TW201726712A

TW201726712A - 藉由使用ｃｄ－ｒａｐ前驅蛋白改善ｃｄ－ｒａｐ製程中之表現與摺疊

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Publication number: TW201726712A
Application number: TW105130213A
Authority: TW
Inventors: 伊莎貝兒舒歐爾托; 朱迪瑟史托曼斯; 保羅哈柏曼; 伯納德喬納柴; 湯瑪士史迪爾吉; 艾克阿特巴特尼基; 沃爾克傑斯柯; 約金沙斯
Original assignee: 賽諾菲公司
Priority date: 2015-09-18
Filing date: 2016-09-19
Publication date: 2017-08-01
Also published as: EP3350204A2; AU2021202110A1; AU2016321884A1; US20200268663A1; JP6976254B2; AU2016321884B2; US10660852B2; WO2017046314A3; WO2017046314A2; US20190046442A1; JP2018527030A; CA2998665A1; CN108602866A

Abstract

本發明係關於包含前序列和CD-RAP的CD-RAP前驅蛋白，及其在製備天然CD-RAP中的用途。本發明還係關於包含CD-RAP和至少一種帶正電荷的胺基酸和緩衝劑的組合物，包含所述組合物的藥物，它們在治療和/或預防患有聚集蛋白聚糖降解，和/或水流入軟骨的增加，和/或降低的CD-RAP表現的患者中的軟骨疾病或損傷的方法中的用途，以及製造所述組合物的方法和在所述組合物中貯存CD-RAP的方法。本發明還係關於包含含有囊封的CD-RAP或其變體的脂質體的組合物，其在治療關節疾病或損傷的方法中的用途，以及製造所述脂質體組合物以及在其中貯存CD-RAP的方法。

Description

藉由使用CD-RAP前驅蛋白改善CD-RAP製程中之表現與摺疊

骨關節炎(OA)是一種高度流行的退化性關節病，其非常緩慢形成。OA的標誌是關節軟骨的破壞(從軟骨基質中損失蛋白聚糖和膠原蛋白)，伴隨著對骨贅的下層骨形成(沿關節邊緣的骨突起)的損傷和滑膜的變化，導致關節炎症(滑膜炎)。總之，這些過程導致受影響的關節的疼痛，失准(misalignment)和功能喪失。骨關節炎的特徵是關節軟骨的損失，其導致疼痛和功能喪失，通常在膝蓋和髖部，並且影響在美國，日本，法國，德國，意大利和西班牙的七個主要市場中的8140萬個體(Datamonitor Report DMHC2493，2009年12月)。在美國，疾病控制和預防中心(CDC)報告，總體上OA影響著年齡25歲以上的成年人的13.9%和65歲以上的成年人的33.6%(1240萬)(2005年估計2690萬美國成年人，從1990年的2100萬上升)。預期壽命和老齡人口的增加預期使骨關節炎到2020年成為殘疾的第四大原因(Anthony D.Woolf & Bruce Pfleger,Burden of major musculoskeletal conditions,Bulletin of the World Health Organization 2003；81：646-656)。從醫學角度來看，OA還與其它慢性病症，如肥胖，糖尿病，高血壓，血脂異常和冠狀動脈疾病有關，這些疾病造成診斷為OA的受試者的多發病率。

目前，除了替代手術外，不能治癒OA，並且可用的治療目的在於緩解症狀和改善功能。這些包括患者教育，物理治療，體重控制和藥物使用(營養補充劑，簡單鎮痛藥，局部NSAIDS，口服NSAIDS，cox-2抑制劑和口服類固醇，關節內施用的類固醇和透明質酸)的組合。

在過去，進行了幾種嘗試以抑制主要參與軟骨降解的那些酶的活性。不幸的是迄今為止很少成功。抗蛋白酶處理缺乏所需要的效力和臨床益處(Lewis EJ,Bishop J,Bottomley KM,Bradshaw D,Brewster M,Broadhurst MJ等Ro 32-3555,an orally active collagenase inhibitor,prevents cartilage breakdown in vitro and in vivo.Br J Pharmacol 1997；121：540-6；Brown PD.Ongoing trials with matrix metalloproteinase inhibitors.Expert Opin Investig Drugs 2000；9：2167-77)，並非充分生物利用或口服活性的和/或對於靶定的酶缺乏特異性。具體地，MMP抑制劑顯示劑量和持續時間依賴性的肌肉骨骼副作用，其由以下組成：關節僵硬，關節纖維增生和I型膠原在骨關節炎關節中的積累(Renkiewicz R,Qiu L,Lesch C,Sun X,Devalaraja R,Cody T等Broad-spectrum matrix metalloproteinase inhibitor marimastat-induced musculoskeletal side effects in rats.Arthritis Rheum 2003；48：1742-9； Rao BG.Recent developments in the design of specific Matrix Metalloproteinase inhibitors aided by structural and computational studies.Curr Pharm Des 2005；11：295-322)。隨著患有該疾病的患者數量的增加，新的治療劑是非常期望的，並且在此之後大量尋求侵入性較小的，不僅減輕症狀而且改善疾病或損傷的根本原因(即軟骨降解)的治療劑。

隨著患有該疾病的患者數量的增加，新的治療劑是非常期望的，並且在此之後大量尋求侵入性較小的，不僅減輕症狀而且改善疾病或損傷的根本原因(即軟骨的降解)的治療劑。

顯示了治療性蛋白CD-RAP能夠減緩軟骨的降解以及改善損傷的軟骨的再生。然而，為了充當足夠藥物供應的來源，CD-RAP還需要滿足生產中高產率的商業需求。因此，期望通過重組DNA技術生產CD-RAP。重組細菌過程可以通過在強細菌啟動子的控制下表現編碼CD-RAP的基因來解決該問題。細菌直接表現需要位置-1的甲硫胺酸用於轉譯的起始。必須將密碼子添加到編碼CD-RAP序列的序列中。天然CD-RAP在其序列的位置3處含有甲硫胺酸。在表現期間，此甲硫胺酸也可用於轉譯起始。因此，將觀察到兩種表現產物，一種從甘胺酸開始以產生天然CD-RAP，而一種從脯胺酸開始以產生CD-RAP的截短形式。迄今可用的CD-RAP製劑的分析揭示，這些製劑實際上含有至少三種不同的CD-RAP種類。特別地，CD-RAP的胺基端(例如在大腸桿菌(E.coli)中表現)對降解敏感，導致CD-RAP產物的約10%的N-端異質性。通過在大腸桿菌中表現獲得的CD-RAP含有至少以下三種不同的蛋白質種類：a)具有額外的N-端甲硫胺酸，即總共108個胺基酸的CD-RAP(108AA)，其是主要種類(90%)並且具有N端：MGPMPKL...b)由沒有額外的N-端甲硫胺酸並具有N端GPMPKL...的成熟CD-RAP序列組成的CD-RAP(107AA)，以及c)CD-RAP(105AA)，其是具有N端序列：MPKL...，即比成熟CD-RAP序列少兩個胺基酸的N端截短的CD-RAP。

產物中的這種異質性是不期望的，因為降低產率的進一步的純化步驟將變得必要。如果F-甲硫胺酸在轉譯後不被定量去除，則異質性可以變得甚至更高。此外，天然CD-RAP表現出高疏水性，這由於其對細胞的相對毒性而導致在細菌中的限制性表現。

CD-RAP的重組表現還需要蛋白質在其表現後的折疊。然而，發現天然CD-RAP的折疊產率非常低，部分是由於高疏水性所致。

為了克服CD-RAP生產中的這些問題，設計了CD-RAP與前序列的融合蛋白，其導致該前體CD-RAP蛋白表現的高產率，這特別可能是由於前驅蛋白的降低的疏水性所致。此外，發現融合蛋白的折疊比天然CD-RAP的折疊容易得多。然而，為了在折疊後構成天然CD-RAP，必需通過酶促切割去除前序列。為了實現這點，將天然CD-RAP的胺基酸序列和前序列之間的界面設計為切割位點，特別是作為內切蛋白酶的切割位點。總體上，CD-RAP的生產能力在其與前序列一起表現並且隨後去除前序列後與沒有前序列的表現相比增加高達60倍。使用本文中公開的CD-RAP前驅蛋白製備CD-RAP允許提供具有107個胺基酸的限定長度並具有限定的N端的CD-RAP製劑。除了在製備CD-RAP時的改善的產率之外，這是必需的優點。

為了特異性靶向受影響的關節並減少可能的(例如全身性)副作用，還需要允許關節內施用CD-RAP的製劑。

在本上下文中，期望適合於靜脈內和關節內施用的配製劑。期望地，這些配製劑包含導致CD-RAP蛋白質的增加的穩定性的賦形劑和緩衝劑組合，允許配製劑的更長的貯存。特別地，需要配製劑，其允許CD-RAP在受影響的一側保持更長的時間段並更有效地到達軟骨細胞。為了允許治療和/或預防性施用，此類配製劑需要是可滅菌的，以及展現出長的儲存期，允許其貯存。因此，開發了適合於關節內施用的CD-RAP的脂質體配製劑。開發了可縮放(scalable)的方法以產生空脂質體，其足夠小以通過過濾滅菌。配製劑開發研究允許鑒定影響脂質體產物中的CD-RAP囊封效率的參數，發現其是緩衝劑類型，和脂質含量以及冷凍乾燥配製劑的重建方法。

生產脂質體配製劑的一般方法包括以下步驟：-通過製備水合和均化的脂質混合物來製備空脂質體(小單層囊泡，SUV)，然後擠出脂質體；-SUV懸浮液與CD-RAP水溶液的混合，-冷凍乾燥，-用注射用水(WFI)重建。

在該方法結束時，脂質體的多分散性相當大(約0.3)，這導致無菌過濾問題。為了簡化方法並降低多分散性，開發了溶劑注射方法以製備空脂質體。在該方法中，不需要產生脂質混合物，從而避免了中間體產物的製備並且消除方法步驟。溶劑注射是一種可縮放(scalable)的方法，其允許直接放大以及避免篩析(sizing)步驟，如均化和擠出。

在第一態樣中，本發明係關於CD-RAP前驅蛋白，其包含a)前序列，所述前序列在其C端包含切割位點，和b)CD-RAP或其變體。

在第二態樣中，本發明係關於編碼第一態樣的前體CD-RAP蛋白的核酸。

在第三態樣中，本發明係關於包含第二態樣的核酸的載體。

在第四態樣中，本發明係關於包含第一態樣的前體CD-RAP蛋白，第二態樣的核酸或第三態樣的載體的宿主細胞。

在第五態樣中，本發明係關於製造天然CD-RAP的方法，其包括以下步驟a)提供第一態樣的CD-RAP前驅蛋白，並b)去除所述前序列以獲得天然CD-RAP。

在第六態樣中，本發明係關於包含具有長度為107個胺基酸的 SEQ ID NO：1的成熟CD-RAP序列的CD-RAP蛋白的CD-RAP蛋白製劑。

在第七態樣中，本發明係關於包含CD-RAP或其變體，和至少一種帶正電荷的胺基酸和緩衝劑的組合物。

在第八態樣中，本發明係關於第六態樣的蛋白質製劑或第七態樣的組合物，其用於治療和/或預防患有聚集蛋白聚糖降解，和/或水流入軟骨的增加，和/或降低的CD-RAP表現的患者中的軟骨疾病或損傷的方法。

在第九態樣中，本發明係關於包含第六態樣的蛋白質製劑或本發明第七態樣的組合物的藥物。

第十態樣中，本發明係關於製造本發明第七態樣的組合物的方法。

在第十一態樣中，本發明係關於一種貯存CD-RAP的方法。

在第十二態樣中，本發明係關於包含含有囊封的CD-RAP(特別是根據SEQ ID NO：1)或其變體的脂質體的組合物，其中脂質體的大小低於200nm。

在第十三態樣中，本發明係關於第十一態樣的組合物，其用於治療和/或預防患有聚集蛋白聚糖降解和/或水流入軟骨的增加，和/或減少的CD-RAP表現的患者中的軟骨疾病或損傷的方法中。

在第十四態樣中，本發明係關於包含第十二或第十三態樣的組合物的藥物。

在第十五態樣中，本發明係關於製造脂質體配製劑的方法，其包括以下步驟：a)在有機溶劑中溶解至少一種脂質，b)將步驟a)的混合物注射到循環水相中，並且c)去除溶劑。

在第十六態樣中，本發明係關於可通過第十四態樣的方法製造的脂質體配製劑。

在第十七態樣中，本發明提供了一種貯存CD-RAP的方法，包括在本發明第十一態樣的脂質體配製劑中保持CD-RAP。

在第十八態樣中，本發明提供了減少脂質體配製劑中的脂質體大小的方法，包括以下步驟：a)在有機溶劑中溶解至少一種脂質，b)將步驟a)的混合物注射到循環的水性相，並且c)去除溶劑。

在第十九態樣中，本發明係關於降低脂質體配製劑的多分散性的方法，包括以下步驟：a)在有機溶劑中溶解至少一種脂質，b)將步驟a)的混合物注射到循環水相中，並且c)去除溶劑。

序列表

SEQ ID NO：1：CD-RAP的胺基酸序列(107個胺基酸)：

SEQ ID NO：2：前序列的胺基酸序列：MATTST

SEQ ID NO：3：前序列的胺基酸序列：MATTLT

SEQ ID NO：4：前序列的胺基酸序列：MATTSTG

SEQ ID NO：5：前序列的胺基酸序列：MATTLTG

SEQ ID NO：6：前序列的胺基酸序列：MATTSTGN

SEQ ID NO：7：前序列的胺基酸序列：MATTLTGN

SEQ ID NO：8：前序列的胺基酸序列：MATTSTGNS

SEQ ID NO：9：前序列的胺基酸序列：MATTLTGNS

SEQ ID NO：10：前序列的胺基酸序列：MATTSTGNSA

SEQ ID NO：11：前序列的胺基酸序列：MATTLTGNSA

SEQ ID NO：12：前序列的胺基酸序列：MATTSTR

SEQ ID NO：13：前序列的胺基酸序列：MATTLTR

SEQ ID NO：14：前序列的胺基酸序列：MATTSTGNSAR

SEQ ID NO：15：前序列的胺基酸序列：MATTLTGNSAR

SEQ ID NO：16：前序列的胺基酸序列：MATTSTLTTHWHWHGNSAR

SEQ ID NO：17：前序列的胺基酸序列：MATTSTGNSAHFQHHHGSLAR

SEQ ID NO：18：前序列的胺基酸序列：MATTSTGNSAHFQHHHGSLAR

SEQ ID NO：19：前序列的胺基酸序列：MATTSTGNSARFVNQHLH HHHHHHHGGGENQQQR

SEQ ID NO：20：前驅蛋白的胺基酸序列：

SEQ ID NO：21：CD-RAP的胺基酸序列(105個胺基酸)：

1、2‧‧‧預培養(和預發酵)

3‧‧‧發酵

4‧‧‧細胞分離

5‧‧‧細胞破壞

6‧‧‧IB清洗和分離

7‧‧‧折疊和過濾

8‧‧‧HIC 1

9‧‧‧切割

10‧‧‧AEX非結合

11‧‧‧CEX

12‧‧‧HIC 2

13‧‧‧TFF(UF/DF)

14‧‧‧填充(包括0.2μ mg過濾)

圖1：自CD-RAP前驅蛋白製備天然CD-RAP的一般方法的示意圖

圖2：A：切割前的CD-RAP前驅蛋白的層析圖(Zorbax柱，流動相梯度水至乙腈，0.8ml/min，烘箱在60℃，波長214nm)，B：切割後的CD-RAP的層析圖

圖3：具有前序列的不同鏈長度的CD-RAP構建體的發酵產率數據

圖4：相對於前序列的鏈長度繪製的CD-RAP的發酵產率數據[g/L]

圖5：在用不同胰蛋白酶濃度(以單位/升表示且在括號中為每mg前-CD-RAP的單位)切割後隨時間的CD-RAP增加

圖6：在不同pH下的胰蛋白酶切割-CD-RAP的增加

圖7：在不同溫度下的胰蛋白酶切割-CD-RAP的增加

圖8：通過DSF在兩個緩衝劑系統中不同rhCD-RAP批次的熔點測定；測定濃度為0.5mg/mL

圖9：第1輪中製備的配製劑的pH和滲透壓

圖10：在T=0時和應激後在第1輪中製備的配製劑的外觀

圖11：用CD-RAP在第1輪中獲得的RP-HPLC結果

圖12：第三清洗步驟後和用稀HCl溶液調節pH後的配製劑的pH

圖13：第2輪中製備的配製劑的pH和滲透壓

圖14：在T=0時和應激後在第2輪中製備的配製劑的外觀

圖15：在第2輪中獲得的RP-HPLC結果

圖16：CD-RAP藥物產品批次F531-03-003p064b的穩定性結果

圖17：安慰劑批次F531-03-003p063的穩定性結果

圖18：方法設置

圖19：脂質溶解度結果

圖20：有機相中脂質濃度對粒度的影響

圖21：靜態混合器內徑對脂質體大小的影響

圖22：水相流速對脂質體大小的影響

圖23：在一個批次中組合測試參數

圖24：與緩衝劑和藥物物質混合後的脂質體的粒度

圖25：A：冷凍乾燥程序運行1；B：冷凍乾燥程序運行2

圖26：測試的配製劑和獲得的EE%的概述

圖27：脂質含量對EE%的影響：A：逐步重建；B：一步重建)

圖28：A：冷凍乾燥法對EE%的影響；B：重建方法對EE%的影響

圖29：測試的配製劑和獲得的EE%的概述

圖30：A：對於配製劑F531-03-008P056的亞批次獲得的EE%結果；B：對於配製劑F531-03-008P064的亞批次獲得的EE%結果。

圖31：脂質體CD-RAP Pk批次的穩定性結果

定義

在下面詳細描述本發明之前，應當理解，本發明不限於本文描述的特定方法，方案和試劑，因為這些可以變化。還應當理解，本文中使用的術語僅用於描述特定實施方案的目的，並且不旨在限制本發明的範圍，其將僅由所附請求項書限制。除非另有定義，本文中使用的所有技術和科學術語具有與本領域普通技術人員通常理解的相同的含義。

在本說明書的整個文本中引用了幾個文件。無論是上文還是下文，本文引用的每篇文獻(包括所有專利，專利申請，科學出版物，製造商的說明書，用法說明等)通過提及整體併入本文。本文中的任何內容不應被解釋為承認憑藉在先發明，本發明沒有資格早於此類公開。本文中引用的一些文獻表徵為“通過提及併入”。在此類併入的參考文獻的定義或教導與本說明書中所述的定義或教導之間存在衝突的情況下，本說明書的文本優先。

在下文中，將描述本發明的要素。這些要素用具體實施方案列出，然而，應當理解，它們可以以任何方式和任何數量組合以產生另外的實施方案。各種描述的示例和優選實施方案不應解釋為將本發明限於僅明確描述的實施方案。此描述應當理解為支持並涵蓋將明確描述的實施方案與任何數量的所公開和/或優選的要素組合的實施方案。此外，本申請中所有描述的要素的任何排列和組合應當認為通過本申請的描述被公開，除非上下文另有說明。

貫穿本說明書和所附的請求項書，除非上下文另有要求，詞語“包括”以及諸如“包括”等變型將理解為暗示包括所述的整數或步驟或整數或步驟的組，但不排除任何其它整數或步驟或整數或步驟組。

如在本說明書和所附請求項書中所使用的，除非上下文另有明確說明，單數形式“一種”，“一個”和“該/所述”包括複數指稱。

當與數值結合使用時，術語“約”意在包括在具有比所指示的數值小5%的下限和具有比所指示的數值大5%的上限的範圍內的數值值。

如本文中使用的，術語“脂質”表示任何脂溶性分子。脂質通常由脂族烴鏈組成，難溶于水但溶於非極性有機溶劑中。脂質是活細胞中的分子的必需基團，其在能量貯存中，作為細胞膜的結構組分和作為信號傳導分子具有重要作用。脂質的例子包括但不限於脂肪醯基，脂肪醇，固醇脂質，如膽固醇，甘油脂，如甘油單酯(單醯基甘油)，甘油二酯(二醯基甘油)或甘油三酯(三醯基甘油，TAG)，甘油磷脂，糖脂，鞘脂，硫脂，聚酮化合物，異戊烯醇脂質(prenol lipid)。

如本文中使用的，術語“脂肪醯基”是指通過乙醯基-CoA引物與丙二醯-CoA(或甲基丙二醯-CoA)基團的鏈延長合成的不同組的分子，其可以含有環狀官能性和/或用雜原子取代。脂肪醯基的例子包括但不限於脂肪酸和共軛物(FA01)，如直鏈脂肪酸(FA0101)，支鏈脂肪酸(FA0102)，不飽和脂肪酸(FA0103)，氫過氧化脂肪酸(FA0104)，羥基脂肪酸(FA0105)，氧脂肪酸(oxo fatty acid)(FA0106)，環氧脂肪酸(FA0107)，甲氧基脂肪酸(FA0108)，鹵化脂肪酸(FA0109)，胺基脂肪酸(FA0110)，氰基脂肪酸(FA0111)，硝基脂肪酸(FA0112)，硫代脂肪酸(thia fatty acid)(FA0113)，碳環脂肪酸(carbocyclic fatty acid)(FA0114)，雜環脂肪酸(FA0115)，分枝菌酸(FA0116)和二羧酸(FA0117)；類十八烷(octadecanoids)(FA02)，如12-氧代植物二烯酸(12-oxophytodienoic acid)代謝物(FA0201)，茉莉酮酸(FA0202)和其它類十八烷(FA0200)；類花生酸類(FA03)，如前列腺素類(FA0301)，白三烯類(FA0302)，血栓烷類(FA0303)，脂氧素(FA0304)，羥基/氫過氧二十碳三烯酸(FA0305)，羥基/氫過氧二十碳四烯酸(FA0306)，羥基/氫過氧二十碳五烯酸(FA0307)，環氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids)(FA0308)，羥基環氧素類(hepoxilins)(FA0309)，levuglandins(FA0310)，異前列腺素(FA0311)，clavulones及其衍生物(FA0312)；和其它類二十烷(Eicosanoids)(FA0300)；類二十二烷(docosanoids)(FA04)；脂肪醇(FA05)；脂肪醛(FA06)，脂肪酯(FA07)，如蠟單酯(wax monoesters)(FA0701)，蠟二酯(wax diester)(FA0702)，氰基酯(FA0703)，內酯(FA0704)，脂肪醯基CoA(FA0705)，脂肪醯基ACP(FA0706)，脂肪醯基肉鹼(FA0707)和脂肪醯基腺苷酸(FA0708)；脂肪醯胺(fatty amides)(FA08)，如伯醯胺(primary amides)(FA0801)，N-醯基胺(FA0802)，脂肪醯基高絲胺酸內酯(FA0803)和N-醯基乙醇胺(內源性大麻素(endocannabinoids))(FA0804)；脂肪腈(FA09)；脂肪醚(FA10)；烴(FA11)；氧化烴(FA12)；脂肪醯基糖苷(FA13)；和其它脂肪醯基(FA00)。脂肪酸結構是生物脂質的最基本結構之一，並且通常用作結構上更複雜的脂質的結構塊。“脂肪酸”由包含賦予分子以極性的親水頭(例如甘油，神經鞘胺醇)和不溶于水的非極性疏水尾的羧酸基團的烴鏈製成。碳鏈可以是飽和的或不飽和的，即可以在兩個碳原子之間包含無一，或一個或多個雙鍵，並且可以具有4-28個碳原子，即4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、或28個碳原子。不飽和脂肪酸中的雙鍵作為順式或反式幾何異構體存在，影響分子的分子構型。還可以附接含有氧，鹵素，氮和/或硫的其它官能團。在活細胞中，通過在稱為脂肪酸合成的過程中經由酶脂肪酸合酶進行的乙醯CoA引物與丙二醯CoA或甲基丙二醯CoA基團的鏈延伸來合成脂肪酸。飽和脂肪酸的例子包括但不限於辛酸(CH3(CH2)6COOH；8：0)，癸酸(CH3(CH2)8COOH；10：0)，月桂酸(CH3(CH2)10COOH；12：0)，肉豆蔻酸(CH3(CH2)12COOH；14：0)，棕櫚酸(CH3(CH2)14COOH；16：0)，硬脂酸(CH3(CH2)16COOH；18：0)，花生酸(CH3(CH2)18COOH；20：0)，山酸(CH3(CH2)20COOH；22：0)，木蠟酸(CH3(CH2)22COOH； 24：0)，和蠟酸(CH3(CH2)24COOH；26：0)。

不飽和脂肪酸的例子包括但不限於肉豆蔻烯酸(myristoleic acid)(CH3(CH2)3CH=CH(CH2)7COOH；14：1)，棕櫚油酸(palmitoleic acid)(CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7COOH；16：1)，sapienic acid(CH3(CH2)8CH=CH(CH2)4COOH；16：1)，油酸(CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH；18：1)，反油酸(Elaidic acid)(CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH；18：1)，異油酸(Vaccenic acid)(CH3(CH2)5CH=CH(CH2)9COOH；18：1)，亞油酸(CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH；18：2)，反亞油酸(Linoelaidic acid)(CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH，18：2)，和α-亞麻酸(CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH；18：3)。

術語“甘油脂”或“甘油酯”是指酯化的甘油，其主要由單取代，二取代和三取代的甘油組成，最主要的成員是甘油的脂肪酸三酯(所謂的甘油三酯)，其中甘油的3個羥基基團各自被酯化，通常由不同的脂肪酸酯化。甘油脂主要作為能量貯存發揮功能，並且因此，構成動物組織中貯存脂肪的大部分。甘油脂的例子包括但不限於單取代基甘油(monoradylglycerols)，二取代基甘油(diradylglycerols)(GL02)，三取代基甘油(triradylglycerols)(GL03)，如例如甘油基三硬脂酸酯(glyceryl tristearate)(硬脂(stearin))；糖基單取代基甘油(glycosylmonoradylglycerols)(GL04)，糖基二取代基甘油(glycosyldiradylglycerols)(GL05)和其它甘油脂(GL00)。

磷脂是細胞的脂質雙層的關鍵組分，其充當細胞膜的主要組分和細胞內和細胞間蛋白質的結合位點。磷脂包含甘油(甘油磷脂)或神經鞘胺醇(鞘脂)，通過酯連接與甘油或神經鞘胺醇結合的脂肪酸，磷酸基團和簡單的有機分子，如例如膽鹼，絲胺酸或乙醇胺。

甘油膦基脂(glycerophosphinolipid)包括對羥基基團酯化兩個脂肪酸和膦(IUPAC名稱：磷烷)的作為醇的甘油。甘油膦醯基脂(glycerophosphonolipids)包括對羥基基團酯化兩個脂肪酸和亞磷酸的作為醇的甘油。

