TW201734212A - 用以建構轉位子之套組及其用途 - Google Patents

Abstract

本揭示內容是關於一種用以建構轉位子之套組及其用途。本發明套組包含五種質體，其中各質體主要是由一與末端重複序列連結或無連結之基因組所組成。該套組可用以篩選在宿主細胞中具有最少增強活性之piggyBac類型。基於篩選結果，本發明提供一種用以建構轉位子的方法，該轉位子可有效將報導基因轉殖至宿主細胞中而不會影響其中基因的表現。

Description

用以建構轉位子之套組及其用途

本揭示內容是與轉位子(transposon)相關。更具體來說，本揭示內容是關於用以篩選最適合之末端重複序列(terminal repeat)類型的套組及方法，藉以建構一種與piggyBac相關的基因轉殖載體。

DNA轉位子可藉由從供體位置(donor site)切下後插入一標的位置來進行轉位，相關領域常利用該轉位特性插入突變及建立基因轉殖，以進行基因體工程。PiggyBac (PB)是第II型轉位子，可經由「切下及貼上」機制準確且有效地於載體及染色體之間進行轉位。PB 轉位子為一自然存在的基因，可用以編碼一轉位酶(transposase)，PB 轉位子的二側通常為反轉末端重複序列(inverted terminal repeat sequence, ITR sequence)。在進行轉位時，轉位酶會辨識ITR序列，進而催化轉位子由原基因座(locus)轉位切下，並有效地插入TTAA標的位置。

基於該「切下及貼上」機制， PB轉位子提供了一種方法，可有效將外源性基因插入至宿主染色體中，據以使外源性基因長期且穩定地於宿主細胞中進行表現。從結構來看，外源性基因是插入ITR序列之間。建構於另一載體之轉位酶可提供轉位活性。藉由此種表現方法可使位於二ITR間的外源性基因輕易地移動至標的基因體中。

然而，已知除了轉位活性外，ITR亦可作為增強子(enhancer)，刺激插入位置附近之內源性基因的表現。該同側作用增強(cis-acting enhancement)有可能會影響整體基因的表現，進而造成非預期性的結果。

PB末端反轉重複序列可分為二種類型：迷你型PB(mini-piggyBac) (較長類型)及微型PB(micro-piggyBac) (較短類型)。因此，相關領域亟需一種能篩選出最適合之PB類型的篩選系統，藉以有效將外源性基因轉殖至宿主細胞中穩定表現而不會影響整體基因的表現；經轉殖的細胞可持續以特定方式表現外源性基因，因此可應用於細胞治療以預防或治療不同的疾病。

發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。

本揭示內容的一態樣是關於一種套組，其係可用以篩選能建構一轉位子的末端重複序列，其中該轉位子可將外源性基因轉殖至宿主細胞中，而不會影響宿主細胞之整體基因的表現。依據本揭示內容實施方式，該套組包含五種質體，其中 對照質體主要是由一基因組所組成，其中該基因組包含一序列編號：5的啟動子及一可操作式連結至該啟動子的報導基因； 第一質體主要是由該基因組及一第一末端重複序列所組成，其中該第一末端重複序列具有序列編號：1的核苷酸序列，且係位於該基因組的上游； 第二質體主要是由該基因組及一第二末端重複序列所組成，其中該第二末端重複序列具有序列編號：2的核苷酸序列，且係位於該基因組的上游； 第三質體主要是由該基因組及一第三末端重複序列所組成，其中該第三末端重複序列具有序列編號：3的核苷酸序列，且係位於該基因組的上游；以及 第四質體主要是由該基因組及一第四末端重複序列所組成，其中該第四末端重複序列具有序列編號：4的核苷酸序列，且係位於該基因組的上游。

依據本揭示內容某些實施方式，本發明基因組中的報導基因可編碼產生一螢光蛋白(fluorescent protein)。依據本揭示內容其他實施方式，本發明基因組中的報導基因可編碼產生一冷光蛋白(luminescent protein)。

依據本揭示內容某些實施方式，該宿主細胞是源自哺乳動物或昆蟲。在一實施方式中，宿主細胞是免疫細胞，其係選自由T細胞(T cell)、B細胞(B cell)、自然殺手細胞(natural killer cell)、樹突細胞(dendritic cell)、巨噬細胞(macrophage)及肥胖細胞(mast cell)所組成的群組。在另一實施方式中，宿主細胞是源自骨髓(bone marrow)、脂肪組織(adipose tissue)、周邊血(peripheral blood)、臍帶血(umbilical cord blood)或牙髓(dental pulp)的幹細胞。在再另一實施方式中，宿主細胞是上皮細胞。

本揭示內容的第二態樣是關於一種用以建構一轉位子的方法，其係利用本發明套組來篩選一對較佳的末端重複序列，據以建構該轉位子。當將依據本發明方法建構之轉位子與能辨識該轉位子之ITR序列的轉位酶共同轉染至宿主細胞後，該轉位子可將外源性基因轉殖至至宿主細胞中，而不會影響插入位置附近基因的表現量。本發明方法包含以下步驟： (1)分別將五種質體(即對照質體及第一到第四質體)轉染至宿主細胞中； (2)檢測對照質體之報導基因於宿主細胞中的對照表現量，及第一到第四質體之個別報導基因於宿主細胞中的個別表現量；以及 (3)基於步驟(2)檢測而得之表現量來建構轉位子。

依據本揭示內容實施方式，本發明方法建構的轉位子主要是由下列所組成： 一包含一非原核生物啟動子及該外源性基因的表現組，其中該外源性基因係可操作式地連結至該非原核生物啟動子； 一第一選擇末端重複序列；以及 一第二選擇末端重複序列。

