TW201900872A - 高活性nk細胞及其利用 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種細胞毒殺活性更高之NK細胞。本發明之課題在於提供一種可期待較高之效果之用於NK細胞療法之醫藥組合物。本發明提供一種NK細胞或其群，其具備下述(1)及(2)之特徵：(1)為CD16陽性、CD56高表現性、且CD57陰性；(2)為NKG2C陽性、NKG2A陰性～低表現性、及CD94陽性。又，本發明提供一種包含此種NK細胞之群、及治療上有效量之抗體的醫藥組合物。
Description
本發明係關於一種具有較高之細胞毒殺活性之自然殺手細胞(NK細胞)與其利用。
自然殺手細胞(NK細胞)係作為自然免疫之主因素子而發揮作用之細胞毒殺性之淋巴球。已知人類末梢血NK細胞為CD16陽性且以較低之水準表現CD56且為CD57陽性(非專利文獻1、2)。
作為NK細胞之細胞毒殺之機制之一，已知有抗體依賴性細胞毒殺(ADCC，Antibody dependent cellular cytotoxicity)。NK細胞於其細胞表面上具有Fc受體(CD16)，而ADCC之機制係NK細胞經由Fc受體而與結合於靶細胞之抗體進行結合，從而進行靶細胞之毒殺。
NK細胞於腫瘤細胞或病毒感染細胞之排斥方面較重要。藉由體外之培養使自患者自身採集之NK細胞數增殖為百倍～數千倍並使之活化，再送回患者體內之NK細胞療法作為副作用相對較少之治療方法而受到關注。通常，一般認為藉由正常成人之末梢血之1次血球分離術(apheresis)能夠回收約1×1010
個單核細胞，若將末梢血單核細胞中之NK細胞之構成比率設為約7%，則獲得7×108
個NK細胞。另一方面，若將患者之體重設為60 kg，則需要6×106
個～4.8×109
個NK細胞需要。因此，業界正不斷開發將自供體獲得之NK細胞培養擴增來獲得足以殺滅靶細胞之NK細胞的技術。例如專利文獻1提出有如下NK細胞之擴增方法，其特徵在於包括如下步驟：製備包含NK細胞之細胞群之步驟；自包含NK細胞之細胞群去除T細胞之步驟；及利用僅包含2500 IU/mL至2813 IU/mL之IL-2作為細胞激素之培養基，不使用飼養細胞而培養去除T細胞後剩餘之細胞的步驟。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本專利特開2013-27385號公報(日本專利第5572863號) [非專利文獻]
[非專利文獻1]Lorenzo, M., Blood, 116: 3689 (2010) [非專利文獻2]有馬靖佳、日本造血細胞移植學會雜誌、第3卷、第1號：12 (2014)
[發明所欲解決之問題]
根據本發明者等人之研究，自末梢血獲得之初代NK細胞為CD16高表現性，於將NK細胞作為效應細胞(E)，將K562細胞作為靶細胞(T)，並以混合比(E：T)1：1進行共培養之情形時之細胞毒殺活性為10～20%左右。若存在細胞毒殺活性更高之NK細胞，則較理想。
又，多數抗體醫藥係以NK細胞之ADCC活性作為其作用機理之一。為了使NK細胞發揮出ADCC活性，需要使位於NK細胞表面之CD16與能夠誘發抗體依賴性細胞毒殺之抗體進行結合。然而，迄今為止尚無將抗體醫藥與NK細胞療法有效地加以組合之相關報告。 [解決問題之技術手段]
[1]本發明提供以下者： 一種NK細胞或其群，其具備下述(1)及(2)之特徵： (1)為CD16陽性、CD56高表現性、且CD57陰性。 (2)為NKG2C陽性、NKG2A陰性～低表現性、及CD94陽性。 [2]如1中所記載之群，其包含CD16高表現性之NK細胞之群、及CD16低表現性之NK細胞之群。 [3]如1中所記載之NK細胞或其群，其為CD16高表現性。 [4]如1中所記載之NK細胞或其群，其為CD16低表現性。 [5]如1至4中任一項所記載之NK細胞或其群，其進而具備下述(3)之特徵： (3)於將該NK細胞作為效應細胞(E)，將K562細胞作為靶細胞(T)，並以混合比(E：T)1：1進行共培養之情形時之細胞毒殺活性為50%以上。 [6]如1至5中任一項所記載之NK細胞或其群之製備方法，其包括下述步驟： 利用包含IL-2之培養基、或無血清培養基培養初代NK細胞之群。 [7]如6中所記載之製備方法，其中初代NK細胞之群係經過去除CD3陽性細胞之步驟者。 [8]一種醫藥組合物，其包含如1至5中任一項所記載之NK細胞之群、及作為醫藥而容許之添加物。 [9]一種醫藥組合物，其包含NK細胞之群、及治療上有效量之抗體。 [10]如9中所記載之醫藥組合物，其中NK細胞之群係如1至5中任一項所記載之NK細胞之群。 [11]如9或10中所記載之醫藥組合物，其中抗體係能夠誘發抗體依賴性細胞毒殺(ADCC，Antibody-Dependent-Cellular-Cytotoxicity)者。 [12]如9至11中任一項所記載之醫藥組合物，其中抗體之至少一部分與NK細胞結合。
[NK細胞、NK細胞群] 本發明提供一種NK細胞或其群，其具備下述(1)之特徵： (1)為CD16陽性、CD56高表現性、且CD57陰性。 又，上述NK細胞或其群具備下述(2)之特徵： (2)為NKG2C陽性、NKG2A陰性～低表現性、及CD94陽性。 上述NK細胞或其群可進而具備下述(3)之特徵： (3)於將該NK細胞作為效應細胞(E)，將K562細胞作為靶細胞(T)，並以混合比(E：T)1：1進行共培養之情形時之細胞毒殺活性為50%以上。
NK細胞係未表現T細胞受體(TCR)、作為T細胞普遍標記物之CD3、及作為膜免疫球蛋白之B細胞受體的大型顆粒性淋巴球，通常人類為CD16陽性，且為CD56陽性。關於是否為NK細胞，只要為從業者，則可基於細胞表面標記物之表現圖案等而容易地判斷。NK細胞具有細胞毒殺活性，該細胞毒殺活性之有無或程度可藉由公知之各種方法進行測定。於稱為NK細胞時，除特別記載之情形以外，包括末梢血NK細胞、初代NK細胞、培養NK細胞、活化NK細胞、藉由本發明所獲得之NK細胞等各種NK細胞。
＜細胞群＞ 所謂細胞群係指包含複數個細胞、例如1×105
個細胞以上之細胞之一群。NK細胞之群係以超過50%之純度(純度(%)＝NK細胞之個數/所有細胞之個數×100)包含NK細胞之群。NK細胞於人類之末梢血中通常占淋巴球之10～30%。即，明確末梢血中之純度為50%以下。因此，可認為NK細胞之群並非天然地存在。又，NK細胞之群可製備為各種細胞密度。例如可製備為1×105
