TW201900671A - 使用可溶性cd24進行神經保護及髓鞘再生的方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於組合物以及其用於保護及維持寡樹突神經膠質細胞之方法中以及治療脫髓鞘病症的用途。

Description

使用可溶性CD24進行神經保護及髓鞘再生的方法
本發明係關於組合物以及其用於保護及維持寡樹突神經膠質細胞之方法中以及治療脫髓鞘病症的用途。
髓鞘為層狀富脂質結構，其圍繞軸突以沿著其介導健康的信號傳導且向其提供營養支持。在中樞神經系統（CNS）中，髓鞘係由寡樹突神經膠質細胞形成。髓鞘為脫髓鞘疾病之標靶，包括神經免疫病症，諸如多發性硬化症（MS）。髓鞘再生為共濟寡樹突神經膠質細胞前驅細胞（OPCs）形成寡樹突神經膠質細胞（能夠在中樞神經系統（CNS）中之脫髓鞘軸突上產生新髓鞘的細胞）的過程。作為對髓鞘變性的反應，多潛能實質祖細胞（稱為寡樹突神經膠質細胞祖細胞（OPCs））被活化且募集至損傷區域。此為體內天然調控過程且在健康CNS中往往會極有效。但在患有神經免疫病症之人類中，髓鞘再生變得愈來愈不完全，以致軸突持久性地脫髓鞘且容易變性，且在許多患者中最終失敗，導致更多進行性疾病形式。
在諸如MS之疾病中，髓鞘再生失敗之原因仍未完全瞭解，且估計很複雜。若干研究已證明，一部分慢性脫髓鞘MS病灶含有未能分化成髓鞘再生性寡樹突神經膠質細胞的OPCs。寡樹突神經膠質細胞藉由髓鞘再生依賴性機制與非依賴性機制而在神經保護中起關鍵作用且賦予針對涉及中樞神經系統之發炎與變性疾病的保護作用，所述疾病包括MS、阿茲海默氏病（Alzheimer's diseases）及潛在巴金森氏病（Parkinson's diseases）（1-4）。
因此，醫學上存在著很大的未滿足需求是藉由促進寡樹突神經膠質細胞之保護及維持及促進髓鞘再生活性來治療脫髓鞘病症。
本文提供維持寡樹突神經膠質細胞、促進髓鞘形成及治療脫髓鞘病症（包括涉及中樞神經系統的發炎及變性疾病）的方法。所述方法可以包含向有需要的個體投與CD24蛋白質。所述脫髓鞘病症可為阿茲海默氏病（Alzheimer's disease）、帕金森氏病（Parkinson's disease）、多發性硬化症、急性播散性腦脊髓炎、視神經脊髓炎譜系病症、視神經炎、橫貫性脊髓炎或急性弛緩性脊髓炎。CD24蛋白質可以維持寡樹突神經膠質細胞。所述方法可以進一步包含投與促進寡樹突神經膠質細胞轉化或促進寡樹突神經膠質細胞產生髓鞘的另一種藥劑。
CD24蛋白質可以包含成熟人類CD24或其變異體。所述成熟人類CD24可以包含SEQ ID NO: 1或2中所闡述之胺基酸序列。CD24蛋白質可以包含人類CD24之任何或所有胞外域。CD24蛋白質之序列可以包含CD24之信號肽序列，所述信號肽序列可以包含SEQ ID NO: 4中所闡述之胺基酸序列。信號肽序列可以允許自表現所述蛋白質之細胞分泌。信號肽序列亦可為另一跨膜或所分泌蛋白質上所發現的序列，或此項技術中已知之現有信號肽經修飾的序列。CD24蛋白質可具有可溶性。CD24蛋白質可經糖基化。CD24蛋白質可以使用真核蛋白質表現系統產生，所述表現系統可以包含中國倉鼠卵巢細胞系中所含的載體或複製缺乏型逆轉錄病毒載體。複製缺乏型逆轉錄病毒載體可以穩定地整合至真核細胞之基因組中。
CD24蛋白質可以包含蛋白質標籤，所述蛋白質標籤可以在CD24蛋白質之N或C末端融合。所述蛋白質可以包含哺乳動物免疫球蛋白（Ig）之一部分，所述部分可為人類Ig蛋白質之Fc區。人類Ig蛋白質可以包含人類Ig蛋白質之鉸鏈區及CH2及CH3域，且人類Ig蛋白質可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgA。Fc區亦可包含IgM之鉸鏈區及CH2、CH3及CH4域。CD24蛋白質可以包含SEQ ID NO: 5、6、8、9、11或12中所闡述之胺基酸序列。
本發明人已驚人地發現，CD24之可溶形式對於維持寡樹突神經膠質細胞及治療與脫髓鞘相關之神經免疫病症是非常有效的。所述作用可經由損傷相關分子模式介導。模式識別涉及由病原體相關分子模式與組織損傷相關分子模式（分別稱為PAMPs及DAMPs）觸發的發炎反應。不受理論束縛，宿主對DAMPs之反應加劇可以在發炎及自體免疫疾病之發病機制中起部分作用。已發現DAMPs在動物模型中促進發炎細胞介素及自體免疫疾病產生，且因此發現DAMPs抑制劑（諸如HMGB1及HSP90）改善類風濕性關節炎（RA）（4-6）。TLRs、RAGE-R、DNGR（由Clec9A編碼）及巨噬細胞誘導C型凝集素（Mincle）已表明為負責介導由多種DAMPs起始之發炎的受體（2，7-14）。
本發明人已表明CD24-唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G相互作用使針對DAMPs的先天免疫力有別於針對PAMPs的先天免疫力（15，16）。唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素蛋白質為識別多種含唾液酸結構的膜相關免疫球蛋白（Ig）超家族成員。大部分唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素具有細胞內免疫酪胺酸抑制基元（ITIM），所述基元與SHP-1、SHP-2及Cbl-b結合以控制發炎反應之關鍵調節因子。CD24經鑑別為唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素（小鼠中之唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G及人體中之唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素10）的第一天然配位體（15）。唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G與唾液酸化CD24發生相互作用，以經由SHP-1/2信號傳導機制抑制TLR介導針對DAMPs（諸如HMGB1）之宿主反應（15），所述信號傳導機制為SLE發病機制之關鍵（2）。唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G亦與Cbl結合而觸發RIG-I降解，從而抑制I型干擾素反應（17），人類狼瘡發病機制中之一種關鍵因素。
另外，本發明人已證明CD24負向調節針對細胞DAMPs的宿主反應，所述細胞DAMPs作為組織或器官損傷的結果而釋放，且至少兩種重疊機制可以解釋此活性。首先，CD24結合至若干DAMPs，包括HSP70、HSP90、HMGB1及核仁素（nucleolin），且抑制針對此等DAMPs之宿主反應。為此，假定CD24可以截留發炎刺激以防止與其受體TLR或RAGE發生相互作用。其次，CD24經由與其受體唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G的相互作用向針對組織損傷之宿主反應提供強大的負向調節。為獲得此活性，CD24可以結合唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G且經由唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G刺激信號傳導，其中唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G結合之SHP1觸發負向調節。兩種機制均可以協同作用，因為任一基因發生靶向突變之小鼠產生強得多的發炎反應。實際上，由CD24-/-或唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G-/-小鼠之骨髓培養而得的DC當用HMGB1、HSP70或HSP90刺激時產生更高量的發炎細胞介素。據本發明人所知，CD24為能夠制止DAMPs觸發發炎的唯一抑制性DAMP受體，且特異性靶向針對組織損傷之宿主發炎反應的藥物目前不可獲得。另外，外源可溶性CD24蛋白質在類風濕性關節炎、多發性硬化症及移植物抗宿主疾病之小鼠模型中緩解DAMP介導之自體免疫疾病。
人類CD24為GPI錨定之小分子，其由CD24基因中240個鹼基對之開放閱讀框架編碼（28）。在80個胺基酸中，最前面的26個構成信號肽，而最後23個充當裂解信號以實現GPI尾連接。因此，成熟人類CD24分子僅具有31個胺基酸。31個胺基酸之一具有人類群體間之多態性。開放閱讀框架之核苷酸170處發生的C向T轉換引起丙胺酸（a）被纈胺酸（v）取代。由於此殘基位於距裂解位點最近之N末端，且由於置換無保守性，因此此兩種對偶基因可以不同效率表現於細胞表面上。的確，cDNA轉染研究證明，CD24v 對偶基因更有效率地表現於細胞表面上（28）。據此，CD24v/v PBL表現更高量的CD24，尤其在T細胞上。
本發明人已發現，Cd24或唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G之靶向突變保護小鼠以防雙環己酮草醯二腙誘導之寡樹突神經膠質細胞損失，所述Cd24或唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G形成選擇性地調節針對DAMPs之先天發炎反應的軸。本發明人已進一步發現，全身投與已知可刺激唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G信號傳導且抑制活體內發炎反應的CD24蛋白質（CD24Fc）保護寡樹突神經膠質細胞以防長期暴露於雙環己酮草醯二腙。因此，針對細胞損傷之宿主反應主動地參與寡樹突神經膠質細胞損失，且為在病理性條件下維持寡樹突神經膠質細胞提供新的途徑。
因此，本文所述方法可以用於提供神經保護作用以便緩解、最小化或治療涉及中樞神經系統的發炎及變性疾病。特定而言，本文所述方法可以用於治療神經免疫病症，包括多發性硬化症（MS）、急性播散性腦脊髓炎（ADEM）、視神經脊髓炎譜系病症（NMOSD）、視神經炎（ON），及橫貫性脊髓炎（TM），其可為急性弛緩性脊髓炎（AFM）。1. 定義 .