依據本揭示內容實施方式，第一選擇末端重複序列是選自第一到第四末端重複序列其中之一，且具有與對照表現量最為相近的表現量。依據本揭示內容某些實施方式，第一選擇末端重複序列是第一或第三末端重複序列；在該些實施方式中，第一選擇末端重複序列是位於表現組的上游，而第二選擇末端重複序列是第二或第四末端重複序列，其係位於表現組的下游。依據本揭示內容其他實施方式，第一選擇末端重複序列是第二或第四末端重複序列；在該些實施方式中，第一選擇末端重複序列是位於表現組的下游，而第二選擇末端重複序列是第一或第三末端重複序列，其係位於表現組的上游。

在本揭示內容某些實施方式中，一旦決定第一選擇末端重複序列後，是依照各末端重複序列於宿主細胞中的表現量來篩選第二選擇末端重複序列。具體來說，當第一選擇末端重複序列是第一或第三末端重複序列時，第二選擇末端重複序列是第二或第四末端重複序列中具有與對照表現量最為相近之表現量的末端重複序列。或者是，當第一選擇末端重複序列是第二或第四末端重複序列時，第二選擇末端重複序列是第一或第三末端重複序列中具有與對照表現量最為相近之表現量的末端重複序列。

在本揭示內容其他實施方式中，是依據第一選擇末端重複序列來決定第二選擇末端重複序列。依據一實施方式，第一選擇末端重複序列是第一末端重複序列，且第二選擇末端重複序列是第二末端重複序列。依據另一實施方式，第一選擇末端重複序列是第二末端重複序列，且第二選擇末端重複序列是第一末端重複序列。依據再另一實施方式，第一選擇末端重複序列是第三末端重複序列，且第二選擇末端重複序列是第四末端重複序列。依據另一實施方式，第一選擇末端重複序列是第四末端重複序列，且第二選擇末端重複序列是第三末端重複序列。

本發明表現組中非原核生物啟動子可以是一誘導型啟動子(inducible promoter)或一組成型啟動子(constitutive promoter)。非限定之組成型啟動子包含巨細胞病毒(cytomegalovirus, CMV)啟動子、勞斯肉瘤病毒(rous sarcoma virus, RSV)啟動子、猿猴病毒(simian virus, SV40)啟動子、鼠乳腺癌病毒(mouse mammary tumor virus, MMTV)啟動子、磷酸甘油酯激酶(phosphoglycerate kinase, PGK)啟動子、雞第二型活性(chicken beta-active)啟動子、延長因子1-α (elongation factor 1-alpha, EF1-α)啟動子、人類H1啟動子及U6啟動子。

在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一段點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。

除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。

在本說明書中，「轉位子」(transposon)一詞是指一多核苷酸，其可由一供體多核苷酸(例如載體)切下後，將多核苷酸本身插入一標的位置(例如細胞基因體或染色體外DNA)中。轉位子包含一多核苷酸，且該多核苷酸包含一段二側為同側作用核苷酸序列的核酸序列；若至少一同側作用核苷酸序列是位於核酸序列的5'端，則至少一同側作用核苷酸序列是位於核酸序列的3'端。同側作用核苷酸序列包含至少一位於轉位子末端的ITR，其係能與轉位酶(較佳是哺乳動物PB家族之轉位酶中的一種)結合。在某些較佳實施方式中，轉位子是哺乳動物PB轉位子。

在本說明書中，「轉位酶」(transposase)一詞是指一多肽，其可催化轉位子由多核苷酸切下後插入標的細胞之基因體或染色體外DNA中。較佳是，轉位酶會結合至反轉序列(inverted sequence)或正向重複序列(direct repeat)。轉位酶可以是一多肽。或者是，轉位酶可以是一包含用以編碼轉位酶之編碼序列的多核苷酸。

在本說明書中，「質體」(plasmid)一詞是指環狀且能插入外來DNA片段的雙股DNA。

在本說明書中，「免疫細胞」(immune cell)一詞是指在免疫反應中具有影響力的細胞。免疫細胞源自造血細胞，包含淋巴細胞(例如B細胞及T細胞)、自然殺手細胞及骨髓細胞(例如單核球(monocyte)、巨噬細胞(macrophage)、嗜酸性球(eosinophil)、肥胖細胞(mast cell)、嗜鹼性球(basophil)及顆粒性細胞(granulocyte))。

「幹細胞」(stem cell)一詞在本說明書是指一種未分化的細胞，其可無限制地分化為構成個體組織的各種細胞類型，藉以製備組織及器官之特定細胞。幹細胞為分化全能(totipotent)或多潛能(multipotent)細胞。幹細胞可分裂為二個子代幹細胞，或是一個子代幹細胞及一個原始幹細胞。之後，細胞會增生為組織中成熟且完整的細胞。

在本說明書中，「間葉幹細胞」(mesenchymal stem cell)是指一多潛能幹細胞，其可分化為脂肪細胞(adipocyte)、骨細胞(osteocyte)、軟骨細胞(chondrocyte)、肌細胞(myocyte)、神經元(neuron)及心肌細胞(cardiomyocyte)。間葉幹細胞具有螺旋外形，且細胞表面標記為CD73(+), CD105(+)、CD34(−)及CD45(−)。

「上皮細胞」(epithelial cell)一詞在本說明書中是指一立方形之有核細胞，會覆蓋於器官之自由表面(free surface，例如皮下表面、黏膜表面或漿液性表面)或位於動物體之管道或腔室之內襯；「上皮細胞」(epithelial cell)一詞在本說明書中具有與本所屬領域習知技藝人士對上皮之上皮細胞相同的定義。上皮細胞層通常可提供一保護性且可能參與運輸過程之內襯及/或表面。

