本發明驚人地發現YSY之水萃取物可減輕體重、高血脂症、脂肪肝及動脈粥狀硬化。 除非另外定義，否則本文中所用之所有技術及科學術語均具有與熟習本發明所屬技術領域者通常所理解含義相同之含義。儘管類似於或等效於本文中所述之彼等方法及材料之任何方法及材料可用於本發明之實踐或測試中，但闡述較佳方法及材料。出於本發明之目的，以下術語定義於下文中。 術語「一(a及an)」係指一個或一個以上(即至少一個)冠詞之語法對象。 如本文所用，在申請專利範圍中，除非明確指示僅指替代物或除非替代物互相排斥，否則術語「或」係指「及/或」。 術語「改善(promote、promotion及promoting)」係指活性、反應、病況、疾病或其他生物學參數之增加。 術語「個體」包括活的生物體，例如人類、猴、母牛、綿羊、馬、豬、牛、山羊、狗、貓、小鼠、大鼠、培養細胞及其轉基因物種。在較佳實施例中，個體係人類。 術語「投與」包括容許本發明組合物實施其預期功能之投與途徑。 術語「治療(treat或treatment)」意指降低疾病或病況之效應之方法。治療亦可指降低疾病或病況自身之潛在病因之方法。治療亦可為自天然水準之任何降低且可為(但不限於)疾病、病況或疾病或病況之症狀之完全消除。 術語「預防(prevent、prevention或preventing)」意指與骨質疏鬆症相關症狀之抑制或防止。 術語「有效量」意指有效治療及/或預防疾病、病況或疾病或病況之症狀之本發明組合物之量。 在一態樣中，本發明提供包含木耳(wood ear,
Auricularia auricular
)、香菇(
Lentinus edodes
)、山楂(hawthorn fruit,
Crataegus pinnatifida
)、洛神葵(roselle,
Hibiscus sabdariffa
)、芹菜(
Apium graveolens
)及李子(梅(
Prunus mume
))之組合物之水萃取物
，
其中該水萃取物係藉由以下獲得：將木耳、香菇、山楂、洛神葵、芹菜及李子混合以形成組合物，將該組合物浸泡於水中在約50℃至約80℃之溫度至少16小時及將所得組合物煮至沸騰以獲得該組合物之水萃取物。所得萃取物可藉由HPLC檢測。 在一個實施例中，組合物之浸泡時間係約18小時至約48小時、約18小時至約46小時、約18小時至約44小時、約18小時至約42小時、約18小時至約40小時、約18小時至約38小時、約18小時至約36小時、約18小時至約34小時、約18小時至約32小時、約18小時至約30小時、約18小時至約28小時、約18小時至約26小時、約20小時至約48小時或約22小時至約48小時。較佳地，組合物浸泡於水中約24小時。 在一個實施例中，浸泡溫度係約50℃至約75℃、約50℃至約70℃、約50℃至約65℃、約55℃至約75℃或約55℃至約70℃。較佳地，浸泡溫度係約60℃。 在一個實施例中，組合物中之木耳、香菇、山楂、洛神葵、芹菜及李子之比率以乾重計為約0.5至約1.5:約0.5至約1.5:約1.5至約2.5:約1.5至約2.5:約4.5至約5.5:約0.5至約1.5。較佳地，該比率以乾重計為約1:約1:約2:約2:約5:約1。 在另一態樣中，本發明提供包含木耳(wood ear,
Auricularia auricular
)、香菇(
Lentinus edodes
)、山楂(hawthorn fruit,
Crataegus pinnatifida
)、洛神葵(roselle,
Hibiscus sabdariffa
)、芹菜(
Apium graveolens
)及李子(梅(
Prunus mume
))之組合物之水萃取物
，
