KR20150091504A - 항―ｍｉｆ 항체 세포 이동 검정법 - Google Patents

항―ｍｉｆ 항체 세포 이동 검정법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항-MIF 항체의 효능에 대한 견고하고, 정밀하며, 사용하기 쉬운 검정법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 항-MIF 항체-세포 이동 검정법 및 각 방법 및 키트를 개시한다.

Description

항―ＭＩＦ 항체 세포 이동 검정법 {ANTI-MIF ANTIBODY CELL MIGRATION ASSAY}
본 발명은 항-MIF 항체의 효능을 시험하는 데 적합한 검정법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 유익하고, 사용하기 쉬운 세포 이동 검정법에 관한 것이다.
대식세포 이동 억제 인자 (MIF)는 처음에 (대식세포를 함유하는) 투베르쿨린 과민성 기니 피그로부터의 복막 삼출물 세포의 시험관내 무작위 이동을 억제시킬 수 있는 그의 능력에 기초하여 단리된 시토카인이다 (Bloom et al. Science 1966, 153, 80-2; David et al. PNAS 1966, 56, 72-7). 오늘날, MIF는 활성의 다면발현적 스펙트럼을 발휘하는 선천성 및 후천성 면역 반응의 중요한 상류 조절인자인 것으로 알려져 있다.
인간 MIF cDNA는 1989년에 클로닝되었고 (Weiser et al., PNAS 1989, 86, 7522-6), 그의 게놈 국재화는 염색체 22로 맵핑되었다. 인간 MIF 유전자의 생성물은 (N-말단 메티오닌 절단 후) 114개의 아미노산을 포함하고, 겉보기 분자 질량이 약 12.5 kDa인 단백질이다. MIF는 임의의 다른 단백질과 유의적인 서열 상동성을 가지지 않는다. 상기 단백질은 동일한 서브유닛으로 이루어진 삼량체로서 결정화된다. 각 단량체는 4-가닥 베타-시트에 대해 패킹되는 2개의 역평행 알파-나선을 함유한다. 단량체는 인접한 서브유닛의 베타-시트와 상호작용하여 단량체 사이에 인터페이스를 형성하는 추가의 2개 베타-가닥을 가진다. 3개의 서브유닛은 분자 삼중 축을 따라 단백질의 중심을 통과하는 용매-접근가능한 채널을 포함하는 장벽을 형성하도록 배열된다 (Sun et al. PNAS 1996, 93, 5191-5196).
대식세포로부터의 MIF 분비는 글루코코르티코이드가 매우 낮은 농도일 때 유도되었다는 것이 보고되었다 (Calandra et al. Nature 1995, 377, 68-71). 그러나, MIF는 또한 글루코코르티코이드의 효과를 역 조절하고, 다른 시토카인, 예컨대, 종양 괴사 인자 TNF-α 및 인터루킨 IL-1β의 분비를 자극한다 (Baugh et al., Crit Care Med 2002, 30, S27-35). MIF는 또한 예컨대, 혈관신생 유발, 염증 유발, 및 항-아폽토시스 특성을 나타냄으로써 종양 세포 성장을 촉진시키는 것으로 밝혀졌다 (Mitchell, R.A., Cellular Signalling, 2004. 16(1): p. 13-19; Lue, H. et al., Oncogene 2007. 26(35): p. 5046-59). 이는 또한 예컨대, 림프종, 흑색종, 및 결장 암의 성장과 직접적인 관련이 있다 (Nishihira et al. J Interferon Cytokine Res. 2000, 20:751-62).
MIF는 다수의 병적 이상의 매개 인자이며, 따라서, 이러한 것으로 제한되는 것은 아니지만, 그 중에서도 특히 염증성 장 질환 (IBD), 류머티스성 관절염 (RA), 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 천식, 사구체 신염, IgA 신장병증, 심근경색 (MI), 패혈증 및 암을 비롯한 다양한 질환과 관련이 있다.
재조합 인간 MIF에 대한 것은 다중클론 및 단일클론 항-MIF 항체가 개발되었다 (Shimizu et al., FEBS Lett. 1996; 381, 199-202; Kawaguchi et al., Leukoc. Biol. 1986, 39, 223-232, 및 Weiser et al., Cell. Immunol. 1985, 90, 167-78).
항-MIF 항체가 치료 용도로 제안되었다. 보고에 따르면, 칼란드라(Calandra) 등 (J. Inflamm. (1995), 47, 39-51)은 실험상 유도된 그람-음성 및 그람-양성 패혈성 쇼크로부터 보호하기 위해 항-MIF 항체를 사용하였다. 항-MIF 항체는 패혈성 쇼크 및 다른 염증성 질환 상태에서 시토카인 생산을 조절하기 위한 요법 수단으로서 제안되었다.
US 6,645,493에는 MIF의 생물학적 활성을 중화시키는, 하이브리도마 세포로부터 유래된 단일클론 항-MIF 항체가 개시되어 있다. 동물 모델에서 상기 마우스-유래 항-MIF 항체가 내독소-유도성 쇼크 치료에서 유익한 효과를 발휘한 것으로 나타날 수 있다.
US 200310235584에는 MIF 유전자가 동형접합 방식으로 넉-아웃된 동물에서 MIF에 대한 고친화성 항체를 제조하는 방법이 개시되어 있다.
글리코실화-억제 인자 (GIF)는 갈라트(Galat) 등에 의해 기술된 단백질이다 (Eur. J. Biochem, 1994, 224, 417-21). 지금은 MIF와 GIF가 동일한 것으로 인지되고 있다. 와타라이(Watarai) 등 (PNAS 2000, 97, 13251-6)은 Ts 세포에서 GIF의 번역 후 변형의 생화학적 성질을 확인하기 위하여 상이한 GIF 에피토프에 결합하는 다중클론 항체를 기술하였다. 와타라이 등 (상기 문헌)은 GIF가 시험관내에서 상이한 입체형태의 이소형으로 존재한다고 보고하였다. 한 유형의 이성질체는 단일 시스테인 잔기의 화학적 변형에 의해 존재한다. 화학적 변형을 통해 GIF 단백질내 입체형태 변화가 일어난다.
항-MIF 항체의 효능을 시험하기 위해서는 신뢰가능하고, 사용하기 쉬운 검정법이 제공될 필요가 있다. 진단 목적 및 치료 목적, 둘 다를 위해, 주어진 항-MIF 항체-샘플을 그의 효능에 관하여 정의할 수 있는 것이 가장 중요하다. 항-MIF 항체의 각 효능에 관해 명백하게 밝혀지지 않고서는, 이는 어떤 진단 또는 요법을 위해서도 사용될 수 없다.
MIF 관련 약물, 특히, 항-MIF 항체의 효능 평가에 관한 견고한 생물검정법에 대해 지금까지 알려진 것은 없다.
비록 이전에 검정 포맷으로 MIF 단백질이 케모카인-유사 기능을 보이고, 이러한 기능이 항-MIF 항체에 의해 차단될 수 있다고 밝혀진 바 있지만 (예컨대, 문헌 [Bernhagen et al., Nature Medicine, 2007]), 예컨대, 단핵구 세포의 자가분비-유도성 세포 이동 억제에 기반한 견고한 MIF 생물검정법에 대해 지금까지 확립되고 적격화된 것은 없다.
따라서, 본 발명의 목적은 항-MIF 항체의 효능을 결정할 수 있는 검정법을 제공하는 것이다. 바람직하게는 상기 검정법 및 각 검정 방법은 고감도이고, 재현가능한 결과를 제공할 수 있어야 하고, 동시에 사용하기 쉬워야 한다.
본 발명자들은 상기 목표를 달성할 수 있는 방법을 조사하기 시작하였고, 이에 본 발명을 달성하게 되었다.
본 발명은 고감도이고, 재현가능하며, 사용하기 쉬운 항-MIF 항체, 특히 항-oxMIF 항체 효능 측정용 검정법에 관한 것이다.
본 발명의 검정법은 하기 정의되는 바와 같은 세포 이동 검정법이다:
1. - 이동할 수 있으며, MIF를 발현하는 세포를 장치의 제1 부분에 제공하는 단계,
- 세포 이동 및 확산이 이루어질 수 있도록 장치의 제1 부분과 연결되어 구성된 장치의 제2 부분에 결정할 항-(ox)MIF 항체를 첨가하는 단계, 및
- 이동 억제를 계산하는 단계를 포함하며,
여기서 세포 이동이 수행되는 것인, 항-MIF 항체의 효능을 결정하는 검정 방법.
이와 관련하여 "효능"이란 주어진 강도의 효과를 일으키는 데 필요한 양으로 표현되는 약물 활성의 척도이다. 이는 바람직하게는 IC50 값 (최대 억제 절반값)으로 표현된다.
