TW201831175A - 乙醯半胱胺酸預防早產、死產、死胎和/或胚胎腦損傷的用途 - Google Patents

Abstract

本揭示內容是關於乙醯半胱胺酸的新穎用途，其可預防懷孕個體的早產、死產或死胎。依據本揭示內容的實施方式，該懷孕個體遭受一如細菌性子宮內感染等細菌感染，其會造成由細菌引發之早產、死產、死胎或胚胎腦損傷。

Description

乙醯半胱胺酸預防早產、死產、死胎和/或胚胎腦損傷的用途

本揭示內容是關於保護人類新生兒之領域。更具體來說，本揭示內容是關於用以預防早產、死產和/或胚胎腦損傷的方法及藥物。

懷孕37週之前的分娩稱為早產 (Preterm birth, PTB)，早產是一項重大的公共健康問題，造成70%的產期前死亡(perinatal mortality)及近半數新生兒的長期性神經病變。台灣的早產率約佔全部分娩數的8-10%，每年約影響20,000個新生兒。這些早產兒通常伴有神經發育缺損，包含整體認知遲緩、腦性麻痺、失明及失聰。

研究指出婦女早產時常併發子宮內感染。感染病原體會經由下生殖道侵入懷孕的子宮，最終造成胚胎的早產、死產、死胎或神經損傷。

有鑑於此，本發明所屬相關領域亟需一種藥劑，可用以保護懷孕婦女或胚胎避免因細菌感染造成早產、死產、死胎或胚胎腦損傷。

本揭示內容部分是基於發明人意外發現乙醯半胱胺酸(N-acetylcystein, NAC)可有效保護胚胎，避免其因細菌毒素造成神經死亡。因此，本揭示內容的第一態樣提供了一種NAC的用途，其可作為一種藥劑，用以預防懷孕個體(特別是遭受細菌感染之懷孕個體)的早產、死產或死胎。

亦或是或此外，本揭示內容的第二態樣提供了另一種NAC的用途，其可作為一種藥劑，用以預防懷孕個體之胚胎因細菌感染引發腦部損傷，進而產生神經發展性疾病。

依據較佳的實施方式，懷孕個體係遭受細菌感染，例如細菌性子宮內感染。會造成懷孕個體細菌性子宮內感染的細菌實例包含，但不限於，具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum) 、 尿溶原漿菌(Ureaplasma urealyticum )、 人型黴漿菌(Mycoplasma hominis )或解脲擬桿菌(Bacteroides urealyticus )。依據某些實施例，懷孕個體係遭受具核梭桿菌之感染。

依據較佳的實施方式，是對懷孕個體投予每公斤10微克到每公斤10毫克的NAC。

神經發展性疾病的實例包含，但不限於，注意力不足過動症(attention deficit hyperactivity disorder, ADHD)、構音障礙(articulation disorder)、自閉症類障礙(autistic spectrum disorder, ASD)、腦性麻痺(cerebral palsy)、學習障礙(learning disability)、智能障礙(mental retardation)、強迫症(obsessive-compulsive disorder)、精神分裂症(schizophrenia)及視覺及聽覺減損。

自閉症類障礙的實例包含，但不限於，亞斯伯格症(Asperger syndrome)、自閉症(autism)、兒童期崩解症(children disintegrative disorder)及廣泛性發展障礙非特定型(pervasive developmental disorder not otherwise specified, PDD-NOS)。

依據本揭示內容較佳的實施方式，該個體為人類。

依據本揭示內容某些實施方式，在對懷孕個體投予NAC之前、同時及/或之後，可投予另一治療藥劑(例如，抗生素)。

依據某些較佳實施方式，可與NAC共同使用的抗生素的實例包含，但不限於，青黴素(penicillin)、抑黴菌素(Mycostatin)、胺羥芐青黴素(amoxicillin)、胺苄青黴素 (ampicillin)、安滅菌(augmentin, amoxicillin-clavulantate)、二氯噻青黴素(Dicloxicillin)、呋喃妥因(Macrobid, nitro furantoin)、甲硝唑(Flagyl, metronidazole)、頭孢菌素(Cephalosporins)、頭孢羥氨苄(Duricef, cefadroxiI)、氯林絲菌素(Cleocin, clindamycin)、紅黴素(Erythromycin)、亞藥索黴素(Zithromax, azithromycin)、抗濾兒(Famzir, famciclovir)、阿昔洛韋(Zovirax, acyclovir)、伐昔洛韋(Valtrex, valacyclovir)、克黴唑陰道劑(Clotrimazole vaginal, Mycelex, Lotrimin)、複方新諾明(Bactrim)、曲美普林(trimethoprim)、克拉黴素(Biaxin, clarithromycin)、塞普沙辛(Cipro, ciprofloxacin)、氟康唑(Diflucan, fluconazole)、咪可納唑(Monistat, miconazole)、特康唑(Terazol, terconazole)、喹吖啶(quinacrinc)、磷酸氯奎(chloroquine)、嘧啶甲胺(pyrimethamine)、曲美普林、派馬喹(primaquine)、異菸酸酊(Isoniazid)、雷發平(Rifampin)及美苯噠唑(Vermox, mebendazole)。

在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

1. 定義

除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。

「胚胎」(fetus或fetal)一詞在本揭示內容是指由受孕約3個月後到出生之前的發育中人類。

在本揭示內容中，「早產」(preterm birth, PTB)一詞是指分娩時間早於懷孕37週的人類個體。

在本揭示內容中，「死產」(still birth)一詞是指死於子宮內或分娩過程中的胚胎。通常使用「死產」來代表其與活產(live birth)或流產(miscarriage)不同。更具體來說，「死產」(still birth)一詞指一死於懷孕中期到全程孕期之間的胚胎。舉例來說，「死產」一詞可用以闡述一於懷孕20-40週間產出之無生命跡象的嬰兒。「流產」(miscarriage)一詞通常則是指發生於胚胎發育早期的死亡。

在本揭示內容中，「死胎」(fetal death)一詞是指發生在被母體完整排出或自母體中引出受孕產物前的死亡，不論死亡是發生在孕期中的哪一段期間，且該死亡不是由誘導終止懷孕所導致。「死胎」是指在被母體排出後，胚胎無呼吸或無其他生命跡象，例如心跳、臍帶的搏動或隨意肌的明確運動。死胎一詞包含流產導致的死胎。

在本揭示內容中，「神經發展性疾病」(neurodevelopmental disorder)一詞是指個體之正常神經功能不足或缺失，或是出現神經功能異常。神經發展性疾病包含由腦細胞損傷及/或死亡所造成的疾病，其中腦細胞包含白質細胞(white matter cell)及灰質細胞(gray matter cell)。具體來說，神經元死亡或腦細胞死亡是由於感染疾病所導致，例如在懷孕過程中，由母體傳遞至胚胎的病毒或細菌感染，進而引發新生兒早產、死產或腦部損傷。神經發展性疾病實例包含，但不限於，注意力不足過動症、構音障礙、自閉症類障礙、腦性麻痺、學習障礙、智能障礙、強迫症、精神分裂症及視覺及聽覺減損。