個細胞/mL以上。
由本發明所提供之NK細胞之群中之NK細胞之純度較佳為60%以上，更佳為70%以上，進而較佳為80%以上。NK細胞之群中所含之NK細胞之數量較佳為1×106
個細胞以上，更佳為5×106
個細胞以上，進而較佳為1×107
個細胞以上。又，NK細胞之群中所含之NK細胞之數量可設為適於向人類投予之1×106
個細胞～1×1010
個細胞。又，NK細胞之群中之細胞密度為1×105
個細胞/mL以上，較佳為2×105
個細胞/mL以上，更佳為5×105
個細胞/mL以上，進而較佳為1×106
個細胞/mL以上。細胞密度之上限值例如可設為1×1010
個細胞/mL以下。又，NK細胞之群中之細胞密度可設為適於培養或冷凍保存之1×106
～1×108
個細胞/mL，又，可設為適於向人類投予之1×105
～1×109
個細胞/mL。
＜特徵(1)＞ 由本發明所提供之NK細胞或其群為CD16高表現性，或為CD16低表現性。又，由本發明所提供之NK細胞之群可包含CD16高表現性之NK細胞之群、及CD16低表現性之NK細胞之群兩者。包含兩者之細胞群若藉由流式細胞法對CD16進行分析，則呈現雙峰性。又，由本發明所提供之NK細胞或其群為CD56高表現性。已知CD56係作為NK細胞之標記物有用之抗原。進而，對於由本發明所提供之NK細胞或其群未觀察到CD57之表現。CD57係作為第5階段(活化型、或成熟型)之標記物而為人所知。
關於CD16等標記物，有以+表示陽性，以-表示陰性之情形。例如有CD16陽性表示為CD16+
，CD16陰性表示為CD16-
之情形。陽性包括高表現性之情形與低表現性之情形。高表現性有表示為high、bright之情形。例如CD16高表現性有表示為CD16high
、CD16bright
之情形。低表現性有表示為low、dim之情形。例如CD16低表現性有表示為CD16low
、CD16dim
之情形。
陽性、陰性、高表現性、低表現性可基於藉由流式細胞法所獲得之圖表進行判斷。出現於圖表中之位置有時根據設備之電壓設定、感度設定、使用抗體選殖、染色條件、使用色素等而發生變動，從業者可於所獲得之圖表中以將被確認為一群之細胞群分開之方式適當地劃線。
於目標標記物之表現為陽性或為陰性之判斷中，可利用使用有同型對照(Isotype control)抗體之情形作為陰性對照進行判斷。同型對照抗體係不會與特定抗原進行反應之抗體。一般而言，於使用抗體之實驗中，因與目標物以外之蛋白質之非特異性結合、或與細胞表面上之Fc受體之結合，有可能產生背景。藉由與使用成為陰性對照之抗體之系統進行比較，而明確一次抗體對於目標抗原之反應為特異性。又，可排除背景之影響，正確地解釋訊號之強度。
目標標記物之表現程度(為低表現性、或為高表現性)可藉由與於同一條件下測得之對照細胞之結果進行比較而判斷。對照細胞之例係本案說明書之實施例之項中所記載之初代NK之類的自末梢血獲得之未進行實質性培養之NK細胞。
例如某NK細胞之群中之CD16之表現程度可使用流式細胞儀，將該細胞群中之CD16表現量與自末梢血獲得之未進行實質性培養之NK細胞之群(對照；已知為CD16高表現性)中之CD16表現量進行比較，於可觀察到與對照同等之表現情形時判斷為高表現性，於表現低於對照細胞之情形時判斷為低表現性。
又，關於CD56，通常第4階段(stage4)之NK細胞(利用幹細胞，經過原始NK(pro-NK)、前NK(pre-NK)、不成熟NK(immature-NK)之階段而獲得之年輕NK細胞)為CD56bright
，第5階段之NK細胞(若於第4階段之NK細胞中轉錄因子MCM4進行活化，則NK細胞分化為第5階段)被理解為CD56dim
。因此，某NK細胞之群中之CD56之表現程度可藉由與第4階段之NK細胞之群、及第5階段之NK細胞之群中之至少一者之比較進行判斷。
將迄今為止已知之NK細胞與藉由本發明所獲得之NK細胞之特徵彙總於以下(參照非專利文獻1、2)。
[表1]
上表係於藉由流式細胞法對CD16及CD56進行評價之情形時所獲得之圖表之概念圖。a～d與非專利文獻1中所報告之圖中之細胞係對應如下。 a：CD56bright
、CD94+++
、KIR-
Killer cell Immunoglobulin-like Receptor、殺手細胞免疫球蛋白樣受體、CD16-
、穿孔素(perforin)+-
、 b：CD56dim
、CD94++
、KIR-
、CD16+-
、穿孔素+
、 c：CD56dim
、CD94+
、KIR+-
、CD16+
、穿孔素++
、 d：CD56dim
、CD94+-
、KIR+
、CD16++
、CD57+
、穿孔素+++
自末梢血獲得之初代之(primary)NK細胞為CD16高表現性。又，已知通常為CD16高表現性之NK細胞為CD56dim
/CD57+
。迄今為止業界尚未報告有CD16high
/CD56high
/CD57-
之NK細胞。
＜特徵(2)＞ 又，由本發明所提供之NK細胞為NKG2C陽性、NKG2A陰性～低表現性、及CD94陽性。NKG2A陰性～低表現性、CD94之表現可於NK細胞之大部分中觀察到。CD94與NKG2家族之分子之一進行二硫醚鍵結，而形成針對MHC(Major Histocompatibility Complex，主要組織相容性複合體)I型分子之受體。已知NKG2C主要於NK細胞中表現，參與NK細胞之活化，CD94/NKG2C異源二聚物係作為活化受體而發揮功能。CD94/NKG2A異源二聚物係針對MHC I型之抑制性受體。NKG2A陰性～低表現性包括NKG2A陰性之情形、有NKG2A之極弱表現之情形、及NKG2A低表現性之情形。
根據本發明者等人之研究，由本發明所提供之NK細胞或其群於與由非專利文獻1所報告之NK細胞(參照上述a～d)之比較中為CD94++
、KIR+
、及穿孔素+++
。
由本發明所提供之NK細胞或其群可藉由將(2)之特徵與現有之NK細胞或其群進行區分，此外或可代替(2)之特徵，藉由將下述(2-1)與現有之NK細胞或其群進行區分。 (2-1)KIR(s)(Killer cell Immunoglobulin-like Receptor(s)，殺手細胞免疫球蛋白樣受體)陽性。
所謂KIR(s)陽性係指選自由KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、及KIR3DS1所組成之群中之至少一個為陽性。
