸如超聲檢查成像母體血清蛋白標記在妊娠期間非侵入性監測胎盤健康（4 ， 5 ）。研究已展示胎盤為母體血漿中之循環游離胎兒核酸之主要源器官（6 - 8 ）。亦已報告患有PET（9 - 12 ）及早產病狀（13 - 15 ）之患者之母體血漿中總游離胎兒DNA及所選擇胎盤特異性RNA轉錄物之顯著較高的程度，支持游離RNA在非侵入性監測胎盤健康中之作用。然而，占絕對優勢的母體造血背景已在偵測胎盤信號中產生顯著困難（16 ）。先前研究已嘗試藉由微陣列分析、大規模平行轉錄組或表觀基因組定序提供母體血漿核酸之更加全面的評估（17 - 23 ）。若干組已探索使用胎兒特異性DNA多態性、器官特異性DNA甲基化（22 ）、DNA斷裂圖案（24 ，25 ）及組織特異性RNA轉錄物（21 ）分離循環游離胎兒核酸庫中之胎盤比重且獲得胎盤比重之總體變化。然而，仍未知母體血漿游離核酸分析是否可用於仔細分析動態及非均相胎兒及母體胎盤組分且解析在細胞水準下不同妊娠期病理中之胎盤的複雜變化。

吾人探索使用基於液滴之單細胞數位轉錄組技術以全面表徵人類胎盤之轉錄組異質性。吾人以不偏方式分析來自多個標準及PET胎盤之超過24,000個非標記選擇之胎盤細胞的單細胞轉錄物組。使用此全面資料集，吾人成功揭示妊娠進展期間母體血漿中之縱向細胞動力學且自母體血漿游離RNA非侵入性地鑑別先兆子癇胎盤中之潛在細胞病理學。吾人之研究證明單細胞及無漿細胞轉錄組研究之整合及協同分析方法之可能性。人類胎盤之細胞異質性之剖析

此部分提供針對使用妊娠及先兆子癇之細胞動態監測及畸變發現中之單細胞及血漿RNA轉錄組的整合分析，針對圖1先前所描述之其他細節。吾人闡述使用基於大規模液滴之單細胞數位轉錄組圖譜分析獲得人類胎盤之細胞異質性之全面理解（26 ）（圖 1 ）。允許定量需要或不需要組織解離之個體細胞之RNA表現圖譜的其他基於非液滴之技術，諸如藉由RNA原位雜交進行之轉錄物計數，藉由組合條形碼進行之單細胞RNA圖譜分析原則上亦為可適用的。

吾人在多個新剖腹產獲取之胎盤（兩名男性及兩名女性嬰兒）之定義位置收集活檢體且將組織解離為無表面標記預選之單細胞懸浮液。吾人自六個不同胎盤實質性活檢體獲得20,518個胎盤細胞之單細胞轉錄組。獲得細胞之單細胞轉錄組可為圖2之區塊202及204。圖 4 展示作為分析之個體之六名健康孕婦及四名嚴重先兆子癇孕婦之資訊。根據程式庫偵測之基因之平均數量為1,006（792-1,333），其中每個細胞之平均覆蓋率為21,471（16,613-36,829）。

藉由t-隨機鄰域嵌入（t-SNE）進行之群聚分析鑑別吾等資料集中之胎盤細胞之12種主要叢集（P1-12）。利用圖 1 中之圖式140及圖2之方塊210描述群聚分析。

圖 5 更詳細地展示轉錄上胎盤之細胞異質性及叢集。曲線中之各點表示單細胞之轉錄組資料，各點之鄰近度係關於轉錄組相似性。叢集經進一步著色且基於PCA-t-SNE中之空間鄰近度及文獻中之已知細胞型特異性標記表現之表現圖案分組為子組（P1-12）。

圖 6 展示重疊文獻中已知對特定類型之胎盤細胞具有特異性之若干基因的表現導致在2維投射中之所定義細胞組處之聚集表現。已知對人類胎盤中之某些類型之細胞具有特異性的選擇基因（在各盒圖中命名）之表現圖案（定量為在0-2範圍之對數轉化之UMI計數）。曲線中之各點表示單細胞之轉錄組資料。灰色表明無表現，且橙紅色度越亮表明表現水準越高。

細胞叢之生物一致性可藉由某些已知細胞型特異性基因之表現圖案直接推斷。舉例而言，已知CD34 基因在胎盤脈管之內皮細胞中尤其表現，因此展示CD34 之高表現水準之P2叢集之細胞可能為內皮細胞。

在其中所關注之器官由來自不同基因來源之細胞構成的情況中，例如其中母體血液及蛻膜細胞可存在於胎盤生檢且在單細胞RNA圖譜中偵測到之胎盤，細胞叢之基因一致性可藉由採用RNA轉錄物中存在之細胞來源之間的基因差異來推斷。

此外，吾人藉由比較各子組中之胎兒與母體特異性RNA SNP之比值且藉由檢查來自懷男胎妊娠之胎盤之細胞中的Y染色體編碼之轉錄物之存在來基因分型母親及胎兒之基因組譜SNP圖案以基因上區分個體細胞之母胎來源。胎兒及母體來源之分析進一步詳細描述於下文中。

圖 7A - H 展示人類胎盤中之細胞異質性之剖析及細胞一致性之註釋。圖 7A 展示比較各細胞子組中之母體或胎兒來源之百分數的百分比條形圖。圖 7B 展示比較表現各細胞子組中之Y-染色體編碼基因之細胞的百分比之條形圖。圖 7C 展示雙軸散佈圖，所述雙軸散佈圖展示如圖5中之原始t-SNE叢集分佈中之所預測胎兒/母體來源的細胞之分佈。尚未繪製來自PN2程式庫之資料，因為無基因分型資訊可用於母胎來源預測。圖 7D 展示P5-7子組中之基質（COL1A1 、COL3A1 、THY1 及VIM ）及髓樣（CSF1R 、 CD14 、 AIF1 及CD53 ）標記之表現圖案。圖 7E 為t-SNE分析，其展示具有電腦模擬產生之人工P4/P7電子對之P5細胞的叢集，表明P5細胞可能為多重態。圖 7F 為雙軸散佈圖，其展示編碼胎盤細胞之不同子組之間的人類白血球抗原之基因的表現圖案。圖 7G 為概述各細胞子組之註釋性質之表。圖 7H 展示不同單細胞轉錄組資料集中之細胞子組組成異質性。PN3P/PN3C and PN4P/PN4C代表接近臍帶附著部位（PN3C/PN4C）及遠離胎盤外周（PN3P/PN4P）取得的成對活檢體。

吾等分析展示除了P1、P6、P8及P9之外，所有叢集均為主要胎兒來源（圖 7A 、 C）。P1轉錄上對應於母體蛻膜細胞，具有已知為蛻膜標記基因之DKK1 、IGFBP1 及PRL 之強烈表現（圖 6 ）。一致性與吾人藉由母胎SNP比值分析所推論之母胎來源相一致，其將P1分類為完全母體的。P6表現之樹突狀標記CD14 、 CD52 、CD83 、CD4 及CD86 ，其可能表示母體子宮樹突狀細胞（圖 6 ）。同時，P8表現高水準之T淋巴細胞標記，例如CD3G 及GZMA 。母胎SNP比值分析表明P8為胎兒與母體淋巴球之混合物（圖 7A - C ）。類似地，成人及胎兒血紅蛋白基因（諸如HBA1 、 HBB 及HBG1 ），及編碼P9中之血色素生物合成酶ALAS2 之均質表現表明其由來自胎兒臍帶及母體源之紅血球細胞構成。確定用某些細胞優先表現某些區域超過其他細胞類似於圖2之方塊212。

胎兒子組之其餘部分（P2-5、7、10-12）可廣泛分為四個組，亦即血管（P2-3）、基質（P4）、髓樣細胞（P5、P7）及滋養層（P11-13）細胞。P2細胞通常表現堅固的血管內皮標記，例如CD34、PLVAP及ICAM。母體來源之若干細胞亦可發現於P2叢集中（圖 7C ）。P3細胞展示血管平滑肌細胞之特徵，其中表現MYH11 及CNN1 。P4細胞之大叢集表現細胞外基質蛋白ECM1 及纖調蛋白（FMOD ）之mRNA，兩者為絨毛狀基質細胞之標記。類似於母體P6細胞，胎兒P5及P7叢集亦高度表現活化單核細胞性/巨噬菌基因CD14 、CSF1R （編碼CD115）、CD53 及AIF1 。 但是，胎兒P5及P7子組展示CD163 及CD209 之其他表現，兩者均為胎盤常駐巨噬細胞（霍夫包爾氏細胞）之標記（圖 7D ）。與P7細胞比較，P5子組亦展示與P4基質細胞共用之纖維母細胞及間葉細胞基因（諸如THY1 （編碼CD90）、膠原蛋白基因（COL3A1 、 COL1A1 ）及VIM ）之普遍表現（圖 7D ）。此等結果提高在單細胞囊封之間P5子組可由P4及P7細胞構成之可能性。為證實此假設，吾人進行電腦模擬分析（圖 7E ）且吾等結果表明P5細胞極其類似於模擬資料且因此可能表示為由P4及P7細胞在單細胞囊封步驟中人工組成的多細胞資料點。

基於滋養層亞型特異性基因PAPPA2 、PARP1 及CGA 之表現，滋養層叢集（P10-12）可分別分成三個子組，亦即絨毛外滋養層（P10: EVTB）、絨毛狀細胞滋養層（P11: VCTB）及融合細胞滋養層（P12: SCTB）（圖 6 ）。涉及產生重要妊娠激素之基因均在SCTB（P12）中特定表現，所述妊娠激素包含CYP19A1 （編碼芳香酶以用於雌激素合成）、CGA （人絨毛膜促性腺激素）及GH2 （人類胎盤生長激素）。已知胎盤EVTB表現諸如HLA-G之人類白血球抗原（human leukocyte antigens；HLA）之非典型形式，以促進具有子宮NK細胞之胎兒之母體免疫耐受性（27 - 29 ）。實際上，吾人偵測具有HLA - C 及HLA - E 之相關表現之EVTB（P10）子組中的HLA - G 之強烈表現（圖 7F ）。VCTB及SCTB中之HLA基因之表現一般為稀少的，而典型HLA - A （P1-9）在非滋養層細胞中特定表現。編碼HLA II類分子（諸如HLA - DP 、 HLA - DQ 及HLA - DR ）之基因之表現集中於P6及P7中，此與其在母體樹突狀細胞及胎兒巨噬細胞中之抗原呈遞功能相一致。在鑑別具有優先表現之基因之前可能不需要如同特定細胞型之叢集之鑑別。

先前的塊體組織轉錄組圖譜分析已展示取自不同胎盤部位之活檢體之間的顯著空間異質性（30 ）。吾等資料集中之不同程式庫之組成異質性的比較亦反映此類變體。吾人包含兩對接近（PN3C & PN4C）及遠離（PN3P & PN4P）兩種不同個體之臍帶附著之部位處的胎盤軟組織之活檢體。（圖 4 ）。吾人發現相比於其他，P1蛻膜細胞在PN1程式庫中顯著低表現。實際上，P2胎兒內皮細胞百分數相比其他程式庫在PN1中顯著較高，此表明在PN1生檢中在胎盤之胎兒表面上之臍帶脈管的高比重。相比之下，PN2程式庫含有最高百分數之P1蛻膜細胞、P6母體子宮樹突狀細胞及P10 EVTB。PN2程式庫可能在較深母胎界面處捕獲更多細胞。獲自成對近端及遠端中間區段之活檢體之細胞組成更加可比，其中僅遠端部位處之蛻膜細胞顯著減少且EVTB增加，而個體間差異保持較高（圖 7H ）。此等發現突出胎盤之細胞異質性及單細胞分析方法之需要。

可用於血漿RNA分析之細胞型特異性標記之鑑別可使用其他過濾，眾所周知血漿RNA庫由多個器官源提供，尤其造血源（2，6）。肝臟特異性RNAALB 亦可在血漿中容易地檢測（15）。為提高細胞型特異性，吾人分析具有來自公用資料集之健康供體之外周血液單核細胞的單細胞轉錄組資料之胎盤資料集（14）（圖 8 ）。

對於吾等資料而言，分別獲得胎盤單細胞RNA結果及PBMC單細胞RNA定序結果。吾人首先電腦模擬合併胎盤單細胞RNA結果及PBMC單細胞RNA定序結果，隨後計算上去除批次偏差且進行群聚分析。此後，吾人鑑別特定叢集中存在之優先表現基因（基因組區域）。此類叢集可為胎盤細胞或PBMC細胞或胎盤與PBMC細胞之混合物。在另一實施例中，來源於不同組織或器官之細胞之實驗亦可同時完成且使用條形碼技術追蹤來源樣品。

圖 8 展示藉由t-SNE觀測獲得之胎盤細胞及公用外周血液單核血球之計算單細胞轉錄組叢集圖案。曲線中之各點表示單細胞之轉錄組資料，各點之鄰近度係關於RNA表現圖譜之相似性。叢集經進一步著色且基於已知細胞型特異性標記表現之空間鄰近度及表現圖案分組為子組（P1-14）。組之著色對應於圖5之著色。基於計算群聚分析之表現區域及空間鄰近度，叢集對應於展示於圖 9 中之類型。