在本揭示內容中，「自閉症類障礙」(autistic spectrum disorder或autism spectrum disorder)一詞是指一種神經發展性疾病，其特徵在於伴隨重複及刻板行為的社會互動與溝通不良。自閉症包含數種與社會互動及溝通不良的病徴；然而，該疾病可依據與社會互動及溝通不良的程度，約略分為「高功能自閉症」(high functioning autism)或「低功能自閉症」(low functioning autism)。被診斷罹患「高功能自閉症」的個體具有最小但可辨識的社會互動及溝通不良(即亞斯伯格症)。自閉症類障礙的實例包含，但不限於，亞斯伯格症、自閉症、兒童期崩解症及廣泛性發展障礙非特定型。

「個體」(subject)一詞在本揭示內容是指一動物，其包含，但不限於，人類、非人類之哺乳動物(例如黑猩猩及其他猿類及猴類)、農場動物(例如牛、綿羊、豬、山羊及馬)、寵物型哺乳動物(例如狗及貓)、包含嚙齒類之實驗型動物(例如小鼠、大鼠及天竺鼠等)。除非另有所指，否則「個體」(subject)一詞同時包含男性及女性。據此，「個體」(subject)一詞包含男性及女性的成熟個體、新生個體及胚胎。在較佳實施方式中，該個體為一哺乳動物，例如一人類；更佳地，為一懷孕婦女。

「有效量」(effective amount)一詞在本揭示內容是指一於治療疾病時，可於特定劑量及投予時間下產生欲求結果的用量。若可完全或部分抑制一疾病及其病徵，即為預防性功效。舉例來說，在預防早產時，一可減少、預防、延緩或遏止任何早產徵狀的藥劑(即，本揭示內容之NAC)即為有效的。一有效量的藥劑不必然可治癒一疾病，而是能達到減緩該疾病的目的，藉以延緩疾病的發生、抑制或減緩疾病及其病徵。有效量可包裝為適合分成1、2或多劑量投予的適當劑型，以於特定時間內分1、2或多次投予至個體體內。依據本揭示內容某些實施方式，是對一懷孕個體投予一有效量之乙醯半胱胺酸(N-acetylcysteine, NAC)，其中該懷孕個體可遭受或未遭受感染(例如細菌或病毒感染)，藉以預防懷孕個體之流產、早產、死產或死胎。依據本揭示內容其他實施方式，是對一懷孕個體投予一有效量之NAC，其中該懷孕個體可遭受或未遭受感染(例如，細菌或病毒感染)，藉以預防懷孕個體的胚胎產生神經發展性疾病。

在本揭示內容中，「投予」(administered、administering或administration)一詞是指一種傳遞模式，包含，但不限於，口服、靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射或皮內注射等方式來給予本發明之藥劑(即NAC)。

在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。

2. NAC 的用途

本揭示內容部分是基於發明人發現NAC可作為一種產期前神經保護劑。本揭示內容之實施例證實NAC具有對抗潛在損傷機制的保護功效，該損傷機制會導致胚胎神經發育時期，神經細胞的損傷及/或死亡。該損傷機制包含，但不限於，感染及發炎。

依據較佳的實施方式，是對遭受細菌感染的懷孕個體投予NAC，以預防早產、死產或死胎。依據某些實施方式，懷孕個體是遭受細菌性子宮內感染。會造成懷孕個體細菌性子宮內感染的細菌實例包含，但不限於，具核梭桿菌、尿溶原漿菌、人型黴漿菌或解脲擬桿菌。依據某些實施方式，懷孕個體是遭受具核梭桿菌之感染。

亦或是或此外，NAC亦可保護胚胎避免細菌引發的腦部損傷，其會導致新生兒的死胎或神經發展性疾病。據此，可對一遭受細菌感染之懷孕個體投予NAC，以預防胚胎產前死亡或出生後罹患神經發展性疾病。神經發展性疾病實例包含，但不限於，注意力不足過動症、構音障礙、自閉症類障礙、腦性麻痺、學習障礙、智能障礙、強迫症、精神分裂症及視覺及聽覺減損。自閉症類障礙實例包含，但不限於，亞斯伯格症、自閉症、兒童期崩解症及廣泛性發展障礙非特定型。

一般來說，是對懷孕個體投予每公斤個體體重10微克到每公斤個體體重100毫克的NAC，例如每公斤個體體重10、20、30、40、50、60、70、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950微克，或是每公斤個體體重 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100毫克的NAC。較佳地，是對懷孕個體投予每公斤個體體重50微克到每公斤個體體重80毫克的NAC，例如每公斤個體體重50、60、70、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950微克，或是每公斤個體體重1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80毫克的NAC。更佳地，是對懷孕個體投予每公斤個體體重1毫克到每公斤個體體重50毫克的NAC，例如每公斤個體體重1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50毫克的NAC。該投予量可以單一劑量型式投予至個體體內，或是於1天內分為多劑量型式(例如每天2、 3或4次)投予至個體體內。NAC的實際投予劑量可隨個體的特定病徵及生理狀況(例如年齡及醫療史等)而有所不同，且醫療人員可依據其經驗進行調整。

在某些實施方式中，本發明方法更包含在投予NAC之前、同時或之後，對懷孕個體投予另一種可安全使用的抗生素及/或抗細菌藥劑。可與NAC一起使用的抗生素包含，但不限於，青黴素、抑黴菌素、胺羥芐青黴素、胺苄青黴素、安滅菌、二氯噻青黴素、呋喃妥因、甲硝唑、頭孢菌素、頭孢羥氨苄、氯林絲菌素、紅黴素、亞藥索黴素、抗濾兒、阿昔洛韋、伐昔洛韋、克黴唑陰道劑、複方新諾明、曲美普林、克拉黴素、塞普沙辛、氟康唑、咪可納唑、特康唑、喹吖啶、磷酸氯奎、嘧啶甲胺、曲美普林、派馬喹、異菸酸酊、雷發平及美苯噠唑。

3. 藥學組合物

本揭示內容亦包含一藥學組合物，用以預防細菌感染造成懷孕個體的早產、死產或死胎。該藥學組合物包含一有效量的NAC，及一藥學上可接受賦形劑。

本發明NAC的重量約佔藥學組合物總重量的0.1%到99%。在某些實施方式中，NAC的重量至少佔藥學組合物總重量的1%。在某些實施方式中，NAC的重量至少佔藥學組合物總重量的5%。在另外實施方式中，NAC的重量至少佔藥學組合物總重量的10%。在其他實施方式中，NAC的重量至少佔藥學組合物總重量的25%。