由本發明所提供之NK細胞或其群可藉由將(2)之特徵與現有之NK細胞或其群進行區分，此外或可代替(2)之特徵，藉由將下述(2-2)與現有之NK細胞或其群進行區分。 (2-2)滿足選自由NKp44陽性、NKp30高表現性、及NKp46高表現性所組成之群中之任一個、較佳為滿足任兩個、較佳為滿足全部。
NKp44通常於初代之NK細胞中為陰性。NKp30係引發MHC非限制性之細胞毒性之NK特異性靶受體，為NKp46、NKp44及迄今為止所鑑定之自然細胞毒性受體(NCR，Natural Cytotoxicity Receptor)之一個。已知NKp30之表現與NKp46並行，且為NKp46bright
之NK細胞為NKp30bright
。又，已知為NKp30bright
係與細胞毒性活性較高相關。關於由本發明所提供之NK細胞或其群係由(2-2)賦予特徵，可參照本案說明書之實施例1及圖1。
再者，關於NK細胞之每一分化階段之表面標記物之表現圖案，可參照以下之文獻。 非專利文獻3：Luetke-Eversloh M., M. Killig, C. Romagnani. 2013. Signatures of human NK cell development and terminal differentiation. Front. Immunol. 4: 499. PubMedGoogle Scholar
＜特徵(3)＞ 由本發明所提供之NK細胞或其群可發揮出較高之細胞毒殺活性。所謂細胞毒殺活性，除特別記載之情形以外，係指對象細胞(效應細胞、E)對於靶細胞(T)之溶解能力。細胞毒殺活性能夠以因效應細胞而死亡之靶細胞之百分率(%)表示，並可藉由下式求出。
(與效應細胞共培養之情形時之細胞死亡－自然細胞死亡(陰性對照))/(最大細胞死亡(陽性對照)－自然細胞死亡(陰性對照))×100
於細胞毒殺活性之測定時，通常根據效應細胞之細胞毒殺活性程度等，效應細胞與靶細胞之混合比(E：T)、效應細胞與靶細胞之共培養之時間可根據所使用之細胞之種類或活性之強度而設為適當。於將NK細胞設為效應細胞時，靶細胞存在K562細胞、急性骨髄性白血病細胞、慢性骨髄性白血病細胞之情形，但並不限定於該等。效應細胞與靶細胞、活細胞與死細胞可藉由利用放射性物質、螢光色素等進行標記之抗體等試劑進行區分，又，進行定量。於將NK細胞設為效應細胞時之細胞毒殺活性例如可於如下條件下進行測定：將K562細胞設為靶細胞，且設為E：T＝1：0.05～10，較佳為設為1：0.1～5，將培養時間設為0.5～18小時，較佳為設為1～12小時。
由本發明所提供之NK細胞或其群係將靶細胞設為K562細胞，以E：T＝1：1進行混合並共培養1～3小時、若進一步特定則為2小時之情形時之細胞毒殺活性為50%以上，較佳為60%以上，更佳為70%以上。
自末梢血獲得之初代之NK細胞細胞毒殺活性較低。迄今為止業界尚未報告有為CD16high
/CD56high
/CDTM
57-
且細胞毒殺活性較高之NK細胞。
[NK細胞或其群之製備方法] 本發明提供一種上述NK細胞或其群之包括下述步驟之製備方法： 利用包含IL-2之培養基培養初代NK細胞之群之步驟。
＜初代NK細胞＞ 於本發明之製備方法中，初代NK細胞之群可藉由從自受驗者採集之血細胞分離單核細胞之步驟而獲得。血細胞有采自末梢血、臍帶血、骨髄及/或淋巴結之情形。血細胞有自末梢血藉由血球分離術法而採集之情形。
於本發明之製備方法中，初代NK細胞之群有利用如下細胞進行製備之情形，其係選自由源自選自由胚胎幹細胞、成體幹細胞及人工多能性幹(iPS)細胞所組成之群中之任一種幹細胞之造血幹細胞、源自臍帶血之造血幹細胞、源自末梢血之造血幹細胞、源自骨髄血之造血幹細胞、臍帶血單核細胞、末梢血單核細胞所組成之群中之至少1種細胞。作為初代NK細胞群之供體之受驗者有源自作為受體之患者自身、或該患者之近親、或與患者無血緣關係者之情形。受驗者有為健康者與罹患疾病之患者之情形。NK細胞有源自受體之主要組織相容性抗原(MHC)與殺傷性免疫球蛋白類受體(KIR，Killer Immunoglobulin-like Receptor)不一致之供體之情形。
於本發明之製備方法中，可自初代NK細胞之群去除T細胞。T細胞之去除有藉由去除CD3陽性細胞之步驟而達成之情形。
本發明之NK細胞之製備方法有包括自初代NK細胞之群造血去除前驅細胞之步驟之情形。自包含NK細胞之細胞群去除造血前驅細胞之步驟有藉由去除CD34陽性細胞之步驟而達成之情形。
初代NK細胞之群可使用從業者已知之各種順序而製備。例如於自臍帶血及末梢血之類的血液回收單核細胞時，可使用比重離心法。又，NK細胞可使用免疫磁珠進行採集。進而，初代NK細胞之群可利用對於細胞表面標記物之特異性抗體進行免疫螢光染色，並使用FACS(Fluorescence activated cell sorter，螢光活化細胞分選儀)或流式細胞儀進行單離、鑑定。又，初代NK細胞之群可使用包括由Invitrogen公司銷售之Dynal公司製造之Dynabeads(商標)、或Miltenyi Biotec公司之CliniMACS(商標)但不限於該等之免疫磁珠，分離去除表現細胞表面抗原CD3及/或CD34之細胞而製備。又，有利用對於T細胞及/或造血前驅細胞之特異性結合對象，選擇性地毒殺或殺滅T細胞及/或造血前驅細胞之情形。再者，去除T細胞之步驟可為將其他細胞類型、例如造血前驅細胞、B細胞及/或NKT(Natural Killer T，自然殺手T)細胞與T細胞一併去除之步驟。去除造血前驅細胞之步驟可為將其他細胞類型、例如T細胞、B細胞及/或NKT細胞與造血前驅細胞一併去除之步驟。
＜培養基＞ 用於培養初代NK細胞之群之細胞培養用培養基包含KBM501培養基(Kohjin Bio股份有限公司；包含1,750 JRU/ml之IL-2；人類NK細胞初代培養(Primary Culture)用)、CellGro SCGM培養基(CellGenix、岩井化學藥品股份有限公司)、X-VIVO15培養基(Lonza、TAKARA BIO股份有限公司)、COSMEDIUM 008(Cosmo Bio；包含1,750 JRU/ml之IL-2；人類NK細胞初代培養用)、CTS AIM V Medium GibcoTM
CTSTM
AIM VTM
