TW201639957A - Ｃｈｏ－ｍｉｆ基因及蛋白質之特徵及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於在抗MIF抗體之生產中特定CHO-MIF複合物之特異性及高敏感偵測。本發明進一步係關於提供可用於CHO-MIF偵測方法之特異性抗體。 本發明亦係關於一種CHO MIF剔除細胞株及其用途。本發明亦提供製劑，其獲自實質上不含CHO-MIF之CHO細胞株之重組生產。

Description

CHO-MIF基因及蛋白質之特徵及其用途
本發明係基於CHO-MIF基因之識別及特徵。此可提供CHO-MIF剔除細胞及建立尤其在抗MIF抗體之生產中對特定CHO-MIF複合物之高敏感偵測方法的基礎。本發明進一步係關於提供具優勢多株兔抗血清，其可用於CHO-MIF偵測方法。此外，展示一種藉由剔除CHO細胞中之內源基因而避免抗MIF抗體受CHO-MIF污染之方法。
巨噬細胞移動抑制因子(MIF)係一種基於其抑制自結核菌素過敏天竺鼠單離之腹膜滲出液細胞(含有巨噬細胞)之體外隨機移動的能力的細胞介素(Bloom等人，Science 1966，153,80-2；David等人，PNAS 1966，56，72-7)。如今，MIF被稱為先天性及後天性免疫反應之關鍵上游調節劑，其產生多效活性譜。
人類MIF cDNA係於1989年選殖(Weiser等人，PNAS 1989，86，7522-6)，而其基因組位置經定位於染色體22。人類MIF基因之產物係具有114個胺基酸(在N-末端甲硫胺酸裂解後)及約12.5kDa之表觀分子量之蛋白質。MIF與任何其他蛋白質不具有顯著序列同源性。該蛋白質結晶成含相同亞單元之三聚物。各單體含有兩個反平行α螺旋，其等包裝四股β折疊。單體具有另外兩股β股，其等與鄰接亞單元之β折疊相互作用以形成單體間之介面。三個亞單元經排列以形成含有溶劑 可進入通道之筒管，該溶劑可進入通道沿分子三重軸通過蛋白質中心(Sun等人，PNAS 1996，93，5191-5196)。
據報導巨噬細胞之MIF分泌係在極低濃度糖皮質激素下被誘發(Calandra等人，Nature 1995,377,68-71)。然而，MIF亦反調節糖皮質激素之作用且刺激諸如腫瘤壞死因子TNF-α及介白素IL-1β之其他細胞介素之分泌(Baugh等人，Crit Care Med 2002,30,S27-35)。MIF亦展現(例如)前血管生成、前增生及抗細胞凋亡性質，藉此促進腫瘤細胞生長(Mitchell,R.A.,Cellular Signalling,2004.16(1)：p.13-19；Lue,H.等人，Oncogene 2007.26(35)：p.5046-59)。例如，其亦與淋巴瘤、黑色素瘤及結腸癌密切相關(Nishihira等人，J Interferon Cytokine Res.2000,20：751-62)。
MIF係許多病理學病況之介體及因此與各種不同疾病有關，尤其包括發炎性腸病(IBD)、類風濕性關節炎(RA)、急性呼吸窘迫症候群(ARDS)、哮喘、腎小球腎炎、IgA腎病、心肌梗塞(MI)、敗血症及癌症，但不限於此。
已開發多株及單株抗MIF抗體來對抗重組人類MIF(Shimizu等人，FEBS Lett.1996；381,199-202；Kawaguchi等人，Leukoc.Biol.1986,39,223-232，及Weiser等人，Cell.Immunol.1985,90,16778)。
已建議將抗MIF抗體用於治療用途。據報導Calandra等人(J.Inflamm.1995.47,39-51)使用抗MIF抗體以保護動物避免實驗誘發之革蘭氏陰性及革蘭氏陽性敗血症休克。建議將抗MIF抗體用作調節敗血症休克及其他發炎性病態中之細胞介素產生之療法。
US 6,645,493揭示自融合瘤細胞衍生之單株抗MIF抗體，其中和MIF之生物活性。在動物模型中顯示，此等小鼠衍生之抗MIF抗體在內毒素誘發休克之治療中具有有利作用。
US 200310235584揭示在動物中製備MIF之高親和性抗體之方 法，於該等動物中MIF基因已經同源剔除。
糖基化作用抑制因子(GIF)係Galat等人所描述之蛋白質(Eur.J.Biochem,1994,224,417-21)。現時已知曉MIF與GIF一致。Watarai等人(PNAS 2000,97,13251-6)描述結合至不同GIF抗原決定部位以識別Ts細胞中之GIF轉譯後修飾之生物化學屬性之多株抗體。
鑒於MIF/GIF之明顯生物重要性，因此極需提供經純化之抗MIF抗體作為診斷及治療工具。
顯然，需要生產抗MIF抗體，藉此使此等抗體不受污染。
現今已知用於生產抗MIF抗體之各種方法。一個主要方法係利用抗MIF抗體之重組生產，藉此使宿主細胞表現出所需之抗MIF抗體產物。
中國倉鼠卵巢(CHO)細胞係自中國倉鼠(灰倉鼠(Cricetulus griseus))之卵巢衍生之細胞株。其等頻繁且廣泛地用於治療性蛋白質(例如抗體)之生物及醫學研究生產中。
現今，CHO細胞係重組蛋白質治療劑(包括抗體)之工業生產之最常用哺乳動物宿主。
CHO細胞已成為一種細胞株選擇，係因其等呈快速生長及高蛋白生產。其等已成為現今研究及生物技術中大腸桿菌(E.coli)之哺乳動物等效物，尤其是當需要長期、穩定基因表現及高蛋白質產率時。
然而，本發明人在將CHO細胞用作宿主細胞以研究抗MIF抗體之可行適宜生產及純化製程時，發現CHO細胞自身產生MIF。此出乎意料地不同於例如當自融合瘤細胞製備MIF或製備多株抗血清時的情況，在此等情況中不發現此類或相應污染。由CHO細胞產生之MIF係中國倉鼠MIF，係因該等CHO細胞係自中國倉鼠之卵巢細胞衍生。此「中國倉鼠MIF」(於上下文中亦稱為「CHO-MIF」)，可能由於CHO-MIF與其他(例如人類)MIF之間之高同源性，亦結合至將生產之抗MIF 抗體。因此，內源CHO-MIF可能會污染以非CHO-MIF(例如人類MIF或小鼠MIF)為目標(例如複合至所需之抗MIF抗體)之最終基於CHO-細胞之抗體製劑。
因此，需提供一種不產生可能污染性CHO-MIF之細胞株；亦需要一種敏感方法，其偵測在產生CHO-MIF之CHO細胞中所產生之抗-MIF抗體製劑中的微量CHO-MIF污染物，及一種特異性方法，其用於生產及純化未受CHO-MIF污染之此類抗-MIF抗體製劑。在提供實質不含CHO-MIF之CHO細胞株及開發針對潛在CHO-MIF污染物之敏感偵測方法之前，需識別及特徵化作為起點之CHO-MIF基因以解決上述問題。
亦需要提供如野生型CHO細胞株之類似生長及生產特性之CHO-MIF細胞株。
發明人已成功識別及特徵化CHO-MIF基因。在彼基礎上，發明人進一步成功地提供容許在CHO細胞中生產及測試抗-MIF抗體製劑之工具及方法，該等製劑實質上不含污染性CHO-MIF。此等工具及方法進一步容許生產及測試在CHO細胞中所產生之所有重組製劑，其等包含重組CHO-MIF-結合蛋白質，因此，此等製劑實質上不含污染性CHO-MIF。就此而論之重組CHO MIF結合蛋白質係結合至CHO MIF之蛋白質；因此，該蛋白質在免疫試驗條件下結合至CHO MIF，藉此可將各種不同的免疫試驗模式用於確定此結合，正如熟習本項技術者所熟知。例如，通常將固相ELISA免疫試驗用於確定此類結合反應；參見Harlow及Lane(1988)，Antibodies,A Laboratory Manual,Col Spring harbour publications,New York，關於可使用之免疫試驗模式及條件的敘述。
因此，本發明係關於編碼CHO-MIF之基因座之分析。此容許產 生MIF剔除CHO細胞，該等細胞產生重組抗體或其他產物，較佳以人類MIF為目標且實質不含任何CHO-MIF污染物之抗體。