真核細胞中的一些甘油磷脂(glycerophospholipid)，如磷脂醯肌醇和磷脂酸，也作為膜衍生的第二信使的前體或直接作為膜衍生的第二信使發揮功能。此外，它們參與代謝和細胞信號傳導。此外，還存在烷基連接的和1Z-烯基連接的(縮醛磷脂)甘油磷脂，以及古細菌中的二烷基醚變體。甘油磷脂的例子包括但不限於甘油磷酸膽鹼(glycerophosphocholines)(GP01)如二醯基甘油磷酸膽鹼(diacylglycerophosphocholines)(GP0101)，1-烷基，2-醯基甘油磷酸膽鹼(1-alkyl,2-acylglycerophosphocholines)(GP0102)，1-(1Z烯基)，2-醯基甘油磷酸膽鹼(1-(1Z-alkenyl),2-acylglycerophosphocholines)(GP0103)，二烷基甘油磷酸膽鹼(dialkylglycerophosphocholines)(GP0104)，單醯基甘油磷酸膽鹼(monoacylglycerophosphocholines)(GPO105)，單烷基甘油磷酸膽鹼(monoalkylglycerophosphocholines)(GP0106)，1Z-烯基甘油磷酸膽鹼(1Z-alkenylglycerophosphocholines)(GP0107)，1-醯基，2-烷基甘油磷酸膽鹼(1-acyl,2-alkylglycerophosphocholines)(GP0108)和1-醯基，2-(1Z-烯基)甘油磷酸膽鹼(1-acyl,2-(1Z-alkenyl)-glycerophosphocholines)(GP0109)；甘油磷酸乙醇胺(glycerophcsphoethanolamines)(GP02)如二醯基甘油磷酸乙醇胺(diacylglycerophosphoethanolamines)(GP0201)，1-烷基，2-醯基甘油磷酸乙醇胺(1-alkyl,2-acylglycerophosphoethanolamines)(GP0202)，1-(1Z烯基)，2-醯基甘油磷酸乙醇胺(1-(1Z-alkenyl),2-acylglycerophosphoethanolamines)(GP0203)，二烷基甘油磷酸乙醇胺(dialkylglycerophosphoethanolamines)(GP0204)，單醯基甘油磷酸乙醇胺(monoacylglycerophosphoethanolamines)(GP0205)，單烷基甘油磷酸乙醇胺(monoalkylglycerophosphoethanolamines)(GP0206)，1Z-烯基甘油磷酸乙醇胺(1Z- alkenylglycerophosphoethanolamines)(GP0207)和1-醯基，2-烷基甘油磷酸乙醇胺(1-acyl,2-alkylglycerophosphoethanolamines)(GP0208)；甘油磷酸絲胺酸(glycerophosphoserines)(GP03)如二醯基甘油磷酸絲胺酸(diacylglycerophosphoserines)(GP0301)，1-烷基，2-醯基甘油磷酸絲胺酸(1-alkyl,2-acylglycerophosphoserines)(GP0302)，1-(1Z烯基)，2-醯基甘油磷酸絲胺酸(1-(1Z-alkenyl),2-acylglycerophosphoserines)(GP0303)，二烷基甘油磷酸絲胺酸(dialkylglycerophosphoserines)(GP0304)，單醯基甘油磷酸絲胺酸(monoacylglycerophosphoserines)(GP0305)，單烷基甘油磷酸絲胺酸(monoalkylglycerophosphoserines)(GP0306)和1Z-烯基甘油磷酸絲胺酸(1Z-alkenylglycerophosphoserines)(GP0307)；甘油磷酸甘油(glycerophosphoglycerols)(GP04)如二醯基甘油磷酸甘油(diacylglycerophosphoglycerols)(GP0401)，1-烷基，2-醯基甘油磷酸甘油(1-alkyl,2-acylglycerophosphoglycerols)(GP0402)，1-(1Z烯基)，2-醯基甘油磷酸甘油(1-(1Z-alkenyl),2-acylglycerophosphoglycerols)(GP0403)，二烷基甘油磷酸甘油(dialkylglycerophosphoglycerols)(GP0404)，單醯基甘油磷酸甘油(monoacylglycerophosphoglycerols)(GP0405)，單烷基甘油磷酸甘油(monoalkylglycerophosphoglycerols)(GP0406)，1Z-烯基甘油磷酸甘油(1Z-alkenylglycerophosphoglycerols)(GP0407)，二醯基甘油磷酸二取代甘油(diacylglycerophosphodiradylglycerols)(GP0408)，二醯基甘油磷酸單取代甘油(diacylglycerophosphomonoradylglycerols)(GP0409)，單醯基甘油磷酸單取代甘油(monoacylglycerophosphomonoradylglycerols)(GP0410)和1-醯基，2-烷基甘油磷酸甘油(1-acyl,2-alkylglycerophosphoglycerols)(GP0411)；甘油磷酸甘油磷酸酯(glycerophosphoglycerophosphates)(GP05)如二醯基甘油磷酸甘油磷酸酯(diacylglycerophosphoglycerophosphates)(GP0501)，1-烷基，2-醯基甘油磷酸甘油磷酸酯(1-alkyl,2- acylglycerophosphoglycerophosphates)(GP0502)，1-(1Z烯基)，2-醯基甘油磷酸甘油磷酸酯(1-(1Z-alkenyl),2-acylglycerophosphoglycerophosphates)(GP0503)，二烷基甘油磷酸甘油磷酸酯(dialkylglycerophosphoglycerophosphates)(GP0504)，單醯基甘油磷酸甘油磷酸酯(monoacylglycerophosphoglycerophosphates)(GP0505)，單烷基甘油磷酸甘油磷酸酯(monoalkylglycerophosphoglycerophosphates)(GP0506)和1Z-烯基甘油磷酸甘油磷酸酯(1Z-alkenylglycerophosphoglycerophosphates)(GP0507)；甘油磷酸肌醇(Glycerophosphoinositols)(GP06)如二醯基甘油磷酸肌醇(diacylglycerophosphoinositols)(GP0601)，1-烷基，2-醯基甘油磷酸肌醇(1-alkyl,2-acylglycerophosphoinositols)(GP0602)，1-(1Z烯基)，2-醯基甘油磷酸肌醇(1-(1Z-alkenyl),2-acylglycerophosphoinositols)(GP0603)，二烷基甘油磷酸肌醇(dialkylglycerophosphoinositols)(GP0604)，單醯基甘油磷酸肌醇(monoacylglycerophosphoinositols)(GP0605)，單烷基甘油磷酸肌醇(monoalkylglycerophosphoinositols)(GP0606)和1Z-烯基甘油磷酸肌醇(1Z-alkenylglycerophosphoinositols)(GP0607)；甘油磷酸肌醇單磷酸酯(glycerophosphoinositol monophosphates)(GP07)如二醯基甘油磷酸肌醇單磷酸酯(diacylglycerophosphoinositol monophosphates)(GP0701)，1-烷基，2-醯基甘油磷酸肌醇單磷酸酯(1-alkyl,2-acylglycerophosphoinositol monophosphates)(GP0702)，1-(1Z烯基)，2-醯基甘油磷酸肌醇單磷酸酯(1-(1Z-alkenyl),2-acylglycerophosphoinositol monophosphates)(GP0703)，二烷基甘油磷酸肌醇單磷酸酯(dialkylglycerophosphoinositol monophosphates)(GP0704)，單醯基甘油磷酸肌醇單磷酸酯(monoacylglycerophosphoinositol monophosphates)(GP0705)，單烷基甘油磷酸肌醇單磷酸酯(monoalkylglycerophosphoinositol monophosphates)(GP0706)和1Z- 烯基甘油磷酸肌醇單磷酸酯(1Z-alkenylglycerophosphoinositol monophosphates)(GP0707)；甘油磷酸肌醇二磷酸酯(glycerophosphoinositol bisphosphates)(GP08)如二醯基甘油磷酸肌醇二磷酸酯(diacylglycerophosphoinositol bisphosphates)(GP0801)，1-烷基，2-醯基甘油磷酸肌醇二磷酸酯(1-alkyl,2-acylglycerophosphoinositol bisphosphates)(GP0802)，1-(1Z烯基)，2-醯基甘油磷酸肌醇二磷酸酯(1-(1Z-alkenyl),2-acylglycerophosphoinositol bisphosphates)(GP0803)，單醯基甘油磷酸肌醇二磷酸酯(monoacylglycerophosphoinositol bisphosphates)(GP0804)，單烷基甘油磷酸肌醇二磷酸酯(monoalkylglycerophosphoinositol bisphosphates)(GP0805)和1Z-烯基甘油磷酸肌醇二磷酸酯(1Z-alkenylglycerophosphoinositol bisphosphates)(GP0806)；甘油磷酸肌醇三磷酸酯(glycerophosphoinositol trisphosphates)(GP09)如二醯基甘油磷酸肌醇三磷酸酯(diacylglycerophosphoinositol trisphosphates)(GP0901)，1-烷基，2-醯基甘油磷酸肌醇三磷酸酯(1-alkyl,2-acylglycerophosphoinositol trisphosphates)(GP0902)，1-(1Z烯基)，2-醯基甘油磷酸肌醇三磷酸酯(1-(1Z-alkenyl),2-acylglycerophosphoinositol trisphosphates)(GP0903)，單醯基甘油磷酸肌醇三磷酸酯(monoacylglycerophosphoinositol trisphosphates)(GP0904)，單烷基甘油磷酸肌醇三磷酸酯(monoalkylglycerophosphoinositol trisphosphates)(GP0905)和1Z-烯基甘油磷酸肌醇三磷酸酯(1Z-alkenylglycerophosphoinositol trisphosphates)(GP0906)；甘油磷酸酯(glycerophosphates)(GP10)如二醯基甘油磷酸酯(diacylglycerophosphates)(GP1001)，1-烷基，2-醯基甘油磷酸酯(1-alkyl,2-acylglycerophosphates)(GP1002)，1-(1Z烯基)，2-醯基甘油磷酸酯(1-(1Z-alkenyl),2-acylglycerophosphates)(GP1003)，二烷基甘油磷酸酯(dialkylglycerophosphates)(GP1004)，單醯基甘油磷酸酯 (monoacylglycerophosphates)(GP1005)，單烷基甘油磷酸酯(monoalkylglycerophosphates)(GP1006)和1Z-烯基甘油磷酸酯(1Z-alkenylglycerophosphates)(GP1007)；甘油焦磷酸酯(Glyceropyrophosphates)(GP11)，如二醯基甘油焦磷酸酯(diacylglyceropyrophosphates)(GP1101)和單醯基甘油焦磷酸酯(monoacylglyceropyrophosphates)(GP1102)；甘油磷酸甘油磷酸甘油(glycerophosphoglycerophosphoglycerols)(GP12)如二醯基甘油磷酸甘油磷酸二取代基甘油(diacylglycerophosphoglycerophosphodiradylglycerols)(GP1201)，二醯基甘油磷酸甘油磷酸單取代基甘油(diacylglycerophosphoglycerophosphomonoradylglycerols)(GP1202)，1-烷基，2-醯基甘油磷酸甘油磷酸二取代基甘油(1-alkyl,2-acylglycerophosphoglycerophosphodiradylglycerols)(GP1203)，1-烷基，2-醯基甘油磷酸甘油磷酸單取代基甘油(1-alkyl,2-acylglycerophosphoglycerophosphomonoradylglycerols)(GP1204)，1-(1Z烯基)，2-醯基甘油磷酸甘油磷酸二取代基甘油(1-(1Z-alkenyl),2-acylglycerophosphoglycerophosphodiradylglycerols)(GP1205)，1-(1Z烯基)，2-醯基甘油磷酸甘油磷酸單取代基甘油(1-(1Z-alkenyl),2-acylglycerophosphoglycerophosphomonoradylglycerols)(GP1206)，單醯基甘油磷酸甘油磷酸單取代基甘油(monoacylglycerophosphoglycerophosphomonoradylglycerols)(GP1207)，單烷基甘油磷酸甘油磷酸二取代基甘油(monoalkylglycerophosphoglycerophosphodiradylglycerols)(GP1208)，單烷基甘油磷酸甘油磷酸單取代基甘油(monoalkylglycerophosphoglycerophosphomonoradylglycerols)(GP1209)，1Z-烯基甘油磷酸甘油磷酸二取代基甘油(1Z-alkenylglycerophosphoglycerophosphodiradylglycerols)(GP1210)，1Z-烯基甘油磷酸甘油磷酸單取代基甘油(1Z- alkenylglycerophosphoglycerophosphomonoradylglycerols)(GP1211)，二烷基甘油磷酸甘油磷酸二取代基甘油(dialkylglycerophosphoglycerophosphodiradylglycerols)(GP1212)和二烷基甘油磷酸甘油磷酸單取代基甘油(dialkylglycerophosphoglycerophosphomonoradylglycerols)(GP1213)；CDP-甘油(GP13)，如CDP-二醯基甘油(GP1301)，CDP-1-烷基，2-醯基甘油(GP1302)，CDP-1-(1Z-烯基)，2-醯基甘油(GP1303)，CDP-二烷基甘油(GP1304)，CDP-單醯基甘油(GP1305)，CDP-單烷基甘油(GP1306)和CDP-1Z-烯基甘油(GP1307)；糖基甘油磷脂(glycosylglycerophospholipids)(GP14)如二醯基糖基甘油磷脂(GP1401)，1-烷基，2-醯基糖基甘油磷脂(GP1402)，1-(1Z烯基)，2-醯基糖基甘油磷脂(GP1403)，單醯基糖基甘油磷脂(GP1404)，單烷基糖基甘油磷脂(GP1405)，1Z-烯基糖基甘油磷脂(GP1406)和二烷基糖基甘油磷脂(GP1407)；甘油磷酸肌醇聚糖(GP15)如二醯基甘油磷酸肌醇聚糖(GP1501)，1-烷基，2-醯基甘油磷酸肌醇聚糖(GP1502)，1-(1Z烯基)，2-醯基甘油磷酸肌醇聚糖(GP1503)，單醯基甘油磷酸肌醇聚糖(GP1504)，單烷基甘油磷酸肌醇聚糖(GP1505)，1Z-烯基甘油磷酸肌醇聚糖(GP1506)和二烷基甘油磷酸肌醇聚糖(GP1507)；甘油膦醯基膽鹼(glycerophosphonocholines)(GP16)如二醯基甘油膦醯基膽鹼(diacylglycerophosphonocholines)(GP1601)，1-烷基，2-醯基甘油膦醯基膽鹼(GP1602)，1-(1Z烯基)，2-醯基甘油膦醯基膽鹼(GP1603)，二烷基甘油膦醯基膽鹼(GP1604)，單醯基甘油膦醯基膽鹼(GP1605)，單烷基甘油膦醯基膽鹼(GP1606)和1Z-烯基甘油磷醯膽鹼(GP1607)；甘油膦醯基乙醇胺(GP17)如二醯基甘油膦醯基乙醇胺(GP1701)，1-烷基，2-醯基甘油膦醯基乙醇胺(GP1702)，1-(1Z烯基)，2-醯基甘油膦醯基乙醇胺(GP1703)，二烷基甘油膦醯基乙醇胺(GP1704)，單醯基甘油膦醯基乙醇胺(GP1705)，單烷基甘油膦醯基乙醇胺(GP1706)和1Z-烯基甘油膦醯乙醇胺 (GP1707)；二甘油四醚磷脂(caldarchaeols)(GP18)；甘油-壬醇四醚磷脂(glycerol-nonitol tetraether phospholipids)(GP19)；氧化甘油磷脂(GP20)，如氧化甘油磷酸膽鹼(GP2001)，氧化甘油磷酸乙醇胺(GP2002)和氧化心磷脂(GP2003)；和其它甘油磷脂(GP00)。

在生物膜中，甘油磷脂包括但不限於磷脂酸(磷脂酸酯)(PA)，磷脂醯乙醇胺(腦磷脂)(PE)，磷脂醯膽鹼(卵磷脂)(PC)，磷脂醯絲胺酸(PS)和磷酸肌醇，如磷脂醯肌醇(PI)，磷脂醯肌醇磷酸(PIP)，磷脂醯肌醇二磷酸(PIP2)，磷脂醯肌醇三磷酸(PIP3)，心磷脂和溶血磷脂是最突出的。

天然存在的磷脂衍生物包括但不限於蛋PC，蛋PG，大豆PC，氫化大豆PC和鞘磷脂。合成磷脂衍生物包括但不限於磷脂酸(DMPA，DPPA，DSPA)，磷脂醯膽鹼(DDPC，DLPC，DMPC，DPPC，DSPC，DOPC，POPC，DEPC)，磷脂醯甘油(DMPG，DPPG，DSPG，POPG)，磷脂醯乙醇胺(DMPE，DPPE，DSPE DOPE)，磷脂醯絲胺酸(DOPS)和PEG磷脂(mPEG-磷脂，聚甘油-磷脂，官能化磷脂，末端活化磷脂)。

“神經鞘脂”包括類神經鞘胺醇鹼(sphingoid base)主鏈，哺乳動物的主要類神經鞘胺醇鹼是神經鞘胺醇。主要的哺乳動物類神經鞘胺醇鹼是二氫神經鞘胺醇和神經鞘胺醇，而二氫神經鞘胺醇和植物神經鞘胺醇是酵母中主要的類神經鞘胺醇鹼。神經鞘胺醇主鏈可以與通常帶電的頭基(例如乙醇胺，絲胺酸或膽鹼)O-連接，並與醯基(如脂肪酸)醯胺連接。脂肪酸通常是飽和的或單不飽和的，鏈長度為16至26個碳原子。類神經鞘胺醇的例子包括但不限於類神經鞘胺醇鹼(SP01)，如鞘-4-氨醇(sphing-4-enines)(神經鞘胺醇)(SP0101)，二氫神經鞘胺醇(sphinganines)(SP0102)，4-羥基神經鞘胺醇(植物神經鞘胺醇)(SP0103)，類神經鞘胺醇鹼同源物和變體(SP0104)，類神經鞘胺醇鹼1-磷酸(SP0105)，溶血鞘磷脂(Lysosphingomyelins)和溶血鞘糖脂(lysoglycosphingolipids)(SP0106)，N-甲基化類神經鞘胺醇鹼(SP0107)和類神經鞘胺醇鹼類似物(SP0108)；神經醯胺(SP02)，諸如N-醯基神經鞘胺醇(神經醯胺)(SP0201)，N-醯基二氫神經鞘胺醇(二氫神經醯胺)(SP0202)，N-醯基-4-羥基二氫神經鞘胺醇(植物神經醯胺)(SP0203)，醯基神經醯胺(SP0204)、和神經醯胺1-磷酸酯(SP0205)；神經鞘磷脂(SP03)，如神經醯胺磷酸膽鹼(鞘磷脂)(SP0301)，神經醯胺磷酸乙醇胺(SP0302)和神經醯胺磷酸肌醇(SP0303)；神經膦醯鞘脂(phosphonosphingolipid)(SP04)；中性鞘糖脂(SP05)如簡單Glc系列(SP0501)，GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc-(Globo系列)(SP0502)，GalNAcβ1-4Galβ1-4Glc-(Ganglio系列)(SP0503)，Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc-(Lacto系列)(SP0504),Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc-(Neolacto系列)(SP0505),GalNAcβ1-3Galα1-3Galβ1-4Glc-(Isoglobo系列)(SP0506),GlcNAcβ1-2Manα1-3Manβ1-4Glc-(Mollu系列)(SP0507),GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3Manβ1-4Glc-(Arthro系列)(SP0508)，Gal-(Gala系列)(SP0509)和其它中性鞘糖脂(SP0500)；酸性鞘糖脂(SP06)，如神經節苷脂(SP0601)，磺基鞘糖脂(硫苷脂)(SP0602)，葡萄糖醛酸鞘脂(glucuronosphingolipids)(SP0603)，磷酸鞘糖脂(phosphoglycosphingolipids)(SP0604)和其它酸性鞘糖脂(SP0600)；鹼性鞘糖脂(SP07)；兩性鞘糖脂(SP08)；偶砷鞘脂(arsenosphingolipids)(SP09)；和其它鞘脂(SP00)。

神經醯胺(N-醯基類神經鞘胺醇鹼)是具有醯胺連接的脂肪酸的類神經鞘胺醇鹼衍生物的主要亞類。神經醯胺的生物相關例子包括但不限於神經醯胺磷醯膽鹼(SPH)，神經醯胺磷酸乙醇胺(Cer-PE)和神經醯胺磷脂醯甘油。哺乳動物的主要磷酸鞘脂是鞘磷脂(例如神經醯胺，磷酸膽鹼)。“鞘糖脂”(glycosphingolipid)由經由糖苷鍵與類神經鞘胺醇鹼連接的一個或多個糖殘基構成。例子是鞘糖脂，如但不限於腦苷脂和神經節苷脂。

術語“糖脂”是指其中的脂肪酸直接與糖主鏈連接，形成與膜雙層相容的結構的分子。糖脂的例子包括但不限於醯基胺基糖 (SL01)，如單醯基胺基糖(SL0101)，二醯基胺基糖(SL0102)，三醯基胺基糖(SL0103)，四醯基胺基糖(SL0104)，五醯基胺基糖(SL0105)，六醯基胺基糖(SL0106)和七醯基胺基糖(SL0107)；醯基胺基糖聚糖(SL02)；醯基海藻糖(SL03)；醯基海藻糖聚糖(SL04)；其它醯基糖(SL05)；和其它糖脂(SL00)。

與甘油磷脂和鞘脂一起，“固醇脂質”，也稱為“類固醇”，如但不限於膽固醇及其衍生物，是作為激素和作為信號傳導分子發揮各種生物學作用的細胞膜脂質的重要組分。類固醇具有四個稠合碳環的核心結構，其可以酯化成碳鏈。十八碳(C18)類固醇包括雌激素家族，而C19類固醇包括雄激素，如睾酮和雄酮。C21亞類包括孕激素以及糖皮質激素和鹽皮質激素。包含各種形式的維生素D的司可固醇類(secosteroids)的特徵在於核心結構的B環的切割。固醇的其它例子是膽汁酸及其綴合物，其在哺乳動物中是膽固醇的氧化衍生物並且在肝臟中合成。植物等同物是植物固醇，例如β-穀固醇，豆固醇和菜子固醇；後一種化合物也可用作藻類生長的生物標誌物。真菌細胞膜中主要的固醇是麥角固醇。固醇脂質的例子包括但不限於固醇(ST01)，如膽固醇和衍生物(ST0101)，膽固醇酯(ST0102)，麥角固醇和C24-甲基衍生物(ST0103)，豆固醇(stigmasterols)和C24-乙基衍生物(ST0104)，C24丙基固醇及衍生物(ST0105)，柳珊瑚固醇(gorgosterols)及其衍生物(ST0106)，呋喃固醇(furostanols)及衍生物(ST0107)，螺旋固烷醇(spirostanols)及衍生物(ST0108)，呋喃螺旋固烷醇(furospirostanols)及其衍生物(ST0109)，環木菠蘿烷醇(cycloartanols)及衍生物(ST0110)，鈣固醇(calysterols)和環丙基側鏈衍生物(ST0111)，強心內酯(cardanolides)和衍生物(ST0112)，蟾蜍甾(bufanolides)和衍生物(ST0113)，油菜甾醇內酯(brassinolides)和衍生物(ST0114)，龍葵次鹼(solanidines)和生物鹼衍生物(ST0115)，和睡茄交酯(withanolides)和衍生物(ST0116)；類固醇(ST02)，如C18類固醇(雌激素)及衍生物(ST0201)，C19類固醇(雄激素)及衍生物(ST0202)，和C21類固醇(糖/鹽皮質激素，孕激素)和衍生物(ST0203)；司可固醇類(ST03)，如維生素D2和衍生物(ST0301)，維生素D3和衍生物(ST0302)，維生素D4和衍生物(ST0303)，維生素D5和衍生物(ST0304)，維生素D6和衍生物(ST0305)，和維生素D7和衍生物(ST0306)；膽汁酸和衍生物(ST04)，如C24膽汁酸，醇和衍生物(ST0401)，C26膽汁酸，醇和衍生物(ST0402)，C27膽汁酸，醇和衍生物(ST0403)，C28膽汁酸，醇和衍生物(ST0404)，C22膽汁酸，醇和衍生物(ST0405)，C23膽汁酸，醇和衍生物(ST0406)，C25膽汁酸，醇和衍生物(ST0407)，和C29膽汁酸，醇和衍生物(ST0408)；類固醇綴合物(ST05)，如糖皮質激素(ST0501)，硫酸鹽(ST0502)，甘胺酸綴合物(ST0503)，牛磺酸綴合物(ST0504)和其它類固醇綴合物(ST0505)；和其它固醇脂質(ST00)。

如本文中使用，術語“聚酮化合物”是指包含結構非常多樣化的成員的家族，其全部通過聚酮化合物合酶途徑經由丙二醯CoA衍生的延伸單元在與脂肪酸合成相似的過程中脫羧縮合而合成。聚酮化合物大致分為三類：I型聚酮化合物(通常由多模式巨大合酶(megasynthases)製造的大環內酯類)，II型聚酮化合物(通常通過解離的酶的迭代作用製造的芳香族分子)和III型聚酮化合物(通常由真菌物種製造的小芳香族分子)。商業上使用的聚酮化合物包括天然抗生素，抗真菌劑，細胞生長抑制劑，抗膽固醇血藥，抗寄生蟲藥，球蟲抑制劑，動物生長促進劑和殺蟲劑。聚酮化合物的例子包括但不限於線性聚酮化合物(PK01)；鹵化己酸配質(acetogenins)(PK02)；番荔枝科己酸配質(annonaceae acetogenin)(PK03)；大環內酯和內酯聚酮化合物(PK04)；安莎黴素(ansamycins)和相關聚酮化合物(PK05)；多烯(polyenes)(PK06)；線性四環素(PK07)；angucycline(PK08)；聚醚聚酮化合物(PK09)；黃麴黴毒素和相關物質(PK10)；松胞菌素(PK11)；黃酮類化合物(PK12)，如花色素(PK1201)，黃烷(flavans)，黃烷醇 (flavanols)和無色花色素類(leucoanthocyanidins)(PK1202)，原花色素(proanthocyanidins)(PK1203)，雙黃酮類(biflavonoids)和多黃酮類(polyflavonoids)(PK1204)，異黃酮類化合物(isoflavonoids)(PK1205)，魚藤酮類化合物黃酮類化合物(rotenoid flavonoids)(PK1206)，紫檀鹼(pterocarpans)(PK1207)，異黃烷(isoflavans)(PK1208)，coumestan黃酮類化合物(PK1209)，新黃酮類化合物(PK1210)，黃酮和黃酮醇(PK1211)，查耳酮和二氫查耳酮(PK1212)，橙酮黃酮類(aurone flavonoids)(PK1213)，黃烷酮(flavanones)(PK1214)，二氫黃酮醇(dihydroflavonols)(PK1215)，和其它黃酮類化合物(PK1216)；芳香族聚酮化合物(PK13)，如單環芳香族聚酮化合物(PK1301)，萘和萘醌(PK1302)，苯並異色醌(benzoisochromanquinones)(PK1303)，蒽和菲(PK1304)，蒽環類化合物(PK1305)，二苯並呋喃(dibenzofurans)，灰黃黴素(griseofulvins)，二苯並吡喃(dibenzopyrans)和口山酮(xanthones)(PK1306)，二苯基甲烷(diphenylmethanes)，醯基間苯三酚(acylphloroglucinols)和二苯甲酮(benzophenones)(PK1307)，縮酚羧酸(depsides)和縮酚酸環醚(depsidones)(PK1308)，二苯醚(diphenyl ethers)，聯苯(biphenyls)，二苄基(dibenzyls)和芪(stilbenes)(PK1309)，苯並呋喃(PK1310)，苯並吡喃(benzopyranoids)(PK1311)和其它芳香族聚酮化合物(PK1312)；非核糖體肽/聚酮化合物雜合體(PK14)；和其它聚酮化合物(PK00)。

術語“異戊烯醇脂質”或“異戊二烯醇脂類(isoprenolides)”是指由五碳前體異戊烯基二磷酸酯(isopentenyl diphosphate)和烯丙基二磷酸二甲酯(dimethylallyl diphosphate)合成的分子，並且主要通過甲羥戊酸途徑產生。在一些細菌(例如大腸桿菌(Escherichia coli))和植物中，通過甲基赤蘚糖醇磷酸(methylerythritol phosphate)途徑製備類異戊二烯前體。由於通過連續添加C5單元形成簡單的類異戊二烯(線性醇，二磷酸鹽等)，因而方便地分類類異戊二烯，那些結構的多萜亞類含有多於40個碳(即8個類異戊二烯單元)。異戊烯醇脂質(Prenol lipid)及其磷酸化衍生物在寡糖跨膜轉運中起重要作用。聚異戊二烯磷酸糖和聚異戊二烯二磷酸糖在胞質外糖基化反應，胞外多糖生物合成(例如，細菌中的肽聚糖聚合)和真核蛋白N-糖基化中發揮功能。異戊烯醇脂質的例子包括但不限於類異戊二烯(PR01)，如C5類異戊二烯(半萜)(PR0101)，C10類異戊二烯(單萜)(PR0102)，C15類異戊二烯(倍半萜)(PR0103)，C20類異戊二烯(二萜)(PR0104)，C25類異戊二烯(二倍半萜)(PR0105)，C30類異戊二烯(三萜)(PR0106)，C40類異戊二烯(四萜)(PR0107)，多萜(PR0108)，和類視色素(retinoids)(PR0109)；醌和氫醌(PR02)，如泛醌(ubiquinones)(PR0201)，維生素E(PR0202)，和維生素K(PR0203)；多萜醇(polyprenols)(PR03)，如細菌萜醇(bactoprenols)(PR0301)，細菌萜醇單磷酸酯(bactoprenol monophosphates)(PR0302)，細菌萜醇二磷酸酯(bactoprenol diphosphates)(PR0303)，植物異戊烯醇(phytoprenols)(PR0304)，植物異戊烯醇單磷酸酯(phytoprenol monophosphates)(PR0305)，植物異戊烯醇二磷酸酯(phytoprenol diphosphates)(PR0306)，多萜醇(dolichols)(PR0307)，多萜醇單磷酸酯(dolichol monophosphates)(PR0308)，和多萜醇二磷酸酯(dolichol diphosphates)(PR0309)；藿烷類(hopanoids)(PR04)；和其它異戊烯醇脂質(PR00)。

如本文中使用的，術語“脂質雙層”是指通常在水性環境中自發形成的脂質的雙層結構，其中親水頭在雙層的每個表面面向水，並且疏水尾部在內部中擋住水。如本文中使用的，該術語涵蓋所有幾何學的雙層，包括但不限於平面和彎曲雙層。

如本文中使用的，術語“微胞”是指分散在液體膠體中的脂質的聚集體。水溶液中的典型微胞形成聚集體，其中親水頭與周圍溶液接觸，並且疏水尾部在微胞的中心。在非極性溶劑中，某些脂質也可形成反向微胞。

如貫穿本說明書和請求項書使用的，術語“脂質體”是指包含脂質雙層膜的囊泡。因此，脂質體不同於微胞，因為它們包含脂質雙層，而微胞由脂質單層構成。脂質體的脂質膜可以包含組分，如但不限於脂質，蛋白質和其它膜相關組分。脂質體的主要類型包括多層囊泡(MLV)，小單層囊泡(SUV)，大單層囊泡(LUV)，巨單層囊泡(GUV)。通常，SUV和LUV脂質體的直徑在1nm和1μm之間，並且GUV脂質體的直徑在1μm和300μm之間，即1，2，3，4，5，10，15，20，25，50，75，100，150，200，250，或300μm。通常，脂質體在疏水膜內囊封液體核心，通常為水溶液。雖然溶解的親水性溶質不能容易地通過脂質雙層，但是疏水性化學品可以溶解到膜中，因此，脂質體可以包含疏水性和親水性分子兩者。脂質體的脂質雙層可以與其它雙層如其它脂質體或細胞膜融合。從而，脂質體可以將其內容物遞送到第二脂質體或細胞。因此，為了避免兩個相鄰脂質體的融合，這些脂質體通常彼此保持一定距離以防止脂質雙層的融合。兩個脂質體之間的距離的程度取決於脂質體的大小，脂質體的組成和溶劑的化學性質。

術語“核酸”或“核酸分子”同義使用並且理解為脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸鹼基或兩者的單鏈或雙鏈寡聚物或聚合物。通常，通過單個核苷酸單體之間的磷酸二酯鍵形成核酸。在本發明的上下文中，術語核酸包括但不限於核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)分子。核酸的單鏈的描述還定義(至少部分)互補鏈的序列。核酸可以是單鏈或雙鏈，或可以包含雙鏈和單鏈序列兩者的部分。核酸可以通過生物學，生物化學或化學合成方法或本領域已知的任何方法獲得。如本文中使用的，術語“核酸”包括術語“多核苷酸”和“寡核苷酸”。當在本發明的不同態樣之一的上下文中使用時，術語“寡核苷酸”是指長度多達約50個核苷酸，例如2至約50個核苷酸的核酸。當在本發明的不同態樣之一的上下文中使用時，術語“多核苷酸”是指長度大於約50個核苷酸，例如51個或更多個核苷酸的核酸。探針和引物是用於通過與靶核酸雜交(探針)或通過與靶核酸雜交和擴增來檢測樣品中或體內的核酸的短多核苷酸或寡核苷酸。術語“可讀框”(ORF)是指可以轉譯成胺基酸的核苷酸序列。通常，此類ORF含有起始密碼子，通常具有3個核苷酸的倍數的長度的後續區域，但在給定閱讀框中不含有終止密碼子(TAG，TAA，TGA，UAG，UAA或UGA)。通常，ORF天然存在或者是人工構建的，即通過基因技術手段。ORF編碼蛋白質，其中其可以轉譯成的胺基酸形成肽連接的鏈。

胺基酸是由胺(-NH2)和羧酸(-COOH)官能團，以及每個胺基酸特有的側鏈構成的有機化合物。通常，胺基酸根據其側鏈的性質分為四組：側鏈可以使胺基酸為弱酸或弱鹼，如果側鏈為極性，那麼為親水物，如果它為非極性，那麼為疏水物。標準胺基酸如下：

在本發明的不同態樣的上下文中，術語“肽”是指通過肽鍵連接的胺基酸的短聚合物。它具有與蛋白質相同的化學(肽)鍵，但通常長度更短。最短的肽是二肽，由通過單個肽鍵連接的兩個胺基酸組成。也可以有三肽，四肽，五肽等。優選地，肽具有高達8，10，12，15，18或20個胺基酸的長度。肽具有胺基末端和羧基末端，除非它是環肽。

在本發明的不同態樣的上下文中，術語“多肽”是指通過肽鍵鍵合在一起的單個線性鏈胺基酸，並且優選包含至少約21個胺基酸。多肽可以是由多於一條鏈構成的蛋白質的一條鏈，或者如果蛋白質由一條鏈構成，那麼其可以是蛋白質本身。

在本發明的不同態樣的上下文中，術語“蛋白質”是指包含一個或多個恢復二級和三級結構的多肽的分子，並且另外，指由形成四級結構的幾個多肽(即幾個亞基)構成的蛋白質。在本發明的上下文中，蛋白質或多肽的一級結構是多肽鏈中的胺基酸序列。蛋白質中的二級結構是蛋白質的局部區段的一般三維形式。然而，它不描述三維空間中的具體原子位置，其被認為是三級結構。在蛋白質中，二級結構由主鏈醯胺和羧基基團之間的氫鍵模式限定。蛋白質的三級結構是由原子坐標確定的蛋白質的三維結構。四級結構是在多亞基複合物中多個折疊或捲曲的蛋白質或多肽分子分子的排列。術語“胺基酸鏈”和“多肽鏈”在本發明的上下文中同義使用。

如本文所使用的，術語“折疊”或“蛋白質折疊”是指蛋白質呈現其三維形狀或構象的過程，即，由此如下指導蛋白質形成特定的三維形狀，即首先通過非共價相互作用進行，諸如但不限於氫鍵鍵合，金屬配位，疏水力，範德華力，π-π相互作用和/或靜電效應。其次，在折疊過程中形成兩個分子內二硫鍵。因此，術語“折疊蛋白質”是指蛋白質，其三維形狀，如其二級，三級或四級結構。

“變性”是其中蛋白質失去其天然狀態下存在的四級，三級和/或二級結構的過程，通常導致其生物功能的喪失。變性蛋白可以展現出寬的特徵範圍，包括但不限於構象變化，溶解性喪失，聚集或完全降解

幾種環境因素影響蛋白質的穩定性，即允許蛋白質實現其功能的結構，三維完整性。這些因素包括但不限於溫度，放射，周圍介質的pH值，肽酶/蛋白酶的存在，蛋白質濃度，鹽濃度，溶劑以及時間。

如本文中使用的，術語“降解”是指其中蛋白質喪失其一級，二級，三級和/或四級結構的過程。因此，術語“降解”涵蓋蛋白質的變性以及從肽鏈中去除單個胺基酸或幾個胺基酸或將肽鏈切割成兩個或更多個片段

如本文中使用的，術語“聚集”是指其中兩個或更多個蛋白質積累和/或凝結在一起的過程。可以發生完整的天然蛋白質以及降解的蛋白質的聚集。經常，蛋白質聚集由蛋白質的疏水基團暴露，然後所述蛋白質積累引起。

CD-RAP是一種分泌性單域蛋白(107aa成熟蛋白，12kDa，Genbank登錄號：AAH05910.1，GI：13543500)，其含有反向平行的β-片層和兩個二硫鍵。TANGO，MIA-2，OTOR是CD-RAP同源蛋白(序列同一性為44%，並且序列同源性為約80%)。CD-RAP的別名是用於自分泌分泌性黑素瘤腫瘤生長抑制活性的MIA。Blesch等人(1994)從惡性黑色素瘤細胞系HTZ-19 dM的上清液克隆MIA作為新型生長調節因子。Weilbach等人(1990)假設MIA是生長調節網絡的一部分。獨立地，Dietz和Sandell(1996)從牛軟骨細胞以蛋白質克隆出CD-RAP，所述蛋白質的表現通過視黃酸處理下調。由於視黃酸抑制軟骨細胞的分化表型，在維持軟骨細胞的分化表型中看到CD-RAP(軟骨衍生的視黃酸敏感蛋白)的功能性背景，即軟骨細胞保持軟骨基質的合成。

CD-RAP是轉錄因子Sox9上游的軟骨分化需要的(Moser,Bosserhoff,Hunziker,Sandell,Fassler,Buettner 2002.Ultrastructural cartilage abnormalities in MIA/CD-RAP-deficient mice.Molecular and Cellular Biology(2002),22(5),1438-1445)。在CD-RAP的存在下，人間充質幹細胞顯示了在糰粒培養物中軟骨標記物聚集蛋白聚糖，骨鈣素和II型膠原mRNA的上調(Tscheudschilsuren,Bosserhoff,Schlegel,Vollmer,Anton,Alt,Schnettler,Brandt,Proetzel,2006.Regulation of mesenchymal stem cell and chondrocyte differentiation by MIA.Exp Cell Res.2006 Jan 1；312(1)：63-72)。CD-RAP通過與BMP-2和TGFbeta3合作維持其表型，因此防止它們進一步分化為骨來阻止軟骨細胞的成骨分化(Tscheudschilsuren,Bosserhoff,Schlegel,Vollmer,Anton,Alt,Schnettler,Brandt,Proetzel,2006.Regulation of mesenchymal stem cell and chondrocyte differentiation by MIA.Exp Cell Res.2006 Jan 1；312(1)：63-72)。CD-RAP被描述為與纖連蛋白(在許多胞外基質中發現)相互作用，直接結合整聯蛋白α4β1和α5β1，並且負調節整聯蛋白活性。整聯蛋白為軟骨細胞充當“傳感器”，以檢測圍繞它們的基質中的變化。與整聯蛋白α5的相互作用調節已知阻斷軟骨形成分化的ERK信號轉導(Schubert,Schlegel,Schmid,Opolka,Grassel,Humphries,Bosserhoff,2010.Modulation of cartilage differentiation by melanoma inhibiting activity/cartilage-derived retinoic acid-sensitive protein(MIA/CD-RAP).Exp Mol Med.2010 Mar 31；42(3)：166-74)。

可以通過化學修飾進一步修飾本發明的蛋白質和多肽(包括蛋白質衍生物，蛋白質變體，蛋白質片段，蛋白質區段，蛋白質表位和蛋白質域)。這意味著此類經化學修飾的多肽包含除20種天然存在的胺基酸之外的其它化學基團。此類其它化學基團的例子包括但不限於糖基化胺基酸和磷酸化胺基酸。多肽的化學修飾可以提供與親本多肽相比有利的性質，例如，下列一種或多種：增強的穩定性，延長的生物半衰期或增加的水溶性。適用於可用於本發明的變體的化學修飾包括但不限於：PEG化，非糖基化的親本多肽的糖基化或親本多肽中存在的糖基化模式的修飾。蛋白質也可以具有附著的非肽基團，諸如例如輔基或輔因子。

術語“表現水平”是指在某一時間點時存在於身體或樣品中的基因產物的量。可以例如依靠從基因表現的蛋白質或mRNA測量/量化/檢測表現水平。可以例如如下量化表現水平：通過將樣品中存在的感興趣的基因產物的量與在相同樣品或參照樣品(例如從相同個體同時採集的樣品或相同樣品的相同大小(重量，體積)的部分)中相同類別的基因產物的總量(總蛋白或mRNA)標準化，或通過鑒定每個限定的樣品大小(重量，體積等)感興趣的基因產物的量。可以依靠如本領域中已知的任何方法測量或檢測表現水平，例如，用於直接檢測和量化感興趣的基因產物的方法(如質譜術)或用於間接檢測和測量感興趣的基因產物的方法，其通常經由感興趣的基因產物與一種或多種對感興趣的基因產物特異性的不同分子或檢測手段(例如引物，探針，抗體，蛋白質支架)的結合起作用。基因拷貝水平的測定還包括確定一個或多個片段的存在或缺乏(例如經由核酸探針或引物，例如定量PCR，多重連接依賴性探針擴增(MLPA)PCR)也在熟練技術人員的知識內。