其中該組合物包含具有滯留時間分別為約3.2分鐘至約4.5分鐘(較佳約3.978分鐘)及約5.4分鐘至約6.2分鐘(約5.943分鐘)之化合物，如藉由HPLC所量測。 在一個實施例中，水萃取物進一步包含滯留時間分別為約3.2分鐘至約4.5分鐘(較佳約3.978分鐘)、約2.7分鐘至3.2分鐘(較佳2.995分鐘)及約5.4分鐘至約6.2分鐘(約5.943分鐘)之化合物，如藉由HPLC所量測。在一實施例中，水萃取物進一步包含滯留時間為約3.2分鐘至約4.5分鐘(較佳約3.978分鐘)、約2.7分鐘至3.2分鐘(較佳2.995分鐘)及約5.4至約6.2分鐘(較佳約5.943分鐘)、約2.0分鐘至約2.5分鐘(較佳約2.307分鐘)、約9.0分鐘至約9.4分鐘(較佳約9.224分鐘)及約6.8分鐘至7.1分鐘(較佳約6.931分鐘)之化合物，如藉由HPLC所量測。除該等峰之外，水萃取物進一步包含滯留時間為約0.565分鐘、約0.751分鐘、約1.175分鐘、約7.996分鐘、約8.361分鐘、約10.879分鐘、約11.709分鐘、約12.303分鐘及約12.766分鐘之化合物，如藉由HPLC所量測。在一實施例中，本發明水萃取物具有如圖1中所示之HPLC概況。 根據本發明，本發明水萃取物具有如下表中所示之HPLC概況。
可採用業內已知之任何萃取技術以製備本發明萃取物。所得萃取物可進一步藉由層析分級分離。較佳層析係使用溶劑溶析之液相層析。較佳地，液相層析係高效液相層析(HPLC)或反相HPLC。在一實施例中，本文中所述HPLC係藉由使用移動相A為ddH
2
O及移動相B為MeOH/甲酸(體積比率99.9:0.1)、C18管柱及流速為0.5 ml/min及UV檢測器來實施。 在一態樣中，本發明提供包含木耳(wood ear,
Auricularia auricular
)、香菇(
Lentinus edodes
)、山楂(hawthorn fruit,
Crataegus pinnatifida
)、洛神葵(roselle,
Hibiscus sabdariffa
)、芹菜(
Apium graveolens
)及李子(梅(
Prunus mume
))之組合物之水萃取物，其中該組合物包含分別具有以下滯留時間之化合物：約4.61分鐘至4.95分鐘(較佳約4.67分鐘)、約6.1分鐘至約6.5分鐘(較佳約6.29分鐘)、約6.8分鐘至約7.0分鐘(較佳約6.91分鐘)、約3.45分鐘至約3.62分鐘(較佳約3.53分鐘)及約2.96分鐘至3.16分鐘(較佳約3.06分鐘)，如藉由多反應監測(MRM)之萃取離子層析圖(XIC)所量測，其中MRM之XIC係在153.000/109.000 Da之HPLC-MS/MS下檢測且使用原兒茶酸作為標準品。 在另一態樣中，在一態樣中，本發明提供包含木耳(wood ear,
Auricularia auricular
)、香菇(
Lentinus edodes
)、山楂(hawthorn fruit,
Crataegus pinnatifida
)、洛神葵(roselle,
Hibiscus sabdariffa
)、芹菜(
Apium graveolens
)及李子(梅(
Prunus mume
))之組合物之水萃取物
，
其中該組合物包含分別具有以下滯留時間之化合物：約4.35分鐘至約4.65分鐘(較佳約4.52分鐘)、約3.41分鐘至約3.62分鐘(較佳約3.55分鐘)、約4.0分鐘至約4.15分鐘(較佳約4.09分鐘)、約3.8分鐘至約4.0分鐘(較佳約3.95分鐘)及約5.18分鐘至約5.4分鐘(較佳約5.26分鐘)，如藉由多反應監測(MRM)之萃取離子層析圖(XIC)所量測，其中MRM之XIC係在153.000/109.000 Da之HPLC-MS/MS下檢測且使用綠原酸作為標準品。 在一態樣中，本發明提供包含如本文中所定義之水萃取物之製劑。 在另一態樣中，本發明提供用於治療及/或預防高血脂症、動脈粥狀硬化及/或肥胖之方法，其包含將有效量之本發明水萃取物投與個體。 本發明水萃取物可與醫藥上可接受之載劑、賦形劑及/或稀釋劑一起調配為用於投與之醫藥製劑或藥劑。 