本發明進一步係關於成功剔除CHO-MIF基因之剔除細胞株。
本發明亦係關於偵測ppm濃度下之CHO-MIF之高敏感方法，於CHO細胞產物，特定言之，抗體及甚至更佳抗MIF抗體或其抗原結合片段產生期間，在某些情況中CHO-MIF可始終黏附於所需產物。於一較佳實施例中，此偵測方法係基於高特異性抗CHO-MIF抗體之產生及純化，該等抗體係經親和性純化之多株兔抗體。
只有利用如本發明中所描述之可偵測極微量CHO-MIF之偵測方法，才能保證最終製劑為純製劑及特定言之不含CHO-MIF。藉此，發明人成功提供在CHO細胞中產生之重組產物製劑，其包含在CHO-MIF存在之情況下可結合至CHO-MIF之產物，其中該製劑實質上不含CHO-MIF。較佳，CHO細胞中所產生之產物係抗體，更佳抗MIF抗體，極佳抗人類MIF抗體。
此等抗人類MIF抗體之較佳實施例描述於下文及分別命名為RAB4、RAB0、RAB9、RAM4、RAM0及RAM9。
因此，本發明提供一種如上定義之重組製劑，其滿足品質控制要求，尤其是關於使CHO-MIF污染物實質上不存在。
本發明進一步係關於編碼CHO細胞所產生之CHO-MIF之mRNA之單離。根據本發明，將藉由此mRNA反轉錄形成之cDNA選殖至原核表現載體中。在大腸桿菌中所表現之CHO-MIF蛋白質係經同源性純化。將重組CHO-MIF用於免疫兔子以產生本發明之對CHO-MIF特異之多株兔抗體。
本發明於以下附圖中進一步描述：圖1：描述CHO-MIF編碼區之核苷酸及胺基酸序列。泳道1顯示 胺基酸之編號，以ATG開始做為位置+1。泳道2顯示胺基酸名稱。泳道3顯示編碼此等胺基酸之DNA序列三聯體。泳道4顯示鹼基對編號。CHO-MIF之總長度為115個胺基酸，由345個鹼基對轉譯而成。
圖2：顯示CHO-MIF基因座之組織。基因組DNA(泳道2：gDNA，SEQ ID NO：14)組織在3個外顯子中，由兩個內含子分隔，如泳道1中所示。cDNA(泳道3，SEQ ID NO：15(外顯子1)、16(外顯子2)及17(外顯子3))轉譯為泳道4中所顯示之CHO-MIF蛋白質序列(SEQ ID NO：18(外顯子1)、19(外顯子2)及20(外顯子3))。cDNA之3'-未轉譯區係於轉譯停止密碼子TGA後至聚腺苷酸尾。基因之轉譯部分在框中。
圖3：係基於pET19b載體(Novagen)之大腸桿菌表現質體pETchoMIF 762-25之示意圖。將CHO-MIF之完整cDNA插入T7啟動子後及藉由T7聚合酶轉錄，該T7聚合酶係大腸桿菌BL21宿主菌株之一部分。
圖4：係自不同下游加工步驟所獲得之抗MIF抗體進行CHO-MIF偵測之西方墨點。墨點係藉由特異親和性純化兔抗CHO-MIF抗體及市售辣根過氧化物酶共軛驢抗兔IgG偵測。泳道1：分子量蛋白質標記物；泳道2：在移除CHO-MIF雜質之前之50μg抗MIF抗體部分；泳道3至5：各50μg來自不同下游加工步驟之抗MIF抗體部分；泳道6：在移除CHO-MIF雜質之後，50μg抗MIF抗體部分；泳道7至10：重組CHO-MIF參照4ng、2ng、1ng及0.5ng/泳道。
圖4a：係獲自如圖4中所顯示之西方墨點之CHO-MIF蛋白質訊號之條形圖。為此，藉由使用Image Reader LAS4000 scanner software®之LAS4000(Fujifilm Life Science®)掃描CHO-MIF訊號及藉由Image Quant LAS4000®軟體直接定量。將來自泳道7之4ng CHO-MIF訊號設定為100%及與其他CHO-MIF訊號直接比較；發現在下游加工之第一步驟後所獲得之50μg抗MIF抗體中之CHO-MIF雜質具有189%訊號強 度，如泳道/條2中所顯示；發現在下游加工之第二步驟後所獲得之50μg抗MIF抗體中之CHO-MIF雜質具有12%訊號強度，如泳道/條3中所顯示；發現在下游加工之第三步驟後所獲得之50μg抗MIF抗體中之CHO-MIF雜質具有11%訊號強度，如泳道/條4中所顯示：在下游加工之第四步驟後所獲得之50μg抗MIF抗體中之CHO-MIF雜質具有5%訊號強度，如泳道/條5中所顯示；在下游加工之最後步驟後所獲得之50μg抗MIF抗體中之CHO-MIF雜質具有0%訊號強度，如泳道/條6中所顯示；2ng重組CHO-MIF計得40%訊號強度，如泳道/條8中所顯示；1ng重組CHO-MIF計得29%訊號強度，如泳道/條9中所顯示；0.5ng重組CHO-MIF計得11%訊號強度，如泳道/條10中所顯示。
圖5：係關於在最終化抗MIF產物中之CHO-MIF雜質之定量之西方墨點。墨點係藉由特異親和性純化兔抗CHO-MIF抗體及市售辣根過氧化物酶共軛驢抗兔IgG偵測。泳道1：分子量蛋白質標記物；泳道2：在移除CHO-MIF污染物之後之最終純化抗MIF抗體(500μg抗MIF抗體/泳道)；泳道3：500μg最終純化抗MIF抗體，但摻雜1ng CHO-MIF；泳道4至7：重組CHO-MIF參照，4ng/泳道(對應在500μg抗MIF抗體中之8ppm)，2ng/泳道(對應在500μg抗MIF抗體中之4ppm)，1ng/泳道(對應在500μg抗MIF抗體中之2ppm)及0.5ng/泳道(對應在500μg抗MIF抗體中之1ppm)。箭頭A表示抗MIF抗體樣品之重鏈，箭頭B表示抗MIF抗體樣品之輕鏈及箭頭C表示CHO-MIF帶。
圖5a：係自圖5中所顯示之西方墨點所獲得之CHO-MIF蛋白質訊號之條形圖。為此，藉由使用Image Reader LAS4000 scanner software®之LAS 4000(Fujifilm Life Science®)掃描CHO-MIF訊號及藉由Image Quant LAS4000®軟體直接定量。將來自泳道4之4ng CHO-MIF訊號設定為100%及與其他CHO-MIF訊號直接比較。發現在泳道1上添加之標記物蛋白質及泳道/條1及2中所顯示之最終純化抗MIF抗體 製劑無CHO-MIF訊號。發現摻雜1ng重組CHO-MIF之純化抗MIF抗體具有46%/100%參照訊號，如泳道/條3所示；發現泳道/條5中所顯示之2ng CHO-MIF蛋白質具有81%/100%參照訊號；發現泳道/條6中所顯示之1ng CHO-MIF蛋白質具有42%/100%參照訊號；發現泳道/條7中所顯示之0.5ng CHO-MIF蛋白質具有16%/100%參照訊號。
圖6：係藉由不同兔抗MIF抗體偵測自西方墨點所獲得之CHO-MIF蛋白質之條形圖(數據未顯示)。條形證實親和性純化兔抗CHO-MIF抗體對CHO-MIF具有較兔抗huMIF及兔抗moMIF抗體之最高敏感性。為此，將相同量CHO-MIF蛋白質印跡至各西方墨點(2ng/泳道；1ng/泳道；0.5ng/泳道)及藉由LAS4000(Fujifilm Life Science®)電子比較所獲得之CHO-MIF訊號強度。各西方墨點係藉由相同量之各兔抗體(3.5μg/ml)組合辣根過氧化物酶共軛驢抗兔IgG(1：6000)偵測。藉由兔抗huMIF及兔抗moMIF偵測之西方墨點另外以10ng rhuMIF或10ng rmoMIF對照以證實兩種抗體製劑之功能性(數據未顯示)。然後，藉由LAS4000 Image Reader LAS4000 scanner software®掃描所獲得之CHO-MIF訊號及藉由Image Quant LAS4000®軟體直接定量。
為直接比較所有CHO-MIF訊號，將來自兔抗CHO-MIF抗體墨點之2ng CHO-MIF訊號設定為100%。黑色條：自兔抗CHO-MIF抗體獲得之CHO-MIF訊號；深灰色條：自兔抗huMIF抗體獲得之CHO-MIF訊號；淺灰色條：自兔抗moMIF抗體獲得之CHO-MIF訊號。