本文中使用的術語“轉譯後”是指在將核苷酸三聯體轉譯成胺基酸並且在序列中形成與前一胺基酸的肽鍵後發生的事件。可以在形成整個多肽之後或已經在轉譯過程期間在已經轉譯的多肽的那些部分上發生此類轉譯後事件。轉譯後事件通常改變或修飾所得多肽的化學或結構性質。轉譯後事件的例子包括但不限於諸如胺基酸的糖基化或磷酸化或肽鏈的切割(例如通過內肽酶)的事件。

本文中使用的術語“共轉譯”是指在核苷酸三聯體轉譯成胺基酸鏈的過程中發生的事件。這些事件通常改變或改變所得胺基酸鏈的化學或結構性質。共轉譯事件的例子包括但不限於可完全停止轉譯過程或中斷肽鍵形成的事件，導致兩種謹慎的轉譯產物。

如本文中使用的，術語“變體”應理解為與通過其長度或序列的一個或多個變化衍生它的多肽或蛋白質相比不同的多肽或蛋白質。衍生多肽變體或蛋白質變體的多肽或蛋白質也稱為親本多肽或蛋白質。術語“變體”包括親本分子的“片段”或“衍生物”。通常，“片段”在長度或大小上比親本分子小，而“衍生物”與親本分子相比在其序列中表現出一個或多個差異。還涵蓋經修飾的分子，諸如但不限於轉譯後修飾的蛋白質(例如糖基化，生物素化，磷酸化，泛素化，棕櫚醯化或蛋白水解切割的蛋白質)。可以人工構建變體，優選通過基因技術手段，而親本多肽或蛋白質是野生型多肽或蛋白質。然而，天然存在的變體也應理解為由如本文中使用的術語“變體”涵蓋。此外，可用於本發明的變體還可以源自親本分子的同源物，直向同源物或側向同源物，或源自人工構建的變體，條件是該變體展現親本分子的至少一種生物活性，即具有功能活性。

如本文中使用的，“變體”可以以與衍生其的親本多肽或親本蛋白質的一定程度的序列同一性為特徵。更確切地，本發明上下文中的蛋白質變體與其親本多肽展現出至少80%的序列同一性。關於多肽序列比較，在整個說明書中使用術語“至少80%序列同一性”。此表述優選指與相應的參照多肽或與相應的參照多核苷酸的至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%的序列同一性。優選地，所討論的多肽和參考多肽在20，30，40，45，50，60，70，80，90，100或更多個胺基酸的連續區段裡或在參照多肽的整個長度裡展現出指定的序列同一性。

本發明的衍生物可以展現出胺基酸序列中的多至100個(多至1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35，40，45，或50)個變化(即交換，插入，缺失，N-端截短和/或C-端截短)的總數。胺基酸交換可以是保守的和/或非保守的。在優選的實施方案中，本發明的衍生物與衍生它的多肽或蛋白質或域相差多至1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35，40，45，或50個胺基酸交換，優選保守胺基酸改變。

術語“缺失變體”和“片段”在本文中可互換使用。此類變體包括N-端截短，C-端截短和/或內部缺失。片段可以是天然存在的(例如剪接變體)或其可以人工構建，優選通過基因技術手段。優選地，片段(或缺失變體)與親本多肽相比在其N末端和/或其C末端和/或內部，優選在其N-末端，在其N-和C-末端或在其C-末端具有多至1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，或100個胺基酸的缺失。

在比較兩個序列並且沒有規定要與其比較計算序列同一性百分比的參考序列的情況下，要相對於待比較的兩個序列中的較長者計算序列同一性，若沒有另外明確指出的話。如果指定參照序列，那麼基於由相應SEQ ID指定的參考序列的全長測定序列同一性，若沒有另外明確指出的話。例如，與根據SEQ ID NO：1的CD-RAP的胺基酸序列相比，由20個胺基酸組成的肽序列可以展現出18.7%(20/107)的最大序列同一性百分比，而具有長度為54個胺基酸的序列可以展現出50.46%(54/107)的最大序列同一性百分比。可以通過序列比對測定胺基酸序列的相似性，即序列同一性的百分比。此類比對可以用幾種本領域已知的算法進行，優選用Karlin和Altschul(Karlin & Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877)的數學算法，用 hmmalign(HMMER package,http：//hmmer.wustl.edu/)或者用CLUSTAL算法(Thompson,J.D.,Higgins,D.G.& Gibson,T.J.(1994)Nucleic Acids Res.22,4673-80)，其例如在http：//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/或http：//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html或http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_clustalw.html可獲得。使用的優選參數是默認參數，如它們在http：//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/或http：//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html上設置一樣。可以使用例如BLAST，BLAT或BlastZ(或BlastX)計算序列同一性(序列匹配)的等級。將類似的算法併入Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410的BLASTN和BLASTP程序中。用BLASTP程序，得分=50，字長=3進行BLAST蛋白質搜索，以獲得與親本多肽同源的胺基酸序列。為了獲得用於比較目的缺口比對，利用缺口BLAST，如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402中描述的。當利用BLAST和缺口BLAST程序時，使用各個程序的默認參數。可以通過如Shuffle-LAGAN(Brudno M.,Bioinformatics 2003b，19 Suppl 1：I54-I62)或Markov隨機場的建立的同源性定位技術補充序列匹配分析。當在本申請中提及序列同一性的百分比時，如果沒有另外明確指明，那麼相對於較長序列的全長計算這些百分比。

另外/或者，缺失變體可以不是由於如上所述的相應胺基酸的結構缺失，而是由於這些胺基酸被抑制或以其它方式不能實現其生物學功能而發生。通常，此類功能缺失由於改變所得蛋白質的功能性質的對胺基酸序列的插入或胺基酸序列中的交換而發生，諸如但不限於所得蛋白質的化學性質的改變(即疏水性胺基酸交換為親水性胺基酸)，所得蛋白質的轉譯後修飾的改變(例如轉譯後切割或糖基化模式)，或二級或三級蛋白質結構的改變。另外/或者，由於轉錄或轉錄後基因沉默(例如通過siRNA)或抑制性分子(諸如但不限於蛋白質抑制劑或抑制性抗體)的存在或不存在，也可能發生功能缺失。

優選半保守且特別是保守的胺基酸取代，其中胺基酸被化學相關的胺基酸取代。典型的取代在具有脂肪族羥基側鏈的胺基酸中，在具有酸性殘基的胺基酸中，在醯胺衍生物中，在具有鹼性殘基的胺基酸中，或在具有芳香族殘基的胺基酸中。典型的半保守和保守取代是：

如果新的半胱胺酸保持為游離巰基，那麼從A，F，H，I，L，M，P，V，W或Y變為C是半保守的。此外，技術人員將理解，不應取代在空間要求位置處的甘胺酸，並且不應將P引入具有α-螺旋或β-片層結構的蛋白質部分中。

如本文中使用的，術語“切割位點”是指胺基酸序列或核苷酸序列，其中此序列指導分開，例如，因為它被切割酶識別和/或可以被分開。通常，通過水解連接胺基酸的一個或多個肽鍵切割多肽鏈，並且通過水解核苷酸之間的一個或多個磷酸二酯鍵切割多核苷酸鏈。肽或磷酸二酯鍵的切割可以源自化學或酶切割。酶切割是指通過蛋白水解酶(包括但不限於限制性內切核酸酶(例如I型，II型，II型，IV型或人工限制酶)和內切或外切肽酶或蛋白酶(例如絲胺酸蛋白酶，半胱胺酸蛋白酶，金屬蛋白酶，蘇胺酸蛋白酶，天冬胺酸蛋白酶，谷胺酸蛋白酶)獲得的此類切割。通常，酶切割由於自身切割而發生或通過獨立的蛋白水解酶實現。可以發生共轉譯或轉譯後的蛋白質或多肽的酶切割。因而，本文中使用的術語“內肽酶切割位點”是指在胺基酸或核苷酸序列內的切割位點，其中此序列被內肽酶(例如腸肽酶或PA族蛋白酶)切割或可切割。內肽酶的例子包括但不限於胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胃蛋白酶，彈性蛋白酶，凝血酶，膠原酶，弗林蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，內肽酶V8，組織蛋白酶，穀胺醯內肽酶。

或者，術語“切割位點”是指分別防止胺基酸或核苷酸之間形成肽鍵或磷酸二酯鍵的胺基酸序列或核苷酸序列。例如，可以由於多肽或多蛋白的共轉譯自身加工而阻止鍵形成，導致從單個可讀框的單個轉譯事件衍生的兩個不連續轉譯產物。通常，通過由假終止密碼子序列引起的“核糖體跳躍”實現此類自身加工，所述假終止密碼子序列誘導轉譯複合物從一個密碼子移動到下一個而不形成肽鍵。誘導核糖體跳躍的序列的例子包括但不限於由幾種病毒家族使用的病毒2A肽或2A樣肽(本文中都統稱為“2A肽”或可互換地稱為“2A位點”或“2A切割位點”)，所述病毒家族包括微小RNA病毒(Picornavirus)，昆蟲病毒，Aphtoviridae，輪狀病毒和錐蟲屬。最知名的是小RNA病毒科的鼻病毒和口蹄疫病毒的2A位點，其通常用於從單個ORF製造多個多肽。

因而，如本文中使用的，術語“自身切割位點”是指在胺基酸或核苷酸序列內的切割位點，其中此序列在此類切割不牽涉任何額外的分子的情況下或者在首先防止此序列中的肽鍵或磷酸二酯鍵形成(例如通過如上所述的共轉譯自身加工)的情況下被切割或可被切割

應當理解，切割位點通常包含幾個胺基酸或由幾個密碼子編碼(例如，在那些情況下，其中“切割位點”不轉譯成蛋白質，但導致轉譯中斷)。因此，切割位點也可以用於肽接頭的目的，即空間上分開兩個肽。因此，在一些實施方案中，“切割位點”既是肽接頭又提供上述切割功能。在此實施方案中，切割位點可以涵蓋另外的N-和/或C-末端胺基酸。

如本文中使用的，術語“親水”或“親水性”是指分子實體或取代基與極性溶劑，特別是與水或與其它極性基團相互作用的能力(PAC,1994,66,1077.物理有機化學中使用的術語詞匯表(Glossary of terms used in physical organic chemistry)(IUPAC推薦1994))。通常，親水性分子在水或其它極性溶劑中良好溶解。相反，如本文中使用的，術語“疏水”是指不被水吸引或不與水相互作用的分子或分子的一部分。疏水性分子傾向于是非極性的，因此，優選其它中性分子和非極性溶劑，並且通常在水中聚簇在一起，形成微胞。

“疏水性標度(Hydrophobicity scale)”是定義胺基酸殘基的相對疏水性的值。該值越為正數，相應胺基酸的疏水性越大。由於用於測量疏水性的不同方法，在不同的疏水性標度之間存在顯著的差異。Rose等人的標度[G.Rose,A.Geselowitz,G.Lesser,R.Lee和M.Zehfus,Science 229(1985)834-838]和Janin標度[J.Janin,Nature,277(1979)491-492]兩者將半胱胺酸置為最疏水的殘基，因為這兩者都檢查具有已知3-D結構的蛋白質，並將疏水特性定義為在蛋白質內部，而不是在其表面上發現殘基的趨勢(由於半胱胺酸形成必須存在於球狀結構內部的二硫鍵，將半胱胺酸排序為最疏水的)。Kyte和Doolittle標度 [Kyte,J.和Doolittle,R.F.(1982)A simple method for displaying the hydropathic character of a protein.J.Mol.Biol.157,105-132]以及Wolfenden標度[R.Wolfenden,L.Andersson,P.Cullis和C.Southgate,Biochemistry 20(1981)849-855]源自胺基酸側鏈的生理化學性質。這些標度主要源自胺基酸結構的檢查。根據Kyte-Doolittle，個別的胺基酸展現以下親水值。

“GRAVY(親水性總平均值(grand average of hydropathy))值”是表現多肽或蛋白質的疏水性的一個值，並且由所有胺基酸的親水值之和除以蛋白質長度來定義。GRAVY值的計算基於Kyte-Doolittle標度。增加的正值表示較大的疏水性。

如本文中使用的，術語“載體”是指能夠被導入細胞中或將其中包含的蛋白質和/或核酸導入細胞中的蛋白質或多核苷酸或其混合物。在本發明的上下文中，優選由導入的多核苷酸編碼的感興趣的基因在導入的一種或多種載體時在細胞內表現。合適載體的例子包括但不限於質粒，粘粒，噬菌體，病毒或人工染色體。包含編碼一種或多種感興趣的基因產物的一種或多種多核苷酸的載體可以包含進一步的表現控制序列。在包含編碼一種或多種感興趣的基因產物的超過一種多核苷酸的載體中，可以通過一種或多種表現控制序列一起或分別控制表現。更具體地，載體上包含的每個多核苷酸可以通過單獨的表現控制序列控制，或者載體上包含的所有多核苷酸可以通過單個表現控制序列控制。包含在由單個表現控制序列控制的單個載體上的多核苷酸優選形成可讀框。

如本文中使用的，術語“宿主細胞”是指含有載體(例如質粒或病毒)的細胞。宿主細胞可以是原核細胞(例如細菌細胞)或真核細胞(例如真菌，昆蟲或哺乳動物細胞)。細菌細胞包括但不限於大腸桿菌細胞，例如大腸桿菌BL21或大腸桿菌K12。

如本文中使用的，術語“緩衝劑”或“緩衝溶液”是指由弱酸及其共軛鹼的混合物組成的水溶液，或反之亦然。當對其添加少量或中等量的強酸或鹼時，其pH變化非常小，因此其用於防止溶液的pH變化。緩衝液溶液用作在極其多種應用中將pH保持在接近恒定值的手段。對於酸性區域中的緩衝劑，可以通過向緩衝劑添加強酸，如鹽酸將pH調節至期望的值。對於鹼性緩衝劑，可以添加強鹼，如氫氧化鈉。或者，緩衝劑混合物可以由酸及其共軛鹼的混合物製成。例如，乙酸鹽緩衝劑可以由乙酸和乙酸鈉的混合物製成。類似地，鹼性緩衝劑可以由鹼及其共軛酸的混合物製成。緩衝劑的例子包括但不限於磷酸鹽緩衝劑(例如PBS)，檸檬酸鹽緩衝劑(例如SSC)，組胺酸緩衝劑，APS，Bicine，Tris，Tricine，TAPSO，HEPES，TES，MOPS，PIPES，Cacodylate，MES，琥珀酸緩衝劑。

磷酸鹽緩衝鹽水(縮寫為PBS)是一種常用於生物研究的緩衝溶液。它是含有磷酸鈉，氯化鈉和在一些配製劑中氯化鉀和磷酸鉀的基於水的鹽溶液。溶液的滲量和離子濃度與人體的滲量和離子濃度匹配(等張)。

在檸檬酸鹽緩衝溶液(包括常用的SSC緩衝劑)中，檸檬酸鈉和氯化鈉用於維持中性pH 7.0。

如本文中使用的，術語“關節”是指兩個或更多個骨接觸的位置。該術語可以指可移動的關節或不可移動的關節。此外，關節可以是纖維關節(fibrous joint)，其中通過富含膠原的緻密結締組織附接骨，或軟骨關節(cartilaginous joint)，其中通過軟骨連接骨。關節還可以是滑膜關節(synovial joint)，其中骨不是直接連接的，而是具有滑膜腔，並且通過與副韌帶和腱相關聯的關節軟骨囊(capsule of articular cartilage)附接。滑膜關節包括但不限於球窩關節(ball-and-socket-joint)，如髖或肩關節；橢圓接頭和平面接頭，如腕接頭；屈戌關節，如肘，膝，踝或手指和腳趾的關節；鞍狀關節，如拇指的關節；和環樞關節(pivot joint)，例如寰椎和樞椎關節。

術語“組織狀況”，“組織的狀況”，“組織狀態”和“組織的狀態”在本文中可互換使用，指組織的狀況。組織的狀態可以通過此種組織的特定形態來表徵，或者可以通過一種或多種特定分子(諸如但不限於肽，蛋白質和核酸，或其組合)的表現來表徵。若組織類似於此類組織在沒有疾病或損傷並且有效實現其特定功能時的狀況，則其狀態可以被認為是“健康的”或“正常的”。若此類組織由於疾病或損傷而不能實現其功能，則組織的狀態可以被認為是“退化的”，“患病的”或“異常的”。另外/或者，若組織的形態學或其分子表現模式與正常組織相比“改變”或“變化”，則組織的狀態可以被認為是“退化的”，“患病的”或“異常的”。因而，組織的形態或組織中特定分子的表現模式可以是組織狀態的指標。組織狀態的例子包括但不限於組織降解，如軟骨降解，骨降解，和滑膜降解，組織炎症，如軟骨炎症，或滑膜炎症，組織重塑，如骨重塑(bone remodelling)或軟骨重塑(cartilage remodelling)，硬化，液體積聚，或增殖組織，如傷口癒合過程，囊腫形成或癌症中的增殖。

如本文中使用的，術語“參照樣品”是指以與感興趣的樣品基本相同的方式分析並且其信息與感興趣的樣品的信息比較的樣品。從而，參照樣品提供允許評價從感興趣的樣品獲得的信息的標準。參照樣品可以與感興趣樣品相同，除了可以交換，缺少或添加的一種組分外。舉例來說，在本發明的上下文中，參照樣品可以不包含聚集蛋白聚糖結合部分或與感興趣的樣品不同的聚集蛋白聚糖結合部分。

如本文中使用的，術語“參照值”是指已知指示某種狀態的值。在本發明的上下文中，參照值可以表示已知存在於缺乏聚集蛋白聚糖結合部分的樣品中的降解程度。或者，參照值可以表示先前已知的不同聚集蛋白聚糖結合部分可以展現的結合活性。或者，參照值可以表示在存在或缺乏抗原結合部分的情況下降解程度的結合活性的改變。在本發明的上下文中，參照值可以是CD-RAP對聚集蛋白聚糖展現出的結合活性。或者，參照值可以是在CD-RAP存在下聚集蛋白聚糖降解程度的改變。

蛋白質的術語“降低”或“減少”水平是指與參照或參照樣品相比，樣品中此類蛋白質的水平降低。蛋白質的術語“升高”或“增加”水平是指與參照或參照樣品相比，樣品中此類蛋白質的水平更高。

術語“病症”是指異常狀況，特別是異常醫學狀況，如疾病或損傷，其中組織，器官或個體不能再有效實現其功能。

通常，“損傷”是指由身體傷害引起的對組織，器官或個體的損害。損傷的例子包括但不限於創傷性損傷，重複勞損損傷(repetitive strain injury)，放射損傷，中毒，燒傷或凍傷損傷，來自毒素或來自藥物副作用(例如疫苗損傷)的損傷和再灌注損傷。根據受影響的組織或器官，損傷也可以相應地分類，例如，軟骨損傷，骨損傷或關節損傷。

術語“疾病”是指異常生理狀況。疾病的例子包括但不限於炎性疾病，感染性疾病，遺傳性疾病，自身免疫性疾病，退化性疾病和增殖性疾病(例如各種類型的癌症)。在患者中，疾病可以影響單個或幾個不同的組織和/或器官。根據受影響的組織或器官，疾病也可以相應地分類，例如軟骨疾病，骨病或關節疾病。

通常但不一定，疾病或損傷與指示此類疾病或損傷的存在的特定“症狀”或“體徵”相關。因此，此類症狀或體徵的存在可以指示患有疾病或損傷的組織，器官或個體。這些症狀或體徵的改變可以指示此類疾病或損傷的進展。疾病或損傷的進展通常特徵在於此類症狀或體徵的增加或減少，這可以指示疾病或損傷的“惡化”或“改善”。疾病或損傷的“惡化”的特徵在於組織，器官或生物體有效地實現其功能的能力降低，而疾病或損傷的“好轉”通常特徵在於組織，器官或個體有效實現其功能的能力增加。有“形成疾病或損傷的風險”的組織，器官或個體處於健康狀態，但顯示出現疾病或損傷的潛力。通常，形成疾病或損傷的風險與此類疾病的早期或微弱體徵或症狀相關。在此類情況下，仍然可以通過治療預防疾病或損傷的發作和/或進展。

術語“關節損傷”是指關節的物理損傷，特別是創傷性損傷，重複勞損損傷，放射損傷，中毒，燒傷或凍傷損傷，來自毒素或來自藥物副作用(例如疫苗損傷)的損傷和再灌注損傷

如本文中使用的，術語“關節疾病”是指關節的異常生理狀況，特別是由於退化，炎性，感染性或自身免疫原因所致的那些。關節疾病包括但不限於關節炎，如類風濕性關節炎(RA)，強直性脊柱炎(AS)，幼年特發性關節炎(JIA)，痛風，膿毒性關節炎，銀屑病關節炎和骨關節炎(OA)，癌症，如軟骨肉瘤，骨肉瘤，纖維肉瘤和多發性骨髓瘤，腱炎，滑囊炎，骨折和對軟骨或骨的損傷。關節疾病可從初始關節損傷發展。

骨關節炎可以被視為導致滑膜關節的結構和功能性衰竭的一系列病症的臨床和病理結果。它在關節組織的分解和修復之間的動態平衡被壓倒時發生。關節軟骨的結構性衰竭可以源自損傷健康軟骨的異常機械應力，以及在生理和機械應力的影響下退化的病理性損傷軟骨的衰竭。OA的特徵在於關節軟骨的進行性退化，最終導致受影響的關節的功能不能。在OA的慢性進展期間，關節軟骨受到破壞，從而釋放下面的骨組織，最終需要受影響的關節的手術替換。除了軟骨的破壞外，還在發生滑膜和韌帶的病理性退化。在OA中發生炎症作為繼發效應。在OA中觀察到的形態學變化包括軟骨糜爛以及可變程度的滑膜炎症。這些變化歸因於生物化學因素的複雜網絡，包括導致軟骨大分子，特別是膠原II，X和聚集蛋白聚糖的分解的蛋白水解酶。由活化的滑膜細胞，單核細胞或關節軟骨自身製造的細胞因子如IL-1和TNF-α顯著上調基質金屬蛋白酶(MMP)和細胞因子基因表現，以及鈍化補償合成途徑。OA的確切病因學仍然沒有解決，但是一些促成因素與疾病的發作和進展相關。最重要的因素是年齡，而且週期性超負荷，肥胖，關節鬆弛，和遺傳素因也發揮重要作用。一般贊同軟骨基質組分的降解是由於胞外蛋白酶的增加的合成和活化以及放大退化過程的細胞因子所致。OA的診斷通常基於對顯示症狀和體徵的逐漸發作的患者的關節的臨床檢查，其中x射線確認診斷。通過x射線可觀察到的典型變化包括關節間隙變窄，邊緣骨贅，軟骨下硬化，軟骨下囊腫形成，骨重塑和關節滲出液。

疾病的“症狀”是由具有此類疾病的組織，器官或生物體可察覺的疾病的暗示，並且包括但不限於組織，器官或個體的疼痛，虛弱，壓痛，應力，僵硬和痙攣。疾病的“體徵”或“信號”包括但不限於特定指示物，如生物標誌物或分子標誌物的變化或改變，如存在，缺乏，增加或升高，減少或降低，或者症狀的形成，存在，或惡化。疼痛的症狀包括但不限於令人不快的感覺，其可以被感覺為持續或變化的燒傷，悸動，瘙癢或刺痛疼痛。

如本文中使用的，術語“指標(indicator)”是指用於狀況的體徵或信號，或用於監視狀況。此類“狀況”是指細胞，組織或器官的生物學狀態或個體的健康和/或疾病狀態。指標可以是分子的存在或缺乏，包括但不限於肽，蛋白質和核酸，或者可以是細胞，或組織，器官或個體中此類分子的表現水平或模式的變化。指標可以是用於個體中疾病的發作，形成或存在或用於此類疾病的進一步進展的體徵。指標還可以是個體中形成疾病的風險的體徵。例如，與關節炎疾病如OA有關的已知指標包括但不限於轉錄因子，如Sox-5，Sox-6，Sox-9，Nfat1，pitx1，FoxO，HIF2A， SAF-1，RUNX-2，細胞因子如IL-1β，IL-2，IL-7，IL-12，IL-18，GM-CFS，TNF-α，NF-κB和INF-γ，磷酸酶，如鹼性磷酸酶(ALP)，蛋白酶如金屬蛋白酶(例如MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-8，MMP-9，MMP-13，MMP-14)，聚集蛋白聚糖酶(例如ADAM-8，ADAM-12，ADAM-TS4，ADAM-TS5)和半胱胺酸蛋白酶(例如組織蛋白酶B，組織蛋白酶K，組織蛋白酶S，鈣蛋白酶(calpain)，胱天蛋白酶-3，胱天蛋白酶-9)，金屬蛋白酶的組織抑制劑(例如TIMP-1，TIMP-2，TIMP-3，TIMP-4)，胞外基質組分，如膠原(例如膠原II，VI，IX，X，XI)，蛋白聚糖(例如硫酸類肝素，硫酸軟骨素，硫酸角質素)，聚集蛋白聚糖，彈性蛋白，透明質酸，纖連蛋白，層粘連蛋白，CDMP，軟骨調節因子和多效蛋白(pleiotrophin)。通常，在患有關節炎，特別是OA的組織，器官或個體中，這些指標的一種或多種以比不患有關節炎的組織，器官或個體中更高或更低的水平上表現或激活。例如，已知與不患有或有風險形成OA的組織，器官或個體相比，胞外基質組分膠原II和X以及聚集蛋白聚糖的水平在患有或有風險形成OA的組織，器官或個體中降低。還已知的是，與不患有或有風險形成OA的組織，器官或個體相比，轉錄因子Sox9以及金屬蛋白酶TIMP-1和TIMP-4的組織抑制劑的水平在患有或有風險形成OA的組織，器官或個體中降低。相比之下，已知與不患有或有風險形成OA的組織，器官或個體相比，細胞因子IL-1，IL-6和TNF-α以及金屬蛋白酶MMP-1，MMP-2，MMP-3和MMP-9和磷酸酶ALP的水平在患有或有風險形成OA的組織，器官或個體中增強。指標的術語“降低”或“減少”水平是指與參照或參照樣品相比，樣品中此類指標的水平降低。指標的術語“升高”或“增加”水平是指與參照或參照樣品相比樣品中的此類指標的水平更高。

如本文中使用的，疾病或損傷的“治療”或“處理”是指實現以下一種或多種：(a)降低疾病或損傷的嚴重性；(b)限制或防止治療的疾病或損傷的特徵性症狀的形成；(c)抑制治療的疾病或損傷的特徵性症狀的惡化；(d)限制或防止先前已經具有疾病或損傷的個體中的疾病或損傷的復發；以及(e)限制或預防先前有疾病或損傷的症狀的個體中的症狀的復發。

如本文中使用的，疾病或損傷的“預防”或“防範”意指防止在患者中發生此類疾病或損傷。

術語“藥物”和“醫藥組合物”在本文中可互換使用，指用於鑒定，預防或治療疾病或損傷的物質和/或物質組合。

如本文中使用的，“施用”包括體內施用，以及在體外直接對組織施用，如靜脈移植物。施用包括但不限於關節內注射，即將藥物應用到受疾病或損傷影響的膝，髖，腕掌關節，掌指關節，肩或任何其它關節。還包括(通過x射線或通過計算機斷層攝影術)熒光鏡檢引導的對椎間盤的注射。

“有效量”或“治療有效量”是足以實現意圖目的治療劑的量。給定治療劑的有效量將隨著諸如藥劑的性質，施用途徑，接受治療劑的動物的大小和物種以及施用目的等因素而變化。熟練技術人員可以根據本領域中建立的方法憑經驗確定每種個別情況下的有效量。

“藥學可接受”意指對於在動物中，且更特別是在人中使用，由聯邦或州政府的管理機構批准的或在美國藥典或其它公認的藥典中列出的。

術語“活性成分”是指具有生物活性，即提供藥用價值的醫藥組合物或配製劑中的物質。醫藥組合物可以包含一種或多種可以彼此聯合或彼此獨立起作用的活性成分。活性成分可以配製成中性或鹽形式。藥學可接受鹽包括與游離胺基基團形成的那些，如源自鹽酸，磷酸，乙酸，草酸，酒石酸等的那些，以及與游離羧基基團形成的那些，如但不限於源自氫氧化鈉，鉀，銨，鈣，鐵，異丙胺，三乙胺，2-乙基胺基乙醇，組胺酸，普魯卡因(procaine)等的那些。

術語“製劑”和“組合物”旨在包括活性化合物與作為提供膠囊的載劑的囊封材料的配製劑，其中具有或沒有其它載劑的活性成分被載劑包圍，所述載劑因此與它結合。

如本文中使用的，術語“載劑”是指藥理學上無活性的物質，諸如但不限於施用治療活性成分的稀釋劑，賦形劑或媒介物。此類藥用載劑可以是液體或固體。液體載劑包括但不限於無菌液體，如水和油中的鹽水溶液，包括石油，動物，植物或合成來源的那些，如花生油，大豆油，礦物油，芝麻油等。鹽水溶液和水性右旋糖和甘油溶液也可以用作液體載劑，特別是用於可注射溶液。當靜脈內施用醫藥組合物時，鹽水溶液是優選的載劑。合適的藥用載劑的例子描述於E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”。

合適的藥用“賦形劑”包括澱粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，明膠，麥芽，米，麵粉，白堊，矽膠，硬脂酸鈉，單硬脂酸甘油酯，滑石，氯化鈉，脫脂乳，甘油，丙二醇，水，乙醇等。

術語“佐劑”是指提升，刺激，活化，增強或調節活性成分的治療效果的藥劑。此類佐劑的例子包括但不限於無機佐劑(例如無機金屬鹽，如磷酸鋁或氫氧化鋁)，有機佐劑(例如皂苷或鯊烯)，油基佐劑(例如弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑)，細胞因子(例如IL-1β，IL-2，IL-7，IL-12，IL-18，GM-CFS和INF-γ)顆粒佐劑(例如免疫刺激複合物(ISCOMS)，脂質體或可生物降解的微球)，病毒體，細菌佐劑(例如單磷醯脂質A或胞壁醯肽)，合成佐劑(例如非離子嵌段共聚物，胞壁醯肽類似物或合成脂質A)或合成多核苷酸佐劑(例如聚精胺酸或聚賴胺酸)。

如本文中使用的，“患者”是指可以受益於本發明的任何哺乳動物，爬行類或鳥類。優選地，患者選自由下列組成之群組：實驗動物(例如小鼠，大鼠或兔)，家畜(包括例如豚鼠，兔，馬，驢，牛，綿羊，山羊，豬，雞，鴨，駱駝，貓，犬，海龜，龜，蛇或蜥蜴)，或靈長類，包括黑猩猩，倭黑猩猩，大猩猩和人。特別優選的是，“患者”是人。

實施方案

發現如果CD-RAP與前序列一起表現，那麼發酵產率和特別地折疊顯著增加。除了前序列本身的存在之外，前CD-RAP的收穫量隨著前序列長度的增加而更高。對於在此蛋白質的成功折疊後獲得的折疊前-CD-RAP的量也發現這點。

因此，在第一態樣中，本發明係關於CD-RAP前驅蛋白，其包含a)前序列，所述前序列在其C端包含切割位點，和b)CD-RAP或其變體。

在具體的實施方案中，CD-RAP是人CD-RAP。在進一步的實施方案中，CD-RAP具有根據SEQ ID NO：1的胺基酸序列或其變體。在具體實施方案中，所述變體具有至少80%的序列同一性，即至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%序列同一性。

在具體實施方案中，前序列不擾亂CD-RAP的折疊。因而，不需要在折疊之前去除前序列。在具體實施方案中，前序列改善CD-RAP的折疊。在進一步的實施方案中，可以在不存在(即缺乏)化學或酶促伴侶的情況下折疊CD-RAP前驅蛋白。在進一步的實施方案中，CD-RAP以一級，二級或三級結構存在。

在具體實施方案中，前序列具有5-50個胺基酸的長度，即5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，20，25，30，35，40，45，或50個胺基酸。在具體實施方案中，前序列具有5-40，6-35，7-33，8-30，9-25，10-20個或胺基酸的長度。

在第一態樣的具體實施方案中，前序列具有比CD-RAP更低的親水性總平均值。

在具體實施方案中，根據Kyte和Doolittle，前序列具有小於-0.2的親水性總平均值(GRAVY)。在具體實施方案中，前序列具有 -0.2至-1.7之間，特別是-0.5至-1.7之間，特別是-0.6至-1.7之間，特別是-0.7至-1.7之間，特別是在-0.8至-1.7之間的親水性總平均值(GRAVY)。特別地，前序列具有小於-0.2，-0.3，-0.4，-0.5，-0.6，-0.7，-0.8，-0.9，-1.0，-1.2，1.3，-1.4，1.5，-1.6，或-1.7的親水性總平均值(GRAVY)。

在具體實施方案中，根據Kyte和Doolittle，前驅蛋白具有小於-0.03的親水性總平均值(GRAVY)。在具體實施方案中，前驅蛋白具有-0.03至-0.3之間的親水性總平均值(GRAVY)。特別地，前驅蛋白具有小於-0.3，-0.2，-0.1，-0.09，-0.08，-0.07，-0.06，-0.05，-0.04或-0.03的親水性總平均值(GRAVY)。

在第一態樣的實施方案中，前序列的切割位點是酶切割位點。在具體實施方案中，切割位點是內肽酶切割位點，更特別地，切割位點是腸激酶或混合親核體超家族A(PA族)蛋白酶切割位點。在具體的實施方案中，切割位點是R或K胺基酸。

在進一步的實施方案中，內肽酶選自由下列組成之群組：半胱胺酸蛋白酶和絲胺酸蛋白酶。在具體實施方案中，內肽酶是胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶，特別是胰蛋白酶。