본 발명의 검정법은 (ox)MIF의 자가분비 화학주성 작용을 억제시키고, 이로써 바람직하게는 그의 세포 표면 상에 MIF, 특히 oxMIF를 발현하는 세포, 예컨대, 특정 단핵구 세포, 예컨대, U937 단핵구 세포의 이동을 억제시키는 원리에 기초한다. 본 발명의 세포는 내인적으로 MIF를 발현할 수 있거나, 또는 MIF를 재조합적으로 발현하도록 조작된 것일 수 있다. MIF는 oxMIF로서 발현/oxMIF로 전환되어야 한다. 바람직한 실시양태에서, 이것이 반드시 본 발명의 중요한 특징은 아니지만, oxMIF는 세포의 표면 상에서 발현된다.
본 검정법은 화학주성인자 구배로의 세포의 유도된 이동에 기초하는 (과학 문헌에서 언급되는 바) 전형적인 주화성 검정법과 구별되어야 한다. 선행 기술에 따른 이러한 화학주성인자 구배는 세포 이외에 장치에 첨가된 (ox)MIF가 될 것이다. 본 발명자들은 놀랍게도 MIF를 발현하는 세포를 사용하여 검정법을 제공할 수 있고, 따라서, 추가의 화학주성인자를 첨가하지 않고, 즉, (ox)MIF를 첨가하지 않고도 검정법을 제공할 수 있다는 것을 보여주었다. 이러한 관찰 결과는, 생성된 검정법이 ox-MIF-확산 비의존성이고, 즉, 시간 경과에 따른 확산은 상기 결과를 방해하지 않고, 따라서, 검정법은 선행 기술의 검정법만큼 시간에 민감하지 않은 바, 특히 도움이 되었다. 항-(ox)MIF 항체는 (ox)MIF를 발현하는 세포 상의 미리 이동하는 (ox)MIF 기능을 억제시킬 수 있고, 이로써, (과학 문헌에서 언급한 세포 주화성을 억제시키기 보다는) 무작위 세포 이동 ("화학운동성")을 억제시킬 수 있다.
본 발명은 또한 첨부된 도면에 의해 추가로 설명된다.
도 1: 본 검정 방법의 일반적인 셋업이다.
도 2: U937 단핵구 세포에 대한 oxMIF의 FACS 데이터이다.
도 3: 상이한 농도의 RAM9 (항-oxMIF 항체; 로그 스케일)로의 U937 (인간 단핵구) 및 NR8383 (래트 대식세포)의 두 이동 억제 곡선을 보여주는 예시적인 도면이다. FACS 플롯은 이들 세포의 세포 표면에의 RAM9의 결합을 보여주는 것이다 (흑색선; 가는 선: 이소형 대조 항체).
본 발명은 부분적으로는 하기 항목을 특징으로 한다:
1. - 이동할 수 있는 세포를 장치의 제1 부분에 제공하며, 여기서 세포는 MIF를 발현하는 것인 단계,
- 세포 이동 및 확산이 이루어지도록 장치의 제1 부분과 연결되어 구성된 장치의 제2 부분에 결정할 항-(ox)MIF 항체를 첨가하는 단계; 및
- 이동 억제를 계산하는 단계
를 포함하며, 여기서 세포 이동이 수행되는 것인, 항-MIF 항체의 효능을 결정하는 검정 방법.
2. 제1항목에 있어서, 항-MIF 항체가 항-oxMIF 항체이고, 바람직하게는 항체가 RAB0, RAB4, RAB9, RAM0, RAM4 및/또는 RAM9로 이루어진 군으로부터 선택되며, 매우 바람직하게는 RAM9인 검정 방법.
3. 제1항목 또는 제2항목에 있어서, 장치가 공극이 있는 분리막을 통해 연결된 상부 및 하부 챔버를 포함하고, 여기서 세포는 상부 챔버에 첨가되고, 항체는 하부 챔버에 첨가되며, 바람직하게는 장치가 2 챔버 세포 이동 검정법 (변형된 보이덴(Boyden) 챔버 검정법), 보다 바람직하게는 트랜스웰(Transwell) 세포 이동 검정법 장치인 검정 방법.
다른 실시양태에서, 장치는 공극이 있는 분리막을 통해 연결된 상부 및 하부 챔버를 포함하고, 여기서, 세포 및 항체, 둘 다 상부 챔버에 첨가되고, 바람직하게는 장치는 2 챔버 세포 이동 검정법 (변형된 보이덴 챔버 검정법), 보다 바람직하게는 트랜스웰 세포 이동 검정법 장치이다.
두 경우 모두 이동 세포의 개수는 하부 챔버에서 측정될 것이다.
4. 제1항목 내지 제3항목 중 어느 한 항목에 있어서, 세포가 (ox)MIF를 바람직하게는 그의 세포 표면 상에 발현하는 세포이고, 바람직하게는 세포가 질환 샘플로부터의 세포이고, 보다 바람직하게는 세포가 단핵구 세포, 바람직하게는 인간 단핵구 세포, 보다 바람직하게는 인간 불멸화 단핵구 세포, 가장 바람직하게는 U937 세포, 또는 THP-1 인간 단핵구 세포, 또는 대안적 실시양태에서 래트 NR 8383 단핵구 세포인 검정 방법.
5. 제1항목 내지 제4항목 중 어느 한 항목에 있어서, 세포를 이동을 허용하는 적합한 이동 배지 중의 세포 현탁액으로서 제공하는 것인 검정 방법.
6. 제5항목에 있어서, 이동 배지가 단백질을 포함하지 않는 것인 검정 방법.
7. 제1항목 내지 제6항목 중 어느 한 항목에 있어서, 항체를 중간 정도의 약산 및 그의 접합체 염기를 포함하는 비독성 생물학적 완충제, 바람직하게는 글리신 완충제, N-치환된 타우린 완충제, 또는 포스페이트 완충제 염수 (PBS) 완충제 중에서, 예컨대 트랜스웰® 챔버의 제2 부분에 첨가하는 것인 검정 방법.
검정법의 바람직한 실시양태에서, 시험하고자 하는 항체의 농도는 통상의 희석 실험을 기초로 하여 측정된다. 제1 단계에서, 예상 IC50은 결정될 것이며, 여기서, IC50 값은 KD 값 (친화도 상수)과 같은 범위여야 한다. 전형적으로, 0.01 내지 100 nM의 수개, 예컨대, 6-10개 농도로 항체를 포함하는 일련의 희석액이 확립될 것이며, 따라서, 예상 IC50 값을 결정할 수 있게 된다. 실제 검정법에서는 이어서, 상기 예상 IC50이 일련의 희석액의 고정 중점으로서 사용되며, 상기 일련의 희석액은 전형적으로 IC50 값 아래로 최대 5개의 농도 단계 및 IC50 값 위로 최대 5개의 농도 단계를 가지게 될 것이다. 농도 단계는 전형적으로 각각 기하급수적으로, 예컨대, 지수가 3, 4, 또는 5인 방식으로 증가 및 감소하게 될 것이다.
따라서, 예비 실험에서 결정된 예상 IC50이 1 nM이라고 가정할 때, 검정법에서 실제 사용되는 농도는 (지수로서 5, 및 3 단계 사용) 0.008, 0.04, 0.2, 1, 5, 25 및 125 nM이 될 것이다.
8. 제1항목 내지 제7항목 중 어느 한 항목에 있어서, 항체를 검정에서 바람직하게는 일련의 희석액으로서 0.01-100 nM, 바람직하게는 0.02 내지 50 nM, 바람직하게는 0.04-30 nM의 최종 농도를 갖도록 첨가하는 것인 검정 방법.
본 검정 방법의 바람직한 실시양태에서, 검정은 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있는 바와 같이, 적합한 용량 반응 곡선이 관찰될 때까지 그 기간 동안 인큐베이션된다. 상기 인큐베이션 기간은 검정법에서 사용되는 세포에 따라 달라질 것이다; 이는 또한 검정 챔버에서 막에 사용되는 공극 크기에 따라 달라질 것이다. 공극 크기가 클수록 세포 분포 속도는 더 빨라질 것이며, 따라서, 인큐베이션 기간은 단축되겠지만, 이로 인해 불특정 결과를 얻게 될 수 있다. 인큐베이션 시간은 예비 실험에서 조정될 수 있고, 이는 통상의 기술자의 일반 기술 범위 내에 충분히 포함되어 있을 것이다.
9. 제1항목 내지 제8항목 중 어느 한 항목에 있어서, 검정, 예컨대 트랜스웰® 챔버를 세포 및 항체 첨가 후에 6-20시간, 바람직하게는 8-12시간 동안, 바람직하게는 대략 37℃에서 인큐베이션하고, 여기서 세포는 U937 세포이고, 막의 공극 크기는 대략 5 ㎛인 검정 방법.
10. 제1항목 내지 제9항목 중 어느 한 항목에 있어서, 이동된 세포를 바람직하게는 상기 인큐베이션 단계 후에, 바람직하게는 하부 챔버에서 계수하고, 이 때 바람직하게는 절반-최대 억제 항체 농도 (IC50 값)를 계산함으로써 시험되는 항체의 효능에 대한 정보를 수득할 수 있는 것인 검정 방법.