圖7：顯示藉由親和性純化兔抗CHO-MIF抗體(3.5μg/ml，HRP共軛物1：6000，如實例5中所描述之相同條件)偵測之具有不同量CHO-MIF之西方墨點。此西方墨點係兔抗CHO-MIF抗體之敏感性之實例。藉由兔抗CHO-MIF抗體偵測之CHO-MIF之最低量係0.25ng/泳道(對應在500μg人抗MIF抗體製劑中之0.5ppm)。
泳道1：2ng CHO-MIF(對應在500μg人抗MIF抗體中之4ppm CHO-MIF雜質)；泳道2：1ng CHO-MIF(對應在500μg人抗MIF抗體中之2ppm CHO-MIF雜質)；泳道3：0.5ng CHO-MIF(對應在500μg人抗MIF抗體中之1ppm CHO-MIF雜質)；泳道4：0.25ng CHO-MIF(對應在500μg人抗MIF抗體中之0.5ppm CHO-MIF雜質)；泳道M：分子量蛋白質標記物。
圖7a：係自圖7中所顯示之西方墨點所獲得之CHO-MIF蛋白質訊號之條形圖。為此，藉由使用Image Reader LAS4000 scanner software®之LAS4000(Fujifilm Life Science®)掃描CHO-MIF訊號及藉由Image Quant LAS4000®軟體直接定量。將來自泳道1之2ng CHO-MIF訊號設定為100%，並與其他CHO-MIF訊號直接比較。發現1ng重組CHO-MIF具有90%/100%參照訊號，如泳道/條2中所顯示；發現泳道/條3中所顯示之0.5ng CHO-MIF蛋白質具有76%/100%參照訊號；發現泳道/條4中所顯示之0.25ng CHO-MIF蛋白質具有26%/100%參照訊號。
圖8：係顯示鋅指核酸酶(ZFN)在MIF基因座(SEQ ID NO：21)之外顯子1/內含子1邊界處之位置及識別位點之草圖。下部分顯示MIF剔除純系之基因特徵化之策略。外顯子1以粗體字母顯示；內含子1以斜體字母顯示。5個鹼基對裂解位點GGCCC係於兩個鋅指核酸酶亞單元之15個bp識別位點之間。NaeI限制性位點GCCGGC以底線標出。
結合在CHO-MIF基因座之轉譯區外之兩個PCR引子9983(SEQ ID NO：11)及9879(SEQ ID NO：12)係經設計。利用此2引子，可在野生型片段中藉由含有2個NaeI位點之PCR擴增1260bp片段。由於經ZFN處理，預期第一NaeI位點受破壞。於野生型基因座之情況中，該1260bp片段之NaeI裂解產生3個片段，於剔除之情況中，僅產生2個片段。在DNA-瓊脂糖凝膠上分離後之預期模式顯示於凝膠之草圖上(泳道1為剔除，泳道2為野生型)。由於預期CHO細胞為二倍體，故預期如泳 道3中所顯示之異型叢。
圖9：顯示在藉由鋅指核酸酶處理後單離之產生抗體RAB0之個別CHO細胞純系之基因分析之瓊脂糖凝膠。跨過MIF之基因座之PCR片段係藉由NaeI裂解及在如圖8中所顯示之瓊脂糖凝膠上分離。五種細胞株係同型MIF剔除細胞(泳道2、3；4、5；8、9；10、11；12、13)。一種細胞株(泳道6、7)係異型。原始野生型細胞株顯示於泳道14、15中。
圖9a：顯示圖9之示意圖。亮灰色圓形展示如圖9中所顯示之PCR片段之主訊號。
圖10：係關於產生抗體RAB0之CHO-MIF剔除細胞株之蛋白質特徵分析之西方墨點的實例。於變性蛋白質凝膠上分離個別CHO-MIF異型(泳道1)、剔除(泳道2至4)及野生型(泳道5及6)細胞純系之細胞提取物及轉移至膜。作為對照，將自大腸桿菌純化之CHO-MIF置於凝膠上(泳道8)。利用MIF特異性抗體對墨點染色。在剔除細胞純系(泳道2、3、4)中無可偵測之MIF。
圖10a：係圖10之示意圖。黑色圓形展示西方墨點之正CHO-MIF訊號(泳道1、5、6、8)；高亮空心圓形展示如圖10之西方墨點中所顯示之CHO-MIF蛋白質之負訊號(泳道2、3、4)。
圖11：係自CHO-MIF剔除細胞株純化之人抗-MIF抗體之西方墨點分析之實例。
於MIF剔除CHO細胞株(泳道2)或野生型CHO細胞株(泳道3)中產生MIF-特異性抗體RAB0。甚至在將高達500μg/泳道之純化抗體上料至凝膠後，若該抗體產生於MIF剔除細胞株中，則無可偵測之CHO-MIF。將不同量之產生於大腸桿菌中之純化CHO-MIF用作對照(泳道4至6)。
圖11a：係自圖11中所顯示之西方墨點獲得之CHO-MIF蛋白質訊 號之條形圖。為此，藉由使用Image Reader LAS4000 scanner software®之LAS4000(Fujifilm Life Science®)掃描CHO-MIF訊號及藉由Image Quant LAS4000®軟體直接定量。將來自泳道4之4ng CHO-MIF訊號設定為100%及與其他CHO-MIF訊號直接比較。發現在剔除CHO細胞株中所產生之純化抗MIF抗體具有0% CHO-MIF訊號強度，如泳道/條2中所顯示；發現自泳道/條3中所顯示之野生型CHO細胞株產生之純化抗體具有巨大CHO-MIF訊號(>>300%)；發現泳道/條5中所顯示之2ng CHO-MIF蛋白質具有57%/100%參照訊號及發現如泳道/條5中所顯示之1ng CHO-MIF具有28%訊號強度。
定義及基本技術
除非在本文中另外說明，否則與本發明連用之科學及技術術語應具有一般技術者共同理解之含義。一般而言，與本文中所描述之細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳及蛋白質及核酸化學連用之命名法及技術係為本技藝所熟知及常用之彼等物。除非另外說明，否則本發明之方法及技術基本上係依照本技藝熟知及如本說明書全文所引述及論述之各通用及更專門參考文獻所描述之習知方法實施。參見，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992)及Harlow and Lane Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)，該等案係以引用之方式併入本文。
「MIF」或「巨噬細胞移動抑制因子」係指已知為免疫及發炎性反應中關鍵介體之蛋白質，尤其稱為糖皮質激素之反調節劑。MIF包括哺乳動物MIF，具體言之，人類MIF(Swiss-Prot主檢索號： P14174)，其中單體形式編碼成115個胺基酸蛋白質，但產生114個胺基酸蛋白質，係因初始甲硫胺酸裂解之故。「MIF」亦包括以前稱為「GIF」(糖基化作用抑制因子)者。
亦已知展現MIF之功能或免疫學性質之MIF衍生物/片段，如，例如MIF之片段或融合蛋白質。
於本申請案中之「抗體」係指完整抗體或與完整抗體競爭特異結合之抗原結合部分。基本上參見Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,2nd ed.Raven Press,N.Y.(1989))(以引用方式併入)。術語抗體包括人類抗體、哺乳動物抗體、單離抗體及基因工程化形式，如，但不限制於，嵌合、駱駝化或人源化抗體。
術語抗體之「抗原結合部分」係指保留特異結合至抗原(例如MIF)之能力之一或多個抗體片段。抗原結合部分可藉由重組DNA技術或藉由完整抗體之酶或化學裂解產生。抗原結合部分包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv及互補決定區(CDR)及其片段、單鏈抗體(scFv)、嵌合抗體、含有抗體中之至少一部分之抗體及多肽，該至少一部分足以賦予該多肽特異性抗原結合。自N-末端至C-末端，成熟輕及重鏈可變域均包含區FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。對各結構域之胺基酸指派係依照Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987 and 1991))、Chothia等人，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)或Chothia等人，Nature 342：878-883(1989)之定義。抗體或其抗原結合部分可衍生或連接至另一功能分子(例如，另一肽或蛋白質)。例如，抗體或其抗原結合部分可功能連接至一或多種其他分子實體，如另一抗體(例如雙特異性抗體或二抗體)、可偵測物、細胞毒性劑、藥劑及/或連接分子。