本文所用之術語僅出於描述特定實施例之目的且不希望具有限制性。除非上下文另有明確規定，否則如說明書及隨附申請專利範圍中所用，單數形式「一（a/an）」及「所述（the）」包括複數個指示物。
對於本文中數值範圍之敍述而言，明確涵蓋其間每個具有相同精確度的中間數值。舉例而言，範圍6-9除涵蓋6及9之外亦涵蓋數值7及8，且範圍6.0-7.0明確涵蓋數值6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9及7.0。
「肽」或「多肽」為連接之胺基酸序列且可為天然的、合成的，或天然與合成之修飾或組合。
「基本上一致」可以意謂第一與第二胺基酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300胺基酸之區域上至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。
當提及防止動物患病時，「治療（Treatment或treating）」意謂預防、抑制、抑止或完全消除疾病。預防疾病涉及在疾病發作之前向動物投與本發明組合物。抑制疾病涉及在疾病誘發之後，但在其臨床顯現之前，向動物投與本發明組合物。抑制疾病涉及在疾病臨床顯現之前向動物投與本發明組合物。
「變異體」可以意謂胺基酸序列因胺基酸之插入、缺失或保守性取代而不同、但保持至少一種生物活性的肽或多肽。「生物活性」的代表性實例包括結合至鐸樣受體（toll-like receptor）及被特異性抗體結合的能力。變異體亦可意謂胺基酸序列與保持至少一種生物活性之參考蛋白質之胺基酸序列基本上一致的蛋白質。胺基酸保守取代（亦即，胺基酸被具有類似特性（例如帶電區域之親水性程度及分佈）之不同胺基酸置換）在此項技術中公認為典型地涉及微小變化。如此項技術中所理解，此等微小變化能部分地藉由考慮胺基酸之親水指數而鑑別。Kyte等人, 《分子生物學雜誌（J. Mol. Biol.）》 157:105-132 (1982)。胺基酸之親水指數係基於其疏水性及電荷之考慮。此項技術中已知具有類似親水指數之胺基酸可經取代且仍保持蛋白質功能。在一個態樣中，親水指數為±2之胺基酸經取代。胺基酸之親水性亦可用於展現使蛋白質保持生物功能之取代。在肽之情形下考慮胺基酸之親水性允許計算彼肽之最大局域平均親水性，此為已報導與抗原性及免疫原性充分關聯的一種適用量度。美國專利第4,554,101號，其以引用的方式完全併入本文中。如此項技術中所理解，具有相似親水值之胺基酸的取代可產生保持生物活性（例如免疫原性）之肽。可以使用親水值在彼此±2內的胺基酸進行取代。胺基酸之疏水指數與親水值均受彼胺基酸之特定側鏈影響。根據彼觀測結果，應理解，與生物功能相容之胺基酸取代取決於胺基酸之相對相似度，特定而言，彼等胺基酸之側鏈的相對相似度，如疏水性、親水性、電荷、尺寸及其他特性所展現。2. CD24
本文中提供一種CD24蛋白質，其可以包含成熟CD24或其變異體。成熟CD24對應於CD24之胞外域（ECD）。成熟CD24可以來自人類或另一種哺乳動物。如上文所述，成熟人類CD24蛋白質具有31個胺基酸長度且在其C末端通常具有可變的丙胺酸（A）或纈胺酸（V）殘基： SETTTGTSSNSSQSTSNSGLAPNPTNATTK(V/A)（SEQ ID NO: 1）
C末端纈胺酸或丙胺酸可能具有免疫原性且可以自CD24蛋白質省去，從而可以降低其免疫原性。因此，CD24蛋白質可以包含缺乏C末端胺基酸之人類CD24胺基酸序列： SETTTGTSSNSSQSTSNSGLAPNPTNATTK（SEQ ID NO: 2）
儘管來自小鼠及人類之成熟CD24蛋白質之胺基酸序列存在相當大的序列變化，但其為功能等效物，因為人類CD24Fc已表明在小鼠中具有活性。人類CD24 ECD之胺基酸序列展示與小鼠蛋白質存在一些序列保守性（39%一致性；基因庫寄存編號NP_033976）。然而，不令人驚訝的是，由於CD24 ECD長度僅為27-31個胺基酸（視物種而定），因此一致性百分比不會更高，並且結合至其一些受體（諸如唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素10/G）受到其唾液酸及/或醣蛋白之半乳糖糖類的介導。人類唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-10（基因庫寄存編號AF310233）之胞外域與其鼠類同源物唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-G（基因庫寄存編號NP_766488）受體蛋白質之間的胺基酸序列一致性為63%（圖2）。由於小鼠與人類CD24之間的序列保守主要存在於C末端及大量糖基化位點，因此使用CD24蛋白質時可以耐受成熟CD24蛋白質之顯著變異，尤其是彼等變異不影響C末端之保守殘基或不影響小鼠或人類CD24之糖基化位點。因此，CD24蛋白質可以包含成熟鼠類CD24之胺基酸序列： NQTSVAPFPGNQNISASPNPTNATTRG（SEQ ID NO: 3）。
人類CD24 ECD之胺基酸序列展示與食蟹獼猴蛋白質存在之序列保守性（52%一致性；UniProt寄存編號UniProtKB-I7GKK1）大於小鼠。同樣，鑒於以下情形，此不會令人驚訝：由於ECD在此等物種中僅具有29-31個胺基酸長度，因此一致性百分比不會更高，且糖殘基之作用為結合至其受體。獼猴唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-10受體之胺基酸序列尚未測定，但人類與恆河猴唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-10（基因庫寄存編號XP_001116352）蛋白質之間的胺基酸序列一致性為89%。因此，CD24蛋白質亦可包含成熟獼猴（或恆河猴）CD24之胺基酸序列： TVTTSAPLSSNSPQNTSTTPNPANTTTKA（SEQ ID NO: 10）
CD24蛋白質可具有可溶性。CD24蛋白質可以進一步包含N末端信號肽，以允許自表現所述蛋白質之細胞分泌。信號肽序列可以包含胺基酸序列MGRAMVARLGLGLLLLALLLPTQIYS（SEQ ID NO: 4）。或者，信號序列可為其他跨膜或所分泌蛋白質上所發現的彼等信號序列或此項技術中已知之現有信號肽經修飾的彼等信號序列中之任一者。a. 融合物
CD24蛋白質可以在其N或C末端與蛋白質標籤融合，所述蛋白質標籤可以包含可來自人類或小鼠或另一物種之哺乳動物Ig蛋白質的一部分。所述部分可以包含Ig蛋白質之Fc區。Fc區可以包含Ig蛋白質之鉸鏈區、CH2、CH3及CH4域中的至少一者。Ig蛋白質可為人類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgA，且Fc區可以包含Ig之鉸鏈區及CH2及CH3域。Fc區可以包含人類免疫球蛋白G1（IgG1）同型（SEQ ID NO: 7. Ig蛋白質亦可為IgM，且Fc區可以包含IgM之鉸鏈區及CH2、CH3及CH4域。蛋白質標籤可為有助於蛋白質純化的親和標籤，及/或增強功能性蛋白溶解性及回收率的溶解性增強標籤。蛋白質標籤亦可提高CD24蛋白質之價數。蛋白質標籤亦可包含GST、His、FLAG、Myc、MBP、NusA、硫氧還蛋白（TRX）、小泛素樣調節劑（SUMO）、泛素（Ub）、白蛋白或駱駝科Ig。用於製備融合蛋白且純化融合蛋白的方法在此項技術中已熟知。
根據臨床前研究，為了構築實例中所鑑別的融合蛋白CD24Fc，已使用30個胺基酸之原生CD24分子的截斷形式，其缺乏位於GPI信號裂解位點之前的最後多態胺基酸（亦即，具有SEQ ID NO: 2的成熟CD24蛋白質）。使成熟人類CD24序列融合至人類IgG1 Fc域（SEQ ID NO: 7）。全長CD24Fc融合蛋白提供於SEQ ID NO: 5（圖1），且自所述細胞分泌之CD24Fc融合蛋白的經處理形式（亦即，缺乏分裂的信號序列）提供於SEQ ID NO: 6。成熟CD24之經處理多態變異體（亦即，具有SEQ ID NO: 1之成熟CD24蛋白質） 與IgG1 Fc的融合物可以包含SEQ ID NO: 11或12。b. 產生
