TW201717889A - 於天然孢子及花粉粒中形成化合物之微包覆 - Google Patents

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Abstract

在一個態樣中，本文提供經工程化以包覆化合物或物質之完整孢子。在某些實施例中，該包覆化合物或物質之完整孢子係塗佈有或共包覆有水凝膠或其他試劑，以控制化合物或物質自孢子釋放之速率。在另一態樣中，本文提供製造包覆化合物或物質之完整孢子之方法。在另一態樣中，本文提供包含完整孢子或包覆化合物或物質之完整孢子之調配物及該等調配物之用途。

Description

於天然孢子及花粉粒中形成化合物之微包覆
本申請案主張2015年7月16日申請之美國臨時申請案第62/193,307號及2015年12月4日申請之美國臨時申請案第62/263,192號之權利，該等申請案以其全文引用方式併入本文中。
在一個態樣中，本文提供經工程化以包覆化合物或物質之完整孢子。該化合物或物質可為(例如)治療劑、草藥、營養藥劑、食品物質、食品補充劑、除草劑、殺蟲劑、化妝品(例如，香味劑)、消毒劑、清潔劑、診斷藥劑、油墨、抗微生物物質、燃料。在某些實施例中，該包覆化合物或物質之完整孢子係塗佈有或共包覆有水凝膠或其他試劑，以控制化合物或物質自孢子釋放之速率。在另一態樣中，本文提供製造包覆化合物或物質之完整孢子之方法。在某些實施例中，該方法進一步包括用水凝膠或其他試劑塗佈完整孢子，或包覆該等化合物或物質，以控制化合物或物質自孢子釋放之速率。在另一態樣中，本文提供包含完整孢子或包覆化合物或物質之完整孢子之調配物及該等調配物之用途。
植物孢子、藻類及花粉粒代表天然包覆之形式，且自然界中通常存在大範圍的產生此等孢子及花粉粒之特定植物物種。此等天然包 裝方式可有效保護敏感性生物材料免遭長時間乾燥、UV暴露及捕食生物形式之極端環境影響。許多植物產生呈種子形式之孢子，其包含產生新植物時所需要之所有遺傳物質。此等孢子提供具有高結構均勻度之現成膠囊骨架及可用於包覆大範圍材料之大內腔。人類消耗天然孢子及花粉粒作為生物補充劑、順勢療法為開發此等材料用於特定於治療性加載及釋放之包覆應用奠定基礎。例如，石松(lycopodium clavatum)為產生孢子及已經確認包含一些用於範圍自胃疾病至阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)之治療性應用之有前景的植物化學品之石松(Lycopodium)屬之一個物種。石松孢子提供堅固的膠囊結構且可在全球大量購得，且此等孢子通常以許多治療效益包括改良之骨生成、認知功能、胃腸道疾病之治療、肝保護活性及抗氧化性質用於傳統的草藥中。近來的研究展示經處理之石松殼用於包覆之用途，然而，生產外壁空膠囊(孢粉素)需要在高溫下藉由極端化學處理長時間處理天然孢子，使得此等所得膠囊不含所有其他生物材料。在許多應用中，此大規模處理可能係不必要的且可能喪失潛在治療性效益。
生產微包覆產品中之主要挑戰在於確保尺寸單分散性，此可能對針對所欲標靶器官之藥物釋放特徵具有重大影響。除了尺寸單分散性外，具有明確界定的微結構在探索廣泛應用中扮演重要角色。大多數習知的用於包覆之材料處理技術諸如乳液溶劑蒸發、噴霧乾燥及化學結合無法可靠地提供尺寸單分散性或明確界定的微結構。雖然先前技術報告使用孢子及花粉之經處理之空外壁微膠囊於包覆藥物、疫苗及MRI造影劑，但產生此等空膠囊極其繁瑣，涉及到長時間的嚴苛化學處理從而高度影響包含人力、製程及持續時間之工業成本。因此，需要新穎之微包覆各種化合物及物質之方法。
2.1 山茶油
山茶油(亦稱作茶籽油)為實際的綠茶油。茶籽油在更多方面極其 健康。其就烹飪而言及從營養角度來看極佳。許多美容品中使用茶籽油。在中國南部該油已用作烹飪長達幾個世紀且其創造出該油的更多用途。該油有助於預防及消除皺紋及妊娠紋。其亦藉由按摩該油進入指甲內用於增強及促進手指甲健康生長。該產品亦適用於調配經設計用來調理頭髮，及處理及防止頭髮損傷之化妝品。
山茶油係提取自茶樹之種子。此使得其為真正的茶油。另一方面，茶樹油並非來自茶樹。其來自澳洲本土稱為澳洲茶樹(Melaleuca alternifolia)之樹。山茶油有幾個品種。
˙山茶花油(Camellia japonica oil)-亦稱為日本茶油。然而，該植物不產茶葉。其為具有紅色花朵之開花植物。其油稱為椿油及其大量地用於化妝品應用中。
˙山茶樹(Camellia sinensis)油-其為茶籽油。
˙油茶樹(Camellia oleifera)油-其稱為茶油或山茶油。
該油係採用溶劑萃取或冷加工提取。可能聽說過冷濾油，但該冷濾油並非意指冷壓油。若用於製作油之內容物在油提取前經過加熱，則可能會改變該油中營養物之化學組成及性質，其通常係非天然的。然而，作為從斑點至昆蟲叮咬之各種問題之越來越受歡迎之療法及青草膏(vapour rub)的茶樹油正處於被歐盟禁用的威脅中。在臨床試驗發現使用者具有皮疹及過敏風險後，EU聲稱甚至係少量的未稀釋油亦可能不安全且不穩定。
使用濃度小於1%之油的化妝品諸如洗髮精及沐浴油係安全的。然而，生產純淨形式之自然療法之清潔用品及化妝品公司直到六月才說服科學家小組該油可安全地公開銷售。補充醫學研究所(Institute for Complementary Medicine)所長Frances Fewell指出「因為精油係天然產品，故大眾通常認為其一定安全」。「絕不應直接塗抹任何類型之精油至皮膚，而應先將其在適宜載油中稀釋。茶樹油已變得極受歡 迎，許多人已開始將其直接塗抹來處理粉刺及皮膚感染。事實上，其為極具刺激性之油。皮膚可能變乾、起泡或起疹子」。在一份措辭強硬的報告中，EU消費性產品科學委員會陳述其極度擔憂純淨油，其發現該純淨油對皮膚「嚴重刺激」及若暴露至空氣、光及熱時會「快速劣化」。
習知之包覆及微包覆方法包括海藻酸鹽包覆、聚氧亞甲基脲微包覆及錯合凝聚(明膠)微包覆。在上述情況中，微珠本身不具治療性且需要合成。在幾乎所有情況中，禁止將合成微粒使用於個人護理產品中，因此此等解決辦法不再可行且在技術上欠佳。
需要將山茶油之健康效益與較佳傳遞選項組合之新穎解決辦法及山茶油與其他存於山茶樹為主之物種中之天然物質之組合協同效應。
2.2 微珠
目前，已知顯著數量之個人護理產品諸如磨砂膏及牙膏包含數千個稱為微塑膠或更具體言之微珠之小塑料球。多年來，微珠已替代傳統的生物可降解替代品(諸如碎堅果殼(ground nut shells)及鹽晶體)。用於個人護理產品中之微珠主要由聚乙烯(PE)製成，但亦可由聚丙烯(PP)、聚對苯二甲酸乙二酯(PET)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)及尼龍製成。在產品使用後被沖下排水溝之情況下，微珠流過世界各地的污水系統然後進入河流及運河且最終直入海洋中，在此其造成塑料湯。通常，微塑膠定義為：尺寸小於5mm之塑料片或纖維。存於個人護理產品中之微珠幾乎總是小於1mm。
持續存於世界之主要問題在於全球大洋及其他海洋環境中塑料碎片之量。每年大量生產塑料，主要係因為其於現代世界之應用無窮多。根據紐約時報，全球每年生產約300,000,000噸塑料。由於其用途多樣及相對低成本，因此塑料生產在未來將繼續增加。塑料污染已達 到據估算損傷佔$130億美元之程度。此外，微塑料珠粒已成為世界海洋環境中之一顯著問題。
同時，微塑膠為通常不被注意之大工業。其被用於許多日常用品諸如開關、感測器及照明中。另外，其於日常化妝品諸如潔面乳、潤膚霜、口紅及牙膏中被用作去角質劑。術語「微塑膠」具體而言係指存於海洋環境中之小塑料片。一般而言，微塑膠之尺寸範圍在數μm至500μm(或0.50mm)，其幾乎是微觀的。微塑膠可源自多種來源，包括通常見於化妝品中之塑料微珠之生產。
包含微珠之化妝品因消費者滿意其所提供之潔淨感而在世界各地受到歡迎。事實上，已報告一半以上的女性每天使用四種或更多種美容品，且全球女性每年花費$4260億，其中一大部分由包含微珠之產品組成。微珠充作良好之去角質劑，此乃因其可經成形為可有效移除皮膚表面上之過量油及污物而不會粗糙或使皮膚脫去其精油之小球。重要地，應注意典型臉部磨砂膏包含約350,000個微珠。然而，該等由合成聚合物例如聚乙烯及/或聚丙烯塑料製成之微珠對環境具有不良影響。
許多州已引入且甚至通過禁止在州內銷售包含微珠之化妝品之法規。在2014年，伊利諾斯州禁止銷售包含塑料微珠之肥皂及沐浴乳，及加州及紐約州均引入相似的法案。描述在伊利諾斯州通過的新法案之文章報告「新法律要求合成微珠到2018年年底前要從製造業移除及在2019年結束前禁止銷售包含微珠之物品」。該法案係完全淘汰合成微珠之第一大步且亦賦予該議題國家性認同。化妝品公司支持該禁令且誓言要支持轉變為天然去角質劑，表明存在適宜替代品之潛在性的大市場。本文中，吾人揭示天然微珠在化妝品中之用途，亦即來自寬範圍之特定植物物種之以植物為主之孢子及花粉粒。
大多數個人護理產品包含傳統的塑料微珠，其係由聚乙烯及/或 聚丙烯化合物之有機聚合物組成。不幸地，該等塑料係不可分解的，此造成水生系統中之污染問題。然而，一種解決辦法係在微珠之製造中併入使用生物可降解塑料。將該等塑料製造成球狀微珠之方法與合成微珠之製造方法極其相似。除了微珠的組成、尺寸及形狀不同外，其硬度亦不同。硬度取決於特定應用，然而，其應足夠地硬，使得其可如所期地清潔皮膚。在目前的塑料污染速率下，傳統的聚丙烯及聚乙烯微珠不再是化妝品之適宜選項。雖然其之生產低廉，但其對環境之影響抵消成本效益且證實其為不可持續性的去角質劑。然而，生物可降解塑料之生產目前極其昂貴，因此，此乃其非廣泛使用之塑料之原因。因此，需要一種負擔得起且容易取得之天然微珠替代物。
在一個態樣中，本文提供經工程化以包覆所關注的化合物或物質之完整孢子。在一個具體實施例中，本文所述之完整孢子係經工程化以包覆所關注的化合物或物質及經塗佈試劑以利於自該完整孢子控制釋放該所關注的化合物或物質。在一個特定實施例中，本文所述之完整孢子係經工程化以包覆所關注的化合物或物質及有利於自該完整孢子控制釋放該所關注的化合物或物質之試劑。
在一個實施例中，完整孢子為冷杉(Abies)孢子、田頭菇(Agrocybe)孢子、黑麯黴(Aspergillus niger)孢子、枯草桿菌(Bacillus subtilis)孢子、小雞油菌(Cantharellus minor)孢子、附球孢菌(Epicoccum)孢子、南瓜(Cuburbita)孢子、小西葫蘆(Cucurbitapapo)孢子、靈芝(Ganomerma)孢子、石松(Lycopodium clavatum)孢子、勿忘草(Myosotis)孢子、青黴菌(Penicillium)孢子、黑團孢菌(Periconia)孢子、黑麥草孢子、提摩西草(Timothy grass)孢子、玉米(maize)孢子、大麻孢子、油菜麻(rape hemp)孢子、小麥孢子、蕁麻(Urtica dioica)孢子、向日葵孢子、玉米(corn)孢子、松樹孢子、香蒲(cattail)孢子、 油菜孢子、蒲公英孢子、黑麥孢子、酒神菊(Baccharis)孢子、小球藻(Chorella)、山茶(Camellia)孢子、豬草孢子、桑椹孢子或胡桃孢子。
在另一實施例中，完整孢子具有在0.5μm至300μm範圍內之尺寸。在另一實施例中，完整孢子具有在40μm至100μm範圍內之尺寸。在另一實施例中，完整孢子具有在1μm至40μm範圍內之尺寸。在另一實施例中，完整孢子具有在1μm至80μm範圍內之尺寸。
在一個實施例中，該所關注的化合物或物質為治療劑。在一些實施例中，該治療劑為有機小分子、肽、核酸、蛋白質、聚合物、生物劑、蛋白質之藥物製劑、草藥、無機化合物、有機金屬化合物、鋰、基於鉑之試劑或鎵。在另一實施例中，該所關注的化合物或物質為油。在另一實施例中，該所關注的化合物或物質為香味劑。在另一實施例中，該所關注的化合物或物質為清潔劑。在另一實施例中，該所關注的化合物或物質為消毒劑。在另一實施例中，該所關注的化合物或物質為殺蟲劑。在另一實施例中，該所關注的化合物或物質為草藥。在另一實施例中，該所關注的化合物或物質為食物成分。在一個實施例中，該食物成分為咖啡因。在另一實施例中，該所關注的化合物或物質為除草劑。在另一實施例中，該所關注的化合物或物質為燃料。
在另一態樣中，本文提供一種包含完整孢子及稀釋劑或載劑之調配物。
在另一態樣中，本文提供一種包含完整孢子及稀釋劑或醫藥上可接受之載劑之調配物。在一個實施例中，該調配物係用於局部投與。在另一實施例中，該調配物係用於非經腸投與。
在另一態樣中，本文提供一種治療個體中疾病或病症之方法，其包括調配物，其中該包覆於完整孢子中之治療劑係有益於治療該疾病或病症。
在另一態樣中，本文提供一種包含完整孢子之化妝品或個人護理產品。在另一態樣中，本文提供一種包含完整孢子之食品或飲品。在又另一態樣中，本文提供一種包含完整孢子之草藥產品。在另一態樣中，本文提供一種殺蟲劑。在另一態樣中，本文提供一種除草劑。
在另一態樣中，本文提供一種掩蔽化合物或物質之味道之方法，其包括將該化合物或物質包覆於完整孢子中及將該完整孢子調配於飲品或食品中。在一個實施例中，該包覆包括使化合物或物質與完整孢子接觸。在另一實施例中，該包覆包括使化合物或物質在真空壓力下與完整孢子接觸。在一些實施例中，該方法進一步包括向該完整孢子塗佈用於控制該化合物或物質自該孢子之釋放之試劑。
在另一態樣中，本文提供一種改良化合物或物質之穩定性之方法，其包括將該化合物或物質包覆於天然生成之完整孢子中。在一些實施例中，該包覆包括使化合物或物質與完整孢子接觸。在其他實施例中，該包覆包括使化合物或物質在真空壓力下與完整孢子接觸。在一些實施例中，該方法進一步包括向完整孢子塗佈用於控制該化合物或物質自完整孢子釋放之試劑。
在另一態樣中，本文提供一種使皮膚去角質之方法，其包括使個體之皮膚與包含完整孢子之調配物接觸。
在另一態樣中，本文提供一種使皮膚去角質之方法，其包括使個體之皮膚與包含經工程化以包覆有益於或適用於化妝或個人護理產品中之化合物或物質之完整孢子之調配物接觸。
在另一態樣中，本文提供一種降低化合物或物質之毒性之方法，其包括將該化合物或物質包覆於天然生成之完整孢子中。在一個實施例中，該包覆包括使化合物或物質與完整孢子接觸。在另一實施例中，該包覆包括使化合物或物質在真空壓力下與完整孢子接觸。在又另一實施例中，該方法進一步包括向完整孢子塗佈用於控制該化合 物或物質自完整孢子釋放之試劑。
在另一態樣中，本文提供一種製備包含所關注的化合物或物質及完整孢子之調配物之方法，其包括將所關注的化合物或物質包覆於完整孢子中。
圖1A-1F. 天然石松孢子及包覆生物大分子之處理技術之示意圖。圖1A：描繪分布於內部包含天然孢原質成分之表面上之均勻脊線之孢子微結構，該等孢子係源自具有螺旋排列之葉子之維管植物。圖1B：懸浮在用於吸收大分子之生物大分子溶液中之天然孢子，放大插圖描繪經過位於石松微結構中之奈米通道之大分子入口。圖1C：指示包覆生物大分子之孢子連同天然孢原質成分。呈現所使用的三種不同微包覆技術。圖1D：涉及於500rpm之攪拌下在4℃之大分子水溶液中培養天然孢子之被動式大分子加載技術。圖1E：涉及壓縮乾孢子粉及在用於藉由孢子吸收大分子之大分子溶液中培養所得孢子錠劑之壓縮技術。圖1F.涉及對包含天然孢子及大分子之懸浮液施加真空之真空加載技術，藉此生物大分子通過位於天然孢子之表面微結構中之奈米通道進入孢子。
圖2A-2D. FlowCam測量：聚合物微球標準(50±1μm)(Thermoscientific,USA)。圖2A：使用1000次良好聚焦的影像分析在顆粒計數為5000且ESD為49.65±0.91μm之測量後之等效球形直徑相對頻率之代表性直方圖。圖2B：來自圓度相對頻率之直方圖之代表圖，表明微球體極接近理想圓值(1)。圖2C：邊緣梯度相對頻率之直方圖，表明良好聚焦的微球體。圖2D：使用FC200流動池於0.1ml/min之流速下在20X放大率下微球體之代表性影像。
圖3A-3H. 於生物大分子加載之前及之後藉由FlowCam®之天然石松孢子之特徵分析：就10,000個孢子之顆粒計數而言於BSA加載之前 及之後藉由動態成像顆粒分析(DIPA,FlowCam®)之尺寸及圓度。作為天然孢子(圖3A)、被動式加載(圖3B)、壓縮加載(圖3C)及真空加載技術(圖3D)呈現來自擬合至於包覆生物大分子之前及之後之孢子之等效球形直徑、圓度及邊緣梯度之直方圖之曲線之代表圖。圖3E、3F、3G及3H分別呈現藉中FlowCam®捕捉之在20x放大率下之加載前、以及被動式、壓縮及真空加載技術之天然孢子。
圖4 於生物大分子加載之前及之後藉由掃描電子顯微鏡(SEM)進行之天然石松孢子之特徵分析：SEM影像圖4A、圖4B、圖4C及圖4D分別呈現藉由FESEM(JEOL，日本)捕捉之加載之前、以及被動式、壓縮及真空加載技術之天然孢子。
圖5A-5D. 生物大分子加載之前及之後天然石松孢子之共焦顯微鏡分析：圖5A列中之CLSM影像為BSA加載前之天然石松孢子。該等天然孢子因存在類萜、酚類及類胡蘿蔔素分子而展現自體螢光。觀察到孢子的天然孢原質成分作為於藍色及紅色通道連同無生物大分子加載之天然孢子之重疊影像中之在孢子內部的微小球，及亦明顯不存在任何綠色螢光。圖5B列描繪使用被動式加載技術之經BSA加載之孢子。圖5C列描繪使用壓縮加載技術之經BSA加載之孢子。圖5D列描繪使用真空加載技術之經BSA加載之孢子。所有該等孢子微粒於綠色通道中因存在FITC-BSA而展現綠色，及該等重疊影像指示存在孢子成分以及經包覆之生物大分子。(比例尺為10μm)。
圖6A-6B. 來自共焦雷射掃描顯微鏡(CLSM)之Z-堆疊影像，其顯示於FITC-BSA加載後(圖6A)及FITC-BSA加載前(圖6B)石松(L.clavatum)孢子之35個光學斷面。
圖7A-7D. 經生物大分子加載之天然石松孢子之活體外釋放曲線：圖7A：模擬胃液(SGF),pH 1.2介質、及圖7B：模擬腸液(SIF),pH 7.4介質中藉由被動式、壓縮及真空加載之經BSA加載之孢子之 累積釋放曲線。使用經真空加載之孢子來實現可調釋放之進一步最佳化及於不同海藻酸鹽塗佈後經真空加載之孢子之累積釋放曲線顯示於圖7C：SGF,pH 1.2介質、及圖7D：SIF,pH 7.4介質中。所有活體外釋放研究係重複進行三次(n=3)及呈現平均值與標準偏差。
圖8A-8C. 於pH 7.4介質中自藉由不同技術製得之天然孢子釋放FITC-BSA後之CLSM影像：圖8A列：被動式加載技術；圖8B列：壓縮加載技術；及圖8C列：真空加載技術。(比例尺為10μm)。
圖9A-9C. 塗佈後石松孢子之掃描電子顯微鏡影像。影像分別呈現經0.5%海藻酸鹽塗佈之孢子(圖9A)、經1%海藻酸鹽塗佈之孢子(圖9B)及經2%海藻酸鹽塗佈之孢子(圖9C)。
圖10A-10D. 藉由不同技術處理以包覆大分子之天然向日葵花粉粒之示意圖。圖10A：展現表面上具有均勻尖峰之特徵性卵形之乾燥天然花粉粒。圖10B：懸浮在用於藉由被動式、壓縮及真空技術包覆之大分子水溶液中之花粉粒。圖10C：顯示載有大分子之完全水合天然花粉粒以及初始花粉內容物。圖10D：自花粉粒壁中之天然孢子釋放大分子後之完全水合天然花粉粒。
圖11A-11C. 藉由FlowCam®進行之於BSA加載之前及之後天然向日葵花粉之特徵分析：針對BSA加載之前及之後之10,000個花粉粒之顆粒計數，藉由動態成像顆粒分析(DIPA,FlowCam®)得到的尺寸及圓度。來自擬合至(圖11A)等效球形直徑相對頻率、(圖11B)圓度相對頻率、及(圖11C)邊緣梯度相對頻率之直方圖之曲線之代表圖。
圖12A-12D. 藉由SEM進行之BSA加載之前及之後天然向日葵花粉之特徵分析：圖12A、12B、12C及12D中之影像分別呈現在FlowCam®中於20x放大率下捕捉之於加載前之天然花粉粒以及於被動式、壓縮及真空加載技術後之天然花粉粒。
圖13A-13D. 藉由SEM進行之BSA加載之前及之後天然向日葵花 粉之特徵分析：圖13A呈現加載前之天然花粉粒及圖13B、13C及13D中之影像分別指示藉由FESEM(JEOL，日本)捕捉之藉由被動式、壓縮及真空加載技術加載大分子之花粉粒。
圖14A-14D. 大分子加載之前及之後天然向日葵花粉粒之共焦顯微鏡分析：圖14A列中之CLSM影像為BSA加載前之天然向日葵花粉粒。圖14B列中，使用被動式加載技術之經BSA加載之花粉粒。圖14C列中，使用壓縮加載技術之經BSA加載之花粉粒。圖14D列中，使用真空加載技術之經BSA加載之花粉粒。(比例尺為10μm)。
圖15A-15B. 來自共焦雷射掃描顯微鏡之Z堆疊影像，顯示於FITC-BSA加載後(圖15A)、及於FITC-BSA加載前(圖15B)花粉粒之50個光學斷面。
圖16A-16C. 活體外釋放曲線：模擬腸液，pH 7.4介質(圖16A)；模擬胃液，pH 1.2介質(圖16B)；塗佈海藻酸鹽之經BSA加載之花粉粒之釋放曲線(圖16C)。
圖17A-17D. 海藻酸鹽塗佈後之花粉粒之掃描電子顯微鏡影像。圖17A及17B列中之影像呈現於1min及10min培養時間後之經0.1%海藻酸鹽塗佈之花粉粒及圖17C及圖17D列中之影像呈現於1min及10min培養時間後之經0.5%海藻酸鹽塗佈之花粉粒。
圖18A-18D. 於2%海藻酸鹽塗佈之前及之後花粉粒之掃描電子顯微鏡影像。圖18A及18B：於塗佈製程前之天然花粉粒。圖18C：於海藻酸鹽塗佈後之完整花粉粒。圖18D：呈現經海藻酸鹽覆蓋之花粉表面。
圖19A-19C. 於pH 7.4介質中自藉由不同技術製得之花粉粒釋放FITC-BSA後之CLSM影像：被動式技術(圖19A列)、壓縮技術(圖19B列)及真空技術(圖19C列)。(比例尺為10μm)。
圖20A-20C. 經5-FU加載之石松孢子調配物之特徵分析。藉由動 態成像顆粒分析(DIPA)以1000之顆粒計數分析直徑、圓度、縱橫比及邊緣梯度。將具有來自三次測量之標準偏差及擬合至直方圖之曲線之代表圖呈現為直徑相對頻率(圖20A)、圓度相對頻率(圖20B)、縱橫比相對頻率(圖20C)及邊緣梯度相對頻率(圖20D)。
圖21A-21D. 經5-FU加載之石松孢子之動態成像顆粒分析影像。圖21A、21B、21C及21D中之影像分別呈現於藉由被動式、壓縮及真空加載技術加載5-FU之前及之後之石松孢子。