Medium(Thermo Fisher Scientific；用以增殖、操作T細胞及樹狀細胞之已知組成之無血清培養基)、CTS OpTmizerT細胞擴增基礎培養基(CTS OpTmizer T Cell Expansion Basal Medium)(Thermo Fisher Scientific；人類T淋巴球之生長及增殖用)、IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium，思考夫改良杜貝可培養基)、MEM(Minimum Essential Medium，最低必需培養基)、DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，杜貝可改良伊格爾培養基)、RPMI-1640等，但並不限定於該等。
有以可達成本發明之目的之濃度向培養基中添加介白素-2(IL-2)之情形。IL-2之濃度有為2500 IU/mL～2813 IU/mL之情形。IL-2較佳為具有人類之胺基酸序列，就安全方面而言較佳為藉由重組DNA(Deoxyribonucleic Acid，去氧核糖核酸)技術進行生產。IL-2之濃度有以國內標準單位(JRU)及國際單位(IU)表示之情形。由於1 IU為約0.622 JRU，故而現有之培養基之1750 JRU/mL相當於約2813 IU/mL。
有向培養基中添加受驗者之自體血清、可自BioWhittaker公司及此外之公司獲取之人類AB型血清、或可自日本紅十字會獲取之獻血人類血清白蛋白之情形。自體血清及人類AB型血清較佳為以1至10%之濃度添加，獻血人類血清白蛋白較佳為以1至10%之濃度添加。
有於培養基中將不損及NK細胞之擴增效果作為條件而包含適當之蛋白質、細胞激素、抗體、化合物及此外之成分之情形。細胞激素有介白素3(IL-3)、介白素7(IL-7)、介白素12(IL-12)、介白素-15(IL-15)、介白素-21(IL-21)、幹細胞因子(SCF)、及/或類FMS酪胺酸激酶3配體(Flt3L)之情形。IL-3、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、SCF及Flt3L較佳為具有人類之胺基酸序列，就安全方面而言較佳為藉由重組DNA技術進行生產。
培養基較佳為無血清培養基。無血清培養基較佳為包含血清白蛋白、轉鐵蛋白、及胰島素。用於培養淋巴球之無血清培養基已被開發出並於市面上銷售，於本發明中可利用該等。無血清培養基之較佳例之一係於基礎培養基中添加有作為支持人類T細胞增殖之組成而於市面上銷售之CTS Immune Cell SR(Thermo Fisher Scientific)者。
培養基之更換能夠以獲得所需之NK細胞之細胞數作為條件，於培養開始後任何時候進行，較佳為每3～5天。
培養時所使用之培養容器包含可自商業途徑獲取之培養皿、燒瓶、培養板、多孔板，但並不限定於該等。培養條件係以不損及NK細胞之擴增效果作為條件，並無特別限定，通常為37℃、5%CO2
及飽和水蒸氣氛圍下之培養條件。利用培養基進行培養之期間越長，越能獲得更多之NK細胞，故而有利。培養期間係以使NK細胞擴增至所需細胞數作為條件，並無特別限定。
藉由培養而獲得之特定NK細胞之群有除目標NK細胞以外亦包含NK細胞前驅物、T細胞、NKT細胞、造血前驅細胞等之情形。培養後，有目標NK細胞或其群例如使用比重離心法、免疫磁珠、FACS、流式細胞儀等而選擇之情形。例如有使用抗CD3抗體、抗CD16抗體、抗CD34抗體、抗CD56抗體、抗CD69抗體、抗CD94抗體、抗CD107a抗體、抗KIR3DL1抗體、抗KIR3DL2抗體、抗KIR2DL3抗體、抗KIR2DL1抗體、抗KIR2DS1抗體、抗KIR2DL5抗體、抗NKp46抗體、抗NKp30抗體、抗NKG2D抗體等，選擇性地分離目標NK細胞或其群之情形。抗體有為單株抗體、多株抗體等之情形。目標NK細胞或其群之選擇有選擇性地去除T細胞、NKT細胞、造血前驅細胞及此外之細胞而進行之情形。
[NK細胞或其群之利用] 本發明提供一種包含NK細胞之群、及作為醫藥而容許之添加物之醫藥組合物。又，本發明提供一種包含NK細胞之群、及治療上有效量之抗體之醫藥組合物。作為醫藥而容許之添加物例如可例示：等張劑、pH值調整劑、緩衝劑、穩定劑、冷凍保護劑、抗生素等。具體而言，可列舉：水、乙醇、氯化鈉、葡萄糖、白蛋白等。本發明之醫藥組合物中所含之NK細胞之群較佳為上述由本發明所提供之NK細胞之群。又，本發明之醫藥組合物中所含之NK細胞之群可為CD16高表現性，於任一情形時均更佳為細胞毒殺活性較高之NK細胞之群。
本發明之醫藥組合物中所使用之抗體較佳為可用作抗體醫藥品者。又，較佳為能夠誘發抗體依賴性細胞毒殺(ADCC，Antibody-Dependent-Cellular-Cytotoxicity)者。本發明之醫藥組合物中所使用之抗體可為小鼠抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人類抗體中之任一種，較佳為人源化抗體、或人類抗體。又，所使用之抗體可經修飾，亦可為藉由Potelligent技術(去除IgG(Immunoglobulin G，免疫球蛋白G)之Fc區之岩藻糖)而製作者。
作為可用作抗體醫藥品且可用於本發明之醫藥組合物之抗體之具體例，可列舉：替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)、碘(iodine)131、卡妥索單抗(catumaxomab)、博納吐單抗(blinatumomab)、莫羅單抗-CD3(muromonab-CD3)、阿昔單抗(abciximab)、利妥昔單抗(rituximab)、巴利昔單抗(basiliximab)、英利昔單抗(infliximab)、西妥昔單抗(cetuximab)、本妥昔單抗(brentuximab)、西妥昔單抗(siltuximab)、達妥昔單抗(dinutuximab)、奧托昔單抗(obiltoxaximab)、達利珠單抗(daclizumab)、帕利珠單抗(palivizumab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、吉妥珠單抗(gemtuzumab)、阿侖珠單抗(alemtuzumab)、奧馬珠單抗(omalizumab)、厄法