吾人推論對於細胞型特異性之基因：1）其應在足夠高水準下於所測試細胞型之細胞中表現且2）其不應在顯著水準下於其他非測試細胞中表現，亦即需要測試細胞中之最小表現臨限值及非測試細胞中之最大表現臨限值。3）表現之差異量級應有意義地較大，其可藉由最小臨限值定量，所述最小臨限值可為藉由某些單位或數學轉化之參數定量之表現的絕對差值，所述參數例如相對倍數變化、對數轉化之倍數變化、標準差或標準化標準差Z分值。在其中比較組中之某一組織之單細胞RNA轉錄組圖譜不可用的情況中，整個組織RNA圖譜之比較可進一步確保細胞型特異性基因之組織特異性，考慮到所關注之基因在其他組織中不應展示高於在測試細胞型之組織中的表現。妊娠期間胎盤細胞動力學之非侵入性闡明

先前的母體血漿轉錄組圖譜分析研究展示某些胎盤特異性轉錄物及總體分數胎盤比重隨妊娠時間增長而增加（21 ， 34 ）。吾人假設有可能藉由在單胎盤細胞水準下建立細胞型特異性基因標誌仔細分析母體血漿游離RNA中之個體胎盤細胞組分之動態變化。吾人藉由z 分值比較鑑別P1-12子組中之細胞型特異性標誌基因。然而，已知母體血漿中之胎盤衍生之游離RNA在具有來源於造血源之游離RNA之混合物中循環。性別不匹配之骨髓移植接受者之供體特異性血漿DNA分析及母體血漿之組織特異性DNA甲基化分析已展示血漿中之循環DNA之約70%及10%的來源分別為造血及肝（16 ， 22 ）。為進一步確保細胞型表現特異性，吾人藉由重新分析來自人類lincRNA目錄項目組織轉錄組資料及公用外周血液單核細胞（PBMC）單細胞轉錄組圖譜來過濾胎盤標誌基因（26 ， 35 ）（圖 10A - E ）。

圖 10A - E 展示細胞型特異性標誌基因組之鑑別及母體游離RNA中之胎盤細胞動態之非侵入性闡明。圖 10A 展示雙軸t-SNE曲線，其展示外周血液單核細胞（PBMC）及胎盤細胞之叢集圖案。PBMC資料自Zheng等人下載（26）。圖10A中之叢集使用與PBMC單細胞定序資料及對於圖1中之圖式140的相似技術合併之胎盤單細胞RNA定序結果確定。圖 10B 展示概述胎盤/PBMC合併資料集中之各細胞子組之註釋性質的表。圖 10C 展示雙軸散佈圖，其展示胎盤細胞及PBMC之不同子組之間特異性標記基因之表現圖案。

圖 10D 為熱度圖，其展示不同PBMC及胎盤細胞叢中之細胞型特異性標誌基因之平均表現。最左側垂直條中所指示之顏色對應於圖10A中之細胞叢著色。與垂直條中之顏色相關之特定行展示用於圖10A之叢集中之組細胞的基因。最頂行上所指示之顏色對應於特定基因之細胞型特異性。具有紅色之盒表明特定基因在特定叢集中具有相對較高之表現水準，從而表明基因與細胞型強相關。具有藍色之盒表明基因在特定叢集中具有相對較低之表現水準，且特定基因與細胞型弱相關。

圖 10E 展示盒狀圖，其比較人類白血球、肝臟及胎盤中之不同細胞型特異性基因之表現水準。比較胎盤、肝臟及白血球之整個組織圖譜中之各細胞型特異性基因的表現水準，且僅選擇在其對應來源組織、胎盤或白血球中展現最高表現水準之基因。吾人隨後排除含有少於10個差異表現基因之細胞叢或其中差異表現基因未展示胎盤與白血球/肝臟之間的充足間距之細胞叢（P值＞0.05）。在PBMC胎盤資料集中之14個細胞叢之間，未針對叢集P5鑑別到特異性基因，且僅少於五個基因通過叢集P6、P9及P11之過濾。表示胎盤霍夫包爾氏巨噬細胞之P7之基因標籤組由於與白血球之不充分間距自其他分析排除。

圖 10F 展示Koh等人之母體血漿RNA圖譜之細胞標誌分析（21 ）。在Koh中，在妊娠之三個三月期及產後6週中之每一者時收集資料。熱度圖展示前三個月母體血漿（T1）、次三個月母體血漿（T2）、後三個月母體血漿（T3）及產後母體血漿（PP）中之不同細胞標籤基因組中之個體細胞型特異性基因的表現水準（左列圖）。線圖展示不同妊娠階段中之個體細胞型標籤基因組之平均細胞標誌分數的變化（右側條形圖）。標誌分析可與圖2所描述之區塊216及218相似。

吾人隨後研究在Tsui等人之分離資料集中，來自不同妊娠階段之母體血漿RNA圖譜中之對應細胞型特異性標籤基因組的縱向表現動力學（20 ）。圖 11 展示在妊娠期間母體血漿RNA圖譜中之胎盤細胞動態。各圖之左列中之熱度圖展示非妊娠女性血漿（A組）、早期妊娠母體血漿（B組）、中/晚期妊娠母體血漿（C組）、產前母體血漿（D組）及產後早期母體血漿（E組）中之不同細胞標籤基因組中之個體細胞型特異性基因的表現水準。各圖之右列中之線圖展示不同血漿組中之個體細胞型標籤基因組之平均細胞標誌分數的變化。

利用Tsui資料集，在妊娠期間細胞型特異性標誌之動態圖案與已知生物變化相一致。吾人觀測到相比於非妊娠對照，早期妊娠之母體血漿RNA中之融合細胞滋養層（SCTB）標誌的顯著上調（圖 11 ）。在出生24小時之後迅速下降至非妊娠對照之水準之前，趨勢在出生前母體血漿處達至峰值。相似圖案亦可發現於絨毛外滋養細胞（EVTB）、胎盤基質細胞及血管平滑肌細胞標誌中。此等圖案對應於胎盤之基質、SCTB及EVTB組分在早期妊娠及胎盤分娩之後清除過程中的快速生長。引起興趣地，在分娩高達24小時之後蛻膜細胞之標誌仍可在母體血漿中觀測到。此可藉由以下事實解釋：游離RNA自殘餘母體蛻膜組織之釋放可在胎盤分娩之後繼續。相比之下，吾人發現B細胞之標誌在整個妊娠過程中持續降低，而T細胞之標誌首先降低且隨後恢復至分娩之前的非妊娠水準。一致地，藉由流式細胞量測術對妊娠相關之淋巴球減少症進行之先前研究展示T及B細胞水準隨妊娠進展下降（36 - 38 ）且周邊B細胞恢復可發生在T細胞之後（37 ）。同時，單核球之標誌展示更多可變圖案、早期妊娠之上調、分娩之前的浸漬及回彈，與妊娠期間骨髓免疫活化之發現一致（36 ， 39 - 41 ）。吾人觀測到於Tsui資料集中發現之細胞標誌之動態圖案與Koh資料集相一致（圖 10F ）。此等細胞圖案增加及減少可能無法用可能不與特異性細胞型相關聯之習知基因組標記觀測到。

此等發現證明細胞型特異性標誌分析仔細分析母體血漿RNA圖譜中之個體細胞組分動力學之能力。標誌分數或標誌分數之組合中之一者可用於測定未來樣品之胎齡。解密來自母體血漿游離 RNA 之先兆子癇胎盤中之細胞畸變

吾人隨後證明血漿RNA之標籤基因組表現分析可偵測複雜疾病之細胞畸變。吾人自香港威爾斯親王醫院（Prince of Wales Hospital）婦產科招募10名後三個月標準妊娠對照及6名患有嚴重早產先兆子癇之女性。吾人藉由在使用RNeasy Mini套組（凱傑（Qiagen））之後立即以3:1之比混合TRIzol（Ambion）與血漿來保存血漿RNA。吾人藉由NanoDrop ND-2000分光光度計（英傑公司（Invitrogen））及LightCycler 96系統（羅氏（Roche））上之實時定量PCR靶向GAPDH定量RNA。吾人藉由Ovation RNA-seq系統V2（NuGEN）進行cDNA逆轉錄及第二股合成。擴增及純化cDNA使用Covaris S2超音波處理器（Covaris）音波處理為250-bp片段且RNA-seq程式庫建構藉由Ovation RNA-seq系統V2（NuGEN）構建。所有程式庫均藉由Qubit（英傑公司）及LightCycler 96系統（羅氏）上之實時定量PCR定量，且隨後在NextSeq 500系統（Illumina）上定序。

吾人推論先兆子癇胎盤之細胞病理學可能影響釋放且因此母體血漿中之細胞型特異性RNA之水準。病理學之細胞來源可因此藉由比較先兆子癇患者與健康妊娠對照之母體血漿中之不同細胞型特異性標誌的表現水準來揭示。

吾人比較健康後三個月妊娠對照與患有嚴重早期先兆子癇之患者之間的多個細胞型之標籤基因組表現。吾人發現絨毛外滋養細胞之標籤基因組中之特異性及顯著升高。此與滋養層細胞凋亡在先兆子癇胎盤中增加之先前報告相一致（20-27）。

引人注目地，吾人發現EVTB標誌在用不同血漿RNA程式庫製劑化學物質分析之兩個獨立群體中之先兆子癇患者中一致上調（P =0.045，雙尾兩樣品威爾科克森（Wilcoxon）簽署之排名測試）（圖 12A ， 圖 14A ）。此等結果指向EVTB衍生之游離RNA向先兆子癇中之母體循環中之增加的釋放。吾人隨後在組織水準下直接驗證此發現。吾人表徵來自四個先兆子癇患者之胎盤活檢體之單細胞轉錄組且比較在正常足月及先兆子癇胎盤之間在HLA - G 表現EVTB叢集中之叢集內轉錄組異質性以揭示不同生物程序中之異常（圖 14B ）。基因組富集分析亦證實先兆子癇EVTB叢集中之細胞死亡相關之基因的顯著富集（圖 12B ）。圖 13 展示蛻膜細胞、內皮細胞及融合細胞滋養層細胞之標誌分數對於先兆子癇及對照個體而言不具有統計學上不同的標誌分數，而EVTB之標誌分數統計學上不同。

圖 B10 展示後三個月對照與嚴重早期PE患者之母體血漿樣品中之絨毛外滋養細胞的細胞標誌分數水準之比較（p ＜0.05）。進行兩樣品雙尾威爾科克森簽署之排名測試以測試統計顯著性。先兆子癇（PE）胎盤之標誌分數水準與對照顯著不同。

此等結果表明先兆子癇胎盤中之EVTB具有較高細胞死亡水準。此結論與先前報告一致：滋養層細胞凋亡，尤其對於侵入性滋養層而言，在先兆子癇中增加（44 - 51 ）。此等提供先兆子癇患者之母體血漿中之EVTB標誌的上調之機理解釋。簡而言之，吾人證明無漿細胞RNA細胞標誌分析作為無非侵入性假設探索性工具揭示複雜器官源之隱性細胞病理學且為先兆子癇之分子診斷提供非侵入性方法之能力。此等結果展示偵測經由血漿游離RNA之單細胞RNA表現圖譜分析發現之細胞類型特異性轉錄物的變化之分析方法可用於偵測、區分及監測影響複雜器官之病理學。討論

對胎盤生物學之單細胞轉錄組分析之可能性可參見最近研究，其中Pavlicev等人剖析來自人類足月胎盤之87個顯微解剖胎盤細胞且成功推斷潛在的細胞間通信（54 ）。在此當前研究中，吾人利用微流單細胞轉錄組技術之能力建立人類胎盤之大規模細胞轉錄組圖譜，圖譜分析來自標準足月及先兆子癇胎盤之超過24,000名非標記選擇細胞。吾人使用基因及轉錄資訊兩者註釋個體細胞之母胎來源以提供包含蛻膜細胞、常駐免疫細胞、血管及基質細胞之胎盤細胞異質性之全面圖像。

最後，吾人證明整合單細胞轉錄組分析與血漿循環RNA分析在非侵入性地剖析標準妊娠進展期間之複雜細胞動力學及先兆子癇胎盤中之細胞病理學中的可行性。使用有限的已知標記導出細胞動態資訊受偵測母體血漿中之低水準游離RNA中之高技術變化妨礙。吾人藉由自大規模單細胞轉錄組圖譜分析重新發現細胞類型特異性標誌基因及基因組分析基礎以利用所有細胞類型特異性基因之資訊來克服此問題。可比細胞動態圖案可在兩個獨立母體血漿RNA資料集中觀測到（20 ， 21 ）。藉由游離RNA細胞標誌分析揭示之滋養層及造血細胞型之細胞動力學與妊娠期間造血系統及胎盤中之一些已知變化相一致。更重要地，此分析允許以無假設方式發現EVTB標誌之差異表現作為PET患者中之細胞畸變中之一者，其反映組織水準下之病理學。因為健康孕婦之侵入性胎盤生檢不可行，所以游離RNA細胞類型特異性標誌分析在探索性活體內研究中將為重要的分子工具以區分胎盤功能異常之不同形式之細胞病理學且提供臨床診斷資訊。隨著大規模單細胞轉錄組技術之成本效果之連續改善及人類細胞圖譜倡議在圖譜分析主要人類器官中之所有細胞亞型之細胞轉錄組異質性中的工作（26 ，56 - 58 ），可設想同一方法可延伸至其他情況，諸如游離腫瘤RNA之腫瘤純系動力學剝離及其他妊娠疾病中之細胞病理學之非侵入性探索。

簡而言之，吾等研究建立標準及先兆子癇胎盤之大規模單細胞轉錄組圖譜且展現單細胞轉錄組學及無漿細胞RNA之整合分析作為新穎非侵入性工具用於闡明複雜生物系統及分子診斷中之細胞動力學及畸變之能力。材料及方法 個體、樣品收集及處理