醫藥上可接受之載劑、稀釋劑及/或賦形劑意指載劑、稀釋劑及/或賦形劑必須與製劑之其他成份相容、不會不利地影響本發明水萃取物之治療益處且對其接受者無毒。 可藉由全身及/或局部遞送化合物之任何方法來投與水萃取物或其製劑以實踐本發明。該等方法包括經口途徑、非經腸途徑、十二指腸內途徑等。 在局部施加中，將水萃取物或其製劑局部地施加至需要其之位點。 對於局部施加，水萃取物或其製劑可調配於含有懸浮或溶解於一或多種載劑中之水萃取物或其製劑之適宜軟膏中。用於局部投與本發明水萃取物或其製劑之載劑包括(但不限於)：礦物油、液體石蠟脂、白石蠟脂、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蠟、糖(例如乳糖)及水。另一選擇為，醫藥製劑可調配於含有懸浮或溶解於一或多種醫藥上可接受之載劑中之水萃取物或其製劑之適宜洗劑或乳霜中。適宜載劑包括(但不限於)礦物油、山梨醇酐單硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蠟、鯨蠟硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇及水。 端視欲治療之具體病況、病症或疾病而定，可與水萃取物或其製劑一起施加額外治療劑。彼等額外藥劑可作為多劑量方案之部分自含水萃取物之組合物以任何順序依序投與(連續或間斷投與)。另一選擇為，彼等藥劑可為單一劑型之部分，與水萃取物或其製劑一起混合於單一組合物中(同時或并行投與)。 對於經口投與，可用於本發明中之醫藥組合物可採取以下形式：溶液、懸浮液、錠劑、丸劑、膠囊、粉劑、顆粒、半固體、持續釋放型調配物、酏劑、氣溶膠及諸如此類。含有各種賦形劑(例如檸檬酸鈉、碳酸鈣及磷酸鈣)之錠劑可連同各種崩解劑(例如澱粉(較佳馬鈴薯或木薯澱粉)及某些複合矽酸鹽)一起，連同黏合劑(例如聚乙烯吡咯啶酮、蔗糖、明膠及阿拉伯膠)一起採用。此外，潤滑劑(例如硬脂酸鎂、月桂基硫酸鈉及滑石粉)通常極為可用於壓錠目的。亦採用相似類型之固體組合物作為軟填充及硬填充明膠膠囊中之填充劑；就此而言，較佳材料亦包括乳糖或牛乳糖以及高分子量聚乙二醇。在期望經口投與水性懸浮液及/或酏劑時，可將本發明之水萃取物或其製劑與各種甜味劑、調味劑、著色劑、乳化劑及/或懸浮劑以及稀釋劑(例如水、乙醇、丙二醇、甘油及其各種相似組合)組合。 調配物之選擇取決於各種因素，例如藥物投與之模式(例如，對於經口投與，調配物呈錠劑、丸劑或膠囊之形式較佳)及原料藥之生物利用度。 本文所用術語「非經腸」係指包括靜脈內、肌內、腹膜內、胸骨內、皮下、髓內及關節內注射及輸注之投與模式。用於非經腸注射之醫藥組合物可包含醫藥上可接受之無菌水性或非水性溶液、分散液、懸浮液或乳液以及在即將使用前重構成無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。水性溶液尤其適用於靜脈內、肌內、皮下及腹膜內注射目的。就此而言，所採用之無菌水性介質均可易於藉由熟習此項技術者眾所周知之標準技術獲得。適宜水性及非水性載劑、稀釋劑、溶劑或媒劑之實例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇及諸如此類)、羧甲基纖維素及其適宜混合物、植物油(例如橄欖油)及可注射之有機酯(例如油酸乙酯)。例如，可藉由使用諸如卵磷脂等塗覆材料、藉由維持所需粒徑(在分散液情形下)且藉由使用表面活性劑來維持適當流動性。 可用於本發明中之醫藥製劑亦可含有佐劑，例如(但不限於)防腐劑、潤濕劑、乳化劑及分散劑。微生物作用之防止可藉由納入各種抗細菌及抗真菌劑(例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸及諸如此類)來確保。包括諸如糖、氯化鈉及諸如此類之等滲劑亦可為合意的。