11. 제1항목 내지 제10항목 중 어느 한 항목에 있어서, 세포를 검정에 사용하기 전에 10 내지 48시간, 바람직하게는 8-16, 바람직하게는 10-12시간 동안 혈청 고갈 상태에 두는 것인 검정 방법.
이와 관련하여 "혈청 고갈"이라는 용어는 세포를 혈청-무함유 배지 중에서, 바람직하게는, 태아 소 혈청 무함유 배지 중에서 상기 명시된 기간 동안 배양하는 것을 의미하여야 한다. 혈청 고갈은 실제 검정 방법에 어떤 혈청 성분도 확실히 포함되지 않도록 수행되어야 한다. 혈청 성분이 실제 검정 방법에 포함되어 있다면, 혈청 성분이 강력한 화학주성인자로 알려져 있는 바 (혈청은 또한 하기 실시예에서 양성 대조군으로서 사용됨), 결과는 불특정 결과가 될 것이다.
12. 제1항목 내지 제11항목 중 어느 한 항목에 있어서, 세포가 작업용 뱅크(working bank)로부터 유래된 것인 검정 방법.
13. 제1항목 내지 제12항목 중 어느 한 항목에 있어서, 어떠한 (ox)MIF도 장치에 첨가하지 않는 것인 검정 방법.
이는 재조합 MIF 단백질이 제조될 필요가 없게 만들고, 따라서, 본 검정법의 장점들 중 하나를 제공한다.
본 검정 방법은 통상의 기술자의 일반 지식에 기초하여 그 또는 그녀에 의해 측정되는 세포 개수를 이용하여 수행될 수 있다.
이러한 세포 개수는 각 검정 장치의 각 웰 (바람직하게는 상부 챔버)에 첨가되는 세포 개수인 것으로 정의된다.
14. 제1항목 내지 제13항목 중 어느 하나 이상의 항목의 검정 방법을 수행하는 데 필요한 모든 시약, 바람직하게는
- MIF를 발현하는 세포
- 항체 희석 완충제 (예컨대, 글리신 완충제)
- 이동 배지, 및/또는
- 2 챔버 세포 이동 시스템
을 포함하는, 항-(ox)MIF-항체의 효능을 결정하기 위한 검정 키트.
본 키트의 바람직한 성분은 하기에서 보다 상세하게 설명될 것이다.
15. 항-(ox)MIF 항체가 제1항목 내지 제14항목 중 어느 한 항목에서 정의된 바와 같이 그의 효능에 대해 결정된다는 점을 특징으로 하는, 항-(ox)MIF 항체를 포함하는 제약 또는 진단 조성물.
본 발명에 따라, 항-(ox) MIF 항체, 특히 RAM0, RAM4, RAM0, RAB9, RAB0 및/또는 RAB4, 가장 바람직하게는 RAM9를 포함하는 제약 및 진단 조성물로서, 여기서, 항체는 그의 효능에 대해 정의되는 것인, 제약 및 진단 조성물을 최초로 신뢰할 수 있게 제공할 수 있다. 생성된 항체 제제는 항체 효능에 있어 일관될 것이다.
MIF 수준 상승, 즉, 일반적으로, MIF의 수준 상승은 각종 질환 발병 이후에, 그 중에서도 특히, 암 발병 이후에 검출된다. 그러나, MIF는 또한 건강한 대상체에서 순환하는 바, 이에 명확하게 구별하기는 어렵다. 이에 반해, oxMIF는 건강한 대상체에는 존재하지 않으며, 따라서, MIF 관련 질환에 대해 보다 강력한 진단 마커가 된다. 본 발명자들의 이전 연구에서 밝혀진 바와 같이, oxMIF는 질환 상태에서는 증가되어 있고, 환자의 샘플, 예컨대, 혈장, 혈액, 혈청 및 뇨 중에서 검출가능하다.
백스터 항체 RAB9, RAB4 및 RAB0 뿐만 아니라, RAM9, RAM4, 및 RAM0은 각각 oxMIF에 특이적으로 결합한다 (그리고, 이는 redMIF에는 결합하지 못함).
본 발명자들에 의해 수행된 이전 실험에서, 산화 방법, 예컨대, 시스틴 매개 산화, GSSG (ox. 글루타티온) 매개 산화 또는 MIF와 프로클린300 또는 단백질 가교제 (예컨대, BMOE)와의 인큐베이션을 수행하면, 상기 언급된 항체에의 결합이 이루어진다는 것을 알 수 있다.
본 발명자들은 하기와 같은 놀라운 결론에 도달하게 되었다:
* 재조합 MIF (인간, 뮤린, 래트, CHO, 원숭이)의 산화 환원 조절 (Cys/Glu 매개 경미한 산화)을 수행하거나, 또는 프로클린300 또는 단백질 가교제를 이용하여 재조합 MIF를 처리하면, 백스터의 항-MIF 항체 RAB9, RAB4 및 RAB0의 결합이 이루어진다.
* oxMIF의 환원은 Ab 결합의 손실을 유도한다.
* oxMIF 이소형에 대한 특이성은 (시험관내/생체내) 생물학적 Ab 효능과 상관 관계를 가진다.
* 반드시 MIF 수준일 필요 없이, 단지 oxMIF 수준만이 질환 상태와 상관 관계가 있다.
상기 언급된 항체는 그의 서열 뿐만 아니라, 상기 언급된 각각의 항체 RAB0, RAB4 및 RAB9 뿐만 아니라, RAM0, RAM4 및 RAM9 각각의 경쇄 또는 중쇄를 포함하는 이. 콜라이(E. coli) (균주 TG1) 플라스미드와 같은 기탁물, 둘 다에 의해 특징화되고, 입증된다.
플라스미드는 부다페스트 조약하에 독일 미생물 수집 및 세포 배양소(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) (DSMZ: 독일 브라운슈바이크 마쉐로더 벡 1베)에 기탁할 때 받은 공인 번호인 그의 DSM 번호로 특징화된다. 플라스미드는 각각 이. 콜라이 균주로 기탁되었다.
번호가 DSM 25110인 플라스미드는 항-MIF 항체 RAB4의 경쇄 서열을 포함한다. 번호가 DSM 25112인 플라스미드는 항-MIF 항체 RAB4의 중쇄 (IgG4) 서열을 포함한다.
적합한 숙주 세포에서 플라스미드 DSM 25110 및 DSM 25112를 공동으로 발현시키면, 그 결과로 바람직한 항-MIF 항체 RAB4가 제조된다.
번호가 DSM 25111인 플라스미드는 항-MIF 항체 RAB9의 경쇄 서열을 포함한다. 번호가 DSM 25113인 플라스미드는 항-MIF 항체 RAB9의 중쇄 (IgG4) 서열을 포함한다.
적합한 숙주 세포에서 플라스미드 DSM 25111 및 DSM 25113을 공동으로 발현시키면, 그 결과로 바람직한 항-MIF 항체 RAB9가 제조된다.
번호가 DSM 25114인 플라스미드는 항-MIF 항체 RAB0의 경쇄 서열을 포함한다. 번호가 DSM 25115인 플라스미드는 항-MIF 항체 RAB0의 중쇄 (IgG4) 서열을 포함한다.
적합한 숙주 세포에서 플라스미드 DSM 25114 및 DSM 25115를 공동으로 발현시키면, 그 결과로 바람직한 항-MIF 항체 RAB0이 제조된다.
항체 RAM0, RAM9 및 RAM4가 모두 기탁되었고; 이들 모두
부다페스트 조약에 따라
2012년 4월 12일자로
DSMZ (독일 브라운슈바이크)에 기탁되었으며, 하기 명칭을 가진다:
RAM9 - 중쇄: 이. 콜라이 GA.662-01.pRAM9hc - DSM 25860.
RAM4 - 경쇄: 이. 콜라이 GA.906-04.pRAM4lc - DSM 25861.
RAM9 - 경쇄: 이. 콜라이 GA.661-01.pRAM9lc - DSM 25859.
RAM4 - 중쇄: 이. 콜라이 GA.657-02.pRAM4hc - DSM 25862.
RAM0 - 경쇄: 이. 콜라이 GA.906-01.pRAM0lc - DSM 25863.
RAM0 - 중쇄: 이. 콜라이 GA.784-01.pRAM0hc - DSM 25864.