此研究經過機構倫理委員會批准且在解釋研究之性質及可能後果之後獲得知情同意書。健康或嚴重先兆子癇孕婦（圖 4 ）自具有知情同意書之香港威爾斯親王醫院婦產科招募。則吾人招募患有早期發作先兆子癇之患者，所述患者需要在24-33^{+ 6} 週之妊娠時分娩，在研發相隔4小時之至少2個時刻血壓為＞ 140/90 mmHg，在20週妊娠之後具有在24小時中＞ 300 mg之蛋白尿，或若24小時收集不可用，則蛋白質/肌酐比值為＞ 30 mg/mmol或在中段或導管尿液試樣之量桿分析上2次＞ 2+之讀段。僅招募藉由剖腹產分娩之患者。

對於各種情況，在選擇性剖腹產之前將20 mL母體外周血液收集至含EDTA之試管中。血漿藉由如先前所描述之雙重離心方案分離（20 ）。對於胎盤實質性生檢而言，在剝落膜之後，在分娩之後自2 cm深及遠離臍帶附著5 cm 之區域新鮮剝離1 cm³ 胎盤。在一些情況下，亦自胎盤邊緣（外周）取得組織取樣之周邊部位。隨後在PBS中洗滌剝離組織。組織隨後根據製造商之方案使用臍帶解離套組（Miltenyi Biotech）進行酶消化。紅血球經溶解且藉由ACK緩衝液（英傑公司）去除。細胞碎片藉由100 µm過濾器（Miltenyi Biotech）去除且單細胞懸浮液在PBS（英傑公司）中另外洗滌三次。成功的解離在顯微鏡下證實。血漿及塊體組織 RNA 提取及程式庫製劑

血漿RNA藉由在血漿分離之後立即以3:1之比混合TRIzol（Ambion）與血漿保存。血漿RNA隨後使用RNeasy Mini套組（凱傑）提取。所有提取之RNA均藉由NanoDrop ND-2000分光光度計（英傑公司）及LightCycler 96系統（羅氏）上之實時定量PCR定量。cDNA逆轉錄及第二股合成根據製造商之方案藉由Ovation RNA-seq System V2（NuGEN）進行。擴增及純化cDNA使用Covaris S2超音波處理器（Covaris）音波處理為250-bp片段。RNA-seq程式庫建構根據製造商之說明書藉由Ovation RNA-seq系統V2（NuGEN）進行。所有程式庫均藉由Qubit（英傑公司）及LightCycler 96系統（羅氏）上之實時定量PCR定量。單細胞囊封 ， 液滴中 RT - PCR 及定序程式庫製劑

單細胞RNA-seq程式庫使用如（26）所描述之鉻單細胞3'試劑套組（10x Genomics）產生。簡言之，使無先前選擇之單細胞懸浮液（在200與1000個細胞/微升PBS之間的細胞濃度）與RT-PCR主混合物混合且根據製造商之說明書連同單細胞3'凝膠珠粒及分離油載入單細胞3'晶片（10X Genomics）。單細胞之RNA轉錄物為唯一帶條碼的且在液滴內反轉錄。cDNA分子經預擴增且混合，後接根據製造商之說明書之程式庫建構。所有程式庫均藉由Qubit及LightCycler 96系統（羅氏）上之實時定量PCR定量。預擴增cDNA及定序程式庫之尺寸圖譜分別藉由Agilent High Sensitivity D5000及High Sensitivity D1000 ScreenTape Systems（安捷倫）檢測。定序，比對及基因表現定量

所有單細胞程式庫均根據製造商之建議利用具有雙重索引（98/14/8/10-bp）形式之定製配對末端（PE）定序。資料比對映射為人類參考基因組且使用如Zheng等人（26 ）所描述之Cell Ranger Single-Cell Software Suite（版本1.0）定量為獨特分子標識符之數目。簡而言之，樣品基於8 bp樣品指數、10 bp UMI標籤及14 bp GemCode條形碼解多工。含有cDNA序列之98 bp長讀段1使用STAR（59 ）對hg19人類參考基因組比對。如Zheng等人（26 ）所描述藉由漢明距離（Hamming distance）進行基於錯誤偵測之UMI定量、GemCode及細胞條形碼。

對於血漿RNA程式庫之比對而言，片段末端上之轉接序列及低品質鹼基（亦即品質分數＜5）經微調且讀段利用配對末端比對選擇以及自UCSC下載之註釋基因型號檔案（http://genome.ucsc.edu/）使用具有以下參數之TopHat（v2.0.4）與人類參考基因組（hg19）比對：轉錄組-錯配=3；配對-標準-偏差=50；基因組-讀段-錯配=3。基因表現定量藉由內部指令碼進行，所述指令碼量化Ensembl GTFs（GRCh37.p13）中註釋之基因上與外顯子區域重疊之讀段。

所有程式庫均分別使用Miseq Reagent v3套組（Illumina）或NextSeq 500 High Output v2套組（Illumina）在MiSeq系統（Illumina）或NextSeq 500系統（Illumina）上定序。胎兒及母體來源確定

為區分細胞之基因來源，母體及胎兒基因型首先分別使用白血球層及胎盤組織藉由iScan系統（Illumina）確定。案例M12491（PN2）之基因型資訊由於生檢材料之限制而不可用。隨後鑑別由定序讀段覆蓋之資訊性SNP，其中當SNP在母親中為異型接合（A/B）且在胎兒中為同型接合（A/A）時其分類為母體特異性。胎兒特異性SNP經反過來分類。接著，吾人如下計算對偶基因比值（R）：B：來源特異性SNP B之對偶基因計數 A：常見SNP A之對偶基因計數。

獲得各細胞之胎兒特異性對偶基因比值（R_f ）及母體特異性對偶基因比值（R_m ）。細胞將標註為1）胎兒來源，若R_f ＞R_m ；2）母體來源，R_m ＞R_f ；3）未測定，若R_m =R_f 或若不存在覆蓋任何資訊性SNP之讀段。電子對模擬

首先自PN3C資料集提取1365 P4細胞及526 P7細胞之基因表現基質。為模擬100電子對資料點，電子對之轉錄組建模為1個P4細胞與1個P7細胞之無規混合物。人工電子對之基因表現水準設定為兩個細胞之平均值。隨後進行PCA。進一步利用PCA分析之後的前10個因素進行t-SNE群聚。在PCA及t-SNE之群聚步驟期間分別採用R中之prcomp 及Rtsne 軟件包。細胞特異性基因之鑑別

外周血液單核細胞之單細胞轉錄組資料自https://support.10xgenomics.com/single-cell/datasets處之10X基因組學之公共領域檢索。資料集經先前出版（26 ）。PBMC資料集與胎盤資料集合併且藉由無規讀段次取樣使用cellrangerRkit 0.99.0版本軟件包標準化。t-SNE群聚使用前10個主組分利用cellrangerRkit 軟件包中之內建式函數進行。細胞叢集基於已知標記基因表現及空間鄰近度在雙軸t-SNE曲線中拓樸鑑別。

細胞類型特異性基因選擇之準則如下： 1. 表現z 分值大於3之基因，且 基因表現z分值經計算為： z_g ：基因g之z 分值：細胞型A之平均表現水準，（log2轉化之標準化UMI計數）：非A細胞之平均表現水準非A細胞之表現之標準偏差。 2. 大於臨限值之測試細胞型中之平均基因表現量（log2轉化之標準化UMI）（＞0.1），及 3. 小於臨限值之非測試細胞之平均基因表現水準（log2轉化之標準化UMI）（＜0.01）及 4. 來自人類lincRNA目錄項目（14，16）之肝臟、胎盤及白血球之整個組織圖譜之基因表現水準（對數轉化之FPKM）在其源器官中展示最高表現，亦即相比於肝臟及白血球，來自標註為胎盤細胞之細胞組之基因在胎盤之整個組織圖譜中展示最高表現；相比於肝臟及胎盤，標註為白血球之細胞組之基因（P8、P9、P13及P14基因）在白血球之整個組織圖譜中展示最高表現。

平均表現水準可為均值、中值或眾數。臨限值儘管列出為0.01及0.1，但可視所需特異性或敏感性而變化。臨限值可選自0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4或0.5。在PBMC胎盤資料集中之14個細胞叢之間，未針對叢集P5鑑別到特異性基因，且僅少於5個基因通過叢集P6、P9及P11之過濾。細胞動力學分析在此等四個叢集中由於所鑑別基因之低數目而未進行。比較胎盤、肝臟及白血球之塊體組織圖譜中之基因之表現水準以進一步選擇在胎盤中展示最高表現特異性之基因組。胎盤細胞及外周血液細胞之基因組中之基因必須分別在胎盤及白血球塊體圖譜中展示最高表現。塊體組織表現資料集自人類lincRNA目錄項目（35 ）http://www.broadinstitute.org/genome_bio/human_lincrnas/在線檢索。P7區域由於不充分的胎盤及白血球/肝臟間距自進一步分析去除（圖 10E ）。基因清單可發現於圖 16 中且基因之熱度圖顯示於圖 17 中。基因清單可為胎盤細胞及PBMC之優先表現區域之組。標誌分數分析

吾人推論使用單個RNA轉錄物作為標記以監測血漿RNA中之細胞動力學將進行以偵測由於血漿中之低含量RNA而產生之大規模平行RNA定序之變化。所述問題可藉由考慮所定義基因組中之多種細胞類型特異性基因改善。

吾人因此藉由可定量複合參數（S:細胞標誌分數）量測血漿RNA圖譜中之個體細胞類型特異性標籤基因組之表現水準。在一個實例中，吾人計算基因組中之基因之log2轉化的表現水準之算術平均值作為血漿RNA中之S之量測。S：標誌分數 n：基因組中之細胞特異性基因之總數 E：細胞特異性基因之表現水準

在實施例中，細胞類型特異性標誌分數可在0至無窮大之範圍內，視構成細胞類型特異性基因之表現水準之限制而定。其單位亦視定量RNA表現之方式之單位。然而，血漿RNA圖譜中之所關注之不同細胞組分的細胞類型特異性標誌分數並非小數表示且不必總和為100%。此意謂血漿RNA圖譜中之一個特定細胞型之標誌分數的變化可能未必導致與所關注之疾病不相關之其他細胞型的標誌分數之倒數變化。標誌分數之計算可為量測標誌分數之一種方式，如圖2之區塊216中所描述。胎盤細胞動態分析

吾人重新分析來自Tsui等人之母體血漿RNA圖譜（20 ）。另外，吾人根據Tsui等人所描述之方法自2名健康孕婦（妊娠第24-30週）及2名患有嚴重先兆子癇之孕婦生成新的血漿RNA資料（20 ）。血漿RNA圖譜使用DESeq2 （60 ）藉由尺寸因子標準化來標準化。各血漿RNA圖譜之細胞類型特異性標誌分數經計算為特異性標籤基因組之平均標準化計數水準。母體血漿樣品分組為5組（A：非妊娠；B：早期妊娠（第13-第20週）；C：中/晚期妊娠（第24週-第30週）；D：出生前；E：產後24小時）。將各組之平均標誌分數與非妊娠水準之變化進行比較，以說明妊娠進展中之細胞動力學。可替代地，Koh等人（21 ）之母體血漿RNA-seq圖譜自SRP042027檢索。資料使用STAR（59 ）比對。選擇可映射讀段＞1,000,000之案例及跨越四個不同時間點（前三個月、次三個月、後三個月及產後6週）之樣品以進行進一步分析（案例2、15、24及32）。各組中之平均標誌分數如上文所述計算。隨後觀測隨前三個月孕婦水準之變化的變化。由於在血漿圖譜中所偵測到之標誌基因之低數目（＜50%）未分析P4（基質細胞）之動力學。PET 及標準母體血漿中之胎盤細胞標誌表現比較

比較C組（中/晚期妊娠血漿）與2名先兆子癇毒血症（PET）患者之間的不同細胞類型特異性標誌之母體血漿RNA水準（展示於圖 14A 中之資料）。招募5名PET患者及8名健康後三個月孕婦之新群體以核實Tsui資料集中之差異EVTB細胞標誌表現之發現。在此新的群體中，使用類似於Koh等人（21 ）之Ovation RNA-Seq System V2（NuGEN）生成血漿RNA圖譜且如上文所述分析。PET與健康對照之間的EVTB標誌差異之統計顯著性藉由雙尾兩樣品威爾科克森簽署之排名測試測定。微陣列基因分型及單核苷酸多態性 （ single nucleotide polymorphism ； SNP ） 鑑別

自母體白血球層及胎盤組織活檢體提取之基因組DNA利用Infinium Omni2.5-8 V1.2套組及iScan系統（Illumina）基因分型。SNP呼叫使用Birdseed v2演算法進行。使胎盤之胎兒基因型與母體白血球層基因型相比以鑑別胎兒特異性SNP等位基因。若SNP在母親中為同型接合且在胎兒中為異型接合，則SNP視為資訊性。統計分析

統計分析之細節描述於上文對應部分中。吾人將小於0.05之P 值視為統計學上顯著。用於癌症及 SLE 之整合單細胞及血漿游離 RNA 分析

針對妊娠及先兆子癇所描述之整合單細胞及血漿游離RNA分析可應用於可能與妊娠不相關之病狀。舉例而言，分析可用於測定全身性紅斑性狼瘡症（SLE）及癌症之表現標記。偵測自身免疫全身性紅斑狼瘡（ SLE ）中之血球畸變