可藉由納入延遲吸收之藥劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)來造成可注射醫藥形式之延長吸收。 除水萃取物及其製劑外，懸浮液可含有懸浮劑，例如乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇及山梨醇酐酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁、膨潤土、瓊脂及黃蓍膠及其混合物。 出於經皮(例如局部)投與之目的，製備其他方面類似於上文非經腸溶液之稀釋無菌水性或部分水性溶液(濃度通常為約0.1%至5%)。 可用於本發明中之醫藥製劑亦可藉由經鼻氣溶膠或吸入投與。此等組合物係根據醫藥調配領域內熟知之技術製備，且可於鹽水中製備為溶液，使用苯甲醇或其他適宜防腐劑、吸收促進劑以增強生物利用度、氟碳化合物及/或其他習用增溶劑或分散劑。 用於直腸或陰道投與之組合物較佳為栓劑，其可藉由將本發明之水萃取物或其製劑與適宜無刺激性賦形劑或載劑(例如可可脂、聚乙二醇或栓劑蠟)混合製備，該等栓劑在室溫為固體但在體溫為液體，且因此可在直腸或陰道腔內融化並釋放藥物。 其他醫藥上可接受之載劑包括(但不限於)無毒固體、半固體或液體填充劑、稀釋劑、囊封材料，或任一類型之調配助劑，包括(但不限於)離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白(諸如人類血清白蛋白)、緩衝物質(諸如磷酸鹽、甘胺酸、山梨酸、山梨酸鉀)、飽和植物脂肪酸之偏甘油酯混合物、水、鹽或電解質(諸如硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽)、膠體二氧化矽、三矽酸鎂、聚乙烯基吡咯啶酮、基於纖維素之物質、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇及羊毛脂。 固體醫藥賦形劑包括(但不限於)澱粉、纖維素、滑石粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻、麵粉、白堊、矽凝膠、硬脂酸鎂、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、氯化鈉、脫脂乳粉及諸如此類。液體及及半固體賦形劑可選自甘油、丙二醇、水、乙醇及各種油，包括石油、動物、植物或合成來源之彼等，例如，花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。較佳液體載劑(尤其用於可注射溶液)包括水、鹽水、水性右旋糖及二醇。 熟習此項技術者已知或將根據此揭示內容明瞭製備各種具有某一量之活性成份之醫藥組合物之方法。其他適宜醫藥賦形劑及其調配物闡述於Remington's Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin編輯，Mack Publishing Company，第19版(1995)。 可用於本發明中之醫藥組合物可含有1%-100% (以重量計)之本發明之水萃取物或其製劑。在任何情形中，欲投與之組合物或調配物將含有一定量之本發明之水萃取物或其製劑，該量可有效治療所治療之個體之病況、病症或疾病。 熟習此項技術者將瞭解水萃取物或其製劑之醫藥上有效量可根據經驗確定且可以純形式或以醫藥上可接受之鹽、酯或前藥形式(若此等形式存在)採用。可將該等藥劑以與一或多種醫藥上可接受之賦形劑組合之醫藥組合物之形式投與患者。將理解，在投與(例如)人類患者時，本發明之藥劑或組合物之總日用量將在由主治醫師做出合理醫學判斷之範圍內決定。任一具體患者之特定治療有效劑量值將端視各種因素而定：欲達成之細胞反應之類型及程度；所採用特定藥劑或組合物之活性；所採用特定藥劑或組合物；患者之年齡、體重、一般健康狀況、性別及飲食；藥劑之投與時間、投與途徑及排泄速率；治療之持續時間；與特定藥劑組合或同時使用之藥物；及醫學領域中熟知之類似因素。