可依據適當的製藥程序來製備藥學組合物，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th edition, ed. Alfonoso R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, Pa (1985)所述方法。藥學上可接受之賦形劑為可與劑型中其他成分相容，且為生物可接受的物質。

依據某些具選擇性之實施方式，該藥學組合物更包含一抗生素。適用於本發明藥學組合物的抗生素實例包含，但不限於，青黴素、抑黴菌素、胺羥芐青黴素、胺苄青黴素、安滅菌、二氯噻青黴素、呋喃妥因、甲硝唑、頭孢菌素、頭孢羥氨苄、氯林絲菌素、紅黴素、亞藥索黴素、抗濾兒、阿昔洛韋、伐昔洛韋、克黴唑陰道劑、複方新諾明、曲美普林、克拉黴素、塞普沙辛、氟康唑、咪可納唑、特康唑、喹吖啶、磷酸氯奎、嘧啶甲胺、曲美普林、派馬喹、異菸酸酊、雷發平及美苯噠唑。

可將本發明NAC配製為適用於口服、穿膜(例如鼻腔、舌下、陰道內、頰內及/或直腸內)，及/或非口服(例如皮下、靜脈內、肌肉內、腹腔內或單次全劑量注射(bolus injection))方式投予的單一劑型。例示性之劑型包含，但不限於，片劑、囊片、膠囊(例如軟式彈性明膠膠囊)、扁囊劑、錠劑、錠片、分散體、栓劑、軟膏、泥罨劑、乳劑、硬膏劑、溶液、貼劑、噴霧劑或凝膠。可將本發明NAC配製為液體藥學組合物，其可以是無菌溶液、懸浮液(例如與水相容或不溶的液體懸浮液、水包油乳劑，或是油包水乳劑)或酏劑；舉例來說，可藉由口服、靜脈內、肌肉內、皮下或腹腔內注射投予至個體體內。

可依據特定的投予路徑來配製本發明NAC。舉例來說，若欲以口服方式投予NAC，可藉由將腸溶衣塗佈於劑型表面來防止NAC在酸性環境中分解，直到其到達個體的小腸。劑型可更包含額外的成分，藉以將NAC傳遞到特定的標的位置。在某些實施例中，是將NAC包覆於一微脂體中，以防止其受到酵素作用而分解，輔助運送NAC通過個體的循環系統，及/或穿透細胞膜到達其特定細胞標的位置。

此外，可將NAC與其他試劑(例如助溶劑、乳化劑及/或表面活性劑)一起配製為液體劑型。例示性之其他試劑包含，但不限於，環糊精(例如α-環糊精及β-環糊精)，以及無水溶劑，其包含，但不限於，乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、1,3-丁二醇、二甲基甲醯胺、二甲亞碸(dimethyl sulfoxide)、生物相容性油(例如棉籽油、花生油、玉米油、小麥胚芽油、蓖麻油、橄欖油、芝麻油、甘油、四氫呋喃、聚乙二醇、山梨醇酐的脂肪酸酯類及其組合)。

NAC的投予劑量可隨著投予路徑的不同而有所改變。舉例來說，相較於慢性治療，急性治療的劑型可包含較大量的NAC。相似地，相較於口服劑型，非口服劑型包含較少量的NAC。本揭示內內容亦包含適用於其他投予路徑的劑量。

3.1 口服劑型

可將NAC配製為適用於口服的劑型。該些劑型包含，但不限於，咀嚼片、片劑、膠囊及糖漿；可依據Remington’s Pharmaceutical Sciences (18th ed., Mack Publishing, Easton, PA (1990))所述方式來製備口服劑型。可依據習知技藝人士所熟知之方法，將預定劑量之活性化合物(例如NAC)及一或多種藥學上可接受之賦形劑進行混合，以製備口服劑型。

片劑及膠囊為二種最常見的口服劑型，可製備為液體或固體組合物形式。一般來說，是將活性成分與液體或研磨固體賦形劑混合後，壓進預定形式，以製備片劑及膠囊。固體劑型可更包含能增加溶解性的崩解劑及潤滑劑。

3.2 非口服劑型

非口服劑型適用以皮下、靜脈內(包含單次全劑量注射)、肌肉內及腹腔內方式投予至個體體內。據此，需要無菌注射液或懸浮液進行配製，以預止受體遭受微生物感染。適用於製備無菌注射液或懸浮液的稀釋劑或溶劑包含，但不限於，1,3-丁二醇、甘露醇、水、林格氏液及等張氯化鈉溶液。亦可利用油酸及其甘油酯衍生物等脂肪酸，或是橄欖油或蓖麻油等天然藥學上可接受之油脂來製備可注射的劑型。該些油溶液或懸浮液亦可包含乙醇稀釋劑、羧甲基纖維素或相似的分散劑。亦可利用聚山梨醇酯(Tweens)、斯潘類磺酸鹽(Spans)及其他相似乳化劑等其他常用以製備藥學上可接受之劑型的表面活性劑來製備非口服劑型。

3.3 穿膜劑型

穿膜劑型適用以局部及穿透黏膜的方式投予至個體體內；該劑型包含，但不限於，噴霧劑、噴霧劑、乳劑、洗劑、軟膏、凝膠、溶液及懸浮液等。

在進行局部投予時，可使用本發明所屬技術領域習知技藝人士所熟知之各種皮膚藥學上可接受之惰性賦形劑。舉例來說，典型的惰性賦形劑可以是水、乙醇、聚乙烯氫吡咯酮、丙二醇、礦物油、硬脂醇及可產生凝膠的物質。上述各劑型及賦形劑皆為醫藥領域所熟知的劑型及賦形劑。劑型的選擇不會對本揭示內容所述組合物之功效產生重大影響。

在進行局部投予時，亦可將本發明藥學組合物配製為黏膜投予的各種劑型，例如單次全劑量投予及/或舌下藥物劑量單位，以藉由口腔黏膜傳遞藥物。可使用藥學上可接受之各種生物可分解聚合賦形劑，以提供適當附著程度及特定的藥物釋放特性；此外，該些生物可分解聚合賦形劑可與單次全劑量投予及/或舌下藥物劑量單位中的活性藥劑及其他成分相容。一般來說，聚合賦形劑包含可附著於口腔黏膜潮溼表面的親水性聚合物。例示性之聚合賦形劑包含，但不限於，丙烯酸聚合物及共聚物、水解聚乙烯醇、聚乙烯氧化物、聚丙烯酸酯、乙烯基聚合物及共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、聚葡萄糖、瓜爾膠(guar gum)、果膠、澱粉及纖維素聚合物。

下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。

實施例

材料及方法

動物

所有的動物實驗皆依照動物照護及使用規範之動物照護和實驗標準來進行。本研究所使用的動物皆經中原大學動物照護及使用委員會許可。由台灣BioLASCO購買6到8週大之Sprague Dawley大鼠(公鼠及母鼠)。將大鼠成對飼養，以進行交配；懷孕的大鼠將進行後續實驗分析。