在另一實例中，吾人證明此分析方法可用於揭示非妊娠疾病中之其他生物系統之細胞畸變。在此範例中，吾人研究自香港威爾斯親王醫院婦產科招募之患有全身狼瘡（SLE）之兩名患者的無漿細胞RNA圖譜。其兩人均在循環及蛋白尿中存在抗dsDNA抗體。將胎盤細胞及PBMC細胞用於此分析。吾人展示在吾等先前分析中發現之B細胞特異性標誌水準在SLE患者中一致減少（圖 18 ）。此與B細胞異常識別為SLE中之主要病理機制之事實相一致（28）。偵測 B 型肝炎病毒感染患者中之肝癌

在另一實例中，吾人證明應用於癌症患者之治療之偵測及監測。作為一範例，吾人剖析來自HBV相關之肝細胞癌（HCC）及其相鄰非腫瘤組織之4個腫瘤切除活檢體之單細胞RNA轉錄組圖譜非標記選擇細胞（樣品2140、2138、2096及2058）。圖 C 21 展示樣品之樣品名稱及臨床病狀。

腫瘤及非腫瘤肝臟組織藉由PBS緩衝液洗滌，且藉由0.5%膠原蛋白酶A（西格瑪阿爾德里奇）消化在37攝氏度下解離約1小時。組織經輕緩濕磨且藉由100 µm濾網（Miltenyi Biotech）過濾以移除大碎屑。紅血球藉由ACK緩衝液（英傑公司）在室溫中溶解1分鐘且細胞在用70 µm濾網（Miltenyi Biotech）最終過濾之前另外使用肝細胞洗滌培養基（Thermo Fisher Scientific）洗滌。成功的解離在顯微鏡下證實。

單細胞轉錄組程式庫使用鉻單細胞3'程式庫及凝膠珠粒套組v2（10x Genomics）生成。細胞裝載於 中單細胞3'晶片（10X Genomics）中，約4000個細胞用於每個樣品之靶細胞恢復。單細胞之RNA轉錄物為唯一帶條碼的且在液滴內反轉錄。cDNA分子經預擴增且混合，後接根據方案說明書之程式庫建構。所有程式庫均藉由Qubit及LightCycler 96系統（羅氏）上之實時定量PCR定量。預擴增cDNA及定序程式庫之尺寸圖譜分別藉由Agilent High Sensitivity D5000及High Sensitivity D1000 ScreenTape Systems（安捷倫）檢測。程式庫在大規模平行定序器（HiSeq2500，Illumina）上定序。定序讀段映射為人類參考基因組且作為獨特分子標識符（UMI）之數目之基因表現定量使用10X Genomics之Cell Ranger管線版本2.0進行。

為在Cell Ranger管線處理之後自資料移除不良品質細胞，吾人去除展示無管家基因ACTB 之表現之細胞；或具有＞20%源自粒線體編碼基因之總UMI計數之百分數的細胞；或在其來源樣品中低於第5百分點或高於第95百分點之總UMI計數之細胞；或具有在其來源樣品中低於第5百分點或高於第95百分點之基因數目的細胞。進行主分量分析且選擇在資料集中捕獲最高有效差異之前5種主組分以用於二維t-隨機鄰域嵌入。

基於t-SNE投射中之細胞鄰近度及已知細胞標記之表現，吾人註釋六個細胞組中之細胞之生物一致性以用於細胞型特異性標記發現：肝細胞樣細胞、膽管上皮樣細胞、肌纖維母細胞樣細胞、內皮細胞、淋巴細胞及髓樣細胞。

圖 20 展示已知對人類肝臟中之某些類型之細胞具有特異性的選擇基因（在各圖中命名）之表現圖案（定量為對數轉化之UMI計數的表現）。曲線中之各點表示單細胞之轉錄組資料。灰色表明無表現，且橙紅色度越亮表明表現水準越高。

圖 21 展示藉由PCA-t-SNE觀測獲得之HCC及相鄰非腫瘤肝細胞之計算單細胞轉錄組群聚圖案。曲線中之各點表示單細胞之轉錄組資料，各點之鄰近度係關於RNA表現圖譜之相似性。叢集經進一步著色且基於如圖20中所提及之已知細胞型特異性標記表現之空間鄰近度及表現圖案分組為6個子組。方括號中之數值表明對應細胞型中之細胞數目。

在此實例中，吾人另外使用Z分值統計作為差異臨限值（Z＞=3），標準化UMI計數＜0.2/細胞型作為比較細胞型中之最大臨限值及標準化UMI計數＞=1 UMI/細胞型作為測試細胞組中之最小臨限值選擇細胞類型之特異性基因。 1. 表現z 分值大於3之基因，且 基因表現z分值經計算為： z_g ：基因g之z 分值：測試細胞型A中之基因g之平均表現水準（標準化UMI計數）其他非A比較細胞型中之基因g之平均表現水準之平均值（標準化UMI計數）：其他非A比較細胞型中之平均表現之標準偏差。 2. 大於臨限值之測試細胞型中之平均表現水準（標準化UMI）（＞=1 UMI/細胞），及 3. 小於臨限值之其他比較細胞型中之平均表現水準（標準化UMI）（＜0.2 UMI/細胞型）

圖 22 展示HCC/肝臟單細胞RNA轉錄組資料集中之細胞類型特異性基因之鑑別。各註釋細胞型之細胞類型特異性基因呈現於表現熱度圖中。方括號中之數值表明對應細胞型中之細胞類型特異性基因之總數目。圖 23 展示細胞類型特異性基因之列舉。列舉中之基因中之任一者可位於一個或多個優先表現區域組中。

在此實例中不必需要與其他人類器官/組織（例如胎盤及PBMC）之整個組織或單細胞表現圖譜之比較，因為患者為非妊娠的且HCC/肝臟單細胞RNA轉錄組資料集已經含有兩個主要血球組（淋巴及髓樣細胞）。

吾人隨後證明細胞類型特異性基因組在偵測及監測患有肝細胞癌及有或無肝硬化之慢性B型肝炎之患者中的效用。

在此實例中，吾人招募及分析健康對照（n=8）、患有B型肝炎病毒（HBV）感染及肝硬化之患者（n=23）、患有B型肝炎病毒（HBV）感染且無肝硬化之患者（n=18）、患有B型肝炎病毒（HBV）相關之肝細胞癌之患者（n=12）及24小時之前接受HBV相關之肝細胞切除手術之患者（n=7）的血漿RNA圖譜。慢性HBV感染藉由B型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）之存在界定且肝硬化藉由超聲波成像證據界定。血漿RNA樣品如類似於母體血漿樣品所描述處理。

圖 24 展示來自健康對照、無肝硬化之慢性HBV、有肝硬化之慢性HBV、HCC術前及HCC術後患者之血漿樣品（左至右）中的不同細胞型之細胞標誌分數之比較。藉由排名之克拉斯卡-瓦立斯測試（Kruskal-Wallis test）針對非參數變異數分析進行且進行兩樣品雙尾威爾科克森簽署之排名測試以測試展示統計顯著性之細胞型中之樣品組之間的統計顯著性（K-W p ＜ 0.05）。藉由本傑明-霍赫貝格（Benjamini-Hochberg）方法針對多個測試調節p值* p ＜ 0.05，** p ＜ 0.01。Y軸表示如所描述計算之細胞標誌分數。方括號中之數值表明對應細胞型中之細胞類型特異性基因之總數目。

血漿RNA圖譜中之各細胞型之標誌分數的比較展示相比於其他患者組，肝細胞樣細胞標誌在患有經證實肝細胞癌之患者中顯著較高。在腫瘤切除24小時之後HCC患者中之信號減少。相比之下，相比於健康對照，淋巴性細胞標誌分數在患有HCC之患者中顯著降低。

在另一實例中，吾人證明組合超過一種細胞標誌分數之分析可藉由血漿RNA分析改善HBV相關之HCC患者與非HCC HBV患者的差異。Chan等人先前展示可利用藉由實時定量PCR分析之血漿RNA中之單個肝臟特異性轉錄物ALB 的靶向偵測以偵測肝臟病理學，諸如移植監測、HCC及肝硬化（30）。吾人因此比較ALB 轉錄物偵測及血漿RNA細胞型特異性標誌分數量測在區分HBV相關之HCC患者與有或無肝硬化之非HCC HBV患者之差異中的診斷性能。

圖 25 展示區分非HCC HBV（有或無肝硬化）與HBV-HCC患者之差異之不同方法的接收者操作特徵曲線。左圖展示使用血漿中之單個肝臟特異性轉錄物ALB 之水準的性能比較，肝細胞樣與淋巴細胞標誌分數之比值，及肝細胞樣與髓樣細胞標誌分數之比值。右圖比較ALB單獨、單獨肝細胞樣、單獨淋巴及單獨髓樣標誌分數之診斷效能。方括號中之數值表示曲線下面積。給出德朗測試（DeLong’s test）之p 值。

接受者操作特徵曲線分析展示肝細胞樣細胞之細胞類型特異性標誌分數（0.7907）具有高於ALB 轉錄物之曲線下面積（0.6423）（德朗測試p = 0.02531）。若使用肝細胞樣細胞於淋巴細胞之比值（0.815）或肝細胞樣細胞與髓樣細胞之比值（0.8049），則曲線下面積進一步增加。此等結果表明可利用不同細胞類型特異性標誌之定量關係之數學轉化以改善血漿RNA診斷學。

在另一實例中，吾人進一步基於t-SNE投射上之群聚圖案將肝細胞樣細胞組分離為5個子組（H1-5），如圖 26 中所示。在圖26中，方括號中之數值代表各子組中之細胞數目。圖26係基於圖21中之相同細胞。圖21中之肝細胞樣叢集藉由子組可能存在之空間圖案。另外，吾人預期肝細胞可包含正常肝細胞及腫瘤細胞兩種。

圖 27 展示五個子組中之細胞來源。細胞之程式庫來源之分析展示H1主要由來自相鄰非腫瘤肝臟組織之細胞構成。H2、H3、H4及H5單獨由四個組織供體之腫瘤組織之細胞主導。

有可能將其他叢集分為子組或將子組進一步分為子組。分析子組之決定可視關於組織（例如生物假設驅動）及/或統計分析（例如k平均值統計）之先驗知識而定。

舉例而言，在腫瘤單細胞RNA結果中，吾人預期至少六個隱性細胞型，包含浸潤淋巴細胞及髓樣細胞、正常肝細胞、腫瘤細胞、內皮細胞及膽管上皮細胞。因此，吾人嘗試首先使用k平均值群聚結果加已知標記之表現圖案定位六個叢集。一旦吾人看到血漿RNA結果中之肝叢集之較高信號，則吾人決定進一步根據2D t-SNE曲線中所展示之子叢集形狀分型肝叢集，因為吾人預期腫瘤細胞將存在於肝叢集中。存在五個存在於肝叢集中之子-子組，展示相對清晰之邊界。

可替代地，吾人可使用一些統計方法以測定應考慮之叢集數目。舉例而言，（1）當總叢集內差異最小化時，吾人可停止研究子組之子組。總叢集內差異反映推測為最小化之群聚之緊密性（參考Kaufman, L. 及P.J. Rousseeuw, 《在資料中發現組（Finding Groups in Data）》 (John Wiley & Sons, New York, 1990)）；（2）叢集之最優數目可能為最大化平均輪廓之一者（Peter J. Rousseeuw (1987). 《輪廓：群聚分析之解釋及驗證之圖形輔助》 Computational and Applied Mathematics. 20: 53-65）；（3）叢集之最優數目亦可能為最大化間隙統計之一者（R. Tibshirani, G. Walther,及T. Hastie (Stanford University, 2001). http://web.stanford.edu/~hastie/Papers/gap.pdf）。使用間隙統計平均具有無規均勻分佈之參考資料集（計算模擬）與所觀察叢集之間的叢集內差異之偏差。

使用Z分值統計作為差異臨限值（Z＞=3），標準化UMI計數＜0.5/細胞型作為比較細胞型中之最大臨限值及標準化UMI計數＞=1 UMI/細胞型作為測試細胞組中之最小臨限值的H1-H5子組之細胞子組特異性基因鑑別鑑別16 H1-H5特異性基因。

圖 28 為表現熱度圖，其展示健康對照、無肝硬化之HBV之患者、具有肝硬化之HBV之患者、HBV相關之HCC之患者HCC及24-48小時之前接受HCC切除手術之患者的血漿RNA圖譜中之H2子組特異性基因GPC3 、H3子組特異性基因REG1A 及H4子組特異性基因AKR1B10 之表現。吾人發現3種基因（REG1A 、 GPC3 及 AKR1B10 ）在手術之前之HCC患者的血漿RNA中特定表現，在健康對照中完全不存在且在有或無肝硬化之非HCC HBV患者中不存在（特異性=100%，49/49）。組合全部三種基因之偵測，HCC偵測之敏感度為66.67%（8/12）。圖 29 展示子組特異性基因之清單。結論

吾人使用所關注之組織之單細胞RNA轉錄組資訊說明衍生自非細胞材料（諸如血漿RNA）之細胞資訊的概念。定量標誌分數可基於血漿中之某些RNA轉錄物之表現水準計算，所述轉錄物基於在源組織之單細胞RNA轉錄組資料集中鑑別之細胞型特異性選擇以偵測病理學且監測源組織之變化。吾人說明此使用妊娠進展、嚴重早期先兆子癇之偵測、自身免疫全身性紅斑性狼瘡症及肝癌作為實例。其可適用於分型疾病，諸如非HCCHBV感染及HBV相關之HCC患者之分離，及使用具有肝癌切除之術前及術後患者的變化作為實例之治療結果。