在一實施例中，本發明水萃取物之有效量係約4 g/天至約18 g/天。在一些實施例中，有效量係約4 g/天至約16 g/天、約4 g/天至約14 g/天、約4 g/天至約12 g/天、約6 g/天至約18 g/天、約6 g/天至約14 g/天、約8 g/天至約18 g/天、約8 g/天至約16 g/天、約8 g/天至約14 g/天、約10 g/天至約18 g/天、約10 g/天至約16 g/天或約8 g/天至約14 g/天。較佳地，有效量係約12 g/天。亦可以患者特定之方式來配置劑量以在血液中提供預測定濃度之藥劑，如藉由業內接受之常規技術所測定。 另一選擇為，水萃取物或其製劑可與食品級載劑、賦形劑、稀釋劑及/或鹽一起調配為保健食品或膳食補充物。上文所提及之載劑、賦形劑、稀釋劑及/或鹽可用於本發明之保健食品或膳食補充物中。保健食品或膳食補充物可以各種形式存在，包括(但不限於)錠劑、膠囊、囊片、粉劑、飲品(包括奶昔)、固體食品類(包括零食棒)等。 熟習相關領域之技術者將易於明瞭可對本文中所述之方法及應用作出其他適宜修改及改寫，而不背離本發明或其任何實施例之範圍。提供以下實例以說明而非限制本發明。
實例 材料及方法 1. 化學品及試劑
抗磷酸-ACC (乙醯CoA羧化酶；編號3661)、磷酸-AMPKα (5'-單磷酸腺苷活化蛋白激酶-α；編號2531s)及PPAR-γ (過氧化物酶體增殖物活化受體-γ；編號2435)之抗體係自Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA)購得。識別β-肌動蛋白(編號ab6276)及C/EBP-β (CCAAT/增強子結合蛋白β；編號GTX61124)蛋白之抗體分別係自Abcam (Cambridge, MA, USA)及GeneTex, Inc. (USA)獲得。抗小鼠免疫球蛋白G (IgG) (編號sc2005)及兔IgG (編號sc2004)之辣根過氧化物標記之二級抗體係自Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)獲得。所有其他試劑均係自Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)購得。
2. YSY 之製備
YSY由6種天然食物構成，包括木耳(wood ear,
Auricularia auricular
)、香菇(
Lentinus edodes
)、山楂(hawthorn fruit,
Crataegus pinnatifida
)、洛神葵(roselle,
Hibiscus sabdariffa
)、芹菜(
Apium graveolens
)以及李子(梅(
Prunus mume
))
，
且其混合比率以乾重計為1:1:2:2:5:1。所有植物均係自標準合格之農場購得且其來源由中藥治療中心(Chinese herbal therapy center)、中國醫藥大學附設醫院(China Medical University Hospital ) (Taichung, Taiwan)驗證。將所有乾燥植物切成片，在60℃下浸泡於水中達24 h，且然後在100℃下煮以濃縮萃取物。
3. YSY 之層析 概況及生物活性化合物之鑑別
藉由LC/ESI-MS/MS (Applied Biosystems Sciex, Foster City, CA, USA)實施YSY中前文所提及之諸如原兒茶酸(PCA)及綠原酸(CGA)等潛在生物活性化合物之鑑別以建立YSY萃取物之參照層析概況，以用於每一批之萃取程序之品質檢查。使用配備有電噴霧電離源且與Agilent 1200 HPLC (Agilent Technologies, Wilmington, DE, USA)連接之API 2000-三重四極質譜儀(Applied Biosystems/MDS Sciex, Foster City, CA, USA)來實施LC/ESI-MS/MS分析。使用Syncronis™ C18管柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm；Thermo, Waltham, MA, USA)分離YSY (500 μg/mL)。移動相A係ddH