術語「人類抗體」係指可變及恒定域係人類序列之任何抗體。該 術語涵蓋具有自人類基因衍生但已改變之序列之抗體，例如改變以降低可能的免疫原性、增大親和性、消除可導致非所需摺疊之半胱胺酸等。該術語涵蓋在非人類細胞中重組產生之抗體，該等非人類細胞可賦予人類細胞不常見之糖基化作用。
術語「人源化抗體」係指包含人類序列且另外含有非人類序列之抗體。
術語「駱駝化抗體」係指抗體結構或序列經改變而與來自駱駝之抗體更為相似之抗體，亦稱為駱駝抗體。用於設計及生產駱駝化抗體之方法係為熟習本項技術者所知曉的部份。
術語「嵌合抗體」係指包含來自兩種或更多種不同物種之區之抗體。
術語「單離抗體」或「其單離抗原結合部分」係指已識別並選自諸如噬菌體呈現庫或B-細胞目錄之抗體源且隨後例如重組製備之抗體或其抗原結合部分。
術語「多株抗體」係指多株抗體製劑，其等可為經純化或經部分純化之多株抗體部分或可以來自經各抗原(例如，經純化之CHO-MIF)免疫之動物之粗血清之形式使用。
術語「KD」係指特定抗體之Fab部分與各抗原之平衡解離常數。
術語「抗原決定部位」包括可特異結合至免疫球蛋白或抗體片段之任何蛋白質決定子。抗原決定性決定子一般係由分子之化學活性表面基團群(如曝露胺基酸、胺基糖或其他碳水化合物側鏈)組成及一般具有特殊三維結構特徵，及特殊電荷特徵。
術語「載體」係指可運輸所連接之另一核酸之核酸分子。於某些實施例中，該載體係質體，即，可拼接其他DNA片段之環狀雙股DNA圓環。
術語「宿主細胞」係指可在引入表現載體後產生重組蛋白質之細 胞株。術語「重組細胞株」係指已引入重組表現載體之細胞株。應理解，「重組細胞株」不僅意指特定個體細胞株，亦意指此細胞株之子代。由於在隨後繼代中會因突變或環境影響而發生特定修飾，故子代實際上可不同於親代細胞，但仍包含於如本文中所使用之術語「重組細胞株」之範圍內。如本發明所使用之宿主細胞係CHO細胞株。
術語「西方墨點」係指將蛋白質點墨在載體膜上之熟知且已確立之技術，藉此可隨後偵測此等蛋白質。轉移至膜係藉由熟知方法實施，其中實例為擴散、施加毛細管力或電泳，但此等實例不以任何方式限制本發明方法。於免疫墨點之情況中，偵測係透過使用單株或多株抗體實施。於本發明中之「半定量」西方墨點意指將來自樣品(例如，在某些情況中可與抗MIF抗體以複合物形式出現之CHO-MIF)之訊號強度與來自相應標準品(例如CHO-MIF)之訊號強度對比之西方墨點。該訊號可為例如藉由例如數位成像系統電子量化之化學發光訊號。
發明人已成功識別及特徵化CHO-MIF基因。在彼基礎上，發明人進一步成功提供可產生及測試在CHO細胞中之抗MIF抗體製劑之工具及方法，該等製劑實質上不含污染性CHO-MIF。此等工具及方法進一步容許產生及測試在CHO細胞中產生之所有製劑，該等製劑包含可結合CHO-MIF之組分(即，CHO MIF結合蛋白質)，藉此此等製劑實質上不含污染性CHO-MIF。
因此，本發明係關於編碼CHO-MIF之基因座之分析。此容許產生MIF剔除CHO細胞，其中該等細胞產生重組抗體或可結合CHO-MIF之其他產物，例如(CHO)MIF配體、(CHO)MIF激動劑或拮抗劑、(CHO)MIF抑制劑，如：(CHO)MIF結合肽、(CHO)MIF受體片段，較佳以人類MIF為目標之實質上不含任何CHO-MIF污染物之抗體。
「實質上沒有任何CHO-MIF污染物」或「實質上不含CHO-MIF 污染物」可交換使用，在本申請書中，應意指CHO-MIF之量低於0.5ppm。較佳，CHO MIF之量低於0.2ppm。
本發明進一步係關於一種剔除細胞株，其中CHO-MIF基因經成功剔除，其中此k.o.(剔除)細胞株展示與親代CHO野生型細胞株實質相同之特徵。
本發明亦係關於一種偵測ppm程度CHO-MIF之高敏感方法，在CHO細胞產生結合至CHO MIF之產物(例如，抗體，較佳抗MIF抗體或其抗原結合片段)期間，在某些情況中CHO-MIF可維持黏附於所需產物。於一較佳實施例中，此偵測方法係基於高特異性抗CHO-MIF抗體之產生及純化，該等抗CHO-MIF抗體係自藉由本發明CHO-MIF免疫之兔所獲得之親和性純化多株抗體。於一較佳實施例中，此等抗體係透過使用重組大腸桿菌技術所產生之CHO-MIF免疫化產生。
因此，本發明進一步係關於編碼CHO細胞所產生之CHO-MIF之mRNA之單離。將藉由此mRNA之反轉錄而形成之cDNA選殖至原核表現載體中。針對同源性純化其在大腸桿菌中表現之CHO-MIF蛋白質。將重組CHO-MIF用於免疫兔以產生本發明之對CHO-MIF特異之多株兔抗體。
極出乎意料地，由發明人提供之親和性純化多株兔抗體(參見實例4)可極其敏感地偵測結合至所需抗MIF抗體之CHO-MIF污染物；藉此得以偵測低至ppm範圍之此等CHO-MIF污染物。
於一較佳實施例中，偵測步驟係藉由西方墨點分析實施。然而其他分析偵測方法係為熟習本項技術者已知且包括(但不以任何方式限制於)例如，酶連接免疫試驗、放射免疫試驗、螢光免疫試驗、生物發光及化學發光免疫試驗、競爭免疫試驗、點墨點技術及免疫沉澱HPLC、質譜分析或LC/MS/MS。
基於對CHO-MIF序列之認知，本發明進一步係關於編碼CHO- MIF之基因座之分析。此容許產生MIF剔除CHO細胞或偵測CHO-MIFmRNA以確認在CHO細胞中MIF之存在或不存在。發明人成功提供一種CHO MIF剔除細胞株，其中出乎意料的是此細胞株穩定且可用於表現重組蛋白質，尤其是可結合CHO-MIF之彼等蛋白質，較佳，抗體，更佳抗MIF抗體，特定言之，由於MIF本身參與極少數重要細胞過程及其在剔除細胞中之不存在必然某程度上擾亂該等細胞過程，如此一來穩定細胞不再可能存活。
十分意外的是，抗MIF抗體之生產率仍與在未剔除CHO MIF之相同細胞(野生型細胞)中所觀察到者相當(數據未顯示)。
在本發明CHO MIF剔除細胞株中產生之抗體亦具有與野生型細胞株產生之彼等抗體相當之物理化學特徵(數據未顯示)。
本發明尤其藉由以下特徵特徵化：
1.一種偵測單株抗MIF抗體製劑中之CHO-MIF污染物之方法，包含使該抗MIF抗體製劑與針對CHO-MIF進行親和性純化之多株抗CHO-MIF抗體接觸的步驟。
2.如項目1之方法，其中該等CHO-MIF污染CHO細胞產生之最終單株抗MIF抗體製劑或其抗原結合片段製劑。
3.如項目1及/或2之方法，其中該CHO-MIF係由CHO細胞產生之內源CHO-MIF。
4.如項目1至3中任一或多項之方法，其中該偵測步驟係藉由半定量西方墨點分析實施。
5.一種針對CHO-MIF進行親和性純化之兔抗CHO-MIF多株抗體之用途，其用於偵測在單株抗MIF抗體或其抗原結合片段之產生期間或在單株抗MIF抗體或其抗原結合片段之最終製劑中之CHO-MIF污染物。
6.如項目5之用途，其中該偵測步驟係以半定量西方墨點分析 之方式實施。
7.一種在CHO細胞中產生抗MIF抗體或其抗原結合片段之方法，其中該等抗體或其抗原結合片段實質上不含CHO-MIF，其中實施如技術方案1至6中任一項所定義之偵測方法。
8.一種CHO-MIF剔除CHO細胞株。