珠單抗(efalizumab)、貝伐珠單抗(bevacizumab)、那他珠單抗(natalizumab)、托西珠單抗(tocilizumab)、雷尼珠單抗(ranibizumab)、依庫珠單抗(eculizumab)、賽妥珠單抗(certolizumabpegol)、莫加珠單抗(mogamulizumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、阿托西珠單抗(obinutuzumab)、維多珠單抗(vedolizumab)、派姆單抗(pembrolizumab)、依達賽珠單抗(idarucizumab)、美泊利單抗(mepolizumab)、埃羅妥珠單抗(elotuzumab)、達雷木單抗(daratumumab)、艾克司單抗(ixekizumab)、瑞利珠單抗(reslizumab)、阿達木單抗(adalimumab)、帕尼單抗(panitumumab)、戈利木單抗(golimumab)、優特克單抗(ustekinumab)、康納單抗(canakinumab)、奧伐單抗(ofatumumab)、地諾單抗(denosumab)、伊匹單抗(ipilimumab)、貝利木單抗(belimumab)、瑞西巴庫(raxibacumab)、雷莫盧單抗(ramucirumab)、納武單抗(nivolumab)、蘇金單抗(secukinumab)、依伏庫單抗(evolocumab)、阿利庫單抗(alirocumab)、及耐昔妥珠單抗(necitumumab)。
本發明之醫藥組合物中所使用之抗體較佳為對CD16親和性較高者。又，於本發明之醫藥組合物中，較佳為抗體之至少一部分與NK細胞結合。根據本發明者等人之研究，於使用利用Potelligent技術製作之莫加珠單抗作為抗體之情形時，於NK細胞與靶細胞之共培養中存在抗體之系統、及預先混合NK細胞與抗體，且於與靶細胞共培養前洗淨NK細胞後(去除未與細胞結合之抗體)進行共培養之系統中，對於後者可觀察到更高之細胞毒殺活性。另一方面，於相同條件下使用達妥昔單抗之情形時，未觀察到由預先混合NK細胞與抗體所引起之效果。該情況提示，只要為對CD16親和性較高之抗體，則藉由預先與NK細胞混合，抗體與NK細胞結合，藉此可發揮出較高之ADCC活性。再者，若研究條件，則認為即便為達妥昔單抗亦有可能獲得相同效果。
本發明之醫藥組合物有使用時進行製備之情形。例如本發明之醫藥組合物可藉由在將NK細胞之群與抗體保持於另一容器之狀態下維持，於即將向對象投予前～數小時前進行混合而製備。
本發明之醫藥組合物亦可經過在將NK細胞群與抗體加以混合後去除未與NK細胞結合之抗體之步驟而製備。即，本發明之醫藥組合物之較佳態樣之一係雖然包含NK細胞與抗體，但抗體與NK細胞結合，且實質上不含未與NK細胞結合之抗體者。
認為抗體醫藥品多數於靜脈內投予後顯示出由ADCC活性引起之抗腫瘤效果。另一方面，於發揮ADCC活性時，除NK以外，單核細胞/巨噬細胞或嗜中性球亦被調動。並且，NK細胞以外之效應器不區分正常細胞與癌細胞均顯示出ADCC活性，認為其亦導致副作用之表現。於本發明中，藉由在投予前將NK細胞與抗體加以混合，而預先使NK細胞具備抗體。因此認為，效應器被限定於NK細胞，可減少所投予之抗體之量，又，對副作用之減少亦極有效。
本發明之醫藥組合物存在具有與藉由本發明之製備方法所製備之NK細胞不同之HLA(Human Leukocyte Antigen，人類白血球抗原)基因型，且向患者投予之情形。
醫藥組合物典型而言為使NK細胞懸浮於溶液中之形態。用以使NK細胞懸浮之溶液通常為例如包含DMSO(dimethylsulfoxide，二甲基亞碸)之冷凍用保護液、生理鹽水、磷酸緩衝生理鹽水(PBS)、培養基、血清等。溶液有包含作為醫藥品及準藥品之藥學上所容許之載體之情形。
本發明之醫藥組合物有用於治療感染症、或癌症之情形。又，本發明之醫藥組合物可應用於對NK細胞具有敏感性之各種疾病之治療及/或預防。疾病例如包括：口腔癌、膽囊癌、膽管癌、肺癌、肝癌、大腸癌、腎癌、膀胱癌、白血病、或由病毒、細菌等引起之感染症，但並不限定於該等。本發明之細胞療法有單獨實施、或與外科療法、化學療法、輻射療法、抗體醫藥品等組合而實施之情形。於使用本發明之醫藥組合物之細胞療法中，NK細胞例如有向靜脈、動脈、皮下、腹腔內等投予之情形。
本發明之醫藥組合物之製造較佳為於符合醫藥品及準藥品之製造管理及品質管理規則之條件(GMP(good manufacturing practice，良好作業規範))及再生醫療等製品之製造管理及品質管理之基準(GCTP(Good Gene, Cellular, and Tissue-based Products Manufacturing Practice，良好之基因、細胞及組織之製品製造實務))下實施。
於本發明中，臍帶血及末梢血之全血之採集、自體血清之製備、源自全血之單核細胞之製備、該單核細胞之培養前後之細胞數之測定、培養前後之單核細胞中之NK細胞、T細胞、造血前驅細胞及此外之細胞類型之構成比率之測定、NK細胞之擴增倍率之算出、及對測定誤差或顯著性之統計分析可使用從業者周知之任意方法而實施。
以下所說明之本發明之實施例僅為例示，並非對本發明之技術範圍加以限定。本發明之技術範圍僅受專利申請範圍之記載所限定。可於不脫離本發明之主旨之條件下進行本發明之變更、例如本發明之構成要件之追加、刪除及置換。 [實施例]
[實施例1] 自健康人志願者實施採血，使用聚蔗糖(GE Healthcare、17144002)分取所獲得之末梢血單核細胞。向所獲得之末梢血單核細胞中添加CD3磁珠※ 1
並使之懸浮，進行4℃、15分鐘培養後，添加分離緩衝液1※ 2
使之充分懸浮，並進行300×g、10分鐘、離心分離。去除上清液，懸浮於1 mL之分離緩衝液中，並添加至預先添加分離緩衝液2 mL而潤濕之LD管柱(Miltenyi Biotec、130-042-901)中，而回收來自LD管柱之溶出液。進而，將分離緩衝液1 mL添加至LD管柱中，並回收溶出液。其後，將管柱洗淨2次，並對所回收之溶液中之細胞數進行計數，而算出總細胞數。進行500×g、5分鐘、離心分離，去除上清液後，以成為5×105
個細胞/mL之方式使之懸浮於NK培養基I※ 3