2
O，而移動相B係MeOH/甲酸(體積比率99.9:0.1)，且流速設至0.5 ml/min。用於HPLC分析中之檢測器係UV檢測器。 使用電噴霧電離串聯式質譜術以負性多反應監測(MRM)模式來實施質譜分析。所有分析物均顯示[M-H]
-
為最強前驅物離子，其可在負離子模式中檢測為[M-H]。對於每一分析物，使用100 ms作為留置時間檢測兩種MRM轉換，一種定量及一種定性；PCA：353/191、353/85；CGA：153/109、153/91。
4. 高血脂動物模型
所有程序及動物護理均根據實驗動物服務中心(Laboratory Animal Service Center)、中國醫藥大學(China Medical University) (Taichung, Taiwan)之機構動物倫理指南批准且實施。將雄性ApoE-KO小鼠(4月齡)分為4組(n=8/組)，包括普通飲食組(正常飲食)、HFD (高脂飲食；正常飲食與60%脂肪混合)、HFD +低劑量YSY (0.4 g/kg/天)及HFD +高劑量YSY (2 g/kg/天)。將雄性倉鼠(8週齡)分為8組(n=6/組)，包括HFD、HFD + YSY (1.48 g/kg/天)、HFD +木耳(1.48 g/kg/天)、HFD +香菇(1.48 g/kg/天)、HFD +山楂(1.48 g/kg/天)、HFD +洛神葵(1.48 g/kg/天)、HFD +芹菜(1.48 g/kg/天)及HFD +梅(1.48 g/kg/天)。藉由HFD誘導降血脂動物持續4週且然後使用YSY萃取物或單一植物成份再治療干預持續8週。在研究結束時，藉由肌內注射Zoteil 50
®
(0.1 ml) (Virbac Ltd, Carros, France)麻醉動物且然後收集包括血液、肝及內臟脂肪組織之生物樣本以評估組織病理學及血液生化檢查。
5. 血液生化分析
在過夜饑餓後，在處死動物後藉由使用分離管收集全部血液，容許血液試樣在室溫下凝塊2 h，然後在4℃下以1000 ×g離心20 min。總膽固醇(TC)、三酸甘油酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、麩丙轉胺酶(GPT)及血脲氮(BUN)之血清含量之量測由Zhen- Xing Co., Ltd (Taichung, Taiwan)提供服務。此外，藉由商業ELISA套組(編號E90605Mu, USCN Life Science Inc., USA)根據製造商之說明書來量測血清脂聯素。
6. 肝及內臟脂肪組織之冷凍切片
根據吾人之先前研究(Pan等人，2013)來實施肝組織中之脂質積累。肝組織使用生理鹽水灌注，在5%福馬林中和溶液(J.T. Baker, Inc., Philipsburg, NJ, USA)中固定24 h，且包埋於Tissue-Tek
®
OCT化合物(編號4583, Sakura Finetek Inc., Torrance, CA, USA)中。將經包埋組織切成10 μm且使用蘇丹IV (對於肝組織)或油紅(對於脂肪組織)以及蘇木精/伊紅(Merck, Whitehouse Station, NJ, USA)染色。在400倍放大下獲得照片且於Alphalmager 2200
®
文件系統(Alpha InnoTech, San Leandro, CA, USA)上定量。 7.