動物處理

在進行LPS處理時，是預先對懷孕母鼠(懷孕14天，GD14)投予或未投予每天每公斤20毫克之NAC或抗壞血酸，1小時後，以腹腔注射方式投予每天每公斤0、0.25、2.5、12.5或25微克的LPS (Sigma-Aldrich)。在標記溴化去氧尿嘧啶(bromodeoxyuridine, BrdU)時，是由懷孕第15-17週(GD 15到GD 17)對懷孕母鼠連續投予三天單劑5-溴化去氧尿嘧啶溶液(溶於PBS，每天每公斤50毫克) (Sigma-Aldrich)。在懷孕第18或20週(GD 18或GD 20)時，以二氧化碳犠牲母體，並立即收集其血液、肝臟、脾臟及胚胎，以進行後續分析。

細胞培養及處理

由美國菌種保存中心(American Type Culture Collection, ATCC, Rockville, MD)取得小鼠類巨噬細胞株RAW264.7。將該細胞株培養於包含青黴素(penicillin)、鏈黴素(streptomycin)及10%胎牛血清的DMEM細胞培養液(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)中，並放置於37^o C包含5%二氧化碳的潮溼環環中培養。當細胞達到90%滿度時，即分盤處理。在初代皮質細胞培養方面，由GD 18的懷孕母鼠取出公鼠及母鼠胚胎後，分離其皮質進行初代皮質細胞培養。分離皮質後，將細胞以每平方毫米1200-1600個細胞的密度種植於預先以聚-D-離胺酸塗佈的玻片上(直徑為12毫米)。將細胞培養於包含B27、青黴素、鏈黴素及GlutaMax (Invitrogen, Carlsbad, CA)的Neurobasal細胞培養液中，10天後進行處理。在投予LPS處理時，是對RAW264.7細胞投予LPS，作用24小時。收集經LPS預處理之RAW264.7培養液(LCM)後，置入皮質細胞培養中，作用48小時。

分析細胞外及羊膜 ROS 生成

利用Cm-H₂ DCFDA偵測套組(Invitrogen)來偵測ROS。在接觸LPS ± NAC後，收集培養液LCM或羊水；之後加入96孔盤，並與10微升之包含Cm-H₂ DCFDA 反應劑(每孔洞的最終濃度為25 μM)的Hank's緩衝鹽溶液(Hank's Buffered Salt Solution, HBSS)混合。立即以微讀取器偵測485/530奈米的螢光值，以決定ROS的濃度。標準化ROS生成量值後，以相對於對照組的百分比來表示。

偵測羊水 IL-6

依據使用操作說明，以大鼠IL-6 ELISA套組(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)來評估IL-6的含量。分析各細胞激素的2倍連續稀釋結果以繪製標準曲線，之後比對標準曲線來決定羊水中IL-6的含量。

決定皮質細胞的細胞毒性

以商業CytoTox-MTS均質完整分析套組(Promega, Madison, WI)來決定細胞毒性。藉由將四唑鹽MTS還原轉換為可溶性甲臢染劑(formazan dye)以定量分析皮質細胞的粒線體酵素活性，進而決定其存活率。分光光度測量於490奈米的吸光值，據以分析染劑的含量。標準化數值後，將其表示為對照組的百分比。

神經元的存活率

以4%之溶於PBS的三聚甲醛室溫固定經LPS ± NAC處理之皮質細胞15分鐘，之後再以PBS洗滌之。接著對固定的神經元進行小鼠抗-MAP2抗體(神經元標誌) (1:500, Abcam, Cambridge, MA)的免疫染色。與FITC或Alexa Fluor 488抗-小鼠二級抗體(Jackson ImmunoResearch Inc.)反應後，利用20倍物鐘觀察會表現MAP2的神經元。以DAPI (Sigma)染色細胞核以決定定細胞存活率。由2到3次獨立試驗中隨機挑選至少20個不同視野進行後續分析。在挑選影像及計算時，並未告知實驗者各組處理條件。經免疫染色後，將會表現MAP2且具有均勻而完整DAPI染色的神經元視為存活細胞。

免疫印漬分析

以包含檢體緩衝液之SDS來製備組織分解物，並以12% SDS-PAGE膠體來分離相等體積的分解物。將蛋白轉染到硝化纖維膜後，加入以下一級抗體進行反應：小鼠抗-SOD抗體(1:1000, Abcam)、兔子抗-過氧化氫酶抗體(1:2500, Abcam)、小鼠抗-HO-1抗體(1:10000, Abcam)及小鼠抗-α-微管蛋白抗體(1:5000, Abcam)。接著加入適當之與HRP鍵結的二級抗體。以增強型化學冷光(Promega™ ECL Western Blotting Substrate)觀察結果，並以 Odyssey紅外光影像系統(LI-COR Biosciences) (Lincoln, NE)進行分析。

以免疫組織化學分析胚胎腦部發育

在某些實驗中，是收集GD 18或GD 20的胚胎腦部後，以4%三聚甲醛固定至少12小時，浸泡於30%蔗糖/PBS並以OCT包埋後，冷凍於-80°C。以低溫恒溫器將固定的檢體切割為10微米的厚度。一個GD 18的胚胎腦部約可切割為780片檢體切片，而一個GD 20的胚胎腦部則約可切割為1,090片檢體切片。收集4到5組取自不同懷孕母鼠的胚胎大腦進行定量分析。各大腦組織是對距離嗅球約2,380微米(分析GD18時)及3,330微米(分析GD20時)的冠狀切片進行分析。使組織乾燥至隔日。阻斷非專一性反應後，加入一級兔子抗-TBR1抗體(1:500, Abcam)、兔子抗-Ctip2抗體(1:500, Abcam)、小鼠抗-SATB2抗體(1:400, Abcam)及小鼠抗-BrdU抗體(1:500)(Sigma-Aldrich)。將以Alexa Fluor 488及594標記的二級抗體(Jackson ImmunoResearch Inc.)加入玻片，再以包含DAPI的抗衰褪封片劑封蓋玻片。以IX51 Olympus顯微鏡觀察影像。分析大腦分層時，是依據先前報導(Tashiro, K et al., Plos one 6, e28497, doi:10.1371/journal.pone.0028497 (2011))，並佐以些微修改，利用NIH Image J軟體來分析冠狀皮質部之背面區域。簡單來說，將皮質深度分為3等分區間，位於區間1及區間2之間的邊界是對應於中間區的邊緣或剛好位於皮質骨板外的區域。分析介於區間1及區間2之邊界的方形區域(1.4 ´ 1.4平方微米)中，Ctip2⁺ 或Tbr1⁺ 細胞對DAPI染色的比值。以對照載體處理組來標準化各處理條件下Ctip2⁺ /DAPI及Tbr1⁺ /DAPI的比值。利用相似方法計算Satb2⁺ /DAPI細胞。將皮質的背面區域分為9等分區間，其中位於區間1及區間2之間的邊界是對應於皮質骨板。以對照載體處理組來標準化各處理條件下Satb2⁺ /DAPI的比值。延著與表面軟腦膜及胼胝體表面正交的線測量皮質的深度。每組由2到3次獨立試驗挑選至少5個影像，進行分析計算。在神經生成部分，分析完整皮質厚度中，具有固定寬度(108.1微米)之背面皮質之長圓形區域的BrdU⁺ /DAPI、Satb2+/DAPI、Ctip2⁺ /DAPI或Tbr1⁺ /DAPI細胞比值。分析皮質骨板、中間區及次腦室/腦室區對皮質厚度的比質。每組由2到3次獨立試驗挑選至少5個影像，進行分析計算。