此方法可延伸至游離DNA分析中之基因組及表觀基因組分析，其中細胞類型特異性基因組突變或細胞類型特異性表觀基因組變化（例如DNA甲基化、組蛋白修飾）可首先定義在所關注之組織中之單細胞水準且在游離DNA圖譜中定量。實例系統

圖30說明根據本發明之一實施例之系統3000。所示之系統包含樣品3005，諸如樣品架3010內之游離DNA分子，其中樣品3005可與分析3008接觸以提供物理特徵3015之信號。在一些實施例中，樣品3005可為具有核酸材料之單細胞。樣品架之實例可為包含分析之探針及/或引子的流槽或液滴藉以移動之管(在包含微滴之分析的情況下)。樣品之物理特徵3015(諸如螢光強度值)係藉由偵測器3020偵測。偵測器可按時間間隔(例如，週期性時間間隔)進行量測，獲得構成資料信號之資料點。在一個實施例中，類比至數位轉換器複數次將來自偵測器之類比信號轉換成數位形式。資料信號3025係自偵測器3020發送至邏輯系統3030。資料信號3025可儲存於本地記憶體3035、外部記憶體3040或儲存裝置3045中。

邏輯系統3030可為或可包含電腦系統、ASIC、微處理器等。其亦可包含或與顯示器（例如監測、LED顯示器等）及使用者輸入裝置（例如小鼠、鍵盤、按鈕等）耦合。邏輯系統3030及其他組件可為獨立或網路連接電腦系統之一部分，或其可直接附接至或併入於熱循環裝置中。邏輯系統3030亦可包含在處理器3050中執行之最佳化軟體。

本文中提及之任何電腦系統可利用任何適合數目個子系統。此類子系統之實例顯示於圖31中電腦設備10中。在一些實施例中，電腦系統包含單一電腦裝置，其中子系統可為電腦裝置之組件。在其他實施例中，電腦系統可包含具有內部組件之多個電腦設備，其各自為子系統。電腦系統可包含桌上型及膝上型電腦、平板電腦、移動電話及其他移動裝置。

圖31中所示之子系統經由系統匯流排75互連。顯示其他子系統，諸如列印機74、鍵盤78、儲存裝置79、與顯示器配接器82耦接之監視器76，及其他。耦合至I/O控制器71之外圍配置及輸入/輸出（I/O）裝置可藉由任何數目之本領域中已知之連接（諸如輸入/輸出（I/O）端口77（例如USB，FireWire^® ））連接至電腦系統。舉例而言，I/O端口77或外部介面81（例如乙太網、Wi-Fi等）可用於將電腦系統10連接至廣域網路，諸如網際網路、滑鼠輸入裝置或掃描儀。經由系統匯流排75之互連允許中央處理器73與各子系統通信且控制系統記憶體72或儲存裝置79（例如固定磁碟，諸如硬盤驅動器或光碟）之多個說明書之執行，以及子系統之間的資訊交換。系統記憶體72及/或儲存裝置79可體現為電腦可讀取媒體。另一子系統為資料收集裝置85，諸如照相機、麥克風、加速計及其類似物。本文所提及之任何資料可自一個組件向另一個組件輸出且可向使用者輸出。

電腦系統可包含例如藉由外部介面81或藉由內部介面連接在一起的多個相同組件或子系統。在一些實施例中，電腦系統、子系統或設備可經網路通信。在此類情況下，可將一台電腦視為用戶端且另一台電腦視為伺服器，其中每一者可為同一電腦系統之一部分。用戶端及伺服器各自可包含多個系統、子系統或組件。

實施例之態樣可以模塊化或集成方式使用硬體（例如特殊應用積體電路或場可程式閘極陣列）及/或使用具有一般可程式化處理器之電腦軟體以邏輯控制之形式實施。如本文中所使用，處理器包含位於同一積體晶片上之單核心處理器、多核心處理器，或位於單一電路板上或網路化之多個處理單元。基於本發明及本文所提供之教示，本領域中一般熟習此項技術者將知道及瞭解使用硬體及硬體與軟體之組合來實施本發明之實施例的其他方式及/或方法。

本申請案中所述之任何軟體組件或功能可使用例如習知或面向對象技術、以軟體程式碼形式實施，軟體程式碼係由使用任何適合電腦語言（諸如Java、C、C++、C#、Objective-C、Swift）或腳本處理語言（諸如Perl或Python）的處理器執行。軟體程式碼可以一系列指令或命令形式儲存於電腦可讀取媒體上進行儲存及/或傳輸。適合的非暫時性電腦可讀取媒體可包含隨機存取記憶體（RAM）、唯讀記憶體（ROM）、磁性媒體（諸如硬碟機或軟碟機）或光學媒體，諸如光盤（CD）或DVD （數位化通用光碟）、快閃記憶體及其類似者。電腦可讀取媒體可為此類儲存或傳輸裝置之任何組合。

此類程式亦可使用適用於經由有線、光學及/或符合多種協定之無線網路（包含網際網路）傳輸的載波信號來編碼及傳輸。因此，電腦可讀取媒體可使用以此類程式編碼的資料信號建立。以程式碼編碼之電腦可讀取媒體可與相容裝置一起封裝或與其他裝置分開提供（例如藉助於網際網路下載）。任何此類電腦可讀媒體可駐存在單一電腦產品（例如硬碟機、CD或整個電腦系統）上或其內，且可存在於系統或網路內之不同電腦產品上或其內。電腦系統可包含用於向使用者提供本文所提及之任何結果的監測器、印表機、或其他適合之顯示器。

本文所述之任何方法可完全或部分地使用電腦系統來進行，該電腦系統包含一個或多個可經組態以執行操作的處理器。因此，實施例可涉及經組態以執行本文所述之任何方法之操作的電腦系統，可能利用不同組件執行相應操作或相應操作組。儘管以經編號之操作呈現，但本文方法之操作可以同時或以不同順序執行。另外，此等操作之部分可與來自其他方法之其他操作之部分一起使用。另外，操作之全部或部分可為視情況選用的。另外，任何方法之任何操作可使用模組、單元、電路或用於執行此等操作之其他方法來執行。

本文中所用之部分標題僅出於組織目的而不應理解為限制所述主題。

應理解，本文所述之方法不限於本文所述之特定方法、協定、主題及定序技術且因此可變化。亦應理解，本文中所用之術語僅出於描述特定實施例之目的而並不意欲限制本文中所描述之方法及組合物之範疇，所述範疇將僅由隨附申請專利範圍限制。雖然本文已顯示及描述本發明之一些實施例，但對於本領域熟習此項技術者應顯而易見的是，此類實施例僅藉助於實例提供。本領域熟習此項技術者現將在不背離本發明之情況下想到許多變化、改變及取代。應理解，本文中所描述的本發明之實施例之各種替代例可在實踐本發明時使用。預期以下申請專利範圍界定本發明之範疇，且因此涵蓋此等申請專利範圍及其等效物之範疇內的方法及結構。

參考用於說明之實例應用來描述數個態樣。除非另外指示，否則任何實施例可與任何其他實施例組合。應理解，闡述許多具體詳情、關係及方法以提供對本文所述之特徵的充分理解。然而，熟練技術人員應容易認識到，可在沒有一個或多個具體詳情之情況下或使用其他方法來實踐本文所述之特徵。本文所述之特徵不受所示行為或事件之順序限制，因為一些行為可以不同的順序發生及/或與其他行為或事件同時發生。此外，並非所有所示行為或事件均需要根據本文所述之特徵來實現方法。

雖然本文已顯示及描述本發明之一些實施例，但對於熟習此項技術者應顯而易見的是，此類實施例僅藉助於實例提供。不希望本發明受本說明書中所提供之實施例的限制。雖然已參考前述說明書描述本發明，但本文實施例之描述及說明並不意欲以限制性意義來解釋。本領域熟習此項技術者現將在不背離本發明之情況下想到許多變化、改變及取代。

此外，應理解，本發明之所有態樣不限於本文所闡述之具體描繪、組態或相對比例，其視各種條件及變數而定。應理解，本文中所描述的本發明之實施例之各種替代例可在實踐本發明時使用。因此，涵蓋本發明亦應涵蓋任何此類替代、修改、變化或等效物。預期以下申請專利範圍界定本發明之範疇，且因此涵蓋此等申請專利範圍及其等效物之範疇內的方法及結構。

在提供值之範圍下，應瞭解除非上下文另外明確規定，否則亦特別揭示在所述範圍上限與下限之間的各插入值，精確至下限單位之十分位。涵蓋在所述範圍內任何陳述值或插入值之間的各更小範圍及所述範圍內之任何其他陳述或插入值。此等更小範圍之上限及下限可獨立地包含或排除在所述範圍內，且任一界限、無界限或兩個界限包含於更小範圍中之各範圍亦涵蓋於本發明內，經受所述範圍中任何特別排除之界限。在所述範圍包含界限中之一或兩者下，亦包含排除彼等所包含之界限之任一者或兩者的範圍。

除非上下文另外明確指示，否則如在本文及所附申請專利範圍中所使用，單數形式「一(a/an)」及「所述(the)」包含多個指示物。因此，舉例而言因此，「方法」之參考包含多個此類方法且「粒子」之參考包含本領域熟習此項技術者已知之一種或多種粒子之參考及其當量，等等。現已出於清楚及理解之目的詳細地描述本發明。然而，應瞭解某些變化及修改可在隨附申請專利範圍之範疇內實踐。參考文獻