脂質墊分析
在8週研究結束時收集脂質墊。解剖性腺周圍及腹脇部脂肪組織且然後使用1×磷酸緩衝鹽水(PBS)沖洗。 脂質墊比率係以如下等式(Eq. (1))計算： 脂質墊比率(%) = 性腺周圍及腹脇部脂肪組織(g)/體重(g)×100 (1)
8. 西方墨點
使用PRO-PREP® 蛋白萃取溶液(500 μl/g)將肝組織均質化，且藉由使用Bio-Rad蛋白分析(Bio-Rad)來量測蛋白濃度。將等量(30 μg)之萃取之蛋白穿過10% SDS-PAGE電泳且然後轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。藉由使用溶解於PBST (具有0.1% Tween 20之1×PBS)中之5%脫脂奶粉將膜封閉1 h且然後使用PBST洗滌。然後在室溫下將膜與特定一級抗體在適當稀釋下(p-ACC, 1:1000；p-AMPK, 1:1000；HMG-CoA, 1:500；PPAR-γ, 1:1000；C/EBP-β, 1:500；β-肌動蛋白，1:1000)一起培育2 h。然後，洗滌墨點且在室溫下與HRP-偶聯二級抗體在1:2000稀釋下一起培育1 h。使用化學發光試劑使發光信號顯影，藉由Fujifilm LAS-4000系統(San Leandro, CA, USA)獲取，且使用來自NIH (USA)之Image J軟體程式定量。
9. 主動脈脂紋之 分析
在動物處死後收集主動脈且然後使用常用鹽水溫和沖洗。將所有組織試樣於4%多聚甲醛中培育10 min且然後在室溫下使用油紅溶液(於異丙醇中，5 mg/mL)染色15 min。將經染色主動脈使用若干不同濃度之異丙醇(90%、70%及50%)洗滌1 min，然後使用水沖洗。使用數位相機(編號D80；Nikon, Tokyo, Japan)獲得照片。
10. 臨床研究
此人類研究係開放標記及平行先導性臨床試驗，其由中國醫藥大學附設醫院(Taichung, Taiwan)批准(編號DMR99-IRB-126)以研究YSY在健康及高血脂個體中之降脂效應。考慮登記由成人治療小組III (Adult Treatment Panel III, ATP III)界定患有高血脂症之年齡為22-65歲之成年人。排除懷孕或患有慢性代謝疾病之參與者。另外，所有個體均未正使用降脂藥物，例如他汀類、膽酸螯合劑、貝特類及菸鹼酸及可在試驗期間改變肝功能之藥品。根據ATP III指導，將合格參與者分為3組(正常、邊界及高組)。研究開始於4週基線期。研究前收集血樣作為空白對照。然後，所有個體接受12 g/天之YSY達2個月。在研究結束時，在YSY投與後24 h收集血樣。
11. 統計學分析
數據表示為平均值± S.D。方差之分析用於評價差異之統計學顯著性，然後對於所有對之比較進行塔基測試(Tukey's test)。將p值＜0.05視為統計上顯著。使用Statistical Package for Social Sciences (SPSS X, Chicago, IL, USA)分析數據。
實例 1 YSY 降低 HFD 飼養之小鼠之體重、脂肪組織 積累及血液脂質
吾人之實驗數據表明，相較於對照組，體重及內臟脂肪組織質量因YSY之高劑量處理而顯著降低(圖1A及1B)。對於確定YSY誘導之體重下降是否係由於食物攝取改變所致，在實驗時期期間記錄食物攝取。如圖1C中所示，在8週之研究後，在所有組之間在食物攝取量上不存在顯著差異。在本研究中，吾人亦探索YSY對HFD飼養之ApoE-KO小鼠之降血脂效應(表1)。實驗結果顯示，相較於對照組(單獨HFD)，在高劑量YSY處理後，若干生化參數(TC、TG及LDL)顯著降低。然而，HDL之血清含量藉由YSY未顯著改良(表1)。此外，觀察到在所有組之間GPT及BUN之血清含量無顯著差異，暗示發現在YSY處理後無明顯毒性。
表 1
-經YSY處理之ApoE-KO小鼠中之血清生化概況.