「誘導型啟動子」(inducible promoter)一詞在本說明書中是指一啟動子，其能因應內源性或外源性刺激而具選擇性地表現一編碼序列或功能性RNA。更具體來說，「誘導型啟動子」(inducible promoter)一詞在本說明書中是指一啟動子，其活性會因應物理或化學刺激而增加；舉例來說，一化學化合物(例如化學誘發劑)、一環境刺激(例如溫度及光線)、一荷爾蒙刺激及/或一發育訊息。

在本說明書中，「組成型啟動子」(constitutive promoter)一詞是指一啟動子，其於個體所有細胞中皆維持相對穩定的活性，而很少或不會受到細胞環境(例如受質濃度)的影響。

「建構體」(construct)一詞在本說明書中是採其最廣泛之定義，泛指由一條以上之核苷酸序列(可分離自天然來源、化學合成或其組合)組合而成的直鏈或環形核苷酸序列(例如DNA)。

在本說明書中，「最小啟動子」(minimal promoter)一詞是指一啟動子的最小部分(例如TATA片段)，其可支持任何的基因轉錄。由於缺少上游或下游活化子(activator，例如增強子(enhancer))，最小啟動子的活性通常會大幅下降。在有適當轉錄因子的情況下，最小啟動子可進行基因轉錄。

本揭示內容旨在提供一種用以建構一轉位子的方法，該轉位子可將一外源性基因轉殖至宿主細胞中，而不會影響宿主細胞中整體基因的表現。因此，本揭示內容的第一態樣是關於一種包含五種質體的套組，其中 對照質體(以下簡稱為pGL3-miniP)主要是由一基因組所組成，其中該基因組包含一序列編號：5的啟動子及一可操作式連結至該啟動子的報導基因； 第一質體(以下簡稱為pGL3-miniP-miniL)主要是由該基因組及一第一末端重複序列所組成，其中該第一末端重複序列具有序列編號：1之核苷酸序列，且係位於該基因組的上游； 第二質體(以下簡稱為pGL3-miniP-miniR)主要是由該基因組及一第二末端重複序列所組成，其中該第二末端重複序列具有序列編號：2之核苷酸序列，且係位於該基因組的上游； 第三質體(以下簡稱為pGL3-miniP-microL)主要是由該基因組及一第三末端重複序列所組成，其中該第三末端重複序列具有序列編號：3之核苷酸序列，且係位於該基因組的上游；以及 第四質體(以下簡稱為pGL3-miniP-microR)主要是由該基因組及一第四末端重複序列所組成，其中該第四末端重複序列具有序列編號：4之核苷酸序列，且係位於該基因組的上游。

就結構來看，五種質體主要皆是由一基因組所組成，其中該基因組包含一最小啟動子及一可操作式連結至該最小啟動子的報導基因。依據本揭示內容實施方式，本發明基因組中該最小啟動子具有序列編號：5之核苷酸序列。在某些實施方式中，該報導基因可用以編碼一螢光蛋白；舉例來說，綠色螢光蛋白(green fluorescence protein, GFP)、增強型綠色螢光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP)、圓盤海葵紅色螢光蛋白(Discosoma sp. red fluorescent protein, DsRed)、藍色螢光蛋白(blue fluorescence protein, BFP)、增強型黃色螢光蛋白(enhanced yellow fluorescent protein, EYFP)、馬哈諾螢光蛋白(Anemonia majano fluorescent proteinm amFP)、鈕扣珊瑚螢光蛋白(Zoanthus fluorescent protein, zFP)、圓盤海葵螢光蛋白(Discosoma fluorescent protein, dsFP)及羽珊瑚螢光蛋白(Clavularia fluorescent protein, cFP)。在其他實施方式中，該報導基因可用以編碼一冷光蛋白，例如螢光素酶(luciferase)、山葵過氧化酶(horseradish peroxidase)、量子點(quantum dot)或其組合。依據一操作實施例，本發明基因組之報導基因係用以編碼螢光素酶。

除了該基因組，第一到第四質體(即pGL3-miniP-miniL、pGL3-miniP-miniR、pGL3-miniP-microL及pGL3-miniP-microR)皆更包含一位於該基因組上游之末端重複序列。具體來說，質體pGL3-miniP-miniL主要是由基因組及第一末端重複序列所組成，其中該第一末端重複序列是源自迷你型PB(mini-piggyBac)的5’-末端重複序列區域且具有序列編號：1的核苷酸序列(以下簡稱miniL)。質體pGL3-miniP-miniR主要是由基因組及第二末端重複序列所組成，其中該第二末端重複序列是源自迷你型PB的3’-末端重複序列區域且具有序列編號：2的核苷酸序列(以下簡稱miniR)。質體 pGL3-miniP-microL主要是由基因組及第三末端重複序列所組成，其中該第三末端重複序列是源自微型PB(micro-piggyBac)的5’-末端重複序列區域且具有序列編號：3的核苷酸序列(以下簡稱microL)。質體 pGL3-miniP-microR主要是由基因組及第四末端重複序列所組成，其中該第四末端重複序列是源自微型PB的3’-末端重複序列區域且具有序列編號：4的核苷酸序列(以下簡稱microR)。