CD24蛋白質可以在很大程度上糖基化，且可以涉及CD24功能，諸如免疫細胞之共刺激及與損傷相關分子模式分子（DAMP）之相互作用。CD24蛋白質可使用真核表現系統製備。表現系統可能需要載體在哺乳動物細胞（諸如中國倉鼠卵巢（CHO）細胞）中表現。所述系統亦可為病毒載體，諸如可以用於感染真核細胞的複製缺乏型逆轉錄病毒載體。CD24蛋白質亦可由穩定細胞系產生，所述細胞系經由已整合至細胞基因組中之載體或載體的一部分表現CD24蛋白質。穩定細胞系可以經由所整合之複製缺乏型逆轉錄病毒載體表現CD24蛋白質。表現系統可為GPEx™。c. 醫藥組合物
CD24蛋白質可以包含於醫藥組合物中，所述醫藥組合物可以包含醫藥學上可接受之量的CD24蛋白質。醫藥組合物可以包含醫藥學上可接受之載劑。醫藥組合物可以包含使CD24蛋白質在延長的期間保持穩定的溶劑。所述溶劑可為PBS，PBS可以使CD24蛋白質在-20℃（-15至-25℃）保持穩定至少66個月。溶劑能夠容納CD24蛋白質與另一種藥物之組合。
醫藥組合物可以經調配用於非經腸投藥，包括（但不限於）注射或連續輸注。注射用的調配物可呈油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液或乳液形式，且可以含有包括（但不限於）懸浮劑、穩定劑及分散劑之調配劑。所述組合物亦可以粉末形式提供，以便用包括（但不限於）無菌無熱原質水的適合媒劑復原。
醫藥組合物亦可調配為儲槽式製劑，其可以藉由植入或藉由肌肉內注射投與。所述組合物可以用適合的聚合物或疏水性物質（例如存在於可接受之油中的乳液）、離子交換樹脂或微溶性衍生物（例如微溶性鹽）調配。皮下注射用的調配物對於如狼瘡之適應症及其相關表現及併發症可為特別相關的。d. 劑量
CD24蛋白質劑量最終可以經由確定具有可接受之毒性及臨床功效之劑量的臨床試驗來確定。初始臨床劑量可以經由嚙齒動物及非人類靈長類動物的藥物動力學及毒性研究來估算。CD24蛋白質之劑量可為0.01 mg/kg至1000 mg/kg，且可為1至500 mg/kg，此取決於所期望的寡樹突神經膠質細胞維持程度或所治療之神經免疫病症及投藥途徑。CD24蛋白質可藉由靜脈內輸注或皮下、壁內（亦即，空腔或器官之壁內）或腹膜內注射投與，且劑量可為10-1000 mg、10-500 mg、10-240 mg、10-120 mg，或10、30、60、120或240 mg，其中個體為人類。3. 治療方法
本文中提供一種藉由向有需要的個體投與本文所述之CD24蛋白質來維持寡樹突神經膠質細胞的方法。本文中進一步提供一種藉由向有需要的個體投與所述CD24蛋白質來治療神經免疫病症之方法，所述神經免疫病症可為脫髓鞘病症。所述CD24蛋白質可投與患有或處於出現神經免疫病症或脫髓鞘病症之風險中的個體。可以藉由增強或改善寡樹突神經膠質細胞髓鞘再生活性來維持個體之中樞神經系統（CNS）中的寡樹突神經膠質細胞。
本文亦提供一種藉由向有需要的個體投與所述CD24蛋白質而向個體提供神經保護作用的方法。CD24蛋白質可以向CNS內的細胞提供神經保護作用。神經保護作用可以緩解、最小化或治療涉及中樞神經系統之發炎或變性疾病。所述發炎或變性疾病可為多發性硬化症、阿茲海默氏病或帕金森氏病。
神經免疫病症可為MS、急性播散性腦脊髓炎（ADEM）、視神經脊髓炎譜系病症（NMOSD）、視神經炎（ON），或橫貫性脊髓炎（TM），其可為急性弛緩性脊髓炎（AFM）。所述CD24蛋白質亦可用以緩解、減輕或治療神經免疫病症。a. 投藥
醫藥組合物之投藥途徑可為非經腸。非經腸投藥包括（但不限於）靜脈內、動脈內、腹膜內、皮下、肌肉內、鞘內、關節內及直接注射。醫藥組合物可以投與人類患者、貓、犬、大型動物或禽類。所述組合物可以每天投與1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次。b. 組合療法
本文所述之CD24蛋白質可以與用於促進髓鞘再生或促進寡樹突神經膠質細胞前驅細胞轉化成寡樹突神經膠質細胞的另一療法組合。此類療法之實例包括抗Lingo-1、NDC-1308、抗蝶素B3（anti-EphrinB3）、氯馬斯汀反丁烯二酸鹽（clemastine fumarate）、氟沙胺（fluorosamine）及芬戈莫德（fingolimod）。LINGO-1為一種由CNS產生的蛋白質，其防止不成熟細胞變成寡樹突神經膠質細胞，且抗Lingo（奧皮魯單抗（opicinumab））能阻斷LINGO-1作用，從而使此等細胞成熟變成寡樹突神經膠質細胞。NDC-1308經設計可修復脫髓鞘神經纖維之髓鞘且為治癒運動神經元損傷的特定標靶。蝶素B3為一種膜結合之信號傳導蛋白質，其阻斷MS中之受損神經元之髓鞘再生，且因此設計抗蝶素來逆轉此阻斷。發現氟沙胺係藉由阻止硫酸軟骨素蛋白聚醣合成及藉由促進寡樹突神經膠質細胞功能來增強小鼠的髓鞘再生。類似地，芬戈莫德（GILENYA），一種獲准供復發多發性硬化症患者預防神經炎的藥物，亦可藉由直接增強神經再生及以部分獨立於其消炎特性的方式增強髓鞘形成而有助於此等患者。
CD24蛋白質可以與其他療法同時或有節奏地投與。如本文所用，術語「同時」意謂CD24蛋白質與另一療法在彼此48小時內投與，較佳為24小時，更佳為12小時，然而更佳為6小時，且最佳為3小時或小於3小時。如本文所用，術語「有節奏地」意謂所述藥劑與另一療法在不同時間且以特定頻率（相對於重複投藥）投與。
CD24蛋白質可以在另一種療法之前的任何時點投與，包括約120小時、118小時、116小時、114小時、112小時、110小時、108小時、106小時、104小時、102小時、100小時、98小時、96小時、94小時、92小時、90小時、88小時、86小時、84小時、82小時、80小時、78小時、76小時、74小時、72小時、70小時、68小時、66小時、64小時、62小時、60小時、58小時、56小時、54小時、52小時、50小時、48小時、46小時、44小時、42小時、40小時、38小時、36小時、34小時、32小時、30小時、28小時、26小時、24小時、22小時、20小時、18小時、16小時、14小時、12小時、10小時、8小時、6小時、4小時、3小時、2小時、1小時、55分鐘、50分鐘、45分鐘、40分鐘、35分鐘、30分鐘、25分鐘、20分鐘、15分鐘、10分鐘、9分鐘、8分鐘、7分鐘、6分鐘、5分鐘、4分鐘、3分鐘、2分鐘及1分鐘。CD24蛋白質可以在CD24蛋白質之第二療法之前的任何時點投與，包括約120小時、118小時、116小時、114小時、112小時、110小時、108小時、106小時、104小時、102小時、100小時、98小時、96小時、94小時、92小時、90小時、88小時、86小時、84小時、82小時、80小時、78小時、76小時、74小時、72小時、70小時、68小時、66小時、64小時、62小時、60小時、58小時、56小時、54小時、52小時、50小時、48小時、46小時、44小時、42小時、40小時、38小時、36小時、34小時、32小時、30小時、28小時、26小時、24小時、22小時、20小時、18小時、16小時、14小時、12小時、10小時、8小時、6小時、4小時、3小時、2小時、1小時、55分鐘、50分鐘、45分鐘、40分鐘、35分鐘、30分鐘、25分鐘、20分鐘、15分鐘、10分鐘、9分鐘、8分鐘、7分鐘、6分鐘、5分鐘、4分鐘、3分鐘、2分鐘及1分鐘。