在具體實施方案中，前序列包括親和標簽。在具體實施方案中，親和標簽是多His標簽。

在具體實施方案中，前序列在其N端包含胺基酸MATTX₁T，MATTX₁TG，MATTX₁TGN，MATTX₁TGNS或MATTX₁TGNSA，其中X₁是L或S。因而，在具體實施方案中，前序列在其N-端包含選自由下列組成之群組的胺基酸序列：MATTST(SEQ ID NO：2)，MATTLT(SEQ ID NO：3)，MATTSTG(SEQ ID NO：4)，MATTLTG(SEQ ID NO：5)，MATTSTGN(SEQ ID NO：6)，MATTLTGN(SEQ ID NO：7)，MATTSTGNS(SEQ ID NO：8)，MATTLTGNS(SEQ ID NO：9)，MATTSTGNSA(SEQ ID NO：10)，MATTLTGNSA(SEQ ID NO：11),MATTSTR(SEQ ID NO：12),MATTLTR(SEQ ID NO：13),MATTSTGNSAR(SEQ ID NO： 14),MATTLTGNSAR(SEQ ID NO：15),MATTSTLTTHWHWHGNSAR(SEQ ID NO：16),MATTSTGNSAHFQHHHGSLAR(SEQ ID NO：17),MATTSTGNSAHFQHHHGSLAR(SEQ ID NO：18)，和MATTSTGNSARFVNQHLH HHHHHHHGGGENQQQR(SEQ ID NO：19)。

在具體實施方案中，前序列在其N端包含胺基酸MATTST，MATTSTG，MATTSTGN，MATTSTGNS或MATTSTGNSA或其變體，並且在其C端包含切割位點。在具體的實施方案中，前序列在其N端包含SEQ ID NO：19的胺基酸序列的胺基酸1-6，1-7，1-8，1-9，1-10，1-11，1-12，1-13，1-14，1-15或1-16或其變體，並且在其C端包含切割位點。在具體實施方案中，前序列在其N端包含胺基酸MATTSTGNSA，並且在其C端包含切割位點。在進一步的實施方案中，前序列在其N端包含胺基酸MATTSTGNSARFVNQHL，並且在其C端包含切割位點。

在具體實施方案中，前序列的胺基酸序列包含或組成為SEQ ID NO：19的胺基酸序列(MATTSTGNSARFVNQHLHHHHHHHHGGGENQQQR)或其變體。

在具體的實施方案中，前驅蛋白具有根據SEQ ID NO：20的胺基酸序列或其變體。

在第二態樣中，本發明係關於編碼如上文詳細描述的本發明的第一態樣的前體CD-RAP蛋白的核酸。

在第三態樣中，本發明係關於包含本發明的第二態樣的核酸的載體。

在具體實施方案中，載體是質粒，病毒，粘粒，噬菌體，細菌芽胞或人工染色體。在具體的實施方案中，載體是質粒。

在第三態樣的進一步實施方案中，載體還包含編碼抗性基因，特別是對氨苄青黴素，新黴素，卡那黴素，鏈黴素，慶大黴素或G 418的抗性的核酸。

在本發明的第三態樣的具體實施方案中，載體還包含調節元件。在具體實施方案中，調節元件選自由下列組成之群組：啟動子，增強子和沉默子。在具體實施方案中，啟動子是組成性啟動子或誘導型啟動子。在具體實施方案中，啟動子是T7啟動子。

在具體的實施方案中，質粒是pET-質粒，特別是pET-52b-II質粒。

在具體實施方案中，宿主細胞是原核細胞或真核細胞。

在具體實施方案中，原核細胞是細菌細胞，特別是大腸桿菌細胞。在具體實施方案中，大腸桿菌細胞是大腸桿菌菌株BL21或K12的細胞。

在具體實施方案中，真核細胞是真菌細胞，昆蟲細胞或哺乳動物細胞。在具體實施方案中，真菌細胞是酵母細胞，特別是乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)。

在第五態樣中，本發明係關於製造天然CD-RAP的方法，其包括以下步驟a)提供CD-RAP前驅蛋白，所述CD-RAP前驅蛋白包含a)前序列，所述前序列在其C端包含切割位點，和b)CD-RAP或其變體，並且b)去除所述前序列以獲得天然CD-RAP。

在具體實施方案中，CD-RAP前驅蛋白可以為一級，二級或三級構象。

在具體實施方案中，本發明的第五態樣的方法還包括一個或多個以下步驟：c)折疊CD-RAP前驅蛋白，並任選純化折疊的CD-RAP，並且d)純化天然CD-RAP。

在本發明的第五態樣的實施方案中，在步驟b)中的前序列去除之前或之後在步驟c)中折疊CD-RAP。在具體實施方案中，在步驟a)之後且步驟b)之前實施步驟c)。因此，在具體實施方案中，在折疊CD-RAP之後去除前序列，即在去除前序列之前折疊CD-RAP。

特別地，在實施方案中，其中在步驟a)中以一級或二級構象提供CD-RAP前驅蛋白，在步驟b)中的前序列去除之前，在步驟c)中折疊CD-RAP。

特別地，在實施方案中，其中在步驟a)中以三級構象提供CD-RAP前驅蛋白，不需要折疊步驟c)來獲得天然CD-RAP。在本發明的第五態樣的實施方案中，在步驟a)中經由生物技術手段提供前體CD-RAP。在具體實施方案中，通過從第四態樣的宿主細胞分離提供前體CD-RAP。

在具體實施方案中，前序列具有5-50個胺基酸的長度，即5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，20，25，30，35，40，45，或50個胺基酸。在具體實施方案中，前序列具有5-40，6-35，7-33，8-30，9-25或10-20個胺基酸的長度。

在第五態樣的具體實施方案中，前序列比CD-RAP具有更低的親水性總平均值(GRAVY)。

在具體實施方案中，根據Kyte和Doolittle，前序列具有小於-0.2的親水性總平均值(GRAVY)。在具體實施方案中，前序列具有-0.2至-1.7之間，特別是-0.5至-1.7之間，特別是-0.6至-1.7之間，特別是-0.7至-1.7之間，特別是-0.8至-1.7之間的親水性總平均值 (GRAVY)。特別地，前序列具有小於-0.2，-0.3，-0.4，-0.5，-0.6，-0.7，-0.8，-0.9，-1.0，-1.2，1.3，-1.4，1.5，-1.6或-1.7的親水性總平均值(GRAVY)。

在第五態樣的實施方案中，前序列的切割位點是酶切割位點。在具體實施方案中，切割位點是內肽酶切割位點，更特別地，切割位點是腸激酶或混合親核體超家族A(PA族)蛋白酶切割位點。在具體的實施方案中，切割位點是R或K胺基酸。

在具體實施方案中，前序列在其N端包含胺基酸MATTX₁T,MATTX₁TG，MATTX₁TGN，MATTX₁TGNS或MATTX₁TGNSA，其中X₁是L或S。因而，在具體實施方案中，前序列在其N-端包含選自由下列組成之群組的胺基酸序列：MATTST(SEQ ID NO：2)，MATTLT(SEQ ID NO：3)，MATTSTG(SEQ ID NO：4)，MATTLTG(SEQ ID NO：5)，MATTSTGN(SEQ ID NO：6)，MATTLTGN(SEQ ID NO：7)，MATTSTGNS(SEQ ID NO：8)，MATTLTGNS(SEQ ID NO：9)，MATTSTGNSA(SEQ ID NO：10)，MATTLTGNSA(SEQ ID NO：11),MATTSTR(SEQ ID NO：12)，MATTLTR(SEQ ID NO：13),MATTSTGNSAR(SEQ ID NO：14)，MATTLTGNSAR(SEQ ID NO：15),MATTSTLTTHWHWHGNSAR(SEQ ID NO： 16),MATTSTGNSAHFQHHHGSLAR(SEQ ID NO：17),MATTSTGNSAHFQHHHGSLAR(SEQ ID NO：18)，和MATTSTGNSARFVNQHLH HHHHHHHGGGENQQQR(SEQ ID NO：19)。

在具體實施方案中，前序列的胺基酸序列包含或組成為SEQ ID NO：19的胺基酸(MATTSTGNSARFVNQHLHHHHHHHHGGGENQQQR)或其變體。

在本發明的第五態樣的實施方案中，在步驟b)中經由酶切割去除前序列。特別地，經由腸激酶切割或經由內肽酶切割去除前序列。在具體實施方案中，在步驟b)中經由胰蛋白酶切割去除前序列。

在本發明的第五態樣的進一步實施方案中，步驟b)中蛋白水解酶，特別是胰蛋白酶和前體CD-RAP蛋白之間的比率為每mg蛋白質的1個單位酶。

在本發明的第五態樣的進一步實施方案中，將步驟b)實施0.5-20小時，即0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5，5，5.5，6，6.5，7，7.5，8，8.5，9，9.5，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，或20小時。在具體實施方案中，將步驟b)實施小於16小時，即小於16小時，小於15，小於14，小於13，小於 12，小於11，小於10，小於9，小於8，小於7，小於6，小於5，小於4，小於3，小於2或小於1小時。在具體實施方案中，將步驟b)實施0.5-20小時，1-15小時，2-8小時或4-7小時。

在本發明的第五態樣的進一步實施方案中，在5至9之間的pH實施步驟b)，即在5，6，7，8或9的pH實施。在具體的實施方案中，pH介於7,8和8,8之間，特別是在8.3。在具體的實施方案中，在pH 5至9，6至9，7至8.5，7.5至8.5，或8至8.5進行步驟b)。

在本發明的第五態樣的進一步實施方案中，在5-40℃的溫度實施步驟b)，即在5，10，15，20，25，30，35或40℃的溫度實施。在具體實施方案中，在5-40℃，10-30℃或20-25℃的溫度實施步驟b)。

在本發明的第五態樣的進一步實施方案中，步驟c)包括步驟(i)在變性緩衝劑中溫育前體CD-RAP蛋白，並(ii)將步驟(i)中獲得的溶液添加到折疊緩衝劑中。

在具體實施方案中，步驟(i)中的變性緩衝劑包含二硫蘇糖醇(DTT)。DTT的濃度將隨著溶液中前體CD-RAP蛋白的濃度增加而增加。在具體實施方案中，變性緩衝劑包含濃度5-15mM，即5，6，7，8，9，10,11，12，13，14，或15mM的DTT，特別是濃度為10mM。在具體實施方案中，變性緩衝劑包含濃度5-15mM，即濃度6-14，7-13，8-12，9-11mM的DTT。

在具體實施方案中，折疊緩衝劑包含精胺酸。在具體的實施方案中，折疊緩衝劑包含濃度0.5-1mol/L，即0.5，0.6，0.7，0.75，0.8，0.9或1mol/L，特別是濃度0.75mol/L的精胺酸。在具體實施方案中，折疊緩衝劑包含濃度0.5-1mol/L，即0.55-0.9，0.6-0.8，0.7-0.8mol/L的精胺酸。

在進一步的實施方案中，折疊緩衝劑不包含任何化學或酶促伴侶。

在具體實施方案中，將變性溶液在步驟(ii)中緩慢添加到折疊緩衝劑中。在具體實施方案中，在步驟(ii)中在1-3小時的時間範圍，即1，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2， 2.1，2.2，2.3，2.4，2.5，2.6，2.7，2.8，2.9或3小時裡添加折疊緩衝液。在具體實施方案中，在步驟(ii)中在1-3小時，特別是2-3小時的時間範圍裡添加折疊緩衝劑。

在具體的實施方案中，在5和25℃之間的溫度實施折疊步驟c)，即在5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，或25℃，特別是在10℃的溫度實施。在具體實施方案中，在5-25℃，5-20℃或5-15℃的溫度實施步驟c)。

在本發明的第五態樣的具體實施方案中，經由層析法純化折疊的前體CD-RAP。在具體實施方案中，通過HIC層析或多峰(MM)層析純化折疊的前體CD-RAP。在具體實施方案中，在層析純化之前過濾CD-RAP。

在本發明的第五態樣的具體實施方案中，通過層析法純化天然CD-RAP。在具體實施方案中，通過HIC-層析純化天然CD-RAP。

在第六態樣中，本發明提供了包含CD-RAP蛋白的CD-RAP蛋白製劑，所述CD-RAP蛋白具有長度為107個胺基酸的SEQ ID NO：1的成熟CD-RAP序列。

在本發明的第六態樣的具體實施方案中，所述CD-RAP(107AA)與存在於CD-RAP蛋白製劑中的任何其它CD-RAP蛋白的比率為99wt-%。在具體實施方案中，所述CD-RAP(107AA)與存在於CD-RAP蛋白製劑中的任何其它CD-RAP蛋白的比率為99.5wt-%或99.9wt-%。

在具體實施方案中，本發明的第六態樣的CD-RAP蛋白製劑不含具有長度為105個胺基酸的SEQ ID NO：21的CD-RAP序列的CD-RAP(105AA)。

如本發明人認識到的，到目前為止可獲得的CD-RAP蛋白製劑總是含有相當大量的作為N-端截短的CD-RAP的CD-RAP(105AA)。本文中公開的CD-RAP前驅蛋白現在允許製備純的CD- RAP(107AA)。不含CD-RAP(105AA)的製劑特別是指基於製劑中存在的CD-RAP(107AA)蛋白，含有1wt%，特別是0.5wt%，特別是0.1wt%，特別是0.01wt%的CD-RAP的量。

在具體的實施方案中，CD-RAP蛋白製劑具有40℃的熔解溫度。在具體的實施方案中，本發明的CD-RAP蛋白製劑具有40℃，特別是45℃，特別是48℃，特別是50℃，特別是52℃的熔解溫度。最優選地，CD-RAP蛋白製劑具有約54℃，最優選地約55℃的熔解溫度。特別地，在200mM L-精胺酸，50mM NaH2PO4，pH7.5緩衝劑中使用DSF(差示掃描熒光測定法)在1.0mg/mL的CD-RAP濃度測定熔點。

在第七態樣中，本發明提供了包含CD-RAP或其變體或如上文詳細描述的第六態樣的CD-RAP蛋白製劑和至少一種帶正電荷的胺基酸和緩衝劑的組合物。

在具體的實施方案中，CD-RAP是人CD-RAP，特別是根據SEQ ID NO：1的人CD-RAP或其變體。

在具體的實施方案中，所述變體與根據SEQ ID NO：1的CD-RAP具有至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%的胺基酸序列同一性。

在具體實施方案中，CD-RAP是經由如上文詳細描述的本發明的第五態樣的方法獲得的天然CD-RAP。

在本發明的第七態樣的實施方案中，至少一種帶正電荷的胺基酸增加CD-RAP的穩定性，特別是通過防止CD-RAP的降解，變性和/或聚集進行。在具體實施方案中，至少一種帶正電荷的胺基酸防止CD-RAP的聚集。在具體實施方案中，至少一種帶正電荷的胺基酸選自由下列組成之群組：精胺酸，賴胺酸和組胺酸。

在本發明的第七態樣的實施方案中，緩衝劑增加CD-RAP的穩定性，特別是通過防止CD-RAP的降解，變性和/或聚集進行。在具體實施方案中，緩衝劑防止CD-RAP的降解。在具體實施方案中，緩衝劑選自由下列組成之群組：檸檬酸鹽緩衝劑，磷酸鹽緩衝劑，組胺酸緩衝劑和Tris緩衝劑。

在實施方案中，本發明的第七態樣的組合物還包含糖或胺基糖。在具體的實施方案中，糖是單糖，二糖或三糖，特別是選自由下列組成之群組：蔗糖，麥芽糖，海藻糖或棉子糖。在具體的實施方案中，胺基糖選自由下列組成之群組：葡糖胺，N-甲基-葡糖胺，半乳糖胺或神經胺酸。

在具體實施方案中，本發明的第七態樣的組合物不包含抗壞血酸和/或甘胺酸。

在本發明的第七態樣的實施方案中，組合物包含濃度50-500mM，即50，60，70，80，90，100，150，200，250，300，350，400，450，或500mM的精胺酸。在實施方案中，組合物包含濃度為100-350mM的精胺酸。在進一步的實施方案中，組合物包含濃度為100-200mM的精胺酸。在具體實施方案中，組合物包含濃度為200mM的精胺酸。

在本發明的第七態樣的實施方案中，組合物包含濃度為5-100mM，即5，6，7，8，9，10，20，25，30，35，40，45，60，65，70，75，80，85，90，95，或100mM的組胺酸。在實施方案中，組合物包含濃度為10-50mM的組胺酸。在進一步的實施方案中，組合物包含濃度為20-50mM的組胺酸。在具體實施方案中，組合物包含濃度為50mM的組胺酸。

在本發明的第七態樣的實施方案中，組合物包含磷酸鹽緩衝劑。在其中組合物包含磷酸鹽緩衝劑的實施方案中，組合物包含在水溶液中的磷酸鈉，特別地濃度為5-100mM，即5，6，7，8，9，10，20，25，30，35，40，45，60，65，70，75，80，85，90，95，或100mM。在實施方案中，組合物包含濃度為10-50mM的磷酸鈉。在進一步的實施方案中，組合物包含濃度為20-50mM的磷酸鈉。在具體實施方案中，組合物包含濃度為20mM的磷酸鈉。

在其中所述組合物包含磷酸鹽緩衝劑的實施方案中，所述組合物包含在水溶液中的磷酸鉀，特別地濃度為5-100mM，即5，6，7，8，9，10，20，25，30，35，40，45，60，65，70，75，80，85，90，95，或100mM。在進一步的實施方案中，組合物包含濃度為20-50mM的磷酸鉀。在具體實施方案中，組合物包含濃度為20mM的磷酸鉀。

在本發明的第七態樣的實施方案中，組合物包含檸檬酸鹽緩衝劑。在其中所述組合物包含檸檬酸鹽緩衝劑的實施方案中，所述組合物在水溶液中包含檸檬酸鹽，特別地濃度為5-100mM，即5，6，7，8，9，10，20，25，30，35，40，45，60，65，70，75，80，85，90，95，或100mM。在實施方案中，所述組合物包含濃度為10-50mM的檸檬酸鹽。在進一步的實施方案中，所述組合物包含濃度為20-50mM的檸檬酸鹽。在具體實施方案中，組合物包含濃度為20mM的檸檬酸鹽。

在本發明的第七態樣的實施方案中，組合物還包含蔗糖。在實施方案中，所述組合物包含濃度為5-100mM，即5，6，7，8，9，10，20，25，30，35，40，45，60，65，70，75，80，85，90，95，或100mM的蔗糖。在實施方案中，所述組合物包含濃度為10-50mM的檸檬酸鹽。在進一步的實施方案中，所述組合物包含濃度為20-50mM的檸檬酸鹽。在具體實施方案中，所述組合物包含濃度為45mM的檸檬酸鹽。

在本發明的第七態樣的實施方案中，組合物還包含帶負電荷的胺基酸。在具體的實施方案中，帶負電荷的胺基酸選自由下列組成之群組：谷胺酸和天冬胺酸。在具體實施方案中，組合物包含谷胺酸和天冬胺酸的組合。

在其中所述組合物包含谷胺酸和天冬胺酸的組合的實施方案中，精胺酸和谷胺酸的總濃度為50-500mM，即50，60，70，80，90，100，150，200，250，300，350，400，450，或500 mM。在實施方案中，組合物包含總濃度為100-350mM，特別是100-200mM的谷胺酸和天冬胺酸的組合。在具體實施方案中，組合物包含總濃度為200mM的谷胺酸和天冬胺酸的組合。

在其中所述組合物包含精胺酸和谷胺酸的組合的實施方案中，精胺酸和谷胺酸以1：1的比率存在。在具體的實施方案中，精胺酸和谷胺酸以1：1,25的比率存在。在進一步的實施方案中，精胺酸和谷胺酸以特別地1：1.5的比率存在。在具體實施方案中，精胺酸和谷胺酸以1：2的比率存在。

在本發明的第七態樣的實施方案中，組合物的pH值在5.5和8.0之間，即5.5，5.6，5.7，5.8，5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9，7.0，7.1，7.2，7.3，7.4，7.5，7.6，7.7，7.8，7.9，或8.0。在實施方案中，組合物的pH值在6.0和7.5之間。在進一步的實施方案中，組合物的pH值在6.0和6.5之間。在具體實施方案中，組合物的pH值為6。

在本發明的第七態樣的實施方案中，使用磷酸或氯化氫調節組合物的pH值。在具體的實施方案中，使用磷酸調節組合物的pH值。

在本發明的第七態樣的實施方案中，CD-RAP或其變體的濃度在1和10mg/ml之間，即1，2，3，4，5，6，7，8，9或10mg/ml。在具體實施方案中，CD-RAP的濃度在2和5mg/ml之間。

在本發明的第七態樣的具體實施方案中，組合物在水溶液中包含2mg/ml CD-RAP或其變體，20mM檸檬酸鹽和200mM精胺酸，並且具有pH值6。

在第八態樣中，本發明提供了如上文詳細描述的第六態樣的CD-RAP蛋白製劑或第七態樣的組合物，用於在治療和/或預防患者中的關節疾病或損傷的方法中使用。在關節疾病或損傷的具體實施方案中，軟骨和/或軟組織受影響。特別地，關節疾病或損傷是軟骨疾病或損傷和/或十字形韌帶和/或副韌帶的疾病或損傷。在進一步的實施方案中，軟骨以導致其降解的方式受影響。軟骨的降解可以由各種因素引起。軟骨降解可以由損傷，諸如但不限於創傷性損傷或重複勞損損傷(如由於重複活動所致的軟骨組織的慢性糜爛)引起或觸發。根據國際軟骨修復學會的分類，即從表面損傷(1級)直至完全厚度損傷，達到骨組織(4級)，軟骨降解的嚴重性的範圍可以從1級到4級。軟骨降解的區域包括初始軟骨損傷的區域(即，其由創傷性損傷或重複勞損損傷引起)以及其它區域(即，其它關節或同一關節的其它部分)中的軟骨，其在所述損傷後也可以受損。在進一步的實施方案中，牽涉一個或多個關節的骨折也可以扭曲軟骨形態，因此從長遠來看，誘導軟骨變性。

另外/或者，軟骨降解可以由疾病，諸如但不限於炎性疾病，傳染病，遺傳性病症，自身免疫性疾病，退化性病症和增殖性病症，特別是由類風濕性關節炎，細菌性滑膜炎，滑膜組織或軟骨本身的肉瘤引起。

在第八態樣的實施方案中，第六態樣的CD-RAP蛋白製劑或第七態樣的組合物用於治療和/或預防患者中的關節疾病或損傷中使用，所述患者患有軟骨降解和/或水流入軟骨增加，和/或軟骨中的CD-RAP的減少的存在。

在進一步的實施方案中，軟骨降解牽涉蛋白聚糖，特別是聚集蛋白聚糖的降解。蛋白聚糖降解可以由於蛋白酶切割而發生。參與蛋白聚糖，優選聚集蛋白聚糖降解的蛋白酶包括但不限於基質金屬蛋白酶(MMP)，組織蛋白酶，解聚素和金屬蛋白酶(A Disintegrin And Metalloproteinase,ADAM)和具有血小板反應蛋白基序的解聚素和金屬蛋白酶(A Disintegrin And Metalloproteinase with Thrombospondin motif,ADAMTS)。在優選的實施方案中，蛋白聚糖，優選聚集蛋白聚糖由選自由下列組成之群組的蛋白酶降解：MMP-1，MMP-3，MMP-2，MMP-7，MMP-8，MMP-9，MMP-13，組織蛋白酶D，ADAMTS-1，ADAMTS-4，ADAMTS-5，ADAMTS-8，ADAMTS-9，ADAMTS-15，ADAMTS-16和 ADAMTS-18。特別優選的是ADAMTS-4和/或ADAMTS-5。

在進一步的實施方案中，在位於聚集蛋白聚糖的球狀G1和G2域之間的切割位點處發生蛋白酶切割。在進一步的實施方案中，聚集蛋白聚糖的多肽鏈在Asn341-Phe342之間和/或Glu373-Ala374之間，優選在Glu373-Ala374肽鍵處被切割。

在進一步的實施方案中，第六態樣的CD-RAP蛋白製劑或第七態樣的組合物用於治療和/或預防患有聚集蛋白聚糖降解的患者中的關節疾病或損傷。在具體的實施方案中，0.5%-5%的聚集蛋白聚糖是降解的，即0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%，3%，3.5%，4%，4.5%或5%的聚集蛋白聚糖是降解的。在具體實施方案中，超過0.5%，超過1%，超過1.5%，超過2%，超過2.5%，超過3%，超過3.5%，超過4%或超過4.5%的聚集蛋白聚糖是降解的。特別地，與不顯著的非患病的軟骨組織相比測量軟骨降解，所述軟骨組織通常但不一定展現出等同於65-150mg/ml，即65，70，75，80，85，90，95，100，110，120，130，140，或150mg/ml的蛋白聚糖密度。或者，不顯著的非患病的軟骨組織通常但不一定展現出等同於通過DGEMRIC技術顯現的T1值中的400，450，500，550，600，650，700，750，800，850，900，950，或1000msec的蛋白聚糖密度。在具體實施方案中，軟骨降解導致低於65，低於60，低於55，低於50，低於45，低於40，低於35，低於30，低於25，低於20，低於15，低於10，或低於5mg/ml的蛋白聚糖密度。或者，軟骨降解導致通過DGEMRIC技術顯現的T1值中低於400，低於350，低於300，低於250，低於200，低於150，低於100或低於50msec的蛋白聚糖密度。

因而，在具體實施方案中，第六態樣的CD-RAP蛋白製劑或第七態樣的組合物將軟骨降解降低至高於5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，或65mg/ml的蛋白多糖密度。或者，第一態樣的組合物將軟骨降解降低至通過DGEMRIC技術顯現的T1值中的高於50，100，150，200，250，300，350，或 400msec的蛋白聚糖密度。

完整蛋白聚糖的喪失，特別是完整聚集蛋白聚糖的喪失(特別是由於聚集蛋白聚糖降解，即切割的蛋白聚糖，優選聚集蛋白聚糖的增加)導致水流入軟骨，從而導致軟骨腫脹以及因此導致關節腫脹。因此，在第二態樣的實施方案中，第一態樣的組合物用於治療和/或預防患者中的關節疾病或損傷中使用，所述患者患有水流入軟骨的增加。

CD-RAP與聚集蛋白聚糖相互作用並防止其降解，特別是其蛋白水解降解。CD-RAP與聚集蛋白聚糖的相互作用防止蛋白酶，諸如例如基質金屬蛋白酶(MMP)，組織蛋白酶，解聚素和金屬蛋白酶(ADAM)和具有血小板反應蛋白基序的解聚素和金屬蛋白酶(ADAMTS)(優選選自由下列組成之群組：MMP-1，MMP-3，MMP-2，MMP-7，MMP-8，MMP-9，MMP-13，組織蛋白酶D，ADAMTS-1，ADAMTS-4，ADAMTS-5，ADAMTS-8，ADAMTS-9，ADAMTS-15，ADAMTS-16，和ADAMTS-18)能夠切割聚集蛋白聚糖肽鏈。CD-RAP的減少的存在或完全缺乏導致聚集蛋白聚糖的降解增加。

因此，在第八態樣的實施方案中，第六態樣的CD-RAP蛋白製劑或第七態樣的組合物用於在治療和/或預防患者中的關節疾病或損傷中使用，所述患者患有關節中的CD-RAP的減少的存在。在具體實施方案中，CD-RAP的存在在軟骨中減少。

CD-RAP的減少的存在可以是由於CD-RAP的表現降低。或者和/或另外，CD-RAP的存在可以由於其保留在表現細胞中而減少，特別是由於其保留在軟骨細胞中。或者和/或另外，CD-RAP的存在可以是由於其在表現細胞內部，特別是在軟骨細胞中被降解，或在其從細胞分泌到胞外空間，優選軟骨後而減少。

在第八態樣的具體實施方案中，第六態樣的CD-RAP蛋白製劑或第七態樣的組合物用於在治療和/或預防患者中的關節疾病或損傷中使用，所述患者患有降低的CD-RAP表現，在細胞，優選軟骨細胞中的CD-RAP的保留，或細胞，優選軟骨細胞或胞外空間中的CD-RAP的降解。

在第八態樣的具體實施方案中，第六態樣的CD-RAP蛋白製劑或第七態樣的組合物用於在治療和/或預防受試者中的軟骨疾病或損傷中使用，所述患者患有聚集蛋白聚糖降解和/或水流入軟骨的增加，和/或降低的CD-RAP存在，其中軟骨疾病選自由下列組成之群組：骨關節炎(OA)，類風濕性關節炎(RA)，軟骨發育不全，軟骨軟化，軟骨肉瘤，退化性盤疾病(degenerative disk disease)，髖發育異常(hip dysplasia)，指骨關節病(asteoarthropathy of the finger)，剝脫性骨軟骨炎和多軟骨炎。

在具體的實施方案中，骨關節炎選自由下列組成之群組：Kellgren-Lawrence骨關節炎，踝骨關節炎，肘骨關節炎，指骨關節炎，髖骨關節炎，膝骨關節炎，肩骨關節炎，脊柱骨關節炎，趾骨關節炎，腕骨關節炎。在具體實施方案中，OA是早發性OA。

在第八態樣的具體實施方案中，第六態樣的CD-RAP蛋白製劑或第七態樣的組合物用於在治療和/或預防患者中的軟骨疾病或損傷中使用，所述患者患有聚集蛋白聚糖降解和/或水流入軟骨的增加，和/或降低的CD-RAP存在，其中軟骨損傷是創傷性損傷或重複勞損損傷(如由於重複活動所致的軟骨組織的慢性糜爛)。根據國際軟骨修復學會的分類，即從表面損傷(1級)直至完全厚度損傷，達到骨組織(4級)，軟骨降解的嚴重性的範圍可以從1級到4級。軟骨降解的區域包括初始軟骨損傷的區域(即，其由創傷性損傷或重複勞損損傷引起)以及其它區域(即，其它關節或同一關節的其它部分)中的軟骨，其在所述損傷後也可以受損。在進一步的實施方案中，牽涉一個或多個關節的骨折也可以扭曲軟骨形態，因此從長遠來看，誘導軟骨退化。

在第八態樣的實施方案中，患者是哺乳動物，爬行類或鳥類。在具體的實施方案中，患者選自由下列組成之群組：實驗動物(例如小鼠或大鼠)，家畜(包括例如豚鼠，兔，馬，驢，牛，綿羊，山羊，豬，雞，駱駝，貓，犬，海龜，龜，蛇或蜥蜴)，或靈長類，包括黑猩猩，倭黑猩猩，大猩猩和人。特別指人。

在第八態樣的進一步的實施方案中，第六態樣的CD-RAP蛋白製劑或第七態樣的組合物改變患者中的軟骨降解的程度。在具體實施方案中，第一態樣的組合物降低患者的軟骨降解的程度，更優選聚集蛋白聚糖降解的程度。特別地，本發明的第一態樣的組合物將軟骨降解程度，優選聚集蛋白聚糖降解程度降低至少5%，至少10%，至少15%，至少20%，或至少25%。在具體的實施方案中，超過0.5%，超過1%，超過1.5%，超過2%，超過2.5%，超過3%，超過3.5%，超過4%或超過4.5%的聚集蛋白聚糖是降解的。特別地，與不顯著的非患病的軟骨組織相比測量軟骨降解，所述軟骨組織通常但不一定展現出等同於65-150mg/ml，即65，70，75，80，85，90，95，100，110，120，130，140，或150mg/ml的蛋白聚糖密度。或者，不顯著的非患病的軟骨組織通常但不一定展現出等同於通過DGEMRIC技術顯現的T1值中的400，450，500，550，600，650，700，750，800，850，900，950，或1000msec的蛋白聚糖密度。在具體實施方案中，軟骨降解導致低於65，低於60，低於55，低於50，低於45，低於40，低於35，低於30，低於25，低於20，低於15，低於10，或低於5mg/ml的蛋白聚糖密度。或者，軟骨降解導致通過DGEMRIC技術顯現的T1值中低於400，低於350，低於300，低於250，低於200，低於150，低於100或低於50msec的蛋白聚糖密度。

因而，在具體實施方案中，第六態樣的CD-RAP蛋白製劑或第七態樣的組合物將軟骨降解降低至高於5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，或65mg/ml的蛋白多糖密度。或者，聚集蛋白聚糖結合部分將軟骨降解降低到通過DGEMRIC技術顯現的T1值中的高於50，100，150，200，250，300，350，或400msec的蛋白聚糖密度。

在本發明的第六，第七或第八態樣的進一步的實施方案中，CD-RAP蛋白製劑或組合物用於靜脈內和/或關節內施用。

在第九態樣中，本發明提供了包含如上文詳細描述的第六態樣的CD-RAP蛋白製劑或第七態樣的組合物的藥物。在具體實施方案中，包含如上文詳細描述的第六態樣的CD-RAP蛋白製劑或第七態樣的組合物的藥物用於在治療和/或預防上文就本發明的第八態樣而言詳述的患者中的關節疾病或損傷的方法中使用。在第九態樣的進一步的實施方案中，包含如上文詳細描述的第六態樣的CD-RAP蛋白製劑或第七態樣的組合物的藥物用於靜脈內和/或關節內施用。

在具體實施方案中，藥物進一步包含藥學可接受載體和/或賦形劑和任選地一種或多種另外的活性物質。

在具體實施方案中，載體是液體。在進一步的實施方案中，液體載體包括但不限於無菌液體，如水和油中的鹽水溶液，包括石油，動物，植物或合成來源的那些，如花生油，大豆油，礦物油，芝麻油等。鹽水溶液和水性右旋糖和甘油溶液也可以用作液體載體，特別是用於可注射溶液。當靜脈內施用醫藥組合物時，鹽水溶液是優選的載劑。合適的藥用載劑的例子描述於E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”。

在進一步的實施方案中，賦形劑包括但不限於澱粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，明膠，麥芽，米，麵粉，白堊，矽膠，硬脂酸鈉，單硬脂酸甘油酯，滑石，氯化鈉，脫脂乳，甘油，丙二醇，水，乙醇等。

在進一步的實施方案中，佐劑提升，刺激，活化，增強或調節活性成分的效果。特別地，佐劑選自由下列組成之群組：無機佐劑(例如無機金屬鹽，如磷酸鋁或氫氧化鋁)，有機佐劑(例如皂苷或鯊烯)，油基佐劑(例如弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑)，細胞因子(例如IL-1β，IL-2，IL-7，IL-12，IL-18，GM-CFS和INF-γ)顆粒佐劑(例如免疫刺激複合物(ISCOMS)，脂質體或可生物降解的微球)，病毒體，細菌佐劑(例如單磷醯脂質A或胞壁醯肽)，合成佐劑(例如非離子嵌段共聚物，胞壁醯肽類似物或合成脂質A)或合成多核苷酸佐劑(例如聚精胺酸或聚賴胺酸)。