中。回收一部分細胞作為流式細胞儀測定用(此處，將所回收之細胞表示為「初代NK(Primary NK)」)，並對剩餘之細胞進行培養。培養係使用6孔板(Thermo Fisher Scientific、140675)或T-75燒瓶(Thermo Fisher Scientific、156499)，利用CO2
培養箱進行(37℃、5% CO2
)。於培養第5天及第9天取培養液之一部分對細胞數進行計數，以細胞密度成為5×105
個細胞/mL之方式添加NK培養基I。於第14天進行細胞回收(此處，將所回收之細胞表示為「第14天(Day 14)」)，使用一部分細胞並利用流式細胞儀進行細胞表面抗原之測定。剩餘之細胞係於懸浮於STEM-CELLBANKER GMP grade(TAKARA BIO、CB045)中之後，於-80℃下進行保存。
利用以下之抗體將所回收之細胞加以染色： 以1 μg/mL之濃度對BV421標記抗人類CD56抗體(Biolegend、318328)、PerCP(Peridinin Chlorophyll Protein，多甲藻黃素葉綠素蛋白)/C5.5標記抗人類CD3抗體(Biolegend、300430)、APC(Antigen Presenting Cell，抗原呈現細胞)標記抗人類NKp30抗體(Biolegend、325209)、PE(phycoerythrin，藻紅素)標記抗人類NKp44抗體(Biolegend、325107)、FITC(fluorescein isothiocyanate，螢光異硫氰酸鹽)標記抗人類NKp46抗體(Biolegend、331921)、PE-Cy7標記抗人類NKG2D抗體(Biolegend、320811)、PE-Cy7標記抗人類CD16抗體(Biolegend、302015)、APC標記抗人類CD69抗體(Biolegend、310910)、FITC標記抗人類CD94抗體(Biolegend、305504)、FITC標記抗人類CD14抗體(Biolegend、325604)、PE標記抗人類NKG2C抗體(R&D, FAB138P)、APC標記抗人類NKG2A抗體(Milteni Biotec、130-098-809)、PerCP Cy5.5標記抗人類CD94抗體(Biolegend、305514)、APC標記抗人類CD57抗體(Biolegend、359610)進行4℃、30分鐘染色後，進行離心分離(500×g、5分鐘、4℃)，去除上清液，使之懸浮於PBS(和光純藥工業)中之後，使用流式細胞儀(BD LSRFortessa、BD Bioscience公司)進行測定，並利用FlowJo軟體(TreeStar)進行分析。
※1：CliniMACS CD3、Miltenyi Biotec公司、目錄編號130-017-601(每1×107
個細胞5 μ) ※2：包含0.5%人類AB型血清(將Cosmo Bio、12181301於56℃下進行30分鐘之滅活處理而成者)、2 mM EDTA(Ethylenediamine Tetraacetic Acid，乙二胺四乙酸)(Thermo Fisher Scientific、15575-020)之PBS ※3：添加有5%人類AB型血清(將Cosmo Bio、12181301於56℃下進行30分鐘之滅活處理而成者)之COSMEDIUM 008(Cosmo Bio、COS-008)
將結果示於圖1。第14天之NK細胞呈現強表現NKp46或NKp30、NKG2D等活化型受體之所謂高活化NK細胞之狀態。另一方面，CD16之表現為雙峰性。
[實施例2] 藉由實施例1中所記載之方法進行細胞之製備。回收培養開始時之細胞與培養結束時(培養第14天)之細胞之一部分，並利用流式細胞儀進行細胞表面抗原之測定。 將所回收之約1×105
個細胞以1 μg/mL之濃度對BV421標記抗人類CD56抗體、PerCP/C5.5標記抗人類CD3抗體、PE-Cy7標記抗人類CD16抗體、APC標記抗人類CD69抗體、FITC標記抗人類CD14抗體進行4℃、30分鐘染色後，進行離心分離(500×g、5分鐘、4℃)，去除上清液，並使之懸浮於適量之PBS中之後，使用流式細胞儀(BD LSRFortessa、BD Bioscience公司)進行測定，並利用FlowJo軟體進行分析。將CD3陰性CD56陽性之細胞設為NK細胞，利用CD16與CD56進行展開並分析NK細胞上之CD16之表現。
將結果示於圖2A～C。第14天之NK細胞包含CD56high
/CD16high
NK細胞((i)群)與CD56high
/CD16low
NK細胞((ii)群)(圖2A)，且未觀察到通常被視為第5階段(活化型、或成熟型)之標記物之CD57之表現(圖2B)。可知第14天之NK細胞進而具備NKG2C陽性、NKG2A陰性～低表現性、CD94陽性之特徵(圖2C)。
[實施例3] 將實施例1中所記載之方法改變一部分而進行細胞之製備。具體而言，使用分離緩衝液2※ 4
，並使用NK培養基II※ 5
進行培養。回收培養開始時之細胞與培養結束時(培養第14天)之細胞之一部分，並藉由實施例2中所記載之方法進行測定及分析。
※4：包含0.5% CTSTM
免疫細胞(Immune Cell)SR(Thermo Fisher Scientific、A25961-01、以下設為CTS)、2 mM EDTA之PBS ※5：添加有5%之CTS之COSMEDIUM 008培養基(Cosmo Bio、COS-008)
將結果示於圖3。利用添加有CTS之無血清培養基，可提高(i)群於NK細胞整體中所占之比率。
[實施例4] ≪K562(靶細胞)之製備≫ 利用包含10%FBS(Fetal Bovine Serum，胎牛血清)(Nichirei Bioscience、171012-500ML)及100單位之青黴素、100 μg/mL之鏈黴素(Nacalai Tesque、26253-84)之RPMI1640培養基(和光純藥工業，189-02025)(以下，稱為10%FBS/RPMI1640)以1×106
個細胞/ml之濃度製備K562細胞(人類慢性骨髄性白血病細胞株)。向所製備之K562細胞中以最終濃度成為30 μM之方式添加DiOC18(Sigma、D4292-20MG)，並於37℃下反應10分鐘。離心分離(400×g、5分鐘、室溫)後，去除上清液，添加10%FBS/RPMI1640，並使之懸浮。重複該洗淨步驟3次，最終使用10%FBS/RPMI1640，以成為2×106
個細胞/mL之方式進行製備。