CD24蛋白質可以在另一種療法之後的任何時點投與，包括約1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、6分鐘、7分鐘、8分鐘、9分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、25分鐘、30分鐘、35分鐘、40分鐘、45分鐘、50分鐘、55分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、6小時、8小時、10小時、12小時、14小時、16小時、18小時、20小時、22小時、24小時、26小時、28小時、30小時、32小時、34小時、36小時、38小時、40小時、42小時、44小時、46小時、48小時、50小時、52小時、54小時、56小時、58小時、60小時、62小時、64小時、66小時、68小時、70小時、72小時、74小時、76小時、78小時、80小時、82小時、84小時、86小時、88小時、90小時、92小時、94小時、96小時、98小時、100小時、102小時、104小時、106小時、108小時、110小時、112小時、114小時、116小時、118小時及120小時。CD24蛋白質可以在先前CD24療法之後的任何時點投與，包括約120小時、118小時、116小時、114小時、112小時、110小時、108小時、106小時、104小時、102小時、100小時、98小時、96小時、94小時、92小時、90小時、88小時、86小時、84小時、82小時、80小時、78小時、76小時、74小時、72小時、70小時、68小時、66小時、64小時、62小時、60小時、58小時、56小時、54小時、52小時、50小時、48小時、46小時、44小時、42小時、40小時、38小時、36小時、34小時、32小時、30小時、28小時、26小時、24小時、22小時、20小時、18小時、16小時、14小時、12小時、10小時、8小時、6小時、4小時、3小時、2小時、1小時、55分鐘、50分鐘、45分鐘、40分鐘、35分鐘、30分鐘、25分鐘、20分鐘、15分鐘、10分鐘、9分鐘、8分鐘、7分鐘、6分鐘、5分鐘、4分鐘、3分鐘、2分鐘及1分鐘。實例 1 CD24 在小鼠中的藥物動力學
將1 mg CD24Fc（CD24Fc）注射至未處理C57BL/6小鼠中且在不同時間點（5分鐘、1小時、4小時、24小時、48小時、7天、14天及21天）收集3隻小鼠在每個時間點的血液樣品。將血清1:100稀釋且使用夾心ELISA、使用純化抗人類CD24（3.3 μg/ml）作為捕獲抗體及過氧化酶結合之山羊抗人類IgG Fc（5 μg/ml）作為偵測抗體來偵測CD24Fc含量。如圖3A中所示，CD24Fc之衰減曲線揭露蛋白質出現典型雙相衰減。第一生物分佈相具有12.4小時之半衰期。第二相依循自中樞隔室發生一級消除之模型。第二相之半衰期為9.54天，其類似於活體內抗體半衰期。此等資料表明融合蛋白在血流中非常穩定。在皮下注射融合蛋白之另一研究中，觀測到幾乎相同之9.52天半衰期（3B）。更重要的是，雖然CD24Fc在血液中耗費約48小時達到峰值含量，但如藉由AUC所量測，任一注射途徑所引起之融合蛋白在血液中的總量基本上相同。因此，自治療視角看，不同的注射途徑不應影響藥物之治療效果。此觀察結果大大簡化了用於靈長類動物毒性及臨床試驗之實驗設計。實例 2 CD24- 唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素 10 在針對組織損傷的宿主反應中相互作用
近二十年前，Matzinger提出什麼通俗地稱為危險理論。本質上，她辯稱免疫系統在其感測到宿主存在危險時開啟。雖然危險性質不能及時明確界定，但已確定壞死與細胞內組分（諸如HMGB1及熱休克蛋白質，稱為DAMP，即危險相關分子模式）之釋放相關。發現DAMP促進發炎細胞介素產生及自體免疫疾病。在動物模型中，發現HMGB1及HSP90之抑制劑改善RA。DAMP之參與提高了可以探究針對DAMP之宿主反應之負向調節用於RA療法的前景。
使用乙醯胺苯酚誘發之肝臟壞死及確保發炎，觀測到CD24經由與唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G相互作用向針對組織損傷之宿主反應提供強大的負向調節。CD24為GPI錨定分子，其廣泛地表現於造血細胞及其他組織幹細胞中。對人類之多種自體免疫疾病（包括多發性硬化症、全身紅斑狼瘡、RA及巨細胞關節炎）進行的遺傳分析表明，CD24多態性與自體免疫疾病風險之間存在顯著的關聯。唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G為I-凝集素家族成員，此根據其識別含唾液酸結構之能力界定。唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G識別CD24上的含唾液酸結構且負向調節樹突狀細胞產生發炎細胞介素。人類唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素10及小鼠唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G就其與CD24相互作用的能力而言，在功能上為等效的。然而，不清楚小鼠與人類同源物之間是否存在一對一相關性。雖然機制仍待充分闡明，但唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集G結合的SHP1可能涉及負向調節。此等資料產生了一種新模型，其中CD24-唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G/10相互作用可以在區分病原體相關分子模式（PAMP）與DAMP方面起關鍵作用（圖4）。
至少兩種重疊機制可以解釋CD24之功能。首先，藉由結合至多種DAMP，CD24可以截留發炎刺激以防止其與TLR或RAGE發生相互作用。此觀點受到如下觀測結果的支持：CD24與若干DAMP分子（包括HSP70、90、HMGB1及核仁素）結合。其次，或許在與DAMP結合之後，CD24可以刺激唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G之信號傳導。兩種機制均可以協同作用，因為任一基因發生靶向突變之小鼠產生強得多的發炎反應。實際上，由CD24-/-或唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G-/-小鼠之骨髓培養而得的DC當用HMGB1、HSP70或HSP90刺激時產生高得多的發炎細胞介素。相比之下，發現在其針對PAMP（諸如LPS及PolyI:C）之反應方面無效果。此等資料不僅提供先天免疫系統區分病原體與組織損傷的機制，而且表明CD24及唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G為與組織損傷相關之疾病的潛在治療標靶。實例 3 CD24Fc 與髓鞘相關醣蛋白（ MAG ）在試管內結合
髓鞘相關醣蛋白（MAG），亦稱為唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-4，為唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素家族成員，其識別含唾液酸結構且在神經元軸突上表現且充當軸突過度生長及神經元再生的負調節劑。MAG蛋白質在小鼠與人類之間具保守性，從而允許在小鼠模型中測試CD24Fc。為了證實CD24Fc結合至MAG，使用重組MAG-Fc融合蛋白（Sigma產品編號M 5063），其包含藉助於多肽連接子與人類IgG1之羧基末端Fc區融合的大鼠MAG胞外域。人類MAG（基因庫寄存編號NP_002352）與大鼠MAG（基因庫寄存編號NP_058886）之胞外域96%一致。
CD24Fc與MAG之相互作用係藉由Biacore表面電漿子共振（SPR）分析加以偵測。簡言之，CD24Fc與人類IgG Fc對照物均經生物素標記且固著於抗生蛋白鏈菌素預固著之感測晶片上。製備感測晶片表面之後，將不同濃度（1、6及24 µM）之10 µl MAG-Fc依序注射至流動通道中。每次注射之後，藉由用HBS溶離劑洗滌來進行10分鐘解離。MAG-Fc結合至感測器表面上所固著之CD24Fc或人類IgG Fc產生了與所結合質量成比例的反應。所述反應作為共振單位（RU）量測，其反映了不同濃度之MAG-Fc注射之後所記錄的信號變化。’
反應單位相對於時間之即時曲線圖證明，與人類IgG Fc相比，所述CD24Fc對MAG-Fc具有更高結合。特異性結合係以劑量依賴性方式呈現（圖5）。因此，在軸突生長及神經元再生期間，CD24Fc可以潛在地阻斷MAG功能。實例 4 CD24Fc 在臨床前模型中之治療功效 治療具有EAE之持續臨床徵象之動物.