圖22A-22D. 藉由SEM進行之經5-FU加載之石松孢子之特徵分析。圖22A、22B、22C及22D中之SEM影像呈現加載前(圖22A)及藉由被動式(圖22B)、壓縮(圖22C)及真空(圖22D)加載技術加載後之石松孢子。
圖23A-23B. 藉由SEM進行之經Eudragit RS100塗佈之石松孢子之特徵分析。圖23A：塗佈2.5% Eudragit RS100後之經5-FU加載之孢子。圖23B：塗佈10% Eudragit RS100後之經5-FU加載之孢子。
圖24A-24C. 經5-FU加載之石松孢子之活體外釋放曲線。藉由被動式、壓縮及真空加載經5-FU加載之孢子(圖24A)於模擬胃液(SGF pH 1.2)及(圖24B)於模擬腸液(SIF),pH 7.4磷酸鹽緩衝鹽水中之累積釋放曲線。圖24C：於Eudragit RS100塗佈後於SGF及SIF中5-FU自經真空加載之孢子之控制釋放，及插圖指示2小時內於SGF中之5-FU釋放。所有活體外釋放研究皆重複進行三次(n=3)並呈現平均值與標準偏差。
圖25A-25C. 基於習知真空加載方案之天然松樹花粉中BSA加載之特徵分析。圖25A：描繪經BSA加載之松樹花粉相對於洗滌之表面潔淨度的SEM影像。圖25B：相對於洗滌之包覆效率及加載效率。圖25C：描繪FITC-BSA之定位之CLSM影像。
圖26. 描繪FITC-BSA於天然松樹花粉中之短期被動式加載趨勢 之CLSM影像。
圖27. BSA/FITC-BSA於天然松樹花粉中之長期被動式加載趨勢。描繪被動式加載期間FITC-BSA之吸收及定位之CLSM影像。
圖28. 描繪FITC-BSA於天然山茶花粉中之短期被動式加載趨勢之共焦雷射掃描顯微鏡(CLSM)。
圖29A-29B. 鈣黃綠素加載之前及之後石松孢子之共焦雷射掃描顯微鏡(CLSM)分析。圖29A：第一列中之CLSM影像指示具有孢原質之孢子。圖29B：第二列中之CLSM影像指示加載至孢子中之鈣黃綠素。比例尺為10μm。
圖30. 以山茶花粉為主的調配物中山茶籽油及尼羅紅染料摻合物之共焦雷射掃描顯微鏡(CLSM)影像。
圖31A-31B. 山茶花粉粒及孢粉素外壁膠囊(SEC)之尺寸及形態學特徵分析。圖31A：山茶花粉及SEC之FlowCam分析。圖31B：山茶花粉(左)及SEC(右)之FlowCam分析。
圖32A-32B. 藉由SEM進行之經咖啡因(CF)加載之石松孢子之特徵分析。圖32A：CF加載前之孢子。圖32B：CF加載後具有共包覆劑ERS之孢子。比例尺為10μm。
圖33A-33B. 鈣黃綠素-CF加載之前及之後石松孢子之共焦雷射成像顯微鏡(CLSM)分析。圖33A中之CLSM影像描繪具有孢原質之孢子。圖33B描繪將CF-鈣黃綠素加載至具有共包覆劑ERS之孢子中。
圖34. 咖啡因(CF)自石松孢子調配物之活體外釋放曲線。於模擬唾液流體(SSF)中之孢子-CF物理混合物及經CF加載並具有共包覆劑ERS。
圖35A-35B. 咖啡因調配物之味道掩蔽評估。圖35A：苦味閾值測試期間人類志願者之苦味評分。圖35B：針對調配有物理混合物石松孢子及ERS之CF之人類志願者評分。
圖36. 經UV-臭氧處理之山茶花粉之接觸角數據，顯示接觸角隨著UV-臭氧處理持續時間之增加而減小。
圖37. 經或未經UV/臭氧處理之山茶花粉粒之掃描電子顯微鏡影像。經處理意指花粉已經脫脂且經UV-臭氧暴露處理。
圖38. 未經處理及經UV-臭氧處理之山茶花粉之水性懸浮液。
圖39. 未經處理及經UV-臭氧處理之山茶SEC之掃描電子顯微鏡影像。經處理意指花粉已經脫脂且經UV-臭氧暴露處理。
圖40. 未經處理及經UV-臭氧處理之山茶SEC之水性懸浮液。
圖41A-41C. 水性懸浮液。圖41A：山茶籽油及水。圖41B：經加載、經乙醇洗滌且經UV-臭氧處理之山茶SEC油。圖41C：山茶SEC。
圖42. 於山茶花粉粒及SEC中之大分子包覆。
圖43. 獲得經脫脂天然花粉粒之製程示意圖。
圖44. 完整孢子微珠實例之SEM影像。
在一個態樣中，本文提供經工程化以包覆所關注的化合物或物質之完整孢子。在另一態樣中，本文提供經工程化以包覆所關注的化合物或物質及經塗佈試劑以利於自完整孢子控制釋放該化合物或物質之該完整孢子。在另一態樣中，本文提供經工程化以包覆所關注的化合物或物質及有利於自完整孢子控制釋放該化合物或物質之具有該化合物或物質之試劑之完整孢子。
在一個具體實施例中，經工程化以包覆所關注的化合物或物質之完整孢子具有非顯著量之黏附至完整孢子表面之化合物或物質。在本文中，「非顯著量」意指完整孢子之外部保持其天然結構特徵及在微尺度上之表面外觀(例如，表面粗糙度)，如使用相關技術中已知的標準測量技術(例如，掃描電子顯微鏡)以高可信度評估。在一個替代性實施例中，係關於經工程化以包覆所關注的化合物或物質之完整孢 子，其中一定百分比之化合物或物質黏附至完整孢子之表面。例如，在一個實施例中，該經工程化以包覆所關注的化合物或物質之完整孢子具有超過1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%之化合物或物質黏附至完整孢子之表面。
在一個具體實施例中，經工程化以包覆所關注的化合物或物質之完整孢子保持完整孢子之一般尺寸、形狀及形態而不包覆該化合物或物質。在另一實施例中，經工程化以包覆所關注的化合物或物質之完整孢子保持完整孢子之一般形態而不包覆該化合物或物質。在另一實施例中，經工程化以包覆所關注的化合物或物質之完整孢子保持完整孢子之一般尺寸而不包覆該化合物或物質。在另一實施例中，經工程化以包覆所關注的化合物或物質之完整孢子保持完整孢子之一般形狀而不包覆該化合物或物質。在一些實施例中，經工程化以包覆所關注的化合物或物質之完整孢子之尺寸相對無包覆之完整孢子膨脹。例如，在一個實施例中，經工程化以包覆所關注的化合物或物質之完整孢子膨脹至超過未包覆化合物或物質之完整孢子之尺寸10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%、125%、150%、175%或200%。
在一些實施例中，完整孢子係經工程化以包覆所關注的化合物或物質，以使得該化合物或物質之效應局限於完整孢子所施覆之位置。在某些實施例中，完整孢子係用於包覆所關注的化合物或物質以保護該化合物或物質免遭苛刻環境條件(例如，暴露於UV光)影響，或免遭降解，以保留化合物或物質的效力。在一些實施例中，完整孢子係用於包覆所關注的化合物或物質以穩定該化合物或物質。在某些實施例中，完整孢子係用於包覆所關注的化合物或物質以降低該化合物或物質在個體中之毒性。在一些實施例中，完整孢子係用於包覆所關 注的化合物或物質以掩蔽該化合物或物質之味道。在某些實施例中，完整孢子係用於包覆所關注的化合物或物質以控制該化合物或物質之釋放。在一個具體實施例中，完整孢子係用於共包覆所關注的化合物或物質及允許改良該化合物或物質之釋放速率之試劑。在另一個具體實施例中，完整孢子係用於包覆所關注的化合物或物質且經塗佈允許改良該化合物或物質之釋放速率之試劑。例如，用於農業中之生物活性物質諸如強效殺蟲劑、除草劑及肥料需要允許改良其穩定性及釋放速率以使其環境影響最小化之方法。
就在藥物、化妝品及食品中之應用而言，可通過包覆增效化合物獲得增強之效應，及總體而言，使用完整孢子提供在針對寬範圍應用之加工複雜性及成本方面之顯著效益。該方法顯著地降低將材料包覆於外壁強化微膠囊中之加工需求，同時亦利用完整孢子(例如，天然花粉)之固有治療效益。
特定言之，使用完整孢子較使用外壁殼來包覆所關注的化合物或物質存在許多優點。例如，使用完整孢子可避免自孢子化學提取外壁殼所涉及之額外成本。此外，經化學提取之外壁殼需要在用作口服產品中之添加劑前經過監管機構批准，而天然生成之孢子通常可在現存的口服產品(例如，健康食品)中得到。另外，得自天然生成來源之完整孢子可輕易地以低成本大量得到。雖然得自天然生成來源之完整孢子通常以約$20至$30/kg銷售，但提取外壁膠囊使生產成本提高至約$3500至$35,000/kg。市售的提取外壁膠囊通常以約$200,000/kg銷售。
完整孢子優於現有方法、裝置或材料之其他優點及改良處例如包括：
˙副作用相較於未經包覆之山茶油減小。
˙山茶油可包覆於水性調配物中。
˙保護山茶油免遭環境降解。
˙隨時間控制釋放油。油可隨時間以受控方式擴散通過天然花粉孔隙。此外，花粉粒完整孢子自身將逐漸地溶解於生物流體中，從而導致穩定且完全之釋放。
˙山茶花粉完整孢子及山茶油之協同健康效益。
來自不同類型之特定植物物種之植物孢子及花粉粒為天然產生、可再生供應大量、每個物種高單分散性、機械性強、具化學回彈性、生物可降解、生物相容及具有各種不同物種特異性表面粗糙度之微尺度顆粒。此外，就所有花粉物種而言，存在可匹配微珠之工業需求的寬尺寸範圍。因為植物孢子及花粉粒係自然界製造的，故生產成本最小，且鑑於吸引人的性質組合，微尺度植物孢子及花粉粒係化妝品中塑料微珠之極吸引人的替代品。該等考量係重要的，因為成本及生產容易度為關於尋找微珠替代品之兩個最大問題。
完整孢子優於現有方法、裝置或材料之其他優點及改良處例如包括：
˙藉由植物自然產生係在全球發生及產生極大量的微粒。若需要，進一步的簡單加工可產生具有小於6wt%蛋白質之無蛋白質微膠囊。
˙各植物物種產生高度單分散性微粒用於取決於應用需求之可調尺寸。
˙植物孢子及花粉粒之範圍涵蓋滿足工業需求之寬廣尺寸範圍。
˙植物孢子及花粉粒係生物可降解的且允許有機再循環。
˙可控制表面塗層之親水性/疏水性以支持水過濾及防止堵塞。
˙來自不同物種之孢子及粒子之表面粗糙度可變及可用於不同 化妝品應用中。
個人護理產品諸如護唇膏、除臭劑、眼線筆、口紅、洗劑、漱口水、洗髮精、調理劑、化妝品、刮鬍膏、牙膏及許多其他產品均係出於個人衛生及/或美化而用於人體。該等產品中許多包含已證明會負面影響環境之合成塑料。併入生物可降解且/或天然之微珠至個人護理產品中將減低水污染同時仍提供與合成塑料相同的用途。植物孢子及花粉粒具有與塑料微珠極相似的性質，此使得其具有在化妝品中作為天然微珠之潛力。實際上，微珠必須為球形以便恰當地去角質及清潔消費者皮膚。目前用於個人護理產品中之不可生物降解之塑料之尺寸在10μm至100μm(0.01mm-0.10mm)之範圍內。所有該等特徵使得植物孢子及花粉粒極有潛力作為用於前述商業應用之替代品。
5.1 完整孢子
如本文所使用，術語「完整」在孢子之背景內容中意指包括外壁殼、內壁層及其中之胞質微器之孢子。術語「完整」在孢子之背景內容中排除任何由或基本上由僅外壁殼或其片段組成之孢子。換言之，完整孢子包含單獨的外壁殼所缺失之其他組分。在一個具體實施例中，完整孢子保留孢子之主要組分(例如，外壁殼、內壁層及胞質微器)之50%以上(較佳地，55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上)。在一些實施例中，完整抱子包括外壁殼、內壁層、胞質微器及其他在自然界中存在之與孢子相關聯之組分(例如，外壁內層(endexine)、中層(nexine)、蛋白質、脂質、核酸等)。
在某些實施例中，完整孢子具有在0.5μm至300μm範圍內之尺寸。在一些實施例中，完整孢子具有在1μm至100μm範圍內之尺寸。在某些實施例中，完整孢子具有在10μm至100μm範圍內之尺寸。在 一些實施例中，完整孢子具有在3μm至80μm範圍內之尺寸。在某些實施例中，完整孢子具有在0.5μm至40μm範圍內之尺寸。在一些實施例中，完整孢子具有在40μm至300μm範圍內之尺寸。在某些實施例中，完整孢子具有在0.5μm至300μm範圍內之尺寸。在一些實施例中，完整孢子具有在40μm至100μm範圍內之尺寸。在某些實施例中，完整孢子具有在1μm至40μm範圍內之尺寸。
在某些實施例中，完整孢子包含有益於個體之組分。在一些實施例中，完整孢子包含具治療價值之組分。在一個具體實施例中，完整孢子具有解毒性質。
如本文所使用，術語「外壁殼」意指孢子或花粉粒之抗乙酸解生物聚合(例如，孢粉素)外層塗層。孢子之外壁殼可藉由相關技術中已知的技術單離得到，包括，例如，藉由有機溶劑、鹼、酸及/或酵素連續處理以移除孢子之其他組分，諸如纖維素內壁層及可附著至或包含於外壁殼中之脂質、蛋白質及核酸組分。外壁殼呈基本上中空膠囊之形式，其通常包括孢粉素。
如本文所使用，術語「孢子」不僅指通常定義為無性生殖單元之真孢子，包括內孢子，及因此如由不開花植物、細菌、真菌、藻類、蕨類及蘚類所產生者，而且指通常定義為有性生殖單元之花粉粒，及因此由具有種子之植物(種子植物)所產生者。除非另有陳述，否則術語「花粉粒」及「花粉」在本文中可互換使用。
在一個具體實施例中，孢子為花粉。在一個實施例中，孢子為蜂花粉、樹花粉、花卉花粉、松花粉或草花粉。在另一個實施例中，孢子為植物孢子。在另一個實施例中，孢子為真菌孢子。在另一個實施例中，孢子為細菌孢子。在一些實施例中，孢子為冷杉孢子、田頭菇孢子、黑麯黴孢子、枯草桿菌孢子、小雞油菌孢子、附球孢菌孢子、南瓜孢子、小西葫蘆孢子、靈芝孢子、石松孢子、勿忘草孢子、 青黴菌孢子、黑團孢菌孢子、黑麥草孢子、提摩西草孢子、玉米(maize)孢子、大麻孢子、油菜麻孢子、小麥孢子、蕁麻孢子、向日葵孢子(例如，丈菊(Helianthus annuus)孢子)、松樹孢子(例如，火炬松(Pinus taeda)孢子)、玉米(corn)孢子(例如，玉蜀黍(Zea mays)孢子)、香蒲孢子(例如，水燭(Typha angustifolia)孢子)、油菜孢子(例如，西洋油菜(Brassica napus)孢子)、蒲公英孢子(例如，西洋蒲公英(Taraxacum offinale)孢子)、黑麥孢子(例如，裸麥(Secale cereale)孢子)、東部酒神菊孢子(例如，香根菊(Baccharis halimifolia)孢子)、小球藻孢子(例如，微藻(Chorella sorkiniana)孢子)、日本山茶孢子(例如，山茶花(Camellia japonica)孢子)、豬草孢子(例如，豚草(Ambrosia artemisifolia)孢子)、桑椹孢子(例如，黑桑(Morus nigra)孢子)或胡桃孢子(例如，山核桃(Carya illinoinesis)孢子)。孢子及花粉粒之實例及其對應之尺寸(直徑，單位為mm)列於表1中。
在一個具體實施例中，根據本文揭示內容使用之完整孢子為天然生成之孢子。如本文所使用，術語「天然生成」在孢子之背景內容中意指孢子係由在自然界中存在之活生物產生。在某些實施例中，根據本文揭示內容使用之完整孢子係得自天然生成來源。如本文所使 用，術語「天然生成來源」為在自然界中存在之活生物。在一些實施例中，天然生成來源為植物、細菌、真菌、藻類、蕨類、蘚類或其他產生孢子之生物(不論係原核或真核)。在一個實施例中，天然生成之生物為植物、蕨類或蘚類。在另一個實施例中，天然生成之生物為細菌。在另一個實施例中，天然生成之生物為藻類。在另一個實施例中，天然生成之生物為真菌。在一些實施例中，天然生成之生物為冷杉、田頭菇、黑麯黴、枯草桿菌、小雞油菌、附球孢菌、南瓜、小西葫蘆、靈芝、石松、勿忘草、青黴菌、黑團孢菌、黑麥草、提摩西草、玉米(maize)、大麻、油菜麻、小麥、蕁麻、向日葵(例如丈菊)、松(例如火炬松)、玉米(corn)(例如玉蜀黍)、香蒲(例如水燭)、油菜(例如西洋油菜)、蒲公英(例如西洋蒲公英)、黑麥(例如裸麥)、東部酒神菊(例如香根菊)、小球藻(例如微藻)、日本山茶(例如山茶花)、豬草(例如豚草)、桑椹(例如黑桑)或胡桃(例如山核桃)。在一個具體實施例中，天然生成之生物為述於下文實例部分中之物種。在一個具體實施例中，天然生成之生物為石松或另一來自相同家族之物種。在另一個具體實施例中，天然生成之生物為山茶。在另一個具體實施例中，天然生成之生物為松樹。
在某些實施例中，根據本文揭示內容所使用之完整孢子係得自產生孢子之經基因改造之活生物。在一些實施例中，經基因改造之活生物為植物、細菌、真菌、藻類、蕨類、蘚類或其他產生孢子之生物(不論係原核或真核)。在一個實施例中，經基因改造之活生物為植物、蕨類或蘚類。在另一個實施例中，經基因改造之活生物為細菌。在另一個實施例中，經基因改造之活生物為藻類。在另一個實施例中，經基因改造之活生物為真菌。在一些實施例中，經基因改造之活生物為冷杉、田頭菇、黑麯黴、枯草桿菌、小雞油菌、附球孢菌、南瓜、小西葫蘆、靈芝、石松、勿忘草、青黴菌、黑團孢菌、黑麥草、 提摩西草、玉米(maize)、大麻、油菜麻、小麥、蕁麻、向日葵(例如丈菊)、松(例如火炬松)、玉米(corn)(例如玉蜀黍)、香蒲(例如水燭)、油菜(例如西洋油菜)、蒲公英(例如西洋蒲公英)、黑麥(例如裸麥)、東部酒神菊(例如香根菊)、小球藻(例如微藻)、日本山茶(例如山茶花)、豬草(例如豚草)、桑椹(例如黑桑)或胡桃(例如山核桃)之經基因改造之變體。在一個具體實施例中，經基因改造之活生物為述於下文實例部分之物種之經基因改造之變體。在一個具體實施例中，經基因改造之活生物為石松或另一來自相同家族之物種之經基因改造之變體。在另一個具體實施例中，經基因改造之活生物為山茶之經基因改造之變體。在另一個具體實施例中，經基因改造之活生物為松花粉之經基因改造之變體。
經基因改造之生物可為已經過基因改造以具有有益性質之天然生成之生物。在一個實施例中，經基因改造之生物為已經過基因改造以減低一或多種過敏原(例如，致敏蛋白質)之產生之天然生成之生物。在另一個實施例中，經基因改造之生物為已經過基因改造以具有已知為過敏原之蛋白質之經改變形式之天然生成之生物。在另一個實施例中，經基因改造之生物為已經過基因改造以產生高於正常量之孢子之天然生成之生物。
在某些實施例中，根據本文揭示內容使用之完整孢子係自產生孢子之天然生成來源或經基因改造之生物單離得。在一些實施例中，完整孢子係自亦包含非孢子污染物之生物基質單離得。非孢子污染物之實例包括(但不限於)植物或天然碎屑，諸如，土壤、石頭、枝條、葉子、花瓣、蠟、樹脂、花蜜及其類似物之碎片。熟悉此項技術者已知用於單離完整孢子之技術，且包括(例如)篩選基質以單離得孢子及移除非孢子污染物。在一些實施例中，完整孢子之單離包括清除孢子的污染物及清潔孢子之任何附著表面之化合物。在一些實施例中，所 單離的完整孢子係5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%不含非孢子污染物。
在一些實施例中，根據本文揭示內容使用之完整孢子已經過結構改良。完整孢子可在自產生孢子之天然生成來源或經基因改造之生物單離後進行改良。在某些實施例中，可改良完整孢子之一種、兩種、三種或所有以下結構特徵：(i)可改良孢子之表面(例如，可改變表面粗糙度)，(ii)可改良孢子之尺寸，(iv)可改良孢子之形狀及/或(v)可改良孢子的結構穩固性(例如，已增強或減弱孢子的抗機械壓力性)。可採用相關技術中已知之任何技術來改良孢子之結構特徵，只要保留完整孢子之組分即可。例如，可藉由暴露於緩衝液、特定pH或pH範圍、或特定溫度或溫度範圍來改良孢子之結構特徵。關於改良完整孢子之結構特徵之方法以及已經歷該等改良之完整孢子，參見，例如，下文章節5.4及實例部分。
在某些實施例中，根據本文揭示內容使用之完整孢子已在自產生孢子之天然生成來源或經基因改造之生物單離之前、期間或之後經過處理。孢子可以任何方式處理，只要保留完整孢子之組分即可。在一些實施例中，根據本文揭示內容使用之完整孢子已經暴露至溶劑。在某些實施例中，該溶劑為有機或無機溶劑。在一些實施例中，有機溶劑為甲醚、乙醚、二乙醚、丙酮、乙醇、甲醇、N-甲基吡咯啶酮、二甲基甲醯胺、二氯甲烷、乙二醇二甲醚、甲基亞碸、乙酸乙酯、三氟乙酸、四氫呋喃、任何類似的有機溶劑或其組合。在某些實施例中，該溶劑為水，及孢子之處理包括在已單離完整孢子之後洗滌孢子。
在某些實施例中，根據本文揭示內容使用之完整孢子已經過洗滌步驟。洗滌步驟可在孢子已經過處理，諸如化學處理(例如溶劑)之前或之後進行。或者或另外，洗滌步驟可在自產生孢子之天然生成來 源或經基因改造之生物單離得完整孢子之後進行。在一些實施例中，洗滌包括自孢子移除表面黏附污染物及/或天然生成之表面黏附脂質樣化合物(通常稱為花粉鞘(pollenkitt))。在一些實施例中，使根據揭示內容使用之完整孢子脫脂以最小化孢子的過敏性。「脫脂」孢子係指已移除其表面蛋白質或其他表面黏附污染物之孢子。在一些實施例中，脫脂孢子係藉由在有機溶劑(例如，乙醚)中洗滌孢子獲得。
在一些實施例中，如圖43中所說明，使山茶油及山茶花粉粒或其衍生物以10：1或更小之油：花粉質量比溶解於水或其他水性懸浮液中。可將油及乾燥花粉粒混合直到形成均勻漿液。在一個較佳實施例中，油係包覆在花粉粒內部，此舉可藉由冷凍乾燥樣本或相關技術中已知之其他加載方法實現。花粉粒亦可經紫外(UV)光及臭氧處理以使其成為親水性及因此可溶於水性懸浮液中。較佳之UV光及臭氧處理係在大氣壓下藉由在185nm及254nm兩種波長下產生之UV光進行。結果，包覆在花粉粒內部之油可與水混合以獲得所選山茶綠茶油或其他油之水性懸浮液。在一個較佳實施例中，在進行加載之前先藉由UV-臭氧處理花粉粒以最佳化加載。
在一些實施例中，根據本文揭示內容使用之完整孢子在自產生孢子之天然生成來源或經基因改造之生物單離之前、期間或之後尚未經過加工。在某些實施例中，根據本文揭示內容使用之完整孢子尚未暴露於溶劑，諸如有機溶劑(例如，甲醚、乙醚、二乙醚、丙酮、乙醇、甲醇、N-甲基吡咯啶酮、二甲基甲醯胺、二氯甲烷、乙二醇二甲醚、甲基亞碸、乙酸乙酯、三氟乙酸、四氫呋喃、任何類似的有機溶劑或其組合)或無機溶劑。
在一個具體實施例中，根據本文揭示內容使用之完整孢子不被認為具過敏性。例如，一般而言，花粉過敏係由於花粉之高濃度之空氣暴露組合過敏性個體之遺傳傾向所致。用於食品中之花粉粒通常很 少引起過敏反應病例，因為其等係經口而非通過呼吸系統攝入。另外，花粉被美國食品及藥物管理局基本認為安全(GRAS)。
在某些實施例中，經選擇用於包覆之完整孢子尤其取決於意欲包覆在完整孢子中之化合物或物質、包含完整孢子之調配物及調配物之所欲用途。在一個具體實施例中，使用大於40μm之完整孢子來包覆食品或其組分或草藥。在一個實施例中，使用松花粉、玉米花粉或黑麥花粉作為用來包覆食品或其組分或草藥之完整孢子。