a
相較於對照組(單獨使用HFD處理)，
p＜
0.05，
b
相較於普通飲食組，
p＜
0.05。
實例 2 YSY 降低 HFD 飼養之小鼠中之脂肪生成
在8週之動物研究後，將內臟脂肪組織冷凍切片且經HE染色變色以評估脂肪細胞大小之改變，且組織病理學結果表明高劑量YSY處理減小脂肪細胞大小(圖2A)，此暗示YSY可調節脂肪細胞分化。因此，檢查參與脂肪細胞分化之3種關鍵蛋白(包括AMPK、PPAR-γ及C/EBP-β)，以闡明YSY之潛在調節。吾人之結果顯示，在經高劑量YSY處理之組中，YSY增加AMPK磷酸化且減少PPAR-γ及C/EBP-β表現(圖2B)。由於YSY降低WAT大小且抑制脂肪生成，故吾人進一步量測HFD飼養之ApoE-KO小鼠中之脂聯素之循環含量。發現YSY劑量依賴地增加脂聯素之血清含量(圖2C)。
實例 3 YSY 改善 HFD 飼養之小鼠之脂肪肝及動脈粥狀硬化
YSY對內臟WTA之抑制效應揭露其預防肥胖之潛在效應。在此研究中，收集肝及主動脈用於組織病理學分析，且吾人之數據展示高劑量YSY處理可減輕脂肪肝及動脈粥狀硬化(圖3A及3B)。許多研究指示，AMPK路徑係脂質代謝之主要調節子之一，其影響脂肪肝及動脈粥狀硬化之發展(Beg、Allmann與Gibson, 1973； Carlson與Kim, 1973)。吾人之數據亦展示YSY藉助增加AMPK及ACC蛋白之磷酸化程度以及降低HMGCR之表現程度而促進脂質代謝(圖3C)。
實例 4 YSY 改良人類個體之高血脂症
招募患有高血脂症之人類個體以確定YSY在動物模型中之降血脂效應。臨床結果指示，在投與2個月後，除在正常組中之外，YSY可顯著降低邊界及高組二者中之TC及TG之血清含量(表2)。
表 2
-經YSY處理之人類個體中之血清生化概況.
邊界組(TC：200-239 mg/dL)及高組(TC：≥ 240 mg/dL)。使用威爾克森符號等級測試(Wilcoxon Signed Rank test)以測試3組之間之顯著差異。使用卡方測試(Chi square test)評估營養處理與患者組之間之關聯。
a
相較於治療前相同組之基礎水準，
p＜
0.05。
實例 5 在 HFD 飼養之倉鼠中，相較於個別植物成份， YSY 展現最佳抗高血脂效應
實驗結果指示，僅梅子萃取物顯示在投與劑量(1.48 g/kg/天；圖4)下對血清LDL含量之降低效應。有趣地，在相同劑量下，YSY展現對膽固醇、TG及LDL之血清含量之多個及顯著抑制。
實例 6 YSY 之層析 概況及生物活性化合物
在吾人之研究中，將標準化合物(PCA及CGA)製備為1 μg/mL之濃度。將YSY (500 μg)溶解於1 mL水中，且隨後藉由0.45 μm過濾器過濾用於HPLC。如圖5A及5B中所示，基於MRM之分析提及，相較於標準品(RT=4.68 min)，YSY中PCA之滯留時間(RT)係4.67 min；且相較於標準品(RT=4.59 min)，YSY中CGA之滯留時間係4.52 min。 此外，藉由HPLC分析YSY之水萃取物(圖6A)及作為比較之YSY之醇萃取物(圖6B)。HPLC概況顯示於圖6中且滯留時間、峰面積及峰之相對高度顯示於下表中。