8-12週齡C57BL/6小鼠用總體積為100 µL之200 µg MOG（大鼠來源之肽35-55（MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK）/CFA（每毫升400 µg結核分支桿菌）皮下免疫。每隻小鼠在免疫之後立即及48小時後再次經尾靜脈接受含有200 ng百日咳毒素（List Biological, Campbell，美國加利福尼亞）之200 µL PBS。隔日觀測小鼠且依0-5之量表評分，中間分數依0.5漸進：0：無臨床徵象；1：尾緊張性減小；2：步態搖晃；3：後肢麻痹；4：後肢及前肢麻痹；及5：死亡。免疫之後第14-21天，將臨床分數為2.5-3.5的小鼠隨機分成兩組且用對照IgG1 Fc或CD24Fc治療。每隻小鼠腹膜內（i.p.）五次隔日注射200 μg 。如圖6中所示，CD24Fc具有顯著的劑量依賴性治療效果。 治療具有預致敏自體反應性T細胞之動物.
為了測試CD24Fc是否能阻止自體反應性T細胞被摧毀，我們對免疫之後第7天的免疫小鼠加以治療。此時，可以在淋巴結中發現MOG反應性T細胞，但未能觀測到臨床症狀。免疫之後第7天，將免疫小鼠分成2組，每組9隻小鼠，且腹膜內用對照免疫球蛋白（Ig）或CD24Fc融合蛋白隔日治療（每隻小鼠每次注射200 µg），總共注射5次（第7、9、11、13及15天）。每天檢查小鼠以如上文所述根據臨床症狀打分。
如圖7中所示，在投與對照IgG或CD24Fc之後的第2天，CD24Fc治療組之臨床症狀的出現遲於對照組。考慮兩組之所有資料時，兩次統計學分析揭露較高的顯著差異（P=0.0019，費雪PLSD檢驗）。此等結果表明CD24Fc融合蛋白治療能夠延遲且減輕EAE臨床症狀。
為了確定最小有效劑量，我們將每次注射100、50及25 µg CD24Fc注射至MOG免疫小鼠中。我們使用1個月期間之累積疾病分數降低50%作為終點。如圖8中所示，觀測到劑量依賴性抑制。劑量反應曲線與對數曲線充分擬合，表明每次注射80 µg使累積疾病分數降低50%。 治療SJL模型之復發緩解性EAE.
C57BL/6小鼠之EAE具有急性臨床過程，此不同於絕大多數MS患者中呈現之慢性過程。大部分MS患者具有復發緩解臨床過程，此在EAE之SJL模型中得到最佳模擬。因此我們用SJL模型測試治療潛力。治療方案與上述實驗相同。簡言之，在免疫之後的第7天，將免疫小鼠分成2組，每組14或15隻小鼠，且腹膜內用媒劑對照物或本發明之CD24Fc融合蛋白（每隻小鼠每次注射200 μg）隔日治療，總共注射5次（第7、9、11、13及15天）。如圖9中所示，CD24Fc治療SJL小鼠使得臨床分數大幅度降低（P=0.0039，費雪PLSD檢驗）。實例 5 CD24Fc 在患有持續實驗性自體免疫腦脊髓炎之小鼠之中樞神經系統中的生物分佈 .
中樞神經系統（CNS）為免疫療法針對多發性硬化症之靶器官。此研究之目標為調查CD24Fc在未處理小鼠及患有持續實驗性自體免疫腦脊髓炎（EAE）之小鼠之CNS中的生物分佈。
圖10中之結果表明投與CD24Fc之後第24小時，未處理小鼠具有極低但可偵測到之CD24Fc含量（23 ng/ml）。然而，在患有持續EAE之小鼠中，CD24Fc含量為約18 µg/ml，比未處理小鼠CNS高超過780倍。增幅極其顯著（P＜0.001，非參數曼惠特尼T檢驗（Mann-Whitney T test））。根據試管內抑制分析，CNS中之CD24Fc含量完全處於有效範圍內。因此，CD24Fc可以近接CNS且在多發性硬化症（MS）患者之CNS中提供局部治療效果。實例 6 CD24 用於治療脫髓鞘疾病及神經保護之用途
此實例證明CD24蛋白質能用於治療脫髓鞘疾病及神經免疫疾病，提供神經保護作用且維持寡樹突神經膠質細胞。慢性暴露於雙環己酮草醯二腙為誘導嚙齒動物發生寡樹突神經膠質細胞損失的經典模型（5）。若干群組已報導寡樹突神經膠質細胞損失對炎症的關鍵作用。然而，寡樹突神經膠質細胞損失之起始信號的性質尚未有明確描述。Janeway已提出先天免疫主要經由微生物產物（稱為病原體相關分子模式或PAMPs）之模式識別來起始（6，7）。後來，Matzinger提出危險信號（後來被他人稱為DAMPs）為起始先天性免疫反應的關鍵（8）。本發明人的研究已表明，PAMPs及DAMPs誘發的炎症能藉由CD24-唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G相互作用來區分，原因是任一基因之靶向突變選擇性地增強了針對DAMPs之宿主反應，而不影響針對PAMPs之宿主反應（9，10）。在此，根據本發明人對CD24之潛在新用途的理解，藉由在慢性雙環己酮草醯二腙治療之後評估Cd24或唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G基因之靶向突變對寡樹突神經膠質細胞存活率的影響來探究先天免疫反應對DAMPs的潛在貢獻。
年齡及性別匹配之WT Cd24-/- 及唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G-/- 小鼠（9，10）用CPZ處理4週，且在處理後第4週使小鼠安樂死。為了監測寡樹突神經膠質細胞之恢復，首先將小鼠治療5週且允許恢復10天，正常食物餵食10天，且接著安樂死用於分析。將前囟-1區域（圖11A）切片且使用特異性結合至寡樹突神經膠質細胞譜系中之所有細胞的抗寡突膠質細胞轉錄因子-2抗體、藉由免疫螢光染色來分析寡樹突神經膠質細胞數目。代表性影像展示於圖11B，而總結資料展示於圖11C中。如圖11B中所示，所有三種小鼠品系在CPZ處理之前均具有類似數目個寡樹突神經膠質細胞。此等資料表明Cd24及唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G不參與此區域中之寡樹突神經膠質細胞之發展。然而，在CPZ處理之後第4週，Cd24或唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G基因之靶向突變引起寡樹突神經膠質細胞更嚴重的耗竭。此外，WT小鼠中之寡樹突神經膠質細胞數目在10天恢復期之後完全恢復，而在Cd24-/- 及唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G-/- 腦中僅觀測到部分恢復（圖11C）。此等資料表明CD24-唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G軸保護寡樹突神經膠質細胞以防CPZ毒性。
為了確定全身性投與唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G促效劑CD24Fc（9，10）（描述於美國專利公開案第20130231464號中，其內容以引用之方式併入本文中）是否能保護寡樹突神經膠質細胞，首先確定CD24Fc是否能夠經由全身投藥遞送至CNS中。將10 mg CD24Fc腹膜內注射至8週齡小鼠中。第1、7、14、21及28天收集血清及CSF，且藉由夾心ELISA量測CD24Fc之量。如圖11D中所示，在4週之整個觀測期期間，均能在CSF中發現CD24Fc，其含量在很大程度上與血漿中所觀測到的含量相似。CSF CD24Fc含量為血漿含量之約0.2-0.3%。第4週發現的含量高於CD24Fc在分析中關於抑制巨噬細胞產生發炎細胞介素之IC50。
CPZ處理之後的第2及4週，根據寡突膠質細胞轉錄因子2+寡樹突神經膠質細胞之原位分析，分析CD24Fc之保護作用。分析胼胝體之前囟-1位置的寡樹突神經膠質細胞數目（圖11E），原因是此區域在CPZ處理期間罹患更多的病理性損傷。觀測到在CPZ處理之後的第2週與第4週，CD24Fc處理使寡樹突神經膠質細胞數目顯著增加（圖11F）。
由於寡樹突神經膠質細胞損失通常與減少的髓鞘再生相關，因此進一步探究CD24或唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G基因之靶向突變是否引起脫髓鞘加快。令人驚訝的是，在任一小鼠品系中均未觀測到更嚴重的脫髓鞘。此等資料表明，寡樹突神經膠質細胞存活率提高可能不足以誘導髓鞘再生。