蘇木精及伊紅 (hematoxylin and eosin, H&E ) 染色分析

以H&E染色來分析與LPS接觸之胚胎腦部的冠狀切片。簡單來說，以4% PFA固定玻片後，以蒸餾水洗滌之。以蘇木精染色5分鐘後，利用水及95%乙醇洗滌。再以伊紅染色3分鐘。進行連續脫水步驟(50到100 %乙醇及二甲苯)後，封蓋玻片。以一般位相差顯微鏡觀察玻片。依據先前報導(Ghiani, C. A. et al., ASN neuro 3, doi:10.1042/AN20110027 (2011))所述方法，利用NIH Image J軟體分析皮質厚度或側面新皮質。以位於胼胝體之舯體(middle body)上方之假定運動區域來測量背面新皮質。延著與表面軟腦膜及胼胝體表面正交的線測量背面皮質的總深度。藉由介於中央新皮質及島狀皮質(insular cortex)之間的假定邊界來分析側面皮質。延著與表面軟腦膜及腦室表面(介於紋狀次腦室及新皮質次腦室區之間)正交的線測量側面皮質的總深度。每組由至少3隻不同懷孕母鼠隨機挑選5組胚胎大腦進行分析。各大腦組織是對二處距離嗅球前方約2,380微米的冠狀切片進行分析。一個GD18胚胎大腦約包含780片組織切片。

統計分析

除非另有所指，否則將所有數據表示為平均值±標準差。利用變異數分析(analysis of variance, ANOVA)及Bonferroni調整來進行多重比較。P ＜ 0.05的概率值即視為具有統計顯著性。

實施例 1 NAC 可保護初代皮質神經元抵抗 LPS 引發的神經毒性

本實施例將探討NAC對LPS引發之神經毒性所產生的保護功效。簡單來說，對小鼠巨噬細胞RAW264.7投予不同劑量之LPS，作用24小時後，收集經LPS預處理的細胞培養液(LCM)，將LCM加入異質初代皮質細胞培養48小時。RAW264.7細胞是用以模擬簡單的母體免疫作用因子，而異質細胞培養則是用以模擬具有不同神經元及神經膠細胞的自然胚胎腦部。投予LPS會使LCM ROS含量於24小時時，增加至180% (第1圖之A小圖)。MTS試驗結果證實異質皮質細胞的存活率會以劑量相關的方式減少(第1圖之B小圖)。接著對皮質細胞培養進行抗-MAP2的免疫染色，以定位分析皮質神經元；並以DAPI染色決定神經元的存活率。結果指出，在投予LCM處理48小時後，神經元會死亡(第1圖之C及D小圖)。此外，亦發現NAC可抑制較低LPS劑量所引發的ROS，而不會抑制較高劑量的反應(第1圖之A小圖)。此外，當與不同濃度之LCM同時投予至異質皮質細胞培養時，NAC可回復細胞存活率(第1圖之B小圖)。投予NAC可回復神經元數量的結果顯示，NAC可緩解神經元存活率(第1圖之C及D小圖)。

實施例 2 NAC 可抑制母體接觸 LPS 後產生的生理變化

本實施例將分析NAC對經LPS處理之懷孕母鼠的功效，其中是將NAC及LPS注入GD14之懷孕母鼠體內。收集包含脾臟、胎盤及血液等母鼠器官，以評估由LPS所引發的發炎反應。結果總結於表1中。 表1　於GD18投予有或無NAC之LPS後，母鼠及胚胎的生理狀況改變

在分析脾臟、胎盤及胚胎的重量，以及RBC、WBC及血紅素數量時，可發現投予低劑量LPS處理(每公斤0.25-12.5微克)之組別與對照組之間並無顯著差異(表1)。然而，投予每公斤25微克之LPS會大幅增加脾臟及胎盤的重量。在該劑量下，LPS不僅會減少RBC數量及血紅素(Hb)含量，亦會顯著增加WBC數量(表1)。

此外，NAC可回復經LPS處理之檢體的脾臟及胎盤重量、Hb含量及RBC與WBC的數量。相較之下，另一種抗氧化劑-抗壞血酸則呈現較差的功效(表1)。此外，投予LPS (每公斤25微克)會增加羊水中IL-6 (第2圖之A小圖)及ROS (第2圖之B小圖)的濃度，而投予NAC則會使IL-6及ROS的含量回復至對照組的狀態。

該些數據指出，NAC可抵抗母體子宮內因LPS刺激引發的氧化及發炎反應。

實施例 3 NAC 可抑制由 LPS 造成之胚胎數量減少及提升胚胎腦部的抗氧化酵素表現

本實施例將探討NAC對LPS造成死胎的作用功效。結果發現在投予每公斤25微克之LPS的組別中，其胚胎數量會顯著地下降；若同時投予NAC處理，則會使胚胎數量回復至正常狀態(第2圖之C小圖)。此外，抗壞血酸具有較差的保護功效(胚胎數量為3.75 ± 3.5，p ＞ 0.05，相較於投予每公斤25微克之LPS的組別)。相似地，投予每公斤25微克之LPS組的胚胎重量會增加，而同時投予NAC則會使胚胎回復至與對照組相似的重量(表1)。

為分析NAC對LPS引發之胚胎氧化性腦損傷的作用功效，接著檢測胚胎腦部之抗氧酵素的表現量。結果顯示投予LPS (每公斤25微克)會顯著增加胚胎腦部之抗氧化酵素(即SOD、HO-1及過氧化氫酶)的表現量(第2圖之D到G小圖)，而投予NAC (每公斤20毫克)治療則會使該些酵素表現量回復至正常值。

該些結果指出，在投予LPS 3天後，胚胎腦部會大幅活化抗氧化機制來抑制ROS的產生。NAC會減緩該些氧化事件。整體來看，該些結果闡述了NAC可減緩持續性的氧化壓力，據以預防胚胎的流失。