≪NK細胞(效應細胞)之製備≫ 自健康人志願者回收藉由實施例1中所記載之方法所獲得之細胞並洗淨後，利用10%FBS/RPMI1640使之懸浮，並利用相同培養基，以1×106
個細胞/ml之濃度製備。利用PE-Cy7標記抗人類CD16抗體(1 μg/mL)對所製備之細胞懸浮液進行4℃、30分鐘染色後，進行離心分離(500×g、5分鐘、4℃)，並去除上清液。於利用10%FBS/RPMI1640使細胞懸浮後，使用相同培養基，製備為2×107
個細胞/ml之濃度，利用流式細胞儀(Cell Sorter SH800、SONY)進行細胞表面抗原之測定，並確認CD16之表現程度。利用相同細胞分選儀分選CD16high
NK細胞與CD16dim
NK細胞，分別回收至盛滿有7 ml之10%FBS/RPMI1640之15 ml錐形管(conical tube)中。回收後，進行離心分離(500×g、5分鐘、4℃)，去除上清液後，利用10%FBS/RPMI1640使之懸浮，並利用相同培養基，製備為2×106
個細胞/ml之濃度。
≪細胞毒殺活性之測定≫ 亦準備利用10%福馬林將未進行分選之NK細胞與K562細胞之群、CD16high
NK細胞與K562細胞之群、CD16dim
NK細胞與K562細胞之群、僅各NK細胞之計6群、僅作為陰性對照之K562細胞之群、及作為陽性對照之K562細胞加以固定之群。NK細胞與K562細胞係以按細胞比計成為1：1之方式添加至96孔板上進行混合，並於37℃下共培養2小時。此時，首先將K562細胞添加至培養板上，其次以最終濃度成為1 μg/ml之方式添加200 μg/ml之APC標記抗人類CD107a抗體※ 6
(Biolegend、328620)，最後添加各NK細胞。培養後，進行離心分離(500×g、5分鐘、4℃)，去除上清液後，添加利用PBS進行稀釋而成之7-AAD溶液(Beckman Coulter、A07704)，使之懸浮，並於室溫下培養10分鐘。使用流式細胞儀(BD LSR Fortessa、BD Bioscience公司)進行測定，並利用FlowJo軟體進行分析。
細胞毒殺活性係藉由下式進行計算。再者，於以下之實施例中亦同樣地進行計算。 (效應細胞與進行培養之情形時之靶細胞之細胞死亡－自然細胞死亡(陰性對照))/(最大細胞死亡(陽性對照)－自然細胞死亡(陰性對照))×100
※6：CD107a存在於NK細胞內顆粒上，於去顆粒(穿孔素、顆粒酶(granzyme)釋出)時轉移至細胞膜表面上，故而CD107a為陽性間接表示NK攻擊了對象。
≪結果≫ 將結果示於圖4。(i)群、(ii)群之細胞毒殺活性均超過50%。
[實施例5] ≪IMR32細胞(靶細胞)之製備≫ 利用10%FBS/RPMI1640將IMR32細胞(人類MYCN擴增神經胚細胞瘤細胞株)製備為1×106
個細胞/ml之濃度。向所製備之K562細胞中以最終濃度成為30 μM之方式添加DiOC18(Sigma、D4292-20MG)，並於37℃下反應10分鐘。離心分離(400×g、5分鐘、室溫)後，去除上清液，添加10%FBS/RPMI1640，並使之懸浮。重複該洗淨步驟3次，最終使用10%FBS/RPMI1640，製備為2×106
個細胞/mL。
≪NK細胞(效應細胞)之製備≫ 自健康人志願者回收藉由實施例1中所記載之方法所獲得之細胞並洗淨後，利用10%FBS/RPMI1640使之懸浮，並利用相同培養基，製備為1×106
個細胞/ml之濃度。利用PE-Cy7標記抗人類CD16抗體(1 μg/mL)對製備液進行4℃、30分鐘染色，其後進行離心分離(500 g、5分鐘、4℃)，並去除上清液。於利用10%FBS/RPMI1640使細胞懸浮後，利用相同培養基製備為2×107
個細胞/ml之濃度，並利用流式細胞儀(Cell Sorter SH800、SONY)進行細胞表面抗原之測定，而確認CD16之表現程度。利用相同細胞分選儀分選CD16high
NK細胞與CD16dim
NK細胞，分別回收至盛滿有7 ml之10%FBS/RPMI1640之15 ml錐形管中。回收後，進行離心分離(500 g、5分鐘、4℃)，去除上清液後，利用10%FBS/RPMI1640使之懸浮，並利用相同培養基，製備為2×106
個細胞/ml之濃度。
≪細胞毒殺活性之測定≫ 亦準備利用10%福馬林將未進行分選之NK細胞與K562細胞之群、CD16high
NK細胞與K562細胞之群、CD16dim
NK細胞與K562細胞之群、僅各NK細胞之計6群、僅作為陰性對照之K562細胞之群、及作為陽性對照之K562細胞加以固定之群。NK細胞與K562細胞係以按細胞比計成為1：1之方式添加至96孔板上進行混合，並於37℃下共培養2小時。
此時，首先將IMR32細胞添加至培養板上，其次以100 μg/ml添加利用PBS製備之達妥昔單抗(商品名Unituxin、United Therapeutics公司)各1 μl(達妥昔單抗添加群)，其次以最終濃度成為1 μg/ml之方式添加200 μg/ml之APC標記抗人類CD107a抗體，最後添加各NK細胞。共培養後，進行離心分離(500 g、5分鐘、4℃)，去除上清液後，添加利用PBS進行稀釋而成之7-AAD溶液(Beckman Coulter、A07704)，使之懸浮，並於室溫下培養10分鐘。使用流式細胞儀(BD LSR Fortessa、BD Bioscience公司)進行測定，並利用FlowJo軟體進行分析。
≪結果≫ 將結果示於圖5。對於達妥昔單抗添加群觀察到更高之細胞毒殺活性。
[實施例6] ≪細胞之製備≫ 使藉由實施例1之方法而獲得之NK細胞懸浮於包含4 μg/mL之濃度之莫加珠單抗(POTELIGEO(註冊商標)點滴靜脈注射20 mg、Kyowa Hakko Kirin)之NK培養基I中，進行37℃、20分鐘培養。離心分離(500×g、5分鐘、室溫)後，去除上清液，添加10%FBS/RPMI1640並使之懸浮，其後進行離心分離(500×g、5分鐘、室溫)，去除上清液，利用10%FBS/RPMI1640製備為2×106
個細胞/mL，而製成NK+莫加珠單抗(預混)。
向Hut 78細胞(人類T淋巴瘤細胞株)中，以最終濃度成為1 μM之方式添加DiOC18(Sigma、D4292-20MG)，並於37℃下反應10分鐘。離心分離(500×g、5分鐘、室溫)後，去除上清液，添加10%FBS/RPMI1640並使之懸浮。重複該洗淨步驟3次，最終使用10%FBS/RPMI1640，以成為2×106