在某些實施例中，經選擇用於包覆之完整孢子尤其取決於包覆在完整孢子中之化合物或物質、包含完整孢子之調配物及調配物之所欲用途。在一個具體實施例中，使用小於40μm(但大於0)之完整孢子來包覆治療劑。在一個實施例中，使用石松孢子、向日葵花粉或山茶花粉作為用來包覆治療劑之完整孢子。
在具體實施例中，使用向日葵花粉作為完整孢子以包覆用於標靶腸傳遞之所關注的化合物或物質(例如，治療劑)。
5.2 適於包覆在完整孢子中之化合物及物質
可將所關注的任何化合物或物質包覆在完整孢子中。如本文所使用，術語「包覆」及其同源詞在完整孢子之背景內容中意指藉由吸附、黏著或結合(不論是否係化學性質或物理性質)吸收化合物或物質於完整孢子之內部核心中。術語「包覆」可與術語「加載」或「吸收」及其同源詞互換使用。如本文所使用，術語「吸附」及其同源詞係指吸收及吸附。關於包覆所關注的化合物及/或物質於完整孢子中之方法、共包覆所關注的化合物及/或物質及控制化合物及/或物質自完整孢子釋放之速率之試劑於完整孢子中之方法、及使完整孢子塗佈控制化合物及/或物質自完整孢子釋放之速率之試劑之方法，參見，例如，下文章節5.5及實例部分。
在某些實施例中，用於包覆在完整孢子中之化合物及/或物質為 治療劑、化妝品或其組分、個人護理產品或其組分、加工食品或其組分、加工飲品或其組分、農用產品或其組分、家用產品或其組分、盥洗用品或其組分、或探針。在具體實施例中，所關注的化合物或物質為治療劑。治療劑之實例包括(但不限於)有機小分子、生物劑、蛋白質之醫藥製劑、草藥、無機及有機金屬化合物(諸如鋰、基於鉑之試劑、鎵及重金屬)、創傷或燒傷癒合劑、消炎劑、抗刺激物、抗微生物劑(其可包括抗真菌劑及抗細菌劑)、維生素、血管擴張劑、局部有效抗生素及防腐劑、或任何其他藥物。在一些實施例中，用於包覆在完整孢子中之化合物及/或物質為激素、抗體、細胞激素、化療劑、或其他適用於或有益於治療疾病之試劑。在一個具體實施例中，治療劑為5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)。在其他實施例中，治療劑並非5-氟尿嘧啶。在一個實施例中，用於包覆在完整孢子中之化合物及/或物質為除5-氟尿嘧啶外之治療劑。在另一個實施例中，用於包覆在完整孢子中之化合物及/或物質為除化療劑外之治療劑。
在某些實施例中，用於包覆在完整孢子中之化合物及/或物質為油墨。在一些實施例中，用於包覆在完整孢子中之化合物及/或物質為診斷藥劑。在某些實施例中，用於包覆在完整孢子中之化合物及/或物質為抗微生物物質。在一些實施例中，用於包覆在完整孢子中之化合物及/或物質為小分子。在某些實施例中，用於包覆在完整孢子中之化合物及/或物質為生物分子。在某些實施例中，用於包覆在完整孢子中之化合物及/或物質為大分子。
在某些實施例中，用於包覆在完整孢子中之化合物及/或物質為化妝品或其組分。在一些實施例中，用於包覆在完整孢子中之化合物及/或物質為個人護理產品或其組分。可尤其取決於產品之類型選擇不同孢子用於化妝品及個人護理產品中作為(例如)微珠，因為不同完整孢子具有不同表面粗糙度。化妝品及個人護理產品之實例包括(但 不限於)化妝品(例如，粉底、粉劑、腮紅、眼影、眼線及唇線、口紅、其他皮膚著色劑及皮膚塗劑)、皮膚護理產品(例如，清潔劑、保濕劑、潤膚劑、活膚水及爽膚水、去角質劑及粗糙皮膚移除劑)、香味劑、香水產品、精油、防曬劑、除防曬劑外之UV保護劑、仿曬劑、曬後劑、抗老化劑、抗皺劑、皮膚提亮劑、局部昆蟲忌避劑、脫毛劑、頭髮修復劑、或指甲護理產品(諸如指甲油或洗甲水)。香水產品可包含一種以上的香味劑。在一些實施例中，化妝品及個人護理產品包括高品質生物活性成分或具有化妝及個人護理性質之化合物。在一些實施例中，包覆在完整孢子中之化妝品及個人護理物質為保護個體免遭氧化或UV光影響之化合物。在某些實施例中，包覆在完整孢子中之化妝品及個人護理物質為矯味劑、芳香劑、營養素、香味劑、植物化學物或治療劑。
在某些實施例中，包覆在完整孢子中之化合物及/或物質為加工食品或其組分、或加工飲品或其組分。加工食品或飲品包括(例如)食品添加劑、健康食品及補充劑、矯味劑、芳香劑、營養素、生物活性劑或植物化學物。在一些實施例中，健康食品及補充劑包括營養素或飲食補充劑(諸如維生素、礦物質、葉酸、ω-3油、魚油、纖維及所謂的「益生菌」或「益生素」)。因此，在某些實施例中，完整孢子中包覆一種、兩種或更多種以下化合物或物質：食品添加劑、健康食品、食品補充劑、矯味劑、芳香劑、營養素、生物活性分子及/或植物化學物。
在某些實施例中，包覆在完整孢子中之化合物及/或物質為食品添加劑。在一些實施例中，食品添加劑包括酸、酸度調節劑、防結塊劑、消泡劑、抗氧化劑、填充劑、食用色素、護色劑、乳化劑、調味劑、增味劑、麵粉處理劑、上光劑、保濕劑、示蹤氣體、防腐劑、穩定劑、甜味劑、增稠劑、或增稠試劑。因此，在某些實施例中，完整 孢子中包覆一種、兩種或更多種該等化合物或物質。
在某些實施例中，包覆在完整孢子中之化合物及/或物質為矯味劑。在一些實施例中，矯味劑包括天然矯味物質、天然等同之矯味物質或人工矯味物質。在一些實施例中，矯味劑係選自由二乙醯、乙醯基丙醯、乙偶姻(acetoin)、乙酸異戊酯、苯甲醛、肉桂醛、丙酸乙酯、鄰胺基苯甲酸甲酯、檸檬烯、癸二烯酸乙酯、己酸烯丙酯、乙基麥芽醇、乙基香草醛及水楊酸甲酯組成之調味劑之群。在一些實施例中，矯味劑包括鹽、糖或人工甜味劑。在一些實施例中，矯味劑包括呈鈉或鈣鹽形式之鹹味矯味劑，例如，胺基酸及核苷酸。在一些實施例中，矯味劑為酸味添加劑，諸如有機酸及無機酸。
在一個具體實施例中，包覆在完整孢子中之化合物及/或物質為咖啡因。在其他實施例中，包覆在完整孢子中之化合物及/或物質並非咖啡因。
在某些實施例中，包覆在完整孢子中之化合物及/或物質為芳香劑。在一些實施例中，芳香劑包括酯、線性萜烯、環狀萜烯、芳族化合物、胺、醇、醛、酮、內酯或硫醇。
在某些實施例中，包覆在完整孢子中之化合物及/或物質為營養素。在一些實施例中，營養素包括碳水化合物、蛋白質、脂肪、膳食礦物質、維生素或膳食纖維。因此，在某些實施例中，完整孢子中包覆一種、兩種或更多種該等化合物或物質。
在某些實施例中，包覆在完整孢子中之化合物及/或物質為生物活性化合物或物質。在一些實施例中，生物活性劑包括脂肪酸、類黃酮、咖啡因、類胡蘿蔔素、肉鹼、膽鹼、輔酶Q、肌酸、二硫代硫酮、植物甾醇、多醣、植物雌激素、硫化葡萄糖苷、多酚、脂質、花青素、益生素或牛磺酸。因此，在某些實施例中，完整孢子中包覆一種、兩種或更多種該等化合物或物質。
在某些實施例中，包覆在完整孢子中之化合物及/或物質為植物化學物。植物化學物之實例包括(但不限於)類萜(例如類胡蘿蔔素、類三萜、單萜、類固醇)、酚類化合物(例如天然單酚、多酚、芳族酸、類苯乙醇)、硫化葡萄糖苷(例如，異硫氰酸鹽前驅物、糖苷配基衍生物、有機硫化物、有機硫化合物及吲哚)、甜菜素(例如甜菜青素、甜菜黃素)、葉綠素、有機酸、胺、碳水化合物(例如，單醣及多醣)及蛋白酶抑制劑。因此，在某些實施例中，完整孢子中包覆一種、兩種或更多種該等化合物或物質。
在某些實施例中，包覆在完整孢子中之化合物及/或物質為燃料。在一些實施例中，包覆在完整孢子中之化合物及/或物質為消毒劑或清潔劑。
在某些實施例中，包覆在完整孢子中之化合物及/或物質為脂質、蛋白質試劑(例如，蛋白質、多肽或肽)、脂肪酸或碳水化合物。
在某些實施例中，包覆在完整孢子中之化合物及/或物質為農用產品或其組分。在一些實施例中，該農用產品為殺蟲劑或肥料。
在某些實施例中，包覆在完整孢子中之化合物及/或物質為殺蟲劑。在一些實施例中，殺蟲劑包括化學性相關殺蟲劑或害蟲特異性調配物。化學性相關殺蟲劑包括(例如)有機磷酸酯殺蟲劑、胺基甲酸酯殺蟲劑、有機氯殺昆蟲劑、擬除蟲菊酯殺蟲劑或磺醯脲除草劑。害蟲特異性調配物包括(例如)除藻劑、抗污劑、抗微生物劑、吸引劑、生物性殺蟲劑、殺生物劑、消毒劑、滅菌劑、殺真菌劑、燻蒸劑、除草劑、殺昆蟲劑、殺蟎劑、微生物殺蟲劑、殺軟體動物劑、殺線蟲劑、殺卵劑、費洛蒙(pheromones)、忌避劑或滅鼠劑。因此，在某些實施例中，完整孢子中包覆一種、兩種或更多種該等殺蟲劑。
在某些實施例中，包覆在完整孢子中之化合物及/或物質為肥料。在一些實施例中，肥料包括氮肥料、磷酸鹽肥料、鉀肥料、複合 物肥料、有機肥料或元素化合物(例如，鈣、鎂及硫)。
在某些實施例中，包覆在完整孢子中之化合物及/或物質為存在於家用產品中之化合物及/或物質。家用產品(無論係適於內部或外部使用)之實例包括表面清潔劑、消毒劑及其他抗微生物劑、香味劑、香水產品、空氣清新劑、昆蟲及其他害蟲忌避劑、洗衣產品(例如洗滌劑及調理劑)、織物處理劑(包括染料)、清潔劑、UV保護劑、洗碗產品、油漆、清漆、油墨、染料及其他著色產品及黏著劑產品。
在某些實施例中，包覆在完整孢子中之化合物及/或物質為存在於盥洗用品中之化合物及/或物質。盥洗用品之實例包括肥皂；清潔劑及其他表面活性劑；除臭劑及止汗劑；潤滑劑；香味劑；香水產品；撲粉及滑石粉；護髮產品，諸如洗髮精、調理劑及染髮劑；及口腔及牙齒護理產品，諸如牙膏、漱口水及口氣清新劑。
在某些實施例中，包覆在完整孢子中之化合物及/或物質為探針。在一些實施例中，探針包括螢光標記分子。在一些實施例中，探針包括牛血清白蛋白(BSA)、鈣黃綠素或結合之異硫氰酸螢光素(FITC)。
在某些實施例中，包覆在完整孢子中之化合物及/或物質為植物提取物。在一些實施例中，包覆在完整孢子中之化合物及/或物質為親油性化合物(例如，油)。在某些實施例中，包覆在完整孢子中之化合物及/或物質為傳統草藥。在一些實施例中，包覆在完整孢子中之化合物及/或物質為現代醫藥。
在一個具體實施例中，包覆在完整孢子中之化合物及/或物質為油。在一些實施例中，包覆在完整孢子中之化合物及/或物質為山茶花油(日本茶油)、茶樹油(茶籽油)或油茶油(茶油)。
在一個具體實施例中，包覆在完整孢子中之化合物及/或物質為揭示於下文實例部分中之化合物或物質。
在其他實施例中，包覆在完整孢子中之化合物及/或物質在自然界中未發現與完整孢子相關聯。
在某些實施例中，完整孢子經加載任何適宜量之所關注的化合物或物質。化合物或物質之適宜量將尤其取決於包含完整孢子及包覆在完整孢子中之化合物或物質之調配物之所欲用途。在一些實施例中，該調配物以100：1至1：1之重量比包含完整孢子及化合物或物質。可能需要較大的完整孢子來包覆較大量的化合物或物質。
在一些實施例中，完整孢子中包覆僅一種所關注的化合物或物質。在其他實施例中，完整孢子中包覆兩種或更多種所關注的化合物或物質。
在某些實施例中，經包覆的化合物或物質保留在完整孢子之空腔中。在一些實施例中，經包覆的化合物或物質較佳保留在完整孢子之中央空腔中。在一些實施例中，一百分比之經包覆化合物或物質附著至完整孢子之表面。在一些實施例中，附著至完整孢子表面之經包覆化合物或物質的百分比小於該化合物或物質之整體包覆量之5重量%。
5.3 用於控制包覆在完整孢子中之化合物及物質之釋放速率之試劑
在另一個態樣中，本文提供用於控制包覆在完整孢子中之所關注的物質或化合物之釋放速率之試劑
在某些實施例中，用於控制包覆在完整孢子中之所關注的物質或化合物之釋放速率之試劑包括塗佈劑或共加載劑。在一些實施例中，塗佈劑包括蠟、奶油、澱粉、松香、樹脂、水凝膠、海藻酸鹽及多醣。在另一個實施例中，試劑包括羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素、乙酸纖維素、聚環氧乙烷、黃原膠、甲基丙烯酸酯共聚物(Eudragit)、卡波姆(Carbomers)、油及蠟及 甲基丙烯酸酯共聚物。塗層可為天然塗層，諸如澱粉、蠟、樹脂、松香等。在一個實施例中，將合成聚合物塗層用於受控釋放及改良之產物穩定性。在一些實施例中，共加載試劑包括甘油、水凝膠、葡萄糖及油。在一些實施例中，共加載試劑為其黏度大於水之黏度之黏性加載溶液。
在某些實施例中，用於控制所關注的物質或化合物之釋放速率之水凝膠包括水膨脹聚合物。例如，可使用離子水凝膠聚合物以及非離子水凝膠聚合物(例如，非離子親水性水凝膠聚合物)。作為一實例，可使用醫藥適宜之均聚物水凝膠(諸如由相同類型之單體聚合而未交聯至兩種或更多種不同類型之單體之聚合物、具有相同類型之側鏈之聚合物、非共聚物)。在一些實施例中，調配物包含完整孢子、所關注的物質或化合物、及約4重量%至80重量%之非交聯、水膨脹均聚物。
非交聯、水膨脹均聚物之實例包括(但不限於)羥丙基甲基纖維素(HPMC，例如METHOCELTM等)、海藻酸鹽、藻酸鈉、纖維素水凝膠、聚乙烯吡咯啶酮、羥丙基纖維素(HPC；例如KLUCELTM等)、硝基纖維素、羥丙基乙基纖維素、羥丙基丁基纖維素、羥丙基戊基纖維素、甲基纖維素、羥乙基纖維素、烷基纖維素、羥烷基纖維素、纖維素醚、乙酸纖維素、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素鈣、聚甲基丙烯酸羥烷酯、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯醇、聚丙烯酸鈉、聚丙烯酸鈣、聚丙烯酸、酸性羧基聚合物、羧基聚亞甲基、羧基乙烯基聚合物、羧基甲基醯胺、聚氧乙二醇、聚環氧乙烷及衍生物、其醫藥上等效之鹽及其混合物。
在一個具體實施例中，用於控制所關注的化合物或物質自完整孢子釋放之速率之試劑為述於下文實例部分中之試劑。在一個特定實施例中，用於控制化合物自完整孢子釋放之速率之試劑為海藻酸鹽。
在一個具體實施例中，用於控制所關注的化合物或物質自完整孢子釋放之速率之試劑減小化合物或物質自孢子釋放之速率。在具體實施例中，試劑之存在使得化合物之釋放速率在相同條件下相對化合物或物質自未包覆或塗佈試劑之完整孢子釋放之速率減小10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。在具體實施例中，試劑之存在導致1小時內之釋放速率在相同條件下相對化合物或物質在1小時內自未包覆或塗佈試劑之完整孢子釋放之速率減小10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。在具體實施例中，試劑之存在使得化合物之累積釋放在相同條件下相對化合物或物質自未包覆或塗佈試劑之完整孢子之累積釋放減小10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。在具體實施例中，試劑之存在導致1小時內之累積釋放在相同條件下相對化合物或物質在1小時內自未包覆或塗佈試劑之完整孢子之累積釋放減小10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。
在一個具體實施例中，用於控制所關注的化合物或物質自完整孢子釋放之速率之試劑延長化合物或物質自孢子之釋放時間。在具體實施例中，試劑之存在使得化合物之釋放時間在相同條件下相對化合物或物質自未包覆或塗佈試劑之完整孢子之釋放時間延長20min、30min、40min、50min、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、15h、20h、25h或30h。在一些實施例中，化合物或物質自經包覆或塗佈試劑之孢子之總釋放時間為1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、15h、20h、25h、或30h。「總釋放時 間」在本文中係指連續釋放直到至少95%之所包覆化合物或物質自孢子釋放之時間。在一個具體實施例中，無爆發效應下化合物或物質自經包覆或塗佈試劑之孢子之總釋放時間為1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、15h、20h、25h、或30h。「爆發效應」在本文中係指自開始釋放起的前1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min、或10min內釋放至少90%之所包覆化合物或物質。
在某些實施例中，塗佈劑、共加載劑、水凝膠或其他用於控制所關注的化合物或物質之釋放速率之試劑係經工程化以共包覆該物質或化合物於完整孢子中。在一些實施例中，調配物包含完整孢子、包覆於完整孢子中之所關注的化合物或物質、及用於控制物質或化合物自完整孢子釋放之速率之經共包覆之試劑。在一些實施例中，調配物包含一或多種經共包覆之釋放控制劑。
在某些實施例中，該經共包覆之試劑保留於完整孢子之空腔中。在一些實施例中，該經共包覆之試劑較佳保留於完整孢子之中央空腔中。在一些實施例中，一百分比之經包覆之試劑附著至完整孢子之表面。在一些實施例中，附著至完整孢子表面之經共包覆之試劑的百分比小於化合物或物質之總包覆量之5重量%。
在某些實施例中，共包覆試劑之步驟係與包覆化合物或物質於完整孢子中之步驟同時或分開進行。在一些實施例中，共包覆包括一或多個不同處理步驟。
在某些實施例中，用於控制所關注的化合物或物質自完整孢子釋放之速率之試劑係塗佈於該完整孢子上。在一些實施例中，調配物包括完整孢子、包覆在完整孢子中之所關注的化合物或物質、及用於控制該物質或化合物自該完整孢子釋放之速率之試劑，其中該完整孢子係經該試劑塗佈。在一些實施例中，完整孢子之塗層包括微珠塗 層。在一些實施例中，微珠塗層包括海藻酸鹽微珠。
5.4 改良完整孢子之性質之方法
在另一態樣中，本文提供改良完整孢子之性質之方法。在某些實施例中，改良完整孢子之性質包括改良孢子之結構特徵。孢子之結構特徵包括(例如)孢子之尺寸、形狀或組成。
在一些實施例中，改良孢子之結構特徵包括改良孢子之表面，例如，表面粗糙度，改變孢子之尺寸或形狀，或改良孢子的結構穩固性，例如，藉由增強或減弱孢子的抗機械壓力性。在一些實施例中，改良孢子之機械穩固性包括採用化學處理。在一些實施例中，在結構上改良孢子之化學處理包括受控地施用酸、鹼、氧化製程及溶劑。
例如，可採用將孢子暴露於酸或鹼化合物以致改變外壁聚合物結構從而引起外壁殼更容易斷裂之化學處理。若孢子之機械穩固性減小，則可允許更快速之孢子分解及所加載化合物之更快速釋放。在一些實施例中，化學處理改變孢子之外壁殼聚合物結構，同時維持孢子之結構完整性。例如，氧化處理使外壁聚合物降解及引起外壁更容易斷裂。其他處理實例為藉由熔融氫氧化鉀之處理及在氧化混合物諸如次氯酸鹽/鹽酸、重鉻酸鉀/硫酸、過氧化氫/硫酸及臭氧中之處理。其他實例包括軟化並最終溶解孢子之外壁聚合物殼之溶劑(例如，2-胺基乙醇、3-胺基丙醇、2,2'2"-氮基三乙醇及4-甲基嗎啉-N-氧化物)。
在一些實施例中，改良完整孢子之性質包括將完整孢子暴露於UV光以增加完整孢子之親水性。例如，暴露於UV光可藉由將疏水性表面蛋白質轉化成其親水性對應物改變其表面化學性質來改變孢子的親水性。關於UV光暴露，參見，例如，下文實例部分。在一些實施例中，完整孢子之親水性及/或疏水性係藉由塗層來控制及改良以支持水過濾及防止孢子堵塞。
5.5 包覆化合物及物質於完整孢子中及塗佈該等完整孢子之方法
在另一個態樣中，本文提供包覆所關注的化合物及/或物質於完整孢子中以及共包覆所關注的化合物及/或物質及控制該化合物及/或物質自完整孢子釋放之速率之試劑之方法。可使用熟悉此項技術者已知的任何技術於包覆所關注的化合物及/或物質於完整孢子中或共包覆所關注的化合物及/或物質及控制該化合物及/或物質自該完整孢子釋放之速率之試劑。在一個具體實施例中，使用述於下文實例部分中之技術來包覆所關注的化合物及/或物質於完整孢子中或共包覆所關注的化合物及/或物質及控制該化合物及/或物質自該完整孢子釋放之試劑。
此外，本文提供將完整孢子塗佈控制所包覆的化合物及/或物質自完整孢子釋放之試劑之方法。在一個具體實施例中，使用述於下文實例部分中之技術作為將完整孢子塗佈控制所包覆的化合物及/或物質自完整孢子釋放之速率之試劑之方法。
5.5.1 被動式加載方法
在某些實施例中，包覆所關注的化合物或物質於完整孢子中之方法包括使該化合物或物質與該完整孢子接觸。在一些實施例中，該使化合物或物質與完整孢子接觸之步驟包括將該化合物或物質溶解於溶劑中，使該完整孢子懸浮於溶液中，及允許該完整孢子包覆該化合物或物質持續一段特定的時間。在一些實施例中，該方法進一步包括在包覆化合物或物質於完整孢子中後，自溶液移除完整孢子。在一些實施例中，該方法進一步包括在自溶液移除完整孢子後，冷凍並冷凍乾燥該完整孢子。
在一些實施例中，該允許完整孢子包覆化合物或物質之步驟包括混合溶液及冷卻溶液至低於室溫。在一些實施例中，冷卻溫度為約4℃。在一些實施例中，允許完整孢子包覆化合物或物質所持續的特定時間為1小時、1.5小時、2小時、2.5小時、3小時、2小時、3小時、 4小時、5小時或更長、或1至2小時、1至5小時、2至3小時或2至4小時。在一些實施例中，自溶液移除完整孢子包括將溶液離心。在一些實施例中，將溶液離心係在12000rpm下持續進行4分鐘。
5.5.2 壓縮加載方法
在某些實施例中，包覆所關注的化合物或物質於完整孢子中之方法包括將完整孢子壓縮成錠劑及使該錠劑與該化合物或物質接觸。在一些實施例中，該使錠劑與化合物或物質接觸之步驟包括將該化合物或物質溶解於溶劑中，將該完整孢子之錠劑浸泡於該溶液中，及允許該完整孢子包覆該化合物或物質持續一段特定的時間。在一些實施例中，該方法進一步包括在包覆化合物或物質於完整孢子中後，自溶液移除完整孢子。在一些實施例中，該方法進一步包括在自溶液移除完整孢子後，冷凍及冷凍乾燥該完整孢子。
在一些實施例中，該允許完整孢子包覆化合物或物質之步驟包括混合該溶液及冷卻該溶液至低於室溫。在一些實施例中，冷卻溫度為約4℃。在一些實施例中，允許完整孢子包覆化合物或物質所持續的特定時間為1小時、1.5小時、2小時、2.5小時、3小時、2小時、3小時、4小時、5小時或更長、或1至2小時、1至5小時、2至3小時或2至4小時。在一些實施例中，該自溶液移除完整孢子之步驟包括將溶液離心。在一些實施例中，該將溶液離心之步驟包括在12000rpm下持續離心溶液4min。
在一些實施例中，該壓縮完整孢子成錠劑之步驟包括施加5噸或至少1噸之壓縮壓力持續至少10sec或20sec之時間。在一些實施例中，該壓縮完整孢子成錠劑之步驟進一步包括將完整孢子填充於模具中及對該模具施加壓縮壓力。
5.5.3 真空加載方法