9.一種CHO-MIF剔除CHO細胞株，其中該細胞株包含以下(存在大腸桿菌中)質體中之任一或多者：DSM 25110、DSM 25112、DSM 25111、DSM 25113、DSM 25114、DSM 25115、DSM 25859、DSM 25860、DSM 25861、DSM 25862、DSM 25863及DSM 25864。
10.如項目8或9之CHO-MIF剔除CHO細胞株，其中該細胞株包含質體DSM 25110及DSM 25112或DSM 25861及DSM 25862。
11.如項目8或9之CHO-MIF剔除CHO細胞株，其中該細胞株包含質體DSM 25111及DSM 25113或DSM 25859及DSM 25860。
12.如項目8或9之CHO-MIF剔除CHO細胞株，其中該細胞株包含質體DSM 25114及DSM 25115或DSM 25863及DSM 25864。
13.如項目8至12中任一項之CHO-MIF剔除CHO細胞株之用途，其用於產生單株抗MIF抗體或其結合片段製劑，較佳用於產生抗體RAB0、RAB9、RAB4、RAM0、RAM9或RAM4中之任一者。
14.實質上不含CHO MIF之抗MIF抗體製劑，其可藉由項目7之方法或藉由使用如項目8至12中任一項之CHO-MIF剔除細胞株獲得。
15.一種產生實質上不含CHO MIF之抗MIF抗體製劑之方法，其特徵在於使用如項目8至12中任一項之CHO-MIF剔除CHO細胞株。
16.一種重組MIF結合蛋白質、較佳(h)MIF結合蛋白質，如：(h)MIF結合肽、配體、激動劑、拮抗劑、抑制劑或MIF受體片段之製劑，或抗(h)MIF抗體製劑，其產生於CHO細胞株，特徵在於該製劑實質上不含CHO-MIF。
17.一種重組MIF結合蛋白質，較佳(h)MIF結合蛋白質，如：(h)MIF結合肽、配體、激動劑、拮抗劑、抑制劑或MIF受體片段之製劑，或抗(h)MIF抗體製劑，其可藉由如項目15之方法或藉由包含較佳如以上項目1至4或7中任一項之偵測方法作為品質控制步驟之生產方法獲得。
18.一種重組MIF結合蛋白質，較佳(h)MIF結合蛋白質，如：(h)MIF結合肽、配體、激動劑、拮抗劑、抑制劑或MIF受體片段之製劑，或抗(h)MIF抗體製劑，其藉由如項目15之方法，或藉由包含較佳如以上項目1至4或7中任一項之偵測方法作為品質控制步驟之生產方法產生。
19.如以上項目16至18中任一項之抗hMIF抗體製劑，其實質上不含CHO-MIF，其中該抗hMIF抗體係選自由RAB4、RAB0、RAB9、RAM4、RAM0及/或RAM9組成之群。
針對以上抗hMIF抗體而放置之質體係藉由其等DSM號特徵化，該等DSM號係依據布達佩斯條約在German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(DSMZ),Mascheroder Weg 1b,Braunschweig,Germany寄存時所獲得之官方號碼。
具有DSM 25110號之質體包含抗MIF抗體RAB4之輕鏈序列。
具有DSM 25112號之質體包含抗MIF抗體RAB4之重鏈(IgG4)序列。
質體DSM 25110及DSM 25112在合適宿主細胞(即CHO細胞)中之共表現導致較佳抗-MIF抗體RAB4產生。
具有DSM 25111號之質體包含抗MIF抗體RAB9之輕鏈序列。
具有DSM 25113號之質體包含抗MIF抗體RAB9之重鏈(IgG4)序列。
質體DSM 25111及DSM 25113在合適宿主細胞(即CHO細胞)中之 共表現導致較佳抗MIF抗體RAB9產生。
具有DSM 25114號之質體包含抗MIF抗體RAB0之輕鏈序列。
具有DSM 25115號之質體包含抗MIF抗體RAB0之重鏈(IgG4)序列。
質體DSM 25114及DSM 25115在合適宿主細胞(即CHO細胞)中之共表現導致較佳抗MIF抗體RAB0產生。
亦寄存抗體RAM0、RAM9及RAM4，所有均在2012年4月12日依照布達佩斯條約由DSZM,Braunschweig,Germany寄存，具有以下命名：
RAM9-重鏈：E.coli GA.662-01.pRAM9hc-DSM 25860。
RAM4-輕鏈：E.coli GA.906-04.pRAM4lc-DSM 25861。
RAM9-輕鏈：E.coli GA.661-01.pRAM9lc-DSM 25859。
RAM4-重鏈：E.coli GA.657-02.pRAM4hc-DSM 25862。
RAM0-輕鏈：E.coli GA.906-01.pRAM0lc-DSM 25863。
RAM0-重鏈：E.coli GA.784-01.pRAM0hc-DSM 25864。
抗(ox)MIF抗體之產生亦可包括為技藝已知用於例如，以連續或分批方式培養該等轉型細胞，及表現抗(ox)MIF抗體(例如，構成性或基於誘導)之任何方法。特定言之可參考WO 2009/086920關於抗(ox)MIF抗體之產生之進一步敘述。於一較佳實施例中，依照本發明產生之抗(ox)MIF抗體結合oxMIF或其抗原決定部位。根據本發明之特佳抗體係抗體RAB9、RAB4及/或RAB0，及RAM9、RAM4及/或RAM0。
此等抗體之序列亦部分揭示於WO 2009/086920中；另參見本申請案之序列表及以下：
SEQ ID NO：22關於RAB9之輕鏈之胺基酸序列：DIQMTQSPSS
SEQ ID NO：23關於RAB4之輕鏈之胺基酸序列：DIQMTQSPGT
SEQ ID NO：24關於RAB0之輕鏈之胺基酸序列：DIQMTQSPGT
SEQ ID NO：25關於RAB2之輕鏈之胺基酸序列：DIQMTQSPVT
SEQ ID NO：26關於RAB9之重鏈之胺基酸序列：EVQLLESGGG
SEQ ID NO：27關於RAB4之重鏈之胺基酸序列：EVQLLESGGG
SEQ ID NO：28關於RAB0之重鏈之胺基酸序列：EVQLLESGGG
SEQ ID NO：29關於RAB2之重鏈之胺基酸序列：EVQLLESGGG
SEQ ID NO：30關於RAM0hc之胺基酸序列：EVQLLESGGG
SEQ ID NO：31關於RAM0lc之胺基酸序列：DIQMTQSPGT
SEQ ID NO：32關於RAM9hc之胺基酸序列：EVQLLESGGG
SEQ ID NO：33關於RAM9lc之胺基酸序列：DIQMTQSPSS
SEQ ID NO：34關於RAM4hc之胺基酸序列：EVQLLESGGG
SEQ ID NO：35關於RAM4lc之胺基酸序列：DIQMTQSPGT
本發明之抗MIF抗體較佳係單離單株抗體。該抗MIF抗體可為 IgG、IgM、IgE、IgA或IgD分子。於其他實施例中，該抗MIF抗體為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4子類。於其他實施例中，該抗體為子類IgG1或IgG4。於其他實施例中，該抗體為子類IgG4。於某些實施例中，該IgG4抗體具有將絲胺酸(絲胺酸228，根據Kabat編號方案)更改為脯胺酸之單突變。因此，於IgG4之Fc區中之CPSC子序列變為CPPC，其係IgG1中之子序列(Angal等人，Mol Immunol.1993,30,105-108)。
此外，抗(ox)MIF抗體之產生可包括本技藝已知之任何方法，該等方法用於純化抗體，例如，藉由陰離子交換層析或親和性層析。於一實施例中，抗(ox)MIF抗體可自細胞培養上清液藉由尺寸排除層析純化。
術語MIF之「中心區」及「C末端區」各別係指包含胺基酸35至68及胺基酸86至115之人類MIF區，較佳各別胺基酸50至68及胺基酸86至102之人類MIF區。