본 출원과 관련하여 생물학적 샘플은 바람직하게는 진단이 이루어져야 하는 대상체의 체액 샘플 또는 조직 또는 세포 샘플이다. 체액 샘플은 통상의 기술자에게 공지된 임의의 체액 샘플이다. 제한하는 것은 아니지만, 상기 샘플의 예는 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 뇨, 콧물, 복수, 안구액, 양수, 수양액, 유리체액, 눈물, 쿠퍼액(Cowper's fluid), 정액, 간질액, 림프, 모유, 점액 (콧물 및 가래 포함), 흉수, 고름, 질액, 피지, 뇌척수액 및 관절 낭액일 수 있다. 본 출원과 관련하여 추가의 생물학적 샘플은 (중공성) 신체 기관의 세척액 (세액) (예컨대, 기관지 폐포 세척 액, 위 세척액 및 장 세척액)일 수 있다. 조직 샘플은 바람직하게는 조직 생검, 예컨대, 니들 코어 생검이다.
대안적 실시양태에서, 본 출원과 관련하여 추가의 생물학적 샘플은 진단이 이루어져야 하는 대상체의 세포 샘플, 가장 바람직하게는 순환 또는 이환된 조직으로부터의 세포 샘플, 보다 바람직하게는 단일 세포 현탁액 샘플이다.
"예방적" 또는 "치료적" 처치라는 용어는 관련 기술 분야에서 인정되는 바와 같이, 환자에게 약물을 투여하는 것을 의미한다. 원치않는 병증 (예컨대, 숙주, 예컨대, 인간 또는 동물의 질환 또는 다른 원치않는 상태)이 임상적으로 발현되기 전에 투여될 경우, 이때 상기 처치는 예방적인 것이며, 즉, 이러한 처치는 원치않는 병증의 발병으로부터 숙주를 보호하는 것이며, 이에 반해, 원치않는 병증이 발현된 이후에 투여된 경우, 이때 상기 처치는 치료적인 것이다 (즉, 현존하는 원치않는 병증 또는 그의 부작용을 감소시키거나, 호전시키거나, 또는 그대로 유지시키고자 하는 것임).
본원에서 사용되는 바, 항-(ox)MIF 화합물이란, (ox)MIF의 생물학적 활성을 약화, 억제, 방해, 중화 또는 감소시키는 임의의 작용제를 의미한다. 항(ox)MIF 화합물은 (ox)MIF 활성을 억제 또는 중화시키는 작용제, 예를 들어, 항체, 특히 바람직하게는 본원에 기술된 항체, 더욱더 바람직하게는 각각의 항체 RAB9, RAB4 및/또는 RAB0, 또는 RAM9, RAM4 및/또는 RAM0일 수 있다.
정의 및 일반 기법
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용되는 과학 용어 및 기술 용어는 통상의 기술자가 통상 이해하는 의미를 가져야 한다. 일반적으로, 본원에 기술된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학과 관련하여 사용되는 명명법, 및 그의 기법은 관련 기술분야에널리 공지되어 있고, 통상 사용되는 것이다. 본 발명의 방법 및 기법은 달리 명시되지 않는 한, 일반적으로 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 종래 방법에 따라, 및 본 명세서 전역에 걸쳐 인용되고, 논의된 다양한 일반 참고 문헌 및 보다 구체적인 참고 문헌에 기술된 바와 같이 수행된다. 예컨대, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), 및 Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)] (상기 문헌은 본원에서 참조로 포함됨)을 참조할 수 있다.
"MIF" 또는 "대식세포 이동 억제 인자"란, 면역 및 염증성 반응에서 중요한 매개 인자로서, 및 글루코코르티코이드의 역 조절인자로서 알려져 있는 단백질을 의미한다. MIF로는, 단량체 형태가 115개의 아미노산 단백질로서 코딩되지만, 개시 메티오닌의 절단에 기인하여 114개의 단백질로서 제조되는, 포유동물 MIF, 구체적으로 인간 MIF (스위스-프롯(Swiss-Prot) 1차 수탁 번호: P14174)를 포함한다. "MIF"는 또한 "GIF" (글리코실화-억제 인자) 및 다른 형태의 MIF, 예컨대, MIF의 융합 단백질을 포함한다. MIF의 아미노산의 번호매김은 N-말단 메티오닌 (1번 아미노산)에서 출발하고, C-말단 알라닌 (115번 아미노산)으로 종결된다.
"산화된 MIF" 또는 oxMIF란, 본 발명의 목적을 위해 약한 산화 시약, 예컨대, 시스틴으로 MIF를 처리함에 따라 발생하는 MIF의 이소형으로서 정의된다. 이전 연구에서 본 발명자들에 의해 밝혀진 바와 같이, 이러한 방식으로 처리된 재조합 oxMIF는 (예컨대,) 동물에 박테리아를 시험감염시킨 후, 생체내 존재하는 oxMIF와 구조상의 재배열을 공유하는 MIF의 이소형(들)을 포함한다. redMIF란, 본 발명의 목적을 위해 환원된 MIF로서 정의되며, 이는 RAB0, RAB9 및/또는 RAB4에 결합하지 않는 MIF이다.
본 발명에 기술된 항-oxMIF 항체는 각각 약한 산화 또는 환원에 의해 생성되는 것인 oxMIF와 redMIF를 구별할 수 있고, 특이적으로 oxMIF를 검출하는 데 유용하다.
이들 형태이성질체 사이의 구별은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 바와 같이, ELISA 또는 표면 플라스몬 공명에 의해 평가된다.
비아코어(Biacore)에 의한 항체의 차등 결합 평가
항체 RAB9 및 RAB0에의 oxMIF 및 redMIF의 결합 동역학적 성질을 비아코어 3000 시스템을 사용하여 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 조사하였다. 항체를 CM5 (= 카르복시메틸화된 덱스트란) 칩 상에 코팅시키고, 0.2% 프로클린(Proclin)300과 함께 미리 인큐베이션된 재조합 MIF 단백질을 주사하였다. (프로클린300은 oxMIF의 redMIF로의 전환을 방지하여 oxMIF 구조를 안정화시키는 산화 이소티아졸론으로 이루어짐). 프로클린300이 첨가되지 않은 천연 HBS-EP 완충제 (= 비아코어 전개 완충제) 중에서, 재조합 MIF 단백질 중 어느 것도 RAB9, RAB0에 결합하지 않거나, 음성 (배경) 결합 대조군으로서 사용되는 참조 항체 (비관련 이소형 대조 항체)에 결합하지 않았다.
바람직한 실시양태에서, oxMIF는 항체 RAB9, RAB4 및/또는 RAB0 또는 그의 항원 결합 단편이 차등 결합하게 되는 MIF이며, 이는 상기 항체가 oxMIF에는 결합하지만, 상기 항체 중 어느 것도 redMIF에는 결합하지 않는다는 것을 의미한다.
다른 실시양태에서, 항-oxMIF 항체, 예컨대, 상기 언급된 항체 또는 그의 항원 결합부는 100 nM 미만의 KD로, 바람직하게는 50 nM 미만의 KD로, 더욱더 바람직하게는 10 nM 미만의 KD로 oxMIF에 결합한다. 특히 바람직하게는 본 발명의 항체는 5 nM 미만의 KD로 oxMIF에 결합한다.
항체, 예컨대, RAB9, RAB4 또는 RAB0의 (oxMIF 또는 redMIF에의) (비)결합은 통상의 기술자에게 일반적으로 알려져 있는 바와 같이 측정될 수 있으며, 그 예는 하기 방법들 중 어느 하나이다: 재조합 MIF를 이용하는 차등 결합 ELISA, 또는 상기 기술된, 널리 공지된 비아코어 검정법과 같이, 재조합 MIF를 그의 환원된 또는 산화된 상태로 사용하는 표면 플라스몬 공명.
바람직한 결합 측정 방법은 항체의 예컨대, rec. (ox)MIF에의 표면 플라스몬 공명인 바, 이에 "결합"은 KD가 100 nM 미만, 바람직하게는 50 nM 미만, 더욱더 바람직하게는 10 nM 미만인 것으로 나타나는 것으로 의도되는 반면, redMIF에의 비-결합은 KD가 400 nM 초과인 것을 특징으로 한다. "결합" 및 "특이적 결합"은 본원에서 교환가능하게 사용되며, 이는 상기 내용을 의미한다. 본 출원과 관련된 "차등 결합"이란, 화합물, 특히, 본원에 기술된 항체가 (예컨대, 상기 언급된 KD 값으로) oxMIF에 결합하면서, redMIF에는 결합하지 않는 (비-결합은 또한 상기와 같이 정의됨) 것을 의미한다.
"항체"란, 온전한 항체, 또는 (특이적) 결합에 대해 온전한 항체와 경쟁하는 항원 결합부를 의미한다. 일반적으로 문헌 [Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))] (참조로 포함됨)를 참조할 수 있다. 항체라는 용어는 비록 제한되는 것은 아니지만, 인간 항체, 포유동물 항체, 단리된 항체 및 유전적으로 조작된 형태, 예컨대, 키메라, 낙타화, 또는 인간화 항체를 포함한다.
