TW201634059A - 免疫治療疫苗及抗體之組合治療 - Google Patents

免疫治療疫苗及抗體之組合治療 Download PDF

Info

Publication number
TW201634059A
TW201634059A TW105104277A TW105104277A TW201634059A TW 201634059 A TW201634059 A TW 201634059A TW 105104277 A TW105104277 A TW 105104277A TW 105104277 A TW105104277 A TW 105104277A TW 201634059 A TW201634059 A TW 201634059A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
combination
cells
virus
cancer
therapeutic vaccine
Prior art date
Application number
TW105104277A
Other languages
English (en)
Other versions
TWI823828B (zh
Inventor
菲利浦 史羅斯
茱莉亞 后堤拉諾
卡洛拉 力特涅爾
卡米爾 皮米里
Original Assignee
傳斯堅公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 傳斯堅公司 filed Critical 傳斯堅公司
Publication of TW201634059A publication Critical patent/TW201634059A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI823828B publication Critical patent/TWI823828B/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/761—Adenovirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001136—Cytokines
    • A61K39/001139—Colony stimulating factors [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001136—Cytokines
    • A61K39/00114—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001169—Tumor associated carbohydrates
    • A61K39/00117—Mucins, e.g. MUC-1
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A61K2039/55533—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24132—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24171—Demonstrated in vivo effect

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本發明係有關於一種組合產物、組成物以及零件套組，其包含至少(i)一治療疫苗及(ii)一或多種免疫查核點調節劑。本發明亦關於一種用於治療增生性或感染性疾病的方法，以及一種用於引出或刺激及/或重新定向免疫反應的方法，其中該方法包含投藥該組合產物或該組成物至需要其之個體內。