實施例 4 NAC 可減緩 LPS 引發之胚胎腦部細胞結構異常

為評估LPS對胚胎腦部形態的影響，利用H&E染色來分析與LPS接觸後胚胎腦部的冠狀切片。結果指出，投予LPS會造成腦部腫脹，且投予較高劑量之LPS會產生更為顯著的腫脹現象；然而，投予NAC (每公斤20毫克)可有效減緩該腫脹狀況(第3圖之A小圖)。

亦檢測背面和側面區域的額葉新皮質厚度(第3圖之A小圖闡述了其位置，且以開放框架標示)。該結果指出，投予較高劑量之LPS會顯著增加20%之側面及背面新皮質的深度(第3圖之C及D小圖)。投予NAC會使新皮質厚度回復至對照組狀態(第3圖之C及D小圖)。此外，LPS會造成細胞核腫脹及血管新生等細胞結構改變(第3圖之B小圖)，意指LPS會造成個體白質損傷。該特徵在較高劑量之LPS (每公斤25微克)處理下會更為明顯，而投予NAC則可抑制該些改變。

先前研究指出，神經膠細胞活化與母體因大腸桿菌感染造成白質損傷相關(Pang Y et al., Brain research. Developmental brain research 157, 141-149, doi:10.1016/j.devbrainres.2005.03.015 (2015))，因此，接著以CD11b/c (一種小神經膠質標誌)進行免疫染色來分析小神經膠質的活化狀態。結果指出，投予LPS (每公斤25微克)會引發胚胎皮質骨板(CP)、中間區(IZ)及次腦室及腦室區(SVZ/VZ)中，小神經膠質的活化，且給予NAC可降低該活化現象(第2圖之E小圖)。

實施例 5 NAC 可抵抗 LPS 引發之胚胎皮質分層異常

本實施例將分析NAC對LPS引發之神經生成降低的作用功效。據此，在接觸LPS後，將BrdU (每天每公斤50毫克)皮內注射至GD 15到GD 18母鼠體內。於GD 18犠牲母鼠，再以BrdU及DAPI對胚胎腦部的冠狀切片進行免疫染色。第4圖闡述了該些結果。

意外地，投予LPS組及對照組的神經生成並無差異性(第4圖)。另外，投予NAC亦不會影響具有BrdU標記之細胞數量(第4圖)。然而，經高劑量之LPS處理後，具有BrdU標記之細胞會分布於接近腦室的部位，相較之下，經對照載體處理後，具有BrdU標記的細胞則主要會分布於皮質骨板。NAC處理可回復該異常特徵。

哺乳動物腦部具有6層新皮質，各層皆具有其特定功能，且會形成適當的局部與遠距離連結。在胚胎時期，基因會高度調控由內而外形成的分層結構(最老的神經元是位於最深層的第6層中)。諸如Tbr1 (T-box brain 1)、Ctip2 (COUP-TF interacting protein 2)及Satb2 (special AT-rich sequence binding protein 2)等基因在分化時皆扮演著重要的角色，且其表現中斷會造成皮質嚴重畸形。為測試NAC是否可改變LPS對神經元分層位置產生的影響，利用標誌Tbr1 (第6層)、Ctip2 (第5層)及Satb2 (第2/3及6層)來標記胚胎腦部冠狀切片之不同皮質層。定量分析會表現各標誌的細胞數量及分布位置。第5及6圖闡述了該些結果。

結果指出，LPS會改變皮質分層標誌的表現模式，其中在投予LPS的組別可觀察到Satb2、Tbr1及Ctip2表現中斷，且會呈現不均勻地分布(第5圖之A及B小圖；以及第6圖之A及B小圖)。投予NAC治療會減少分層結構紊亂的情況。此外，定量分析結果顯示了以Tbr1及Ctip2標記之細胞的紊亂分層狀態，而NAC則可減緩該紊亂分層狀態(第5圖之A及C小圖)。以Satb2標記之細胞的分層位置有擾動趨勢，而NAC可將該趨勢回復為對照組狀態(第6圖之C小圖)。亦計算在單位皮質寬度中，經Satb2、Tbr1及Ctip2標記之細胞總數。結果指出，投予每公斤25微克的LPS會顯著減少經Tbr1及Ctip2標記之細胞數量(第5圖之E及F小圖)。Satb2不會受到影響(第6圖之D小圖)。NAC可回復Tbr1及Ctip2標記細胞的減少狀況。該些數據指出，LPS引起的ROS損傷會明顯影響胚胎皮質的分層。

實施例 6 LPS 引發子宮內發炎反應對胚胎腦部的長期影響

為了解LPS於發育腦部引發之分層異常是暫時性的延遲作用或是無法回復的結果，接著以Tbr1及Ctip2皮質分層標誌來分析經LPS處理之懷孕20天的胚胎腦部。於投予LPS的組別可發現，Tbr1及Ctip2標記細胞會彼此相互重疊(第7圖之A小圖)。在對照組中，第5層與第6層的區隔更為明顯(第7圖之A小圖)，此為腦部發育後期正常的分層結構。

本研究亦計算GD20時，皮質骨板、中間區及次腦室/腦室區對皮質總厚度的比例。結果指出，在接觸LPS之胚胎腦部中，皮質骨板會較對照組薄，而中間區及次腦室/腦室區則較對照組厚(第7圖之B小圖)。然而，該趨勢與GD18的胚胎腦部不同，其在投予LPS組別可觀察到增大的皮質骨板比例，及減少的中間區(第7圖之C小圖)。次腦室/腦室區間則無顯著差異。除了中間區外，NAC可將分布異常回復至對照組的狀態(第7圖之C小圖)。有趣的是，在投予LPS的情況下，胚胎皮質的總厚度會於GD20時減少(第7圖之D小圖)，而於GD18時增加(第3圖之C及D小圖)。該些結果顯示，母體感染會對發育中的胚胎腦部組成造成無法回復的影響。

總結上述，本揭示內容數據清楚證實NAC可保護胚胎神經元，避免受到細菌引起的損傷(例如LPS引發的損傷)；因此，NAC可作為一種藥物，以預防懷孕母體因細菌感染造成的早產、死產及/或胚胎腦部損傷。

雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。

無

為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：

第 1 圖闡述了 NAC 可藉由去活化巨噬細胞分泌細胞外 ROS 來回復 (rescue)LPS 造成的皮質神經毒性。 將初代皮質神經元種植於預先塗佈聚-D-離胺酸(poly-D-lysine)的24孔塑膠盤中。於GD10時，對細胞投予包含或不包含5 mM NAC的LPS條件細胞培養液(LPS-conditioned media, LCM)，作用48小時後，進行CytoTox- MTS均質完整試驗，或是以4%三聚甲醛予以固定。對固定的細胞進行MAP2的免疫細胞化學分析及DAPI染色，以決定神經元的存活率。(a) 利用Cm-H₂ DCFDA偵測套組來決定在RAW264.7細胞培養液中，LPS誘發產生的ROS含量。將RAW264.7細胞與LPS接觸24小時，以誘發其釋放細胞外ROS，且NAC可減少低劑量LPS處理組中ROS的表現量。以ANOVA與Kruskal-Wallis分析，以及Dunn’s多重比對測試得到*p＜ 0.05 ； **p＜0.01 ； ***p＜0.001 。 n = 3試驗，每次為二重複。(b) 細胞存活率會以濃度相關的方式減少，且NAC可抑制由LPS引發的細胞減少。n = 3試驗，每次為二重複。(c) 由二到三次獨立試驗隨機挑選20個不同視野的定量分析結果，並計算不同濃度處理之存活細胞量。可觀察到LCM具顯著神經元毒性，以及NAC的回復功效。*=與不含NAC之對照載體處理組間具有統計差異。^# =相較於NAC，各LPS劑量具有統計差異。以ANOVA與Kruskal-Wallis分析，以及Dunn’s多重比對測試得到*p＜ 0.05 ； **p＜0.01 ； ***p＜0.001 。 n = 20。(d) 由(c)得到之在有或無NAC處理的情況下，與LCM接觸後，具有MAP2表現之神經元的代表性照片。比例尺為50微米。

第 2 圖闡述了 NAC 可抑制由 LPS 引發的 ROS 反應及子宮內死胎。 (a) 利用 ELISA來偵測羊水中IL-6的含量。該些結果指出，子宮內投予最高量之LPS (每公斤25微克)會顯著增加羊水中IL-6的含量，而投予NAC可減少該上升反應。n = 3試驗，每次為二重複。(b) 利用Cm-H₂ DCFDA偵測套組來決定羊水中LPS誘發產生的ROS含量。投予最高濃度之LPS (每公斤25微克)會明顯引發羊水中ROS的含量，而投予NAC則會減少該反應。n = 3試驗，每次為二重複。(c) 胚胎的數量會因與LPS接觸而減少。N 值(懷孕母鼠的數量)：每公斤0微克之LPS的組別為11，每公斤0.25微克之LPS的組別為3，每公斤2.5微克之LPS的組別為5，每公斤12.5微克之LPS的組別為5，每公斤25微克之LPS的組別為5，每公斤25微克之LPS加上NAC的組別為5。(d) 5次獨立試驗萃取物之抗氧化標誌的代表性西方墨點分析結果。(e) SOD/微管蛋白蛋白帶強度的定量分析指出，SOD表現量會以劑量相關的方式增加，且投予NAC則會減緩該反應。n = 5。(f) 過氧化氫酶(catalase)/微管蛋白蛋白帶強度的定量分析結果指出，高劑量之LPS會顯著誘發過氧化氫酶表現，且NAC會阻礙LPS的作用。n = 5。(g) HO-1/微管蛋白蛋白帶強度的定量分析結果指出，LPS會增加HO-1的表現量，且投予NAC會以劑量相關的方式減少HO-1的表現量。*=與不含NAC之對照載體處理組間具有統計差異。^# =相較於NAC，各LPS劑量具有統計差異。由ANOVA及Tukey-Kramer多重比對測試得到*p ＜0.05，**p ＜0.01， ***p ＜0.001。n = 5。

第 3 圖闡述了於產前接觸 LPS 後， NAC 可降低胚胎腦部皮質厚度的增加。 (a) 對特定GD 18大鼠胚胎腦部的冠狀切片進行H&E染色。結果顯示相較於接觸對照載體及投予NAC治療的胚胎，接觸高劑量LPS的胚胎腦部會呈現顯著的腫脹。比例尺為500微米。(b) 在第(a)圖開放框架位置中，左側(L)及右側(R)的背視圖及側視圖。相較於接觸PBS及投予NAC治療的胚胎，接觸LPS的胚胎具有腫脹細胞核、空洞組織結構及血管增生。比例尺為50微米。(c) 定量分析背面皮質的厚度差異。(d) 定量分析側面皮質的厚度差異。(c)及(d)是隨機選由至少3隻不同懷孕母鼠中挑選5組胚胎大腦。每組大腦是對位於嗅球(olfactory bulb)前方約2380微米位置的二冠狀切片(如(a)所標示之位置)進行分析。接觸LPS之胚胎的背面及側面皮質區域皆顯著大於接觸PBS及投予NAC治療之動物的背面及側面皮質區域。柱狀圖是以平均值±標準差來表示。*=與不含NAC之對照載體處理組間具有統計差異。^# =相較於NAC，各LPS劑量具有統計差異。以ANOVA與Kruskal-Wallis分析，以及Dunn’s多重比對測試得到*p ＜ 0.05；***p＜ 0.001。(e) 對特定 GD18大鼠胚胎腦部的冠狀切片進行CD11b/c (小神經膠質(microglia)標誌)及DAPI (細胞核)免疫染色。皮質骨板(cortical plate, CP)、中間區(intermediate zone, IZ)及次腦室及腦室區(sub-ventricular and ventricular zone, SVZ/VZ)的代表性照片是選自三次獨立試驗結果。投予LPS會活化動物的小神經膠質，而投予NAC則會降低該活化反應。比例尺為50微米。

第 4 圖闡述了母體接觸 LPS 及 NAC 不會影響胚胎的神經生成。 於接觸LPS後，將BrdU (每天每公斤50毫克)皮內注射至GD 15到GD 18的動物體內。於GD 18犠牲動物後進行免疫組織化學分析。對特定GD 18大鼠胚胎腦部的冠狀切片進行BrdU及DAPI免疫染色。合併影像是由BrdU (紅色)及DAPI (綠色)的染色結果所組成。(a) 為選自三次獨立試驗之皮質背面區域的代表性照片。相較於接觸對照載體的組別(其BrdU⁺ 神經元主要位於皮質骨板)，在投予高劑量LPS的組別中，BrdU⁺ 細胞則會位於鄰近腦室的區域。NAC可將分層(laminar)異常的特徵回復至對照組的狀態。比例尺為50微米。(b) 為皮質的特定背面區域((a)圖之點線方框位置)中，BrdU⁺ 及DAPI⁺ 細胞的定量分析結果。由至少3隻不同懷孕母鼠中隨機挑選4組胚胎大腦。每組大腦是對位於嗅球前方約2380微米位置的二冠狀切片進行分析。以接觸PBS之組別標準化各條件得到的BrdU⁺ /DAPI比值。由ANOVA及Tukey-Kramer多重比對測試得知投予LPS不會影響神經生成。