在某些實施例中，包覆所關注的化合物或物質於完整孢子中之 方法包括使該化合物或物質與該完整孢子在真空壓力下接觸。在一些實施例中，該使化合物或物質與完整孢子在真空壓力下接觸之步驟包括將該化合物或物質溶解於溶劑中，使該完整孢子懸浮於該溶液中，向該懸浮液施加真空，及允許該完整孢子包覆該化合物或物質持續一段特定的時間。在一些實施例中，該方法進一步包括在包覆化合物或物質於完整孢子中後，自溶液移除完整孢子。在一些實施例中，該方法進一步包括在自溶液移除完整孢子後，冷凍及冷凍乾燥該完整孢子。
在一些實施例中，該允許完整孢子包覆化合物或物質之步驟包括混合該溶液及冷卻該溶液至低於室溫。在一些實施例中，冷卻溫度為約4℃。在一些實施例中，允許完整孢子包覆化合物或物質所持續的特定時間為1小時、1.5小時、2小時、2.5小時、3小時、2小時、3小時、4小時、5小時或更長、或1至2小時、1至5小時、2至3小時或2至4小時。在一些實施例中，該自溶液移除完整孢子之步驟包括將溶液離心。在一些實施例中，將溶液離心係在12000rpm下持續進行4min。
在一些實施例中，該向懸浮液施加真空之步驟包括使用冷凍乾燥器。在一些實施例中，該真空包括2mbar或至少小於5mbar之壓力。
5.5.4 塗佈方法
在施用試劑至完整孢子表面之背景內容中通常使用塗佈，而共包覆則包括以該試劑填充至少部分的孢子空腔。可使用熟悉此項技術者已知的任何技術來以控制所關注的化合物或物質自該完整孢子釋放之速率之試劑塗佈完整孢子。
在某些實施例中，以控制所關注的化合物或物質自該完整孢子釋放之試劑塗佈完整孢子之方法包括採用個別顆粒塗佈或聚結物顆粒塗佈來將該試劑塗佈於該完整孢子上。在一些實施例中，個別顆粒塗 佈包括噴塗、濺塗或應用氣相沉積。在一些實施例中，聚結物顆粒塗佈包括對孢子丸粒施壓及浸塗、噴塗、濺塗或應用氣相沉積。在一些實施例中，聚結物顆粒塗佈包括將完整孢子與共包覆化合物或物質混合及藉由各種技術固化該混合物以形成包含該完整孢子及該化合物或物質之聚結物。
5.5.5 評估化合物或物質包覆之方法
包覆化合物或物質之完整孢子之尺寸、形狀及形態之均勻度對於包含該孢子之產品之各種用途而言係重要的。產品之化合物釋放及調配很大程度上取決於孢子之該等均勻微粒學性質。較均勻之孢子允許於完整孢子中包覆較大量之化合物或物質。此外，包覆完整孢子中之較高均勻度確保在製備及使用包含包覆化合物或物質之完整孢子之調配物中之較大一致性。
可使用熟悉此項相關技術者已知或述於本文之任何技術來評估所關注的化合物及/或物質於完整孢子中之包覆(參見，例如，下文實例部分)。在某些實施例中，評估化合物或物質於完整孢子中之包覆之方法包括使用動態粒子影像分析儀來評估完整孢子之結構特徵。在一些實施例中，所評估的結構特徵包括完整孢子之均勻度、尺寸、形狀及微粒學形狀。
例如，動態粒子影像分析儀(DIPA)使用高解析度數位相機及物鏡來捕捉流過薄且透明之流動池之粒子(即包覆化合物或物質之完整孢子)之影像。接著基於影像之數位信號處理產生粒度均勻度數據。除了尺寸測量外，數位粒子影像允許獲得包括完整孢子之邊緣梯度、圓度及形狀之其他訊息。在一些實施例中，針對所有批次調配物以10,000個完整孢子之初始顆粒計數進行藉由DIPA之尺寸、邊緣梯度及圓度分析，及使用軟體處理影像以獲得1000個良好聚焦之完整孢子。在一些實施例中，將代表性數據作圖成直方圖及藉由高斯曲線擬合及 以標準偏差報告數值。在一個具體實施例中，DIPA係如下文實例部分中所述使用。
在某些實施例中，評估包覆化合物或物質於完整孢子中之方法包括使用共焦雷射掃描顯微鏡來觀察完整孢子。在一些實施例中，該方法包括將包覆物質或化合物之完整孢子固定於黏性載玻片上。在一些實施例中，該方法包括測量來自包覆在完整孢子中之化合物或物質之螢光。在一些實施例中，該化合物或物質為螢光探針或螢光探針標記分子。在某些實施例中，該化合物或物質為述於下文章節5.2中之化合物之螢光標記變體。在一些實施例中，該化合物或物質為經FITC結合之BSA、螢光素、5-氟尿嘧啶或鈣黃綠素。在其他實施例中，該化合物或物質並非經FITC結合之BSA、螢光素、5-氟尿嘧啶或鈣黃綠素。在一個具體實施例中，共焦雷射掃描顯微鏡係如下文實例部分中所述使用。
可使用熟悉此項技術者已知或述於本文之任何技術來測定包覆在完整孢子中之化合物或物質的量(參見，例如，下文實例部分)。在某些實施例中，測定包覆在完整孢子中之化合物或物質的量之方法包括：(1)使經加載化合物或物質之完整孢子破裂；(2)在溶液中培養該等破裂的完整孢子以允許最大量化合物釋放於溶液中；(3)藉由過濾自包含化合物之溶液分離完整孢子之團塊；(4)採用包含化合物之溶液之光譜分析(例如UV光譜法)來測定包含化合物之溶液之光吸收性質；及(5)將測得之光吸收性質與標準吸收曲線進行比較以確定化合物或物質的量，其中標準吸收曲線係自一系列具有已知量化合物之溶液收集得的光吸收數據獲得。
在一些實施例中，用於測定包覆在完整孢子中之化合物或物質的量之方法進一步包括使用安慰劑重複步驟(1)-(5)及在將所測得之光吸收性質與標準吸收曲線進行比較以確定化合物或物質的量之前自完 整孢子之所測得光吸收性質中減去安慰劑之所測得光吸收性質。該額外步驟確保測定化合物或物質量時的準確度提高。在一些實施例中，藉由以下式確定完整孢子中化合物或物質的量、化合物或物質加載之百分率、及包覆效率之百分率：
在某些實施例中，用於測定完整孢子與包覆在完整孢子中之化合物或物質之重量比之方法包括採用用於測定包覆在完整孢子中之化合物或物質的量之方法來測定化合物或物質的量及完整孢子的量，其中該完整孢子量係從上述步驟(3)中之完整孢子之所分離質量測得。在一些實施例中，比值係由化合物或物質的量：完整孢子的量給出。例如，4mg化合物與6mg完整孢子給出1：1.5之比值。
可使用熟悉此項技術者已知或本文所述之任何技術來測定包覆在完整孢子中之化合物或物質之釋放速率(參見，例如，下文實例部分)。在某些實施例中，評估包覆在完整孢子中之化合物或物質之受控釋放速率之方法包括在溶液中培養完整孢子之調配物，允許所包覆的化合物或物質釋放至該溶液中，及採用標準分析化學技術測定所釋放化合物的量。在一些實施例中，標準分析化學技術包括，例如，UV光譜法。
在某些實施例中，評估包覆在完整孢子中之化合物或物質之受控釋放速率之方法包括進行該方法之步驟(2)-(5)以測得包覆在完整孢子中之化合物或物質的量，其中在固定時間點停止該完整孢子之培養。
可使用熟悉此項技術者已知或本文所述之任何技術來評估個體對完整孢子或經包覆化合物或物質之完整孢子之過敏。在某些實施例中，評估個體中過敏之方法包括進行過敏血液測試或皮膚針刺測試。在一些實施例中，該方法進一步包括使個體暴露於完整孢子或經包覆化合物或物質之完整孢子。暴露例如包括皮膚接觸、吸入或攝入。大多數花粉過敏通常與吸入暴露相關。在一些實施例中，該方法包括確定個體皮膚在使化合物或物質與皮膚接觸後之反應。
5.6 包含完整孢子或包覆化合物或物質之完整孢子之調配物及其用途
在另一個態樣中，本文提供包含完整孢子、包覆所關注的化合物或物質之完整孢子、或共包覆所關注的化合物或物質及有利於受控釋放化合物或物質之試劑之完整孢子之調配物、及其用途。在一個具體實施例中，調配物包含包覆所關注的化合物或物質之完整孢子。在某些實施例中，調配物包含共包覆化合物或物質及有利於自完整孢子受控釋放化合物或物質之試劑之完整孢子。在一些實施例中，調配物包含包覆化合物或物質且經塗佈有利於自完整孢子受控釋放化合物或物質之試劑之完整孢子。
在某些實施例中，本文所述之調配物進一步包含一或多種額外試劑，諸如流體媒劑、賦形劑、稀釋劑、載劑、穩定劑、表面活性劑、滲透促進劑或其他用於使完整孢子及/或所關注的化合物或物質之傳遞靶向所欲投與部位之試劑。在一個實施例中，調配物包含完整孢子及稀釋劑或載劑。在另一個實施例中，調配物包含完整孢子及稀釋劑或醫藥上可接受之載劑。術語「醫藥上可接受之載劑」係指無毒性載劑。
在一個具體實施例中，調配物包含包覆所關注的化合物或物質之完整孢子及稀釋劑或醫藥上可接受之載劑。在某些實施例中，調配 物包含共包覆化合物或物質及有利於自完整孢子受控釋放化合物或物質之試劑之完整孢子及稀釋劑或醫藥上可接受之載劑。在一些實施例中，調配物包含包覆化合物或物質且經塗佈有利於自完整孢子受控釋放化合物或物質之試劑之完整孢子及稀釋劑或醫藥上可接受之載劑。
本文所述之調配物可包含0.0001：1至50：1，諸如0.001：1至5：1、0.01：1至5：1、0.1：1至5：1、或0.5：1至50：1之所關注的化合物或物質與完整孢子的重量比。
在某些實施例中，適宜之調配物係藉由常用方法使用以下物質來製備：習知之有機或無機添加劑或載劑，諸如賦形劑(例如，蔗糖、葡萄糖、乳糖、纖維素、山梨糖醇、滑石、甘露醇、磷酸鈣、澱粉或碳酸鈣)、結合劑(例如，纖維素、羥甲基纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、聚丙基吡咯啶酮、阿拉伯膠、明膠、聚乙二醇、澱粉或蔗糖)、崩解劑(例如，澱粉、羥丙基澱粉、羧甲基纖維素、低取代羥丙基纖維素、磷酸鈣、碳酸氫鈉或檸檬酸鈣)、潤滑劑(例如，硬脂酸鎂、滑石、輕質無水矽酸或月桂基硫酸鈉)、矯味劑(例如，檸檬酸、甘油、甲醇或有機粉末)、防腐劑(例如，苯甲酸鈉、對羥基苯甲酸甲酯、亞硫酸氫鈉或對羥基苯甲酸丙酯)、穩定劑(例如，檸檬酸、乙酸或檸檬酸鈉)、懸浮劑(例如，甲基纖維素、硬脂酸鋁或聚乙烯吡咯啶酮)、分散劑(例如，羥丙基甲基纖維素)、稀釋劑(例如，水)及基蠟(例如，可可脂、聚乙二醇或白礦脂)。
完整孢子、包覆化合物或物質之完整孢子、共包覆化合物或物質且經塗佈有利於自完整孢子受控釋放化合物或物質之試劑之完整孢子、或包覆化合物或物質且經塗佈有利於自完整孢子受控釋放化合物或物質之試劑之完整孢子之調配物將根據所欲用途而變化。此外，投與個體之調配物可根據投與個體之途徑而變化。本文所述之調配物可藉由熟悉此項技術者已知的任何途徑投與。例如，本文所述之調配物 可經口、非經腸、皮內、肌肉內、腹膜內、穿皮、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜外、舌下、腦內、陰道內、經皮、直腸、黏膜、藉由吸入或局部投與耳、鼻、眼或皮膚。在一個具體實施例中，本文所述之調配物係經口投與個體。在另一個具體實施例中，本文所述之調配物係非經腸(例如，皮下、肌肉內或靜脈內)投與個體。投與模式由健康照護醫師判斷，及可部分地取決於醫學病症之部位或完整孢子或化合物或物質之類型。
調配物可例如採取洗劑、霜劑、軟膏、糊劑、凝膠、發泡體、水凝膠洗劑、皮膚貼劑之形式或任何其他已知用於局部投與之物理形式，包括例如係為或可施覆至諸如海綿、擦拭棒、刷、紙巾、皮膚貼劑、敷料或牙科用纖維或膠帶之載體以利於其局部投與之調配物。其可採取黏性或半黏性流體或諸如可用於噴霧劑(例如鼻噴霧劑)、滴劑(例如眼或耳滴劑)、氣霧劑或漱口水中之較小黏性流體之形式。在一些實施例中，局部調配物為化妝或治療洗劑。在一些實施例中，本文所述之完整孢子可經調配為複合粉末狀材料。該複合粉末狀材料係併入寬廣範圍之食品或飲品、加工食品、食品補充劑等中。
在另一個態樣中，本文提供包含本文所述調配物之產品。在又另一個態樣中，本文提供包含完整孢子之產品。
在一些實施例中，本文提供用於諸如下列特定類型產品之調配物：例如，醫藥產品；草藥或營養藥劑產品；個人健康照護產品；化妝品及個人護理產品(例如沐浴用品、肥皂、護髮產品；指甲護理產品及牙科用產品，諸如牙膏、潔齒劑、漱口水及牙線)；食品及飲品(包括食物及飲料添加劑及成分)；及殺蟲劑、除草劑及肥料；家居用品(不論係用於內部或外部用途，包括表面清潔劑、消毒劑及其他抗微生物劑、香味劑、香水產品、空氣清香劑、昆蟲及其他害蟲忌避劑、殺蟲劑、洗衣產品(例如，洗滌劑及調理劑)、織物處理劑(包括染 料)、清潔劑、UV保護劑、洗碗產品、塗料、清漆、油墨、染料及其他著色產品、及黏著產品)；農用及園藝用產品(包括殺蟲劑、除草劑及肥料)；盥洗用品(包括肥皂；清潔劑及其他表面活性劑；除臭劑及止汗劑；潤滑劑；香味劑；香水產品；撲粉及滑石粉末；護髮產品諸如洗髮精、調理劑及染髮劑；及口腔及牙科護理產品諸如牙膏、漱口水及口氣清新劑)；燃料；炸藥；推進劑；及攝影材料。完整孢子、包覆化合物或物質之完整孢子、共包覆化合物或物質且經塗佈有利於自完整孢子受控釋放化合物或物質之試劑之完整孢子、或包覆化合物或物質且經塗佈有利於自完整孢子受控釋放化合物或物質之試劑之完整孢子可添加或包含於熟悉相關技術者已知的任何調配物，包括彼等述於本文中者。
在某些實施例中，包覆所關注的化合物或物質之完整孢子之調配物係用於沐浴乳、牙膏、漱口水及潔面乳中以治癒皮膚疾患、老化及妊娠紋，以治療切傷及燒傷，及/或用作昆蟲及蝨忌避劑。
在某些實施例中，包覆所關注的化合物或物質之完整孢子之調配物包含複數個山茶花粉及油以用於化妝及皮膚應用。具體而言，在一些實施例中，調配物包含有效量之山茶花花粉粒或等效物與一或多種類型之山茶油來減小皮膚刺激及最佳化治療性質。花粉之天然微球載體由於在其天然組合物中存在之組分而具有提供治療效應之附加效益。
在某些實施例中，用於如本文所述之個人護理產品之調配物包含完整孢子或包覆所關注的化合物或物質之完整孢子。
在另一個態樣中，本文提供一種治療個體中疾病或病症之方法，其包括對個體投與包含包覆有益於治療疾病或病症之化合物或物質(例如，治療劑、草藥或營養藥劑)之完整孢子之調配物。在一些實施例中，包覆在完整孢子中之治療劑係有益於治療疾病或病症。
在某些實施例中，本文所述之調配物係用於治療皮膚或皮膚結構病症(例如，粉刺、牛皮癬或濕疹)、傷口或燒傷癒合，治療抗發炎性疾病或病症、及/或用作抗刺激劑或抗微生物劑(包括抗真菌劑及抗細菌劑)。
術語「個體」如本文所使用係指已成為治療、觀察或實驗之目標且處於(或容易)發展出疾病或病症之風險之患者，諸如動物、哺乳動物或人類。
在另一個態樣中，本文提供一種保護所關注的化合物或物質免遭熱、光(包括UV光)、水、氧氣、氧化劑或條件及其他環境危險之方法。由完整孢子所提供之保護及其他效益之實例包括：(1)保護免遭大氣效應，特定言之免遭光及/或氧氣影響，及因此避免過早降解；(2)物理保護以幫助減低化合物或物質由例如蒸發、擴散或浸出所造成之損耗；(3)尺寸、形狀及表面性質之良好均勻度，不同於典型的合成包覆實體；(4)不同物種間之孢子尺寸及形狀之顯著變化，從而允許根據化合物或物質之性質及所需濃度、其所欲施用之部位及方式、所期望之釋放速率、使用前的可能儲存條件定製調配物；(5)提供去角質效應之粒度；(6)藉由物理上屏蔽化合物或物質以防接觸直到開始釋放為止來保護防止化合物或物質之毒性或不良效應；(7)用於所包覆化合物或物質之抗氧化劑；及(8)允許掩蔽包覆在完整孢子中之化合物或物質之味道之無味性。
在某些實施例中，在調配物中使用包覆所關注的化合物或物質之完整孢子改變化合物或物質之疏水性、氮/氧電漿等。在一些實施例中，在調配物中使用包覆所關注的化合物或物質之完整孢子改良該化合物或物質之分散特徵。
在另一個態樣中，本文提供改良所關注的化合物或物質之穩定性之方法，該等方法包括將該化合物或物質包覆於完整孢子中。化合 物或物質之穩定性可藉由相關技術中已知的技術來評估。
在另一個態樣中，本文提供防止氧化或提供保護以防化合物或物質降解之方法，該等方法包括將該化合物或物質包覆於完整孢子中。在一些實施例中，氧化包括空氣氧化。
在一些實施例中，可藉由測定諸如過氧化物值之參數的改變速率來測定氧化穩定性。另外或另一種選擇為，可藉由測定氧化還原電位、硫代巴比妥酸價、碘價、甲氧苯胺值、TOTOX值(定義為加至甲氧苯胺值之過氧化物值的兩倍)及/或游離脂肪酸含量之改變速率、及/或藉由RANCIMAT、活性氧或Schaal烘箱測試方法、或藉由任何其他適宜之測試方法來測定氧化穩定性。用於測定氧化穩定性之其他方法包括使用氧化穩定性儀器(OSI)或油脂氧化儀(oxidograph)，其等為較複雜AOM(活性氧方法)之自動化型式。RANCIMAT方法已變得最為完善且被許多國家及國際標準所認可。
在另一個態樣中，本文提供減低化合物或物質之毒性之方法，該等方法包括將化合物或物質包覆於天然生成之完整孢子中。在某些實施例中，該方法允許靶向個體身體之一位置來釋放化合物或物質。在一些實施例中，該等方法允許減低待投與個體之化合物或物質的需要量。在一些實施例中，完整孢子經共包覆控制化合物或物質自孢子釋放之速率之試劑。在某些實施例中，完整孢子經塗佈控制化合物或物質自孢子釋放之速率之試劑。可使用熟悉此項技術者已知的任何技術來評估經包覆化合物或物質之完整孢子減低化合物或物質之毒性之能力。
在某些實施例中，在使用前測試對用於投與之調配物之過敏。
在另一個實施例中，本文提供掩蔽所關注的化合物或物質(例如，營養素、植物化學物或生物活性分子)之味道之方法，該等方法包括將該化合物或物質包覆於天然生成之完整孢子中及將該完整孢子 調配於飲品或食品中。在一些實施例中，該完整孢子經共包覆控制化合物或物質自孢子釋放之速率之試劑。在某些實施例中，該完整孢子經塗佈控制化合物或物質自孢子釋放之速率之試劑。可使用熟悉此項技術者已知(例如調查)或述於本文(參見，例如，下文實例部分)之任何技術來評估經包覆化合物或物質之完整孢子掩蔽化合物或物質之味道之能力。
在某些實施例中，如本文所述之包覆疏水性材料之方法(包括(但不限於)包覆油進入花粉粒中)包括首先將花粉粒轉化成親水性微膠囊且接著加載疏水性材料。該方法最佳化疏水性材料之加載同時最小化疏水性材料之表面污染，此點對於化妝品及食品應用(例如味道掩蔽)而言係重要的。
在另一個態樣中，本文提供使皮膚去角質之方法，該等方法包括使個體之皮膚與包含完整孢子之調配物接觸。在另一個態樣中，本文提供使皮膚去角質之方法，該等方法包括使個體之皮膚與包含經工程化以包覆有益於或適用於化妝或個人護理產品之化合物或物質之完整孢子之調配物接觸。可使用熟悉此項技術者已知的任何技術來評估完整孢子或經包覆化合物或物質之完整孢子使皮膚去角質之能力。
在另一個態樣中，使用完整孢子作為微珠。該種微珠可用於其中使用塑料微珠之任何應用中，例如，化妝品、牙膏、美髮產品等。在一個具體實施例中，用作微珠之完整孢子係經工程化以包覆所關注的化合物或物質(例如，有益於或適用於化妝品或個人護理產品之化合物或物質)。完整孢子微珠之實例之SEM影像說明於圖44中。
6. 實例
6.1 實例1：石松孢子：用於藥物傳遞之天然製造之超堅固生物材料
本實例報告探索基於天然植物之「孢子」作為明確界定的微結 構材料用於包覆生物大分子作為藥物傳遞平臺。利用天然「孢子」包覆之優點包括包含天然微脊在內之更高的均勻尺寸分佈、顯著之生物大分子加載及連同生物大分子一起保留天然孢子成分。此外，該等具有多種治療活性之天然孢子可用作先進材料用於包覆多種藥劑、化學品及化妝品。在此，吾人已初次探索天然孢子作為先進材料以藉由包括被動式、壓縮及真空加載之三種不同微包覆技術來包覆生物大分子。藉由共焦雷射掃描顯微鏡(CLSM)廣泛地針對尺寸均勻度、形狀、包覆效率及生物大分子於孢子中之定位來表徵藉由該等技術開發之天然孢子調配物。吾人亦研究所開發的孢子調配物於模擬胃、腸流體中之活體外釋放曲線以及使用真空加載型孢子展示可調釋放曲線。該等使用異常穩定孢子顆粒之結果為進一步探索廣範圍之包覆材料提供基礎。
6.1.1 摘要
天然石松孢子擁有具備尺寸及形態均勻度之極獨特的微結構，及被視為構成有機界中最堅固材料中之一者。此外，該材料可廣泛用作針對若干人類疾病之草藥製劑及中藥中之治療材料。首次探索該等天然孢子藉由三種不同包覆技術來包覆模型生物大分子及針對尺寸均勻度、圓度及包覆效率廣泛地表徵。FlowCam及SEM結果確認具有獨特結構之均勻孢子，且此微結構在藉由所有三種不同技術包覆後仍保留。共焦雷射顯微圖顯示生物大分子之包覆，此外，已藉由孢子之多種海藻酸鹽塗層實現若干釋放曲線來達成可調釋放。該研究提供使用具有獨特材料性質(諸如尺寸均勻度及明確界定的微結構)之天然孢子作為用於生物大分子包覆之先進材料以用於受控及靶向釋放應用之獨特方法。
6.1.2 引介
植物孢子代表天然包覆之一種形式，且自然界中通常存在寬廣 範圍之產生孢子之特定植物物種。[1,2]此等天然包裝方式可有效保護敏感性生物材料免遭長時間乾燥、UV暴露及捕食生物形式之極端環境影響。[3]一些植物產生呈種子形式之孢子，其包含產生新植物所需要的所有遺傳物質。[4,5]此等孢子提供具有高結構均勻度之現成膠囊骨架及可用於包覆寬廣範圍材料之大內腔。[6,7]石松為產生孢子且已經確認包含一系列用於範圍自胃疾病至阿茲海默氏症之治療性應用之有前景的植物化學物之石松屬中之一個物種。[8-10]石松孢子提供堅固的膠囊結構且可在全球大量購得。[6,7]石松孢子通常以寬廣範圍之治療效益包括改良之骨生成[11]、改良之認知功能[12]、胃腸疾病之治療[8]、肝保護活性[13]及抗氧化性質[14]用於傳統草藥中。近來的研究展示經處理之石松殼用於包覆之用途，[15-19]然而，生產石松孢粉素膠囊需要在高溫下藉由極端化學處理長時間地處理天然孢子，使得此等所得膠囊不含所有其他生物材料。[20-24]在許多應用中，此大規模處理可能係不必要的且可能喪失潛在的治療效益。就在藥物、化妝品及食品中之應用而言，可通過包覆協同化合物獲得增強之效應，[25]及總體而言，使用天然未處理孢子可提供在處理複雜性及寬廣範圍應用之成本方面之顯著效益。
生產微包覆產品中之主要挑戰係確保尺寸單分散性，[26,27]此可能對針對所欲標靶器官之藥物釋放特徵具有大的影響。[28,29]除了尺寸單分散性之外，具有明確界定的微結構在探索廣泛應用中扮演重要角色。[30-32]大多數習知的用於包覆之材料處理技術，諸如乳液溶劑蒸發、噴霧乾燥及化學結合，無法可靠地提供尺寸單分散性或明確界定的微結構。[26,27,30-32]雖然若干研究已報告使用空外壁微膠囊於包覆藥物、疫苗及MRI造影劑、以及用於化妝品及食品補充劑上，[7,16-18,22]但仍未探索使用天然「孢子」作為微包覆材料及傳遞媒劑。於此方面，吾人已致力於探索採用三種不同微包覆技術來產生經生物大分子 加載之孢子之系統。吾人已開發來利用天然孢子的該等技術係簡單、具成本效益且通用的，及可應用於開發若干包覆產品來克服目前經包覆產品之限制同時提供明確界定的微粒學性質。本發明工作之特定科學合理性為i).大分子包覆至天然孢子中成為生物材料且保留天然孢子成分。ii).於包覆之前及之後表徵天然生物材料的尺寸均勻度、形狀及結構以提供關於其作為醫藥賦形劑之潛在用途之有價值的資訊。iii).包覆大分子於天然孢子中以獲得具有明確界定的微粒學性質之均勻尺寸顆粒作為醫藥包覆材料。iv)提供一種可行的方法以基於意欲於胃腸道中釋放藥物之塗佈最佳化來實現自經加載大分子之孢子之可調釋放曲線。因此，該研究展示使用天然孢子作為新穎包覆材料及該研究提供孢子用途之新維度，此點強烈地藉由石松孢子由於孢子成分之固有治療效益作為針對各種疾患之基於植物之藥物之用途所支持。[8-10]此外，吾人的研究展示該等藥物孢子可針對定製應用而包覆所關注的分子。