如上所述，本發明套組可用以篩選一對較佳之末端重複序列以建構一轉位子。據此，本揭示內容第二態樣是關於一種利用本發明套組建構轉位子的方法。若將該轉位子與轉位酶於宿主細胞中共同表現時，該轉位子可將一外源性基因轉殖至宿主細胞中，而不會影響宿主基因及該外源性基因的表現。依據本揭示內容實施方式，本發明方法包含以下步驟： (1)將本發明套組之五種質體(即pGL3-miniP、pGL3-miniP-miniL、pGL3-miniP-miniR、pGL3-miniP-microL及pGL3-miniP-microR)分別轉染至宿主細胞中； (2)分別檢測對照質體(即pGL3-miniP)之報導基因於宿主細胞中的對照表現量，以及第一到第四質體(即pGL3-miniP-miniL、pGL3-miniP-miniR、pGL3-miniP-microL及pGL3-miniP-microR)之個別報導基因於宿主細胞中的個別表現量；以及 (3)依據步驟(2)所檢測的表現量來建構轉位子。

在執行本發明方法前，先將宿主細胞培養至全滿後，將其懸浮並種植至細胞培養盤之五個孔洞(即第一、第二、第三、第四及第五孔洞)中，其中各孔洞具有大致相同的細胞量以便進行後續實驗。依據特定需求挑選宿主細胞，其可以是源自哺乳動物或昆蟲。依據本揭示內容一實施方式，宿主細胞是人類免疫細胞，其係選自由T細胞、B細胞、自然殺手細胞、樹突細胞、巨噬細胞及肥胖細胞所組成的群組。依據本揭示內容另一實施方式，宿主細胞是源自骨髓、脂肪組織、周邊血、臍帶血或牙髓的人類幹細胞。依據本揭示內容再另一實施方式，宿主細胞是人類上皮細胞。依據本揭示內容另一實施方式，宿主細胞是源自草地夜蛾(Spodoptera frugiperda )的昆蟲細胞。

在步驟(1)中，分別將五種質體轉殖至種植於細胞培養盤第一到第五孔洞之宿主細胞。用以將質體轉殖至宿主細胞的方法包含，但不限於，化學方法(例如磷酸鈣、高分支有機化合物/樹枝狀聚合物(dendrimer)、脂質體及陽離子聚合物)、電穿孔、細胞擠壓(cell squeezing，輕壓細胞膜)、超音波穿孔(sonoporation，包含利用高強度超音波於細胞膜形成孔洞)、光轉染(optical transfection，利用高聚焦電射於細胞膜製造一微小孔洞)、基因交付(impalefection，將DNA連接至一可穿透細胞之奈米纖維的表面)、基因槍(gene gun，將DNA連接至一奈米粒子後，直接注入標的細胞核內)、磁轉染(magnetofection)/磁輔助轉染(magnet assisted transfection，利用磁力將DNA送至標的細胞內)，以及病毒法/病毒轉染(利用病毒作為轉體，將DNA送至標的細胞內)。依據本揭示內容一操作實施例，是利用化學方法(FuGENE^® HD轉染)將五種質體分別轉殖至宿主細胞中。依據本揭示內容另一操作實施例，是利用電穿孔(核轉染，Nucleofection)將五種質體分別轉殖至宿主細胞中。

在步驟(2)中，將檢測分別經五種質體轉殖之細胞中報導基因的表現量。可利用不同方法來檢測報導基因的表現量。依據本揭示內容某些實施方式，報導基因係用以編碼一螢光蛋白，因此可利用流式細胞儀(flow cytometry technique)及/或測量該螢光蛋白發散的螢光強度來檢測該表現量。依據本揭示內容其他實施方式，報導基因係用以編碼一冷光蛋白，且可藉由測量冷光強度來偵測該冷光蛋白。在一特定實施例中，報導基因是螢火蟲螢光素酶基因。如習知技藝人士所熟知，螢光素酶會催化螢光素(luciferin)的氧化，可利用光譜儀來偵測發散強度。

在步驟(3)中，將依據步驟(2)所檢測之報導基因於宿主細胞中的表現量來建構轉位子。具體來說，係從質體pGL3-miniP-miniL、pGL3-miniP-miniR、pGL3-miniP-microL及pGL3-miniP-microR中挑選出一種質體以建構轉位子，其中在經該挑選出之質體轉染的宿主細胞中，報導基因的表現量會與經質體pGL3-miniP轉染之宿主細胞中報導基因的表現量相近。將本發明套組之質體pGL3-miniP的表現量設定為表現背景值。接著，將質體pGL3-miniP-miniL、pGL3-miniP-miniR、pGL3-miniP-microL及pGL3-miniP-microR的表現量與該表現背景值進行比對。報導基因的表現量愈高表示質體中末端重複序列可更有效地增強基因的表現。一般來說，末端重複序列的增強活性會隨著宿主細胞的選擇而有所不同。依據本揭示內容一實施方式，除了末端重複序列miniR外，所有末端重複序列(包含miniL、microL及microR)於昆蟲細胞中皆具有低增強活性。依據本揭示內容另一實施方式，在所有檢測的末端重複序列中，末端重複序列microR於人類ECS、上皮細胞及T細胞中具有最低的增強活性。依據本揭示內容再另一實施方式，在所有檢測的末端重複序列中，末端重複序列miniL於人類間葉幹細胞(mesenchymal stem cell, MSC)最不會增強報導基因的表現。