Description

免疫治療疫苗及抗體之組合治療 發明領域
本發明一般而言係有關於新穎的組合，其包含一或多種免疫查核點調節劑及至少一治療疫苗(更具體地為一種編碼抗原之載體化的疫苗)。具體例亦包括包含此等組分之組成物及套組，以及用於治療、預防或是抑制增生性及感染性疾病的方法。本發明對免疫療法的領域特別有興趣，特別為增進宿主的免疫反應，並且尤其是瓦解免疫耐受性。
發明背景
利用宿主的免疫系統來根除持續性的感染性生物及惡性細胞為一種大有可為的方法。此特定類型的疫苗策略一般稱為免疫療法。廣泛地使用於傳統的疫苗接種，免疫療法於治療嚴重、慢性及威脅生命的疾病療法中業已顯示出一些有希望的結果。
許多研究團隊已經研究免疫療法作為治療癌症有潛力的模態，試圖要刺激免疫系統且因而排斥並且消滅腫瘤。幾十年來文獻中業已於描述非常大量利用各種方法 的免疫療法，舉例來說，癌細胞、細胞的一部分、純化的抗原及載體化的抗原。細胞疫苗一般而言是由癌細胞構成，該癌細胞為在手術過程從病人移除且在重新引入病人之前於實驗室中改變使得其等更適合被病人的免疫系統攻擊。任擇地，可以使用的免疫細胞為：得自於業已暴露於癌細胞或是關聯性抗原之病人血液，在會使其等轉變成樹狀細胞之化學激活素存在下培養，然後透過靜脈內灌注而送回該病人，俾以幫助其他的免疫系統細胞攻擊癌細胞。樹狀細胞為基的疫苗普羅文奇®(Provenge®)(西普魯塞-T(sipuleucel-T))，係於晚期臨床試驗中測試用於治療晚期前列腺癌並且於2010年得到FDA核准。然而，此等細胞為基的疫苗需要為每個病人各別地製造，以及因而生產此等細胞的方法為複雜且昂貴的。
抗原疫苗只由對某些類型的癌症或病原體特異性的一種或一些蛋白質或胜肽抗原構成。一旦投藥，其等能夠誘導對抗此等抗原的特定免疫反應且推升病人的免疫系統。數種候選胜肽疫苗達成臨床發展。舉例而言，脂質體疫苗Stimuvax®併入常見的癌症普遍表現的黏蛋白1(MUC1)醣蛋白所產生的脂肽。縱然於臨床試驗中，沒有於具有非小細胞肺癌(NSCL)的病人體內提供整體存活之顯著改善，然而於一些子群病人中可看見效應。
載體為基的疫苗業已顯現出很大的希望且於新的治療策略開發上扮演重要的角色。載體係用來遞送靶定的抗原至身體內。典型地，載體係源自病毒、細菌、酵母 菌細胞或是其他結構，其等已經改變成不再對病人有害的(諸如，不活化、減毒等等)。理想的病毒載體應安全且使能夠將編碼抗原有效呈現給免疫系統。再者，載體系統必須滿足使其能夠在大規模基礎上生產之準則。活病毒載體因其等表現來自各種各樣的病原體之抗原及腫瘤組織的能力，以及透過能有效誘導細胞免疫反應之重要的內源途徑而促進抗原呈現的能力，而引起注意(Reyes-Sandoval,2007,Immunology 121(2)：158-65)。因而至今已有數種病毒載體，其等全體均有相關的優點以及限制，取決於提出的應用而定(參閱舉例而言，Harrop and Carroll,2006,Front Biosci.,11,804-817；Inchauspé等人，2009,Int Rev Immunol 28(1)：7-19；Torresi等人，2011,J.Hepatol.54(6)：1273-85)。也已經有進行重大的研究工作來開發編碼抗原的DNA質體及有關的遞送裝置，以刺激保護性免疫反應(舉例來說參見，Reyes-Sandoval and Ertl,2001,Curr Mol Med 1(2)：217-43)。
舉例而言，複製缺陷型腺病毒(Ad)載體業已被廣泛使用，因為Ad會感染複製細胞及非複製細胞，具有廣大的組織趨性，於合適的包裝細胞株內有效地繁殖，以及生產方法是可縮放且經濟實惠的(Boukhebza等人，2014,Vaccine 32(26)：3256-63)。減毒非複製牛痘病毒安卡拉(Ankara)株(MVA)亦為引起注意候選者，因為其於癌症及感染性疾病領域二者中，業已顯示會誘導穩健的細胞免疫反應及優秀的安全性廓型(Boukhebza等人，2012,Hum Vaccin Immunother 8(12)：1746-57；Habersetzer等人，2011,Gastroenterology 141(3)：890-99；Fournillier等人，2007,Vaccine 25(42)：7339-53；Drexler等人，2004,Curr Opin Biotechnol 15(6)：506-12)。MVA業已於雞胚胎纖維母細胞內減毒超過多於570個繼代，導引其之基因體損失15%。所以，MVA因損失數種抗免疫防禦基因而無法於多數哺乳動物細胞中生產成熟的病毒粒子，此引致傳播的風險降低，以及增高的免疫原性(immunogenicity)(Sutter等人，1994,Vaccine 12(11)：1032-40)。
然而，免疫系統與慢性感染性疾病及癌症對抗的能力有限。有時免疫系統不能偵測到癌或感染的細胞為外來物，因為該等細胞與正常細胞之差異並不夠充分。在其他情況下，反應可能不夠強大到足以毀壞病態細胞，尤其是於免疫受損的病人。最後，免疫系統可能因病態細胞已演化出不同的方式來躲避免疫系統而不起作用。