在其中存在另外的活性物質的實施方案中，優選所述活性物質是提供藥物價值的活性成分。特別地，醫藥組合物可以包含一種或多種可以彼此聯合或彼此獨立地起作用的活性成分。活性成分可以配製成中性或鹽形式。藥學可接受鹽包括與游離胺基基團形成的那些，如源自鹽酸，磷酸，乙酸，草酸，酒石酸等的那些，以及與游離羧基基團形成的那些，如但不限於源自氫氧化鈉，鉀，銨，鈣，鐵，異丙胺，三乙胺，2-乙基胺基乙醇，組胺酸，普魯卡因的那些。

在具體實施方案中，藥物還包含至少一種帶正電荷的胺基酸和緩衝劑，如下文就本發明的第十態樣而言詳細描述的。

在第十態樣中，本發明提供了製造本發明的第七或第八態樣的組合物的方法，包括將CD-RAP或其變體添加到緩衝劑的步驟，所述緩衝劑包含至少一種帶正電荷的胺基酸。

在第十態樣的具體實施方案中，CD-RAP是人CD-RAP，特別是根據SEQ ID NO：1的人CD-RAP或其變體。

在具體的實施方案中，所述變體與根據SEQ ID NO：1的CD-RAP具有至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%胺基酸序列同一性。

在具體的實施方案中，CD-RAP是經由如上文詳細描述的本發明的第五態樣的方法獲得的天然CD-RAP。

在本發明的第十態樣的實施方案中，至少一種帶正電荷的胺基酸增加CD-RAP的穩定性，特別是通過防止CD-RAP的降解，變性和/或聚集。在具體實施方案中，至少一種帶正電荷的胺基酸防止CD-RAP的聚集。在具體實施方案中，至少一種帶正電荷的胺基酸選自由下列組成之群組：精胺酸，賴胺酸和組胺酸。

在本發明的第十態樣的實施方案中，緩衝劑增加CD-RAP的穩定性，特別是通過防止CD-RAP的降解，變性和/或聚集。在具體實施方案中，緩衝劑防止CD-RAP的降解。在具體實施方案中，緩衝劑選自由下列組成之群組：檸檬酸鹽緩衝劑，磷酸鹽緩衝劑，組胺酸緩衝劑和Tris緩衝劑。

在實施方案中，通過本發明的第十態樣製造的組合物還包含糖或胺基糖。因而，第十態樣的方法還包括添加糖或胺基糖的步驟。在具體的實施方案中，糖是單糖，二糖或三糖，特別是選自由下列組成之群組：蔗糖，麥芽糖，海藻糖或棉子糖。在具體的實施方案中，胺基糖選自由下列組成之群組：葡糖胺，N-甲基-葡糖胺，半乳糖胺或神經胺酸。

在具體實施方案中，通過本發明的第十態樣製造的組合物不包含抗壞血酸和/或甘胺酸。

在本發明的第十態樣的實施方案中，製造的組合物包含濃度50-500mM，即50，60，70，80，90，100，150，200，250，300，350，400，450，或500mM的精胺酸。因而，第十態樣的方法包括添加濃度50-500mM，即50，60，70，80，90，100，150，200，250，300，350，400，450，或500mM的精胺酸的步驟。在實施方案中，製造的組合物包含濃度為100-350mM的精胺酸。因而，第十態樣的方法包括添加濃度為100-350mM的精胺酸的步驟。在進一步的實施方案中，製造的組合物包含濃度為100-200mM的精胺酸。因而，第十態樣的方法包括添加濃度為100-200mM的精胺酸的步驟。在具體實施方案中，製造的組合物包含濃度為200mM的精胺酸。因而，第十態樣的方法包括添加濃度為200mM的精胺酸的步驟。

在本發明的第十態樣的實施方案中，製造的組合物包含濃度為5-100mM，即5，6，7，8，9，10，20，25，30，35，40，45，60，65，70，75，80，85，90，95，或100mM的組胺酸。因而，第十態樣的方法包括添加濃度為5-100mM的組胺酸的步驟。在實施方案中，製造的組合物包含濃度為10-50mM的組胺酸。因而，第十態樣的方法包括添加濃度為10-50mM的組胺酸的步驟。在進一步的實施方案中，製造的組合物包含濃度為20-50mM的組胺酸。因此，第十態樣的方法包括添加濃度為20-50mM的組胺酸的步驟。在具體實施方案中，製造的組合物包含濃度為50mM的組胺酸。因此，第十態樣的方法包括添加濃度為50mM的組胺酸的步驟。

在本發明的第十態樣的實施方案中，製造的組合物包含磷酸鹽緩衝劑。因此，第十態樣的方法包括將CD-RAP或其變體添加到磷酸鹽緩衝劑。在其中製造的組合物包含磷酸鹽緩衝劑的實施方案中，組合物包含在水溶液中的磷酸鈉，特別是濃度為5-100mM，即5，6，7，8，9，10，20，25，30，35，40，45，60，65，70，75，80，85，90，95，或100mM。在實施方案中，製造的組合物包含濃度為10-50mM的磷酸鈉。在進一步的實施方案中，製造的組合物包含濃度為20-50mM的磷酸鈉。在具體實施方案中，組合物包含濃度為20mM的磷酸鈉。

在其中製造的組合物包含磷酸鹽緩衝劑的實施方案中，製造的組合物包含在水溶液中的磷酸鉀，特別是濃度為5-100mM，即5，6，7，8，9，10，20，25，30，35，40，45，60，65，70，75，80，85，90，95，或100mM。在進一步的實施方案中，組合物包含濃度為20-50mM的磷酸鉀。在具體實施方案中，組合物包含濃度為20mM的磷酸鉀。

在本發明的第十態樣的實施方案中，製造的組合物包含檸檬酸鹽緩衝劑。因而，第十態樣的方法包括將CD-RAP或其變體添加到檸檬酸鹽緩衝劑。在其中製造的組合物包含檸檬酸鹽緩衝劑的實施方案中，製造的組合物包含在水溶液中的檸檬酸鹽，特別是濃度為5-100mM，即5，6，7，8，9，10，20，25，30，35，40，45，60，65，70，75，80，85，90，95，或100mM。在實施方案中，製造的組合物包含濃度為10-50mM的檸檬酸鹽。在進一步的實施方案中，製造的組合物包含濃度為20-50mM的檸檬酸鹽。在具體實施方案中，製造的組合物包含濃度為20mM的檸檬酸鹽。

在本發明的第十態樣的實施方案中，製造的組合物還包含蔗糖。因而，第十態樣的方法包括添加蔗糖的步驟。在實施方案中，製造的組合物包含濃度為5-100mM，即5，6，7，8，9，10，20，25，30，35，40，45，60，65，70，75，80，85，90，95，或100mM的蔗糖。因而，第十態樣的方法包括添加濃度為5-100mM的蔗糖的步驟。在實施方案中，製造的組合物包含濃度為10-50mM的蔗糖。因而，第十態樣的方法包括添加濃度為10-50mM的蔗糖的步驟。在進一步的實施方案中，製造的組合物包含濃度為20-50mM的蔗糖。因此，第十態樣的方法包括添加濃度為20-50mM的蔗糖的步驟。在具體實施方案中，製造的組合物包含濃度為45mM的蔗糖。因此，第十態樣的方法包括添加濃度為45mM的蔗糖的步驟。

在本發明的第十態樣的實施方案中，製造的組合物還包含帶負電荷的胺基酸。因而，第十態樣的方法包括添加帶負電荷的胺基酸的步驟。在具體的實施方案中，帶負電荷的胺基酸選自由下列組成之群組：谷胺酸和天冬胺酸。在具體實施方案中，製造的組合物包含谷胺酸和天冬胺酸的組合。

在其中製造的組合物包含谷胺酸和天冬胺酸的組合的實施方案中，精胺酸和谷胺酸的總濃度為50-500mM，即50，60，70，80，90，100，150，200，250，300，350，400，450，或500mM。因而，第十態樣的方法包括添加總濃度為50-500mM的谷胺酸和天冬胺酸的組合的步驟。在實施方案中，製造的組合物包含總濃度為100-350mM，特別是100-200mM的谷胺酸和天冬胺酸的組合。因而，第十態樣的方法包括添加總濃度為100-350mM，特別是100-200mM的谷胺酸和天冬胺酸的組合的步驟。在具體實施方案中，製造的組合物包含總濃度為200mM的谷胺酸酸和天冬胺酸的組合。因而，第十態樣的方法包括添加總濃度為200mM的谷胺酸和天冬胺酸的組合的步驟。

在其中製造的組合物包含精胺酸和谷胺酸的組合的實施方案中，精胺酸和谷胺酸以1：1的比率存在。在具體的實施方案中，精胺酸和谷胺酸以1：1.25的比率存在。在進一步的實施方案中，精胺酸和谷胺酸以特別地1：1.5的比率存在。在具體實施方案中，精胺酸和谷胺酸以1：2的比率存在。

在本發明的第十態樣的實施方案中，製造的組合物的pH值在5.5和8.0之間，即5.5，5.6，5.7，5.8，5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9，7.0，7.1，7.2，7.3，7.4，7.5，7.6，7.7，7.8，7.9，或8.0。因而，第十態樣的方法包括將pH調節至5.5-8.0的值的步驟。在實施方案中，組合物的pH值為6.0-7.5。在進一步的實施方案中，組合物的pH值為6.0-6.5。在具體實施方案中，組合物的pH值為6。

在本發明的第十態樣的實施方案中，使用磷酸或氯化氫調節組合物的pH值。在具體的實施方案中，使用磷酸調節組合物的pH值。

在本發明的第十態樣的實施方案中，CD-RAP或其變體的濃度為1-10mg/ml，即1，2，3，4，5，6，7，8，9，或10mg/ml。在具體實施方案中，CD-RAP的濃度是2-5mg/ml。

在本發明的第十態樣的具體實施方案中，製造的組合物包含在水溶液中的2mg/ml CD-RAP或其變體，20mM檸檬酸鹽和200mM精胺酸，並且具有pH值6。

在第十一態樣中，本發明提供了一種貯存CD-RAP的方法，包括在包含至少一種帶正電荷的胺基酸的緩衝劑中保持CD-RAP。

在第十一態樣的具體實施方案中，CD-RAP是人CD-RAP，特別是根據SEQ ID NO：1的人CD-RAP或其變體。

在具體實施方案中，CD-RAP是通過如上文詳細描述的本發明的第五態樣的方法獲得的天然CD-RAP。

在本發明的第十一態樣的實施方案中，至少一種帶正電荷的胺基酸增加CD-RAP的穩定性，特別是通過防止CD-RAP的降解，變性和/或聚集。在具體實施方案中，至少一種帶正電荷的胺基酸防止CD-RAP的聚集。在具體實施方案中，至少一種帶正電荷的胺基酸選自由下列組成之群組：精胺酸，賴胺酸和組胺酸。

在本發明的第十一態樣的實施方案中，緩衝劑增加CD-RAP的穩定性，特別是通過防止CD-RAP的降解，變性和/或聚集。在具體實施方案中，緩衝劑防止CD-RAP的降解。在具體實施方案中，緩衝劑選自由下列組成之群組：檸檬酸鹽緩衝劑，磷酸鹽緩衝劑，組胺酸緩衝劑和Tris緩衝劑。

在實施方案中，緩衝劑進一步包含糖或胺基糖。在具體的實施方案中，糖是單糖，二糖或三糖，特別是選自蔗糖，麥芽糖，海藻糖或棉子糖。在具體的實施方案中，胺基糖選自由下列組成之群組：葡糖胺，N-甲基-葡糖胺，半乳糖胺或神經胺酸。

在具體實施方案中，緩衝劑不包含抗壞血酸和/或甘胺酸。

在本發明的第十態樣的實施方案中，緩衝劑包含濃度50-500mM，即50，60，70，80，90，100，150，200，250，300，350，400，450，或500mM的精胺酸。在實施方案中，緩衝劑包含濃度為100-350mM的精胺酸。在進一步的實施方案中，緩衝劑包含濃度為100-200mM的精胺酸。在具體的實施方案中，緩衝劑包含濃度為200mM的精胺酸。

在本發明的第十態樣的實施方案中，緩衝劑包含濃度為5-100mM，即5，6，7，8，9，10，20，25，30，35，40，45，60，65，70，75，80，85，90，95，或100mM的組胺酸。。在實施方案中，緩衝劑包含濃度為10-50mM的組胺酸。在進一步的實施方案中，緩衝劑包含濃度為20-50mM的組胺酸。在具體實施方案中，緩衝劑包含濃度為50mM的組胺酸。

在本發明的第十一態樣的實施方案中，緩衝劑是磷酸鹽緩衝劑。在其中緩衝劑是磷酸鹽緩衝劑的實施方案中，緩衝劑包括在水溶液中的磷酸鈉，特別是濃度為5-100mM，即5，6，7，8，9，10，20，25，30，35，40，45，60，65，70，75，80，85，90，95，或100mM。在實施方案中，緩衝劑包含濃度為10-50mM的磷酸鈉。在進一步的實施方案中，緩衝劑包含濃度為20-50mM的磷酸鈉。在具體實施方案中，緩衝劑包含濃度為20mM的磷酸鈉。

在其中緩衝劑是磷酸鹽緩衝劑的實施方案中，緩衝劑包括在水溶液中的磷酸鉀，特別是濃度為5-100mM，即5，6，7，8，9，10，20，25，30，35，40，45，60，65，70，75，80，85，90，95，或100mM。在進一步的實施方案中，緩衝劑包含濃度為20-50mM的磷酸鉀。在具體實施方案中，緩衝劑包含濃度為20mM的磷酸鉀。

在本發明的第十一態樣的實施方案中，緩衝劑是檸檬酸鹽緩衝劑。在緩衝劑包含檸檬酸鹽緩衝劑的實施方案中，緩衝劑在水溶液中包含檸檬酸鹽，特別是濃度為5-100mM，即5，6，7，8，9，10，20，25，30，35，40，45，60，65，70，75，80，85，90，95，或100mM。在實施方案中，緩衝劑包含濃度為10-50mM的檸檬酸鹽。在進一步的實施方案中，緩衝劑包含濃度為20-50mM的檸檬酸鹽。在具體實施方案中，緩衝劑包含濃度為20mM的檸檬酸鹽。

在本發明的第十態樣的實施方案中，緩衝劑進一步包含蔗糖。在實施方案中，緩衝劑包含濃度為5-100mM，即5，6，7，8，9，10，20，25，30，35，40，45，60，65，70，75，80，85，90，95，或100mM的蔗糖。在實施方案中，組合物包含濃度為10-50mM的蔗糖。存進一步的實施方案中，組合物包含濃度為20-50mM的蔗糖。在具體實施方案中，組合物包含濃度為45mM的蔗糖。

在本發明的第十態樣的實施方案中，緩衝劑進一步包含帶負電荷的胺基酸。在具體的實施方案中，帶負電荷的胺基酸選自由下列組成之群組：谷胺酸和天冬胺酸。在具體的實施方案中，緩衝劑包含谷胺酸和天冬胺酸的組合。

在其中緩衝劑包含谷胺酸和天冬胺酸的組合的實施方案中，精胺酸和谷胺酸的總濃度為50-500mM，即50，60，70，80，90，100，150，200，250，300，350，400，450，或500mM。在實施方案中，緩衝劑包含總濃度為100-350mM，特別是100-200mM的谷胺酸和天冬胺酸的組合。在具體實施方案中，緩衝劑包含總濃度為200mM的谷胺酸和天冬胺酸的組合。

在實施方案中，其中緩衝劑包含精胺酸和谷胺酸的組合，精胺酸和谷胺酸以1：1的比率存在。在具體的實施方案中，精胺酸和谷胺酸以1：1.25的比率存在。在進一步的實施方案中，特別地，精胺酸和谷胺酸以1：1.5的比率存在。在具體實施方案中，精胺酸和谷胺酸以1：2的比率存在。

在本發明的第十一態樣的實施方案中，緩衝劑的pH值在5.5和8.0之間，即5.5，5.6，5.7，5.8，5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9，7.0，7.1，7.2，7.3，7.4，7.5，7.6，7.7，7.8，7.9，或8.0。在實施方案中，緩衝劑的pH值在6.0和7.5之間。在進一步的實施方案中，緩衝劑的pH值在6.0和6.5之間。在具體實施方案中，組合物的pH值為6。

在本發明的第十一態樣的實施方案中，使用磷酸或氯化氫調節緩衝劑的pH值。在具體實施方案中，使用磷酸調節緩衝劑的pH值。

在本發明第十一態樣的實施方案中，CD-RAP或其變體的濃度在1和10mg/ml之間，即1，2，3，4，5，6，7，8，9或10mg/ml。在具體實施方案中，CD-RAP的濃度在2和5mg/ml之間。

在本發明的第十一態樣的具體實施方案中，在包含水溶液中的20mM檸檬酸鹽和200mM精胺酸的緩衝液中貯存2mg/ml CD- RAP或其變體，並且具有pH值6。

在第十一態樣的具體實施方案中，在-80℃至40℃，特別是-20℃至25℃，特別是-20℃至5℃的溫度貯存CD-RAP。

在第十一態樣的具體實施方案中，將CD-RAP貯存多至6個月，即多至6個月，多至5個月，多至4個月，多至3個月，多至2個月，多至1個月，多至3周，多至2周，多至1周，多至6天，多至5天，多至4天，多至3天，多至2天，多至1天的時間段。在具體實施方案中，將CD-RAP貯存多至3個月，特別是多至1個月。

特別地，在基本上不聚集，變性或降解的情況下將CD-RAP貯存上文指定的時間段。

在第十二態樣中，本發明提供了包含脂質體的組合物，所述脂質體包含囊封的CD-RAP或其變體，其中脂質體的大小低於200nm。

在具體的實施方案中，CD-RAP是人CD-RAP，特別是根據SEQ ID NO：1的人CD-RAP或其變體。在具體的實施方案中，變體與SEQ ID NO：1的CD-RAP具有至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%的胺基酸序列同一性。

在第十二態樣的實施方案中，脂質體的大小低於200nm，i.e.低於200nm，低於190nm，低於180nm，低於170nm，低於160nm，低於150nm，低於140nm，130nm，低於120nm，低於110nm，低於100nm，低於90nm，低於80nm，低於70nm，低於60nm，低於50nm，低於40nm，低於30nm，低於20nm，或低於10nm。在具體實施方案中，溶酶體的大小低於150nm。在進一步的實施方案中，溶酶體的大小為120nm，特別是低於 100nm。

在第十二態樣的實施方案中，在脂質體中囊封總CD-RAP的超過20%。在具體實施方案中，在脂質體中囊封總CD-RAP的至少30%。在進一步的實施方案中，在脂質體中囊封總CD-RAP的至少40%。在實施方案中，在脂質體中囊封總CD-RAP的40-100%，即在脂質體中囊封總CD-RAP的40%，45%，50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，或99%。在具體實施方案中，在脂質體中囊封總CD-RAP的40%-90%，40-80%，50-90%，50-80%，60-90%，60-80%，70-80%，70-90%或80-90%。

在第十二態樣的實施方案中，CD-RAP與脂質體的比率為1：0.5至1：1.5，即1：0.5，1：0,6，1：0,7，1：0,8，1：0,9，1：1，1：1,1，1：1.2，1：1,3，,1：1,4，1：1,5。在具體實施方案中，CD-RAP與脂質體的比率為1：1.2。

在第十二態樣的實施方案中，脂質體的多分散性指數(PDI)低於0.3。在具體實施方案中，PDI低於0.2，特別是低於0.15。在具體實施方案中，PDI為0.132。

在第十二態樣的實施方案中，脂質體由一種或多種脂質構成。在實施方案中，一種或多種脂質選自由下列組成之群組：甘油酯，磷脂，甘油膦基脂(glycerophosphinolipids)，甘油膦醯脂(glycerophosphonolipids)，硫脂，鞘脂，異戊二烯醇脂，類固醇，硬脂(stearines)，固醇和含有碳水化合物的脂質。在具體的實施方案中，脂質體由選自由下列組成之群組的脂質構成：磷脂酸(PA)，磷脂醯乙醇胺(PE)，磷脂醯膽鹼(PC)，磷脂醯絲胺酸(PS)和磷酸肌醇，如磷脂醯肌醇(PI)，磷脂醯肌醇磷酸(PIP)，磷脂醯肌醇二磷酸(PIP2)，磷脂醯肌醇三磷酸(PIP3)，心磷脂，溶血磷脂質(lysophospholipid)和膽固醇。在實施方案中，脂質體由至少兩種脂質組成。在進一步的實施方案中，脂質體由磷脂和固醇組成。在具體實施方案中，脂質體由磷脂醯膽鹼和膽固醇組成。

在進一步的實施方案中，脂質磷脂醯膽鹼和膽固醇以60：40，65：35，70：30，75：25，80：20：85：15，或90：10的比率存在。在具體實施方案中，脂質磷脂醯膽鹼和膽固醇以74.8：25.2的比率存在。

在第十二態樣的實施方案中，脂質體還包含疏水性抗壞血酸酯。在具體實施方案中，疏水性抗壞血酸酯是抗壞血酸棕櫚酸酯。

在進一步的實施方案中，抗壞血酸酯以與磷脂和固醇的量的0.1：99.9至1：99的比率，即以0.1：99.9，0.2：99.8，0.3：99.7，0.4：99.6，0.5：99.5，0.6：99.4，0.7：99.3，0.8：99.2，0.9：99.1，或1.0：99.0的比率存在。在具體實施方案中，抗壞血酸酯以與磷脂和固醇的量的0.1：99.9的比率存在。

在第十二態樣的實施方案中，CD-RAP和溶酶體存在於含有至少一種帶正電荷的胺基酸的磷酸鹽緩衝劑或檸檬酸鹽緩衝劑中。

在具體實施方案中，至少一種帶正電荷的胺基酸增加CD-RAP的穩定性，特別是通過防止CD-RAP的降解，變性和/或聚集。在具體實施方案中，至少一種帶正電荷的胺基酸防止CD-RAP的聚集。在具體實施方案中，至少一種帶正電荷的胺基酸選自由下列組成之群組：精胺酸，賴胺酸和組胺酸。

在進一步的實施方案中，緩衝劑增加CD-RAP的穩定性，特別是通過防止CD-RAP的降解，變性和/或聚集。在具體實施方案中，緩衝劑防止CD-RAP的降解。

在本發明第十二態樣的實施方案中，組合物包含濃度為20-500mM，即20，30，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250，300，350，400，450，或500mM的精胺酸。在實施方案中，組合物包含濃度為100-350mM的精胺酸。在進一步的實施方案中，組合物包含濃度為100-200mM的精胺酸。在具體實施方案中，組合物包含濃度為200mM的精胺酸。

在本發明第十二態樣的實施方案中，所述組合物包含濃度為 5-100mM，即5，6，7，8，9，10，20，25，30，35，40，45，60，65，70，75，80，85，90，95，或100mM的組胺酸。在實施方案中，組合物包含濃度為10-50mM的組胺酸。在進一步的實施方案中，組合物包含濃度為20-50mM的組胺酸。在具體實施方案中，組合物包含濃度為20mM的組胺酸。

在本發明第十二態樣的實施方案中，組合物包含0.1-10%賴胺酸，即0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，0.6%，0.7%，0.8%，0.9%，1.0% 1.5%，2.0%，2.5%，3.0%，3.5%，4.0%，4.5%，5.0%，5.5%，6.0%，6.5%，7.0%，7.5%，8.0%，8.5%，9.0%，9.5%，10%賴胺酸。在第一態樣的實施方案中，組合物包含0.5%-7.5%的賴胺酸。在進一步的實施方案中，組合物包含1.0%-5.0%的賴胺酸。在具體實施方案中，組合物包含2.0%-3.0%的賴胺酸。在本發明的第一態樣的實施方案中，組合物包含磷酸鹽緩衝劑。在其中組合物包含磷酸鹽緩衝劑的實施方案中，組合物包含在水溶液中的磷酸鈉，特別是以5-100mM，即5，6，7，8，9，10，20，25，30，35，40，45，60，65，70，75，80，85，90，95，或100mM的濃度。在實施方案中，組合物包含濃度為10-50mM的磷酸鈉。在進一步的實施方案中，組合物包含濃度為20-50mM的磷酸鈉。在具體實施方案中，組合物包含濃度為20mM的磷酸鈉。

在其中所述組合物包含磷酸鹽緩衝劑的實施方案中，所述組合物包含在水溶液中的磷酸鉀，特別是以5-100mM，即5，6，7，8，9，10，20，25，30，35，40，45，60，65，70，75，80，85，90，95，或100mM的濃度。在進一步的實施方案中，組合物包含濃度為20-50mM的磷酸鉀。在具體實施方案中，組合物包含濃度為20mM的磷酸鉀。

在本發明的第十二態樣的實施方案中，組合物包含檸檬酸鹽緩衝劑。在其中所述組合物包含檸檬酸鹽緩衝劑的實施方案中，所述組合物包含在水溶液中的檸檬酸鹽，特別是以5-100mM，即 5，6，7，8，9，10，20，25，30，35，40，45，60，65，70，75，80，85，90，95，或100mM的濃度。在實施方案中，組合物包含濃度為10-50mM的檸檬酸鹽。在進一步的實施方案中，組合物包含濃度為20-50mM的檸檬酸鹽。在具體實施方案中，組合物包含濃度為20mM的檸檬酸鹽。

在本發明的第十二態樣的實施方案中，組合物還包含蔗糖。在實施方案中，所述組合物包含濃度為5-100mM，即5，6，7，8，9，10，20，25，30，35，40，45，60，65，70，75，80，85，90，95，或100mM的蔗糖。在實施方案中，所述組合物包含濃度為10-50mM的檸檬酸鹽。在進一步的實施方案中，所述組合物包含濃度為20-50mM的檸檬酸鹽。在具體實施方案中，所述組合物包含濃度為45mM的檸檬酸鹽。

在本發明的第十二態樣的實施方案中，組合物還包含帶負電荷的胺基酸。在具體的實施方案中，帶負電荷的胺基酸選自由下列組成之群組：谷胺酸和天冬胺酸。在具體實施方案中，組合物包含谷胺酸和天冬胺酸的組合。

在其中所述組合物包含谷胺酸和天冬胺酸的組合的實施方案中，精胺酸和谷胺酸的總濃度為50-500mM，即50，60，70，80，90，100，150，200，250，300，350，400，450，或500mM。在實施方案中，組合物包含總濃度為100-350mM，特別是100-200mM的谷胺酸和天冬胺酸的組合。在具體實施方案中，組合物包含總濃度為200mM的谷胺酸和天冬胺酸的組合。

在其中所述組合物包含精胺酸和谷胺酸的組合的實施方案中，精胺酸和谷胺酸以1：1的比率存在。在具體的實施方案中，精胺酸和谷胺酸以1：1.25的比率存在。在進一步的實施方案中，特別地，精胺酸和谷胺酸以1：1.5的比率存在。在具體實施方案中，精胺酸和谷胺酸以1：2的比率存在。

在本發明第十二態樣的實施方案中，組合物的pH值在5.5和8.0之間，即5.5，5.6，5.7，5.8，5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4， 6.5，6.6，6.7，6.8，6.9，7.0，7.1，7.2，7.3，7.4，7.5，7.6，7.7，7.8，7.9，或8.0。在實施方案中，組合物的pH值在6.0和7.5之間。在進一步的實施方案中，組合物的pH值在6.0和6.5之間。在具體實施方案中，組合物的pH值為6。

在本發明的第十二態樣的實施方案中，使用磷酸或氯化氫調節組合物的pH值。在具體的實施方案中，使用磷酸調節組合物的pH值。

在第十三態樣中，本發明提供了如上文詳細描述的第十二態樣的組合物，用於在治療和/或預防患者中的關節疾病或損傷的方法中使用。在關節疾病或損傷的具體實施方案中，軟骨和/或軟組織受影響。特別地，關節疾病或損傷是軟骨疾病或損傷和/或十字形韌帶和/或副韌帶的疾病或損傷。在進一步的實施方案中，軟骨以導致其降解的方式受影響。軟骨的降解可以由各種因素引起。軟骨降解可以由損傷，諸如但不限於創傷性損傷或重複勞損損傷(如由於重複活動所致的軟骨組織的慢性糜爛)引起或觸發。根據國際軟骨修復學會的分類，即從表面損傷(1級)直至完全厚度損傷，達到骨組織(4級)，軟骨降解的嚴重性的範圍可以從1級到4級。軟骨降解的區域包括初始軟骨損傷的區域(即，其由創傷性損傷或重複勞損損傷引起)以及其它區域(即，其它關節或同一關節的其它部分)中的軟骨，其在所述損傷後也可以受損。在進一步的實施方案中，牽涉一個或多個關節的骨折也可以扭曲軟骨形態，因此從長遠來看，誘導軟骨退化。

在第十三態樣的實施方案中，第十二態樣的組合物用於在治療和/或預防患者中的關節疾病或損傷中使用，所述患者患有軟骨降解和/或水流入軟骨增加，和/或軟骨中的CD-RAP的減少的存在。

在進一步的實施方案中，軟骨降解牽涉蛋白聚糖，特別是聚集蛋白聚糖的降解。蛋白聚糖降解可以由於蛋白酶切割而發生。參與蛋白聚糖，優選聚集蛋白聚糖降解的蛋白酶包括但不限於基質金屬蛋白酶(MMP)，組織蛋白酶，解聚素和金屬蛋白酶(ADAM)和具有血小板反應蛋白基序的解聚素和金屬蛋白酶(ADAMTS)。在優選的實施方案中，蛋白聚糖，優選聚集蛋白聚糖由選自由下列組成之群組的蛋白酶降解：MMP-1，MMP-3，MMP-2，MMP-7，MMP-8，MMP-9，MMP-13，組織蛋白酶D，ADAMTS-1，ADAMTS-4，ADAMTS-5，ADAMTS-8，ADAMTS-9，ADAMTS-15，ADAMTS-16和ADAMTS-18。特別優選的是ADAMTS-4和/或ADAMTS-5。

在進一步的實施方案中，第十二態樣的組合物用於在治療和/或預防患有聚集蛋白聚糖降解的患者中的關節疾病或損傷中使用。在具體的實施方案中，0.5%-5%的聚集蛋白聚糖是降解的，即0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%，3%，3.5%，4%，4.5%或5%的聚集蛋白聚糖是降解的。在具體實施方案中，超過0.5%，超過1%，超過1.5%，超過2%，超過2.5%，超過3%，超過3.5%，超過4%或超過4.5%的聚集蛋白聚糖是降解的。特別地，與不顯著的非患病的軟骨組織相比測量軟骨降解，所述軟骨組織通常但不一定展現出等同於65-150mg/ml，即65，70，75，80，85，90，95，100，110，120，130，140，或150mg/ml的蛋白聚糖密度。或者，不顯著的非患病的軟骨組織通常但不一定展現出等同於通過DGEMRIC技術顯現的T1值中的400，450，500，550，600，650，700，750，800，850，900，950，或1000msec的蛋白聚糖密度。在具體實施方案中，軟骨降解導致低於65，低於60，低於55，低於50，低於45，低於40，低於35，低於30，低於 25，低於20，低於15，低於10，或低於5mg/ml的蛋白聚糖密度。或者，軟骨降解導致通過DGEMRIC技術顯現的T1值中低於400，低於350，低於300，低於250，低於200，低於150，低於100或低於50msec的蛋白聚糖密度。

因此，在具體實施方案中，第十二態樣的組合物將軟骨降解降低至高於5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，或65mg/ml的蛋白多糖密度。或者，第一態樣的組合物將軟骨降解降低到通過DGEMRIC技術顯現的T1值中的高於50，100，150，200，250，300，350，或400msec的蛋白聚糖密度。

完整蛋白聚糖的喪失，特別是完整聚集蛋白聚糖的喪失(特別是由於聚集蛋白聚糖降解，即切割的蛋白聚糖，優選聚集蛋白聚糖的增加)導致水流入軟骨，從而導致軟骨腫脹以及因此導致關節腫脹。因此，在第十三態樣的實施方案中，第十二態樣的組合物用於在治療和/或預防患者中的關節疾病或損傷中使用，所述患者患有水流入軟骨的增加。

因此，在第十三態樣的實施方案中，第十二態樣的組合物用於在治療和/或預防患者中的關節疾病或損傷中使用，所述患者患有關節中的CD-RAP的減少的存在。在具體實施方案中，CD-RAP的存在在軟骨中減少。

在第十三態樣的具體實施方案中，第十二態樣的組合物用於在治療和/或預防患者中的關節疾病或損傷中使用，所述患者患有CD-RAP表現降低，在細胞，優選軟骨細胞中的CD-RAP的保留，或細胞，優選軟骨細胞或胞外空間中的CD-RAP的降解。

在第十三態樣的具體實施方案中，第十二態樣的組合物用於在治療和/或預防受試者中的軟骨疾病或損傷中使用，所述患者患有聚集蛋白聚糖降解和/或水流入軟骨的增加，和/或降低的CD-RAP存在，其中軟骨疾病選自由下列組成之群組：骨關節炎(OA)，類風濕性關節炎(RA)，軟骨發育不全，軟骨軟化，軟骨肉瘤，退化性盤疾病，髖發育異常，指骨關節病，剝脫性骨軟骨炎和多軟骨炎。

在第十三態樣的具體實施方案中，第十二態樣的組合物用於在治療和/或預防患者中的軟骨疾病或損傷中使用，所述患者患有聚集蛋白聚糖降解和/或水流入軟骨的增加，和/或降低的CD-RAP存在，其中軟骨損傷是創傷性損傷或重複勞損損傷(如由於重複活動所致的軟骨組織的慢性糜爛)。根據國際軟骨修復學會的分類，即從表面損傷(1級)直至完全厚度損傷，達到骨組織(4級)，軟骨降解的嚴重性的範圍可以從1級到4級。軟骨降解的區域包括初始軟骨損傷的區域(即，其由創傷性損傷或重複勞損損傷引起)以及其它區域(即，其它關節或同一關節的其它部分)中的軟骨，其在所述損傷後也可以受損。在進一步的實施方案中，牽涉一個或多個關節的骨折也可以扭曲軟骨形態，因此從長遠來看，誘導軟骨退化。