之後，利用經挑選之質體的末端重複序列來建構本發明轉位子。就結構來看，建構完成的轉位子主要依序是由5’-末端重複序列、表現組及3’-末端重複序列所組成。表現組包含一欲轉殖至宿主細胞中進行表現的外源性基因，及一用以驅動標的基因表現的非原核生物啟動子。因應使用需求，外源性基因可以是報導基因或治療性基因；非限定之例示性治療性基因包含毒殺基因(cytotoxic gene)、免疫調節基因(immunomodulatory gene)、抗血管新生基因(anti-angiogenic gene)、抗發炎基因(anti-inflammatory gene)、抗增生基因(anti-proliferation gene)、腫瘤抑制基因(tumor suppressor gene)、促分化基因(pro-differentiation gene)及荷爾蒙基因(hormone gene)。至於非原核生物啟動子，可以是一種誘導型啟動子，其表現不會受到內源性因子的影響，卻會受到環境條件及外在刺激等人為操作所調控。例示性之誘導型啟動子包含，但不限於熱休克誘導型啟動子(heat shock inducible promoter)、金屬硫蛋白啟動子(metallothionin promoter)、蛻皮激素誘導型啟動子(ecdysone-inducible promoter)、FKBP 二聚合誘導型啟動子(FKBP dimerization inducible promoter)、Gal4-動情素受體融合蛋白調控啟動子(Gal4-estrogen receptor fusion protein regulated promoter)、類固醇誘導型啟動子(steroid inducible promoter)、鏈黴殺陽素反應性啟動子(streptogramin responsive promoter)及四環素調控性啟動子(tetracycline regulated promoter)。或者是，非原核生物啟動子可以是組成型啟動子，其係選自由巨細胞病毒(cytomegalovirus, CMV)啟動子、勞斯肉瘤病毒(rous sarcoma virus, RSV)啟動子、猿猴病毒(simian virus, SV40)啟動子、鼠乳腺癌病毒(mouse mammary tumor virus, MMTV)啟動子、磷酸甘油酯激酶(phosphoglycerate kinase, PGK)啟動子、雞第二型活性(chicken beta-active)啟動子、延長因子1-α (elongation factor 1-alpha, EF1-α)啟動子、人類H1啟動子或U6啟動子所組成的群組。

至於5’-末端重複序列及3’-末端重複序列，其中之一是該經挑選之質體的末端重複序列。更具體來說，當末端重複序列miniL或microL的表現量與對照表現量最為相近時，則選定該末端重複序列作為位於表現組上游的5’-末端重複序列；在該種情況下，選定末端重複序列miniR或microR作為位於表現組下游的3’-末端重複序列。依據本揭示內容某些實施方式，末端重複序列miniR及microR的選擇是取決於其於宿主細胞的表現量，其中是選擇表現量與對照表現量較為相近的末端重複序列作為3’-末端重複序列。依據本揭示內容其他實施方式，末端重複序列miniR及microR的選擇是取決於5’-末端重複序列；意即，當以末端重複序列miniL作為5’-末端重複序列時，則選擇miniR作為3’-末端重複序列；或者是，當以末端重複序列microL作為5’-末端重複序列時，則選擇microR作為3’-末端重複序列。

亦或是，當末端重複序列miniR或microR的表現量與對照表現量最為相近時，則選定該末端重複序列作為位於表現組下游的3’-末端重複序列；在該種情況下，選定末端重複序列miniL或microL作為位於表現組上游的5’-末端重複序列。依據本揭示內容某些實施方式，末端重複序列miniL及microL的選擇是取決於其於宿主細胞的表現量，其中是選擇表現量與對照表現量較為相近的末端重複序列作為5’-末端重複序列。依據本揭示內容其他實施方式，末端重複序列miniL及microL的選擇是取決於3’-末端重複序列；意即，當以末端重複序列miniR作為3’-末端重複序列時，則選擇miniL作為5’-末端重複序列；或者是，當選擇末端重複序列microR作為3’-末端重複序列時，則選擇microL作為5’-末端重複序列。

據此，依據宿主細胞的不同，本發明轉位子可以建構為以下形式：(i) miniL-表現組-miniR (如轉位子 迷你型PB形式)、(ii) miniL-表現組-microR、(iii) microL-表現組-microR (如轉位子微型PB形式)或(iv) microR-表現組-miniL。

本發明轉位子的優點在於，當與能辨識本發明轉位子之5’-末端重複序列及 3’-末端重複序列的轉位酶共同表現時，本發明轉位子可有效地將特定基因(例如治療性基因)轉殖至宿主細胞中，而不會影響宿主細胞中基因的表現。因此，本發明轉位子提供一種用以治療不同疾病(包含癌症、發炎性疾病、免疫缺失性疾病、與血管新生相關之疾病及與荷爾蒙相關之疾病)的方法。

一般來說，包含轉位酶之質體可與本發明轉位子同時轉殖至宿主細胞中，藉此轉位酶及本發明轉位子可於宿主細胞同時進行表現。或者是，轉位酶及本發明轉位子是位於同一多核苷酸中，據此當將該多核苷酸轉殖至宿主細胞宿主細胞後，轉位子及轉位酶會於宿主細胞同時進行表現。較佳的情況是，轉位酶是PB轉位酶。

下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。 實施例

材料及方法

細胞培養

將HEK293細胞培養於包含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS; Hyclone, South Logan, UT, USA)、2 mM L-麩醯胺酸(L-glutamine)、1倍非必需胺基酸、1倍青黴素/鏈黴素(penicillin/streptomycin)及1 mM丙酮酸鈉(sodium pyruvate)的MEM細胞培養液中。將ESC培養於包含15% FBS、2 mM GlutaMAX、0.1 mM非必需胺基酸、1倍青黴素/鏈黴素、1mM丙酮酸鈉、0.1 mM 2-巰乙醇(2-mercaptoethanol)、10 mM HEPES及由以γ射線照射之小鼠胚胎纖維母細胞(mouse embryonic fibroblast, MEF)分泌之10³ U白血病抑制因子(leukaemia inhibitory factor, LIF)的高葡萄糖DMEM細胞培養液中。將Jurkat T細胞培養於包含 2 mM L-麩醯胺酸、10% FBS、1mM丙酮酸鈉及0.1 mM非必需胺基酸的RPMI1640細胞培養液中。將SF9細胞培養於EX-CELL^® 420血清細胞培養液中。將由人類瓦頓氏凝膠(Wharton’s jelly)取得的MSC細胞WJMSC960531培養於包含20% FBS、1倍青黴素/鏈黴素、2 mM L-麩醯胺酸及每毫升4微克之鹼性纖維母細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, b-FGF)之MEM細胞培養液中。除了Sf9細胞是培養於25°C之大氣環境外，所有的細胞皆係培養於包含5% CO2之37°C的環境中。

