TW201817428A - 針對酪氨酸羥化酶之雙股ｒｎａ的用途 - Google Patents

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Abstract

一種針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA的用途，係用以製備提升蝦體免疫能力之藥物，其中，該針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA係投予一蝦體，以增強該蝦體之免疫能力。

Description

針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA的用途
本發明係關於一種針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA的用途，特別係該針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA用以製備提升蝦類免疫能力之藥物的用途。
近年來，台灣蝦類養殖蓬勃發展，蝦體不僅可以作為食物來源，亦可以外銷為國家帶來豐富的經濟效益。由於蝦體養殖快速發展，而限於土地價格高，養殖業者須採用高密度養殖，以降低成本。
高密度的養殖方式會造成養殖環境惡化，使蝦體之間容易相互傳染疾病，因而會使蝦體的死亡率上升；為了降低死亡率，養殖業者常會於飼料中添加抗生素，然而抗生素的濫用，不僅是導致食用者攝取蝦體而發生過敏的原因，亦可能會誘發病原菌產生抗藥性，因此仍需進一步的改善。
本發明提供一種針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA的用途，係可以提升蝦類之免疫能力，以免除抗生素的使用者。
本發明之針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA的用途，係用以製備提升蝦類免疫能力之藥物，其中，該針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA係投予一蝦體，以增強該蝦類之免疫能力。
本發明之針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA的用途，係藉由該 針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA的投予，可以提升蝦類之總血球細胞數及酚氧化酵素的活性等免疫參數、促進蝦類之血球細胞的吞噬率與清除細菌之能力，且降低蝦類遭受病原菌攻擊的死亡率，是以可以降低養殖業者於養殖過程中的抗生素使用量，為本發明之功效。
本發明之針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA的用途，其中，該針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA具有如SEQ ID NOS：1及2所示之核苷酸序列；或者，該針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA具有如SEQ ID NOS：3及4所示之核苷酸序列；又或者，該針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA具有如SEQ ID NOS：5及6所示之核苷酸序列；如此藉由該針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA的核苷酸序列，具有較佳的提升該蝦體之免疫能力的效果。
本發明之針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA的用途，其中，該針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA係注射投予該蝦體，較佳係注射至該蝦體的頭胸部腹面血竇；如此該針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA可以經由該蝦體之血淋巴流向各組織，而具有較佳的提升該蝦體之免疫能力的效果。
本發明之針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA的用途，其中，該蝦體之重量係11.63±2.1公克，且該針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA係以每公克之蝦體重投予1~6μg之劑量投予該蝦體，較佳能夠以毎公克之蝦體重投予5μg之劑量投予該蝦體；如此藉由該針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA的投予劑量而具有較佳的提升蝦體之免疫能力的效果。
第1a圖：試驗(A)各組白蝦之酪氨酸羥化酶的活性。
第1b圖：試驗(A)各組白蝦之多巴胺的表現量。
第1c圖：試驗(A)各組白蝦之正腎上腺素的表現量。
第2a圖：試驗(B)各組白蝦之血淋巴中的總血球數。
第2b圖：試驗(B)各組白蝦之酚氧化酵素的活性。
第3a圖：試驗(C)各組白蝦之血球細胞的吞噬活性。
第3b圖：試驗(C)各組白蝦之溶藻弧菌的清除能力。
第4圖：試驗(D)各組白蝦之存活率。
為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：本發明所述「蝦類」係可以指養殖蝦，包含但不限於，白蝦(Litopenaeusvannamei)、草蝦(Penaeusmonodon)、斑節蝦(Marsupenaeusjaponicus)、中國草蝦(Fenneropenaeuschinensis)、印度對蝦(Fenneropenaeusindicus)、沙蝦(Metapenaeusensisbarbata)、紅尾蝦(Penaeuspenicillatus)及淡水大蝦(Macrobrachiumrosenbergii)。
本發明所述「針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA」，係具有對應酪氨酸羥化酶之基因序列的核苷酸序列，因而當該針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA投予一蝦體時，可以於該蝦體中阻斷酪氨酸羥化酶的蛋白質活性，此為本領域所屬具有通常知識者所廣泛應用，在此不加以贅述；舉例而言，該針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA可以具有如SEQ ID NOS：1及2所示之核苷酸序列，或者具有如SEQ ID NOS：3及4所示之核苷酸序列，又或者具有如SEQ ID NOS：5及6所示之核苷酸序列，但不以此為限。
該針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA可以阻斷酪氨酸羥化酶的蛋白質活性，因而可以將一有效劑量之針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA投予該蝦體，以提升該蝦體之免疫能力。
舉例而言，該針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA係可以利用注射方式投予該蝦體，例如將該針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA注射至該蝦體的頭胸部之腹面血竇，該腹面血竇係接近心臟，為該蝦體之血淋巴集中處， 是以該針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA可以經由該蝦體之血淋巴流向各組織；於本實施例中，係選用重量約為11.63±2.1公克之蝦體，且該有效劑量係以每公克之蝦體重投予1~6μg之針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA，較佳可以為每公克之蝦體重投予5μg之針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA。
為證實該針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA可以有效提升蝦體免疫能力，及降低蝦體遭受病原菌攻擊的死亡率，遂進行以下試驗：
(A)酪氨酸羥化酶活性分析
本試驗係選用從屏東養殖場取得的白蝦，試驗前，先將該白蝦置於實驗室養殖兩週，使其適應試驗養殖環境(淡水環境，鹽度為20ppt；水溫為27±1℃；pH值為8.2~8.7)。
請參照第1表所示，將該針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA(SEQ ID NOS：1及2)注射投予第A2組之白蝦，另將非針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA分別注射投予第A3、A4組之白蝦以作為控制組(第A3組係投予針對甘油醛3-磷酸脫氫酶之雙股RNA，第A4組係投予針對worm非特定基因之雙股RNA)，各組雙股RNA之注射劑量均為5μg/g；另以未投予任何雙股RNA之第A1組作為控制組。本試驗係於注射投予各組之雙股RNA的3天後，測量酪氨酸羥化酶的活性。