本發明之特佳抗體結合至人類MIF之胺基酸50至68區或胺基酸86至102區。此亦表現為較佳抗體RAB0、RAB4、RAB2及RAB9，及RAM4、RAM9及RAM0之結合，其等如下結合：
RAB4及RAM4：aa 86至102
RAB9及RAM9：aa 50至68
RAB0及RAM0：aa 86至102
RAB2：aa 86至102
術語「抗原決定部位」包括可特異結合至免疫球蛋白或抗體片段之任何蛋白質決定部位。抗原決定部位一般係由分子之化學活性表面基團群組成，如曝露胺基酸、胺基糖或其他碳水化合物側鏈及一般具有特殊三維結構特徵，及特殊電荷特徵。
以下關於抗MIF抗體產生之敘述將示例性說明產生重組抗MIF抗 體製劑之製程，該製程包括測試純化抗體製劑是否不含污染性MIF之步驟，即，CHO-MIF污染物之偵測步驟。
根據本發明之抗MIF抗體之產生製程包括任何透過基因工程化來產生重組DNA之方法，例如，透過RNA之反轉錄及/或DNA之擴增及選殖至表現載體中。於某些實施例中，載體係病毒載體，其中可將其他DNA片段接合至該病毒基因組中。於某些實施例中，載體可在所引入之宿主細胞中自我複製(例如具有細菌複製源點之細菌載體及游離基因組哺乳動物載體)。於其他實施例中，該載體(例如，非游離基因組哺乳動物載體)可在引入至宿主細胞後整合至該宿主細胞之基因組中，及藉此與宿主基因組一起複製。此外，特定載體可指導其等所操作連接之基因之表現。此等載體在本文中稱為「重組表現載體」(或簡言之「表現載體」)。
抗MIF抗體可藉由習知表現載體(如細菌載體(例如pBR322及其衍生物)或真核載體)產生。彼等編碼抗體之序列可具有調節宿主細胞之複製、表現及/或分泌之調節序列。此等調節序列包含，例如，啟動子(例如CMV或SV40)及訊號序列。表現載體亦可包含篩選及擴增標記物，如二氫葉酸還原酶基因(DHFR)、潮黴素-B-磷酸轉移酶及胸苷-激酶。所使用之載體之組分(如篩選標記物、複製子、增強子)可自市面購置或藉由習知方法製備。載體係經建造以於細胞培養物中(即，CHO細胞中)表現。
可將抗MIF抗體輕鏈基因及抗MIF抗體重鏈基因插入不同載體中或將兩種基因插入同一表現載體中。抗體基因係藉由標準方法插入表現載體中(例如，在抗體基因片段及載體上之互補限制性位點接合或若不存在限制性位點，則鈍端接合)。
抗MIF抗體或其抗原結合片段之產生可包括本技藝中已知用於透過轉染(例如，透過電穿孔或微注射)將重組DNA引入至真核細胞中之 任何方法。例如，抗MIF抗體之重組表現可如下達成：將含有抗MIF抗體編碼DNA序列之表現質體在一或多個調節序列(如強啟動子)之控制下藉由合適轉染方法引入至CHO細胞中，獲得具有穩定整合至基因組中之引入序列之細胞。脂質轉染方法係根據本發明可使用之轉染方法之一實例。
抗MIF抗體之產生亦可包含本技藝中已知用於例如以連續或分批方式培養該等經轉型細胞及表現抗-MIF抗體(例如，構成性或基於誘導)之任何方法。特定言之可參考WO 2009/086920關於抗MIF抗體之產生之進一步敘述。於一較佳實施例中，根據本發明所產生之無CHO-MIF抗MIF抗體製劑之抗體結合至MIF或MIF片段。根據本發明計劃產生之特佳抗體係RAB9、RAB4及RAB0(各別地，RAB0以含有質體DSM 25114及DSM25115，RAB9以含有DSM 25111及DSM 25113，及RAB4以含有DSM 25110及DSM 25112之大腸桿菌寄存)。
用於產生如本文中所描述之MIF之生產方法中之宿主細胞類型係CHO細胞。於一實施例中，抗MIF抗體係於DHFR缺陷CHO細胞株(例如DXB11)中及藉由添加G418作為篩選標記物來表現。當將編碼抗體基因之重組表現載體引入至CHO宿主細胞中時，抗體係藉由培養該等宿主細胞足以容許該抗體在該宿主細胞中表現或抗體分泌至宿主細胞生長之培養基中的時間。
抗MIF抗體可利用標準蛋白質純化方法自培養基回收。
此外，抗MIF抗體之產生可包含本技藝中已知用於純化抗體之任何方法，例如，透過陰離子交換層析或親和性層析。於一實施例中，抗MIF抗體可藉由尺寸排除層析而自細胞培養上清液純化。
本發明現將提供一種具優勢方法，其顯著改良及最優化用於產生抗MIF抗體或其抗原結合片段之先前技藝方法。
特定言之，本發明最先顯示藉由CHO細胞製備之抗體製劑可包含 CHO-MIF污染物，該等污染物可令最終製劑無法用於醫藥或研究目的。
本發明亦最先識別及特徵化CHO-MIF基因。基於此認識，發明人另提供一種特異性偵測方法，其容許在低至ppm範圍下偵測結合至抗MIF抗體之CHO-MIF污染物。
十分出乎意料地，本發明藉此提供驗證抗MIF抗體之生產方法，特定言之，純化方法是否適合產生實質上不含CHO-MIF之製劑的可能性。此係建立不含CHO-MIF之抗MIF抗體製劑之生產方法之前提。特定言之，此改良容許將本技藝中已知之方法最優化及組合用於依耗盡CHO-MIF污染物之方式純化抗體製劑，藉此提供不含CHO-MIF污染物之高純度最終Ab製劑。此外，本發明方法係該等污染物之高敏感偵測方法，係工業生產方法中之保障，確保產生不含CHO-MIF污染物之高純度最終Ab-製劑。較佳，此偵測係藉由使用多株兔抗MIF抗體之偵測步驟實施，該抗體已藉由針對CHO-MIF之親和性純化獲得。親和性純化係如熟習本項技術者所熟知般實施及描述於例如Lottspeich F.及Zorbas H.(1998)Bioanalytik,Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg-Berlin,ISBN 3-8274-0041-4中。
CHO-MIF污染物可偵測低至ppm程度，特定言之，可利用高敏感兔抗CHO-MIF抗體於常見西方墨點技術中偵測低達0.5ppm(對應在500μg抗體製劑中之0.25ng CHO-MIF)之CHO-MIF污染物，藉由數位定量成像系統(例如，GE Healthcare之ImageQuant LAS 4000)中之化學發光訊號定量。
於本文中「CHO-MIF污染物」意指結合至重組產生產物，例如結合至重組產生產物製劑(例如抗MIF抗體)中之抗MIF抗體之CHO-MIF。
本發明方法之高敏感性在使用透過親和性純化獲得之多株兔抗 MIF抗體下特別有效。
於在CHO細胞中產生無MIF抗MIF抗體之另一實施例中，本發明係關於不產生CHO-MIF之剔除CHO細胞株。藉由此等剔除細胞株，可實施生產方法以提供實質上不含CHO-MIF污染物之極純抗MIF抗體製劑。
於一較佳實施例中，上述偵測方法可用於在CHO MIF細胞株中重組產生之蛋白質，較佳抗MIF抗體生產之品質控制，特定言之，以保證最終製劑實質上不含CHO MIF。該偵測方法亦可用於CHO MIF剔除細胞株之品質控制。
根據本發明之剔除細胞可依照本技藝中已知之方法產生，藉此一可能性詳細描述於以下實例中，但本發明不應視為限制於此實施例。
實例1
編碼CHO-MIF之DNA序列之確定
黏接至CHO-MIF之編碼區之5'端及3'端之寡核苷酸係透過比較相關物種之DNA序列設計。選擇高守恆區域以設計含有搖擺鹼基之寡核苷酸8951及8954，以保證結合至其等在CHO-MIF DNA中之對應區。將此等寡核苷酸與polyT寡核苷酸一起使用，可藉由標準cDNA選殖製程擴增來自由CHO細胞單離出之mRNA之cDNA複本。對所獲得之PCR產物進行DNA定序。
在知曉CHO-MIF cDNA之DNA序列後，可利用標準製程設計用於擴增自CHO細胞純化之基因組DNA之片段。藉由PCR擴增在該cDNA區域中之三個基因組片段及獲得以下PCR產物：- P27463，使用引子9063及9196，藉由寡核苷酸9063、9196定序；- P27465，使用引子9199及9064，藉由9064定序；- P28254，使用引子9216及9244，藉由9216、9242定序。