載體建構

pGL3-miniP

以限制酶Kpn I及Xho I 切割pGL3-basic載體。合成序列編號：7之DNA片段miniP，以限制酶Kpn I及Xho I進行切割後接合至經Kpn I及Xho I切割的pGL3-basic載體。將製得的質體命名為pGL3-miniP，其係包含序列編號：5的最小啟動子。

pGL3-miniP-miniL

以限制酶Kpn I及Xho I 切割質體pGL3-miniP。合成序列編號：8之DNA片段miniL，以限制酶Kpn I及Xho I進行切割後接合至經Kpn I及Xho I切割的pGL-miniP。將製得的質體命名為pGL3-miniP-miniL，其係包含序列編號：1的末端重複序列。

pGL-miniP-miniR

以限制酶Kpn I及Xho I 切割質體pGL3-miniP。合成序列編號：9之DNA片段miniR，以限制酶Kpn I及Xho I進行切割後接合至經Kpn I及Xho I切割的pGL-miniP。將製得的質體命名為pGL-miniP-miniR，其係包含序列編號：2的末端重複序列。

pGL3-miniP-microLR

以限制酶Kpn I及Xho I 切割質體pGL3-miniP。合成序列編號：10之DNA片段microLR，以限制酶Kpn I及Xho I進行切割後接合至經Kpn I及Xho I切割的pGL-miniP。將製得的質體命名為pGL3-miniP-microLR，其係包含序列編號：6的末端重複序列。

pGL3-miniP-microL

以限制酶Kpn I及Xho I 切割質體pGL3-miniP。合成包含序列編號：11之microL (micro-piggyBac之左端TIR)、大小為96 bp的DNA片段，以限制酶Kpn I及Xho I進行切割後接合至經Kpn I及Xho I切割的pGL-miniP。將製得的質體命名為pGL3-miniP-microL，其係包含序列編號：3的末端重複序列。

pGL3-miniP-microR

以限制酶Kpn I及Xho I 切割質體pGL3-miniP。合成序列編號：12之DNA片段microR，以限制酶Kpn I及Xho I進行切割後接合至經Kpn I及Xho I切割的pGL-miniP。將製得的質體命名為pGL3-mini-microR，其係包含序列編號：4的末端重複序列。

增強試驗

將對照組pPL-TK (海腎螢光素酶，Renilla Luciferase)與特定螢火蟲螢光素酶建構體(即pGL3-miniP、pGL3-miniP-microL、pGL3-miniP-microR、pGL3-miniP-microLR、pGL-miniP-miniR及pGL3-miniP-miniL)共同轉染至HEK293(利用Fugene)、Sf9(利用核轉染)、R1 ES細胞(利用核轉染)或Jurkat T細胞(利用核轉染)中。轉染48小時後，收集細胞並依據使用操作說明以雙螢光素酶試驗(Dual-Luciferase assay, Promega)檢測表現。

實施例 1 在不同宿主細胞中的增強活性

在本實施例中，分別將對照質體(即pGL3-miniP)及五種測試質體(即pGL3-miniP-miniL、pGL3-miniP-miniR、pGL3-miniP-microLR、pGL3-miniP-microL及pGL3-miniP-microR)轉殖至包含Sf9細胞(第1A圖)、ESC (第1B圖)、HEK293細胞(第1C圖)及Jurkat T細胞(第2圖)等宿主細胞中。依據「材料及方法」所述之增強試驗來分析該些質體的增強活性。

如第1A圖所示，相較於其他質體(即pGL3-miniP、pGL3-miniP-miniL、pGL3-miniP-microLR、pGL3-miniP-microL及pGL3-miniP-microR)，經pGL3-miniP-miniR轉染之Sf9細胞具有最高的螢光素酶活性。至於哺乳動物細胞，在所有測試質體中，pGL3-miniP-microR質體的螢光素酶表現量與pGL3-miniP質體的螢光素酶表現量最為相近(ESC：第1B圖；HEK293細胞：第1C圖；Jurkat T細胞：第2圖)。

該些結果指出，各末端重複序列的增強活性會隨著宿主細胞的不同而有所差異；依據實驗結果，除了序列編號：2的末端重複序列，所有測試的末端重複序列(即序列編號：1、3、4及6)於Sf9細胞中並不具有增強活性。相較之下，在包含ESC、HEK293細胞及Jurkat T細胞等哺乳動物細胞中，相較其他測試末端重複序列，序列編號：4的末端重複序列最不會影響報導基因的表現。

實施例 2 在人類 MSC 中的增強活性

此外，亦利用源自瓦頓氏凝膠的人類MSC來評估末端重複序列的增強活性。第3圖闡述該些結果。

相較於對照組，序列編號：3及6的末端重複序列分別會增強報導基因的表現，而序列編號：1或4 (特別是序列編號：1)的末端重複序列則於測試的MSC中不具有顯著的增強活性。