綜合而言，本文所述之資料表明CD24-唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G軸保護寡樹突神經膠質細胞以免被CPZ殺死，且因此表明針對DAMPs的宿主反應為CPZ模型中之寡樹突神經膠質細胞損失的未識別元兇。對寡樹突神經膠質細胞損失之發病機制的新洞察表明促進活體內寡樹突神經膠質細胞存活率的新途徑。根據此觀點，已表明全身投與結合至DAMPs（9，10）且用作唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G促效劑（9，10）的CD24Fc足以保護寡樹突神經膠質細胞以免被CPZ殺死。由於寡樹突神經膠質細胞損失已牽涉於多種神經變性疾病（1-4），因此資料表明可以根據此等難治性神經疾病之治療發展來探究針對細胞損傷的宿主反應。最後，應注意CD24亦已知為用於活化T細胞之共刺激分子（11），所述T細胞包括自體反應性T細胞（12）及肝內CD4 T細胞（13）。相應地，CD24Fc亦表明可抑制自體免疫疾病（14）。由於CD24Fc對自體免疫疾病中之Cd24基因的基因缺陷進行了表型模擬，因此其可能經由不同於拮抗劑的機制發揮作用。實例 7 CD24 在人體中的藥物動力學
此實例展示CD24蛋白質在人體中之藥物動力學分析。此來源於I期、隨機分組、雙盲、安慰劑對照、單次遞增劑量研究，以評估CD24Fc在健康男性及女性成年個體中之安全、耐受性及PK。此研究中招募了總共40位個體，分5組，每組8位個體。每組8位個體中有六位接受研究藥物且2位個體接受安慰劑（0.9%氯化鈉生理鹽水）。第一組給與10 mg。後續幾組接受30 mg、60 mg、120 mg及240 mg CD24Fc或匹配安慰劑且間隔至少3週給藥，以便審查先前每組之安全及耐受性資料。僅當安全及耐受性已得到充分證明時才允許向新一組個體投與下一個較高劑量。
第1天，每組中初始2位個體1位是研究藥物接受者且1位是安慰劑接受者。第7天之後（各子組之間最少相隔24小時），向第3至第5位個體及第6至第8位個體給藥。同一子組中之每位個體相隔至少1小時給藥。必要時，其餘個體延遲給藥，對給藥後期間可能出現之涉及彼組之第一或第二子組的任何重大安全問題審查後再定。前一組之後至少3週，向後一組給藥。 篩檢期：
主動治療期開始之前至多21天進行篩檢問診（第1次問診）。個體在提供知情同意書之後，進行合格篩檢程序。 治療期：
個體在第1天獲准進入臨床藥理單元（Clinical Pharmacology Unit，CPU）（第2次問診），且隨機化治療期始於最短10小時隔夜禁食之後的第1天。個體隨機分配CD24Fc或安慰劑單次劑量治療。個體被禁閉直至第4日晨。 隨訪：
所有個體在第7天、第14天、第21天、第28天及第42天（±1天）返回至CPU接受隨訪問診（第3次問診、第4次問診、第5次問診、第6次問診及第7次問診）。第7次問診為所有個體之最後一次問診。
治療持續時間：每位個體之總研究持續時間為至多63天。第1天投與單次劑量。 個體數目： 計劃：40位個體 篩檢：224位個體 隨機：40位個體 完成：39位個體 中斷：1位個體
診斷及主要納入標準：此研究用的群體為年齡在18歲與55歲之間（包括18歲及55歲）的健康男性及女性，其身體質量指數在18 kg/m2 與30 kg/m2 之間（包括18 kg/m2 及30 kg/m2 ）。 研究藥品及比較資訊：
CD24Fc：經由靜脈內輸注投與之10 mg、30 mg、60 mg、120 mg或240 mg單次劑量；批號：09MM-036。CD24Fc為完全人類化融合蛋白，其由人類CD24之成熟序列及人類免疫球蛋白G1之可結晶片段區域（IgG1Fc）組成。CD24Fc作為無菌、透明、無色、無防腐劑水溶液供應用於靜脈內投與。CD24Fc調配為單次劑量注射溶液，其濃度為10 mg/mL且pH為7.2。各CD24Fc小瓶含有160 mg CD24Fc、5.3 mg氯化鈉、32.6 mg磷酸氫二鈉七水合物及140 mg磷酸二氫鈉單水合物於16 mL ± 0.2 mL CD24Fc中。CD24Fc在具有氯丁基橡膠塞及易拉鋁密封蓋的透明硼矽酸鹽玻璃小瓶中供應。
經由靜脈內輸注投與的匹配安慰劑（0.9%氯化鈉生理鹽水）；批號：P296855、P311852、P300715、P315952。
治療意願（ITT）群體由接受至少1次劑量之研究藥物的所有個體組成。ITT群體為用於個體資訊及安全評估的主要分析群體。
臨床實驗室評估（化學、血液學及尿分析）係依據治療及問診來概述。亦概述相對於基線的變化。生命體徵（血壓、心率、呼吸速率及溫度）係依據治療及時間點概述。亦概述相對於基線的變化。列舉所有體檢資料。概述心電圖參數及相對於基線的變化。列舉總體解釋。 血漿CD24Fc濃度
如圖9中所示，CD24Fc之平均血漿濃度相對於CD24Fc之投與劑量按比例增加。對於除120 mg外之所有劑量組而言，CD24Fc在給藥後1小時達到最大平均血漿濃度。對於120 mg群組而言，CD24Fc在給藥後2小時達到最大平均血漿濃度。截至第42天（984個小時），所有群組之CD24Fc平均血漿濃度已降低至最大平均血漿濃度之2%與4%之間。
表1概括了PK可評估群體經治療之血漿CD24Fc PK參數。 表1 PK可評估群體經治療之血漿CD24Fc藥物動力學參數概述 血漿CD24Fc劑量比例分析
10展示PK可評估群體之CD24Fc Cmax 相對於劑量的劑量比例圖。11展示PK可評估群體之CD24Fc AUC0-42d 相對於劑量的劑量比例圖。12展示PK可評估群體之CD24Fc AUC0-inf 相對於劑量的劑量比例圖。表2展示劑量比例之冪分析。 表2 劑量比例之冪分析：血漿CD24Fc藥物動力學參數 - PK可評估群體
Cmax 斜率估算值為1.172，90% CI為1.105至1.240。AUC0-42d 斜率估算值為1.088，90% CI為1.027至1.148。AUC0-inf 斜率估算值為1.087，90% CI為1.026至1.1。 藥物動力學結論
在小鼠、猴及人類中，血漿CD24Fc之Cmax 及AUCs相對於所投與劑量按比例增加。血漿CD24Fc在1.01與1.34小時之間達到Tmax 。血漿CD24Fc之t½ 範圍在280.83與327.10小時之間。參考文獻 1 Nave, K. A. 及Trapp, B. D. 軸突-神經膠質信號傳導及神經膠質對軸突功能的支持（Axon-glial signaling and the glial support of axon function），《神經科學年鑒（Annu. Rev. Neurosci. ）》31 , 535-561, doi:10.1146/annurev.neuro.30.051606.094309 (2008). 2 Rivera, A., Vanzuli, I., Arellano, J. J. 及Butt, A. 寡樹突神經膠質細胞祖細胞（NG2-神經膠質）在衰老腦中之再生能力降低：突觸功能障礙、髓鞘損失及神經元中斷的惡性循環？（Decreased Regenerative Capacity of Oligodendrocyte Progenitor Cells (NG2-Glia) in the Ageing Brain: A Vicious Cycle of Synaptic Dysfunction, Myelin Loss and Neuronal Disruption?），《當前阿茲海默病研究（Current Alzheimer research ）》13 , 413-418 (2016). 3 Cai, Z. 及Xiao, M. 寡樹突神經膠質細胞及阿茲海默氏病（Oligodendrocytes and Alzheimer's disease），《國際神經科學雜誌（Int. J. Neurosci. ）》126 , 97-104, doi:10.3109/00207454.2015.1025778 (2016). 4 McTigue, D. M. 及Tripathi, R. B. 