本文所提及之所有專利、專利申請案、公開案及描述均出於所有目的以全文引用之方式併入。不承認任一者為先前技術。 1. G. J. Burton, A. L. Fowden, 《胎盤：多層面瞬態器官（The placenta: a multifaceted, transient organ）》. 《皇家學會哲學學會生物科學（ Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci ） 》370 , 20140066 (2015). 2. T. Chaiworapongsa, P. Chaemsaithong, L. Yeo, R. Romero, 《子癇前症部分1：其病理生理學之當前理解（Pre-eclampsia part 1: current understanding of its pathophysiology）》. 《自然綜述：腎臟病學 （Nat Rev Nephrol ）》10 , 466-480 (2014). 3. S. J. Fisher, 《為何先兆子癇中之胎盤異常？（Why is placentation abnormal in preeclampsia？）》《美國產科與婦科學雜誌（ Am J Obstet Gynecol ）》 213 , S115-122 (2015). 4. A. M. Vintzileos, C. V. Ananth, J. C. Smulian, 《在胎盤植入異常之臨床管理中使用超聲波（Using ultrasound in the clinical management of placental implantation abnormalities）》.《美國產科與婦科學雜誌》 213 , S70-77 (2015). 5. H. Zeisler, E. Llurba, F. Chantraine, M. Vatish, A. C. Staff, M. Sennstrom, M. Olovsson, S. P. Brennecke, H. Stepan, D. Allegranza, P. Dilba, M. Schoedl, M. Hund, S. Verlohren, 《患有疑似先兆子癇之女性之sFlt-1:PlGF比值的預測值（Predictive Value of the sFlt-1:PlGF Ratio in Women with Suspected Preeclampsia）》. 《新英格蘭醫學雜誌 （N Engl J Med ）》374 , 13-22 (2016). 6. S. S. Chim, Y. K. Tong, R. W. Chiu, T. K. Lau, T. N. Leung, L. Y. Chan, C. B. Oudejans, C. Ding, Y. M. Lo, 《母體血漿中之乳腺絲抑蛋白基因之胎盤表觀遺傳簽名的偵測（Detection of the placental epigenetic signature of the maspin gene in maternal plasma）》. 《美國科學院院報 （Proc Natl Acad Sci U S A ）》102 , 14753-14758 (2005). 7. M. Alberry, D. Maddocks, M. Jones, M. Abdel Hadi, S. Abdel-Fattah, N. Avent, P. W. Soothill, 《假妊娠中之母體血漿中之無胎兒DNA：滋養層來源之證實（Free fetal DNA in maternal plasma in anembryonic pregnancies: confirmation that the origin is the trophoblast）》. 《產前診斷 （Prenat Diagn ）》27 , 415-418 (2007). 8. B. H. Faas, J. de Ligt, I. Janssen, A. J. Eggink, L. D. Wijnberger, J. M. van Vugt, L. Vissers, A. Geurts van Kessel, 《使用大規模平行結紮定序之胎兒非整倍體之非侵入性產前診斷及證明母體血漿中之游離胎兒DNA來源於滋養細胞（Non-invasive prenatal diagnosis of fetal aneuploidies using massively parallel sequencing-by-ligation and evidence that cell-free fetal DNA in the maternal plasma originates from cytotrophoblastic cells）》. 《生物療法之專家意見 （Expert Opin Biol Ther ）》12 增刊 1 , S19-26 (2012). 9. Y. M. Lo, T. N. Leung, M. S. Tein, I. L. Sargent, J. Zhang, T. K. Lau, C. J. Haines, C. W. Redman, 《先兆子癇中之母體血清中之胎兒DNA的定量異常（Quantitative abnormalities of fetal DNA in maternal serum in preeclampsia）》. 《臨床化學 （Clin Chem ）》45 , 184-188 (1999). 10. E. K. Ng, T. N. Leung, N. B. Tsui, T. K. Lau, N. S. Panesar, R. W. Chiu, Y. M. Lo, 《母體血漿中之循環促皮質素釋放激素mRNA之濃度在先兆子癇中增加（The concentration of circulating corticotropin-releasing hormone mRNA in maternal plasma is increased in preeclampsia）》. 《臨床化學 （Clin Chem ）》49 , 727-731 (2003). 11. A. Martin, I. Krishna, M. Badell, A. Samuel, 《游離胎兒DNA預測先兆子癇之數量：系統綜述（Can the quantity of cell-free fetal DNA predict preeclampsia: a systematic review）》.《產前診斷》 34 , 685-691 (2014). 12. Y. G. Zhang, H. L. Yang, Y. Long, W. L. Li, 《血球中之循環RNA與血漿蛋白因子組合以用於早期預測子癇前症（Circular RNA in blood corpuscles combined with plasma protein factor for early prediction of pre-eclampsia）》. 《英國婦產科雜誌（ BJOG ） 》123 , 2113-2118 (2016). 13. T. N. Leung, J. Zhang, T. K. Lau, N. M. Hjelm, Y. M. D. Lo, 《作為早產標誌之母體血漿胎兒DNA（Maternal plasma fetal DNA as a marker for preterm labour）》. 《柳葉刀 （The Lancet ）》352 , 1904-1905 (1998). 14. A. Farina, E. S. LeShane, R. Romero, R. Gomez, T. Chaiworapongsa, N. Rizzo, D. W. Bianchi, 《母體血清中之胎兒游離DNA之高水準：自發性早產之風險因子（High levels of fetal cell-free DNA in maternal serum: a risk factor for spontaneous preterm delivery）》.《美國產科與婦科學雜誌》 193 , 421-425 (2005). 15. T. R. Jakobsen, F. B. Clausen, L. Rode, M. H. Dziegiel, A. Tabor, 《與自發性早產之增加風險相關之胎兒DNA之高水準（High levels of fetal DNA are associated with increased risk of spontaneous preterm delivery）》.《產前診斷》 32 , 840-845 (2012). 16. Y. Y. Lui, K. W. Chik, R. W. Chiu, C. Y. Ho, C. W. Lam, Y. M. Lo, 《性別不匹配之骨髓移植之後血漿及血清中之游離DNA之主要造血來源（Predominant hematopoietic origin of cell-free DNA in plasma and serum after sex-mismatched bone marrow transplantation）》. 《臨床化學 》48 , 421-427 (2002). 17. N. B. Tsui, S. S. Chim, R. W. Chiu, T. K. Lau, E. K. Ng, T. N. Leung, Y. K. Tong, K. C. Chan, Y. M. Lo, 《母體血漿中之胎盤mRNA之基於系統性微觀陣列的鑑別：針對非侵入性產前基因表現圖譜分析（Systematic micro-array based identification of placental mRNA in maternal plasma: towards non-invasive prenatal gene expression profiling）》. 《醫學遺傳學雜誌 （J Med Genet ）》41 , 461-467 (2004). 18. F. M. Lun, R. W. Chiu, K. Sun, T. Y. Leung, P. Jiang, K. C. Chan, H. Sun, Y. M. Lo, 《藉由母本血漿DNA之基因組譜亞硫酸氫鹽定序進行之非侵入性產前甲基化分析（Noninvasive prenatal methylomic analysis by genomewide bisulfite sequencing of maternal plasma DNA）》. 《臨床化學 》59 , 1583-1594 (2013). 19. X. Huang, T. Yuan, M. Tschannen, Z. Sun, H. Jacob, M. Du, M. Liang, R. L. Dittmar, Y. Liu, M. Liang, M. Kohli, S. N. Thibodeau, L. Boardman, L. Wang, 《藉由深度測序進行之人類血漿衍生之外吐小體RNA的表徵（Characterization of human plasma-derived exosomal RNAs by deep sequencing）》. 《BMC 基因組學（ BMC Genomics ） 》14 , 319 (2013). 20. N. B. Tsui, P. Jiang, Y. F. Wong, T. Y. Leung, K. C. Chan, R. W. Chiu, H. Sun, Y. M. Lo, 《用於妊娠相關之轉錄物之全基因體轉錄組圖譜分析及鑑別的母體血漿RNA定序（Maternal plasma RNA sequencing for genome-wide transcriptomic profiling and identification of pregnancy-associated transcripts）》. 《臨床化學 》60 , 954-962 (2014). 21. W. Koh, W. Pan, C. Gawad, H. C. Fan, G. A. Kerchner, T. Wyss-Coray, Y. J. Blumenfeld, Y. Y. El-Sayed, S. R. Quake, 《人類中之組織特異性全局基因表現之非侵入性活體內監測（Noninvasive in vivo monitoring of tissue-specific global gene expression in humans）》. 《美國科學院院報 》111 , 7361-7366 (2014). 22. K. Sun, P. Jiang, K. C. Chan, J. Wong, Y. K. Cheng, R. H. Liang, W. K. Chan, E. S. Ma, S. L. Chan, S. H. Cheng, R. W. Chan, Y. K. Tong, S. S. Ng, R. S. Wong, D. S. Hui, T. N. Leung, T. Y. Leung, P. B. Lai, R. W. Chiu, Y. M. Lo, 《用於非侵入性產前、癌症及移植評估之藉由全基因體甲基化定序進行之血漿DNA組織地圖繪製（Plasma DNA tissue mapping by genome-wide methylation sequencing for noninvasive prenatal, cancer, and transplantation assessments）》. 《美國科學院院報 》112 , E5503-5512 (2015). 23. Y. Qin, J. Yao, D. C. Wu, R. M. Nottingham, S. Mohr, S. Hunicke-Smith, A. M. Lambowitz, 《藉由使用熱穩定第II族內含子逆轉錄酶之人類血漿RNA之高通量定序（High-throughput sequencing of human plasma RNA by using thermostable group II intron reverse transcriptases）》. 《RNA 》22 , 111-128 (2016). 24. M. W. Snyder, M. Kircher, A. J. Hill, R. M. Daza, J. Shendure, 《游離DNA包含告知其來源組織之活體內核小體足跡（Cell-free DNA Comprises an In Vivo Nucleosome Footprint that Informs Its Tissues-Of-Origin）》. 《細胞 （Cell ）》164 , 57-68 (2016). 25. K. C. Chan, P. Jiang, K. Sun, Y. K. Cheng, Y. K. Tong, S. H. Cheng, A. I. Wong, I. Hudecova, T. Y. Leung, R. W. Chiu, Y. M. Lo, 《第二代非侵入性胎兒基因組分析揭露新生突變、單鹼基親本遺傳及較佳之DNA末端（Second generation noninvasive fetal genome analysis reveals de novo mutations, single-base parental inheritance, and preferred DNA ends）》. 《美國科學院院報 》113 , E8159-E8168 (2016). 26. G. X. Zheng, J. M. Terry, P. Belgrader, P. Ryvkin, Z. W. Bent, R. Wilson, S. B. Ziraldo, T. D. Wheeler, G. P. McDermott, J. Zhu, M. T. Gregory, J. Shuga, L. Montesclaros, J. G. Underwood, D. A. Masquelier, S. Y. Nishimura, M. Schnall-Levin, P. W. Wyatt, C. M. Hindson, R. Bharadwaj, A. Wong, K. D. Ness, L. W. Beppu, H. J. Deeg, C. McFarland, K. R. Loeb, W. J. Valente, N. G. Ericson, E. A. Stevens, J. P. Radich, T. S. Mikkelsen, B. J. Hindson, J. H. Bielas, 《單細胞之大規模平行數位轉錄圖譜分析（Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells）》. 《自然通訊 （Nat Commun ）》8 , 14049 (2017). 27. S. Kovats, E. K. Main, C. Librach, M. Stubblebine, S. J. Fisher, R. DeMars, 《在人類滋養層中表現之I類抗原HLA-G（A class I antigen, HLA-G, expressed in human trophoblasts）》. 《科學 （Science ）》248 , 220-223 (1990). 28. S. Djurisic, T. V. Hviid, 《妊娠及先兆子癇中之HLA Ib類分子及免疫細胞（HLA Class Ib Molecules and Immune Cells in Pregnancy and Preeclampsia）》. 《免疫學前沿進展 （Front Immunol ）》5 , 652 (2014). 29. J. Trowsdale, A. Moffett, 《妊娠中之NK受體與MHC I類分子之相互作用（NK receptor interactions with MHC class I molecules in pregnancy）》. 《種子免疫學 （Semin Immunol ）》20 , 317-320 (2008). 30. R. Sood, J. L. Zehnder, M. L. Druzin, P. O. Brown, 《人類胎盤中之基因表現圖案（Gene expression patterns in human placenta）》. 《美國科學院院報 》103 , 5478-5483 (2006). 31. C. Trapnell, D. Cacchiarelli, J. Grimsby, P. Pokharel, S. Li, M. Morse, N. J. Lennon, K. J. Livak, T. S. Mikkelsen, J. L. Rinn, 《細胞命運決策之動力學及調控因子由單細胞之假臨時排序（The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells）》. 《自然生物技術 （Nat Biotechnol ）》32 , 381-386 (2014). 32. S. Mi, X. Lee, X. P. Li, G. M. Veldman, H. Finnerty, L. Racie, E. LaVallie, X. Y. Tang, P. Edouard, S. Howes, J. C. Keith, J. M. McCoy, 《合胞素為涉及人類胎盤形態發生之捕獲逆轉錄病毒包膜蛋白（Syncytin is a captive retroviral envelope protein involved in human placental morphogenesis）》. 《自然 （Nature ）》403 , 785-789 (2000). 33. J. Sugimoto, M. Sugimoto, H. Bernstein, Y. Jinno, D. Schust, 《新穎人類內源性逆轉錄病毒蛋白抑制細胞-細胞融合（A novel human endogenous retroviral protein inhibits cell-cell fusion）》. 