항체의 "항원 결합부"라는 용어는 항원 (예컨대, (ox)MIF)에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 의미한다. 항원 결합부는 재조합 DNA 기법에 의해, 또는 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 제조될 수 있다. 항원 결합부는 예컨대, 비록 제한되는 것은 아니지만, 하기의 것을 포함한다: Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 및 상보성 결정 영역 (CDR) 단편, 단일 쇄 항체 (scFv), 키메라 항체, 폴리펩티드, 즉, ox 또는 redMIF에의 특이적인 항원 결합을 부여하는 데 충분한 항체의 적어도 일부를 함유하는 항체 및 폴리펩티드. 성숙한 경쇄 및 중쇄 가변 도메인은 N-말단에서 C-말단으로 영역 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 아미노산은 문헌 [Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))], [Chothia et al. J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)], 또는 [Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989)]의 정의에 따라 각 도메인으로 지정된다. 항체 또는 그의 항원 결합부는 유도체화될 수 있거나, 또 다른 기능성 분자 (예컨대, 또 다른 펩티드 또는 단백질)에 연결될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합부는 하나 이상의 다른 분자 엔티티, 예컨대, 또 다른 항체 (예컨대, 이중특이적 항체 또는 디아바디), 검출가능한 작용제, 세포독성제, 제약 작용제, 및/또는 연결 분자에 기능적으로 연결될 수 있다.
본원에서 "KD"라는 용어는 통상의 기술자의 일반 지식에 따라 특정 항체와 각 항원의 평형 해리 상수를 의미한다. 상기 평형 해리 상수는 보다 큰 객체 (본원에서: 복합체 ox 또는 red MIF/항체)를 보다 작은 성분 (본원에서: ox 또는 red MIF 및 항체)으로 분리, 즉, 해리시키는 성향을 나타내는 척도가 된다.
"인간 항체"라는 용어는 가변 및 불변 도메인이 인간 서열인, 임의의 항체를 의미한다. 상기 용어는 인간 유전자로부터 유래된 서열을 포함하지만, 가능한 면역원성을 증가시키기 위해, 친화도를 증가시키기 위해, 바람직하지 못한 폴딩을 유발할 수 있는 시스테인을 제거하는 것 등의 목적을 위해 변이된 항체를 포함한다. 상기 용어는 예컨대, 인간 세포의 전형적인 특징이 아닌 글리코실화를 부여할 수 있는, 비인간 세포에서 재조합적으로 제조된 상기 항체를 포함한다.
"인간화 항체"라는 용어는 인간 서열을 포함하고, 비인간 서열 또한 함유하는 항체를 의미한다.
"낙타화 항체"라는 용어는 항체 구조 또는 서열이 낙타로부터 유래된 항체와 더욱더 유사하도록 변이된 것이 항체를 의미하며, 이는 낙타류 항체로도 명명된다. 낙타화 항체를 설계하고 제조하는 방법은 통상의 기술자의 일반 지식의 일부이다.
"키메라 항체"라는 용어는 2개 이상의 상이한 종으로부터의 영역을 포함하는 항체를 의미한다. "단리된 항체" 또는 "단리된 그의 항원-결합부"라는 용어는 항체 공급원, 예컨대, 파지 디스플레이 라이브러리 또는 B 세포 레퍼토리로부터 확인되고 선택된 항체 또는 그의 항원 결합부를 의미한다.
본 발명에 따른 항-(ox)MIF 항체 제조는 유전자 조작에 의해, 예컨대, RNA의 역전사 및/또는 DNA 증폭 및 발현 벡터로의 클로닝을 통해 재조합 DNA를 생성하는 임의의 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 라이게이션되어 있는 바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 그가 내부로 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제할 수 있다 (예컨대, 박테리아의 복제 기점을 가진 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 실시양태에서, 벡터 (예컨대, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로의 도입시 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있으며, 이로써, 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 또한, 특정 벡터는 그가 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 상기 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 간단하게, "발현 벡터")로 지칭된다.
항-(ox)MIF 항체는 그 중에서도 특히, 종래 발현 벡터, 예컨대, 박테리아 벡터 (예컨대, pBR322 및 그의 유도체), 또는 진핵성 벡터에 의해 제조될 수 있다. 항체를 코딩하는 상기 서열은 복제, 발현 및/또는 숙주 세포로부터의 분비를 조절하는 조절 서열과 함께 제공될 수 있다. 이러한 조절 서열로는 예를 들어, 프로모터 (예컨대, CMV 또는 SV40) 및 신호 서열을 포함한다. 발현 벡터는 또한 선별 및 증폭 마커, 예컨대, 디히드로폴레이트 리덕타제 유전자 (DHFR), 히그로마이신-B-포스포트랜스퍼라제, 및 티미딘-키나제를 포함할 수 있다. 사용도는 벡터의 성분, 예컨대, 선별 마커, 레플리콘, 인핸서는 상업적으로 수득할 수 있거나, 또는 종래 방법에 의해 제조될 수 있다. 벡터는 다양한 세포 배양물에서, 예컨대, 포유동물 세포 예컨대, CHO, COS, HEK293, NSO, 섬유모세포, 곤충 세포, 효모 또는 박테리아, 예컨대, 이. 콜라이에서의 발현을 위한 것으로 구축될 수 있다. 일부 경우, 발현된 단백질을 최적으로 글리코실화시킬 수 있는 세포가 사용된다.
항-(ox)MIF 항체 경쇄 유전자(들) 및 항-(ox)MIF 항체 중쇄 유전자(들)는 별개의 벡터 내로 삽입될 수 있거나, 또는 유전자는 같은 발현 벡터 내로 삽입된다. 항체 유전자는 표준 방법에 의해, 예컨대, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보적인 제한 부위의 라이게이션, 또는 제한 부위가 존재하지 않을 경우, 평활 단부 라이게이션에 의해 발현 벡터 내로 삽입된다.
항-(ox)MIF 항체 또는 그의 항원-결합 단편 제조는 형질감염에 의해, 예컨대, 전기천공 또는 미세주입을 통해 재조합 DNA를 진핵 세포 내로 도입하기 위한 방법으로서, 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 조절 서열, 예컨대, 강한 프로모터 제어하의 항-(ox)MIF 항체 코딩 DNA 서열을 포함하는 발현 플라스미드를 적절한 형질감염 방법에 의해 적합한 숙주 세포주 내로 도입하여 도입된 서열이 게놈 내로 안정적으로 통합되어 있는 세포를 생성함으로써 항-(ox)MIF 항체의 재조합 발현을 달성할 수 있다. 리포펙션 방법이 본 발명에 따라 사용될 수 있는 형질감염 방법의 일례이다.
항-(ox)MIF 항체 제조는 또한 상기 형질전환된 세포를 예컨대, 연속적인 또는 배치식의 방식으로 배양하고, 항-(ox)MIF 항체를 예컨대, 구성적으로 또는 유도시에 발현시키는 방법으로서, 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 포함할 수 있다. 항-(ox)MIF 항체의 제조에 대한 추가 참조를 위해 구체적으로 WO 2009/086920이 참조된다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따라 제조된 항-(ox)MIF 항체는 oxMIF 또는 그의 에피토프에 결합한다. 본 발명에 따라 특히 바람직한 항체는 항체 RAB9, RAB4 및/또는 RAB0 뿐만 아니라, RAM9, RAM4 및/또는 RAM0이다.
이들 항체의 서열은 또한 부분적으로는 WO 2009/086920에 개시되어 있으며; 추가로 본 출원의 서열 목록 및 하기를 참조할 수 있다:
RAB9의 경쇄의 아미노산 서열에 대한 서열 1:
Figure pct00001
RAB4의 경쇄의 아미노산 서열에 대한 서열 2:
Figure pct00002
RAB0의 경쇄의 아미노산 서열에 대한 서열 3:
Figure pct00003
RAB2의 경쇄의 아미노산 서열에 대한 서열 4:
Figure pct00004
RAB9의 중쇄의 아미노산 서열에 대한 서열 5:
Figure pct00005
RAB4의 중쇄의 아미노산 서열에 대한 서열 6:
Figure pct00006
RAB0의 중쇄의 아미노산 서열에 대한 서열 7:
Figure pct00007
RAB2의 중쇄의 아미노산 서열에 대한 서열 8:
Figure pct00008
RAM0hc의 아미노산 서열에 대한 서열 9:
Figure pct00009
RAM0lc의 아미노산 서열에 대한 서열 10:
Figure pct00010
RAM9hc의 아미노산 서열에 대한 서열 11:
Figure pct00011
RAM9lc의 아미노산 서열에 대한 서열 12:
Figure pct00012
RAM4hc의 아미노산 서열에 대한 서열 13:
Figure pct00013
RAM4lc의 아미노산 서열에 대한 서열 14:
Figure pct00014
본 발명의 항-MIF 항체는 바람직하게는 단리된 단일클론 항체이다. 항-MIF 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, 또는 IgD 분자일 수 있다. 다른 실시양태에서, 항-MIF 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 하위부류이다. 다른 실시양태에서, 항체는 하위부류 IgG1 또는 IgG4이다. 다른 실시양태에서, 항체는 IgG4이다. 일부 실시양태에서, IgG4 항체는 세린 (세린228, 카바트(Kabat) 번호매김 체계에 따른 것)을 프롤린으로 변이시키는 단일 돌연변이를 가진다. 따라서, IgG4의 Fc 영역 중의 CPSC 하위서열은 IgG1 중의 하위서열인 CPPC가 된다 (Angal et al. Mol Immunol. 1993, 30, 105-108).