成人CNS中之寡樹突神經膠質細胞的壽命、死亡及置換（The life, death, and replacement of oligodendrocytes in the adult CNS），《神經化學雜誌（J. Neurochem. ）》107 , 1-19, doi:10.1111/j.1471-4159.2008.05570.x (2008). 5 Blakemore, W. F. 關於雙環己酮草醯二腙中毒小鼠之寡樹突神經膠質細胞變性、海綿狀腦分解及髓鞘再生的觀測結果（Observations on oligodendrocyte degeneration, the resolution of status spongiosus and remyelination in cuprizone intoxication in mice），《神經細胞學雜誌（J. Neurocytol. ）》1 , 413-426 (1972). 6 Janeway, C. A. 接近漸近線? 免疫學演變及革命（Approaching the asymptote? Evolution and revolution in immunology），Cold Spring Harb. 《定量生物學論文集（Symp. Quant. Biol. ）》54 , 1-13 (1989). 7 Liu, Y. & Janeway, C. A., Jr. 微生物誘導共刺激活性用於CD4 T細胞生長（Microbial induction of co-stimulatory activity for CD4 T-cell growth），《國際免疫學（Int. Immunol. ）》3 , 323-332 (1991). 8 Matzinger, P. 耐受性、危險及擴大的家族（Tolerance, danger, and the extended family），《免疫學年鑒（Annu. Rev. Immunol. ）》12 , 991-1045 (1994). 9 Chen, G. Y.等人，藉由抑制唾液酸酶介導CD24-唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集G相互作用中斷而改善敗血症（Amelioration of sepsis by inhibiting sialidase-mediated disruption of the CD24-SiglecG interaction），《自然生物技術（Nat. Biotechnol. ）》29 , 428-435, doi:nbt.1846 [pii] 10.1038/nbt.1846 (2011). 10 Chen, G. Y., Tang, J., Zheng, P.及Liu, Y. CD24及唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-10選擇性地抑制組織損傷誘導之免疫反應（CD24 and Siglec-10 selectively repress tissue damage-induced immune responses），《科學（Science ）》323 , 1722-1725 (2009). 11 Fang, X., Zheng, P., Tang, J. & Liu, Y. CD24：自A至Z（CD24: from A to Z），《細胞及分子免疫學（Cellular & molecular immunology ）》7 , 100-103 (2010). 12 Bai, X. F. 等人，CD24在實驗性自體免疫腦脊髓炎期間控制中樞神經系統中之自體反應性T細胞的擴增及持續（CD24 Controls Expansion and Persistence of Autoreactive T Cells in the Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis），《實驗醫學雜誌（J. Exp. Med. ）》200 , 447-458 (2004). 13 Zheng, C., Yin, S., Yang, Y., Yu, Y. 及Xie, X. CD24藉由促進CD4+ T細胞產生IFN-γ來使自體免疫性肝炎之急性肝臟損傷惡化（CD24 aggravates acute liver injury in autoimmune hepatitis by promoting IFN-gamma production by CD4+ T cells），《細胞及分子免疫學（Cellular & molecular immunology ）》, doi:10.1038/cmi.2016.57 (2017). 14 Bai, X. F. 等人，熱穩定性抗原決定了自反應性T細胞在實驗性自體免疫腦脊髓炎中的病原性（The heat-stable antigen determines pathogenicity of self-reactive T cells in experimental autoimmune encephalomyelitis），《臨床研究雜誌（J. Clin. Invest. ）》105 , 1227-1232 (2000).
圖1A展示全長CD24融合蛋白CD24Fc（在本文中亦稱為CD24Ig）（SEQ ID NO: 5）。加下劃線的26個胺基酸為CD24（SEQ ID NO: 4）之信號肽，其在自表現所述蛋白質之細胞分泌期間分裂且因此缺失於所述蛋白質之經處理形式（SEQ ID NO: 6）。所述序列之粗體部分為融合蛋白（SEQ ID NO: 2）。為了避免免疫原性，通常存在於成熟CD24蛋白質中之最後一個胺基酸（A或V）已缺失於構築體中。未加下劃線的非粗體字母為IgG1 Fc之序列，其包括鉸鏈區及CH1及CH2域（SEQ ID NO: 7）。圖1B展示CD24V Fc之序列（SEQ ID NO: 8），其中成熟人類CD24蛋白質（粗體）為SEQ ID NO: 1之纈胺酸多態性變異體。圖1C展示CD24A Fc之序列（SEQ ID NO: 9），其中成熟人類CD24蛋白質（粗體）為SEQ ID NO: 1之丙胺酸多態性變異體。圖1B及1C中之融合蛋白的不同部分如圖1A加以標記且變異型纈胺酸/丙胺酸胺基酸加雙下劃線。 圖2展示來自小鼠之成熟CD24蛋白質（SEQ ID NO: 3）與來自人類之成熟CD24蛋白質（SEQ ID NO: 1）之間的胺基酸序列變異。潛在的O-糖基化位點加粗，且N-糖基化位點加下劃線。 圖3. 對CD24IgG1（CD24Fc）之藥物動力學進行的WinNonlin隔室模型化分析。空心圓表示3隻小鼠之平均值，且線條為預測藥物動力學曲線。圖3A. 靜脈內注射1 mg CD24IgG1。圖3B. 皮下 注射1 mg CD24IgG1（CD24Fc）。圖3C. 血液中之抗體總量的比較，如藉由曲線下面積（AUC）、半衰期及最大血液濃度所量測。應注意，總體而言，皮下注射之AUC及Cmax 為靜脈內注射之約80%，但差異無統計顯著性。 圖4. 區別PAMP與DAMP之間的CD24-唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素（10）（CD24-Siglec G（10））相互作用。圖4A. 宿主對PAMP的反應不受CD24-唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G（10）相互作用的影響。圖4B. CD24-唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G（10）相互作用抑制宿主對DAMP的反應，此可能經由與唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G/10相關的SHP-1達成。 圖5. CD24Fc與髓鞘相關醣蛋白（MAG）在試管內結合。 圖6. 人類CD24融合蛋白對小鼠EAE之治療功效。C57BL/6j小鼠用如圖4之圖例中所述的MOG肽免疫。免疫後第14-21天，EAE分數達到2.5與3.5之間的小鼠隨機分成三組且經由隔日進行之5次注射CD24融合蛋白（200或50 µg/注射）或對照蛋白質（200 µg/注射）來治療。