為了驗證在ATG起始密碼子及5'上游區附近之序列，藉由BstHI裂解CHO細胞之基因組DNA及予以環化。已知BstHI自cDNA序列切斷在該cDNA之ATG下游之140個鹼基對(bp)。藉由反PCR，利用兩特異性寡核苷酸9216(反引子)及9242(正引子)在cDNA之已知部分中之結合擴增經環化之DNA。利用此PCR產物(P27883)，可確定在ATG上游數百個鹼基對之基因組DNA之序列。
CHO-MIF之DNA及對應蛋白質序列顯示於圖1及SEQ ID NO：1及2中。
用於擴增及定序CHO-MIF cDNA之寡核苷酸(引子)之序列：
實例2
CHO-MIF基因座之識別及特徵化
獲得CHO-MIF cDNA及基因組DNA之DNA序列之實驗方案描述於實例1中。cDNA及基因組DNA之分析同時實施。
基因座之整體組織係藉由比配基因組與cDNA序列確定。CHO-MIF之編碼區係以片段化方式分佈在被兩短內含子間隔之三個外顯子上。CHO-MIF基因座之序列顯示於圖2中。
實例3
重組CHO-MIF之產生及純化
在T7啟動子之控制下將CHO-MIF之cDNA選殖至大腸桿菌表現載體pET19b(Novagen)中。該質體顯示於圖3中。
質體在大腸桿菌菌株BL21-CodonPlus(DE3)-RP(Stratagene)中轉型。此菌株含有在IPTG可誘導lac啟動子控制下穩定插入之噬菌體T7之RNA聚合酶複本。在藉由IPTG誘導後CHO-MIF蛋白質高度表現及利用2步式純化方案高度純化：首先將樣品施加至陰離子交換DEAE-瓊脂糖凝膠管柱(緩衝劑A：20mM Tris/HCl，pH 7.8；緩衝劑B：20mM Tris/HCl，pH 7.8，包含1M NaCl；重組CHO-MIF藉由10%緩衝劑B之線性梯度溶離)。於第二步驟中，將蛋白質上料至S源管柱上(緩衝劑A：20mM BisTris/HCl，pH 5.5；緩衝劑B：20mM BisTris/HCl，pH 5.5，包含1M NaCl；重組CHO-MIF藉由7至10%緩衝劑B之間之線性梯度溶離)。最後蛋白質利用常見脫鹽管柱(例如，PD-10管柱)而濃縮及再緩衝於PBS中。在凝膠電泳製程後藉由考馬斯(Coomassie)染色確定CHO-MIF之純度。
實例4
在抗MIF抗體製劑中ppm程度之CHO-MIF污染物之偵測
建立高敏感半定量西方墨點分析以監視重組抗MIF抗體製劑中之CHO-MIF污染物，此容許偵測ppm程度之CHO-MIF。
將在大腸桿菌中表現之純化重組CHO-MIF用於免疫兔以產生抗CHO-MIF之特異性抗體。特異性兔抗CHO-MIF抗體係藉由二步式純化(參見以下a)及b))純化。所獲得之特異性兔抗CHO-MIF抗體可用於高敏感半定量西方墨點中，以偵測在較低皮克範圍內之CHO-MIF污染物。此容許在人類CHO細胞所產生之人抗MIF抗體之下游加工期間進行CHO-MIF雜質監視(圖4、4a、5及5a)。
於人抗MIF抗體中之CHO-MIF雜質之偵測極限經確定為0.25ng/泳道，對應在500μg人抗MIF抗體製劑中之0.5ppm(顯示於圖7及7a中)。
a)藉由重組CHO-MIF對兔之免疫化
為了產生CHO-MIF特異性抗體，依照以下方案對10隻兔進行免疫。對於初始免疫而言：將25μg重組CHO-MIF(於100μl PBS中)與100μl CFA(完全佛氏佐劑)混合。動物皮下接受200μl(4×50μl)該混合物。以2至3週間隔藉由如上所述之相同劑量/動物，使用IFA(不完全佛氏佐劑)進行兩次追加免疫。藉由ELISA測試血清。在第二次追加後之兩週，先藉由戊巴比妥麻醉，然後將兔放血。收集血清用於單離抗CHO-MIF抗體。
b)總IgG自CHO-MIF免疫兔之純化
藉由親和性層析，利用GE Healthcare之A蛋白MabSelect Sure親和性材料進行純化。一般而言，將來自CHO-MIF免疫兔之血清以1：2稀釋於緩衝劑A(=20mM Na2HPO4，pH 7.0)中及施加至100ml MabSelect Sure管柱。藉由10個管柱體積(CV)清洗製程，使用緩衝劑A洗去未結合或非特異性血清材料及藉由pH移位法，使用100%梯度步進至緩衝劑B(100mM甘胺酸，pH 2.8)實施總兔IgG之溶離。收集溶離份及再緩衝於20mM Na2HPO4 pH 7.0中用於下一親和性純化步驟。
c)CHO-MIF特異性抗體之純化
利用自備5ml NHS-管柱(GE Healthcare)(偶合重組CHO-MIF)以最終純化經親和性純化之兔抗CHO-MIF抗體。一般而言，將100ml再緩衝總兔IgG溶離份施加至5ml CHO-MIF親和性管柱。在清洗步驟(20CV，使用緩衝劑A)後，藉由pH移位法，使用100%梯度步進至緩衝劑B(100mM甘胺酸，pH 2.8)進行特異性抗CHO-MIF抗體之溶離。收集溶離材料，再緩衝於PBS中，若需要，濃縮及保存在-80℃下。藉由西 方墨點及CHO-MIF ELISA證明純化兔抗CHO-MIF抗體之功能性。
d)在單株抗MIF抗體製劑中之CHO-MIF之偵測
測試原理
藉由SDS-PAGE電泳(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺-凝膠電泳)分離所關注之抗體樣品及轉移至常用膜(例如聚偏二氟乙烯(PVDF)或硝基纖維素)。藉由特異性多株兔抗CHO-MIF抗體及化學發光反應，利用對應二級抗體共軛物識別及定量標的蛋白質CHO-MIF。
樣品及對照之製備以監視下游加工：為了監視在抗MIF抗體之純化期間污染性CHO-MIF之移除，藉由SDS緩衝劑將樣品稀釋至指定濃度。在上料至凝膠上之前，所有樣品具有相同濃度(建議：30至80μg抗MIF抗體/泳道)(圖4及4a)。
亦將對照(重組CHO-MIF)上料至SDS凝膠上，最終濃度為0.5、1、2及4ng/泳道。
樣品及對照之製備以分析最終純化抗體：就最終純化抗MIF抗體製劑中之潛在CHO-MIF污染物之分析而言，將500μg/泳道上料至SDS Page上。將對照(重組CHO-MIF)添加至凝膠，最終量為0.5、1、2及4ng/泳道。(圖5及5a)
測試細則
將樣品以1：1稀釋於SDS緩衝劑(100mM Tris，4% SDS，0.2%溴酚藍，20%甘油，200mM DTT，pH 6.8)中及在99℃下培養5分鐘(蛋白質還原及變性步驟)。然後，將指定濃度之各樣品上料至4至12% Bis/Tris凝膠(Invitrogen)上及藉由凝膠電泳分離，隨後電轉移至合適膜(例如PVDF)。為降低非特異性結合作用，在RT下藉由2%稀釋於TBST緩衝劑(25mM Tris，150mM NaCl，0.1%聚山梨酯20，pH 7.5)中之乳粉封阻該膜2分鐘。未結合蛋白之移除係透過再次使用TBST之清洗步驟達成。CHO-MIF之偵測係藉由稀釋於0.05%乳粉-TBST溶液 中之親和性純化兔抗CHO-MIF抗體實施。在RT下藉由該膜培養與辣根過氧化物酶共軛之二級抗體(例如，驢抗兔/HRP)1小時及再次利用TBST清洗。藉由添加化學發光物(例如，Super Signal West Femto,Pierce)，使用Fujifilm之發光影像分析儀(LAS-4000)偵測及定量特異性CHO-MIF訊號。
實例5
藉由親和性純化兔抗CHO-MIF抗體之CHO-MIF之高敏感偵測
將親和性純化兔抗CHO-MIF抗體對CHO-MIF之敏感性與其他兩種抗人MIF及小鼠MIF之親和性純化多株抗體比較。此等多株抗體亦係藉由針對兔抗CHO-MIF抗體所描述之相同製程製造，存在以下不同：兔抗huMIF係針對rhuMIF進行親和性純化及兔抗moMIF係針對rmoMIF進行親和性純化(如針對兔抗CHO-MIF抗體所描述之相同條件)。