在第十三態樣的實施方案中，患者是哺乳動物，爬行類或鳥類。在具體的實施方案中，患者選自由下列組成之群組：實驗動物(例如小鼠或大鼠)，家畜(包括例如豚鼠，兔，馬，驢，牛，綿羊，山羊，豬，雞，駱駝，貓，犬，海龜，龜，蛇或蜥蜴)，或靈長類，包括黑猩猩，倭黑猩猩，大猩猩和人。特別指人。

在第十三態樣的另一個實施方案中，第十二態樣的組合物改變患者中的軟骨降解的程度。在具體實施方案中，第十二態樣的組合物降低患者中的軟骨降解的程度，更優選聚集蛋白聚糖降解的程度。特別地，本發明的第十二態樣的組合物將軟骨降解程度，優選聚集蛋白聚糖降解程度降低至少5%，至少10%，至少15%，至少20%，或至少25%。在具體的實施方案中，超過0.5%，超過1%，超過1.5%，超過2%，超過2.5%，超過3%，超過3.5%，超過4%或超過4.5%的聚集蛋白聚糖是降解的。特別地，與不顯著的非患病的軟骨組織相比測量軟骨降解，所述軟骨組織通常但不一定展現出等同於65-150mg/ml，即65，70，75，80，85，90，95，100，110，120，130，140，或150mg/ml的蛋白聚糖密度。或者，不顯著的非患病的軟骨組織通常但不一定展現出等同於通過DGEMRIC技術顯現的T1值中的400，450，500，550，600，650，700，750，800，850，900，950，或1000msec的蛋白聚糖密度。在具體實施方案中，軟骨降解導致低於65，低於60，低於55，低於50，低於45，低於40，低於35，低於30，低於25，低於20，低於15，低於10，或低於5mg/ml的蛋白聚糖密度。或者，軟骨降解導致通過DGEMRIC技術顯現的T1值中低於400，低於350，低於300，低於250，低於200，低於150，低於100或低於50msec的蛋白聚糖密度。

因此，在具體實施方案中，第十二態樣的組合物將軟骨降解降低至高於5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，或65mg/ml的蛋白多糖密度。或者，聚集蛋白聚糖結合部分將軟骨降解降低到通過DGEMRIC技術顯現的T1值中的高於50，100，150，200，250，300，350，或400msec的蛋白聚糖密度。

在本發明第十二或第十三態樣的進一步的實施方案中，組合物用於關節內投予。

在第十四態樣中，本發明提供了包含如上文詳細描述的本發明的第十二或第十三態樣的組合物的藥物。在具體實施方案中，藥物進一步包含藥學可接受載劑和/或賦形劑和任選的一種或多種另外的活性物質。

在具體實施方案中，載劑是液體。在進一步的實施方案中，液體載劑包括但不限於無菌液體，如水和油中的鹽水溶液，包括石油，動物，植物或合成來源的那些，如花生油，大豆油，礦物油，芝麻油等。鹽水溶液和水性右旋糖和甘油溶液也可以用作液體載劑，特別是用於可注射溶液。當靜脈內施用醫藥組合物時，鹽水溶液是優選的載劑。合適的藥用載劑的例子描述於E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”。

在進一步的實施方案中，佐劑提升，刺激，活化，增強或調節活性成分的效果。特別地，佐劑選自由下列組成之群組：無機佐劑(例如無機金屬鹽，如磷酸鋁或氫氧化鋁)，有機佐劑(例如皂苷或鯊烯)，油基佐劑(例如弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑)，細胞因子(例如IL-1β，IL-2，IL-7，IL-12，IL-18，GM-CFS和INF-γ)顆粒佐劑(例如免疫刺激複合物(ISCOMS)，脂質體或可生物降解的微球)，病毒體，細菌佐劑(例如單磷醯脂質A或胞壁醯肽)，合成佐劑(例如非離子嵌段共聚物，胞壁醯肽類似物或合成脂質A) 或合成多核苷酸佐劑(例如聚精胺酸或聚賴胺酸)。

在第十五態樣中，本發明提供了一種製造脂質體配製劑的方法，包括以下步驟：a)在有機溶劑中溶解至少一種脂質，b)將步驟a)的混合物注射到循環水相中，並且c)去除溶劑。

在第十五態樣的實施方案中，所述方法還包括步驟d)將通過步驟a-c)獲得的脂質體配製劑與包含CD-RAP的組合物混合。因此，預形成的脂質體摻加CD-RAP。

在實施方案中，步驟a)的有機溶劑是3類溶劑。特別地，溶劑選自由下列組成之群組：乙酸，丙酮，苯甲醚，1-丁醇，2-丁醇，乙酸丁酯，叔丁基甲基醚，枯烯，二甲亞碸，乙醇，乙酸乙酯，乙醚甲酸乙酯，甲酸，庚烷，乙酸異丁酯，乙酸異丙酯，乙酸甲酯，3-甲基-1-丁醇，甲基乙基酮，甲基異丁基酮，2-甲基-1-丙醇，戊烷，1-戊醇，1-丙醇，2-丙醇，乙酸丙酯，更優選1-丙醇。

在第十五態樣的實施方案中，步驟a)的至少一種脂質選自由下列組成之群組：甘油酯，甘油磷脂，甘油膦基脂，甘油膦醯脂，硫脂，鞘脂，磷脂，異戊二烯醇脂，類固醇，硬脂，固醇和含有碳水化合物的脂質。在具體的實施方案中，至少一種脂質選自由下列組成之群組：磷脂酸(PA)，磷脂醯乙醇胺(PE)，磷脂醯膽鹼(PC)，磷脂醯絲胺酸(PS)和磷酸肌醇，如磷脂醯肌醇(PI)，磷脂醯肌醇磷酸(PIP)，磷脂醯肌醇二磷酸(PIP2)，磷脂醯肌醇三磷酸(PIP3)，心磷脂，溶血磷脂質和膽固醇。在具體的實施方案中，至少一種脂質是兩種脂質的組合，特別地，磷脂和固醇的組合，特別地磷脂醯膽鹼和膽固醇的組合。

在第十五態樣的實施方案中，在步驟a)中，在有機溶劑中溶解兩種或更多種脂質。在實施方案中，在有機溶劑中溶解一種或多種磷脂和一種或多種固醇。在具體實施方案中，在有機溶劑中溶解脂質磷脂醯膽鹼和膽固醇。特別地，脂質和有機溶劑之間的比率為3：1。

在進一步的實施方案中，溶劑中的脂質總濃度為0.02至0.4g/ml，即0.02至0.4g/ml，即0.02g/ml，0.03g/ml，0.04g/ml，0.05g/ml，0.06g/ml，0.07g/ml，0.08g/ml，0.09g/ml，0.10g/ml，0.11g/ml，0.12g/ml，0.13g/ml，0.14g/ml，0.15g/ml，0.16g/ml，0.17g/ml，0.18g/ml，0.19g/ml，0.2g/ml，0.21g/ml，0.22g/ml，0.23g/ml，0.24g/ml，0.25g/ml，0.26g/ml，0.27g/ml，0.28g/ml，0.29g/ml，0.30g/ml，0.31g/ml，0.32g/ml，0.33g/ml，0.34g/ml，0.35g/ml，0.36g/ml，0.37g/ml，0.38g/ml，0.39g/ml，或0.4g/ml。在具體實施方案中，溶劑中的脂質總濃度為0.03-0.3g/ml，0.03-0.1g/ml，0.03-0.05g/ml。在具體實施方案中，溶劑中的脂質總濃度為0.033g/ml。

在第十五態樣的進一步的實施方案中，除了步驟a)中的至少一種脂質之外，在有機溶劑中溶解疏水性抗壞血酸酯。在具體的實施方案中，疏水性抗壞血酸酯是抗壞血酸棕櫚酸酯，在進一步的實施方案中，抗壞血酸酯以與磷脂和固醇的量的0.1：99.9至1：99的比率，即以0.1：99.9，0.2：99.8，0.3：99.7，0.4：99.6，0.5：99.5，0.6：99.4，0.7：99.3，0.8：99.2，0.9：99.1，或1.0：99.0的比率存在。在具體實施方案中，抗壞血酸酯以與磷脂和固醇的量的0.1：99.9的比率存在。

在第十五態樣的其它實施方案中，速度為1-10ml/min，即速度為1，2，3，4，5，6，7，8，9或10ml/min。在具體實施方案中，以5ml/min的速度注射混合物。

在第十五態樣的進一步的實施方案中，水相以500-3000ml/min，即500，600，700，800，900，1000，1100，1200，1300，1400，1500，1600，1700，1800，1900，2000，2100，2200，2300，2400，2500，2600，2700，2800，2900，或3000ml/min的速度循環。在具體實施方案中，水相以1000-2500，1500-2500，或2000-2500ml/min的速度循環。在具體實施方案中，水相以2200ml/min的速度循環。

在具體實施方案中，通過剪切誘導裝置循環水相。在實施方案中，剪切引發裝置是靜態混合器或正常攪拌器。特別地，剪切誘導裝置是靜態混合器。在第一態樣的實施方案中，靜態混合器具有10-15mm，即10，11，12，13，14，或15mm的內徑。在具體實施方案中，靜態混合器具有12-13mm，即12.0，12.1，12.2，12.3，12.4，12.5，12.6，12.7，12.8，12.9，或13.0mm的內徑。在實施方案中，靜態混合器適合於混合150-300ml，即150，160，170，180，190，200，210，220，230，240，250，260，270，280，290，或300ml最終體積的脂質體配製劑。特別地，靜態混合器適合於混合170-300ml的最終體積，特別是200-250ml的最終體積的脂質體配製劑。因而，在具體實施方案中，靜態混合器的內徑與混合脂質配製劑的體積之間的比率是每15ml脂質配製劑的內徑為0.7mm-1mm，即0.7，0.8，0.9或1.0mm。在具體實施方案中，在步驟b)中，在剪切誘導裝置的前面注射a)的混合物。在具體實施方案中，在靜態混合器的前面注射a)的混合物。

在進一步的實施方案中，在步驟c)中使用過濾，特別是使用切向流過濾去除溶劑。

在進一步的實施方案中，步驟d)中混合的CD-RAP的組合物包含1-10mg/ml CD-RAP，即1，2，3，4，5，6，7，8，9或10mg/ml CD- RAP。在具體實施方案中，組合物包含2-9，3-8，4-8，5-8或6-8mg/ml CD-RAP。在具體實施方案中，組合物包含7mg/ml CD-RAP。在進一步的實施方案中，在步驟d)中混合的CD-RAP包含在如上文詳細描述的精胺酸磷酸鹽緩衝劑或精胺酸檸檬酸鹽緩衝劑中。

在進一步的實施方案中，脂質體配製劑和CD-RAP之間的比率為1：1，1.1：1，1.2：1，1.3：1，1.4：1或1.5：1。在具體實施方案中，脂質體配製劑和CD-RAP之間的比率為1.2：1。

在第十五態樣的實施方案中，方法還包括步驟e)冷凍乾燥脂質體配製劑。

在第十五態樣的實施方案中，方法包括步驟f)在精胺酸磷酸鹽緩衝劑或精胺酸檸檬酸鹽緩衝劑中重建冷凍乾燥的脂質體配製劑。在實施方案中，通過一次添加並混合精胺酸磷酸鹽緩衝劑或精胺酸檸檬酸鹽緩衝劑的完全重建體積在單個步驟中重建冷凍乾燥的脂質體配製劑。在實施方案中，通過在兩個或更多個後續步驟中添加精胺酸磷酸鹽緩衝劑或精胺酸檸檬酸鹽緩衝劑的完全重建體積的部分，在兩個或更多個後續步驟中重建冷凍乾燥的脂質體配製劑，即在第一步驟中可以添加並混合精胺酸磷酸鹽緩衝劑或精胺酸檸檬酸鹽緩衝劑的完全重建體積的一半體積，並且在第二步驟中可以添加並混合精胺酸磷酸鹽緩衝劑或精胺酸檸檬酸鹽緩衝劑的完全重建體積的第二個一半體積。在實施方案中，重建包括兩個步驟，其中在第一步驟中，可以添加並混合精胺酸磷酸鹽緩衝劑或精胺酸檸檬酸鹽緩衝劑的完全重建體積的三分之一的體積，並且在第二步驟中，可以添加並混合精胺酸磷酸鹽緩衝劑或精胺酸檸檬酸鹽緩衝劑的重建體積的三分之二。在實施方案中，重新配製包括三個步驟，其中在每個步驟中，可以添加並混合精胺酸磷酸鹽緩衝劑或精胺酸檸檬酸鹽緩衝劑的完全重建體積的三分之一。

在第十六態樣中，本發明提供了通過如上文詳細描述的第十四態樣的方法可製造或製造的脂質體配製劑。

在第十七態樣中，本發明提供了一種貯存CD-RAP的方法，包括在上文就本發明的第十一態樣而言詳細規定的脂質體配製劑中保持CD-RAP。

在第十七態樣的實施方案中，在-80℃至40℃，即在-80℃，-75℃，-70℃，-65℃，-60℃，-55℃，-50℃，-45℃，-40℃，-35℃，-30℃，-25℃，-20℃，-15℃，-10℃，-5℃，0℃，5℃，10℃，15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，或40℃的溫度在脂質體配製劑中貯存CD-RAP。在第六態樣的實施方案中，在-20℃至25℃或-10℃至10℃，特別是5℃的溫度在脂質體配製劑中貯存CD-RAP。

在第十七態樣的實施方案中，在脂質體配製劑中將CD-RAP貯存多至6個月，即多至6個月，多至5個月，多至4個月，多至3個月，多至2個月，多至1個月，多至3周，多至2周，多至1周，多至6天，多至5天，多至4天，多至3天，多至2天，多至1天的時間段。在第六態樣的實施方案中，在脂質體配製劑中將CD-RAP貯存多至3個月，特別是多至1個月。

在第十八態樣中，本發明提供了降低在上文就本發明的第一態樣而言詳細規定的脂質體配製劑中的脂質體大小的方法，包括以下步驟：a)在有機溶劑中溶解至少一種脂質，b)將步驟a)的混合物注射到循環水相中，並且c)去除溶劑。

在第十八態樣的實施方案中，方法還包括步驟d)將通過步驟a-c)獲得的脂質體配製劑與包含CD-RAP的組合物混合。

在實施方案中，步驟a)的有機溶劑是3類溶劑。特別地，溶劑選自乙酸，丙酮，苯甲醚，1-丁醇，2-丁醇，乙酸丁酯，叔丁基甲基醚，枯烯，二甲基亞碸，乙醇，乙酸乙酯，乙醚甲酸乙酯，甲酸，庚烷，乙酸異丁酯，乙酸異丙酯，乙酸甲酯，3-甲基-1-丁醇，甲基乙基酮，甲基異丁基酮，2-甲基-1-丙醇，戊烷，1-戊醇，1-丙醇，2-丙醇，更優選1-丙醇。

在第十七態樣的實施方案中，步驟a)的至少一種脂質選自甘油酯，甘油磷脂，甘油膦醯脂，甘油磷脂，硫脂，鞘脂，磷脂，異戊烯醇，類固醇，硬脂，固醇和含碳水化合物的脂質。在特定實施方案中，至少一種脂質選自磷脂酸(PA)，磷脂醯乙醇胺(PE)，磷脂醯膽鹼(PC)，磷脂醯絲胺酸(PS)和磷酸肌醇例如磷脂醯肌醇(PI)，磷脂醯肌醇磷酸)，磷脂醯肌醇二磷酸(PIP2)，磷脂醯肌醇三磷酸(PIP3)，心磷脂，溶血磷脂和膽固醇。在具體實施方案中，至少一種脂質是兩種脂質的組合，特別是磷脂和固醇的組合。在具體的實施方案中，所述至少一種脂質是磷脂醯膽鹼和膽固醇的組合。

在第十八態樣的實施方案中，在步驟a)中，在有機溶劑中溶解兩種或更多種脂質。在具體實施方案中，在有機溶劑中溶解脂質磷脂醯膽鹼和膽固醇。特別地，脂質和有機溶劑之間的比例為3：1。

在進一步的實施方案中，溶劑中的脂質的總濃度為0.02-0.4g/ml，即0.02g/ml，0.03g/ml，0.04g/ml，0.05g/ml，0.06g/ml，0.07g/ml，0.08g/ml，0.09g/ml，0.10g/ml，0.11g/ml，0.12g/ml，0.13g/ml，0.14g/ml，0.15g/ml，0.16g/ml，0.17g/ml，0.18g/ml，0.19g/ml，0.2g/ml，0.21g/ml，0.22g/ml，0.23g/ml，0.24g/ml，0.25g/ml，0.26g/ml，0.27g/ml，0.28g/ml，0.29g/ml，0.30g/ml，0.31g/ml，0.32g/ml，0.33g/ml，0.34g/ml，0.35g/ml，0.36g/ml，0.37g/ml，0.38g/ml，0.39g/ml，或0.4g/ml。在具體的實施方案中，溶劑中的脂質的總濃度為0.03-0.3g/ml，0.03-0.1g/ml，0.03-0.05g/ml。在具體的實施方案中，溶劑中的脂質的總濃度為0.033g/ml。

在第十八個態樣的進一步的實施方案中，除了步驟a)中的至少一種脂質外，在有機溶劑中溶解疏水性抗壞血酸酯。在具體的實施方案中，疏水性抗壞血酸酯是抗壞血酸棕櫚酸酯。

在第十八態樣的其它實施方案中，在步驟b)中，以1-10ml/min的速度，即1，2，3，4，5，6，7，8，9或10ml/min的速度注射a)的混合物。在具體實施方案中，以5ml/min的速度注射混合物。

在第十七態樣的進一步的實施方案中，水相以500-3000ml/min，即500，600，700，800，900，1000，1100，1200，1300，1400，1500，1600，1700，1800，1900，2000，2100，2200，2300，2400，2500，2600，2700，2800，2900，或3000ml/min的速度循環。在具體實施方案中，水相以1000-2500，1500-2500，或2000-2500ml/min的速度循環。在具體實施方案中，水相以2200ml/min的速度循環。

在具體實施方案中，通過剪切誘導裝置循環水相。在實施方案中，剪切引發裝置是靜態混合器或正常攪拌器。特別地，剪切誘導裝置是靜態混合器。

在進一步的實施方案中，靜態混合器具有10-15mm，即10，11，12，13，14，或15mm的內徑。在具體實施方案中，靜態混合器具有12-13mm，即12.0，12.1，12.2，12.3，12.4，12.5，12.6，12.7，12.8，12.9，或13.0mm的內徑。在實施方案中，靜態混合器適合於混合150-300ml，即150，160，170，180，190，200，210，220，230，240，250，260，270，280，290，或300ml最終體積的脂質體配製劑。特別地，靜態混合器適合於混合170-300ml的最終體積，特別是200-250ml的最終體積的脂質體配製劑。因而，在具體實施方案中，靜態混合器的內徑與混合脂質體配製劑的體積之間的比率是每15ml脂質體配製劑的內徑為0.7mm-1mm，即0.7，0.8，0.9或1.0mm。

在具體實施方案中，在步驟b)中，在剪切誘導裝置的前面注射a)的混合物。在具體實施方案中，在靜態混合器的前面注射a)的混合物。

在進一步的實施方案中，步驟d)中混合的CD-RAP的組合物包含1-10mg/ml CD-RAP，即1，2，3，4，5，6，7，8，9或10mg/ml CD-RAP。在具體實施方案中，組合物包含2-9，3-8，4-8，5-8或6-8mg/ml CD-RAP。在具體實施方案中，組合物包含7mg/ml CD-RAP。在進一步的實施方案中，在步驟d)中混合的CD-RAP包含在如上文詳細描述的精胺酸磷酸鹽緩衝劑或精胺酸檸檬酸鹽緩衝劑中。

在第十八態樣的實施方案中，所述方法還包括步驟e)冷凍乾燥所述脂質體配製劑。

在第十八態樣的實施方案中，所述方法包括步驟f)在精胺酸磷酸鹽緩衝劑或精胺酸檸檬酸鹽緩衝劑中重建冷凍乾燥的脂質體配製劑。在實施方案中，通過一次添加和混合完全重建體積的精胺酸磷酸鹽緩衝劑或精胺酸檸檬酸鹽緩衝劑，在單個步驟中重新開始冷凍乾燥的脂質體配製劑。在實施方案中，冷凍乾燥的脂質體配製劑在兩個或更多個後續步驟中重新開始，通過在兩個或更多個後續步驟中，即在第一步驟中添加完全重建體積的精胺酸磷酸鹽緩衝劑或精胺酸檸檬酸鹽緩衝劑的部分的精胺酸磷酸鹽緩衝劑或精胺酸檸檬酸鹽緩衝劑的完全重建體積的體積，並且在第二步驟中，精胺酸磷酸鹽緩衝劑或精胺酸檸檬酸鹽緩衝劑的完全重建體積的後半部分可以添加並混合。在實施方案中，重新配製包括兩個步驟，其中在第一步驟中，可以添加並混合完全重建體積的精胺酸磷酸鹽緩衝劑或精胺酸檸檬酸鹽緩衝劑的三分之一體積，並且在第二步中，可以添加精胺酸磷酸鹽緩衝劑或精胺酸檸檬酸鹽緩衝劑的重建體積並混合。在實施方案中，重新配製包括三個步驟，其中在每個步驟中，可以添加並混合精胺酸磷酸鹽緩衝劑或精胺酸檸檬酸鹽緩衝劑的完全重建體積的三分之一。

在第十九態樣中，本發明提供了降低脂質體配製劑的多分散性的方法，其包括以下步驟：a)在有機溶劑中溶解至少一種脂質，b)將步驟a)的混合物注射到循環水相中，並且c)去除溶劑。

在第十九態樣的實施方案中，所述方法還包括步驟d)將通過步驟a-c)獲得的脂質體配製劑與包含CD-RAP的組合物混合。因此，預形成的脂質體摻加CD-RAP。

在第十九態樣的實施方案中，步驟a)的至少一種脂質選自由下列組成之群組：甘油酯，甘油磷脂，甘油膦基脂，甘油膦醯脂，硫脂，鞘脂，磷脂，異戊二烯醇脂，類固醇，硬脂，固醇和含有碳水化合物的脂質。在具體的實施方案中，至少一種脂質選自由下列組成之群組：磷脂酸(PA)，磷脂醯乙醇胺(PE)，磷脂醯膽鹼(PC)，磷脂醯絲胺酸(PS)和磷酸肌醇，如磷脂醯肌醇(PI)，磷脂醯肌醇磷酸(PIP)，磷脂醯肌醇二磷酸(PIP2)，磷脂醯肌醇三磷酸(PIP3)，心磷脂，溶血磷脂質和膽固醇。在具體的實施方案中，至少一種脂質是兩種脂質的組合，特別地磷脂醯膽鹼和膽固醇的組合。

在第十九態樣的實施方案中，在步驟a)中，在有機溶劑中溶解兩種或更多種脂質。在具體實施方案中，在有機溶劑中溶解脂質磷脂醯膽鹼和膽固醇。特別地，脂質和有機溶劑之間的比率為3：1。

在第十九態樣的進一步的實施方案中，除了步驟a)中的至少一種脂質之外，在有機溶劑中溶解疏水性抗壞血酸酯。在具體的實施方案中，疏水性抗壞血酸酯是抗壞血酸棕櫚酸酯。

在第十九態樣的其它實施方案中，在步驟b)中，以1-10ml/min的速度，即1，2，3，4，5，6，7，8，9或10ml/min的速度注射a)的混合物。在具體實施方案中，以5ml/min的速度注射混合物。

在第十九態樣的進一步的實施方案中，水相以500-3000 ml/min，即500，600，700，800，900，1000，1100，1200，1300，1400，1500，1600，1700，1800，1900，2000，2100，2200，2300，2400，2500，2600，2700，2800，2900，或3000ml/min的速度循環。在具體實施方案中，水相以1000-2500，1500-2500，或2000-2500ml/min的速度循環。在具體實施方案中，水相以2200ml/min的速度循環。

在具體實施方案中，通過剪切誘導裝置循環水相。在實施方案中，剪切引發裝置是靜態混合器或正常攪拌器。特別地，剪切誘導裝置是靜態混合器。在實施方案中，靜態混合器具有10-15mm，即10，11，12，13，14，或15mm的內徑。在具體實施方案中，靜態混合器具有12-13mm，即12.0，12.1，12.2，12.3，12.4，12.5，12.6，12.7，12.8，12.9，或13.0mm的內徑。在實施方案中，靜態混合器適合於混合150-300ml，即150，160，170，180，190，200，210，220，230，240，250，260，270，280，290，或300ml最終體積的脂質體配製劑。特別地，靜態混合器適合於混合170-300ml的最終體積，特別是200-250ml的最終體積的脂質體配製劑。因而，在具體實施方案中，靜態混合器的內徑與混合脂質體配製劑的體積之間的比率是每15ml脂質體配製劑的內徑為0.7mm-1mm，即0.7，0.8，0.9或1.0mm。在具體實施方案中，在步驟b)中，在剪切誘導裝置的前面注射a)的混合物。在具體實施方案中，在靜態混合器的前面注射a)的混合物。

在第十九態樣的實施方案中，方法還包括步驟e)冷凍乾燥脂質體配製劑。

在第十九態樣的實施方案中，方法包括步驟f)在精胺酸磷酸鹽緩衝劑或精胺酸檸檬酸鹽緩衝劑中重建冷凍乾燥的脂質體配製劑。在實施方案中，通過一次添加並混合精胺酸磷酸鹽緩衝劑或精胺酸檸檬酸鹽緩衝劑的完全重建體積在單個步驟中重建冷凍乾燥的脂質體配製劑。在實施方案中，通過在兩個或更多個後續步驟中添加精胺酸磷酸鹽緩衝劑或精胺酸檸檬酸鹽緩衝劑的完全重建體積的部分，在兩個或更多個後續步驟中重建冷凍乾燥的脂質體配製劑，即在第一步驟中可以添加並混合精胺酸磷酸鹽緩衝劑或精胺酸檸檬酸鹽緩衝劑的完全重建體積的一半體積，並且在第二步驟中可以添加並混合精胺酸磷酸鹽緩衝劑或精胺酸檸檬酸鹽緩衝劑的完全重建體積的第二個一半體積。在實施方案中，重建包括兩個步驟，其中在第一步驟中，可以添加並混合精胺酸磷酸鹽緩衝劑或精胺酸檸檬酸鹽緩衝劑的完全重建體積的三分之一的體積，並且在第二步驟中，可以添加並混合精胺酸磷酸鹽緩衝劑或精胺酸檸檬酸鹽緩衝劑的重建體積的三分之二。在實施方案中，重新配製包括三個步驟，其中在每個步驟中，可以添加並混合精胺酸磷酸鹽緩衝劑或精胺酸檸檬酸鹽緩衝劑的完全重建體積的三分之一。

特別地，本發明提供以下實施方案：

1.一種CD-RAP前驅蛋白，所述CD-RAP前驅蛋白包含：a)前序列，所述前序列在其C端包含切割位點，和b)CD-RAP(特別是根據SEQ ID NO：1或其變體)或其變體。

2.態樣1的前驅蛋白，其中所述前序列不幹擾CD-RAP的折疊，特別是其中在折疊之前不需要消除前序列。

3.態樣1或2的前驅蛋白，其中所述前序列改善CD-RAP的折疊。

4.前述態樣中任一項的前驅蛋白，其中所述前序列具有5-50個胺基酸，特別是7-33個胺基酸的長度。

5.前述態樣中任一項的前驅蛋白，其中所述前序列包含親和標簽，特別是多His標簽。

6.前述態樣中任一項的前驅蛋白，其中所述前序列比CD-RAP具有更低的親水性總平均值。

7.前述態樣中任一項的前驅蛋白，其中所述前驅蛋白具有根據Kyte和Doolittle的小於-0.03的親水性總平均值(GRAVY)，和/或其中所述前序列具有根據Kyte和Doolittle的小於-0.2的親水性總平均值(GRAVY)。

8.前述態樣中任一項的前驅蛋白，其中所述切割位點是酶切割位點，特別是內肽酶的切割位點，特別是腸激酶或混合親核體超家族A(PA族)蛋白酶的切割位點，特別是R或K胺基酸。

9.態樣8的前驅蛋白，其中所述內肽酶選自由下列組成之群組：半胱胺酸蛋白酶和絲胺酸蛋白酶，優選胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶，更優選胰蛋白酶。

10.前述態樣中任一項的前驅蛋白，其中所述前序列在其N端包含胺基酸MATTX1T，MATTX1TG，MATTX1TGN，MATTX1TGNS或MATTX1TGNSA，其中X1是L或S。

11.前述態樣中任一項的前驅蛋白，其中所述前序列在其N端包含胺基酸MATTST，MATTSTG，MATTSTGN，MATTSTGNS或MATTSTGNSA或其變體。

12.前述態樣中任一項的前驅蛋白，其中所述前序列包含或組成為選自由下列組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12,SEQ ID NO：13，SEQ ID NO： 14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19或其變體。

13.前述態樣中任一項的前驅蛋白，其中所述前驅蛋白包含或組成為根據SEQ ID NO：20的胺基酸序列或其變體。

14.編碼態樣1至13中任一項的前體CD-RAP蛋白的核酸。

15.包含態樣14的核酸的載體。

16.一種宿主細胞，其包含態樣1至13中任一項的前體CD-RAP蛋白，態樣14的核酸或態樣15的載體。

17.態樣16的宿主細胞，其中所述宿主細胞是原核或真核細胞。

18.態樣16的宿主細胞，其中所述宿主細胞是細菌細胞，特別是大腸桿菌細胞。

19.一種製造天然CD-RAP的方法，其包括以下步驟a)提供態樣1至13中任一項的CD-RAP前驅蛋白，並且b)去除所述前序列以獲得天然CD-RAP。

20.根據態樣19的方法，還包括以下步驟中的一個或多個：c)折疊CD-RAP前驅蛋白，並任選純化折疊的CD-RAP，並且d)純化天然CD-RAP。

21.態樣19或20的方法，其中步驟a)中提供的CD-RAP前驅蛋白以其一級，二級或三級構象存在。

22.態樣19至21的方法，其中在步驟b)中去除所述前序列之前或之後，特別是在步驟b)中去除所述前序列之前，在步驟c)中折疊CD-RAP。

23.態樣19至22的方法，其中在步驟a)中經由生物技術手段提供所述前體CD-RAP，特別是從態樣17-19的宿主細胞中。

24.態樣19至23中任一項的方法，其中在步驟b)中，經由酶切割，特別是經由腸激酶切割或經由內肽酶切割，特別是經由胰蛋白酶切割去除所述前序列。

25.態樣24的方法，其中所述蛋白水解酶，特別是胰蛋白酶和所述前體CD-RAP蛋白之間的比率為每mg蛋白質的0.5-1.5個酶單位。

26.態樣19至27中任一項的方法，其中將步驟b)實施0.5-20小時，特別是0.5-16小時，特別是4-7小時。

27.態樣19至26中任一項的方法，其中在7和9之間，特別是8和8.5之間，特別是8.3的pH實施步驟b)。

28.態樣19至27中任一項的方法，其中在5-40℃，特別是在20-25℃的溫度實施步驟b)。

29.根據態樣20至29中任一項所述的方法，其中在步驟a)之後且步驟b)之前實施步驟c)。

30.根據態樣19至29中任一項所述的方法，其中步驟c)包括以下步驟：(i)在變性緩衝劑中溫育所述前體CD-RAP蛋白，並且(ii)將步驟(i)中獲得的溶液添加到折疊緩衝劑。

31.態樣30的方法，其中所述變性緩衝劑包含DTT，特別是以10mM的濃度。

32.態樣30或31的方法，其中所述折疊緩衝劑包含精胺酸，特別是濃度為0.5-1mol/L，特別是0.75mol/L。

33.態樣30至32中任一項的方法，其中將步驟(i)中獲得的溶液逐滴添加到折疊緩衝劑中，特別是在1-3小時的時間範圍裡。

34.態樣30至32中任一項的方法，其中以每小時折疊緩衝劑的0.5-2體積%，特別是1.5體積%的比率添加步驟(i)中獲得的溶液。

35.態樣30至34中任一項的方法，其中在5和25℃之間，特別是10℃的溫度實施所述折疊步驟c)。

36.態樣30至35中任一項的方法，其中經由層析，特別是經由HIC層析或多峰(MM)層析純化所述折疊的前體CD-RAP。

37.態樣30至36中任一項的方法，其中經由層析，特別是經由離子交換層析和/或HIC層析純化所述天然CD-RAP。

38.一種CD-RAP蛋白製劑，其包含具有長度為107個胺基酸的SEQ ID NO：1的成熟CD-RAP序列的CD-RAP蛋白，其中所述CD-RAP(107AA)與存在於所述CD-RAP蛋白製劑中的任何其它CD-RAP蛋白的比率99wt-%。

39.一種CD-RAP蛋白製劑，其包含具有長度為107個胺基酸的SEQ ID NO：1的成熟CD-RAP序列的CD-RAP(107AA)蛋白，所述製劑不含CD-RAP(105AA)，其具有長度為105個胺基酸的SEQ ID NO：21的CD-RAP序列。