추가로, 항-(ox)MIF 항체 제조는 예컨대, 음이온 교환 크로마토그래피 또는 친화도 크로마토그래피를 통해 항체를 정제시키는 방법으로서, 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 항-(ox)MIF 항체는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제될 수 있다.
MIF의 "중심 영역" 및 "C-말단 영역"이라는 용어는 각각 아미노산 35-68 및 aa 86-115, 바람직하게는 각각 인간 MIF의 aa 50-68 및 86 내지 102를 포함하는 인간 MIF의 영역을 의미한다. 본 발명에 의해 검정될 수 있는 특히 바람직한 항체는 인간 MIF의 영역 aa 50-68 또는 영역 aa 86-102에 결합한다. 이는 또한 하기와 같이 결합하는 바람직한 항체 RAB0, RAB4, RAB2 및 RAB9 뿐만 아니라, RAM4, RAM9 및 RAM0의 결합에 반영된다:
RAB4 및 RAM4: aa 86-102
RAB9 및 RAM9; aa 50-68
RAB0 및 RAM0: aa 86-102
RAB2: aa 86-102
"에피토프"라는 용어는 이뮤노글로불린 또는 항체 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정기를 포함한다. 에피토프 결정기는 일반적으로 분자, 예컨대, 노출된 아미노산, 아미노 당, 또는 다른 탄수화물 측쇄로 된 화학적으로 활성인 표면 그룹으로 이루어지고, 특이적인 3차원 구조적 특징 뿐만 아니라, 특이적인 전하 특징을 가진다.
"벡터"라는 용어는 한 핵산에 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 상기 핵산 분자를 의미한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 플라스미드, 즉, 추가의 DNA 절편에 라이게이션되어 있는 고리형의 이중 가닥 DNA 루프이다.
"숙주 세포"라는 용어는 발현 벡터 도입 후, 재조합 단백질을 제조할 수 있는 세포주를 의미한다. "재조합 세포주"라는 용어는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포주를 의미한다. "재조합 세포주"는 특정 대상체 세포주 뿐만 아니라, 상기 세포주의 자손도 의미한다. 돌연변이 또는 환경상의 영향으로 다음 세대에서 특정의 변형이 발생할 수 있기 때문에, 사실상 상기 자손은 모체 세포와 동일하지 않을 수도 있지만, 이는 본원에서 사용되는 "재조합 세포주"라는 용어의 범주 내에 여전히 포함된다.
본 발명에 따른 숙주 세포 유형은 예컨대, COS 세포, CHO 세포, 또는 예컨대, HEK293 세포, 또는 통상의 기술자에게 공지된 임의의 다른 숙주 세포이며, 따라서, 예를 들어, 박테리아 세포, 예컨대, 이. 콜라이 세포 또한 포함한다. 한 실시양태에서, 항-MIF 항체는 선별 마커로서 G418이 첨가된, DHFR-고갈 CHO 세포주, 예컨대, DXB11에서 발현된다. 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 CHO 숙주 세포 내로 도입되고 나면, 항체는 숙주 세포에서 항체의 발현을 허용하거나, 숙주 세포가 성장하는 배양 배지 내로의 항체 분비를 허용하는 데 충분한 기간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 제조된다.
항-(ox)MIF 항체는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
제조된 임의의 항-(ox)MIF 항체는 주어진 효능을 가질 것이다. 이러한 항체가 진단 또는 제약 제제로 제제화되어야 하는 경우, 이러한 효능은 확실히 공지되도록 하는 것이 특히 중요하다. 그러므로, 예컨대, IC50 값으로 표시되는 것과 같이, 상기 효능을 명확하고, 신뢰가능하게 측정 및 계산하는 검정 방법을 가지는 것이 필요하다.
본 발명의 바람직한 검정 포맷은, 세포 이동을 허용하고, 검정 종료 후에는 바람직하게는 하부 챔버 중 이동 세포의 계수를 허용하는 두 챔버를 포함하는, 변형된 보이덴 챔버 (트랜스웰®) 검정법이다. 보이덴 챔버 및 트랜스웰® 챔버 검정법, 둘 다 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 관련 기술분야에서 세포 이동 검정법에 사용되는 모든 널리 공지된 장치는 원칙적으로 본 검정 방법을 위해 사용될 수 있다; 유일의 전제 조건은 2개의 (이상의) 챔버가 제공된다는 점이며, 여기서, 세포는 한 챔버 (예컨대, 상부 챔버)에 제공되고, 항체는 다른 챔버 (예컨대, 하부 챔버)에 제공된다. 그러나, 항체를 세포와 함께 상부 챔버에 첨가할 수도 있다. 보이덴 챔버와는 별개로, 다른 널리 공지된 검정 포맷, 예컨대, 다중웰 챔버, 또는 던(Dunn) 챔버 (슬리이드 상에 동심원 고리가 배열되어 있는 것)가 사용될 수 있다. 챔버는 해당 세포가 확산, 및 특히 이동할 수 있도록 상호 연결되어 있어야 한다. 이는 연결 막에 각 공극을 제공함으로써 달성된다. 공극 크기는 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같이, 검정에서 사용되는 세포 유형에 따라 선택된다. 결코 제한하고자 하지 않는 일례로서, 하기의 공극 크기는 전형적으로 본 발명의 검정법, 예컨대, 보이덴 챔버 검정법를 위해 선택된다:
보이덴 챔버 검정법:
성상세포 12 ㎛
림프구 5 ㎛
암 세포주 8 ㎛
대식세포 5 ㎛
내피 세포 8 ㎛
단핵구 5 ㎛
상피 세포 8 ㎛
호중구 3 ㎛
섬유모세포 8 ㎛
백혈구 3 ㎛
저속 이동 세포 12 ㎛.
본 발명에서 사용되는 바람직한 이동 배지는 특별히 제한되지 않는다. 이동 배지는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 바람직한 실시양태에서, 배지는 단백질 및 혈청 무함유 배지이다. 한 예로는 혈청-무함유 RPMI-배지: 10 mM Hepes, 1 mM 피브루산 나트륨, 4.5 g/L 글루코스를 포함하는 RPMI 1640 (깁코(Gibco), 카탈로그 번호 11835)이 있다.
예시적인 대조군으로서, 10% FBS를 포함하는 배지를 사용하여 세포 이동을 유도한다 (RPMI-배지: 불활성화된 10% FBS, 10 mM Hepes, 1 mM Na-피루베이트, 4.5 g/L 글루코스, 0.05 mM β-메르캅토에탄올을 함유하는 RPMI 1640 (깁코, 카탈로그 번호 11835)).
본 발명의 검정법에 바람직한 세포는 이동할 수 있는 세포이다. 세포는 (ox)MIF를 발현하는 세포인 것이 본 발명에 특히 중요하다. 세포는 내인성 (ox)MIF를 발현할 수 있거나, 또는 (ox)MIF가 이들 세포에 의해 발현되도록 상기 세포로 유전적으로 조작될 수 있다. 특히, 이를 통해서 세포 이동이 달성되며; 즉, 세포는 바람직하게는 그의 표면 상에 (ox)MIF를 발현하여 그 자신의 이동을 자극시킨다. 이들 세포는 특히 그의 이동에 특히 활성을 띠고, 항-(ox)MIF 항체가 이들 세포의 (ox)MIF와 접촉하게 될 경우, 상기와 같은 이동은 억제될 것 (즉, 저속화될 것)으로 나타났다. 이러한 접촉은 대개 예컨대, 두 챔버를 분할하는, 공극이 있는 막과 같은 칸막이 상에서 발생할 것이다. 해당 항체가 높은 효능을 가지는 경우, 이 항체는 세포의 이동 작용을 효능이 낮은 경우에서보다 훨씬 더 저속화시킬 것이다. 따라서, 실제로 칸막이, 예컨대, 공극을 통해 상부 챔버에서부터 하부 챔버로 이동한 세포 개수는 항체가 얼마나 효능이 있는지를 나타내는 지표가 된다. 하부 챔버로 이동한 세포 개수가 많다는 것은 효능이 낮다는 것 (즉, 이동 억제가 낮음)과 같은 반면, 하부 챔버로 이동한 세포 개수가 적다는 것은 효능이 높다는 것 (즉, 이동 억제가 높음)과 같다.