第 5 圖闡述了在母體接觸 LPS 後，投予 NAC 可減緩胚胎腦部發育時皮質分層異常。 對特定GD 18大鼠胚胎腦部的冠狀切片進行Tbr1、Ctip2及DAPI免疫染色。Tbr1指出位於皮質第6層的細胞，而Ctip2則標示了第5層的細胞。合併影像是由Tbr1 (紅色)及Ctip2 (綠色)所組成。 DAPI (藍色)代表各細胞核。由至少3隻不同懷孕母鼠中隨機挑選5組胚胎大腦。每組大腦是對位於嗅球前方約2380微米位置的二冠狀切片進行分析。代表性照片為皮質(a) 背面區域及(b) 側面區域的切片分析結果。相較於接觸對照載體及投予NAC治療的胚胎，投予LPS會使Ctip2⁺ 及Tbr1⁺ 細胞呈現分散性分布。比例尺為50微米。(c) 及(d) 為小虛線方框的代表性結果。將皮質的背面區域分為3等分區間，位於區間1及區間2之間的邊界是對應於中間區的邊緣或剛好位於皮質骨板外的區域(如點線區域)。以對照載體組來標準化各條件得到之Tbr1⁺ /DAPI及Ctip2⁺ /DAPI的比值。投予LPS會使多數Tbr1⁺ 及Ctip2⁺ 細胞維持於中間區內部，而投予NAC則可將該比值回復至以對照載體處理的狀態。*=與不含NAC之對照載體處理組間具有統計差異。^# =相較於NAC，各LPS劑量具有統計差異。以ANOVA及Bonferroni多重比對測試或Dunn’s多重比對測試可得到**p ＜0.01，***p ＜0.001。(e) 及(f) 為大點線方框的定量分析結果，與計算BrdU的區域相同。以DAPI⁺ 的細胞數量來標準化Tbr1⁺ 或Ctip2⁺ 的細胞數量。LPS會顯著減少Tbr1⁺ 及Ctip2⁺ 的細胞數量，而投予NAC則會回復該抑制反應。*=與不含NAC之對照載體處理組間具有統計差異。^# =相較於NAC，各LPS劑量具有統計差異。以ANOVA及Tukey-Kramer多重比對測試得到*p ＜0.05，**p ＜0.01，***p ＜0.001。

第 6 圖闡述了投予 NAC 可回復由 LPS 所引發的神經發育缺陷。 對特定GD 18大鼠胚胎腦部的冠狀切片進行Satb2、Ctip2及DAPI免疫染色。會表現Satb2的神經元主要位於第2/3層，部分位於第6層，而Ctip2則標記了第5層的細胞。合併影像是由Satb2 (紅色)及Ctip2 (綠色)所組成。DAPI (藍色)代表各細胞核。由至少3隻不同懷孕母鼠中隨機挑選5組胚胎大腦。每組大腦是對位於嗅球前方約2380微米位置的二冠狀切片進行分析。代表性照片為皮質(a) 背面區域及(b) 側面區域的切片分析結果。相較於接觸對照載體的組別，投予LPS會使Ctip2⁺ 細胞呈現擴展性的分布表現，該分布情況在較高劑量之LPS組別會更為顯著。在與高劑量LPS接觸後，Satb2⁺ 神經元會呈現更為分散及混亂的分布。NAC可將皮質分層異常特徵回復至對照組的狀態。比例尺為50微米。(c) 為小虛線方框的定量分析結果。將皮質的背面區域分為9等分區間，其中位於區間1及區間2之間的邊界是對應於點線區域的皮質骨板。以對照載體組來標準化各條件所得之Satb2⁺ /DAPI的比值。LPS會使表現於皮質骨板的Satb2⁺ 細胞數量減少，而投予NAC則可有效回復Satb2的分層分布位置。以ANOVA及Tukey-Kramer多重比對測試得到^# p ＜0.05。(d) 為大點線方框的定量分析結果，其與計算BrdU的區域相同。以DAPI⁺ 細胞數量標準化Satb2⁺ 細胞數量。Satb2⁺ 總細胞數量於各組間皆無顯著差異。以ANOVA及Tukey-Kramer多重比對測試得到^ns p＞0.05 。

第 7 圖闡述了 NAC 可回復 LPS 對胚胎腦部發育晚期造成的持久性影響。 對特定GD 20大鼠胚胎腦部的冠狀切片進行Tbr1、Ctip2及DAPI免疫染色。由至少3隻不同懷孕母鼠中隨機挑選5組胚胎大腦。每組大腦是對位於嗅球前方約2380微米位置的二冠狀切片進行分析。代表性照片為取自三次獨立試驗之皮質背面區域(a) 及側面區域(b) 的切片分析結果。可在以對照載體處理的組別中區別Tbr1⁺ 與Ctip2⁺ 二種細胞，然而，在投予LPS的組別中，二種細胞則會交錯表現。比例尺為50微米。(c) 分析GD 20腦部之背部皮質骨板(CP)、中間區(IZ)及次腦室及腦室區(SVZ/VZ)由腦室邊緣到上方表面的總厚度。相較於對照載體處理，LPS會顯著減少CP的體積。以非成對t測試得到各區域***p ＜0.001。(d) 分析GD 18腦部之背面皮質骨板(CP)、中間區(IZ)及次腦室及腦室區(SVZ/VZ)由腦室邊緣到上方表面的總厚度。LPS會大幅增加CP部分，而投予NAC則會回復至以對照載體處理的狀態。以ANOVA及Tukey-Kramer多重比對測試或Dunn’s多重比對測試可得到***或^### p ＜0.001。(e) 背面皮質厚度之差異性的定量分析結果。以平均值±標準差來表示柱狀圖。n = 10。以Student’s-t測試得到***p＜0.001 。

Claims (10)

1. 一種乙醯半胱胺酸的用途，其可用以製備一藥物，以預防一懷孕個體出現早產、死產或死胎。
2. 如請求項1所述之用途，其中是對該懷孕個體投予每公斤10微克到每公斤10毫克的藥物。
3. 如請求項2所述之用途，其中該懷孕個體是遭受一細菌感染。
4. 如請求項3所述之用途，其中該細菌感染是由具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum )、 尿溶原漿菌(Ureaplasma urealyticum) 、 人型黴漿菌(Mycoplasma hominis )或解脲擬桿菌(Bacteroides urealyticus )所造成。
5. 一種乙醯半胱胺酸的用途，其可用以製備一藥物，以預防一懷孕個體之胚胎罹患神經發展性疾病。
6. 如請求項5所述之用途，其中該懷孕個體是遭受一細菌感染。
7. 如請求項6所述之用途，其中該細菌感染是由具核梭桿菌、尿溶原漿菌、 人型黴漿菌或解脲擬桿菌所造成。
8. 如請求項5所述之用途，其中該神經發展性疾病是選自由注意力不足過動症、構音障礙、自閉症類障礙、腦性麻痺、學習障礙、智能障礙、強迫症、精神分裂症及視覺及聽覺減損所組成的群組。
9. 如請求項8所述之用途，其中該自閉症類障礙是選自由亞斯伯格症、自閉症、兒童期崩解症及廣泛性發展障礙非特定型所組成的群組。
10. 如請求項5所述之用途，其中是對該懷孕個體投予每公斤10微克到每公斤10毫克的藥物。