整體來看，該結果指出，迷你型PB的末端反轉序列可作為一基因轉殖載體，藉以將外源性基因轉殖至MSC中，而不會影響(即增強或抑制)細胞中整體基因的表現。相較之下，微型PB的末端反轉序列則適用於建構可於小鼠胚胎幹細胞及人類T細胞進行表現的基因轉殖載體。

綜合上述，本揭示內容提供一種用以篩選最適合之PB的套組，經篩選的PB於宿主細胞中僅具有轉位活性而不會影響基因的表現。依據篩選結果，習知技藝人士可建構一種轉位子，其係能有效將特定基因轉殖至宿主細胞中，而幾乎不會改變或干擾(即增強或抑制)宿主細胞整體基因的表現。據此，本揭示內容提供了一種安全的方法，藉由使治療性基因適當且有效地於有需要之個體體內進行表現來治療不同疾病(例如癌症、發炎性疾病、免疫缺失性疾病、與血管新生相關之疾病及與荷爾蒙相關之疾病)。

雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。

無

為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：

第1A-1C圖是依據本揭示內容實施例1所繪示之柱狀圖，其係關於特定質體於SF9細胞(第1A圖)、胚胎幹細胞(embryonic stem cell，ESC，第1B圖)或HEK293細胞(第1C圖)中的增強活性；

第2圖是依據本揭示內容實施例1所繪示之柱狀圖，其係關於特定質體於治療相關細胞- Jurkat T細胞中的增強活性；以及

第3圖是依據本揭示內容實施例2所繪示之柱狀圖，其係關於特定質體於治療相關細胞-WJMSC960531細胞中的增強活性。

根據慣常的作業方式，圖中各種特徵與元件並未依比例繪製，其繪製方式是為了以最佳的方式呈現與本發明相關的具體特徵與元件。

＜110＞ 吳瓊媛   ＜120＞ 用以建構轉位子之套組及其用途   ＜130＞ P2903-TW   ＜160＞ 12   ＜170＞ BiSSAP 1.3   ＜210＞ 1 ＜211＞ 244 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ miniL (mini-piggyBac之左端末端反轉序)   ＜400＞ 1 ttaaccctag aaagataatc atattgtgac gtacgttaaa gataatcatg tgtaaaattg     60   acgcatgtgt tttatcggtc tgtatatcga ggtttattta ttaatttgaa tagatattaa    120   gttttattat atttacactt acatactaat aataaattca acaaacaatt tatttatgtt    180   tatttattta ttaaaaaaaa caaaaactca aaatttcttc tataaagtaa caaaactttt    240   atcg                                                                 244     ＜210＞ 2 ＜211＞ 313 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ miniR (mini-piggyBac之右端末端反轉序)   ＜400＞ 2 gctatctata acaagaaaat atatatataa taagttatca cgtaagtaga acatgaaata     60   acaatataat tatcgtatga gttaaatctt aaaagtcacg taaaagataa tcatgcgtca    120   ttttgactca cgcggtcgtt atagttcaaa atcagtgaca cttaccgcat tgacaagcac    180   gcctcacggg agctccaagc ggcgactgag atgtcctaaa tgcacagcga cggattcgcg    240   ctatttagaa agagagagca atatttcaag aatgcatgcg tcaattttac gcagactatc    300   tttctagggt taa                                                       313     ＜210＞ 3 ＜211＞ 67 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ microL (micro-piggyBac之左端末端反轉序)   ＜400＞ 3 ttaaccctag aaagataatc atattgtgac gtacgttaaa gataatcatg cgtaaaattg     60   acgcatg                                                               67     ＜210＞ 4 ＜211＞ 40 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ microR (micro-piggyBac之右端末端反轉序)   ＜400＞ 4 gcatgcgtca attttacgca gactatcttt ctagggttaa                           40     ＜210＞ 5 ＜211＞ 35 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ Minimal promoter   ＜400＞ 5 atctagaggg tatataatgg aagctcgact tccag                                35     ＜210＞ 6 ＜211＞ 107 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ microLR (包含micro-piggyBac之左端及右端末端反轉序之DNA序列)   ＜400＞ 6 ttaaccctag aaagataatc atattgtgac gtacgttaaa gataatcatg cgtaaaattg     60   acgcatggca tgcgtcaatt ttacgcagac tatctttcta gggttaa                  107     ＜210＞ 7 ＜211＞ 82 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ DNA片段-miniP   ＜400＞ 7 ggtaccgagc tcttacgcgt gctagcccgg gctcgagatc tagagggtat ataatggaag     60   ctcgacttcc agaagcttgg ca                                              82     ＜210＞ 8 ＜211＞ 264 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ DNA片段-miniL   ＜400＞ 8 atcgggtacc ttaaccctag aaagataatc atattgtgac gtacgttaaa gataatcatg     60   tgtaaaattg acgcatgtgt tttatcggtc tgtatatcga ggtttattta ttaatttgaa    120   tagatattaa gttttattat atttacactt acatactaat aataaattca acaaacaatt    180   tatttatgtt tatttattta ttaaaaaaaa caaaaactca aaatttcttc tataaagtaa    240   caaaactttt atcgctcgag atct                                           264     ＜210＞ 9 ＜211＞ 334 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ DNA片段-miniR   ＜400＞ 9 atcgggtacc gctatctata acaagaaaat atatatataa taagttatca cgtaagtaga      60   acatgaaata acaatataat tatcgtatga gttaaatctt aaaagtcacg taaaagataa     120   tcatgcgtca ttttgactca cgcggtcgtt atagttcaaa atcagtgaca cttaccgcat     180   tgacaagcac gcctcacggg agctccaagc ggcgactgag atgtcctaaa tgcacagcga     240   cggattcgcg ctatttagaa agagagagca atatttcaag aatgcatgcg tcaattttac     300   gcagactatc tttctagggt taagctcgag atct                                 334     ＜210＞ 10 ＜211＞ 152 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ DNA片段-microLR   ＜400＞ 10 atcgggtacc ttaaccctag aaagataatc atattgtgac gtacgttaaa gataatcatg     60   cgtaaaattg acgcatgctc gagatttaaa tccaccgcgg tggcatgcgt caattttacg    120   cagactatct ttctagggtt aactcgagat ct                                  152     ＜210＞ 11 ＜211＞ 87 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ DNA片段-microL   ＜400＞ 11 atcgggtacc ttaaccctag aaagataatc atattgtgac gtacgttaaa gataatcatg     60   cgtaaaattg acgcatgctc gagatct                                         87     ＜210＞ 12 ＜211＞ 71 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ DNA片段-microR   ＜400＞ 12 atcgggtacc ccaccgcggt ggcatgcgtc aattttacgc agactatctt tctagggtta     60   actcgagatc t                                                          71