在此，吾人已初次探索天然孢子作為先進材料以藉由包括被動式、壓縮及真空加載之三種不同簡單包覆技術來包覆生物大分子。藉由共焦雷射掃描顯微鏡(CLSM)廣泛地針對尺寸均勻度、形狀、包覆效率及生物大分子於孢子中之定位來表徵藉由該等技術開發之天然孢子調配物。吾人亦研究所開發的孢子調配物於模擬胃及腸流體中之活體外釋放曲線，此外選擇真空加載調配物來藉由使用海藻酸鹽、天然生物材料作為第二塗佈材料而實現可調釋放曲線。吾人的包覆技術涉及使用牛血清白蛋白(BSA)作為模型生物大分子來加載至天然石松孢子中。
6.1.3 材料及方法
6.1.3.1 材料及化學品
天然石松孢子、牛血清白蛋白(BSA)、經FITC結合之BSA、海藻 酸鈉及其他化學品係購自Sigma(新加坡)。Vectashield(H-1000)介質係購自Vector labs(CA,USA)及未消毒的黏性載玻片，D 263 M Schott玻璃，1.5H號(170μm,25mm×75mm)係購自Ibidi GmbH(Munich,Germany)。
6.1.3.2 加載大分子至天然石松孢子中之微包覆技術
包覆大分子於天然石松孢子中：在1.5mL聚丙烯管中將75mg BSA溶解於0.6mL純水中及將150mg孢子懸浮於BSA溶液中。藉由渦轉(VWR,Singapore)混合懸浮液5min及將該管轉移至4℃及500rpm下之恆溫振盪器(Hangzhou Allsheng Inst.Singapore)以進行被動式加載。在壓縮加載之情況中，藉由使用5噸壓力之水壓機維持20秒來製備壓縮錠劑，將孢子錠劑浸泡於BSA溶液中及允許藉由孢子顆粒(孢子錠劑之尺寸提供於支援資訊中)吸收BSA。關於真空加載技術，使用BSA及孢子顆粒懸浮液，在冷凍乾燥器(Labconco,MO,USA)中慢慢地施加2mbar真空。針對所有批次保持BSA的量、孢子顆粒及培養時間(2小時)不變，及於培養後藉由以12000rpm離心4min收集加載BSA之孢子顆粒及使用0.5ml水快速洗滌，接著離心以移除黏著表面之BSA。在冷凍機中於-70℃下冷凍孢子30min接著冷凍乾燥24小時，將最終的加載BSA之石松孢子儲存在-20℃以進行進一步特徵分析。藉由相同程序在無BSA下製備安慰劑孢子且保存在-20℃。
被動式加載技術：於1.5mL聚丙烯管中將75mg BSA溶解至0.6mL純水中及將150mg天然孢子懸浮於BSA溶液中。藉由使用旋渦混合器(VWR,Singapore)混合懸浮液5min及將該管轉移至設置在4℃，500rpm之恆溫振盪器(Hangzhou Allsheng Inst.Singapore)以進行2h的培養。停止該製程及藉由以12000rpm離心4min收集加載BSA之孢子。使用0.5ml水快速地洗滌孢子及離心以移除黏著表面之BSA。將該等孢子冷凍於-70℃之冷凍機中30min及冷凍乾燥24h。將所得的加 載大分子之孢子儲存在-20℃直到進行進一步的活體外表徵。使用相似的程序在無BSA下製備安慰劑孢子及保存在-20℃。
壓縮加載技術：將150mg天然孢子填充至12mm模具中及使用FTIR造粒機在提供5噸負荷的水壓機下維持20sec而壓縮形成約10-12mm直徑之錠劑。表2中提及孢子錠劑之尺寸及於4℃下將該等錠劑浸泡於20mL平底玻璃瓶內的0.6mL包含75mg BSA之水溶液中2h以允許吸收BSA分子。停止該製程及藉由於12000rpm下離心4min收集加載BSA之孢子。使用0.5ml水快速地洗滌及離心以移除結合表面之BSA。在冷凍機中於-70℃下冷凍該等孢子30min及冷凍乾燥24h。將所得的孢子儲存在-20℃直到進行進一步的特徵分析。藉由相同程序在無BSA下製備安慰劑孢子及保存在-20℃。
(a)在藉由壓縮技術之BSA加載中所使用之錠劑及結果係具有標準偏差之三個批次(n=3)的平均值；(b)在Boeco BBX 22(Germany)分析天平中測得的重量；(c)使用數位游標卡尺測得之直徑及厚度。
真空加載技術：在1.5mL離心管中將75mg BSA溶解於0.6mL純水中及使150mg孢子懸浮，藉由使用漩渦混合器混合5min。使用冷凍乾燥器施加2mbar的真空維持2h。停止該製程及藉由以12000rpm離心4min收集加載BSA之石松孢子。使用0.5ml水快速洗滌及離心以移除結合表面之BSA，在冷凍機中於-70℃下冷凍該等孢子30min及冷凍乾燥24h。將所得的顆粒儲存在-20℃直到進行進一步的特徵分析。利用相同的程序在無BSA下製備安慰劑孢子及保存在-20℃。為 了預測BSA於天然石松孢子中之定位，藉由如章節6.1.3.2中所述之三種不同技術包覆與FITC結合之BSA。
6.1.3.3 天然石松孢子及加載大分子之天然石松孢子之特徵分析
藉由FlowCam ®(VS,Fluid Imaging Technologies,Maine,USA)之動態粒子影像分析：手動將具有0.5mL(2mg/ml)之操作前體積之天然石松孢子及加載生物大分子之孢子加入至流動池中。以0.1ml/min之流速及10框/sec之攝影速率分析聚焦之孢子，得到約9%之採樣效率，及藉由邊緣梯度定序及人工處理離析1000個良好聚焦的孢子。將代表性數據作成直方圖及藉由高斯曲線擬合，及以標準偏差報告數值。(關於詳細描述及校準，參見下一段落中之描述)。
藉由FlowCam®之動態粒子影像分析：將臺上型系統(FlowCamVS,Fluid Imaging Technologies,Maine,USA)配備200μm流動池(FC-200)、20X放大透鏡(Olympus®,Japan)及藉由視覺試算表軟體第3.4.11版控制。用1mL去離子水(Millipore,Singapore)以0.5ml/min之流速沖洗該系統及在每次樣本操作之前視覺上監測流動池清潔度。手動將具有0.5mL之操作前體積之天然石松孢子及加載大分子之孢子(2mg/ml)加入至流動池中及以0.1ml/min之流速、10框/s之攝影速率分析得到約9%之採樣效率。每次測量將最少10,000個顆粒固定為計數及進行三次獨立的測量並使用經邊緣梯度離析之高度聚焦的1000個孢子進行數據分析。使用聚苯乙烯微球體(50±1μm,Thermoscientific,USA)校準儀器及將代表性數據作成直方圖以擬合高斯曲線及以標準偏差報告數值(圖2及表3)。
(a)將FlowCam測量重複進行三次及報告具有標準偏差的一個代表值
藉由掃描電子顯微鏡(SEM)之表面形態評估：使用FESEM 7600F(JEOL,Japan)進行SEM成像。藉由使用JFC-1600(JEOL,Japan)(20mA,60sec)將樣本塗佈10nm厚度之鉑及藉由採用FESEM以5.00kV之加速電壓於不同放大率下記錄影像以提供形態資訊/以預測形態觀察。
共焦雷射掃描顯微鏡分析：使用Carl Zeiss LSM700(Germany)共焦顯微鏡進行共焦雷射掃描顯微分析。使用EC Plan-Neofluar 100x 1.3油物鏡M27透鏡中具有DIC之雷射激發線405nm(6.5%)、488nm(6%)及633nm(6%)。在配備以下發射濾光器：416-477、498-550、572-620之光線倍增管中收集來自天然石松孢子及加載大分子之石松孢子之螢光。將雷射掃描速度設在每一個相(1024×1024：84.94μm2尺寸)67sec及使用具有3.15μsec像素停留時間之平面模式掃描，及每個樣本捕捉至少三個影像且處理所有影像並在相同條件下使用軟體ZESS 2008(ZEISS,Germany)轉化。關於與共焦雷射掃描顯微鏡分析相關之更多詳細內容，參見下一段落。
天然孢子及加載大分子之天然孢子之共焦雷射掃描顯微鏡分析：使用配備三個所反射光譜/螢光偵測通道、六個雷射線(405/458/488/514/543/633nm)且連接至Z1倒置顯微鏡(Carl Zeiss,Germany)之Carl Zeiss LSM700(Germany)共焦顯微鏡進行共焦雷射掃描顯微分析。將天然孢子及加載大分子之孢子固定於黏性載玻片(Ibidi,Germany)上，添加一滴固定介質(Vectashield®)及用另一黏性載玻片覆蓋孢子顆粒。立即於以下條件下收集影像：EC Plan-Neofluar 100X 1.3油物鏡M27透鏡中具有DIC之雷射激發線405nm(6.5%)、488nm(6%)及633nm(6%)。在配備以下發射濾光器：416-477、498-550、572-620之光線倍增管中收集來自天然孢子及加載大分子之孢子之螢光。雷射掃描速度設定在每一個相(1024×1024：84.94μm2尺寸)67sec及平面模式掃描之像素停留時間為3.15μsec。將光圈設為對於樣本條件為最佳及在顆粒之中間(光切面)捕捉所有影像且所有樣本之其他設置固定為相同及每個不同樣本捕捉至少三個影像並使用ZESS 2008軟體(ZEISS,Germany)在相同條件下處理所有影像。
6.1.3.2 包覆效率
包覆效率：將5mg加載BSA之石松孢子懸浮於1.4mL PBS中，渦旋5min及探針音波處理10sec(3個週期，40%振幅)。使用0.45μm PES針筒過濾器(Agilent,USA)過濾溶液以收集經提取之BSA。使用安慰劑提取物作為空白樣本測量280nm下之吸光度(Boeco-S220,Germany)以計算得孢子顆粒中BSA的量。特定言之，如下使用安慰劑提取物作為空白樣本測量280nm下之吸光度以計算得天然孢子中BSA的量：
6.1.3.3 活體外藥物釋放評估
活體外藥物釋放研究：將5mg加載BSA之石松孢子懸浮在pH 1.2(0.1M HCl)及磷酸鹽緩衝鹽水(pH 7.4)介質中。在迴旋式振盪培養器(LM-400-D-220,Yihder,Taiwan)中於37℃在50rpm下培養，於特定時 間間隔藉由在14000rpm下離心30sec來收集釋放樣本，並補充新鮮釋放介質。使用PES針筒過濾器過濾釋放樣本及測量280nm下之吸光度。使用BSA標準曲線計算所釋放BSA的量。
於模擬胃流體(0.1M HCl,pH 1.2)中之活體外藥物釋放評估：將5mg加載BSA之孢子及安慰劑懸浮在1.4ml介質中及於37℃、50rpm下培養。在特定時間間隔藉由於14000rpm下離心30sec收集1ml釋放樣本並補充1ml新鮮釋放介質。使用PES膜過濾器(Agilent,USA)過濾釋放樣本及使用安慰劑作為空白樣本測定280nm下之吸光度。使用BSA標準曲線計算所釋放BSA的量。
於模擬腸流體(PBS pH 7.4)中之活體外藥物釋放評估：將5mg加載BSA之孢子及安慰劑懸浮在1.4ml介質中及於37℃、50rpm下培養。在特定時間間隔藉由於14000rpm下離心30sec收集1ml釋放樣本並補充1ml新鮮釋放介質。使用PES膜過濾器(Agilent,USA)過濾釋放樣本及使用安慰劑作為空白樣本測定280nm下之吸光度。使用BSA標準曲線計算所釋放BSA的量。
6.1.3.4 調配用於可調釋放之經生物大分子加載之孢子
將150mg加載BSA(真空加載)之孢子與1.5ml在水中之海藻酸鹽(0.5%、1%、2%)均勻地混合。使用不鏽鋼18G鈍針於磁力攪拌下將所得懸浮液慢慢地添加至10ml氯化鈣(8%)溶液，繼續攪拌5分鐘，及藉由離心移除氯化鈣(1500rpm,2分鐘)。使用1.5ml水洗滌該等珠粒兩次及冷凍乾燥24h。將所有該等調配物儲藏在-20℃直到進行進一步研究及使用10mg經海藻酸鹽塗佈之石松孢子來進行活體外研究。
6.1.3.5 統計分析
使用雙尾t-測試進行統計分析及將P<0.05視為統計上顯著。重複天然孢子之包覆及釋放實驗至少三次及將所有數據表示為平均值±標準偏差(SD)。
6.1.4 結果及討論
6.1.4.1 大分子包覆及天然孢子之特徵分析
圖1A-1E顯示經開發以使用天然孢子作為先進包覆材料之不同包覆技術之示意圖。吾人技術之吸引人的特徵包括多樣性及簡易性，具有允許在環境處理條件下應用至多種小或大生物分子的潛力。圖1A顯示源自維管植物石松之天然孢子，該等孢子同時展現明確界定的尺寸及微結構。在將該等孢子懸浮於生物大分子溶液中時(圖1B)，生物大分子通過約40nm尺寸之孢子壁中之天然奈米通道進入內部孢子空腔[7]。圖1C描繪加載生物大分子之孢子與孢子天然細胞質成分。圖1D、1E及1F分別呈現三種不同微包覆技術，即被動式、壓縮及真空加載。關於前述三種技術，將孢子培養於生物大分子溶液中，在壓縮及真空製程中施加額外的外力以包覆生物大分子。
吾人已針對在包覆製程過程中引起之尺寸均勻度、表面形態及物理變化研究天然孢子。為了表徵天然孢子，吾人採用基於使用高解析度數位相機(參見材料及方法部分)所捕捉的影像之動態粒子影像分析(DIPA,FlowCam®)。根據高度聚焦影像之數位信號處理獲得天然孢子之尺寸及形態。除了尺寸分析外，孢子影像允許吾人獲得包括孢子顆粒之邊緣梯度、圓度及形狀之額外資訊。藉由FlowCam之尺寸、邊緣梯度及圓度分析係針對所有批次之孢子調配物以~10,000個孢子顆粒之初始顆粒計數進行及使用FlowCam軟體處理影像以獲得1000個高度聚焦之孢子。圖3A-3D顯示等效球形直徑(ESD)相對頻率之代表性直方圖數據與高斯曲線擬合，其中(圖3A)天然孢子之平均ESD為30.31±1.87μm及(圖3B)被動式、(圖3C)壓縮及(圖3D)真空加載孢子之ESD分別為30.63±1.92μm、30.61±1.92μm及30.56±1.88μm。
天然孢子之尺寸均勻度及圓度由生物大分子加載之前及之後之ESD數據證實。該數據藉由擬合至如圖3A-3D中所顯示之圓度相對頻 率之直方圖之曲線來表示。由於孢子表面上之特徵性微脊所致，將BSA加載之前及之後之孢子形狀視為非圓形，所得圓度值<1(理想圓=1)。用於數據分析之影像品質由指示在FlowCam分析期間所使用之良好聚焦孢子調配物之邊緣梯度相對頻率數據明顯可見。除了該等微粒學數據之外，圖3E、3F、3G及3H分別顯示加載之前以及採用被動式、壓縮及真空加載技術後之孢子之結構相似性。
在本研究中，由於在使用天然孢子於包覆研究以及用於大型工業生產之具成本效益之原材料中之主要益處，而探索以該等天然生物材料作為新穎包覆材料。該等孢子歸因於下列因素而提供不同於習知材料的益處：(i).均勻尺寸及單分散性與明確界定的微粒學性質，且不需要形成顆粒；(ii).大規模原材料可利用性，國際市場中25USD/kg之具成本效益之價格的一致均勻性；(iii).人類攝入石松孢子膠囊及其成分用於各種治療效益之經實證之追蹤記錄；(iv).經顯示在高溫、壓力及溶劑下穩定從而允許用於不同分子之不同包覆策略之堅固的膠囊結構；及(v).可無需使用毒性有機溶劑來包覆且可針對不同生物活性釋放應用定製之現成顆粒。在過去，由於治療性分子使用各種包覆材料諸如主要以甲殼素、明膠、澱粉及透明質酸鈉為主之天然聚合物顆粒及主要以聚(D,L-乳交酯-共聚-乙交酯)、聚己內酯、聚酐及聚丙烯酸酯為主之合成聚合顆粒之商業潛力，因而包覆研究已受到廣泛重視。[26]在天然聚合物中，無可避免地會使用到溶劑及毒性交聯劑及可能由於殘留的危險性組分而導致毒性效應。天然聚合物亦主要源自動物，此導致獲得原材料之處理成本相對較高。此外，該等習知的聚合材料通常缺乏均勻度以及界定的微結構。在合成聚合物之情況中，使用諸如二氯甲烷之溶劑為開發顆粒調配物之主要先決條件且亦存在國際市場中3000至10000USD/kg之極高原材料成本。另一顧慮係，基於PLGA之微球體之酸性降解產物可潛在地導致蛋白質劣化， 包括變性、聚集及甚至化學降解。此外，在胃腸道中，相鄰微環境之pH值減小可引起諸如發炎之副作用。[33-35]因此，必須探索利用多樣包覆策略的新生物材料來滿足對於包覆生物材料之日益增加之需求。
此外，為表徵孢子之代表性批次，吾人使用掃描電子顯微鏡(SEM)來檢查任何結構及形態變化，及分別針對加載前、以及被動式、壓縮及真空加載技術後之孢子，將該等影像顯示為圖4A、圖4B、圖4C及圖4D。結構及形態觀察顯示天然孢子調配物維持其結構完整性而未發生任何變性，及展現使用三種不同微包覆技術進行生物大分子包覆後之尺寸均勻度。值得注意的是，作為一種包覆材料，於環境溫度下之材料處理後保留結構完整性係最為重要的。[36,37]
在分批製備後就孢子中之加載及包覆效率而言之孢子調配物產率之定量測定結果呈現於表4中，及由於一步驟被動式加載相較於多步驟壓縮及真空技術，因而在被動式加載製程中觀察到相對較高之分批產率。然而，被動式及壓縮加載之包覆效率(EE)相對地相似，為42.7±3.7%及42.8±1.1%，而就真空加載製程而言，實現59.2±2.2%之統計顯著性(p<0.05)更高的EE。
(a)結果係具有標準偏差之三個批次(n=3)的平均值；(b)理論加載係 基於天然石松孢子之50%重量：(c)BSA包覆效率係使用5mg加載BSA之天然孢子顆粒測定。
於形態表徵之後，吾人以觀察生物大分子於天然孢子中之定位之目標來研究天然孢子調配物。吾人藉由前述三種技術將與FITC結合之BSA包覆於天然孢子中及使用共焦雷射掃描顯微鏡(CLSM)進行分析。於100x下利用固定設置(參見實驗部分)捕捉於固定在薄載玻片之間並嵌入vectashield中之孢子的中截面聚焦的所有影像。大分子加載前天然石松孢子之共焦顯微鏡影像呈現於圖5A中。由圖5A列明顯可見加載前之孢子未觀察到由FITC-BSA所產生之綠色，而藍色及紅色通道則顯示來自孢子成分之強的自體螢光，其由其之重疊影像甚至更為明顯。該自體螢光可歸因於孢原質成分之存在。[38,39]
在藉由被動式技術之FITC-BSA加載之情況中(圖5B)，觀察到強綠色螢光，證實生物大分子加載於天然孢子中，及由指示FITC-BSA連同天然孢子成分之所有通道之重疊清楚地明顯可見。在壓縮加載生物大分子之情況中(圖5C)，吾人亦觀測到亮綠色螢光。然而，重要的是，應注意於在5噸下壓縮20秒後仍保留結構完整性及孢子成分。在真空加載(FIG.5D)之情況下觀察到相對較強之螢光，此點支持吾人除了在生物大分子溶液中培養之外可藉由施加外部真空力來獲得更高包覆效率之推斷。雖然被動式加載綠色通道影像中看來存在少量黏著表面之FITC-BSA，且一薄層之FITC-BSA可能黏著至所有經加載孢子之微脊結構，但總體而言，該等數據證實顯著大量之大分子係加載於天然孢子空腔內部而非加載於被網脊(muri)圍起來的內質網腔中。為進一步證實FITC-BSA於孢子空腔內部之定位，於圖6A及6B中提供Z-堆疊影像。
基於植物之藥物從遠古時代就作為主要治療選項發揮顯著作用至今，在許多開發中國家該等傳統的植物衍生藥物作為健康照護之主要形式發揮關鍵作用。此外，此亦導致發現針對多種影響人類之疾病之新穎藥物候選物。石松(已知為杵狀苔蘚(club moss))為石松科石松 屬中最廣泛之物種。石松孢子粉之提取物係用作主要用於肝功能障礙以及泌尿及消化疾病之基於植物之藥物。[13]亦報告石松在記憶受損大鼠模型中改良記憶功能及腦血流的藥用效應。[12]具體而言，在順式療法藥物學(homeopathic Materia Medica)中，闡明石松對膽道結石及肝衰竭具有治療效應，及由於其多樣的重要性，該等孢子之應用成為健康照護中有潛力的新治療形式。該等經實證之治療效益促使基於石松之口服草藥調配物商業化以治療多種健康病症，諸如焦慮、白蛋白尿、便秘、痢疾、膽結石、胃灼熱、痔瘡、陽萎、消化不良、易怒、前列腺炎、腎絞痛及風濕病。該等孢子成分之治療活性經石松之生物分析導引研究證實，指明主要組分石松鹼生物鹼係造成提取物對傷口癒合應用之抗炎活性的原因。[40]就其他工業應用而言，該等孢子亦已作為乾粉用於乳膠手套及保險套製造中。由此，應注意若干報告指示與對石松孢子過敏之風險相關聯之職業性過敏病例。然而，已提出此點可能係由於每天長時間暴露於孢子大量存在的地方所致且該等孢子亦可能是致敏乳膠蛋白質之載體。[41]以往的報告指出石松過敏極罕見，且在臨床病例中由於未出現致敏症狀而從未被診斷出且該等石松過敏通常涉及局部治療。[42]特定言之，61例與石松提取物相關聯之鼻炎或皮膚反應之臨床病例之回顧指示大多數病例為弱陽性且無臨床顯著性。[42]在吾人的研究中，基於石松孢子之調配物涉及孢子作為安全口服調配物用於生物活性釋放之低至5mg之量。
6.1.4.2 調節自天然孢子之大分子釋放
吾人已證實天然孢子為用於藉由BSA作為模型蛋白質包覆各種分子之吸引人的材料。吾人進一步研究分別在模擬胃流體(SGF,pH 1.2)及模擬腸流體(SIF,pH 7.4)條件中BSA自該等天然孢子之活體外釋放曲線。於SGF中BSA之活體外釋放(圖7A)表明90%生物大分子在前5分鐘內釋放及在30至60分鐘內觀察到完全釋放。在自採用不同技術製得 之加載BSA之孢子之釋放之間並無顯著差異(p 0.05)。在腸條件(圖7B)之情況中，藉由三種不同加載技術製得之孢子調配物觀察到相似的爆發釋放，表明在模擬胃及腸條件中不存在顯著釋放差異。所觀察到的釋放趨勢指示在兩種模擬條件中之快速釋放且由於BSA之高水溶解度導致自天然孢子之奈米域快速釋放而明顯可見。此點證實吾人指示缺乏障壁來延遲於SGF及SIF中之生物大分子釋放持續更長時段之關於天然孢子之發現。[7,16,18]針對使用石松孢子之經處理之孢粉素微膠囊報告相似的藥物釋放曲線。[16,18]為探索於PBS中與FITC結合之BSA釋放後之結構改變，吾人在完全釋放後進行CLSM及結果指示孢子中不存在任何綠色，證實FITC-BSA自天然孢子完全釋放(參見圖8A-8C)。然而，在具有外部FITC-BSA結合之孢子之外壁殼周圍觀察到低強度綠色，及有趣的是，該等天然孢子之自體螢光在用於包覆及釋放之處理後仍存留。該等觀察清楚地指示天然孢子中之完整孢原質。