所示資料為 臨床分數之平均值及標準誤差。* P＜0.05。** P＜0.01。總體而言，當投與200 µg融合蛋白時，觀測到顯著治療效果（P=0.0083）。在每組總共7-12隻小鼠的兩個獨立實驗中觀測到治療效果。 圖7. CD24Fc防止自體免疫被MOG預致敏T細胞摧毀。六週齡雌性C57BL/6小鼠第0天用CFA中之MOG肽免疫。免疫後第7天，當大多數小鼠不存在臨床症狀時，小鼠隔日用腹膜內對照人類IgG Fc或CD24Fc（200 µg/注射/小鼠）治療，總共5次注射，如箭頭所指示。每天檢查小鼠，根據臨床症狀打分。所示資料為每組9隻及10隻小鼠之平均值及SEM。（P=0.0019，費雪PLSD檢驗（Fisher's PLSD test））。治療效果已在另一個實驗中再現。 圖8. 鑑別CD24Fc在小鼠中之最小有效劑量。C57BL/6小鼠用MOG免疫且用CD24Fc治療，如圖4之圖例中所詳述。利用第一個月期間的累積疾病分數計算由CD24Fc引起之抑制%。IgG1Fc治療組之分數用作基線。利用對數曲線擬合來計算出最小有效劑量。 圖9. CD24Fc治療SJL模型之復發緩解性EAE。六週齡雌性SJL小鼠第0天用CFA中之PLP肽免疫。免疫後第7天，當大多數小鼠不存在臨床症狀時，小鼠隔日用腹膜內對照人類IgG Fc或CD24 Ig（200 µg/注射/小鼠）治療，總共5次注射（第7、9、11、13及15天）。每天檢查小鼠，根據臨床症狀打分。所示資料為每組14或15隻小鼠之平均值及SEM。P=0.0039，費雪PLSD檢驗。SJL模型中之治療效果已重複3次。由於IgGFc在涉及此模型的一些實驗中加大了疾病分數（且因此擴大了治療效果），因此在此模型中使用GMP級媒劑（PBS）。 圖10. CD24Fc在未處理及EAE小鼠中的濃度。EAE係藉由用含有400 µg結核分支桿菌（Mycobacterium tuberculosis）之弗氏完全佐劑（Complete Freund's Adjuvant，CFA）中的200 µg MOG35-55肽使8-10週雌性C57BL/6小鼠皮下免疫而誘發。免疫後立即及在48小時後注射200 ng百日咳毒素。EAE誘發後第11天，小鼠靜脈內投與1 mg CD24Fc。年齡匹配之未處理雌性C57BL/6小鼠亦靜脈內接受相同量的CD24Fc。24小時後，自兩組小鼠收集腦脊髓液（CSF），且藉由夾心ELISA量測CNS中的CD24Fc濃度。在此研究中，投與PBS之未處理小鼠的腦脊髓液用作陰性對照。 圖11. Cd24或唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G之靶向突變使得寡樹突神經膠質細胞對雙環己酮草醯二腙（Cuprizone，CPZ）處理的敏感性增強。圖11A. 所分析之胼胝體組織切片的位置。圖11B. WT Cd24-/-及唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G-/-小鼠之前囟-1腦區域中之寡突膠質細胞轉錄因子-2（oligo-2）染色的代表性影像。8週齡時，小鼠喂飼含有0.2重量% CPZ之食物2至5週後處死。其他動物保持含CPZ飲食5週且接著恢復（自所述飲食中移除CPZ）額外10天後處死。對照組維持正常食物。小鼠經賁門灌注磷酸鹽緩衝生理鹽水（PBS），隨後灌注含有4%多聚甲醛的冷PBS。移出腦，在4%多聚甲醛中固定隔夜，且轉移至防凍溶液中。在Leica滑動式薄片切片機上切割冠狀面冷凍切片（30 µm，自由浮動）。自由浮動切片在PBS中沖洗且在室溫下用5%正常驢或山羊血清阻斷1小時。接著，切片在室溫下與抗寡突膠質細胞轉錄因子2抗體（EMD Millipore，目錄號 Ab9610，以1:2000稀釋度使用）一起培育2小時，隨後與fluor 555結合之驢抗兔IgG二級抗體（Invitrogen，目錄號A-31572）一起在室溫下培育1小時。隨後，洗滌切片，用DAPI染色，固著於玻璃載片上，且用Fluoromount-G覆蓋蓋玻片。圖11C. CPZ對WT Cd24-/-及唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集g-/-腦之前囟-1區域中之寡樹突神經膠質細胞數目之影響的總結資料。所示資料代表兩次獨立實驗。P值係利用司徒登氏t檢驗（student t-test）確定。資料以平均值及標準差展示。圖11D. 單次全身投與CD24Fc（10 mg/小鼠）之後，在CSF及血清中偵測到的CD24Fc濃度。此等資料代表兩次獨立實驗，N=4。資料以平均值及標準差展示。圖11E. 治療實驗之研究時間線。11F. 單次劑量之CD24Fc治療（10 mg/小鼠）之後的第2或4週，前囟-1中之寡突膠質細胞轉錄因子2+細胞數目。所示資料代表兩次獨立實驗。P值係藉由司徒登氏t檢驗來確定。N=4。資料以平均值及標準差展示。使用GraphPad Prism軟體進行所有統計學分析。資料以平均值及標準差展示。 圖12展示人類個體中之PK可評估群體經治療之平均血漿CD24Fc濃度（±SD）的曲線圖。PK=藥物動力學；SD=標準差。 圖13展示PK可評估群體之CD24Fc Cmax 相對於劑量的劑量比例圖。 圖14展示PK可評估群體之CD24Fc AUC0-42d 相對於劑量的劑量比例圖。 圖15展示PK可評估群體之CD24Fc AUC0-inf 相對於劑量的劑量比例圖。

Claims (18)

  1. 一種治療脫髓鞘病症的方法，包含向有需要的個體投與CD24蛋白質。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中所述脫髓鞘病症選自由以下組成之群：阿茲海默氏病（Alzheimer's disease）、帕金森氏病（Parkinson's disease）、多發性硬化症、急性播散性腦脊髓炎、視神經脊髓炎譜系病症、視神經炎、橫貫性脊髓炎及急性弛緩性脊髓炎。
  3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中所述CD24蛋白質維持寡樹突神經膠質細胞。
  4. 根據權利要求1所述的方法，進一步包含投與促進寡樹突神經膠質細胞轉化的另一種藥劑。
  5. 如申請專利範圍第1項之方法，進一步包含投與促進寡樹突神經膠質細胞產生髓鞘的另一種藥劑。
  6. 如申請專利範圍第1項之方法，其中所述CD24蛋白質包含成熟人類CD24或其變異體。
  7. 如申請專利範圍第6項之方法，其中所述成熟人類CD24包含SEQ ID NO: 1或2中所闡述之胺基酸序列。
  8. 如申請專利範圍第1項之方法，其中所述CD24蛋白質為可溶的。
  9. 如申請專利範圍第1項之方法，其中所述CD24蛋白質經糖基化。
  10. 如申請專利範圍第6項之方法，其中所述CD24蛋白質進一步包含蛋白質標籤，其中所述蛋白質標籤在所述CD24蛋白質之N末端或C末端融合。
  11. 如申請專利範圍第10項之方法，其中所述蛋白質標籤包含哺乳動物免疫球蛋白（Ig）的一部分。
  12. 如申請專利範圍第11項之方法，其中所述Ig部分為人類Ig蛋白質之Fc區。
  13. 如申請專利範圍第12項之方法，其中所述Fc區包含所述人類Ig蛋白質之鉸鏈區及CH2及CH3域，且其中所述Ig選自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及IgA組成之群。
  14. 如申請專利範圍第12項之方法，其中所述Fc區包含IgM之鉸鏈區及CH2、CH3及CH4域。
  15. 如申請專利範圍第13項之方法，其中所述CD24蛋白質包含SEQ ID NO: 6、11或12中所闡述之胺基酸序列。
  16. 如申請專利範圍第1項之方法，其中所述CD24蛋白質係使用真核蛋白質表現系統產生。
  17. 如專利申請範圍第16項之方法，其中所述表現系統包含中國倉鼠卵巢細胞系中所含的載體或複製缺乏型逆轉錄病毒載體。
  18. 如申請專利範圍第17項之方法，其中所述複製缺乏型逆轉錄病毒載體穩定整合至真核細胞之基因組中。
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