個細胞/mL之方式進行製備。
≪細胞毒殺活性之測定≫ 準備相對於NK細胞1將Hut 78細胞設為5(細胞數比)之群、於相對於NK細胞1將Hut 78細胞設為5(細胞數比)後以最終濃度成為4 μg/mL之方式添加有莫加珠單抗之群、相對於NK+莫加珠單抗(預混)1將Hut 78細胞設為5(細胞數比)之群之合計3群。以細胞比1：5添加至96孔板上進行混合，並於37℃下共培養2小時。亦準備作為陰性對照之僅Hut 78細胞之群、利用10%福馬林將作為陽性對照之Hut 78固定而成之群。於2小時之共培養後，進行離心分離(500×g、5分鐘、室溫)，去除上清液，以60 μL/孔添加利用PBS稀釋為6倍之7-AAD溶液(Beckman Coulter、A07704)，使之懸浮，並於室溫下培養10分鐘。使用流式細胞儀(BD LSRFortessa、BD Bioscience公司)進行測定，並利用FlowJo軟體進行分析。
≪IMR32細胞之製備、細胞毒殺活性之測定≫ 依照上述Hut 78中之實驗而進行。條件不同之處為所使用之細胞株為IMR32之方面、所使用之抗體為達妥昔單抗之方面、NK細胞與腫瘤細胞之細胞數比為1：10之方面。
≪結果≫ 將結果示於圖6。關於莫加珠單抗，對於NK+莫加珠單抗(預混)群觀察到最高之細胞毒殺活性。多數抗體醫藥係將NK細胞之抗體依賴性細胞毒殺(ADCC)活性作為其作用機理之一，提示預先將NK細胞與抗體醫藥加以混合之有效性。
[實施例7] 於使用STEM-CELLBANKER GMP grade(TAKARA BIO、CB045)將藉由實施例1中所記載之方法所獲得之NK細胞冷凍後，進行解凍並使用NK培養基II於37℃之CO2
培養箱中徹夜進行培養。利用包含1 mM EDTA(Thermo Fisher Scientific、15575-020)之PBS剝離細胞，向圓底之96孔板(IWAKI)中各分注1×105
個，離心分離(500×g、5分鐘、室溫)後，去除上清液，添加100 μL之莫加珠單抗溶液(最終濃度：0 μg/mL、1 μg/mL、10 μg/mL、100 μg/mL、1,000 μg/mL)，使之懸浮，並於室溫下培養1小時。離心分離(500×g、5分鐘、室溫)後，去除上清液，利用300 μL之PBS進行3次洗淨操作(500×g、5分鐘、室溫)。其次，添加染色用之抗體溶液(BV421標記抗人類CD56抗體、PerCP/C5.5標記抗人類CD3抗體、PE-Cy7標記抗人類CD16、PE標記抗人類IgG Fc抗體(SouthernBiotech、2043-09)，使之懸浮，並於4℃下使之反應30分鐘。離心分離(500×g、5分鐘、室溫)後，去除上清液，添加100 μL之PBS，使之懸浮，使用流式細胞儀(BD LSRFortessa、BD Bioscience公司)進行測定，並利用FlowJo軟體進行分析。
將結果示於圖7。確認到莫加珠單抗與NK細胞結合。不僅成功地使莫加珠單抗與(i)群結合，於莫加珠單抗為高濃度之條件下亦成功地使之與(ii)群結合。
圖1係培養第14天之NK細胞中之主要細胞表面標記物之表現。CD16之表現為雙峰性。 圖2A為第14天之NK細胞由CD56與CD16賦予特徵之情況。包含第14天之NK細胞CD56high
/CD16high
NK細胞((i)群)與CD56high
/CD16low
NK細胞((ii)群)。 圖2B為第14天之NK細胞之特徵。通常未觀察到被認為第5階段(Stage5)(活化型、或成熟型)之標記物之CD57之表現。 圖2C為第14天之NK細胞之特徵。為NKG2C陽性、NKG2A陰性～低表現性、CD94陽性。 圖3係使用無血清、CTS添加培養基進行培養而獲得之第14天之NK細胞。可提高(i)群於NK細胞整體中所占之比率。 圖4為(i)群及(ii)群之細胞毒殺活性。(i)群、(ii)群之細胞毒殺活性均超過50%。 圖5為(i)群及(ii)群之細胞毒殺活性。對於達妥昔單抗(Dinutuximab)添加群觀察到更高之細胞毒殺活性。 圖6為抗體醫藥+NK細胞之效果。關於莫加珠單抗(Mogamulizumab)，對於預混群(premix群)觀察到最高之細胞毒殺活性。 圖7為莫加珠單抗與所培養之NK細胞之分析結果。確認到莫加珠單抗與NK細胞發生結合。不僅成功地使莫加珠單抗與(i)群結合，於莫加珠單抗為高濃度之條件下亦成功地使之與(ii)群結合。
Claims (12)
- 一種NK細胞或其群，其具備下述(1)及(2)之特徵： (1)為CD16陽性、CD56高表現性、且CD57陰性； (2)為NKG2C陽性、NKG2A陰性～低表現性、及CD94陽性。
- 如請求項1之群，其包含CD16高表現性之NK細胞之群、及CD16低表現性之NK細胞之群。
- 如請求項1之NK細胞或其群，其為CD16高表現性。
- 如請求項1之NK細胞或其群，其為CD16低表現性。
- 如請求項1至4中任一項之NK細胞或其群，其進而具備下述(3)之特徵： (3)於將該NK細胞作為效應細胞(E)，將K562細胞作為靶細胞(T)，並以混合比(E：T)1：1進行共培養之情形時之細胞毒殺活性為50%以上。
- 一種如請求項1至5中任一項之NK細胞或其群之製備方法，其包括下述步驟： 利用包含IL-2之培養基、或無血清培養基培養初代NK細胞之群。
- 如請求項6之製備方法，其中初代NK細胞之群係經過去除CD3陽性細胞之步驟者。
- 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至5中任一項之NK細胞之群、及作為醫藥而容許之添加物。
- 一種醫藥組合物，其包含NK細胞之群、及治療上有效量之抗體。
- 如請求項9之醫藥組合物，其中NK細胞之群係如請求項1至5中任一項之NK細胞之群。
- 如請求項9或10之醫藥組合物，其中抗體係能夠誘發抗體依賴性細胞毒殺(ADCC，Antibody-Dependent-Cellular-Cytotoxicity)者。
- 如請求項9至11中任一項之醫藥組合物，其中抗體之至少一部分與NK細胞結合。
Applications Claiming Priority (2)
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