《科學報告 （Sci Rep ）》3 , 1462 (2013). 34. E. K. Ng, N. B. Tsui, T. K. Lau, T. N. Leung, R. W. Chiu, N. S. Panesar, L. C. Lit, K. W. Chan, Y. M. Lo, 《可容易在母體血漿中偵測之胎盤來源之mRNA（mRNA of placental origin is readily detectable in maternal plasma）》. 《美國科學院院報 》100 , 4748-4753 (2003). 35. M. N. Cabili, C. Trapnell, L. Goff, M. Koziol, B. Tazon-Vega, A. Regev, J. L. Rinn, 《人類大基因間非編碼RNA之整合註釋揭露全局特性及特異性子類（Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses）》. 《基因及發展 （Genes Dev ）》25 , 1915-1927 (2011). 36. H. Valdimarsson, C. Mulholland, V. Fridriksdottir, D. V. Coleman, 《妊娠中之白血球計數及淋巴細胞反應之縱向研究：所標記之單核球-淋巴細胞比值之早期增加（A longitudinal study of leucocyte blood counts and lymphocyte responses in pregnancy: a marked early increase of monocyte-lymphocyte ratio）》. 《臨床與實驗免疫學 （Clin Exp Immunol ）》53 , 437-443 (1983). 37. M. Watanabe, Y. Iwatani, T. Kaneda, Y. Hidaka, N. Mitsuda, Y. Morimoto, N. Amino, 《正常妊娠期間及之後T、B及NK淋巴細胞亞群之變化（Changes in T, B, and NK lymphocyte subsets during and after normal pregnancy）》. 《美國生殖免疫學雜誌 （Am J Reprod Immunol ）》37 , 368-377 (1997). 38. J. Lima, C. Martins, M. J. Leandro, G. Nunes, M. J. Sousa, J. C. Branco, L. M. Borrego, 《晚期妊娠至分娩後健康孕婦之B細胞之特徵：前瞻性觀測研究（Characterization of B cells in healthy pregnant women from late pregnancy to post-partum: a prospective observational study）》. 《BMC 妊娠及分娩 （BMC Pregnancy Childbirth ）》16 , 139 (2016). 39. W. C. Andrews, R. W. Bonsnes, 《妊娠期間的白血球（The leucocytes during pregnancy）》.《美國產科與婦科學雜誌》 61 , 1129-1135 (1951). 40. R. M. Pitkin, D. L. Witte, 《妊娠中之血小板及白血球計數（Platelet and leukocyte counts in pregnancy）》. 《美國醫學協會雜誌 （JAMA ）》242 , 2696-2698 (1979). 41. A. J. Balloch, M. N. Cauchi, 《來源於患者群體之妊娠中之血液學參數的參考範圍（Reference ranges for haematology parameters in pregnancy derived from patient populations）》. 《臨床血液實驗學 （Clin Lab Haematol ）》15 , 7-14 (1993). 42. P. Brennecke, S. Anders, J. K. Kim, A. A. Kolodziejczyk, X. Zhang, V. Proserpio, B. Baying, V. Benes, S. A. Teichmann, J. C. Marioni, M. G. Heisler, 《解釋單細胞RNA-seq實驗中之技術雜訊（Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments）》. 《自然方法 （Nat Methods ）》10 , 1093-1095 (2013). 43. A. A. Kolodziejczyk, J. K. Kim, J. C. Tsang, T. Ilicic, J. Henriksson, K. N. Natarajan, A. C. Tuck, X. Gao, M. Buhler, P. Liu, J. C. Marioni, S. A. Teichmann, 《可塑狀態之單細胞RNA定序解鎖模塊化轉錄差異（Single Cell RNA-Sequencing of Pluripotent States Unlocks Modular Transcriptional Variation）》. 《細胞幹細胞 （Cell Stem Cell ）》17 , 471-485 (2015). 44. E. DiFederico, O. Genbacev, S. J. Fisher, 《先兆子癇與子宮壁內胎盤細胞滋養層之廣泛細胞凋亡相關（Preeclampsia is associated with widespread apoptosis of placental cytotrophoblasts within the uterine wall）》. 《美國臨床病理學雜誌 （Am J Pathol ）》155 , 293-301 (1999). 45. F. Reister, H. G. Frank, J. C. Kingdom, W. Heyl, P. Kaufmann, W. Rath, B. Huppertz, 《巨噬細胞誘導之細胞凋亡限制先兆子癇女性之子宮壁中之血管內滋養層侵入（Macrophage-induced apoptosis limits endovascular trophoblast invasion in the uterine wall of preeclamptic women）》. 《實驗室研究 （Lab Invest ）》81 , 1143-1152 (2001). 46. D. N. Leung, S. C. Smith, K. F. To, D. S. Sahota, P. N. Baker, 《併發先兆子癇之懷孕中之增加的胎盤細胞凋亡（Increased placental apoptosis in pregnancies complicated by preeclampsia）》.《美國產科與婦科學雜誌》 184 , 1249-1250 (2001). 47. N. Ishihara, H. Matsuo, H. Murakoshi, J. B. Laoag-Fernandez, T. Samoto, T. Maruo, 《藉由先兆子癇或宮內發育延遲併發之人類足月胎盤中之融合細胞滋養層中的增加的細胞凋亡（Increased apoptosis in the syncytiotrophoblast in human term placentas complicated by either preeclampsia or intrauterine growth retardation）》.《美國產科與婦科學雜誌 （American Journal of Obstetrics and Gynecology ）》 186 , 158-166 (2002). 48. P. K. Lala, C. Chakraborty, 《調節滋養層遷移及侵襲之因素：促進子癇前症及胎兒受傷之可能紊亂（Factors regulating trophoblast migration and invasiveness: possible derangements contributing to pre-eclampsia and fetal injury）》. 《胎盤 （Placenta ）》24 , 575-587 (2003). 49. M. Kadyrov, J. C. Kingdom, B. Huppertz, 《來自併發母體貧血及早期發作先兆子癇/宮內發育遲緩之懷孕之胎盤床螺旋動脈的發散滋養層侵入及細胞凋亡（Divergent trophoblast invasion and apoptosis in placental bed spiral arteries from pregnancies complicated by maternal anemia and early-onset preeclampsia/intrauterine growth restriction）》.《美國產科與婦科學雜誌》 194 , 557-563 (2006). 50. S. Z. Tomas, I. K. Prusac, D. Roje, I. Tadin, 《併發先兆子癇之懷孕之胎盤中的滋養層細胞凋亡（Trophoblast apoptosis in placentas from pregnancies complicated by preeclampsia）》. 《婦產科研究（Gynecol Obstet Invest ）》71 , 250-255 (2011). 51. M. S. Longtine, B. Chen, A. O. Odibo, Y. Zhong, D. M. Nelson, 《絨毛狀滋養層細胞凋亡由併發先兆子癇、IUGR或具有IUGR之先兆子癇之懷孕中的細胞滋養層提高且受其限制（Villous trophoblast apoptosis is elevated and restricted to cytotrophoblasts in pregnancies complicated by preeclampsia, IUGR, or preeclampsia with IUGR）》. 《胎盤 （Placenta ）》33 , 352-359 (2012). 52. Y. M. Lo, K. C. Chan, H. Sun, E. Z. Chen, P. Jiang, F. M. Lun, Y. W. Zheng, T. Y. Leung, T. K. Lau, C. R. Cantor, R. W. Chiu, 《母本血漿DNA定序揭露胎兒之全基因體基因及突變圖譜（Maternal plasma DNA sequencing reveals the genome-wide genetic and mutational profile of the fetus）》. 《科學轉化醫學期刊 （Sci Transl Med ）》2 , 61ra91 (2010). 53. W. W. Hui, P. Jiang, Y. K. Tong, W. S. Lee, Y. K. Cheng, M. I. New, R. A. Kadir, K. C. Chan, T. Y. Leung, Y. M. Lo, R. W. Chiu, 《基於通用單倍型之非侵入性單基因疾病產前檢測（Universal Haplotype-Based Noninvasive Prenatal Testing for Single Gene Diseases）》.《臨床化學》 63 , 513-524 (2017). 54. M. Pavlicev, G. P. Wagner, A. R. Chavan, K. Owens, J. Maziarz, C. Dunn-Fletcher, S. G. Kallapur, L. Muglia, H. Jones, 《人類胎盤之單細胞轉錄組學：推斷母胎界面之細胞通信網路（Single-cell transcriptomics of the human placenta: inferring the cell communication network of the maternal-fetal interface）》. 《基因組研究 （Genome Res ）》, (2017). 55. L. Ji, J. Brkic, M. Liu, G. Fu, C. Peng, Y. L. Wang, 《胎盤滋養層細胞分化：生理學調節及與先兆子癇之病理相關性（Placental trophoblast cell differentiation: physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia）》. 《醫學之分子態樣 （Mol Aspects Med ）》34 , 981-1023 (2013). 56. E. Z. Macosko, A. Basu, R. Satija, J. Nemesh, K. Shekhar, M. Goldman, I. Tirosh, A. R. Bialas, N. Kamitaki, E. M. Martersteck, J. J. Trombetta, D. A. Weitz, J. R. Sanes, A. K. Shalek, A. Regev, S. A. McCarroll, 《使用奈升液滴之個體細胞之高度平行全基因體表現圖譜分析（Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets）》. 《細胞 （Cell ）》161 , 1202-1214 (2015). 57. A. M. Klein, L. Mazutis, I. Akartuna, N. Tallapragada, A. Veres, V. Li, L. Peshkin, D. A. Weitz, M. W. Kirschner, 《應用於胚胎幹細胞之單細胞轉錄組學之液滴條形碼（Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells）》. 《細胞 》161 , 1187-1201 (2015). 58. T. M. Gierahn, M. H. Wadsworth, 2nd, T. K. Hughes, B. D. Bryson, A. Butler, R. Satija, S. Fortune, J. C. Love, A. K. Shalek, 《Seq-Well：高通量下單細胞之攜帶型低成本RNA定序（Seq-Well: portable, low-cost RNA sequencing of single cells at high throughput）》. 《自然方法 》, (2017). 59. A. Dobin, C. A. Davis, F. Schlesinger, J. Drenkow, C. Zaleski, S. Jha, P. Batut, M. Chaisson, T. R. Gingeras, 《STAR：超速通用RNA-seq比對器（STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner）》. 《生物信息學（Bioinformatics ）》29 , 15-21 (2013). 60. M. I. Love, W. Huber, S. Anders, 《具有DESeq2之RNA-seq資料之倍數變化及分散性的適當估算（Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2）》. 《基因組生物學 （Genome Biol ）》15 , 550 (2014). 61. Pang WW, 等人 . (2009) 《用於鑑別用以胎兒生長評估之循環胎盤RNA標記之策略（A strategy for identifying circulating placental RNA markers for fetal growth assessment）》. 《產前診斷 》 29(5):495-504. 62. Muraro MJ, 等人 (2016) 《人類胰臟之單細胞轉錄組圖譜（A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Human Pancreas）》. 《細胞系統 （Cell Syst ）》 3(4):385-394 e383. 63. Zeisel A, 等人 (2015) 《大腦結構.藉由單細胞RNA-seq揭露之小鼠皮質及海馬體中之細胞型（Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq）》. 《科學 》 347(6226):1138-1142. 64. Patel AP, 等人 (2014) 《單細胞RNA-seq強調原始神經膠母細胞瘤中之瘤內異質性（Single-cell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity in primary glioblastoma）》. 《科學 》 344(6190):1396-1401. 65. Ng EK, 等人 . (2002) 《癌症患者及健康個體之血漿中之可過濾及不可過濾mRNA之存在（Presence of filterable and nonfilterable mRNA in the plasma of cancer patients and healthy individuals）》. 《臨床化學 》 48(8):1212-1217. 66. Wong BC, 等人 . (2005) 《母體血漿中之循環胎盤RNA與5'mRNA片段之優勢相關：非侵入性產前診斷及監測之含義（Circulating placental RNA in maternal plasma is associated with a preponderance of 5' mRNA fragments: implications for noninvasive prenatal diagnosis and monitoring）》. 《臨床化學 》 51(10):1786-1795. 67. Chiu RW, 等人 . (2005) 《胎兒恆河猴D mRNA不可在母體血漿中偵測（Fetal rhesus D mRNA is not detectable in maternal plasma）》. 《臨床化學 》 51(11):2210-2211. 68. Sanz I (2014) 《SLE中B細胞靶向之基本原理（Rationale for B cell targeting in SLE）》. 《種子免疫學 （Semin Immunopathol ）》 36(3):365-375. 69. Chan RW, Wong J, Lai PB, Lo YM, Chiu RW. 《用於肝臟移植後管理之連續血漿白蛋白mRNA監測之可能臨床效用（The potential clinical utility of serial plasma albumin mRNA monitoring for the post-liver transplantation management）》. 《臨床生物化學（Clin Biochem.）》 2013;46(15):1313-9. 70. Chan RW, Wong J, Chan HL, Mok TS, Lo WY, Lee V, 等人 《肝臟病理中之肝臟衍生之血漿白蛋白mRNA之異常濃度（Aberrant concentrations of liver-derived plasma albumin mRNA in liver pathologies）》. 《臨床化學》. 2010;56(1):82-9.