이러한 기준을 충족시키는 세포는 일반적으로 통상의 기술분야에 공지되어 있지만, 그러나, 본 포맷에서는 단핵구 세포, 예컨대, (인간) U937 세포 (ATCC 카탈로그 번호: CRL-1593.2)를 사용하는 것이 특히 바람직하다. 항-oxMIF 항체의 효능을 결정할 경우, 세포는 (ox)MIF를 예컨대, 그의 세포 표면 상에 발현하여야 하고, 이는 통상의 기술자에게 널리 공지된 바와 같이, 예컨대, FACS (형광 활성 세포 분류)에 의해 측정될 수 있다. 세포는 MIF를 재조합적으로 발현할 수 있거나, 또는 본 발명자들에 의해 oxMIF는 오직 질환 상태인 동안에만 세포에 의해서 발현되는 것으로 앞서 밝혀진 바와 같이, 예컨대, 질환 샘플로부터 채취된 세포와 같이, 내인적으로 MIF를 발현할 수 있다. 상기 바람직한 세포가 이러한 기준을 충족시킨다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 항체는 완충제 시스템으로 제공된다. 완충제 시스템은 바람직하게는 비독성이고, 항체에 대해 우수한 가용성을 나타낸다. 보다 바람직하게는 완충제 시스템은 통상의 기술자에게 널리 공지된 바와 같이, 중간 정도의 약산 및 그의 접합체 염기, 예컨대, PBS (포스페이트 완충 염수) 또는 N-치환된 타우린 완충제를 포함한다. 특히 바람직한 실시양태는 글리신 완충제를 사용한다 (예컨대, 100-350 mM 글리신 완충제, 보다 바람직하게는 200-300 mM, 가장 바람직하게는 대략 250 mM, pH 4.5-5.5, 바람직하게는 대략 pH 5.0).
검정법에 바람직한 온도는 37℃ 또는 약 37℃이다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되며, 이는 결코 별첨된 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예
실시예 1
항-MIF 항체 RAM9 화학운동성 검정법; 세포 기반 검정법
의도 목적:
단핵구 세포의 무작위 이동 (= 화학운동성)을 억제시킬 수 있는 글리신-완충처리된 항-MIF RAM9 제제 (= 시험 품목)의 기능성을 시험하기 위해 시험을 설정하였다. 본 검정법 및 각각의 방법은 최종 약물 제품(Final Drug Product: FDP)에 대한 공정 단계에서 품질 관리 시험으로서 사용될 수 있다고 본 발명자들에 의해 밝혀졌다.
1) 이론적 설명:
MIF는 구성적으로 U397 (및 다른 암성) 단핵구에서 발현되고, oxMIF는 이들 세포의 세포 표면 상에 존재하며 (FACS 데이터, 도 2 참조), 이것이 이동성 기능을 입증한다. (ox)MIF를 내인적으로 또는 외인적으로 발현하는 세포, 예컨대, 질환 샘플로부터 유래된 세포를 사용하는 것이 본 발명의 중요한 특징이다. 이러한 원리는, oxMIF는 건강항 세포 또는 조직에는 존재하지 않는다는 본 발명자들의 이전 결과에 기초한 것이다. U397 세포주는 본 발명을 수행하는 데 바람직한 일례이다. 이는 1차 세포주가 아닌, 암성 조직으로부터 유래된 불멸 세포주이다.
시험 방법 원리:
인간 단핵구의 무작위 이동 (화학운동성)을 억제시킬 수 있는 항-MIF 항체의 능력은 (보이덴 챔버 검정법과 유사한) 트랜스웰® 검정법으로 시험된다. 본 시험 방법의 일반적인 셋업은 도 1에 제시되어 있다. 상기와 같은 용도로 이용하기 위해, 혈청 고갈된 단핵구 세포 (세포주: U937)를 다공성 (5 ㎛) 트랜스웰® 삽입물 (즉, "상부 챔버")에 시딩하고, 상이한 농도의 항-MIF 항체 RAM9 (= 하부 챔버 중 시험 품목)로의 세포 이동을 측정하였다. RAM9의 농도 (로그 스케일)에 대한 이동 세포 개수의 비선형 회귀 방정식 (4-파라미터 로지스틱)에 의해 IC50을 측정하였다.
Y = (Y최대-Y최소)/(1 +(X/IC50)Exp기울기+Y최소.
시험 방법에 관한 상세한 설명:
물질 및 장치
Figure pct00015
2) 추가 정보:
샘플 적용:
각 항체 희석액을 6회 (n=6) 적용시켰다. 추가 계산을 위해 평균 값을 사용하였다. 5 ㎕의 최소 피펫 부피를 사용하였다.
대조군: 각 플레이트에 음성 및 양성 대조군
이중 플레이트로 검정법을 수행하였다 (로트 시험당 2개의 플레이트).
3) (하기 다이어그램에 제시된 바와 같은) 레이아웃:
신뢰도 증진을 위해 RAM9 및 대조 항체 샘플에 대해서는 (96 웰 ELISA 플레이트의) 가장자리 웰을 사용하지 않았다 (완충제 대조군 및 양성 대조군에 대해서만 오직 사용).
Figure pct00016
4) 방법:
1일째:
a. U937 세포를 계수하였다.
b. 적합한 양의 세포 현탁액을 800 rpm으로 실온에서 5 min 동안 원심분리하였다.
c. 상청액을 버리고, 세포를 미리 가온된 이동 배지 중에서 재현탁시켰다 (세척).
d. 800 rpm으로 실온에서 5 min 동안 추가의 원심분리 단계를 수행하였다.
e. 상청액을 버렸다.
f. 이후, 세포를 미리 가온된 이동 배지 중에 1 x 106개 세포/ml로 재현탁시켰다.
g. 세포 현탁액을 인큐베이터에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다.
2일째:
a. 트랜스웰® 플레이트를 하기와 같이 평형화시켰다:
235 ㎕ 미리 가온된 이동 배지를 플레이트의 모든 웰에 적용시켰다.
플레이트에 트랜스웰® 삽입물을 넣고, 100 ㎕ 미리 가온된 이동 배지를 삽입물에 첨가하였다. 세포 배양 인큐베이터에서 1시간 이상 인큐베이션시켰다.
b. 하기와 같이 항체를 제조하였다:
하부 웰 중 RAM9의 최종 농도:
30 nM, 10 nM, 3.33 nM, 1.11 nM, 0.37 nM, 0.12 nM, 0.04 nM (1 ㎍/ml의 IgG는 6.7 nM로 계산됨).
하부 웰 중 시나지스®의 최종 농도:
30 nM, 10 nM, 3.33 nM (1 ㎍/ml의 IgG는 6.7 nM로 계산됨).
동일 부피의 항체 희석 완충제를 첨가하여 샘플 부피를 조정하였다. 샘플 혼합을 개선시키기 위해 희석 플레이트 및 다채널 피펫을 사용함으로써 사전 희석 단계를 수행하는 것이 고도로 권고되는 바, 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이, 사전 희석 단계 또한 수행하였다.
c. 세포를 하기와 같이 제조하였다:
세포를 계수하고, 800 rpm으로 실온에서 5 min 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 세포를 미리 가온된 이동 배지로 1회에 걸쳐 세척하였다. 800 rpm으로 5 min 동안 또 한번의 원심분리 단계를 수행하였다.
상청액을 버리고, 펠릿을 1 x 106개 세포/ml의 세포 계수로 재현탁시켰다.
d. 플레이트 제조를 위해, 하기 단계를 수행하였다:
평형 단계로부터 얻은 배지를 (웰 및 삽입물로부터) 버렸다.
삽입물 막에 닿지 않도록 하였고, 삽입물을 바닥이 위로 향하게 라미나르 플로우(Laminar Flow) 후드에 배치하였다 (막의 대기 건조 방지).
e. 220 ㎕ 미리 가온된 이동 배지 (또는 10% HG-전체 배지 = 양성 대조군)를 첨가하였다. 235 ㎕ 이동 배지를 사용되지 않은 웰에 첨가하였다.
하기와 같이 항체를 추가하였다:
다채널 피펫을 이용하여 15 ㎕의 미리 희석된 항체를 트랜스웰® 플레이트의 웰에 적용시켰다. 웰 안에 기포를 방지하였다!
f. 하기와 같이 세포를 첨가하였다:
주의하여 삽입물을 트랜스웰® 플레이트에 부착시키고, 다채널 피펫을 이용하여 제조된 세포 현탁액 100 ㎕ (1 x 106개 세포/ml)를 모든 삽입물에 첨가하였다. → 삽입물내 최종 세포 개수: 1 x 105개 세포/웰.
삽입물 막이 피펫 팁과 닿지 않게 하였다.
g. 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에서 밤새도록 (대략 16시간) 인큐베이션시켰다.
3일째:
a. 삽입물을 버렸다; 세포 계수에 트랜스웰® 플레이트를 사용하였다.
b. 다채널 피펫을 이용하여 수회에 걸쳐 위아래로 피펫팅하여 세포를 분리하였다.
c. 기포를 제거하였다.
d. 측정 전 30 min 이상 동안 세포가 웰에서 침전될 수 있도록 하였다.
e. 셀라비스타 시스템 (세포 컨플루언스를 위한 오퍼레이터 설정 환경과 함께 파라미터 설정 환경 THP -1 AK)을 이용하여 세포를 계수하였다.