另外，為了實現持續可調釋放，吾人已將該製程最佳化以將加載生物大分子之天然孢子併入至海藻酸鹽微珠中。該等微珠係藉由在不同濃度之海藻酸鹽溶液(亦即，0.5%、1%及2%(w/v))中使用經真空加載之孢子來製得。吾人已研究在SGF及SIF中自具有不同量之海藻酸鹽之天然孢子之釋放曲線及結果分別呈現於圖7C及圖7D中。在SGF之情況中，自天然孢子之釋放曲線指示基於調配物中所使用海藻酸鹽量之全身性釋放趨勢。0.5%海藻酸鹽調配物相較於1%及2%海藻酸鹽存在更高程度之爆發釋放，此外，使用在2%海藻酸鹽珠粒中之天然孢子實現持續釋放長達8h而無任何爆發效應。在SIF中，可調釋放就不同量之海藻酸鹽而言更顯著，長達8h，顯示胃腸通過時間。分別在SGF及SIF中進行自天然孢子之生物大分子釋放之統計分析及結果指示不同調配物間之顯著差異(p<0.05)。此外，在使用1%及2% 海藻酸鹽進行海藻酸鹽塗佈後達成釋放曲線中之顯著差異(p<0.05)。在模擬胃及腸兩種條件中研究活體外釋放曲線具關鍵性，及特定言之，所觀察到之大分子自孢子之釋放指示與pH無關之釋放曲線。就進一步的開發而言，該等基於孢子之調配物可在涉及不同吸收窗口且需要在GI道之不同部分釋放藥物之靶向胃腸疾病之藥物之口服劑型調配物中高度有益。[43,44]此外，該等天然孢子之大內腔提供高治療劑加載及於胃腸道中之釋放。
為評估於海藻酸鹽塗佈後微珠之結構，於經0.5%、1%及2%海藻酸鹽塗佈之孢子上進行SEM分析，及結果描繪於圖9A-9C中。有趣的是，孢子融合在海藻酸鹽微珠內部，及表面分析顯示就具有0.5%、1%及2%海藻酸鹽之可變塗層而言，孢子係完整的。該等形態觀察進一步支持與濃度相關的釋放曲線，其指示海藻酸鹽充作延遲大分子自孢子釋放之障壁。因此，吾人的結果提供一種藉由改變海藻酸鹽的量來調節生物大分子自天然石松孢子釋放之方法。該等釋放曲線在靶向人類胃腸道中之藥物吸收窗口中具關鍵性[43,45]而有助於開發針對新疾病標靶之新口服治療劑。
6.1.5 結論
總言之，吾人已成功地展示藉由三種不同微包覆技術(亦即，被動式、壓縮及真空加載)將生物大分子包覆至天然孢子中。採用真空加載技術實現顯著包覆及藉由雷射掃描顯微鏡藉由FITC-BSA於天然孢子中之定位證實大分子之包覆。表面表徵及動態粒子影像分析(DIPA)顯示所有該等開發的調配物與明確界定的微脊之較高的尺寸均勻度。所展示之天然孢子於包覆應用之潛力提供進一步探索其作為傳遞媒介用於各種試劑，包括小分子、肽及化妝品之動機。實際上，不同天然孢子具有藉由天然生物模板化過程形成之獨特結構，及其精確的均勻度及穩固的穩定性使得其等為用於包覆目的的理想生物材料， 尤其係根據吾人無需嚴苛化學處理之環保包覆策略。重要的是，吾人亦已展示可藉由形成生物相容性海藻酸鹽塗層來將生物大分子從石松孢子中之釋放控制為可調曲線。在將來，天然及合成生物材料之整合為開發用於醫學及生物技術兩種應用之多功能傳遞平臺提供大量機會。
6.1.6 於實例1中引用之參考文獻
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6.2 實例2：作為藥物傳遞媒劑之天然向日葵花粉
在本實例中，採用相同的三種包覆技術(被動式、壓縮及真空加載)將牛血清白蛋白(BSA)加載至天然丈菊(向日葵)花粉中。
6.2.1 引介
具有複雜結構之均勻微米級膠囊之製造係朝向成功材料包覆策略之長期目標。[1,2]雖然已在過去幾十年內設計出各種製造方法，但 自然界的生物合成能力已在更長的時間尺度內演化，而產生大量具有高逼真度之精緻複雜微膠囊。一個該實例包括包覆敏感性生物材料以在嚴苛條件下持續長時間之微米級花粉粒。[3,4]在自然界中，花粉粒藉由保護核酸及其他遺傳物質免遭不利環境條件諸如長時間乾燥、高溫、紫外光及微生物損傷影響而確保植物之生殖能力。[5]遺傳物質儲存在花粉粒之細胞質核中且經由內層及外層組成之雙層殼包圍。[6,7]最外部的外壁層包含被認為係自然界最具彈性材料中之一者之孢粉素生物聚合物。[8,9]隨著對花粉的獨特材料性質及其有機生產及簡單收集之越來越多地認識，重新對探索花粉及其組分作為有前景的生物材料產生興趣。
近年來，自花粉粒及植物孢子分離之堅固的外壁膠囊已展示作為用來包覆包括藥物、疫苗、造影劑及油之各種材料之傳遞媒介之強大潛力。[10-21]在迄今所探索的材料包覆策略中，要求高純度外壁膠囊及通過在嚴苛條件下使用高溫有機溶劑、酸劇烈且長時間地處理花粉粒或孢子或系統性地暴露於多種酵素來獲得。[22]實際上，通常認為「可將藥物附著至全[花粉]顆粒外部，但加載受到限制且藥物受到極少保護及其釋放相對地不受控制」。[12]同時，作為天然花粉週期之部分，孢粉素外壁及纖維素內層二者係可滲透的且經歷脫水及水合，其在周圍流體被抽入內部花粉空腔中時有利於材料加載。[23-26]此點表明在未經處理之花粉粒內部之材料包覆應係可能的，只要能找到適宜之包覆途徑。天然向日葵花粉粒作為藥物傳遞媒介之潛在優點很多；(1)由於用作生物補充劑及用於草藥中而經實證追蹤記錄為對人類口服食用安全。(2)「蜂花粉」為供人類消耗以達成營養及治療效益之常見成分。(3)無需使用有機溶劑及嚴苛超音波處理或均質化條件來用於材料包覆之經濟原材料。(4)具有均勻尺寸分佈及內腔之獨特微結構。天然向日葵花粉粒之主要缺點係存在導致快速藥物釋放之 孔隙，然而，此點可藉由適宜之聚合物塗佈技術根據靶向胃腸道不同區域之需求調節釋放而得到解決。
受到花粉粒生物功能之啟發，吾人猜想可設計包覆策略來將生物大分子加載至天然花粉粒中。該方法將顯著地降低對在外壁增強微膠囊中之材料包覆之處理要求，同時亦利用通常用作飲食補充劑及用於傳統草藥中之天然花粉之固有的治療效益。[27,28]特定言之，在丈菊(向日葵)中為常見成分之經多花種蜂採集之花粉[29,30]與寬廣範圍之營養及治療效應相關聯。[27,28]
作為測試吾人假說之概念證明，吾人研究天然、未處理向日葵花粉粒作為微尺度材料用於生物大分子之有效包覆。通過對三種不同包覆策略(被動式水合、水壓壓縮及真空輔助)的比較，吾人展示以牛血清白蛋白(BSA)作為模型生物大分子來實現高效蛋白質加載之多個途徑。重要的是，所使用的該等方法環保且保留天然花粉粒之複雜結構，包括尺寸、均勻度及表面特徵。另外，吾人展示可藉由將花粉粒包覆於海藻酸鹽水凝膠珠粒內部來實現受控釋放曲線。總之，吾人的發現提供天然花粉粒為極佳藥物傳遞媒介之有力證據。
6.2.2 材料及方法
6.2.2.1 材料及化學品
天然向日葵花粉粒(經脫脂)係購自Greer Labs(NC,USA)，牛血清白蛋白(BSA)、與FITC結合之BSA及其他試劑係購自Sigma(Singapore)。Vectashield(H-1000)介質係購自Vector labs(CA,USA)及未消毒的黏性載玻片，D 263 M Schott玻璃，1.5H號(170μm,25mm×75mm)係購自Ibidi GmbH(Munich,Germany)。
6.2.2.2 加載大分子(BSA)至天然向日葵花粉粒中之微包覆技術
包覆大分子於天然花粉粒中：在1.5mL聚丙烯管中將75mg BSA溶解於0.5mL純水中及將150mg天然花粉粒懸浮於BSA溶液中。藉由 渦轉(VWR,Singapore)混合懸浮液5min及將該管轉移至4℃及500rpm下之恆溫振盪器(Hangzhou Allsheng Inst.Singapore)以進行被動式加載。在壓縮加載之情況中，藉由使用5噸壓力之水壓機維持20秒來製備壓縮錠劑，將錠劑浸泡於BSA溶液中及允許藉由花粉粒(壓縮錠劑之尺寸提供於支援資訊中)吸收BSA。所使用的5噸壓縮壓力能夠保持具有一些部分之花粉細胞質組分之完整向日葵花粉結構，如由紅色及藍色通道CLSM自體螢光所指示。就真空加載技術而言，使用BSA及花粉粒懸浮液，及在冷凍乾燥器(Labconco,MO,USA)中慢慢地施加2mbar真空。針對所有批次保持BSA的量、花粉粒及培養時間(2小時)不變，及於培養後藉由以12000rpm離心4min收集加載BSA之花粉粒及使用0.5ml水洗滌，接著離心以移除黏著表面之BSA。在冷凍機中於-70℃下冷凍花粉粒30min接著冷凍乾燥24小時，將最終的加載BSA之花粉粒儲存在-20℃以進行進一步特徵分析。藉由相同的程序在無BSA下製備安慰劑花粉粒及保存在-20℃。關於其他關於該等方法之細節，參見以下段落。
被動式填充：於1.5mL聚丙烯管中將75mg BSA溶解至0.5mL純水中及將150mg天然花粉粒懸浮於BSA溶液中。藉由渦轉(VWR,Singapore)混合懸浮液5min及將該管轉移至4℃、500rpm下之恆溫振盪器(Hangzhou Allsheng Inst.Singapore)維持2h。停止該製程及藉由於12000rpm下離心4min來收集加載BSA之顆粒。使用0.5ml水洗滌及離心以移除黏著表面之BSA。在冷凍機中於-70℃下冷凍該等花粉粒30min及冷凍乾燥24h。將所得的顆粒儲存在-20℃以進行進一步的特徵分析。藉由相同程序在無BSA下製備安慰劑花粉粒且保存在-20℃。
壓縮填充：將150mg天然向日葵花粉粒填充至12mm模具中及使用FTIR造粒機在提供5噸負荷的水壓機下壓縮維持20秒以形成約10- 12mm直徑之錠劑。於4℃下將依此方法形成之丸粒浸泡於20mL平底玻璃瓶內之0.5mL包含75mg BSA之水溶液中2h以允許花粉粒膨脹，藉此使BSA包裹於花粉粒中。停止該製程及藉由於12000rpm下離心4min來收集加載BSA之顆粒。使用0.5ml水洗滌及離心以移除結合表面之BSA。在冷凍機中於-70℃下冷凍該等花粉粒30min及冷凍乾燥24h。將所得的顆粒儲存在-20℃以進行進一步的特徵分析。藉由相同程序在無BSA下製備安慰劑花粉粒且保存在-20℃。
(a)在藉由壓縮技術之BSA加載中所使用之錠劑及結果係具有標準偏差之三個批次(n=3)的平均值；(b)在具有1mg準確度之Boeco(Germany)天平中測得的重量；(c)使用數位游標卡尺測得之直徑及厚度。
真空填充：在1.5mL離心管中將75mg BSA溶解於0.5mL純水中及將150mg花粉粒懸浮且渦旋5min以均質化。使用冷凍乾燥器施加2mbar之真空2h。停止該製程及藉由以12000rpm離心4min來收集加載BSA之花粉粒。使用0.5ml水洗滌及離心以移除結合表面之BSA，接著在冷凍機中於-70℃下冷凍該等花粉粒30min及冷凍乾燥24h。將所得的顆粒儲存在-20℃以進行進一步的特徵分析。藉由相同程序在無BSA下製備安慰劑花粉粒且保存在-20℃。
為預測BSA於天然花粉粒中之定位，藉由如章節1.1中所提及之三種不同技術以每一批次天然花粉粒22.5mg之包含7.5mg FITC-BSA之批次大小包覆與FITC結合之BSA。
6.2.2.3 天然花粉粒及加載大分子之天然花粉粒之特徵分析
藉由FlowCam®之動態粒子影像分析：FlowCam VS臺上型系統 (FlowCam® VS,Fluid Imaging Technologies,Maine,USA)。以0.1ml/min之流速及10框/s之攝影速率分析0.5mL(2mg/ml)之天然向日葵花粉粒及具有0.5mL之操作前體積之加載大分子之花粉粒(手動加入至流動池中)，得到約9%之採樣效率，及藉由邊緣梯度定序離析1000個高度聚焦之花粉粒。將代表性數據作成直方圖及藉由高斯曲線擬合，及以標準偏差報告數值。(關於詳細描述，參見下一段落)。
藉由FlowCam®之動態粒子影像分析：將FlowCam VS臺上型系統(FlowCam® VS,Fluid Imaging Technologies,Maine,USA)配備200μm流動池(FC-200)、20X放大透鏡(Olympus®,Japan)及藉由視覺試算表軟體第3.4.11版控制。用1mL去離子水(Millipore,Singapore)以0.5ml/min之流速沖洗該系統及在每次樣本操作之前視覺上監測流動池清潔度。以0.1ml/min之流速及10框/s之攝影速率分析0.5mL(2mg/ml)之具有0.5mL之操作前體積之天然向日葵花粉粒及加載大分子之花粉粒(手動加入至流動池中)得到約9%之採樣效率。每次測量將最少10,000個顆粒固定為計數及進行三次獨立的測量並使用經邊緣梯度離析之1000個良好聚焦的花粉粒進行數據分析。使用聚苯乙烯微球體(50±1μm,Thermoscientific,USA)校準儀器。將代表性數據作成直方圖並以高斯曲線擬合及以標準偏差報告數值。DIPA使用高解析度數位相機及物鏡來捕捉流過薄且透明之流動池之顆粒之影像。接著基於影像之數位信號處理產生粒度均勻度數據。除了尺寸測量外，數位顆粒影像允許吾人獲得包括邊緣梯度、圓度及花粉粒之形狀的額外資訊。針對花粉調配物之所有批次以10,000個花粉粒之初始顆粒計數進行藉由FlowCam之尺寸、邊緣梯度及圓度分析，及使用FlowCam軟體處理影像以獲得1000個良好聚焦之花粉粒。
表6.天然向日葵花粉及加載BSA之花粉粒之等效球形直徑
(a)將FlowCam測量重複進行三次及報告具有標準偏差之其中一個代表值
藉由掃描電子顯微鏡(SEM)之表面形態評估：使用FESEM 7600F(JEOL,Japan)進行SEM成像。藉由使用JFC-1600(JEOL,Japan)(20mA,60sec)將樣本塗佈10nm厚度之鉑及藉由採用FESEM以5.00kV之加速電壓於不同放大率下記錄影像以提供形態資訊/觀察形態特徵。
共焦雷射掃描顯微鏡分析：使用Carl Zeiss LSM700(Germany)共焦顯微鏡進行共焦雷射掃描顯微分析。使用EC Plan-Neofluar100×1.3油物鏡M27透鏡中具有DIC之雷射激發線405nm(6.5%)、488nm(6%)及633nm(6%)。在配備以下發射濾光器：416-477、498-550、572-620之光線倍增管中收集來自天然花粉粒及加載大分子之花粉粒之螢光。將雷射掃描速度設在每一個相(1024×1024：84.94μm2尺寸)67sec及使用具有3.15μsec像素停留時間之平面模式掃描，及每個樣本捕捉至少三個影像且處理所有影像並在相同條件下使用軟體ZESS 2008(ZEISS,Germany)轉化。關於與共焦雷射掃描顯微鏡分析相關之額外資訊，參見下一段落。
天然花粉粒及加載大分子之天然花粉粒之共焦雷射掃描顯微鏡分析：使用配備三個所反射光譜/螢光偵測通道、六個雷射線(405/458/488/514/543/633nm)且連接至Z1倒置顯微鏡(Carl Zeiss,Germany)之Carl Zeiss LSM700(Germany)共焦顯微鏡進行共焦雷射掃描顯微分析。將天然花粉粒及加載大分子之花粉粒固定於黏性載玻片 (Ibidi,Germany)上，添加一滴固定介質(Vectashield®)及用另一黏性載玻片覆蓋花粉粒。立即於以下條件下收集影像：EC Plan-Neofluar 100×1.3油物鏡M27透鏡中具有DIC之雷射激發線405nm(6.5%)、488nm(6%)及633nm(6%)。在配備以下發射濾光器：416-477、498-550、572-620之光線倍增管中收集來自天然花粉粒及加載大分子之花粉粒之螢光。雷射掃描速度設定在每一個相(1024×1024：84.94μm2尺寸)67sec及平面模式掃描之像素停留時間為3.15μsec。將光圈設為對於樣本條件為最佳及在顆粒之中間區域(光切面)捕捉所有影像且所有樣本之其他設置固定為相同及每個不同樣本捕捉至少三個影像並使用軟體ZESS 2008(ZEISS,Germany)在相同條件下處理及轉化所有影像。
6.2.2.4 包覆效率：
將5mg加載BSA之花粉粒懸浮於1.4mL PBS中，渦旋5min及探針音波處理10sec(3個週期，40%振幅)。使用0.45μm PES針筒過濾器(Agilent,USA)過濾溶液以收集經提取之BSA。使用安慰劑提取物作為空白樣本測量280nm下之吸光度(Boeco-S220,Germany)以計算得花粉粒中BSA的量。
將5mg加載BSA之SP懸浮於1.6mL PBS中，渦旋5min及探針音波處理10sec(3個週期，40%振幅)。使用0.45μm PES針筒過濾器過濾溶液以收集經提取之BSA。如下使用安慰劑提取物作為空白樣本測量280nm下之吸光度以計算得花粉粒中BSA的量：
6.2.2.5 活體外藥物釋放研究
活體外藥物釋放研究：將5mg加載BSA之花粉粒及安慰劑懸浮在pH 1.2(0.1M HCl)及磷酸鹽緩衝鹽水(pH 7.4)介質中。在迴旋式振盪器中於37℃在50rpm下培養，於特定時間間隔藉由在14000rpm下離心30s來收集釋放樣本，並補充新鮮釋放介質。使用PES過濾器過濾釋放樣本及使用安慰劑釋放樣本作為空白樣本來測量280nm下之吸光度。使用BSA標準曲線計算所釋放BSA的量。
於模擬胃流體(0.1M HCl,pH 1.2)中之活體外藥物釋放評估：於模擬腸流體(pH 1.2)中之活體外藥物釋放評估：將5mg加載BSA之花粉粒及安慰劑懸浮於pH 1.2介質中。於37℃在50rpm下培養及在5min、15min及30min藉由以14000rpm離心30sec收集釋放樣本，補充新鮮釋放介質及繼續該釋放研究。使用PES膜過濾器過濾釋放樣本及使用安慰劑釋放樣本作為空白樣本測量280nm下之吸光度。使用BSA標準曲線計算所釋放BSA的量。
於模擬腸流體(PBS pH 7.4)中之活體外藥物釋放評估：將5mg加載BSA之花粉粒及安慰劑懸浮於pH 7.4介質中。於37℃在50rpm下培養及在5min、15min及30min藉由以14000rpm離心30sec收集釋放樣本，補充新鮮釋放介質及繼續該釋放研究。使用PES膜過濾器過濾釋放樣本及使用安慰劑釋放樣本作為空白樣本測量280nm下之吸光度。使用BSA標準曲線計算所釋放BSA的量。
6.2.2.6 將加載大分子之天然花粉粒調配至海藻酸鹽珠粒中：
將150mg加載BSA(真空加載)之花粉粒與1.5ml在水中之海藻酸鹽(2%)均勻地混合。使用18G鈍針於磁力攪拌下將所得懸浮液慢慢地添加至10ml氯化鈣(8%)，繼續攪拌5分鐘，及藉由離心移除氯化鈣(1500rpm,2分鐘)。使用1.5ml水洗滌該等珠粒兩次及冷凍乾燥24h。 將所有該等調配物儲藏在-20℃以進行進一步的研究及使用10mg經海藻酸鹽塗佈之花粉粒來進行活體外研究。關於額外資訊，請參見下一段落。
為控制大分子自天然花粉粒之釋放，將該等天然花粉粒併入海藻酸鹽珠粒中。將150mg加載BSA(真空加載)之花粉粒與1.5ml在水中之海藻酸鹽(2%)均勻地混合。使用18G鈍針於磁力攪拌下將所得懸浮液慢慢地添加至10ml氯化鈣(8%)溶液，繼續攪拌5分鐘及藉由離心(1500rpm,2分鐘)接著用1.5ml水洗滌兩次及冷凍乾燥24h來移除氯化鈣。將所有該等調配物儲存在-20℃以進行進一步研究。
6.2.2.7 統計分析
使用雙尾t-測試進行統計分析及將P<0.05視為統計上顯著。重複天然花粉之包覆及釋放實驗至少三次及將所有數據表示為平均值±標準偏差(SD)。
6.2.3 結果及討論
圖10A-10D概述基本水合及包覆製程，接著隨後釋放。水合係以取得具有完整細胞質材料之乾燥向日葵花粉粒(圖10A)及與BSA溶液組合(圖10B)開始。BSA溶液在花粉粒膨脹時被吸收至花粉粒中且BSA溶液充滿藉由膨脹過程所產生的額外體積(圖10C)。該過程可係自然的，如在被動式加載方法中，或係輔助的，如在壓縮或真空加載方法中。在BSA於模擬腸或胃流體中釋放後，雖然所有BSA經釋放，但花粉粒仍維持膨脹(圖10D)。
為展示使用天然花粉粒作為藥物傳遞媒介之平臺技術，已有調理地表徵花粉粒來評估於包覆製程過程中產生之尺寸均勻度、形態及物理變化。為表徵天然花粉粒，吾人採用動態粒子影像分析(DIPA)[31,32](參見支援實驗部分)。圖11A藉由擬合等效球形直徑(ESD)相對頻率之直方圖的曲線顯示代表性數據，其中天然花粉粒之平均ESD為 37.93±1.41μm及經被動式、壓縮及真空加載之花粉粒之ESD分別為36.54±1.45μm、36.95±1.35μm及36.17±1.36μm。天然花粉粒在尺寸方面之均勻度自大分子加載之前及之後之ESD數據獲得證實，此點係粒狀藥物傳遞系統之重要先決條件。[33]除了花粉尺寸均勻度之外，在BSA加載之前及之後測定花粉圓度及藉由如圖11B中所顯示之擬合至圓度相對頻率之直方圖之曲線呈現數據。由於花粉表面上之尖峰之特徵性分佈所致，將BSA加載之前及之後之花粉膠囊形狀視為非圓形，所得圓度值<1(理想圓=1)。用於數據分析之影像之影像焦點品質自圖11C顯而易見，及所呈現之邊緣梯度相對頻率數據指示在DIPA分析中使用高度聚焦之花粉粒。
除了定量數據之外，影像圖12A、12B、12C及12D分別顯示加載之前以及接受被動式、壓縮及真空加載技術之花粉之結構相似性。除了DIPA外，吾人使用掃描電子顯微鏡(SEM)來表徵花粉粒之每一個代表性批次以檢查任何形態變化[13]及加載之前及藉由被動式、壓縮、真空加載技術加載之後之花粉之該等影像分別顯示為圖13A、13B、13C、13D。該等結構及形態觀察指示吾人之花粉粒調配物維持其結構完整性而未發生任何變性，及展現使用不同技術進行大分子包覆後之尺寸均勻度。此點非常重要，因為任何所提出的針對受控及標靶傳遞之藥物傳遞媒介要求尺寸及形狀均勻度以達成有效品質控制及性能，及其可能係包覆製程中控制產品品質之主要挑戰。[34]其從存在花粉孔徑及該等花粉粒表面上之每個尖峰由允許可能吸收大分子及利於花粉水合過程之孔隙包圍之形態觀察顯而易見。[23-26]於大分子包覆後在花粉粒中之加載及包覆效率方面之定量測定結果描述於表7中。被動式及壓縮加載之包覆效率(EE)相似，為37.2±4.4%及37.8±3.2%，而就真空加載製程而言，實現65.7±1.8%之統計顯著性(p<0.05)更高的EE。更高大分子包覆之可能原因從在天然花粉再水合 過程中除了大分子吸收外亦施加真空作為外力顯而易見。[23-26]雖然一些現有的報告討論將藥物包覆至經提取的外壁膠囊中，[15]但吾人已聚焦於涉及通過包覆模型大分子之天然花粉粒之包覆製程。
(a)結果係具有標準偏差之三個批次(n=3)的平均值；(b)理論加載 係基於天然花粉之50%重量：(c)BSA包覆效率係使用5mg加載BSA之 天然花粉粒測定。
為直接定性觀察及明瞭在花粉細胞質成分存在下經加載大分子於花粉內的存在，吾人藉由前述三種技術將與FITC結合之BSA包覆於天然花粉粒中及使用共焦雷射掃描顯微鏡進行分析。捕捉聚焦於花粉粒之中間截面的所有影像。大分子加載前天然向日葵花粉粒之共焦顯微鏡影像呈現於圖14A中。由列(A)明顯可見加載前之花粉粒未觀察到由FITC-BSA所致之綠色，而藍色及紅色通道則顯示來自花粉成分之強的自體螢光，其由其之重疊影像甚至更為明顯。