請參照第1a圖所示，該針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA的投予確實可以降低白蝦的酪氨酸羥化酶活性。
又，已知酪氨酸羥化酶為催化形成多巴胺(dopamin)及正腎上腺素(epinephrine)的重要酵素，且多巴胺與正腎上腺素的過度表現會降低白蝦的免疫能力。
因此，為確認該針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA的投予是否係藉由降低多巴胺與正腎上腺素的表現量，來提升白蝦的免疫能力，進一步測量各組白蝦的多巴胺與正腎上腺素的含量，結果分別如第1b及1c圖所示，各組白蝦的多巴胺含量與正腎上腺素含量均沒有顯著差異。
(B)對免疫參數(immune parameter)的影響
請參照第2表所示，本試驗同樣將各組之雙股RNA注射投予該白蝦(注射劑量均為5μg/g)，並且於注射投予各組之雙股RNA的3天後，抽取該白蝦的血淋巴，並計算各組白蝦之血淋巴中的總血球數，及檢測各組白蝦之酚氧化酵素的活性。前述之總血球數及酚氧化酵素的活性皆為免疫參數(immune parameters)，各免疫參數值越高，即表示免疫系統越強化。
請參照第2a、2b圖所示，相較於第B1、B3及B4組，投予針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA的第B2組的總血球細胞數及酚氧化酵素的活性均有大幅的提升，顯示該針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA的投予確實可以提升白蝦的免疫能力。
(C)對抗溶藻弧菌的效能
請參照第3表所示，本試驗同樣將各組之雙股RNA注射投予該白蝦(注射劑量均為5μg/g)，並且於注射投予各組之雙股RNA的3天後，以溶藻弧菌注射各組白蝦，使該白蝦感染溶藻弧菌(感染劑量為2×105CFU/蝦體)1.5小時後，再抽取血淋巴，並進一步檢測各組白蝦之血球細胞的吞噬率及血淋巴液中清除細菌之能力，以評估對抗溶藻弧菌的效能。
請參照第3a、3b圖所示，相較於第C1、C3及C4組，投予針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA的第C2組的血球細胞的吞噬率及血淋巴液中清除細菌之效能均有大幅的提升，顯示該針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA 的投予確實有助於清除血淋巴液中的溶藻弧菌。
(D)溶藻弧菌感染後的存活率
請參照第4表所示，本試驗同樣將各組之雙股RNA注射投予該白蝦(注射劑量均為5μg/g)，並且於注射投予各組之雙股RNA的3天後，以溶藻弧菌注射各組白蝦，使該白蝦感染溶藻弧菌(感染劑量為2×105CFU/蝦)，並於0、6、12、24、48、72、96、120、144及168小時分別計算各組白蝦的死亡率。
請參照第4圖所示，未感染溶藻弧菌之第D0組白蝦於168小時內的死亡率為0；僅感染溶藻弧菌，未投予該針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA的第D1、D3、D4組白蝦於168小時內的死亡率約為70~80%；優先投予該針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA後才感染溶藻弧菌的第D2組白蝦於168小時內的死亡率降低至50%，顯示該針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA可以有效預防溶藻弧菌的感染，降低白蝦受到溶藻弧菌的感染而死亡的風險。
綜合上述，本發明之針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA的用 途，係藉由該針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA的投予，可以提升蝦類之總血球細胞數及酚氧化酵素的活性等免疫參數、促進蝦類之血球細胞的吞噬率與清除細菌之能力，且降低蝦類遭受病原菌攻擊的死亡率，是以可以降低養殖業者於養殖過程中的抗生素使用量，為本發明之功效。
雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
<110> 國立屏東科技大學
<120> 針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA的用途
<130> PK14577
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> LvTH dsRNA
<400> 1
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> LvTH dsRNA
<400> 2
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> LvTH dsRNA
<400> 3
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> LvTH dsRNA
<400> 4
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> LvTH dsRNA
<400> 5
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> LvTH dsRNA
<400> 6
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> GAPDH dsRNA
<400> 7
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> GAPDH dsRNA
<400> 8
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> worm dsRNA
<400> 9
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> worm dsRNA
<400> 10

Claims (9)

  1. 一種針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA的用途，係用以製備提升蝦體免疫能力之藥物，其中，該針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA係投予一蝦體，以增強該蝦體之免疫能力。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA的用途，其中，該針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA具有如SEQ ID NOS：1及2所示之核苷酸序列。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA的用途，其中，該針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA具有如SEQ ID NOS：3及4所示之核苷酸序列。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA的用途，其中，該針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA具有如SEQ ID NOS：5及6所示之核苷酸序列。
  5. 如申請專利範圍第1~4項中任一項所述之針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA的用途，其中，該針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA係注射投予該蝦體。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA的用途，其中，該針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA係注射至該蝦體的頭胸部腹面血竇。
  7. 如申請專利範圍第1~4項中任一項所述之針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA的用途，其中，該蝦體之重量係11.63±2.1公克。
  8. 如申請專利範圍第1~4項中任一項所述之針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA的用途，其中，該針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA係以每公克之蝦體重投予1~6μg之劑量投予該蝦體。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA的用途， 其中，該針對酪氨酸羥化酶之雙股RNA係以每公克之蝦體重投予5μg之劑量投予該蝦體。
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