40.請求項38或38的CD-RAP蛋白製劑，其中所述CD-RAP蛋白具有40℃的熔解溫度。

41.一種組合物，其包含CD-RAP或其變體，或根據態樣38-41中任一項的CD-RAP蛋白製劑，和至少一種帶正電荷的胺基酸和緩衝劑。

42.態樣41的組合物，其中所述至少一種帶正電荷的胺基酸防止CD-RAP的聚集。

43.態樣41或42的組合物，其中所述至少一種帶正電荷的胺基酸選自由下列組成之群組：精胺酸，賴胺酸，組胺酸和脯胺酸。

44.態樣41至43中任一項的組合物，其中所述緩衝劑防止CD-RAP的降解。

45.態樣41至44中任一項的組合物，其中所述緩衝劑選自由下列組成之群組：檸檬酸鹽緩衝劑，磷酸鹽緩衝劑，組胺酸緩衝劑和Tris緩衝劑。

46.態樣41至44中任一項的組合物，還包含糖或胺基糖。

47.態樣46的組合物，其中所述糖是單糖，二糖或三糖，特別是蔗糖，麥芽糖，海藻糖或棉子糖。

48.態樣46的組合物，其中所述胺基糖是葡糖胺，N-甲基-葡糖胺，半乳糖胺或神經胺酸。

49.態樣41至48中任一項的組合物，其中所述組合物不包含抗壞血酸和/或不包含甘胺酸。

50.態樣41至49中任一項的組合物，其中所述組合物包含濃度為50-500mM，特別是100-350mM，特別是100-200mM，更特別是200mM的精胺酸。

51.態樣41至50中任一項的組合物，其中所述組合物包含濃度為5-100mM，特別是10-50mM，特別是20-50mM，更特別是50mM的組胺酸。

52.態樣41至51中任一項的組合物，其中所述組合物包含濃度為5-100mM，特別是10-50mM，特別是20-50mM，更特別是20mM的磷酸鈉。

53.態樣41至52中任一項的組合物，其中所述組合物包含濃度為5-100mM，特別是10-50mM，特別是20-50mM，更特別是20mM的磷酸二氫鈉。

54.態樣41至53中任一項的組合物，其中所述組合物包含濃度為5-100mM，特別是10-50mM，特別是20-50mM，更特別是20mM的檸檬酸鹽。

55.態樣41至54中任一項的組合物，其中所述組合物包含濃度為5-100mM，特別是10-50mM，特別是20-50mM，更特別是45mM的蔗糖。

56.態樣41至55中任一項的組合物，其中所述組合物還包含帶負電荷的胺基酸，優選選自由下列組成之群組：谷胺酸和天冬胺酸。

57.態樣56的組合物，其中組合包含50-500mM，特別是100-350mM，特別是100-200mM，更特別是200mM的精胺酸和谷胺酸的總濃度。

58.態樣56或57的組合物，其中所述組合物包含比率1：1，特別是1：1,25，特別是1：1.5，更特別是1：2的精胺酸和谷胺酸的組合。

59.態樣41至58中任一項的組合物，其中所述組合物的pH值在5.5和8.0之間，特別是在6.0和7.5之間，特別是6.0-6.5，更特別是6。

60.態樣59的組合物，其中使用磷酸或氯化氫，特別是磷酸調節所述組合物的pH值。

61.態樣41至60中任一項的組合物，其中CD-RAP或其變體的濃度為1-10mg/ml，特別是2-5mg/ml。

62.態樣41至61中任一項的組合物，其中所述組合物包含2mg/ml CD-RAP或其變體，20mM檸檬酸鹽，200mM精胺酸，並且具有pH值6。

63.態樣41至62中任一項的組合物，其用於在治療和/或預防患者中的軟骨疾病或損傷的方法中使用，所述患者患有聚集蛋白聚糖降解和/或水流入軟骨的增加和/或減少的CD-RAP表現，

64.態樣41至60中任一項的組合物，其用於靜脈內和/或關節內施用。

65.一種製造態樣41至64中任一態樣的組合物的方法，包括將CD-RAP或其變體添加到包含至少一種帶正電荷的胺基酸的緩衝液。

66.一種貯存CD-RAP的方法，包括在包含至少一種帶正電荷的胺基酸的緩衝劑中保持CD-RAP。

67.態樣66的方法，其中在-80℃至40℃，特別是-20℃至25℃，特別是-20℃至5℃的溫度貯存CD-RAP。

68.態樣66或67的方法，其中將CD-RAP貯存多至6個月，特別是多至3個月，特別是多至1個月的時間段。

69.一種包含態樣41至64中任一項的組合物的藥物。

70.一種包含含有囊封的CD-RAP或其變體的脂質體的組合物，其中所述脂質體的大小低於200nm，特別是低於150nm，特別是低於120nm，特別是低於100nm。

71.態樣70的組合物，其中在脂質體中囊封總CD-RAP的超過20%，特別是至少30%，特別是至少40%，特別是40%-80%。

72.態樣70至71中任一項的組合物，其中CD-RAP與脂質體的比率為1：0.5，1：0,6，1：0,7，1：0,8，1：0,9，1：1，1：1,1，1：1.2，1：1,3，1：1,4，1：1,5。

73.態樣70至72中任一項的組合物，其中所述脂質體的多分散性指數(PDI)低於0.3，特別是低於0.2，特別是低於0.15，特別是0.132。

74.態樣70-73中任一項的組合物，其中所述CD-RAP和脂質體存在於含有至少一種帶正電荷的胺基酸的磷酸鹽緩衝劑或檸檬酸鹽緩衝劑中。

75.態樣74的組合物，其中所述至少一種帶正電荷的胺基酸選自由下列組成之群組：精胺酸，組胺酸和賴胺酸。

76.態樣75的組合物，其中組胺酸以50-500mM，特別是100-400mM，特別是20mM的量存在。

77.態樣74至76中任一項的組合物，其中所述檸檬酸鹽緩衝液中的檸檬酸鹽的量為10-100mM，特別是10-50mM，特別是20mM。

78.態樣70至77中任一項的組合物，其中所述脂質體由選自由下列組成之群組的脂質組成：甘油酯，甘油磷脂，甘油膦基脂，甘油膦醯脂，硫脂，鞘脂，磷脂，異戊二烯醇脂，類固醇，硬脂，固醇和含有碳水化合物的脂質，特別是磷脂醯膽鹼和膽固醇。

79.態樣78的組合物，其中所述脂質磷脂醯膽鹼和膽固醇以74.8：25.1的比率存在。

80.態樣78或79的組合物，其中所述脂質體還包含疏水性抗壞血酸酯，特別是抗壞血酸棕櫚酸酯。

81.態樣78至80中任一項的組合物，其中所述抗壞血酸酯以與磷脂和固醇的量的0.1：99.9的比率存在。

82.態樣70至81中任一項的組合物，其用於在治療和/或預防患者中的軟骨疾病或損傷的方法中使用，所述患者患有聚集蛋白聚糖降解和/或水流入軟骨的增加和/或減少的CD-RAP表現。

83.態樣70至82中任一項的組合物，用於關節內施用。

84.一種藥物，其包含態樣70至83中任一項的組合物。

85.一種製造脂質體配製劑的方法，包括以下步驟：a)在有機溶劑中溶解至少一種脂質，b)將步驟a)的混合物注射到循環水相中，並且c)去除所述溶劑。

86.態樣85的方法，其還包括步驟d)將通過步驟a-c)獲得的脂質體配製劑與包含CD-RAP的組合物混合。從而，預形成的脂質體摻加CD-RAP。

87.態樣85或86的方法，其中所述有機溶劑是3類溶劑，優選選自由下列組成之群組：乙酸，丙酮，苯甲醚，1-丁醇，2-丁醇，乙酸丁酯，叔丁基甲基醚，枯烯，二甲亞碸，乙醇，乙酸乙酯，乙醚甲酸乙酯，甲酸，庚烷，乙酸異丁酯，乙酸異丙酯，乙酸甲酯，3-甲基-1-丁醇，甲基乙基酮，甲基異丁基酮，2-甲基-1-丙醇，戊烷，1-戊醇，1-丙醇，2-丙醇，乙酸丙酯，更優選1-丙醇。

88.態樣85至87中任一項的方法，其中所述至少一種脂質選自：甘油酯，甘油磷脂，甘油膦基脂，甘油膦醯脂，硫脂，鞘脂，磷脂，異戊二烯醇脂，類固醇，硬脂，固醇和含有碳水化合物的脂質，特別是磷脂醯膽鹼和膽固醇。

89.態樣85至88中任一項的方法，其中在步驟a)中，在有機溶劑中溶解兩種或更多種脂質。

90.態樣89的方法，其中在所述有機溶劑中溶解所述脂質磷脂醯膽鹼和膽固醇，特別是以3：1的比率。

91.態樣85至90中任一項的方法，其中所述溶劑中脂質的總濃度為0.02至0.4g/ml，特別是0.03至0.3g/ml，特別是0.033g/ml。

92.態樣85至91中任一項的方法，其中除了步驟a)中的所述至少一種脂質之外，在所述有機溶劑中溶解疏水性抗壞血酸酯，特別是棕櫚酸抗壞血酸酯。

93.態樣92的方法，其中所述抗壞血酸酯以與所述至少一種脂質的0.1：99.9的比率存在。

94.態樣85至93中任一項的方法，其中在步驟b)中，以1-10ml/min，特別是5ml/min的速度注射a)的混合物。

95.態樣85至94中任一項的方法，其中以500-3000ml/min，特別是1000-2500，特別是2200ml/min的速度循環所述水相。

96.態樣85至95中任一項的方法，其中通過剪切誘導裝置，特別是靜態混合器(特別是具有10-15cm，特別是12.6cm的直徑)循環水相。

97.態樣85至96中任一項的方法，其中在步驟b)中，在剪切誘導裝置的前面，特別是在靜態混合器的前面注射a)的混合物。

98.態樣85至97中任一項的方法，其中在步驟c)中使用過濾，特別是使用切向流過濾去除所述溶劑。

99.態樣85至98中任一項的方法，其中步驟d)中混合的CD-RAP的組合物包含1-10mg/ml CD-RAP，特別是7mg/ml，特別是在精胺酸磷酸鹽緩衝劑或精胺酸檸檬酸鹽緩衝劑中。

100.態樣99的方法，其中所述脂質體配製劑和CD-RAP之間的比率為1.2：1。

101.態樣85至100中任一項的方法，還包括步驟e)冷凍乾燥所述脂質體配製劑。

102.態樣101的方法，還包括步驟f)在精胺酸磷酸鹽緩衝劑或精胺酸檸檬酸鹽緩衝劑中重建在所述冷凍乾燥的脂質體配製劑。

103.通過態樣85-102中任一項的方法可製造的脂質體配製劑。

104.一種貯存CD-RAP的方法，包括在如態樣70至83中任一項中規定的脂質體組合物中保持CD-RAP。

105.態樣104的方法，其中在-80℃至40℃，特別是-20℃至25℃，特別是5℃的溫度貯存CD-RAP。

106.態樣104或105的方法，其中將CD-RAP貯存多至6個月，特別是多至3個月，特別是多至1個月的時間段。

107.一種降低脂質體配製劑中的脂質體大小的方法，包括以下步驟：a)在有機溶劑中溶解至少一種脂質，b)將步驟a)的混合物注射到循環水相中，並且c)去除溶劑。

108.一種降低脂質體配製劑的多分散性的方法，包括以下步驟：a)在有機溶劑中溶解至少一種脂質，b)將步驟a)的混合物注射到循環水相中，並且c)去除溶劑。

在實施例和附圖中更詳細地描述本發明，所述實施例和附圖不應理解為限制本發明的範圍。

【實施例】

實施例1：CD-RAP前驅蛋白的製造和分離

設計了包含前序列的軟骨衍生的視黃酸蛋白CD-RAP的以下構建體：

a)表現

使用大腸桿菌菌株類型BL21，其包含pET-52b-II質粒，該pET-52b-II質粒包含編碼上文規定的CD-RAP前驅蛋白(即包含相應的前序列和根據SEQ ID NO：1的CD-RAP的序列)的核苷酸序列和氨苄青黴素抗性。在LB中在預培養物中和在具有基本培養基的發酵罐中在葡萄糖補料的主要培養物中在37℃，pH 7.0培養菌株。

b)前CD-RAP的裂解，溶解和捕獲

收穫細胞，並通過弗氏壓碎器(french press)裂解兩次，用水將包含體內包含融合蛋白的裂解物清洗兩次，並離心。

對於變性，將28.5g的約27g/L融合蛋白放入燒杯中，然後添加6M Gua-HCl，2mM EDTA，10mM DTT，50mM Tris/HCl(pH 8.3)的混合物。在環境溫度將它攪拌2小時。溶液是深褐色且稍微混濁的。

c)前CD-RAP的折疊

對於重折疊步驟，製備0.75M精胺酸，1mM EDTA，1mM還原性谷胱甘肽(glutathione red.)，0.5mM氧化性谷胱甘肽(glutathione oxid)的混合物，pH8.3。將具有變性的前-CD-RAP的溶液緩慢倒入此混合物中，然後將其在環境溫度攪拌16小時。獲得0.61g/L的折疊前-CD-RAP。

d)捕獲前CD-RAP

添加硫酸銨，直至獲得80mS/cm的電導率。實施深層過濾和0.2μm過濾。用疏水相互作用層析完成捕獲步驟自身。柱具有2.6cm的直徑，並且用吸附劑Toyopearl Butyl 650(Tosoh公司)填充到高度26cm。將0.90L的過濾溶液應用到到柱上。平衡緩衝劑是具有50mM NaHPO₄/0.5M NH₄SO₄的水，pH 7.0，並且洗脫緩衝劑是含有50mM NaHPO₄的水，pH 7.0。在級分中收集洗脫體積。合併含有前CD-RAP的級分，此合併物的體積為0.35L。其中前-CD-RAP的濃度為0.70g/L。捕獲層析後的收率為47%。

e)去除前序列

在HI-層析的洗脫液(乙酸鈉，pH 4.5)中發生酶切割，所述洗脫液通過NaOH調節至pH 8.3。對於切割，使用在大腸桿菌中重組製備的內切蛋白酶胰蛋白酶(豬胰蛋白酶)。在來自捕獲層析的洗脫液(其中溶解有前-CD-RAPAP)中實施切割，所述洗脫液的pH用氫氧化鈉升至8.3。將164μL的胰蛋白酶溶液添加到溶液，目標是每mg蛋白質採用1個單位的酶。將溶液在環境溫度攪拌16小時。

通過HPLC-層析法評估切割，其顯示相對於CD-RAP的分開的峰(參見圖2)。

根據前序列的長度，獲得天然CD-RAP的不同總體濃度，因為從包含更長前序列的CD-RAP構建體獲得更高的收率(參見圖3和4)。

實施例2：切割參數

為了找到用於切割前體CD-RAP的最佳參數集，研究了以下參數：

a)酶濃度

為了研究切割對胰蛋白酶濃度的依賴性，進行試驗以監測在不同胰蛋白酶濃度的切割。

使用441.8mg/L的已知前-CD-RAP濃度，通過NaOH設定為pH 4.1至8.3。然後，將溶液分成10個部分，將其在環境溫度(23-25℃)搖動。向每個部分添加不同量的胰蛋白酶(50，100，150，200，250，300，400，600，1000，或2000u/L)，並採集樣品以通過HPLC監測切割。結果示於圖5中。

b)pH值

使用250個單位/mL的胰蛋白酶濃度(以9615個單位/mL胰蛋白酶溶液的初始活性值計算)和0,24g/mL的前-CD-RAP含量研究pH值對切割的影響。採取通過HCl和NaOH設置為pH 3，4，5，6，7，8，9，10和11的此溶液的9個部分。在Falcon管中在25℃攪拌切割。在不同的時間間隔中，採集樣品以通過HPLC進行研究。圖6的圖顯示不同pH值的前CD-RAP含量(以HPLC峰的面積表示)的減少。可以觀察到，切割在pH 5或更低不運行，在pH 6時，它發生但是緩慢發生。在pH 8.3和更高時，切割是快速的，但是在具有最大值後CD-RAP的量下降，這可能是由胰蛋白酶得到的CD-RAP消化物，現在可能通過暴露胰蛋白酶切割位點，其在較低的pH值隱藏在蛋白質的空間結構內。結論是，切割步驟的pH在7和8之間是理想的。當切割應在較短時間發生時，優選約8.0至8.3的pH，但是在此種情況下應當注意，在10小時內去除胰蛋白酶，否則CD-RAP的消化物是可能的。當應當在較長的時間段中發生切割時，優選pH值7.0和在20小時後去除胰蛋白酶。

c)溫度

測試溫度對胰蛋白酶切割的影響。使用相同的前CD-RAP溶液，並且應用每mL溶液1.25個單位的胰蛋白酶。唯一的變化是溫度；將其以5℃的步驟從5℃變為40℃。在具有可調節溫度的搖動器中的2.0mL管中實施試驗。通過HPLC在不同的時間間隔中監測切割的進展。結果如下圖所示。圖7顯示HPLC-層析圖中前-CD-RAP峰面積的降低。在每個溫度發生降低(但是這也可以由其它原因，如沉澱引起)。此種降低在較高溫度時較快。在較高的溫度，發現在約24小時後前CD-RAP的完全消失，而在較低的溫度，前CD-RAP的某種殘留物似乎在時間加倍後仍然持續。一般來說，似乎在應用的條件下，收率在較低溫度下較高，但是到達那裡花費長得多。來自數據的結果是20-25℃的切割溫度似乎是良好的工作範圍。

實施例3：不同CD-RAP構建體的穩定性

對不同rhCD-RAP構建體就其熱穩定性和應激穩定性而言進行物理化學表徵，所述構建體在它們的一級序列以及其配製劑中不同。

為了區分不同rhCD-RAP構建體的效果，進行通過差示掃描熒光測定法(DSF)的熔點測定，其中在SYPRO Orange存在下，在蛋白質的變性過程中記錄熒光強度對溫度。經由蛋白質的解折疊，疏水斑被暴露，並且與它們結合的染料分子發射610nm的強熒光。通過HEX通道監測蛋白解折疊的程度，所述HEX通道捕獲Sypro Orange-解折疊的蛋白複合物的光譜性質(激發515-535nm，發射560-580nm)。

將不同rhCD-RAP構建體的樣品過夜透析到2個緩衝劑系統(透析室：D-tube Dialyzer Midi，來自Novagen的MWCO 6-8kDa，No.71507-3)中，並且通過用相應的緩衝劑稀釋將濃度固定於1.0mg/mL。

緩衝劑製備：

350mM L-精胺酸磷酸鹽，pH7.5

在約1.8L水中稀釋121.94g L-精胺酸，用85%磷酸將pH調節至pH7.5，並用純水填充至終體積為2L。

200mM L-精胺酸，50mM NaH ₂ PO ₄ ，pH 7.5

在約1.8L水中稀釋69.68g L-精胺酸和15.60g NaH₂PO₄ x 2 H₂O，用85%磷酸調節pH至pH7.5，並用純水填充至終體積為2L。

將每種緩衝劑與Sypro Orange染料(2μL染料+48μL緩衝劑=200x Sypro Orange)混合。將每個rhCD-RAP樣品(1.0mg/mL rhCD-RAP)稀釋至終濃度為0.5mg/mL和0.1mg/mL，每種有三個重組(具有10xSypro Orange濃度)。

測量所有樣品一次，每種有三個重複。使用實時PCR檢測系統CFX96 Touch(Bio-Rad)，在25℃至95℃的熱梯度中以1℃的增量和30秒保持間隔溫育蛋白質。通過HEX通道監測蛋白質解折疊的程度，所述HEX通道捕獲Sypro Orange-解折疊的蛋白複合物的光譜性質(激發515-535nm，發射560-580nm)。通過CFX Manager軟件分析數據，並使用一階導數光譜確定熔解溫度。

令人驚訝的是，在產物CMC-B-0052中檢測到53℃的顯著較低的熔融溫度，而其它測試的rhCD-RAP批次(F-MPL.120004.001和G25-Q131 #003)顯示出具有54℃-56℃的較高熔點。在2種不同配製劑中證明3℃的此種差異。下文在表2和圖8中顯示了結果。

實施例4：製備5種具有5mg/ml的CD-RAP濃度的配製劑。分析中包括非配製的非濃縮的CD-RAP作為參照(配製劑0)。可以在表3中找到配製劑的組成的概述。

製備的緩衝劑列於表4中。如下製備每種緩衝劑：

- 將60ml正確的緩衝液倒入100ml玻璃瓶或燒杯中

- 若適用的話，添加需要體積的Arg/Glu溶液(參見表4)

- 若適用的話，添加需要量的精胺酸HCl(粉末，參見表4)

- 若適用的話，添加需要量的蔗糖(粉末，參見表4)

- 將pH調節至目標值+/- 0.1

注意：在所有情況下，用1M NaOH調節pH。

- 將溶液轉移至容量瓶中，用正確的緩衝劑完成體積，測量最終pH。在0.2μm濾器上過濾緩衝劑。

通過使用Amicon 4管(3kDa MW截留)的過濾-離心進行緩衝劑交換。將CD-RAP藥物物質(2ml)轉移到預稱重的管中，並且添加等體積的合適緩衝劑。將管離心(4000g，15℃)，並且通過稱量滲透物和滲餘物監測清洗過程。進行四個清洗循環。在最後一次離心期間，進行輕微濃縮(約10%)以獲得5mg/ml CDRAP(用於此輪的批次F-AKO-120018A的校正含量為4.7mg/ml)。在緩衝劑交換後，將樣品的部分等分取樣2R玻璃管形瓶中用於應激測試，而在5℃貯存剩餘物，期間等待t=0分析。

使用方法2-3；5-9(表5)分析T=0樣品。在製劑製備後48小時內進行t=0分析。在40℃將所有配製劑(包括參照配製劑)應激7天。這通過將管形瓶放置在穩定性櫥櫃中完成。此外，通過冷凍/融化應激配製劑。這通過在-20℃貯存管形瓶完成。24小時後，將管形瓶在環境溫度融化1小時，然後再次冷凍24小時。以此方式進行五個冷凍-融化循環。冷凍-融化後，在5℃貯存管形瓶，期間等待分析。用方法2-3；5-7(表5)一起分析所有應激的樣品(即在完成這兩個應激測試後)。在應激測試結束後48小時內進行所有分析。

在T=0時測量配製劑的pH和滲透壓。結果示於圖9。可以看出，配製劑和特別地配製劑2和3的pH高於目標pH 6.5(分別為6.7，7.1和7.0)。這指示20mM的緩衝液濃度可能太低，以至於不能在具有鹼性性質(pKa 9.3-10.3)的蛋白質存在下將pH維持於 6.5。在檸檬酸鹽和組胺酸緩衝劑的情況下，pH 6.5在這些緩衝劑的緩衝劑能力範圍的邊緣。因此，如果選擇這些緩衝劑，那麼配製劑的pH的降低可以是有益的。例如，在pH6.0，檸檬酸鹽和組胺酸的緩衝劑能力可能會足以使緩衝劑濃度保持於20mM。

大多數製備的配製劑是高滲的，除了含有Arg/Glu混合物的配製劑4外。有趣的是，通過SCIL製備的參照製劑也是高滲的。如預期的，對配製劑添加蔗糖對滲透壓具有顯著的影響(配製劑5)。鑒於在配製劑2和3中沒有獲得目標pH，將在第2輪中重複這些配製劑(如果基於獲得的其它結果判斷為相關)。在製備第1輪配製劑中不考慮配製劑的滲透壓，因為此輪的目的主要是評估不同賦形劑對CD-RAP穩定性的影響。

圖10中呈現了配製劑的外觀。在T=0時，所有配製劑是澄清且無色的。在7天的熱應激後，所有配製劑都是混濁的，配製劑4是最混濁的。在所有制劑中，糰粒隨時間在管形瓶的底部下沉，指示其以大的不溶性蛋白質聚集體為主。還觀察到含有蔗糖的配製劑5具有略黃的顏色。在5次冷凍-融化循環後，與T=0相比，配製劑具有相似的外觀。

圖11中呈現了通過RP-HPLC獲得的結果及主峰的CD-RAP。

在過程期間發生10-15%的蛋白質損失。這可以已經由CD-RAP對Amicon管的膜的吸附，或由滲透物(即流過膜孔)中蛋白質的損失引起。不同配製劑的含量是相當的(3.4-3.8mg/ml)，指示蛋白質損失與配製劑的組成或其pH沒有關聯。

當查看對在40℃應激7天的樣品獲得的結果時，可以看出配製劑的性能可以如下評級(從最好到最差)：配製劑0=2>1=3>4=5。因此，檸檬酸鹽緩衝劑中的配製劑2與參照配製劑0一樣好地運行。與T=0相比，分別含有Arg/Glu和蔗糖的配製劑4和5在應激後具有最低的CD-RAP主峰回收。配製劑5在熱應激後具有到目前為止最低的CD-RAP純度(圖11中的11.6%)。

在冷凍-融化應激後，可以觀察到變化，儘管它們不如熱應激後觀察到的那樣明顯。配製劑的性能可以如下評級(從最好到最差)：3>1=2=4=5<0。總之，結果指示配製劑0(參照)是最差的，並且其它配製劑通常是等同的。因此，磷酸鈉緩衝劑在冷凍-解凍應激時顯示最差的性能，並且可以看出作為緩衝劑濃度的函數的趨勢(含有20mM磷酸鈉的配製劑1表現得好於含有50mM此緩衝劑的配製劑0)。這可能是由於此緩衝劑在冷凍時發生的pH轉變。通過對空白中不存在的層析圖中的所有峰進行積分，獲得應激後回收的總蛋白質含量(圖11的最後3欄)。因此，在應激後獲得的回收代表未通過HPLC柱從樣品中濾出的材料。可以看出，在熱應激後，總CD-RAP含量在50和72%之間變化，配製劑4有明顯的例外，其中僅回收了20%的材料。這與澄清度結果一致，這顯示了在該製劑中出現更多的糰粒。冷凍-融化應激後獲得的CD-RAP的總量比熱應激後高得多，並且與在T=0時測量的總量相當。這是預期的，因為在這些樣品中沒有觀察到糰粒。一個例外是參照配製劑，其顯示冷凍-融化應激後的總回收率80%。由於在此樣品中沒有觀察到糰粒，這可以通過形成可溶性聚集體解釋。

實施例5：

基於第1輪中獲得的結果，在5mg/ml的目標CD-RAP濃度製備6種配製劑。此外，包括兩種對照配製劑：非配製的，非濃縮的DS(如在第1輪中一樣，配製劑0a)，以及非配製的，非濃縮的DS，其經歷緩衝劑交換過程(配製劑0b)。可以在表6中找到配製劑的組成的概述。

在第二輪中研究了以下因素：

˙在50mM，pH 6.5的緩衝劑類型(磷酸鈉對磷酸鉀對檸檬酸鹽對組胺酸)的影響

˙抗氧化劑(抗壞血酸)的影響

與第1輪相比，將緩衝劑濃度增加至50mM。這樣做是為了改善配製劑的緩衝能力。所有制備的配製劑的pH設定為6.5，因為在Sanofi獲得的新數據指示CD-RAP蛋白在酸性pH下更穩定。將穩定劑濃度(精胺酸)保持在200mM。在此輪中，在所有配製劑中使用精胺酸鹼。

對於第2輪，與第1輪相比不同地製備緩衝劑。在第1輪中，首先在沒有任何額外的賦形劑的情況下製備磷酸鈉和組胺酸緩衝劑，並且用HCl或磷酸調節其pH。然後，添加其它賦形劑(精胺酸HCl，Arg/Glu，蔗糖)，並再次用1N NaOH調節pH至目標pH。在第2輪中，在添加賦形劑之前用緩衝劑鹽調節緩衝劑的pH。這導致僅使用強酸的一個pH調節步驟，其在添加賦形劑後結束時進行。預期以此種方式製備緩衝劑將對配製劑的滲透壓具有有益的影響，其在第1輪中相當高。更具體地，第2輪的緩衝劑如下製備：

˙對於磷酸鉀緩衝劑，製備KH2PO4鹽溶液。用KH2PO4溶液滴定此溶液，直至達到pH 6.5。取出限定體積的緩衝溶液，並添加精胺酸(鹼)和抗壞血酸(若適用的話)。用磷酸將pH調節回到6.5。然後，將緩衝劑轉移至容量瓶中，並用水完成體積。

˙對於檸檬酸鹽緩衝劑，製備檸檬酸溶液。用1M氫氧化鈉溶液滴定此溶液，直至達到pH 6.5。添加精胺酸(鹼)和抗壞血酸(若適用的話)。用鹽酸(HCl)將pH調節回到6.5。然後將緩衝劑轉移至容量瓶中，並用水完成體積。

˙對於組胺酸緩衝劑，方案與用於其它2種緩衝劑的方案相同，除了組胺酸由單一鹽組成，因此不發生第一個滴定步驟。對於檸檬酸鹽緩衝劑，用HCl調節組胺酸緩衝劑的pH。

在製備後，測量每種緩衝劑的最終pH，並將溶液在0.2μm濾器上過濾

使用與實施例4中所述相同的方法製備配製劑。在緩衝劑交換之前，除配製劑0a外的所有配製劑用它們相應的緩衝劑稀釋到5.5mg/ml的濃度。選擇此濃度以補償在該過程期間發生的10%蛋白質損失，如通過第1輪中的RP-HPLC獲得的T=0結果提示的。在第三個清洗步驟之後(例如，在添加最後2ml緩衝液劑後)，使用稀HCl溶液將配製劑的pH調節至目標值。對緩衝劑進行初步測試以確定應當使用的合適的HCl濃度。圖12中顯示了過程中pH調節的結果。

使用方法2-3；5；7-9(表5)分析T=0樣品。在配製劑製備後48小時內進行t=0分析。與對於第1輪一樣進行應激測試，區別在於應用熱應激(40℃)2天而不是7天。完成這點以防止如在第1輪中觀察到的蛋白質的大量沉澱。在應激期後，將樣品在5℃下貯存，同時等待分析。使用方法2-3；5；7(表5)一起分析所有應激的樣品(即在完成了這兩個應激測試後)。在最後一個冷凍-融化循環後48小時內進行所有分析。

可以在圖13中找到在第2輪中製備的配製劑的pH和滲透壓結果。在T=0時測量這兩個參數。可以看出與第1輪形成對比，所有配製劑的pH都在目標上，這是在第三清洗步驟後引入的過程中pH調節步驟的結果。儘管在高測，磷酸鉀緩衝劑中的配製劑1和2的滲透壓是可接受的。50mM磷酸鉀緩衝劑的滲透壓比在第1輪中製備的20mM磷酸鈉緩衝劑的滲透壓低。在第2輪中引入的單一pH調節步驟和使用精胺酸鹼代替精胺酸HCl導致緩衝劑滲透壓的改善。分別在檸檬酸鹽和組胺酸緩衝劑中製備的配製劑3-4和5-6的滲透壓超過350mOsm/kg的可接受數值。在50mM檸檬酸鹽緩衝液的情況下，由於以下實情，這必須是預期的：●pH 6.5是緩衝劑能力的上部範圍(即主要存在共軛鹼，檸檬酸三鈉)

●檸檬酸三鈉離子化程度=4(即50mM檸檬酸三鈉=200mM離子)+Arg 200mM=在調節pH之前的400mOsm/kg。

解釋檸檬酸鹽和組胺酸緩衝劑的高滲透壓的另一個原因是這些緩衝劑的pH用HCl而不是用磷酸調節。從文獻中已知，在精胺酸和磷酸根離子之間發生強離子相互作用。此種相互作用實際上可以被認為是共價相互作用，並且甚至可以通過質譜碰撞誘導解離對抗片段化。由於此種絡合物的形成，用磷酸調節pH將對滲透壓具有低得多的影響。氯離子不形成此種絡合物，因此配製劑3-6的滲透壓(其pH用HCl調節)是較高的，如圖13中看到的。在檸檬酸鹽和組胺酸緩衝劑中使用HCl，以便不在配製劑中引入另外的離子(磷酸根)。如果選擇的最終配製劑在這些緩衝劑之一中，那麼將認為磷酸調節pH。

圖14中呈現了配製劑的外觀。在t=0時，除配製劑6(其是略微粉紅色的)外，所有配製劑都是澄清且無色的。在緩衝劑中已經觀察到顏色的變化，其在製備後幾小時顯示黑紅色。這可能是由抗壞血酸的氧化引起的。將緩衝劑製備3次，並且每次都觀察顏色的變化，並且即使緩衝劑被避光也是如此。在抗壞血酸和組胺酸之間沒有記錄到不相容性，因此含有抗壞血酸的其它緩衝劑沒有如此快速地改變顏色的原因是未知的。在40℃應激2天后，所有配製劑都是混濁的。然而，與第1輪相比，糰粒不沉沒在管形瓶的底部並仍然在懸浮液中，指示已經發生較少的沉澱。所有含有抗壞血酸的配製劑(2，4和6)也顯示顏色變化，其在配製劑6中更顯著。此配製劑也是最混濁的之一。

在5個冷凍/融化循環後，配製劑具有與在t=0時相同的外觀。

通過RP-HPLC獲得的結果示於圖15中。可以看出，在t=0時配製劑的含量呈現一些變化性，配製劑0a，1，4並且特別是6高於5mg/ml的目標CD-RAP濃度，以及配製劑0b低於5mg/ml的目標CD-RAP濃度。這指示Amicon管中的緩衝劑交換過程是難以控制的，並且為了獲得準確的含量，應當在該過程期間引入IPC。在2天熱應激後，在含有抗壞血酸的配製劑(2，4和6)中觀察到與t=0相比CD-RAP含量和純度的顯著降低。有趣的是，純度的降低在t=0時已經存在於配製劑4和6中。在5個冷凍-融化循環後，在這3種配製劑中也看到純度降低，儘管程度小於熱應激後。

實施例6：

進行6個月的穩定性研究以便在溫度的影響下評價CD-RAP蛋白隨時間的穩定性。意圖在-80℃，-20±5℃和5±3℃(特別是5℃)貯存化合物。在不同的貯存條件(-80℃，-20℃，5℃，25℃和40℃)下貯存配製劑。在穩定性研究中使用兩個批次。一個藥物產品(DP)批次和一個匹配DP批次的安慰劑批次。在表7-9中描述這兩個批次：

用長期/實時貯存條件(-80℃，-20℃和5℃)和加速貯存條件(25℃和40℃)測試配製劑。將-80℃，-20℃，5℃和25℃的穩定性監測6個月。將40℃的穩定性監測1個月。在研究的6個月期間，樣品的顏色和澄清度，pH，滲透壓，主帶MW和純度在不同時間點或在各種貯存溫度下沒有改變。在任何穩定性樣品中在不同溫度下貯存6個月裡沒有觀察到聚集體。通過RP-HPLC，HPSEC和SDS-PAGE分析，對應於CD-RAP藥物產品(DP)的安慰劑顯示對DP無幹擾。釋放時的樣品的總活體需氧計數(TVAC)也在藥典規範內。

在-80℃，-20±5℃，5±3℃，25±2℃和40±2℃在不同穩定性櫥櫃中以直立位置在穩定性櫥櫃中貯存配製劑。在指定的時間點時，從櫥櫃中取出樣品並在兩周內分析。在等待分析時，在5℃貯存樣品。使用下表8中呈現的參數和測試方法評價批次的穩定性。

在圖16和17中顯示了結果。

根據歐洲藥典(即在黑色和白色背景前)進行目視檢查(可見顆粒，顏色和澄清度)。然而，對管形瓶直接實施檢查，因為可獲得的樣品量不允許轉移到標準化的歐洲藥典管中。可見顆粒，澄清度和顏色的目視檢查由2名操作者進行。