將不同量之CHO-MIF(2、1及0.5ng/泳道)施加至SDS凝膠，藉由常見電泳製程分離及印跡至PVDF膜。為了比較各多株兔抗MIF抗體對CHO-MIF之敏感性，將其等以相同濃度(各3.5μg/ml)施用至西方墨點。兔抗人及小鼠MIF抗體之功能性另藉由正樣品(10ng huMIF及10ng moMIF)證明。
如圖6中所顯示，發現親和性純化兔抗CHO-MIF抗體對CHO-MIF具有最高敏感性(參見黑色箭頭，圖6)。
藉由兔抗CHO-MIF抗體偵測之CHO-MIF之最低濃度經確定為0.25ng/泳道，對應在500μg人抗MIF抗體製劑中之0.5ppm(顯示於圖7中)。
實例6
MIF剔除CHO細胞株之產生
準確知曉基因組結構(包括基因座之外顯子/內含子接面)係設計鋅 指核酸酶(ZFN)(Sangamo-Sigma Aldrich)之前提。CHO-MIF基因座之基因組組織係於實例2中確定。核酸酶經設計以於外顯子1/內含子1接面處形成雙股斷裂。(圖8)。ZFN技術之優點係可在單個步驟中以極高頻率剔除基因之對偶基因。產生MIF剔除細胞株及藉由基因組特徵化(圖9及9a)及西方墨點分析(圖10及10a)，利用實例4中所描述之CHO-MIF特異性抗體證實MIF不存在。此細胞株係用於表現抗MIF抗體，同時避免結合至其細胞標靶之相關問題。
a)獨特MIF剔除細胞純系之產生
藉由表現特異性ZFN之兩種亞單元之兩質體轉染穩定表現抗MIF抗體RAB0(RAB0.CHO-S.33)之CHO細胞株。於此等條件下，表現功能性核酸酶，破壞在細胞基因組中之內源MIF基因座。轉染兩週後，將細胞收集物稀釋於半固體培養基中。生長1週後，利用ClonePix(Genetix Limited)將獨特純系轉移至96孔平皿及生長成小培養物。
利用相同策略，剔除不同CHO宿主細胞株(像是CHO-S及CHO-DG44)中之內源MIF。
b)MIF剔除RAB0產生CHO-S細胞株之基因特徵化
獨特細胞純系之染色體DNA係利用Qiagen的QIAamp DNA Mini Kit(50)，依照生產商協定純化。將該DNA用作模板，藉由PCR使用以下引子擴增特異性片段：pPCR.choMTFg 9983：CGTTAATCTGCAGCGTCTACCTGA(SEQ ID NO：11)及pPCR.choMIFg 9879 GTAAGGCCACTAT AGGAAAGCCTG(SEQ ID NO：12)。
於野生型(wt)細胞純系之情況中，預期片段為1260個bp長(圖8)。於剔除細胞株之情況中，長度係視突變基因之個別結構而變化。一般而言，在ZFN之裂解位點刪除或插入核苷酸。同時，破壞限制性酶NaeI重疊ZFN裂解位點之識別位點。
藉由NaeI裂解PCR產物及在1%瓊脂糖凝膠上分離片段。由於剔除細胞株中之限制性位點之喪失，預期有另一種限制性模式(圖9及9a)。
c)MIF剔除RAB0產生CHO-S細胞株之西方墨點分析
為了證明MIF蛋白質耗盡，藉由西方墨點分析剔除細胞蛋白質提取物。
利用市售溶解緩衝劑(#9803「Cell Signaling」)製備細胞提取物。在Invitrogen NU Page 4至12% Bis/Tris-凝膠1.5mm×15孔上分離樣品及轉移至硝基纖維素膜。藉由間接免疫螢光，將實例5中所描述之多株兔抗MIF抗體用作第一抗體及將來自Invitrogen之抗兔IgG，辣根過氧化物酶用作第二抗體以偵測CHO-MIF。利用發光影像分析儀CB-SG-39視檢蛋白質圖案(圖10及10a)。
實例7
在CHO-MIF剔除細胞株中之抗MIF抗體之產生
在剔除內源CHO-MIF後，抗MIF抗體RAB0在CHO細胞株中產生。為供相較，抗體於CHO野生型MIF細胞株中產生相同。在A蛋白管柱上純化該抗體但不進一步處理以移除結合至該抗體之CHO-MIF。純化抗體係藉由實例4d中所描述之西方墨點分析特徵化。相較於野生型CHO-S細胞株中所產生的相同抗體，在剔除細胞株CHO-RAB0 MIFko.cp75中無可偵測之殘留CHO-MIF(圖11及11a)。
實例8
以相同方式，利用穩定表現抗MIF抗體RAB4或抗MIF抗體RAB9之CHO細胞株重複上述實例6及7，各別產生抗MIF抗體RAB4或RAB9，及使用表現抗MIF抗體RAM4或RAM9或RAM0之CHO細胞株，各別產生抗MIF抗體RAM4、RAM9或RAM0。
實例9-產生抗MIF抗體RAM0之MIF野生型與MIF剔除細胞株在 搖瓶發酵中之抗體生產率之比較
RAM0MIFko.CHO-S.33cp75及親代產生細胞株RAM0.CHO-S.33在28℃下展現最高表現程度及細胞存活率。於此實驗中，兩種細胞株均生長在37℃下搖瓶中直至細胞密度達約3×105，在37℃下培養一天及隨後變為28℃再培養19天。利用CEDEX監視細胞數及存活率。藉由MIF特異性結合ELISA定量RAM0之產生。
該實驗顯示以下結果(數據未顯示)：
- 細胞在長時間內高度存活
- 細胞在28℃下停止生長
- 細胞連續產生抗體
- MIFko細胞十分出乎意料地展示與親代MIFwt細胞株實質相同之特徵。
實例10-產生抗MIF抗體RAM9之MIF野生型及MIF剔除細胞株在3公升規模分批發酵中之抗體生產率之比較
在含有野生型MIF基因之CHO-DG44細胞株RAM9.CHO-DG44#20及含有剔除MIF基因之RAM9.CHO-DG44.MIFko#10中產生抗MIF抗體RAM9。
出乎意料地發現，在兩種細胞株中可達成類似程度之細胞生長及生產率(數據未顯示)。
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<223> ZFN裂解位點
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<223> 內含子1，部分
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RAM4lc
<400> 35

Claims (8)

  1. 一種CHO-MIF剔除細胞株，其中該CHO MIF剔除細胞株包含以下質體中之任一或多者：DSM 25110、DSM 25112、DSM 25111、DSM 25113、DSM 25114、DSM 25115、DSM 25859、DSM 25860、DSM 25861、DSM 25862、DSM 25863及DSM 25864。
  2. 如請求項1之CHO-MIF剔除CHO細胞株，其中該細胞株包含質體DSM 25110及DSM 25112或DSM 25861及DSM 25862。
  3. 如請求項1之CHO-MIF剔除CHO細胞株，其中該細胞株包含質體DSM 25111及DSM 25113或DSM 25859及DSM 25860。
  4. 如請求項1之CHO-MIF剔除CHO細胞株，其中該細胞株包含質體DSM 25114及DSM 25115或DSM 25863及DSM 25864。
  5. 一種如請求項1至4中任一項之CHO-MIF剔除CHO細胞株之用途，其用於產生單株抗MIF抗體或其結合片段之製劑。
  6. 如請求項5之用途，其中該抗MIF抗體為抗體RAB0、RAB4、RAMB9、RAM0、RAM4或RAM9中之任一者。
  7. 一種實質上不含CHO MIF之抗MIF抗體製劑，其可藉由使用請求項1至4中任一項之CHO-MIF剔除CHO細胞株獲得。
  8. 一種產生實質上不含CHO MIF之抗MIF抗體製劑之方法，其特徵在於使用如請求項1至4中任一項之CHO-MIF剔除CHO細胞株。
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