통상의 기술자에게 널리 공지된 바와 같이, 예컨대, 4-파라미터 피트 비선형 회귀 모델 및 하기 방정식을 사용하여 평가 (IC50 값 계산)를 수행하였다:
Y= ( Y 최대 - Y 최소 )/(1 +(X/IC 50 ) Exp 기울기 + Y 최소 .
RAM9에 대해 허용되는 IC50 값의 예시적인 범위: ≥ 0.1 nM 및 ≤ 4 nM.
상기와 관련하여 "허용되는"이란, 각 플레이트의 IC50 계산치가 상기 범위 내에 포함되지 않는 경우, 시험은 반복 수행되어야 한다는 것을 의미한다. 반복 수행된 시험의 IC50이 상기 범위 내에 포함되지 않는 경우, RAM9 항체는 시험을 통과하지 못했다.
주의:
RAM9의 IC50 계산을 위해서는 예컨대, 5개 이상의 연속 농도 (및 피트 값)가 곡선 피트에 포함되어야 한다. (제시된 실시예에서, 계산을 위해 6개의 농도 (0.04 nM - 10 nM 항체)가 사용됨).
Figure pct00017
5) 결론: 본 방법은 그의 의도 목적에 대해 적격한 것이고, 즉, 항-(ox)MIF 항체의 효능을 시험하는 데 성공적으로 사용될 수 있다. 특히, 임상 I + II상 물질을 시험하는 데 매우 적합하다.
실시예 2
원칙적으로, 같은 검정 방법을 사용하여 항체가 상부 챔버에 세포와 함께 제공될 수 있는지 여부를 측정하였다.
간단한 요약:
세포 이동 검정법: HTS 트랜스웰 플레이트 (코닝): 5 ㎛.
* 세포: U937 (10번째 계대접종물), 밤새도록 고갈 상태.
* RAM9 항체: 30 nM - 0.04 nM, 삽입물 내로 피펫팅됨.
* 글리신 중 시나지스®: 30 nM; 10 nM; 3.3 nM, 삽입물 내로 피펫팅됨.
* 음성 대조군: 글리신; 양성 대조군: FBS (태아 소 혈청).
* 인큐베이션: 2개의 플레이트, 16 h
* 결과 계산을 위해 셀라비스타® 사용.
결과:
플레이트 1
Figure pct00018
플레이트 2
Figure pct00019
결론:
본 검정 방법은 그의 의도 목적에 대해 적합한 것이다.
본 검정법은 FDA 생물검정법 가이드라인에 따라 MIF 특이적 항체/약물을 그의 효능에 대해 시험할 수 있게 하는 검정법의 견고성 및 정밀도와 관련하여 새로운 (산업상) 표준을 설정하고; 실제 검정법은 임상 III상까지 항-MIF 최종 약물 제품 로트를 시험하는 데 충분한 적격 시험이다. 다른 종으로부터의 (예컨대, 래트로부터의) 단핵구 세포를 적용시킴으로써, 검정법은 또한 재조합 MIF를 사용할 필요 없이 MIF 억제 항체/분자의 종 비교가능성 연구를 뒷받침하는 데에도 사용될 수 있다.
본 검정법은 사용이 용이하고, 재조합 MIF 단백질 사용을 필요로 하지 않는다. 작용 기전에 기초하여, 생물검정법은 염증성 질환과 관련하여 항-MIF 항체 효능을 평가하는 데 있어 FDA의 승인을 받았다. 다른 적응증 (예컨대, 암)에서의 항-MIF 항체/약물의 시험관내 효능을 평가하기 위해, 다른 검정 원리/포맷이 규제 기관에 의해 요구될 수 있다.
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
SEQUENCE LISTING <110> Baxter Healthcare S.A. Baxter International Inc. <120> ANTI-MIF ANTIBODY CELL MIGRATION ASSAY <130> 162 869 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of RAB9 <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Arg Ile Met Thr Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Val Ala Ser His Ser Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Trp Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 2 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of RAB4 <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Ser Ser 20 25 30 Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Thr Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Ala Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Arg Ser Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 3 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of RAB0 <400> 3 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Ser Ser 20 25 30 Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Thr Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Ala Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Arg Ser Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 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Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 370 375 380 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 385 390 395 400 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 405 410 415 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 420 425 430 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 435 440 445 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 14 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RAM4lc <400> 14 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Ser Ser 20 25 30 Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Thr Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Ala Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Arg Ser Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims (15)

  1. - 이동할 수 있는 세포를 장치의 제1 부분에 제공하고, 여기서 세포는 MIF를 포함하는 것인 단계,
    - 세포 이동 및 확산이 이루어지도록 장치의 제1 부분과 연결되어 구성된 장치의 제2 부분에 결정할 항-(ox)MIF 항체를 첨가하는 단계, 및
    - 이동 억제를 계산하는 단계
    를 포함하며, 여기서 세포 이동이 수행되는 것인, 항-MIF 항체의 효능을 결정하는 검정 방법.
  2. 제1항에 있어서, 항-MIF 항체가 항-oxMIF 항체이고, 바람직하게는 항체가 RAB0, RAB4, RAB9, RAM0, RAM4 및/또는 RAM9로 이루어진 군으로부터 선택되며, 매우 바람직하게는 RAM9인 검정 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 장치가 공극이 있는 분리막을 통해 연결된 상부 및 하부 챔버를 포함하고, 여기서 세포는 상부 챔버에 첨가되고, 항체는 하부 챔버에 첨가되며, 바람직하게는 장치가 2 챔버 세포 이동 검정법 (변형된 보이덴(Boyden) 챔버 검정법), 보다 바람직하게는 트랜스웰(Transwell) 세포 이동 검정법 장치인 검정 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 (ox)MIF를 바람직하게는 그의 세포 표면 상에 발현하는 세포이고, 바람직하게는 세포가 질환 샘플로부터의 세포이고, 보다 바람직하게는 세포가 단핵구 세포, 바람직하게는 인간 단핵구 세포, 보다 바람직하게는 인간 불멸화 단핵구 세포, 가장 바람직하게는 U937 세포, 또는 THP-1 인간 단핵구 세포, 또는 대안적 실시양태에서 래트 NR 8383 단핵구 세포인 검정 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 세포를 이동을 허용하는 적합한 이동 배지 중의 세포 현탁액으로서 제공하는 것인 검정 방법.
  6. 제5항에 있어서, 이동 배지가 단백질을 포함하지 않는 것인 검정 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항체를 중간 정도의 약산 및 그의 접합체 염기를 포함하는 비독성 생물학적 완충제, 바람직하게는 글리신 완충제, N-치환된 타우린 완충제, 또는 포스페이트 완충 염수 (PBS) 완충제 중에서, 예컨대 트랜스웰® 챔버의 제2 부분, 예컨대 하부 챔버에 첨가하는 것인 검정 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항체를 검정에서 바람직하게는 일련의 희석액으로서 0.01-100 nM, 바람직하게는 0.02 내지 50 nM, 바람직하게는 0.04-30 nM의 최종 농도를 갖도록 첨가하는 것인 검정 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 검정, 예컨대, 트랜스웰® 챔버를 세포 및 항체 첨가 후에 6-20시간, 바람직하게는 8-12시간 동안, 바람직하게는 대략 37℃에서 인큐베이션하며, 여기서, 세포는 U937 세포이고, 막의 공극 크기는 대략 5 ㎛인 검정 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 이동된 세포를 바람직하게는 상기 인큐베이션 단계 후에, 바람직하게는 하부 챔버에서 계수하고, 이 때 바람직하게는 절반-최대 억제 항체 농도 (IC50 값)를 계산함으로써 시험된 항체의 효능에 대한 정보를 수득할 수 있는 것인 검정 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 세포를 검정에 사용하기 전에 10 내지 48시간, 바람직하게는 8-16, 바람직하게는 10-12시간 동안 혈청 고갈 상태에 두는 것인 검정 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 작업용 뱅크(working bank)로부터 유래된 것인 검정 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 어떠한 (ox)MIF도 장치에 첨가하지 않는 것인 검정 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나 이상의 항의 검정 방법을 수행하는 데 필요한 모든 시약, 바람직하게는
    - MIF를 발현하는 세포
    - 항체 희석 완충제 (예컨대, 글리신 완충제)
    - 이동 배지, 및/또는
    - 2 챔버 세포 이동 시스템
    을 포함하는, 항-(ox)MIF-항체의 효능을 결정하기 위한 검정 키트.
  15. 항-(ox)MIF 항체가 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같이 그의 효능에 대해 결정된다는 점을 특징으로 하는, 항-(ox)MIF 항체를 포함하는 제약 또는 진단 조성물.
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