關於花粉粒，雄性配子體基於例如類胡蘿蔔素、酚醛樹脂及類萜之化合物的存在而展現自體螢光，此點證實天然向日葵花粉中所觀察到的自體螢光。[35]在藉由被動式技術之FITC-BSA加載之情況中(圖14B)，觀察到強綠色螢光，證實大分子加載於天然花粉粒中，及由指示FITC-BSA連同天然花粉成分之所有通道之重疊清楚地明顯可見。在壓縮加載大分子之情況中(圖14C)，吾人亦觀測到亮綠色螢光。然而，此外，儘管花粉粒看來經壓縮，但仍保留其結構完整性。在真空加載之情況下觀察到相對更高的總體螢光(圖14D)，此點支持吾人除 了天然花粉再水合過程之外可藉由施加外部真空力來獲得更高包覆效率之推斷。[23-26]針對藉由真空加載技術加載之加載FITC-BSA之花粉粒進行CLSM Z-堆疊成像(圖15A-15B，於支援資訊中)，以進一步證實FITC-BSA之包覆於天然花粉粒中。
大分子於天然花粉粒中之包覆係明顯可見的，且吾人進一步研究分別在模擬腸(PBS,pH 7.4)及胃條件(pH 1.2)中BSA自該等天然花粉粒之活體外釋放曲線。參見圖16A-16C。於PBS中BSA之活體外釋放(圖16A)表明在前5分鐘釋放80%及在30至60分鐘內觀察到完全釋放。在自採用不同技術製得之加載BSA之花粉粒之釋放之間並無顯著差異(p0.05)。預期高百分比之釋放係由於花粉粒上大量之孔隙及孔徑導致快速釋放所致，此點亦與先前針對石松外壁膠囊所報告之藥物釋放速率類似。[15]在模擬胃條件中(圖16B)，針對所有三種不同加載技術觀察到相似的爆發釋放，表明在模擬胃及腸條件中不存在顯著釋放差異。
此外，為控制大分子釋放，吾人選擇經真空加載之BSA花粉粒來藉由使用氯化鈣之離子交聯併入至天然生物聚合物海藻酸鹽珠粒中。有趣的是，於大分子加載後，花粉粒之孔隙未被顯著覆蓋，然而，於海藻酸鹽塗佈後，清楚地指示花粉孔實質上封閉，因此充作針對大分子釋放之障壁。吾人使用0.1%及0.5%海藻酸鹽之初始花粉塗佈最佳化提供一薄海藻酸鹽塗層，但並不適於調節大分子之釋放。發現使用2%海藻酸鹽溶液之進一步的最佳化(圖17A-17D及圖18A-18D)提供適於延遲大分子釋放之障壁，且亦必需形成黏性足夠的水凝膠以防止塗佈製程期間BSA之滲出。藉由使用2%海藻酸鹽作為水凝膠介質，延遲釋放且延長長達20h，且於兩種模擬條件中塗佈後之釋放相較於塗佈前之釋放存在顯著差異(p0.05)。於模擬胃及腸條件中自經塗佈之花粉粒之BSA釋放間，在胃條件中觀察到更多的延遲釋放。在以往亦 使用海藻酸鹽凝膠微球體的研究中報告相似的釋放曲線[36]，及或者，藉由建構人類血清白蛋白及L-α-二肉豆蔻醯基磷脂酸(DMPA)之自組裝以在藥物晶體上形成逐層組裝亦報告受控藥物釋放。[37-39]基於DMPA之多層方法基於膠囊壁厚度控制藥物釋放[37]且此提供可藉由調節塗層之滲透性來達成對蛋白質釋放之更大控制的進一步證據。
為觀察FITC-BSA釋放後花粉粒之狀況，吾人使用在模擬腸介質中之活體外釋放後的花粉粒及進行共焦顯微鏡分析。圖19A、19B及19C清楚地指示FITC-BSA自採用三種不同技術製得之花粉粒釋放且發現花粉結構保持完整。從CLSM影像亦明顯可見已發生少量的BSA結合至外壁及藉由所得「綠色環」清晰可見。
總之，吾人已首次展示藉由使用基於被動式、壓縮及真空加載之包覆技術包覆作為模型大分子之BSA而將天然花粉粒用作藥物傳遞媒介。採用真空加載技術實現高達65%之包覆，顯示一種包覆治療性化合物於天然花粉粒中之簡單方法。採用該等方法，可開發不同天然花粉粒來以簡單的製程無需使用會損害治療性分子穩定性之嚴苛包覆條件而包覆小分子、蛋白質、肽、生長因子及生物類似物。此外，吾人已展示一種藉由使用天然生物聚合物，通過使海藻酸鹽與鈣離子交聯來延遲花粉粒釋放大分子以實現長達20小時之受控釋放的方法。此在需要不同藥物釋放曲線來改良活性成分之治療效益之治療性分子之受控傳遞領域中尤其受到關注。吾人的群組目前仍持續研究天然花粉粒及其外壁膠囊作為自然來源之有效藥物傳遞載體之用途。
6.2.4 於實例2中引用之參考文獻
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6.3 實例3：5-氟尿嘧啶於天然石松孢子中之包覆及受控釋放調配物
本實例展示一種生產基於天然石松孢子之5-氟尿嘧啶(5-FU)之經口受控釋放調配物之具成本效益之簡單方法。提供於本實例中之數據 證實真空加載技術相比於被動式及壓縮加載技術提供49%之最高包覆效率。加載5-FU之孢子之測微性質確認均勻尺寸分佈，及5-FU孢子之表面特徵分析驗證無殘留5-FU之證據，表明5-FU包覆於孢子內部。加載5-FU之孢子上之均勻Eudragit RS100塗層(ERS)提供5-FU之受控釋放長達30小時。加載5-FU之孢子之所展示特徵指示用於胃腸癌症治療及其他疾病之潛在的經口藥物傳遞系統。
6.3.1 材料及方法
6.3.1.1 材料
使用以下材料：完整石松孢子、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氫氧化銨及乙醇係購自Sigma(Singapore)。聚苯乙烯微球體(50±1mm)係購自Thermoscientific(CA,USA)。Eudragit RS100(ERS)係購自Evonik Industries(Essen,Germany)及全氟烷氧基聚合物(PFA)燒瓶係購自Vitlab(Grossostheim,Germany)。不鏽鋼澆鑄之丸粒壓製模具(13mm)係購自Specac(Kent,UK)。
6.3.1.2 藉由被動式加載技術包覆5-FU於完整石松孢子中
藉由將75mg藥物溶解於1.8mL之乙醇與1N氫氧化銨(1：1)溶液混合物中來製得5-氟尿嘧啶溶液。將完整石松孢子(150mg)懸浮於製得之溶液中。渦旋該懸浮液5min及將管轉移至設在500rpm之恆溫振盪器(Hangzhou Allsheng Inst.Singapore)以進行室溫下2小時的培養。藉由以4500rpm離心3min收集加載5-FU之孢子。使用4mL去離子水洗滌該等孢子及離心以移除黏著表面之5-FU。將加載5-FU之孢子置於-70℃之冷凍機中30min及冷凍乾燥24小時。將所得加載5-FU之孢子儲藏在室溫下的乾燥箱中直到進行進一步的特徵分析。藉由使用如上文所述之相同程序製備不含5-FU之被動式加載安慰劑孢子。
6.3.1.3 藉由壓縮加載技術包覆5-FU於完整石松孢子中
將150mg石松孢子填充於13mm丸粒壓製模具中及在利用5噸負 荷之水壓機下壓縮20sec以形成錠劑(模具直徑13mm；面積132.75mm2；370MPa)。孢子錠劑之尺寸列於表8中。將錠劑浸泡於20mL平底玻璃瓶內的1.8mL 5-FU溶液中2小時以允許吸收5-FU。藉由以4500rpm離心3min收集加載5-FU之孢子。使用4mL去離子水洗滌該等孢子及離心以移除結合表面之5-FU。將該等孢子置於-70℃之冷凍機中30min及冷凍乾燥24小時。將所得的孢子儲藏在乾燥箱中直到進行進一步的特徵分析。藉由使用如上文所述之相同程序製得不含5-FU之壓縮加載安慰劑孢子。
(a)在藉由壓縮技術之5-FU加載中所使用之錠劑及結果係具有標準 偏差之三個批次(n=3)的平均值；(b)在Boeco BBX 22(Germany)分析天 平中測得的重量；(c)使用數位游標卡尺測得之直徑及厚度
6.3.1.4 藉由真空加載技術包覆5-FU於完整石松孢子中
藉由將150mg石松孢子懸浮於1.8mL 5-FU溶液中來進行真空輔助之5-FU加載。漩渦該懸浮液5min。將樣本置於冷凍乾燥機(Lanconco,USA)中及施加1mbar真空持續2小時。停止該製程及使用4mL水洗滌加載5-FU之石松孢子且離心以移除結合表面之藥物。將該等孢子置於-70℃之冷凍機中30min及冷凍乾燥24小時。將所得的孢子顆粒儲藏在乾燥箱中直到進行進一步的特徵分析。藉由使用如上文所述之無5-FU下之相同程序製得不含5-FU之真空加載安慰劑孢子。
6.3.1.5 藉由掃描電子顯微鏡(SEM)之表面形態評估
使用FESEM 7600F(JEOL,Japan)實施加載5-FU之孢子之表面形態評估。藉由使用20mA下之自動精細塗布機JFC-1600(JEOL,Japan) 持續60sec來在每個樣本上沉積10nm厚的鉑塗層。以5kV之加速電壓在不同放大率下取得影像。
6.3.1.6 動態粒子影像分析(DIPA)
將臺上型系統(FlowCamVS,Fluid Imaging Technologies,Maine,USA)安裝視覺試算表軟體第3.4.11版、200μm流動池(FC-200)及20x放大透鏡(Olympus®,Japan)。藉由用1mL去離子水在0.5mL/min流速下沖洗該系統來清潔流動池。使用聚苯乙烯微球體(50±1μm)校準儀器及將操作前體積為0.5mL之完整石松孢子及加載5-FU之孢子加入且轉移至該流動池中。以0.1mL/min之流速及10FPS之圖框速率進行分析得到約9%之取樣效率。每次分析之計數固定在最少10,000個顆粒及藉由邊緣梯度選擇高度聚焦顆粒來進行數據分析。本研究工作中報告之代表性數據為具有標準偏差之三次重複測量(n=3)之平均。
6.3.1.7 製備塗佈Eudragit RS100之孢子調配物
使用Eudragit RS100(ERS)以兩種不同ERS濃度(2.50% w/v及10.0% w/v)塗佈加載5-FU之石松孢子。藉由慢慢地溶解Eudragit RS100於丙酮中來製得塗佈溶液。就塗佈製程而言，將150mg加載5-FU(真空法)之孢子添加至PFA圓底燒瓶內的1.2mL Eudragit RS100溶液中及在真空乾燥器中蒸發溶劑1小時。另外，在真空烘箱(Memmert GmbH,Germany)中於1mbar下乾燥孢子1小時。接著使用瑪瑙研杵及研缽輕輕地將經乾燥之孢子調配物磨粉並儲藏在乾燥箱中直到進行進一步的特徵分析。
6.3.1.8 包覆效率
將10mg加載5-FU之石松孢子懸浮在10mL pH 7.4磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中，使用漩渦混合器(IKA,Staufen,Germany)混合5min，及於室溫在40%振幅下進行探針音波處理(Qsonica,Newtown,USA)15sec(3個週期)。在以4500rpm離心3min後收集上清液及使用UV光譜儀 (Boeco-S220,Germany)以安慰劑孢子作為空白樣本測量266nm下之吸光度。使用以下公式計算得存於完整石松孢子中之5-FU的量：
6.3.1.9 於模擬胃流體(SGF)及模擬腸流體(SIF)中之活體外藥物釋放
首先在SGF中2小時接著在SIF中進行活體外5-FU釋放以模擬胃腸條件。使用具有1.2之pH值之0.1M鹽酸溶液作為SGF及使用具有7.4之pH之PBS緩衝液作為SIF。將10mg加載5-FU之石松孢子懸浮在10mL釋放介質中及在37℃下培養同時在迴旋式振盪培養器(LM-450D,Yihder,Taiwan)中於50rpm下攪拌。在預定的時間點，收集1mL釋放介質且補充新鮮釋放介質。使用UV光譜儀(Boeco-S220,Germany)於266nm下測定釋放樣本中之吸光度。使用在5mL釋放介質中之30mg樣本進行自塗佈Eudragit RS100之5-FU孢子調配物之活體外藥物釋放。
6.3.1.10 統計分析
使用雙尾t-測試進行統計分析及將p<0.05視為統計上顯著。重複天然孢子之5-FU包覆及活體外釋放實驗至少三次及將所有數據表示為平均值±標準偏差(SD)。
6.3.2 結果及討論
6.3.2.1 微包覆5-FU於天然石松孢子中
為包覆5-FU於孢子中，先藉由溶解藥物於乙醇與1N氫氧化銨 (1：1)之混合物中來將5-FU之溶解度提高至50mg/mL。5-FU之較高溶解度有利於孢子中較高之藥物加載，因為孢子中之加載將受到藥物之水溶解度限制(Garea等人，Int.J.Pharm.491(2015)299-309)。藉由將石松孢子懸浮於5-FU溶液中，藥物能夠通過孢子壁上之奈米級通道進入孢子之內腔(Diego-Taboada等人，Pharmaceutics 6(2014)80-96)。採用三種不同包覆技術以加載5-FU至完整石松孢子中，數據呈現於表9中。
(a)理論加載係基於批次之總初始重量(225mg)；(b)結果為三個獨立批次(n=3)之具有標準偏差之平均值；(c)使用10mg加載5-FU之完整石松孢子測定5-FU包覆效率。
就33% 5-FU之理論加載容量而言，真空輔助加載相比於被動式加載技術導致49%之明顯更高之包覆效率(EE)(p<0.05)。在壓縮加載技術之情況中，觀察到相比於真空加載技術相對較低的EE，但不存在顯著差異。該等觀察與藥物分子之加載受到包覆製程中所供應之外部能量影響之事實一致。在被動式加載之情況中，未涉及外力且加載可能受到經由位於孢子壁上之奈米級通道進入內腔之藥物通道限制(Diego-Taboada等人，Pharmaceutics 6(2014)80-96；Barrier等人J.Mater.Chem.21(2011)975-981)。
由於彈性外壁，經壓縮之錠劑使得孢子能夠併入更高藥物濃度至內腔中(Barrier等人，J.Mater.Chem.21(2011)975-981)。值得注意 的是，孢子在5噸下之壓縮並無不利，指示石松孢子之堅固結構。於1mbar下真空輔助加載5-FU至完整石松孢子中有利於迫使藥物分子進入孢子之內腔中。Barrier等人(Diego-Taboada等人，J.Mater.Chem.B.1(2013)707-713；Barrier等人，J.Mater.Chem.21(2011)975-981)報告包覆於自石松孢子製得之孢粉素外壁膠囊(SEC)中之藥物及蛋白質有相似的包覆數據，證實5-FU藉由真空輔助加載進入石松孢子中之較高之EE。在5-FU包覆之情況中，嘗試加載5-FU至交聯天然聚合物中導致基於藥物與聚合物比之EE在8%至53%範圍內。該等結果因此對於如何以藉由採用不同加載技術最佳化包覆效率之方式加載低水溶性藥物提供見解。
6.3.2.2 加載5-氟尿嘧啶之孢子之微粒學性質
為瞭解加載5-FU之石松完整孢子之微粒學性質，如章節6.3中所述對經加載之孢子進行動態粒子影像分析(DIPA)。圖20A-20D說明來自DIPA之結果。由直徑測量(圖20A)顯而易見，具有30±0.45mm之天然直徑之完整孢子在藉由所有三種包覆技術進行5-FU包覆後保持不變。5-FU加載之前及之後之孢子直徑列於表10中。加載5-FU之孢子保持具有均勻尺寸分佈之完整微結構。為研究加載5-FU之孢子之均勻形狀，測定圓度及縱橫比及將數據說明於圖20B及20C中。由圖20B顯而易見，加載5-FU之孢子之圓度接近圓形及藉由三種不同技術將5-FU包覆於孢子中有利於保留孢子之天然形狀。為證實孢子之形狀均勻度，加載5-FU之孢子之縱橫比數據亦指示孢子微結構未改變。如圖20D中所說明之邊緣梯度指示基於影像分析之所有微粒學性質係使用良好聚焦之顆粒獲得。
(a)FlowCam測量重複進行三次及報告具有標準偏差(SD)之其中一個代表值
分別針對5-FU加載之前以及藉由被動式、壓縮及真空加載技術加載之後之孢子，將於DIPA中所捕捉的影像呈現於圖21A-21D。DIPA影像指示於5-FU加載後之所有孢子保留明確界定的微結構，證實針對均勻尺寸分佈之DIPA數據。
為進一步評估加載5-FU之孢子之結構及形態，藉由如章節6.3.1.5中所述之SEM分析於5-FU加載之前及之後之石松孢子。藉由被動式、壓縮及真空進行5-FU加載後之SEM影像分別呈現於圖22A-22D中。5-FU加載前之孢子之結構及形態數據顯示具有網狀結構及均勻尺寸分佈之特徵性明確界定的裝飾。在藉由三種不同包覆技術獲得之加載5-FU之石松孢子的情況中，保留孢子的天然微結構及裝飾。包覆5-FU之孢子顯示經藥物加載甚至在使用外部因素諸如於5噸下壓縮及利用1mbar真空後對孢子微結構無不利影響。加載5-FU之孢子之表面乾淨無任何殘留藥物聚集之跡象，表明所包覆的藥物主要係在孢子內腔內部。因此，加載5-FU之孢子之數據證實所揭示之包覆5-FU於完整石松孢子中之方法提供作為具有均勻尺寸分佈及明確界定表面形態之多顆粒經口傳遞系統之極佳潛力。
6.3.2.3 ERS塗佈
為研究ERS塗佈之效應，對如章節6.3.1.7中所述製得之塗佈ERS之孢子進行SEM分析。圖23A及23B分別說明使用2.5%及10% ERS濃度之塗佈ERS之孢子之SEM影像。塗佈之後完整孢子之表面形態指示孢子經ERS塗佈，及在塗佈10% ERS之孢子之情況中，ERS塗層更 高。位於孢子上之網脊經填充充作針對5-FU釋放之障壁之塗佈材料。
6.3.3 活體外釋放研究
在模擬胃腸條件中進行加載5-FU之孢子之活體外釋放研究。圖24A及24B分別說明SGF(pH 1.2)及SIF(pH 7.4)中之5-FU釋放曲線。在開始的10min內觀察到高達90%之高釋放速率及在60min內觀察到由於通過外壁中之奈米通道離開所致之完全5-FU釋放(Diego-Taboada等人，Pharmaceutics 6(2014)80-96)。類似地，Bhardwaj等人(Bhardwaj等人，Scientific World Journal(2014)705259)使用浮動微球體報告針對胃標靶釋放於SGF中較高之5-FU釋放，及最近，Diego-Taboada等人(Diego-Taboada等人，J.Mater.Chem.B.1(2013)707-713)報告於SGF中於1小時內自石松孢粉素外壁膠囊(SEC)之更高的布洛芬(ibuprofen)釋放。因此，5-FU自天然孢子之釋放指示適於延遲於模擬胃腸條件中之藥物釋放之聚合塗層將係有利的。
為調節5-FU自孢子之釋放，使用聚甲基丙烯酸酯(Eudragit RS 100)塗層。Eudragit RS 100為丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯之共聚物及被廣泛地用作塗層材料以開發受控釋放調配物(Alai等人，J.Microencapsul.30(2013)519-529；Piao等人，AAPS PharmSciTech.11(2010)630-636)。使用不同濃度之Eudragit RS 100之初始塗佈及於模擬胃腸條件中之活體外釋放研究顯示塗佈2.5% w/v及10% w/v ERS可於完整石松孢子上提供適宜塗層。圖24C說明使用塗佈ERS之孢子之活體外釋放曲線之數據，顯示於模擬胃腸條件下ERS塗層顯著地(p<0.05)延遲5-FU釋放。插圖(圖24C)顯示在開始的2小時內釋放約70%之5-FU，及藉由將ERS濃度增加至10%，5-FU釋放降低至50%。另外，活體外5-FU釋放延長長達30小時及塗佈10% ERS之孢子相比2.5%塗層觀察到5-FU釋放之顯著(p<0.05)差異，表明10% ERS塗層有益於實現自完整孢子之受控5-FU釋放。
在塗佈2.5%及10% ERS之完整孢子之情況中，腸包衣覆蓋孢子微結構，藉此封閉外壁上之奈米通道(Diego-Taboada等人，Pharmaceutics 6(2014)80-96)。藉由加載5-FU之孢子上之腸包衣控制自孢子之5-FU釋放。由於ERS之與pH無關的釋放行為，因而未觀察到5-FU自腸包衣孢子釋放之時間延遲。另外，5-FU自塗佈ERS之孢子之釋放基於塗佈孢子中所使用之ERS濃度以受控方式逐漸地減少。活體外釋放數據顯示5-FU自塗佈ERS之孢子之釋放係聚合物自孢子表面侵蝕之結果，因為腸包衣較高，故30小時內之5-FU釋放減低。因此，5-FU自腸包衣孢子釋放之可能機制為溶解、擴散侵蝕之組合及與以往的發現(Piao等人，AAPS PharmSciTech.11(2010)630-636)一致。
因此，5-FU自石松孢子之活體外釋放可在胃腸條件中藉由ERS塗層進行控制。Sanli等人(Sanli等人，Drug Deliv.21(2014)213-220)以在模擬胃腸條件下受控釋放長達12小時報告自改質海藻酸鈉微球體之相似的5-FU釋放曲線。5-FU之受控胃腸釋放極度有益於治療乳癌、胃癌及結腸癌，另外可能避免重複給藥。因此，加載5-FU之石松完整孢子之所揭示的結果顯示完整孢子可包覆並控制5-FU在胃腸條件下之釋放。
6.4 實例4：包覆牛血清於松花粉中
於本實例中，採用三種不同包覆技術(被動式、壓縮及真空加載)將牛血清白蛋白(BSA)加載至完整松花粉粒中。
6.4.1 材料及方法
包覆BSA於天然、未處理之松花粉粒中：在1.5mL聚丙烯管中將75mg BSA(50wt%，以花粉粒重量計)溶解於0.5mL純水中及將150mg完整花粉粒懸浮於BSA溶液中。藉由渦旋(VWR,Singapore)混合該懸浮液5min及將管轉移至於4℃及500rpm下之恆溫振盪器(Hangzhou Allsheng Inst.Singapore)以進行被動式加載。就真空加載技術而言， 使用BSA及花粉粒懸浮液，及在冷凍乾燥器(Labconco,MO,USA)中慢慢地施加2mbar真空。針對所有批次將BSA的量、花粉粒及培養時間(2小時)保持不變，及於培養後藉由以12000rpm離心4min收集加載BSA之花粉粒，使用0.5ml水洗滌，且接著離心以移除黏著表面之BSA。於-70℃之冷凍機中冷凍該等花粉粒30min及冷凍乾燥24小時。將最終的加載BSA之松花粉粒儲藏在-20℃直到進行進一步的特徵分析。如上述實例中所述進行掃描電子顯微鏡分析及加載效率(LE)及包覆效率(EE)之計算。
6.4.2 結果