在這兩種配製劑中沒有觀察到在不同溫度下貯存6個月後顏色和澄清度的顯著變化。在這些樣品中沒有觀察到顏色和澄清度作為貯存溫度的函數的趨勢。將樣品的顏色報告為“著色不超過B9/BY7/Y7”，因為它們與注射用水一樣無色。樣品的澄清度報告為“<Ref I”，因為它們也與注射用水一樣清澈。安慰劑批次F531-03-003P063在所有貯存溫度和時間點幾乎沒有可見的顆粒。然而，DP批次F531-03-003P064B顯示出可見顆粒作為貯存溫度和時間的函數的趨勢。在釋放時，樣品幾乎沒有可見的顆粒。在-20℃和5℃貯存的DP樣品在t=1個月時仍幾乎沒有可見顆粒。在t=3和t=6個月的時間點，在-20℃和5℃貯存的樣品中觀察到5-10個纖維樣顆粒。然而，這仍然報告為幾乎沒有可見顆粒，因為量小於10。有趣的是，在-20℃和5℃貯存的樣品中從t=3個月到t=6個月檢測到的顆粒數目沒有增加。會需要鑒定顆粒的性質(即蛋白質性或非蛋白質性)以及貯存較長時段的管形瓶的目視檢查，以確認這些顆粒是CD-RAP DP批次在-20℃和5℃的不穩定性的指示。貯存6個月後，在-80℃貯存的樣品顯示20-30個纖維樣顆粒，其比在-20℃貯存相同時段的樣品中檢測到的顆粒多。因此，在-80℃貯存沒有呈現相對於在-20℃貯存的任何優點。在25℃，在t=1個月時，樣品仍幾乎沒有可見顆粒。在t=3和t=6個月時，這些樣品分別顯示20和10-20個纖維樣顆粒。在40℃，樣品在t=1個月時顯示超過10個白色纖維樣顆粒。總之，這可以是CD-RAP DP在40℃在貯存1個月後和在25℃在貯存3個月後的不穩定性的指示。總體上，可見顆粒結果指示，CD-RAP DP在-20℃和5℃在貯存6個月後是最穩定的。

在這兩種配製劑中沒有觀察到在不同溫度貯存6個月後的pH值變化。樣品的pH保持為6.0-6.1。

在釋放時和在t=6個月時分析CD-RAP DP和安慰劑批次的滲透壓。在整個研究中配製劑的滲透壓沒有變化，對於DP和安慰劑批次，其分別為315-319mOsm/kg和309-313mOsm/kg。這是預期的，因為滲透壓通常不是穩定性指示參數。

經由RP-HPLC，來自安慰劑批次的峰沒有幹擾任何樣品中的DP批次。觀察到CD-RAP含量“本身”以及CD-RAP純度的逐漸降低作為貯存溫度和時間的函數。這通過%Ox-Met-SAR396049和除了Ox-Met-SAR396049之外的%最大雜質的增加組合。在-80℃，%Ox-Met-SAR396049和除了Ox-Met-SAR396049之外的%最大雜質在貯存6個月後與在釋放時獲得的值相比都顯示0.4%的增加(分別為從6.6%至7.0%和從1.5%至1.9%)。在-20℃，在相同時段裡觀察到類似的趨勢(與這兩種雜質類型的釋放相比增加0.6%和0.4%)。在整個研究期間，總體CD-RAP純度降低為約1%(從t=0時的85.0%至t=6個月時的83.9%)，並且在這兩種貯存溫度，CD-RAP含量“本身”從2.2降低至2.0mg/ml。在5℃，觀察到與在-80℃和-20℃觀察到的趨勢相同的趨勢，除了%Ox-Met-SAR396049的增加在該溫度下更重要(從釋放時的6.6%至在t=6個月時的7.5%)。這伴隨著1.5%(從85.0%至83.5%)的CD-RAP純度的降低。在25℃，%Ox-Met-SAR396049分別從釋放時的6.6%增加至貯存3個月和6個月時後的8.2%和8.9%。在該溫度下在t=6個月時獲得的%Ox-Met幾乎等同於在1個月後在40℃貯存的樣品中獲得的%Ox-Met(9.1%)。除了Ox-Met-SAR396049之外的%最大雜質也從釋放時的1.5%增加至在25℃貯存6個月之後的2.8%。類似於用可見顆粒觀察到的事情，這些結果可以是在25℃從3個月起貯存和在40℃貯存1個月時CD-RAP DP的不穩定性的跡象。

經由HPSEC在6個月裡在所有貯存溫度在CD-RAP DP批次F531-03-003P064B中沒有觀察到聚集體。來自安慰劑的峰沒有幹擾任何樣品中的DP批次。

基於在本研究中獲得的結果，可以得出結論，當在-20℃和5℃貯存時，CD-RAP蛋白溶液是最穩定的。在-80℃貯存沒有呈現相對於在-20℃貯存的清楚優點。

實施例7：建立製造空脂質體的溶劑注射方法

本研究的目的是通過改善目前用於製備脂質體的方法並修改配製劑(例如脂質)組成開發適合於關節內施用並且允許冷凍乾燥的CD-RAP的脂質體配製劑。

圖17中顯示了使用溶劑注射方法製備空脂質體的一般方法的方案。使用蠕動泵將含有脂質的有機溶劑混合物以受控的方式注射到水相中。在設置中插入靜態混合器以混合兩種液體，如圖17中顯示的。在靜態混合器前進行注射以實現增加的湍流，即有利於脂質體形成的條件。注射後有機溶劑的量為10%(v/v)，以允許即時脂質體形成。此過程在環境溫度下進行。脂質注射後，結果是含有10%有機溶劑的水中的空脂質體。用水清洗空脂質體懸浮液以去除有機溶劑。這通過切向流過濾(TFF)進行。此過程可以去除>99.5%的有機溶劑。

在精胺酸-磷酸鈉(arg-磷酸鹽)緩衝液，pH 7.3-7.4(精胺酸350mM，磷酸二氫鈉50mM，用磷酸調節pH)中以約5mg/ml的CD-RAP濃度製造CD-RAP溶液。

在測試溶劑注射方法前，用脂質進行溶解度測試，以找到可以溶解所有脂質的溶劑混合物。為了使方法保持簡單，必須找到溶劑混合物，其中可以在環境溫度溶解脂質。測試以下脂質和溶劑：脂質：-大豆PC，-抗壞血酸棕櫚酸酯，-膽固醇，溶劑：-乙醇(96%)，-TBA(95%)，-丙酮，-DMSO，-DMA

在乙醇和TBA中測試大豆PC和抗壞血酸棕櫚酸酯的溶解度。在丙酮，DMSO和DMA中測試膽固醇。在所有情況下，稱重脂質並添加適用的溶劑。對變得清澈的混合物(即其中溶解脂質)，添加另外的脂質。對沒有變得清澈的混合物添加另外的溶劑。目視評價溶解度。

圖19中顯示了此實驗的結果。推斷可以在乙醇(96%)中溶解大豆PC和抗壞血酸棕櫚酸酯，而DMA是膽固醇的最佳溶劑。儘管抗壞血酸棕櫚酸酯的溶解度在TBA(95%)中較高，但是更方便的是使用用於多種脂質的一種溶劑。為了在環境溫度下獲得一種清澈的脂質溶液，以3：1的比率混合兩種脂質溶液乙醇：DMA。在乙醇/DMA混合物中含有所有脂質的最終脂質溶液在環境溫度下是清澈的。

在乙醇(96%)中溶解大豆卵磷脂和抗壞血酸棕櫚酸酯，並且在DMA中溶解膽固醇。由於DMA是2類溶劑，優選轉換為3類溶劑。能夠溶解膽固醇並且在環境溫度下當與其它脂質混合時形成清澈溶液的3類溶劑是1-丙醇。對使用的溶劑量沒有做出改變。

脂質有機溶液濃度的影響

有機溶劑中的脂質濃度可以在溶劑注射後對粒度具有影響。由於溶劑注射方法基於用水相將有機溶劑稀釋至約10%(v/v)，較高的脂質濃度意味著需要較少的水以及形成較少稀釋的脂質體。另一方面，有機相中較高濃度的脂質可以導致較大的顆粒(脂質體)大小。通過使用相同的注射參數注射不同濃度的脂質確定脂質濃度的影響。

圖20清楚地顯示了有機相中脂質濃度的影響。隨著脂質濃度的降低，形成的脂質體的粒度減小和顆粒的更窄的分佈(更低的PDI)。隨著脂質濃度降低，脂質體變得更稀，導致更高的濃縮因子。濃度因子指示需要濃縮注射後的整體(bulk)脂質體懸浮液以在與CD-RAP蛋白混合前達到目標脂質含量的次數。

靜態混合器大小的影響

在溶劑注射期間使用靜態混合器混合水和有機相。具有不同配置的不同混合器是可用的。這些配置之一是混合器的內徑。通過改變內徑，改變內部體積，並且憑藉這點，改變有機相和水相的混合比率。

對於每個批次使用不同的靜態混合器製備兩個批次。

小靜態混合器：內徑5.3mm

大靜態混合器：內徑12.6mm

所有其它注射參數對於每個批次是相同的。混合器內徑對粒度的影響示於圖21中。從圖21中的結果可以得出結論，使用具有較大內徑的靜態混合器製備的脂質體在大小上較小並具有較低的PDI。

水相流速的影響

改變水相流速對靜態混合器中產生的剪切和注射的有機溶劑的稀釋具有影響。製備兩個批次以測試此參數。使用大靜態混合器，因為此混合器更好地適合於較高的水相流動。除了水相流動外，所有注射參數對於這兩個批次是相同的。結果示於圖21中。將水相流速從550ml/min增加到1100ml/min導致粒度和PDI的顯著降低。Z-平均值從147nm降低至106nm，並且PDI從0.213降低至 0.193。

與2200ml/min的較高水相速度組合，將溶劑注射速度增加至5ml/min或甚至10ml/min導致與以1ml/min注射速度製備的批次中看到的粒度數據相當的粒度數據。因此，高達10ml/min的較高的注射速度是可行的。

組合

通過組合上文測試的參數的最佳設置，製備批次。上述部分中的最佳設置是：有機相中的脂質濃度：0.033(g/ml)；靜態混合器內徑：大(12.6mm)；水相流速：1100(ml/min)。結果示於圖23中。組合來自所有測試參數的最佳設置得到粒度為72nm和PDI為0.132的脂質體批次。

實施例8：與CD-RAP蛋白混合的脂質體

在脂質體製備和(若適用的話)DS緩衝劑交換/濃縮後，以55：45的脂質體：CD-RAP比率混合這兩種液體。分析與緩衝劑(用作安慰劑)混合後和與CD-RAP混合後脂質體的粒度。如可以在圖24中看出，在與CD-RAP混合後，脂質體粒度沒有變化。

實施例9：冷凍乾燥和重建

根據圖25A和B中給出的程序進行冷凍乾燥的兩次運行。在運行2(在圖25B中給出)中，在-10℃而不是+5℃進行初步乾燥，如在運行1(在圖25A中給出)中完成。根據圖25A中給出的程序的冷凍乾燥導致具有大裂縫的餅。在餅重建後，在進行重建後觀察到相分離。根據圖25B中給出的程序的冷凍乾燥導致無裂縫的餅。在餅重建後，沒有觀察到相分離。

如下進行餅的重建，即從5℃冰箱中取出管形瓶，並通過在環境溫度下逐步或一次全部添加水的總重建體積(1mL)並振盪30秒立即重建餅。

實施例10：囊封效率

在一系列批次上評價不同參數對囊封效率(EE)和重建容易性的影響，目的是確定哪些參數導致最佳EE%。表11提供了所有制備的配製劑的概述。

參數調查：配製劑F531-03-008P027，008P031和008P033

測試的配製劑具有標準或2X脂質含量。在一步中(即通過一次添加總重建體積)或逐步重建管形瓶。在文獻中提及逐步重建方法作為促進對脂質體的較高分子包埋的方式。當使用此方法時，重建如下進行：1：添加總重建體積的30%，將管形瓶手動旋動，並且在實驗室臺上靜置30分鐘。2：重複步驟1，3：添加重建體積的剩餘部分，手動旋轉管形瓶，並且在實驗室臺上靜置30分鐘。

使用逐步重建方法，所有標準脂質含量配製劑在最後重建步驟後是同質的。在實驗室臺上總共2小時靜置期後，2X脂質含量配製劑是同質的。然而，當使用一步重建方法時，在任何配製劑中沒有塊在重建後立即可見，並且無論配製劑的脂質含量如何都是如此。因此，似乎一步重建方法導致更容易的配製劑重建。

重建後，用精胺酸-磷酸鹽緩衝液將脂質體懸浮液稀釋20倍，並用直接VivaSpin方法(離心4000g，5分鐘)處理。通過RP-HPLC分析濾液的游離蛋白質含量。使用每個管形瓶的CD-RAP的理論量作為參照計算EE%，其通過將用於製備批次(F-MPL-120004)的DS中的蛋白質含量乘以管形瓶中移液的DS溶液的量獲得。值得注意的是，在這些批次中未測量重建產物的體積，因為餅體積效應在項目中後期發現。然而，可以彼此比較具有相同脂質含量的批次中的EE%值，因為它們在重建後的體積是等同的。

可以在圖26中找到測試的配製劑和獲得的EE%的概述。獲得的EE%在17和53%之間變化。在下面的部分中更詳細地討論了所研究的每個參數的效果。

通過評價來自以相同方式重建的相同批次的2或3個管形瓶測試EE%結果的再現性。在具有標準脂質含量的配製劑中獲得可重現的數據。對於具有2X脂質含量的配製劑P033A獲得的結果呈現較多的變異性。

比較脂質含量的影響。由於沒有做出餅體積的校正的實情，在此應當慎重解讀EE%結果。使用這兩種重建方法以較高的脂質含量獲得較高的EE%。在冷凍乾燥前對重建時沒有濃縮脂質體的效果(比較配製劑P027K和P027F)。用標準脂質含量，但通過添加CD-RAP溶液體積的一半製備配製劑P027H。這也導致較高的脂質：蛋白質比率。可以看出，降低蛋白質含量導致較低的EE%。這指示脂質體沒有用CD-RAP飽和，因為如果會囊封最大量的可用蛋白，那麼蛋白質含量的減少將導致EE%的增加。

還研究了脂質含量對重建產物中脂質體的粒度的影響。然而，脂質含量對重建後的脂質體粒度和大小分佈沒有影響。

可以在圖28A中看到冷凍乾燥方法的效果。對於具有標準脂質含量的樣品，受控的冷凍乾燥導致比Christ冷凍乾燥更好的EE%。在具有2X脂質含量的樣品中恢復此種趨勢。鑒於進行受控冷凍乾燥的樣品也進行退火步驟，比較在此是困難的。

還研究了重建方法對重建產物中脂質體的粒度的影響。如可以在圖28B中看出，一步重建導致更窄的粒度分佈。

參數調查：配製劑F531-03-008P041和008P050

測試的配製劑具有2X，3X或4X脂質含量。用一步法重建管形瓶(即通過一次添加總重建體積)。使用此方法，可以重建所有配製劑。重建後，將脂質體懸浮液用其相應的緩衝劑稀釋20倍，並用直接VivaSpin方法(離心4000g，5分鐘)處理。通過RP-HPLC分析濾液的游離蛋白質含量。使用每個管形瓶的CD-RAP的理論量作為參照計算EE%，其通過將用於製備批次(F-MPL-120004或F-AKO-120006)的DS中的蛋白質含量乘以管形瓶中移液的DS溶液量獲得。值得注意的是，在這些批次中未測量重建產物的體積，因為餅體積效應在項目中在後期發現。然而，具有可以彼此比較相同脂質含量的批次中的EE%值，因為它們在重建後的體積是等同的。

製備具有2X脂質含量的第一系列的配製劑(F531-03-008P041A/C/E/G)，以評價：-在一步重建後的高脂質含量樣品中EE%的重複性和再現性-冷凍乾燥方法(受控對Christ)對EE%的影響-對於2X脂質含量批次在重建後靜止期的需要-管形瓶大小和填充體積對餅外觀，重建和EE%的影響。

對於第二系列的配製劑(F531-03-008P050A/C/E/G/J/L)，與脂質體混合的蛋白質溶液在arg-磷酸鹽或arg-檸檬酸鹽緩衝劑中。將所有批次在2R iso管形瓶中填充，並在受控冷凍乾燥器中冷凍乾燥。使用這些批次，評價以下參數的效果：-在一步重建後高脂質含量樣品中EE%的重複性和再現性-填充體積(以獲得高脂質含量)對餅外觀和重建的影響-脂質濃度對EE%的影響-蛋白質緩衝劑類型對EE%的影響。

可以在圖29中找到配製劑的概述。獲得的EE%在39和62%之間變化。通過評價來自相同批次的2或3個管形瓶測試EE%結果的再現性。與在小管形瓶(3ml和6ml)中具有較低填充物的DP相比，在10R管形瓶中具有3ml填充物的DP中獲得更大的變化。這可以是由與大的管形瓶中相比在小管形瓶中更強力且可再現的重建引起。該方法對於具有高脂質含量的配製劑是可重複的。RSD%或差異%在3ml管形瓶中<10%。當RSD%或差異%<10%時，通過RP-HPLC方法獲得的游離蛋白質含量的差異為<0.3mg/ml。8.2.1管形瓶大小和填充體積的影響。在表71中可以比較管形瓶大小和填充體積對EE%的影響。對於具有不同填充體積的樣品和在不同管形瓶大小中沒有獲得2X脂質含量配製劑的EE%的顯著差異。與6ml和3ml管形瓶大小相比，獲得了10ml管形瓶大小的EE%的更大變化。

對於在溫育1小時後或在不溫育的情況下的樣品沒有獲得2X脂質含量樣品的EE%的顯著差異。因此，不需要重建2X脂質含量樣品後的靜置期。

在Christ冷凍乾燥和受控冷凍乾燥之間沒能觀察到2X脂質含量樣品的EE%的顯著差異。

也可以比較脂質含量的影響。然而，由於沒有對餅體積進行校正的實情，在此應當慎重解讀EE%結果。對於arg磷酸鹽緩衝劑中的DP批次，獲得更高的EE%作為脂質含量的函數(當脂質量加倍時為40%至62%)。對於在arg-檸檬酸鹽緩衝劑中的DP批次，具有2X對3X脂質含量的樣品的EE%沒有差異。然而，從2/3X到4X脂質含量，EE%從40%增加到51%。

對於具有2X脂質含量的DP批次，兩種不同緩衝劑類型的EE%沒有顯著差異。然而，對於具有3X和4X脂質含量的DP批次，對於在精胺酸-磷酸鹽緩衝劑中的配製劑獲得較高的EE%。

參數調查-配製劑F531-03-008P056和008P064

測試的批次在冷凍乾燥前具有4X脂質含量。此種脂質濃度太高，並且在脂質體的無菌過濾期間產生問題。重建後，它們具有4X，6X或8X脂質含量。在精胺酸-檸檬酸鹽緩衝劑中製備批次，用受控冷凍乾燥進行冷凍乾燥，並用一步法重建。重建後，用檸檬酸鹽緩衝劑將脂質體懸浮液稀釋20倍，並用直接VivaSpin方法(離心4000g，5分鐘)處理。通過RP-HPLC分析濾液的游離蛋白質含量。對於這些批次，當評價EE%時考慮重建產物的體積。

製備配製劑F531-03-008P056E/F/H/J/L/M以評價以下參數的效果：-脂質含量(4X/6X/8X)，-冷凍乾燥前的填充體積，-管形瓶大小(6R/2R管形瓶)。製備配製劑F531-03-008P064E1/E2/F1/F2以確認脂質含量的影響並評價冷凍乾燥期間冷凍速率的影響。除了確認哪些參數導致最佳EE%外，這些批次的目的是選擇最終批次的管形瓶大小/脂質含量/填充體積/冷凍速率。

在冷凍乾燥之後，由於冷凍乾燥運行期間的問題，來自P056系列的批次顯示出提升和相分離的餅。因此，對於該批次，必須慎重解讀重建和EE%結果。然而，可以比較不同參數的效果。可以容易地重建6R管形瓶中的所有樣品。沒有觀察到塊。然而，不能重建配製劑P056H/L(2R管形瓶中的6X和8X脂質含量)。這些研究證明，對於6X和8X脂質含量，管形瓶大小應為6R。

使用2種不同的冷凍速率將來自P064系列的批次冷凍乾燥：緩慢和快速。為了進行此實驗，將經歷緩慢冷凍的管形瓶置於冷凍乾燥器的架上並以0.3℃/min的速率冷凍至-40℃。一旦冷凍這些管形瓶，將經歷快速冷凍的管形瓶置於已經在-40℃的架上。冷凍乾燥後，來自P064系列的所有批次顯示出良好的餅。可以在1分鐘旋動內重建所有其它樣品。沒有觀察到塊。這些結果指示8X脂質含量不能導致可行的產品。

可以在圖30中找到P056系列批次的EE%結果。可以看出管形瓶大小沒有產生差異。然而，似乎存在脂質含量的小影響。因此，證實了脂質含量增加的效果。然而，它遠遠不如觀察到的事情重要。總體上，可以實現30%的EE。

實施例11：穩定性

在3個月穩定性研究中測試脂質體CD-RAP配製劑的穩定性以及其匹配的安慰劑的穩定性。使用長期/實時貯存條件(-80℃，-20℃和5℃)和加速貯存條件(25℃)測試意圖用於藥動學(PK)研究的配製劑。對於所有貯存溫度，將穩定性監測3個月。在研究的3個月期間，餅外觀，pH，粒度以及主帶MW和純度(如通過SDS-Page測定)在不同時間點或在各種貯存溫度下沒有改變。對應於CD-RAP配製劑的安慰劑顯示沒有對CD-RAP配製劑的幹擾。總體上，在本研究中獲得的結果顯示脂質體冷凍乾燥的CD-RAP在-80℃，-20℃和5℃下貯存時是穩定的。在-80℃和-20℃下貯存與在5℃下貯存相比沒有清楚的優點。

將兩種配製劑置於穩定性研究中：一種藥物產品(DP)配製劑和一種與DP配製劑匹配的安慰劑配製劑，如表15，16和17中指示的。

貯存條件和穩定性樣品的製備

在穩定性櫥櫃中插入配製劑。在-80℃，-20±5℃，5±3℃和25±2℃下在不同穩定性櫥櫃中以直立位置貯存它們。在指定的時間點時，從櫥櫃中取出樣品並在兩周內分析。在等待分析時，在5℃貯存樣品。使用表18中呈現的參數和測試方法來評價批次的穩定性。

在釋放時，DP和安慰劑批次兩者在重建後是同質的懸浮液。

對於CD-RAP和安慰劑配製劑，在圖31中分別呈現了所有的穩定性結果。

在貯存1個月後，對於安慰劑批次在5℃貯存的管形瓶之一中，對於安慰劑批次在25℃貯存的管形瓶之一中，和對於CD_RAP配製劑在25℃貯存的兩個管形瓶中觀察到塊。這些結果提示貯存溫度對重建的容易性的影響。

在貯存3個月後，在-80℃貯存的樣品沒有顯示任何塊。對於在-20℃貯存的安慰劑批次的管形瓶也是如此。相反，在-20℃下貯存的DP管形瓶中觀察到塊。在5℃和25℃，對於DP和安慰劑批次分別在兩個中的一個管形瓶中和兩個管形瓶中看到塊。

通常，所研究的產物難以重建，並且所得的懸浮液是粘稠的。因此，難以推斷在重建後經常觀察到的懸浮液的不均勻性是產物不穩定性作為時間和溫度的函數的結果。

粒度

僅通過釋放時的DLS測量重建後脂質體的粒度。對於DP和安慰劑批次，z平均值分別為2.9和3.6μm。這與通過激光衍射獲得的結果(對於DP和安慰劑批次分別為D(0.5)3.9和4.0μm)在相同的範圍內。大小分佈顯示DP批次P082K的雙峰分佈。在安慰劑批次P082L的情況下，大小分佈另外顯示在所分析的2個管形瓶之一中存在小脂質體。多分散性指數(PdI)是寬的(對於兩個批次為0.4)，對於多峰大小分佈始終如此。對於DP和安慰劑批次，釋放時的粒度是相似的，並且貫穿整個研究保持恒定。這暗示重建後團塊的存在(見上文)不影響批次的粒度。

pH

在兩種配製劑中都沒有觀察到在不同溫度貯存6個月後的pH值變化。對於CD-RAP和安慰劑配製劑，樣品的pH分別保持6.2和6.1。

總蛋白質含量

通過提取方法測定的總蛋白含量

在研究期間當在-80℃，-20℃和5℃貯存產物時，總CD-RAP含量為3.9±0.2mg/ml。一個例外是在-20℃貯存1個月的管形瓶，其顯示2.8mg/ml的較低的總蛋白質含量。此結果可能是異常值。事實上，CD-RAP總含量在t=3個月時回到3.9mg/ml。此外，使用餅體積法在相同管形瓶中測定的CD-RAP總含量顯示與釋放時獲得的結果(3.8mg/ml)相當的結果。

與在較低溫度貯存的樣品相比，在25℃貯存的樣品顯示較低的總蛋白質含量(3.5mg/ml)。由於總蛋白質含量在給定批次中應當保持恒定，含量“本身”的降低只能是CD-RAP降解的結果，導致CD-RAP主峰面積%降低。在這項研究中獲得的結果顯示，情況就是這樣。當在給定時間點時與在25℃貯存的樣品比較在-20℃貯存的樣品的CD-RAP主峰面積%時，可以看出CD-RAP主峰面積%在t=1個月時從76%降低到70%，並且在t=3個月時從70%降低到63%。

通過餅體積法測定的總蛋白質含量

貫穿整個研究，總CD-RAP含量為3.9±0.3mg/ml。與用提取方法獲得的結果形成對比，貯存溫度對總CD-RAP含量沒有影響。鑒於此方法的確使用含量“本身”，但是使用理論CD-RAP濃度作為參照的實情，這是預期的。此理論濃度取決於每個管形瓶中填充的蛋白質溶液的量和重建體積。

游離CD-RAP的含量

當產物在-80℃，-20℃和5℃貯存時，游離CD-RAP含量在整個研究期間為2.6±0.3mg/ml。

與在較低溫度貯存的樣品相比，在25℃貯存的樣品顯示較低的游離蛋白質含量(2.2-2.3mg/ml)。類似於對用提取方法獲得的總蛋白質含量結果觀察到的事情，游離蛋白質含量“本身”的降低是CD-RAP降解的結果，導致CD-RAP主峰面積%降低。這在貯存3個月後尤其如此，其中游離蛋白質含量從5℃的2.7mg/ml(CD-RAP主峰面積77%)降低到25℃的2.3mg/ml(CD-RAP主峰面積69%)。這些結果支持用總蛋白質含量方法獲得的結果，並提示冷凍乾燥的脂質體CD-RAP DP在高達5℃的溫度穩定至少3個月，但是在25℃貯存時穩定小於1個月。

囊封效率

使用以下等式計算囊封效率(EE%)：EE%=100-[游離蛋白質(mg/ml)/總蛋白質(mg/ml)* 100]

在此計算中，可以通過提取方法或通過餅體積法獲得總蛋白質含量。值得注意的是，圖31中呈現的游離蛋白質含量，總蛋白質含量以及EE%值是從在每個時間點分析的2個管形瓶獲得的平均值。出於此原因，使用圖31中呈現的平均數據計算EE%可以導致與呈現的結果略有不同的結果。

基於提取方法使用總蛋白質含量得到的EE%

釋放時，EE%為33%。此EE%在整個研究期間保持恒定(30-38%)，除了在-20℃貯存1個月的管形瓶，其顯示11%的較低的EE%。此較低的EE%是用這些樣品獲得的較低的總蛋白質含量的結果，並且可能是異常值。即使在25℃貯存的樣品中EE%保持恒定，其中觀察到CD-RAP主峰面積%的降低。這可以通過以下事實來解釋：在這些樣品中，游離的和總的蛋白質含量“本身”都是減少的，導致EE%的相對無變化。

基於餅體積法使用總蛋白質含量得到的EE%

釋放時，EE%為33%。當在-80℃，-20℃和5℃貯存產物時，此EE%在整個研究期間保持恒定(30-37%)。一個例外是在-80℃貯存3個月的管形瓶，其顯示較低的EE% 20%。這可能是由略高的游離CD-RAP(2.9mg/ml)與略低的總CD-RAP(3.6mg/ml)組合引起的，這導致較低的囊封的蛋白質水平。

在25℃貯存的樣品中，與釋放相比獲得更高的EE%(在t=1和t=3個月時分別為40%和44%)。這是在這些樣品中的低游離CD-RAP含量“本身(as is)”(2.2-2.3mg/ml)組合沒有測定的總蛋白質含量“本身”中的結果。因此，由於CD-RAP主峰面積%的降低所致的游離CD-RAP的降低未被同樣總CD-RAP降低補償，並且得到較高的EE%。

總之，這些結果顯示EE%結果依賴於用於獲得總蛋白質含量的分析方法。當觀察到不穩定性時(即，當CD-RAP主峰面積%降低時)，基於提取的總蛋白質含量方法導致更精確的EE%結果，因為測量的含量“本身”與對游離的蛋白質含量觀察到的事情類似地降低。

總體上，可以推斷本研究中看到的EE%的變化是由方法變化性和/或由總蛋白質含量分析方法的選擇引起的，並且總體上，在3個月裡在所有溫度沒有觀察到EE%的變化。

滲透壓

僅在釋放時分析脂質體CD-RAP DP和安慰劑批次的滲透壓。對於DP和安慰劑批次，結果分別為270和253mOsm/kg。

殘留水含量

在釋放時和在t=3個月時分析冷凍乾燥的脂質體CD-RAP DP 和安慰劑批次的殘留水含量。水含量顯示作為貯存溫度和時間的函數的趨勢。在釋放時發現的值(對於DP和安慰劑批分別為0.15和0.11%)在t=3個月時略微增加。增加的程度是貯存溫度的函數。3個月後，與t=0相比，在-80℃和-20℃貯存的樣品沒有顯示顯著差異。然而，在5℃和25℃貯存的樣品在同一時間段裡分別顯示0.08%和0.16-0.17%的水含量增加。由於已知本研究中使用的容器對水蒸氣不能透過，這些結果的一個可能的解釋是存在于塞中的水向餅中的擴散。對塞的更徹底的乾燥可用於製備未來批次以防止這點發生。總體上，水含量的增加是小的，因為水含量在3個月後最大為0.3%。

TVAC

僅在使用傾注板法(pour plate method)釋放時確定TVAC。DP和安慰劑批次的結果是<1CFU/1ml和<1CFU/5ml，其在藥典規範內。

<110> 賽諾菲(SANOFI)

<120> 藉由使用CD-RAP前驅蛋白改善CD-RAP製程中之表現與摺疊

<130> DE2015/094 WO

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 107

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

<210> 2

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 前序列

<400> 2

<210> 3

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 前序列

<400> 3

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 前序列

<400> 4

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 前序列

<400> 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 前序列

<400> 6

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 前序列

<400> 7

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 前序列

<400> 8

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 前序列

<400> 9

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 前序列

<400> 10

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 前序列

<400> 11

<210> 12

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 前序列

<400> 12

<210> 13

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 前序列

<400> 13

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 前序列

<400> 14

<210> 15

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 前序列

<400> 15

<210> 16

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 前序列

<400> 16

<210> 17

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 前序列

<400> 17

<210> 18

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 前序列

<400> 18

<210> 19

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 前序列

<400> 19

<210> 20

<211> 141

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD-RAP前體蛋白

<400> 20

<210> 21

<211> 105

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 21

1、2‧‧‧預培養(和預發酵)

3‧‧‧發酵

4‧‧‧細胞分離

5‧‧‧細胞破壞

6‧‧‧IB清洗和分離

7‧‧‧折疊和過濾

8‧‧‧HIC 1

9‧‧‧切割

10‧‧‧AEX非結合

11‧‧‧CEX

12‧‧‧HIC 2

13‧‧‧TFF(UF/DF)

14‧‧‧填充(包括0.2μ mg過濾)

Claims

一種CD-RAP前驅蛋白，其包含a)前序列，該前序列在其C端包含切割位點，和b)CD-RAP或其變體。
一種核酸，其編碼請求項1的前體CD-RAP蛋白。
一種載體，其包含請求項2的核酸。
一種宿主細胞，其包含請求項1的前體CD-RAP蛋白，請求項2的核酸或請求項3的載體。
一種製造天然CD-RAP的方法，其包括以下步驟a)提供請求項1的CD-RAP前驅蛋白，並b)去除該前序列以獲得天然CD-RAP。
一種CD-RAP蛋白製劑，其包含具有長度為107個胺基酸的SEQ ID NO：1的成熟CD-RAP序列的CD-RAP蛋白，其中該CD-RAP(107AA)與存在於該CD-RAP蛋白製劑中的任何其它CD-RAP蛋白的比率為99wt-%。
一種組合物，其包含CD-RAP或其變體，和至少一種帶正電荷的胺基酸和緩衝劑。
一種製造請求項7的組合物的方法，其包括將CD-RAP或其變體添加到包含至少一種帶正電荷的胺基酸的緩衝劑。
一種包含脂質體的組合物，該脂質體包含囊封的CD-RAP或其變體，其中該脂質體的大小低於200nm，特別是低於150nm，特別是低於120nm，特別是低於100nm。
一種製造脂質體配製劑的方法，其包括以下步驟：a)在有機溶劑中溶解至少一種脂質，b)將步驟a)的混合物注射到循環水相中，並且c)去除該溶劑。
一種可通過請求項10的方法製造的脂質體配製劑。
一種降低脂質體配製劑中的脂質體大小的方法，其包括以下步驟：a)在有機溶劑中溶解至少一種脂質，b)將步驟a)的混合物注射入循環水相中，並且c)去除該溶劑。
一種降低脂質體配製劑的多分散性的方法，其包括以下步驟：a)在有機溶劑中溶解至少一種脂質，b)將步驟a)的混合物注射到循環水相中，並且c)去除該溶劑。
一種藥物，其包含請求項6，請求項7或請求項9的組合物。
如請求項6，請求項7或請求項9中詳明的組合物，其用於治療和/或預防患有聚集蛋白聚糖降解，和/或水流入軟骨的增加，和/或降低的CD-RAP表現的患者中的軟骨疾病或損傷。
一種貯存CD-RAP的方法，其包括在如請求項7或請求項9中詳明的組合物中保持CD-RAP。