10‧‧‧電腦設備

71‧‧‧I/O控制器

72‧‧‧系統記憶體

73‧‧‧中央處理器

74‧‧‧列印機

75‧‧‧系統匯流排

76‧‧‧監視器

77‧‧‧輸入/輸出（I/O）端口

78‧‧‧鍵盤

79‧‧‧儲存裝置

81‧‧‧外部介面

82‧‧‧顯示器配接器

110‧‧‧圖式

112‧‧‧胎兒

114‧‧‧懷孕女性

116‧‧‧胎盤

120‧‧‧圖式

130‧‧‧圖式

140‧‧‧圖式

142‧‧‧叢集

150‧‧‧圖式

152‧‧‧組

154‧‧‧組

156‧‧‧組

160‧‧‧圖式

170‧‧‧圖式

200‧‧‧方法

202‧‧‧區塊

204‧‧‧區塊

206‧‧‧區塊

208‧‧‧區塊

210‧‧‧區塊

212‧‧‧區塊

214‧‧‧區塊

216‧‧‧區塊

218‧‧‧區塊

300‧‧‧方法

302‧‧‧區塊

304‧‧‧區塊

306‧‧‧區塊

308‧‧‧區塊

310‧‧‧區塊

312‧‧‧區塊

3000‧‧‧系統

3005‧‧‧樣品

3008‧‧‧分析

3010‧‧‧樣品架

3015‧‧‧物理特徵

3020‧‧‧偵測器

3025‧‧‧資料信號

3030‧‧‧邏輯系統

3040‧‧‧外部記憶體

3045‧‧‧儲存裝置

3050‧‧‧處理器

圖 1 為使用妊娠及先兆子癇作為根據本發明之實施例之實例，解釋細胞動態監測及畸變發現中之單細胞及血漿RNA轉錄組學之整合分析的示意圖。圖 2 為根據本發明之實施例鑑別表現標記以區分不同病狀程度之方法之方塊流程圖。圖 3 為根據本發明之實施例使用時間相關之子群體測定病狀程度之方法的方塊流程圖。圖 4 為展示根據本發明之實施例用於分析之關於用作個體之妊娠期婦女的資訊。圖 5 展示根據本發明之實施例，藉由t-SNE分析進行之20,518個胎盤細胞之單細胞轉錄組叢集圖案。圖 6 展示根據本發明之實施例，在2維投射中，若干基因在細胞叢集之聚集表現。圖 7A 展示根據本發明之實施例，在資料集中各細胞叢集之胎兒及母體來源百分比分析。圖 7B 展示根據本發明之實施例，比較各細胞叢集中表達來自Y染色體的基因之細胞數量百分比條形圖。圖 7C 展示雙軸散佈圖，其展示根據本發明之實施例，在原始t-SNE叢集分佈中所推定為胎兒/母體來源之細胞分佈。圖 7D 展示根據本發明之實施例，P5-7細胞叢集中之基質及髓樣細胞標記的表現圖案。圖 7E 展示根據本發明之實施例，使用電腦模擬產生之人工P4/P7混合細胞與P4, P5, P7細胞叢集的t-SNE比較分析。圖 7F 展示根據本發明之實施例，在不同胎盤細胞叢集之間人類白血球抗原之基因之表現圖案的雙軸散佈圖。圖 7G 為根據本發明之實施例概述各細胞叢集之註釋性質定義。圖 7H 展示根據本發明之實施例，不同單細胞轉錄組資料集中之不同性質細胞叢集組成的百分比分析。圖 8 展示根據本發明之實施例，藉由t-SNE合併分析胎盤細胞及來自公用數據的外周血液單核血球之單細胞轉錄組獲得之叢集圖案。圖 9 為根據本發明之實施例，概述合併分析來自公用數據的外周血液單核血球（PBMC）及胎盤細胞之單細胞轉錄組中之不同細胞型之註釋性質的表。圖 10A 展示根據本發明之實施例，藉由t-SNE分析合併胎盤細胞及來自公用數據的外周血液單核血球之單細胞轉錄組獲得之叢集圖案。圖 10B 為根據本發明之實施例，概述合併分析來自公用數據的外周血液單核血球（PBMC）及胎盤細胞之單細胞轉錄組中之不同細胞型之註釋性質的表。圖 10C 展示雙軸散佈圖，其根據本發明之實施例展示胎盤細胞及PBMC之不同細胞叢集之間特異性標記基因之表現圖案。圖 10D 為熱度圖，其根據本發明之實施例展示不同PBMC及胎盤細胞叢集中之特異性標誌基因之平均表現。圖 10E 展示盒狀圖，其根據本發明之實施例比較人類白血球、肝臟及胎盤在全組織轉組中不同細胞型特異性基因之表現水準。圖 10F 展示根據本發明之實施例，文獻中妊娠期間母體血漿RNA資料集之細胞型特異性基因表達量變化分析。圖 11 展示根據本發明之實施例，在妊娠期間母體血漿RNA中之胎盤細胞型特異性基因表達量變化動態。圖 12A 展示根據本發明之實施例，在先兆子癇患者及對照母體血漿RNA中之絨毛外滋養細胞（EVTB）細胞特異性基因表達標誌分析。圖 12B 展示根據本發明之實施例，細胞死亡相關之基因在先兆子癇及對照個體胎盤中之EVTB細胞之表達程度比較。圖 13 展示根據本發明之實施例，不同細胞類特異性基因在先兆子癇及對照母體血漿RNA之特異性表達量標誌分數。圖 14A 展示根據本發明之實施例，在另一組先兆子癇患者及對照母體血漿RNA中之絨毛外滋養細胞（EVTB）細胞特異性基因表達標誌分析。圖 14B 展示根據本發明之實施例，來自先兆子癇患者及正常足月之胎盤活檢體之單細胞轉錄組HLA - G 及 PAPPA2 基因在EVTB細胞叢集中之表達特異性。圖 15 展示根據本發明之實施例，在來自妊娠晚期對照及嚴重早期先兆子癇（PE）患者之母體血漿RNA中EVTB細胞特異性基因標誌分數之比較。圖 16 展示根據本發明之實施例，胎盤細胞及PBMC之特異性基因清單。圖 17 為根據本發明之實施例，胎盤細胞及PBMC中之特異性基因的表現熱度圖。圖 18 為根據本發明之實施例，在健康對照與患有活性SLE患者來源之血漿RNA中之來自單細胞轉錄組分析的B細胞特異性基因表現標誌分數比較。圖 19 展示根據本發明之實施肝癌樣品之樣品名稱及臨床資訊。圖 20 展示根據本發明之實施例，已知對人類肝臟中某些細胞型具有特異性之基因在本發明之實施肝癌樣本之單細胞轉錄組中的表現圖案。圖 21 展示根據本發明之實施例，藉由PCA-t-SNE觀測獲得之HCC及相鄰非腫瘤肝細胞之計算單細胞轉錄組叢集圖案。圖 22 展示根據本發明之實施例，HCC/肝臟單細胞轉錄組資料集中之細胞型特異性基因之鑑別。圖 23 為根據本發明之實施例列舉HCC/肝臟單細胞分析之細胞型特異性基因之表。圖 24 展示根據本發明之實施例，健康對照、無肝硬化之慢性HBV、具有肝硬化之慢性HBV及HCC手術前以及HCC手術後患者之血漿RNA中不同類細胞之細胞型特異性基因表現標誌分數之比較。圖 25 展示根據本發明之實施例，不同方法在區分非HCC HBV（有或無肝硬化）相對於HBV-HCC患者之接收者操作特徵曲線分析比較。圖 26 展示根據本發明之實施例，藉由t-SNE分析把肝細胞樣細胞組細分之五個子組。圖 27 展示根據本發明之實施例，肝細胞樣細胞組之五個子組中的細胞來源。圖 28 為表現熱度圖，其根據本發明之實施例展示肝細胞樣細胞組之五個子組中之優先表現區域的表現。圖 29 為根據本發明之實施例在肝細胞樣細胞組之子組中優先表現之基因清單的表。圖 30 說明根據本發明之實施例之系統。圖 31 展示可與根據本發明之實施例之系統及方法一起使用的實例電腦系統之方塊圖。

Claims (38)

1. 一種鑑別表現標記以區分不同病狀程度的方法，所述方法包括： 對於獲自一個或多個第一個體之多個細胞中之各細胞而言： 分析來自所述細胞之RNA分子以獲得一組讀段，藉此獲得多組讀段； 對於所述讀段組中之各讀段而言： 藉由電腦系統鑑別對應於所述讀段之參考序列中之表現區域； 用於多個表現區域中之每一者而言： 確定對應於所述表現區域之讀段的量； 使用對應於所述區域之所述讀段量確定所述表現區域之表現分數，藉此確定包括所述多個表現區域之所述表現分數的多維表現點； 使用對應於所述多個細胞之所述多維表現點、藉由所述電腦系統將所述多個細胞分成多個叢集，所述多個叢集少於所述多個細胞； 對於所述多個叢集中之各叢集而言，確定一組一個或多個優先表現區域，所述優先表現區域在所述叢集之細胞中以大於其他叢集之細胞的指定速率表現； 對於多個游離RNA樣品中之每一者而言： 分析多個游離RNA分子以獲得多個游離讀段，其中所述多個游離RNA樣品來自多個群組的第二個體，其中所述多個群組中之各群組患有不同程度之所述病狀；以及 對於所述多組一個或多個優先表現區域中的每一組一個或多個優先表現區域而言： 使用對應於所述組的一個或多個優先表現區域之游離讀段量測對應叢集之標誌分數； 基於所述標誌分數將所述組的一個或多個優先表現區域中之一或多者鑑別為一個或多個表現標記以用於未來樣品的分類，從而區分所述病狀之不同程度。
2. 如請求項1之方法，其中： 所述病狀為妊娠相關之病狀， 所述第一個體為各自懷有胎兒之女性個體， 所述多個細胞為胎盤細胞， 所述第二個體為各自懷有胎兒之女性個體。
3. 如請求項2之方法，其中所述游離RNA樣品獲自所述第二個體之血漿或血清。
4. 如請求項2之方法，其中所述妊娠相關之病狀為先兆子癇。
5. 如請求項4之方法，其中所述程度為先兆子癇之嚴重程度。
6. 如請求項4之方法，其中： 各群組包含具有不同胎齡之子群組，且 第一組一個或多個優先表現區域為區分第一胎齡之所述病狀之不同程度的第一表現標記。
7. 如請求項1之方法，其中所述病狀為癌症。
8. 如請求項7之方法，其中所述病狀之所述程度為是否存在癌症、癌症的不同階段、腫瘤的不同尺寸、癌症對治療之反應，或癌症嚴重程度或進展之另一量度。
9. 如請求項7之方法，其中所述多個叢集中之第一叢集之第一組一個或多個優先表現區域為區分第一組織之癌症程度之第一表現標記，其中所述第一叢集包含來自所述第一組織之細胞。
10. 如請求項9之方法，其中 所述第一組織來自肝臟，藉此具有包含肝細胞之所述第一叢集； 所述肝細胞包括腫瘤細胞及非腫瘤細胞或所述肝細胞不包括腫瘤細胞，且 所述癌症為肝細胞癌。
11. 如請求項1之方法，其中： 所述病狀為全身性紅斑性狼瘡症（systemic lupus erythematosus；SLE），且 所述多個細胞為腎細胞。
12. 如請求項1之方法，進一步包括： 對於所述多個細胞中之各細胞而言： 將與對應於所述細胞之唯一代碼相關之所述讀段組儲存在所述電腦系統之記憶體中， 其中鑑別對應於所述讀段之所述參考序列中之所述表現區域包含使用所述讀段及所述參考序列之多個表現區域執行比對程序，且 其中確定對應於所述多個細胞中之第一細胞之第一表現區域的所述讀段量係使用（1）對應於所述第一細胞之所述唯一代碼以便鑑別對應於所述第一細胞之讀段及（2）對所述第一細胞之所述讀段組執行所述比對程序之結果。
13. 如請求項1之方法，進一步包括： 獲得包括所述多個細胞之樣品； 分離所述多個細胞中之各細胞以能夠分析特定細胞之所述RNA分子。
14. 如請求項13之方法，進一步包括： 用所述細胞之唯一代碼標記所述多個細胞中之各細胞的RNA分子，使得所述相關讀段包含所述唯一代碼，及 將與對應於所述讀段組之所述細胞之所述唯一代碼相關的各讀段組儲存在所述電腦系統之記憶體中。
15. 如請求項1之方法，其中： 所述指定速率包括自所述叢集之細胞之平均表現分數及其他叢集之細胞之平均表現分數確定的值。
16. 如請求項1之方法，其中： 將所述多個細胞分成所述多個叢集包括進行降維方法或對所述多維表現點使用基於力之方法。
17. 如請求項16之方法，其中： 將所述多個細胞分成所述多個叢集包括進行降維方法，且 所述降維方法包括主分量分析（principal component analysis；PCA）或擴散映射。
18. 如請求項16之方法，其中： 將所述多個細胞分成所述多個叢集包括使用基於力之方法，且 所述基於力之方法包括t-分佈隨機鄰域嵌入（t-distributed stochastic neighbor embedding；t-SNE）。
19. 如請求項1之方法，進一步包含： 鑑別所述多個叢集中之第一叢集以包含第一類型之細胞，此藉由比較所述第一叢集中之所述組的一個或多個優先表現區域與已知在所述第一類型之細胞中優先表現之一個或多個區域來達成。
20. 如請求項19之方法，其中所述第一類型之細胞包括蛻膜細胞、內皮細胞、血管平滑肌細胞、基質細胞、樹突狀細胞、霍夫包爾氏（Hofbauer）細胞、T細胞、紅血球母細胞、絨毛外滋養細胞、細胞營養層細胞、融合細胞滋養層細胞、B細胞、單核球、肝細胞樣細胞、膽管上皮細胞樣細胞、肌纖維母細胞樣細胞、內皮細胞、淋巴細胞或髓樣細胞。
21. 如請求項1之方法，其中所述第一個體與所述第二個體相同。
22. 如請求項1之方法，其中所述標誌分數為所述對應叢集之所述優先表現區域之表現水準的平均值。
23. 如請求項1之方法，其中鑑別用於未來樣品分類之所述一組或多組的一個或多個優先表現區域以區分所述病狀之不同程度包括鑑別統計學上不同於所述叢集中之其他群組之標誌分數的群組及叢集之標誌分數。
24. 如請求項1之方法，進一步包含： 自獲自第三個體之生物樣品之游離RNA分子的分析接收多個游離讀段； 對於第一表現標記中之各優先表現區域而言： 確定所述優先表現區域之讀段量，及 比較一個或多個優先表現區域之所述讀段量與一個或多個參考值；及 基於一個或多個優先表現區域之所述讀段量與一個或多個參考值之所述比較來確定所述第三個體之所述病狀之程度。
25. 如請求項24之方法，進一步包括： 分析獲自所述第三個體之所述生物樣品之多個游離RNA分子以獲得多個游離讀段。
26. 如請求項24之方法，其中比較一個或多個優先表現區域之所述讀段量與一個或多個參考值包括比較各優先表現區域之所述讀段量與各優先表現區域之參考值。
27. 如請求項24之方法，其中比較一個或多個優先表現區域之所述讀段量與一個或多個參考值包括： 利用一個或多個優先表現區域之所述讀段量計算總分數，及 比較所述總分數與一個參考值。
28. 一種確定個體之病狀程度之方法，所述方法包括： 自獲自所述個體之生物樣品之游離RNA分子的分析接收多個游離讀段； 對於一個或多個表現標記之各優先表現區域而言，所述一個或多個表現標記藉由如請求項1之方法確定： 確定所述優先表現區域之讀段量，及 比較所述一個或多個優先表現區域之對應於參考值之讀段量與一個或多個參考值；及 基於各優先表現區域之所述讀段量與一個或多個參考值之所述比較來確定所述個體之所述病狀的程度。
29. 一種確定個體之病狀程度之方法，所述方法包括： 自獲自所述個體之生物樣品之游離RNA分子的分析接收多個游離讀段； 確定與所述病狀相關之時間參數值； 利用所述時間參數值確定所述病狀在所述時間參數值時之表現標記，所述表現標記包括一或多組優先表現區域； 對於所述表現標記之各優先表現區域而言： 確定對應於所述優先表現區域之讀段量； 比較一個或多個優先表現區域之所述讀段量與一個或多個參考值；及 基於一個或多個優先表現區域之所述讀段量與一個或多個參考值之所述比較來確定所述個體之所述病狀的程度。
30. 如請求項29之方法，其中： 所述病狀為妊娠相關之病狀，且 所述個體為懷有胎兒之女性。
31. 如請求項30之方法，其中所述妊娠相關病狀為先兆子癇。
32. 如請求項30之方法，其中所述時間參數為以妊娠週、妊娠月或妊娠三個月表示的胎齡。
33. 如請求項30之方法，其中所述病狀為癌症。
34. 如請求項33之方法，其中所述時間參數為治療持續時間、自癌症確診以來之時間，或手術後存活時間。
35. 如請求項29之方法，其中比較一個或多個優先表現區域之所述讀段量與一個或多個參考值包括比較各優先表現區域之所述讀段量與各優先表現區域之參考值。
36. 如請求項29之方法，其中比較一個或多個優先表現區域之所述讀段量與一個或多個參考值包括： 利用一個或多個優先表現區域之所述讀段量計算總分數，及 比較所述總分數與一個參考值。
37. 一種電腦產品，包括電腦可讀取媒體，所述電腦可讀取媒體儲存用於控制電腦系統的多條指令以執行如請求項1至36中任一項之方法。
38. 一種系統，包括經組態以執行如請求項1至36中任一項之方法的一個或多個處理器。