Claims (12)

1. 一種用以建構一能將一外源性基因轉殖至宿主細胞之轉位子的方法，包含： (1)分別以一對照質體及一第一到一第四質體來轉染該宿主細胞中，其中 該對照質體主要是由一基因組所組成，其中該基因組包含一序列編號：5的啟動子及一可操作式連結至該啟動子的報導基因；以及 該第一到該第四質體主要是由下列所組成：該基因組及分別位於該基因組上游之一第一到一第四末端重複序列，其中該第一到該第四末端重複序列分別具有序列編號：1到4之核苷酸序列； (2)檢測該對照質體之該報導基因於該宿主細胞中的對照表現量，及該第一到該第四質體之個別報導基因於該宿主細胞中的個別表現量；以及 (3)建構該轉位子，其主要是由下列所組成：(i)一包含一非原核生物啟動子及該外源性基因的表現組，其中該外源性基因係可操作式地連結至該非原核生物啟動子，(ii)一第一選擇末端重複序列，其係選自該第一到該第四末端重複序列其中之一，且具有一與該對照表現量最為相近的表現量，以及(iii)一第二選擇末端重複序列，其中 (3a)當該第一選擇末端重複序列是該第一或該第三末端重複序列時，該第一選擇末端重複序列是位於該表現組的上游，而該第二選擇末端重複序列是該第二或該第四末端重複序列，且位於該表現組的下游；或是 (3b)當該第一選擇末端重複序列是該第二或該第四末端重複序列時，該第一選擇末端重複序列是位於該表現組的下游，而該第二選擇末端重複序列是該第一或該第三末端重複序列，且位於該表現組的上游。
2. 如請求項1所述之方法，其中 在步驟(3a)中，該第二選擇末端重複序列是該第二或該第四末端重複序列中具有與該對照表現量最為相近之表現量的末端重複序列；或是 在步驟(3b) 中，該第二選擇末端重複序列是該第一或該第三末端重複序列中具有與該對照表現量最為相近之表現量的末端重複序列。
3. 如請求項1所述之方法，其中 在步驟(3a)中，當該第一選擇末端重複序列是該第一末端重複序列時，該第二選擇末端重複序列是該第二末端重複序列；或是當該第一選擇末端重複序列是該第三末端重複序列時，該第二選擇末端重複序列是該第四末端重複序列；或是 在步驟(3b) 中，當該第一選擇末端重複序列是該第二末端重複序列時，該第二選擇末端重複序列是該第一末端重複序列；或是當該第一選擇末端重複序列是該第四末端重複序列時，該第二選擇末端重複序列是該第三末端重複序列。
4. 如請求項1所述之方法，其中該宿主細胞是源自哺乳動物或昆蟲。
5. 如請求項4所述之方法，其中該宿主細胞是免疫細胞，其係選自由T細胞、B細胞、自然殺手細胞、樹突細胞、巨噬細胞及肥胖細胞所組成的群組。
6. 如請求項4所述之方法，其中該宿主細胞是源自骨髓、脂肪組織、周邊血、臍帶血或牙髓(dental pulp)的幹細胞。
7. 如請求項4所述之方法，其中該宿主細胞是上皮細胞。
8. 如請求項1所述之方法，其中該非原核生物啟動子是一誘導型啟動子(inducible promoter)。
9. 如請求項1所述之方法，其中該非原核生物啟動子是一組成型啟動子(constitutive promoter)。
10. 如請求項9所述之方法，其中該非原核生物啟動子是巨細胞病毒(cytomegalovirus, CMV)啟動子、勞斯肉瘤病毒(rous sarcoma virus, RSV)啟動子、猿猴病毒(simian virus, SV40)啟動子、鼠乳腺癌病毒(mouse mammary tumor virus, MMTV)啟動子、磷酸甘油酯激酶(phosphoglycerate kinase, PGK)啟動子、雞第二型活性(chicken beta-active)啟動子、延長因子1-α (elongation factor 1-alpha, EF1-α)啟動子、人類H1啟動子或U6啟動子。
11. 一種套組，包含： 一主要由一基因組所組成的對照質體，其中該基因組包含一序列編號：5的啟動子及一可操作式連結至該啟動子的報導基因；以及 一主要由下列所組成之一第一到一第四質體：該基因組及分別位於該基因組上游之一第一到一第四末端重複序列，其中該第一到該第四末端重複序列分別是由序列編號：1到4之核苷酸序列所組成。
12. 如請求項11所述之套組，其中該報導基因可編碼一螢光蛋白或一冷光蛋白。