首先藉由採用如上所述之真空加載技術將BSA加載至完整未處理的松花粉粒。於包覆BSA後，觀察表面潔淨度與洗滌次數之關係。經確定一次水洗即適於移除殘留黏著表面之BSA(參見圖25A，其顯示於0個、1個、2個或3個洗滌步驟後加載BSA之松花粉粒之表面潔淨度)。亦測定每一個洗滌步驟後加載BSA之松花粉調配物之加載效率(LE)及包覆效率(EE)數據。如圖25B中所顯示，在0次洗滌時，於包覆後不久，約80%之BSA仍存於調配物中，及調配物之約27wt.%包含BSA，使得加載比為約1：3(BSA：花粉粒)。於1個洗滌步驟後，約40%之BSA留在調配物中，及調配物之約13wt.%包含BSA，使得加載比為約1：7(圖25B)。隨後的洗滌導致LE及EE兩者進一步減小(圖25B)。使用與FITC結合之BSA(FITC-BSA)允許通過共焦雷射掃描顯微鏡(CLSM)觀察花粉粒中之BSA。如圖25C中所顯示，如藉由共焦雷射掃描顯微鏡所觀察到，大多數FITC-BSA存在於接近松花粉翼腔之表面處。
接著，探索長時間被動式加載BSA於松花粉中之過程。觀察到在一小時的時間內，於10mg/ml及150mg/ml之BSA溶液濃度中培養之松花粉發生最低程度之加載(圖26)。當在1、2、3、7天的時間內進行 松花粉對四種BSA溶液濃度(5、25、125、250mg/ml)之長時間被動式加載時，觀察到第1天、第2天、第3天時中央空腔中之加載增加且在第3天時達到最大，而第3天及第7天的加載看來相同(圖27)。因此，該等結果顯示長時間被動式加載對中央空腔加載更有效，而真空加載對翼空腔加載更有效。
6.5 實例5：包覆牛血清於山茶花粉中
於本實例中，採用被動式加載技術將牛血清白蛋白(BSA)加載至完整山茶花粉粒中。
6.5.1 材料及方法
包覆大分子於天然花粉粒中：在1.5mL聚丙烯管中將75mg BSA(50wt%，以花粉粒重量計)溶解於0.5mL純水中及將150mg完整山茶花粉粒懸浮於BSA溶液中。藉由渦旋(VWR,Singapore)混合該懸浮液5min及將管轉移至於4℃及500rpm下之恆溫振盪器(Hangzhou Allsheng Inst.Singapore)(未經洗滌)以進行被動式加載。如上述實例中所述進行掃描電子顯微鏡分析。
6.5.2 結果
探索長時間被動式加載BSA於松花粉中之過程。在1小時的時間內，針對於150mg/ml之BSA溶液濃度中培養之山茶花粉觀察到顯著加載(圖28)。結果顯示其中一個山茶花粉粒(虛線正方形)在9min至20min間的培養時間開始發生加載。大多數的山茶花粉粒在約20min的培養時間後顯示顯著的BSA加載。
6.6 實例6：包覆鈣黃綠素於石松孢子中
於本實例中，採用被動式加載技術將鈣黃綠素加載至完整石松孢子中。
6.6.1 材料及方法
鈣黃綠素(藥品級)、完整石松孢子及其他溶劑係購自Sigma- Aldrich(Singapore)。聚苯乙烯微球體(50±1μm)係購自Thermoscientific(CA,USA)。
包覆鈣黃綠素於石松孢子中。採用改良之被動式加載技術進行鈣黃綠素之加載於孢子中。藉由將22mg鈣黃綠素溶解於2.2mL DMSO中，及在50mL聚丙烯管中將孢子(1g)懸浮於鈣黃綠素溶液中來加載鈣黃綠素混合物。使用漩渦混合器(IKA,Staufen,Germany)混合懸浮液10分鐘以形成均質懸浮液。在室溫下培養鈣黃綠素懸浮液過夜，並於200rpm下斷續攪拌5小時。採用真空過濾來過濾該懸浮液。將加載鈣黃綠素之調配物轉移至250ml燒杯，使用40ml熱水(45℃)洗滌，並收集。於-20℃下冷凍所收集的調配物1小時，及冷凍乾燥(Labconco,MO,USA)24小時。收集孢子調配物，稱重及儲藏在乾燥箱中直到進行進一步的特徵分析。
共焦雷射掃描顯微(CLSM)分析：使用Carl Zeiss LSM700(Germany)共焦顯微鏡進行共焦雷射掃描顯微(CLSM)分析。使用於EC Plan-Neofluar100x1.3油物鏡M27透鏡中具有微分干涉差(DIC)之雷射激發線405nm(6.5%)、488nm(6%)及633nm(6%)。在配備以下發射濾光器之光線倍增管中收集來自加載鈣黃綠素之孢子之螢光：416-477nm、498-550nm及572-620nm。將雷射掃描速度設定在每一個相(1024×1024：84.94μm2尺寸)67sec及使用具有3.15μsec像素停留時間之平面模式掃描。每個樣本捕捉至少三個影像及在相同條件下使用軟體ZEN 2008(ZEISS,Germany)處理並轉化所有影像。
6.6.2 結果
探索被動式加載鈣黃綠素於石松孢子中之過程。通過使用共焦掃描雷射顯微鏡(CLSM)，觀察到在加載之後大量鈣黃綠素存在於孢子中(比較圖29B(加載後之影像)與圖29A(加載前之影像))。
6.7 實例7：包覆山茶油於山茶花粉中
於本實例中，採用真空加載技術將山茶油加載至完整山茶花粉粒中。
6.7.1 材料及方法
包覆油於天然花粉粒中：在1.5mL聚丙烯管中將1mg尼羅紅(nile red)溶解於0.5ml山茶油中及將150mg完整山茶花粉粒懸浮於油溶液中。藉由渦旋5min混合該懸浮液，且接著在未經洗滌下，在冷凍乾燥器(Labconco,MO,USA)中慢慢地施加2mbar真空。
探索真空加載油於山茶花粉中之過程。通過使用共焦掃描雷射顯微鏡(CLSM)，觀察到在真空加載之後大量山茶油存在於山茶花粉調配物中(圖30)。
圖31A及31B說明如藉由DIPA測得之完整山茶花粉粒之尺寸及形態與山茶花粉粒的經分離孢粉素外壁膠囊(SEC)之尺寸及形態明顯不同。DIPA係如上述實例中所述進行。完整花粉粒之平均直徑為平均37nm，相較於SEC的平均直徑為31nm。此外，相較於SEC的較光滑表面，完整花粉粒展現更多的特徵性表面特徵。
6.8 實例8：包覆咖啡因於石松孢子及受控釋放調配物中
於本實例中，採用改良之被動式加載技術將咖啡因(CF)加載至完整石松孢子中。
6.8.1 材料及方法
咖啡因(藥品級)、石松孢子及其他溶劑係購自Sigma-Aldrich(Singapore)。聚苯乙烯微球體(50±1μm)係購自Thermoscientific(CA,USA)。
包覆咖啡因(CF)於石松孢子中：採用改良之被動式加載技術進行咖啡因之加載於孢子中。將等同於50%理論加載之CF溶解於含或不含共包覆劑(1.8% w/v,Eudragit RS 100)之11mL二氯甲烷中。在50mL聚丙烯管中將孢子(1g)懸浮於CF溶液中。使用漩渦混合器(IKA, Staufen,Germany)混合該懸浮液10min以形成均質懸浮液。在室溫下培養該CF懸浮液過夜，並於200rpm下斷續攪拌5小時。藉由使用真空過濾來過濾該懸浮液。接著將加載CF之調配物轉移至250ml燒杯及使用40ml熱水(45℃)洗滌。於收集之後，在-20℃下冷凍調配物1小時及冷凍乾燥(Labconco,MO,USA)24小時。收集孢子調配物，稱重及儲藏在乾燥箱中直到進行進一步的特徵分析。除了CF之外以相同程序製備安慰劑孢子，及亦於室溫下儲藏在乾燥箱中。
為藉由CLSM研究CF包覆，根據相同程序藉由將22mg鈣黃綠素溶解於2.2mL DMSO中及與上述CF溶液均勻地混合來加載螢光鈣黃綠素-CF混合物。針對一些加載CF之孢子，根據先前段落中所述之利用共包覆劑(1.8% w/v,Eudragit RS 100)之製程與CF一起施用額外的共包覆劑Eudragit RS 100(ERS)。
藉由掃描電子顯微鏡(SEM)之表面形態評估：使用FESEM 7600F(JEOL,Japan)來進行SEM影像處理。使用JFC-1600(JEOL,Japan)(20mA,60sec)將CF加載之前及之後之孢子塗佈10nm厚的鉑。利用5.00kV之加速電壓在不同放大率下記錄影像以觀察CF包覆於孢子中之前及之後之形態變化。
動態粒子影像分析(DIPA)：藉由配備200μm流動池(FC-200)及20X放大鏡(Olympus®,Japan)之臺上型系統(FlowCamVS,Fluid Imaging Technologies,Maine,USA)分析CF加載之前及之後之孢子之微粒學性質。用1mL去離子水(Millipore,Singapore)以0.5ml/min之流速沖洗該系統及在每次樣本操作之前目測檢視流動池清潔度。手動將利用2mg/ml之濃度加載CF之前及之後之孢子加入至流動池(操作前體積為0.5mL)中及以0.1ml/min之流速及14框/s之攝影速率分析得到約12.2%之採樣效率。每次測量將最少10,000個孢子固定為顆粒計數及進行三次獨立的測量。使用自原始數據藉由基於邊緣梯度離析獲得之 1000個良好聚焦之孢子進行數據分析。使用聚苯乙烯微球體(50±1μm)校準儀器。使用三次獨立測量之平均值±標準偏差報告直徑、圓度、縱橫比及邊緣梯度之B-樣條曲線。
共焦掃描顯微鏡。使用Carl Zeiss LSM700(Germany)共焦顯微鏡進行共焦雷射掃描顯微分析。使用於EC Plan-Neofluar100x1.3油物鏡M27透鏡中具有微分干涉差(DIC)之雷射激發線405nm(6.5%)、488nm(6%)及633nm(6%)。在配備以下發射濾光器之光線倍增管中收集來自加載CF-鈣黃綠素之孢子之螢光：416-477nm、498-550nm及572-620nm。將雷射掃描速度設在每一個相(1024×1024：84.94μm2尺寸)67sec及使用具有3.15μsec像素停留時間之平面模式掃描且每個樣本捕捉至少三個影像及在相同條件下使用軟體ZESS 2008(ZEISS,Germany)處理並轉化所有影像。
測定CF包覆效率：將10mg加載CF之孢子懸浮於10mL PBS中，接著渦旋10min然後藉由以4500rpm離心5min收集上清液及使用0.45μm PES針筒過濾器(Agilent,CA,USA)過濾。重複CF提取兩次及將所有經提取之CF溶液合併在一起以測定吸光度。在具有共包覆劑之CF調配物之情況中，將10mg加載CF之孢子懸浮於1ml DCM中，渦旋5min以溶解共包覆劑聚合物。經10min添加10ml PBS渦旋物及於4500rpm下離心5min。收集水層及使用Advantech濾紙過濾溶液。根據相同程序重複CF提取。於275nm(Boeco-S220,Germany)下使用安慰劑提取物作為空白樣本測定吸光度值及使用CF標準曲線及以下公式計算孢子中CF的量：
加載CF之孢子之活體外釋放研究：為預測加載CF之孢子調配物之活體外釋放曲線，在模擬唾液流體pH 6.8(SSF)中進行長達5min的釋放研究。將10mg加載CF之孢子懸浮於20mL SSF中及在迴旋式振盪培養器LM-450D(Yihder,Taiwan)中於37℃、50rpm下培養。在預定的時間點，收集1ml釋放樣本並補充新鮮釋放流體。使用UV光譜儀(Boeco-S220,Germany)於275nm下以安慰劑作為空白樣本測定釋放樣本之吸光度。
統計分析：使用雙尾t-測試進行統計分析及將p<0.05視為統計上顯著。將三次獨立實驗之包覆效率及活體外釋放數據報告為平均值±標準偏差。
6.8.2 結果
圖32A-32B顯示藉由SEM之CF加載之前(圖32A)及CF加載之後之包含共包覆劑Eudragit RS 100(ERS)之石松孢子。加載CF之孢子之微粒學性質確認均勻尺寸分佈，顯示為單分散多顆粒之味道掩蔽調配物。掃描電子顯微鏡及共焦雷射掃描顯微分析確認咖啡因包覆於孢子中而無CF殘留於表面上。圖33A-33B顯示CF-鈣黃綠素加載之前(圖33A)及CF加載於具有共包覆劑ERS之孢子中之後之具有孢原質之孢子之CLSM影像。藉由Eudragit RS 100(ERS)作為共包覆劑進行包覆之CF提供最高的包覆效率12%。
於模擬唾液流體中之活體外釋放曲線確認相比於CF與孢子之物理混合物較低之釋放曲線。CF自具有ERS作為共包覆劑之加載CF之孢子之受控釋放確認延長CF釋放長達24小時，表明CF味道掩蔽調配 物適用於經口受控釋放應用(圖34)。
表11提供採用上文所述之改良之被動式加載技術加載於石松孢子中之咖啡因之百分率。
(a)理論加載係基於批次之總初始重量(2g)中之CF。(b)結果為三 個獨立批次(n=3)之具有標準偏差之平均值。(c)CF包覆效率係使用10mg加載CF之石松孢子測定。
6.9 實例9：藉由包覆咖啡因於石松孢子中來掩蔽味道
於本實例中，採用如上述實例中所述之被動式加載研究實例8之具有ERS作為共包覆劑之加載CF之石松孢子之味道掩蔽性質。
在知情同意的健康人類志願者中於機構倫理委員會批准下進行人類味道掩蔽研究。選擇任一性別的年齡範圍在18歲與47歲之間之人類個體。有發燒、感冒、吸煙、口瘡、傷口之個體排除在研究之外，納入標準為滿足基本知覺標準之健康志願者。評估所選擇的健康志願者以建立其對咖啡因苦味之基本知覺水平。使用紅外(IR)溫度計記錄舌頭表面溫度及進行純CF之篩選以確定個體的臨限值及針對CF之苦味識別知覺。招募十位對CF標準溶液報告苦味之人類志願者來進行味道試驗。
首先，人類志願者以水(空白樣本)及不同CF劑量(0.5、1、5、10mg)開始經口投與2mL純咖啡因溶液。要求志願者以0至5分對每個溶液進行苦味評分，其中0表示無苦味及5表示極苦。在此步驟中，評估所有人類志願者之苦味識別臨限值。基於合格的志願者選擇及24小時 之清除期，要求志願者將測試產品(CF與孢子之物理混合物及加載CF之孢子)置於其舌上持續30sec時間。隨機(盲目)投與兩種產品及指導志願者以0至5分對該等產品評分。將所有人類志願者提供的分數平均及表示為平均值±SD。使用t-測試在95%置信水平下比較CF與孢子之物理混合物與加載CF之孢子調配物之間的平均分數。將P<0.05視為統計上顯著。
(a)評估分數係基於0至5分：0為不苦及5為最苦。
(b)人類志願者藉由1mg CF達到之味道臨限值。
表12列出所有人類志願者對包括下列調配物之個別苦味評估分數：水、含於2ml水中之0.5mg、1mg、5mg及10mg之CF、CF與石松孢子之物理混合物(陰性對照)及加載CF/經ERS共包覆之石松孢子(引導調配物)。圖35A及35B顯示該等調配物之對應苦味評分直方圖。
因此，咖啡因之苦味可藉由以改良之被動式加載技術包覆CF於石松孢子中或藉由經ERS共包覆有效地被掩蔽。人類試驗之結果確認CF之味道藉由包覆CF之孢子調配物掩蔽，使得其適用於掩蔽商業食 品補充劑及藥品之苦味。
6.10 實例10：藉由UV/臭氧暴露改質疏水性表面
於本實例中，研究天然山茶花粉粒之表面改質。
6.10.1 材料及方法
使用紫外線(UV)臭氧清潔器之表面改質：藉由暴露於UV-臭氧清潔器改質花粉粒之表面。將完整山茶花粉粒(約50mg)之薄層平整地鋪在90×15mm培養皿上及使用臺上型PSD系列UV-臭氧清潔器(Novascan,United States)進行UV-臭氧處理。花粉粒之UV-臭氧處理在30sec至120min範圍內。
接觸角測量：將經UV-臭氧處理之花粉之薄層鋪於載玻片上之自黏碳帶上。使2μL水珠慢慢地降低至花粉層上。使用具有OneAttension 1.0軟體之Attension θ光學張力計(Biolin Scientific Holding AB,Sweden)測量接觸角。於0.7X放大率下進行測量及以12框/sec(fps)測量10sec。
6.10.2 結果
圖36說明經UV-臭氧處理之山茶花粉粒之接觸角數據，其顯示接觸角隨著UV-臭氧處理持續時間之增加而減小。藉由UV-臭氧處理山茶花粉導致接觸角隨著UV-臭氧處理持續時間之增加而減小。所觀察到接觸角之減小指示於通過暴露於UV-臭氧改質花粉表面後花粉粒之疏水性減小。
如圖37-42中進一步說明，UV-臭氧處理改良花粉粒及孢粉素外壁膠囊(SEC)之親水性以促進花粉粒及其中所包覆材料之水性分散。圖37顯示經UV-臭氧處理及未經處理之花粉粒之SEM影像，指示在經UV-臭氧處理之花粉粒之情況中經改良之表面粗糙度。圖39顯示經UV-臭氧處理及未經處理之山茶SEC之SEM影像。圖38顯示經UV-臭氧處理及未經處理之山茶花粉粒之水溶液。圖40顯示經UV-臭氧處理及 未經處理之山茶SEC之水溶液。圖41A顯示山茶籽油之水溶液。圖41B顯示未加載及未經處理山茶SEC之水溶液。圖41C顯示經油加載、經乙醇洗滌且經UV-臭氧處理之山茶SEC之水溶液。圖42顯示說明大分子包覆於山茶花粉粒及SEC中之CLSM影像。
本說明書中所引述之所有公開案、專利及專利申請案係以引用之方式併入本文，如同各個別公開案或專利申請案經明確及個別地表明通過引用之方式併入般。雖然為清楚理解起見，已藉由說明及實例相當詳細地說明前述發明，但熟悉此項技術者根據本發明之教示將容易明白在不脫離隨附申請專利範圍之精神或範疇下可對其進行某些改變及修改。

Claims (45)

  1. 一種完整孢子，其經工程化以包覆所關注的化合物或物質。
  2. 一種完整孢子，其經工程化以包覆所關注的化合物或物質及經塗佈試劑以利於自該完整孢子控制釋放該所關注的化合物或物質。
  3. 一種完整孢子，其經工程化以包覆所關注的化合物或物質及有利於自該完整孢子控制釋放該所關注的化合物或物質之試劑。
  4. 如請求項1、2或3之完整孢子，其中該完整孢子為冷杉(Abies)孢子、田頭菇(Agrocybe)孢子、黑麯黴(Aspergillus niger)孢子、枯草桿菌(Bacillus subtilis)孢子、小雞油菌(Cantharellus minor)孢子、附球孢菌(Epicoccum)孢子、南瓜(Cuburbita)孢子、小西葫蘆(Cucurbitapapo)孢子、靈芝(Ganomerma)孢子、石松(Lycopodium clavatum)孢子、勿忘草(Myosotis)孢子、青黴菌(Penicillium)孢子、黑團孢菌(Periconia)孢子、黑麥草孢子、提摩西草(Timothy grass)孢子、玉米(maize)孢子、大麻孢子、油菜麻(rape hemp)孢子、小麥孢子、蕁麻(Urtica dioica)孢子、向日葵孢子、玉米(corn)孢子、松樹孢子、香蒲(cattail)孢子、油菜孢子、蒲公英孢子、黑麥孢子、酒神菊(Baccharis)孢子、小球藻(Chorella)、山茶(Camellia)孢子、豬草孢子、桑椹孢子或胡桃孢子。
  5. 如請求項1、2或3之完整孢子，其中該完整孢子具有在0.5μm至300μm範圍內之尺寸。
  6. 如請求項5之完整孢子，其中該完整孢子具有在40μm至100μm範圍內之尺寸。
  7. 如請求項6之完整孢子，其中該完整孢子具有在1μm至40μm範圍內之尺寸。
  8. 如請求項5之完整孢子，其中該完整孢子具有在1μm至100μm範圍內之尺寸。
  9. 如請求項1至8中任一項之完整孢子，其中該化合物或物質為治療劑。
  10. 如請求項9之完整孢子，其中該治療劑為有機小分子、肽、核酸、蛋白質、聚合物、生物劑、蛋白質之藥物製劑、草藥、無機化合物、有機金屬化合物、鋰、基於鉑之試劑或鎵。
  11. 如請求項1至8中任一項之完整孢子，其中該化合物或物質為油。
  12. 如請求項1至8中任一項之完整孢子，其中該化合物或物質為香味劑。
  13. 如請求項1至8中任一項之完整孢子，其中該化合物或物質為清潔劑。
  14. 如請求項1至8中任一項之完整孢子，其中該化合物或物質為消毒劑。
  15. 如請求項1至8中任一項之完整孢子，其中該化合物或物質為殺蟲劑。
  16. 如請求項1至8中任一項之完整孢子，其中該化合物或物質為草藥。
  17. 如請求項1至8中任一項之完整孢子，其中該化合物或物質為食物成分。
  18. 如請求項17之完整孢子，其中該食物成分為咖啡因。
  19. 如請求項1至8中任一項之完整孢子，其中該化合物或物質為除草劑。
  20. 如請求項1至8中任一項之完整孢子，其中該化合物或物質為燃料。
  21. 一種調配物，其包含如請求項1至20中任一項之完整孢子及稀釋劑或載劑。
  22. 一種調配物，其包含如請求項1至9中任一項之完整孢子及稀釋劑或醫藥上可接受之載劑。
  23. 如請求項22之調配物，其係用於局部投與。
  24. 如請求項22之調配物，其係用於非經腸投與。
  25. 一種治療個體之疾病或病症之方法，其包括投與如請求項22、23或24之調配物，其中包覆在該完整孢子中之治療劑係有利於治療該疾病或病症。
  26. 一種化妝品或個人護理產品，其包含如請求項1至9中任一項之完整孢子。
  27. 一種食品或飲品，其包含如請求項1至8、16、17或18中任一項之完整孢子。
  28. 一種草藥產品，其包含如請求項1至8或16中任一項之完整孢子。
  29. 一種殺蟲劑，其包含如請求項1至8或15中任一項之完整孢子。
  30. 一種除草劑，其包含如請求項1至8或19中任一項之完整孢子。
  31. 一種掩蔽化合物或物質之味道之方法，其包括將該化合物或物質包覆於完整孢子中及將該完整孢子調配於飲品或食品中。
  32. 如請求項31之方法，其中該包覆包括使該化合物或物質與該完整孢子接觸。
  33. 如請求項31之方法，其中該包覆包括使該化合物或物質與該完整孢子在真空壓力下接觸。
  34. 如請求項31、32或33之方法，其進一步包括將該完整孢子塗佈用於控制該化合物或物質自該孢子之釋放之試劑。
  35. 一種改良化合物或物質之穩定性之方法，其包括將該化合物或 物質包覆於完整孢子中。
  36. 如請求項35之方法，其中該包覆包括使該化合物或物質與該完整孢子接觸。
  37. 如請求項35之方法，其中該包覆包括使該化合物或物質與該完整孢子在真空壓力下接觸。
  38. 如請求項35、36或37之方法，其進一步包括將該完整孢子塗佈用於控制該化合物或物質自該完整孢子之釋放之試劑。
  39. 一種使皮膚去角質之方法，其包括使個體之皮膚與包含完整孢子之調配物接觸。
  40. 一種使皮膚去角質之方法，其包括使個體之皮膚與包含經工程化以包覆有益於或適用於化妝或個人護理產品之化合物或物質之完整孢子之調配物接觸。
  41. 一種降低化合物或物質之毒性之方法，其包括將該化合物或物質包覆於完整孢子中。
  42. 如請求項41之方法，其中該包覆包括使該化合物或物質與該完整孢子接觸。
  43. 如請求項41之方法，其中該包覆包括使該化合物或物質與該完整孢子在真空壓力下接觸。
  44. 如請求項41、42或43之方法，其進一步包括將該完整孢子塗佈用於控制該化合物或物質自該完整孢子之釋放之試劑。
  45. 一種製備包含所關注的化合物或物質及如請求項1至20中任一項之完整孢子之調配物之方法，其包括將該所關注的化合物或物質包覆於該完整孢子中。
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