主要的免疫抑制機轉中的一者是一種已知為“T細胞衰竭”的過程，其起因於慢性的暴露於抗原，且特徵在於抑制性受體之向上調控。此等抑制性受體擔任免疫查核點，俾以防止不受控制的免疫反應。文獻中業已描述作用於不同位準的T細胞的免疫性之各種免疫查核點，包括計畫性細胞死亡蛋白質1(PD-1)、胞毒型T淋巴球關聯性抗原4(CTLA-4)、淋巴球活化基因3(LAG3)、B與T淋巴球衰減因子、T細胞免疫球蛋白、含黏蛋白領域蛋白質3(TIM-3)，以及T細胞活化的V-領域免疫球蛋白抑制因子(VISTA)。亦已 有報導PD-1與其之配體PDL-1與PDL-2之交互作用於T細胞衰竭方面扮演關鍵性的角色(Maier等人，2007,J.Immunol.178：2714-20；Tzeng等人，2012,PLoS One 7：e39179)。
無論是什麼作用機轉，此等免疫查核點都能抑制有效的免疫反應之發展。對於封阻此免疫查核點作為抑制免疫系統耐受性的手段且因而拯救衰竭的T細胞，越來越有興趣(Leach等人，1996,Science 271：1734-6)。在過去十年的期間業已發展出非常大量的拮抗劑抗體(諸如，抗LAG3、-PD-L1、-CTLA-4、-PD1等等)，以及有三種已經上市銷售。第一種到達上市者為單株-CTLA-4-專一性抗體伊匹單抗(ipilimumab)(益伏(Yervoy)商品名稱，Bristol-Myers Squibb(BMS))業已經認可用於不可切除或轉移性黑色素瘤。BMS報告從用伊匹單抗(ipilimumab)治療的1861個黑色素瘤病人，於3及7年後分別地有22%及17%仍然活著。抗-PD1納武單抗(nivolumab)抗體(Opdivo商品名稱，BMS)係於日本在2014年七月核准用於惡性的黑色素瘤。期中第二期數據顯示預治療的轉移性黑色素瘤32%的反應率且高惡性不良事件比伊匹單抗(Ipilimumab)低。抗-PD-1潘博利速單抗(pembrolizumab)(Keytruda商品名稱，Merck)，獲得加速FDA核准用於治療不可切除或轉移性黑色素瘤。上市的抗體以及靶定PD-1(諸如，比帝利速單抗(pidilizumab)，CureTech)、CTLA-4(諸如，摧麥拉單抗(Tremelimumab)(AstraZeneca)、PD-L1(諸如MPDL3280A，Roche)、KIR(利瑞單抗(lirilumab)，BMS)、IDO1(諸如吲哚西莫特 (indoximod)，NewLink genetics)及其他之各種其他的免疫查核點抑制劑，亦於臨床試驗中用於其他的適應症，包括NSCLC(非小細胞肺癌)。
拮抗劑抗體之預臨床研究亦於感染性疾病領域中實行(參見諸如，Barber等人，2006,Nature 439：682-7：Cecchinato等人，2008,J.Immunol 180：5439-47)，以及考慮不同的載體平台之組合(DNA、MVA、慢病毒、牛痘等等)。尤其是，PD-L1封阻及表現LMCV(淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒)抗原決定位的牛痘病毒之組合，顯示出在持續性的病毒感染期間改善抗原決定位-專一性CD8+T細胞的功能(Ha等人，2008,JEM 205：543-55)。抗PD-1抗體與SIV gag腺病毒載體一起投藥於初始(naive)獼猴造成Gag-專一性T細胞增加(Finnefrock等人，2009,J.Immunol.182：980-7)。WO2004/058801係有關於癌症治療法，其係使用一種編碼p53致癌性多肽的重組MVA載體組合以抗-CTLA4抗體及CpG寡去氧核苷酸免疫調節劑。
可以預期癌症及感染性疾病會繼續是許多年嚴重的全球健康威脅。縱然可得到抗生素及疫苗，但是感染性疾病於全世界每年造成100.000件死亡(WHO數據2002年)。另一方面，惡性且尤其是轉移性腫瘤經常對慣用的療法有抗性，此解釋了一些癌症顯著的發病率。以上說明清楚地闡明設計有效的療法為一件困難的工作，因許多宿主身體建立的機轉會逃避免疫效應細胞。
發明概要
於本發明的上下文內，本發明人辨識出一種組合產物，其能增強病人的免疫反應及/或恢復衰竭的T細胞媒介之免疫性。此一種組合產物之必需元素為一種治療疫苗及一種免疫查核點抑制劑。本發明人驚訝地發現一種編碼模型抗原(βGal)的MVA載體組合以抗-CTLA4或是抗PD-1抗體投藥，對於植入人類癌症動物模式之腫瘤的體積縮減及該等動物的存活率增加方面令人驚訝地有效。此等組合提供抗腫瘤效應的能力良好的指示，本發明能用於治療人類個體對抗各種疾病，以及尤其是感染性疾病及增生性疾病。
在本發明的第一個態樣中提供一種組合產物，其包含至少一治療疫苗及一或多種免疫查核點調節劑。較佳地，該治療疫苗包含一種病毒載體且更佳為一種重組病毒載體，其編碼一種抗原多肽。該免疫查核點調節劑較佳為一種單株抗體，其能夠至少部分地拮抗免疫查核點例如CTLA-4或PD-1之活性。
本發明亦提供一種組成物，其包含該治療疫苗及該一或多種免疫查核點調節劑，以及使用此一種組成物或組合之用途或治療方法，尤其是用於治療感染性及增生性疾病，例如癌症。
本發明其他與進一步之態樣、特徵與優點，將從下列本發明當即較佳具體例之說明而更臻清楚。這些具體例提出之目的為揭露內容。
如上所述，本發明人辨識出一種組合產物，其包含至少(i)一治療疫苗及(ii)一或多種免疫查核點調節劑。
如在整個申請案中所用之術語“一(a)”與“一(an)”，係在其等表示所指稱組分或步驟的“至少一者”、“至少第一者”、“一或多”或“多個”之涵義上使用，除非上下文中另有明確指出。舉例而言，術語"一治療疫苗"包括多個治療疫苗，含括其等之混合物。
術語“一或多”意指一或一以上的數字(諸如2、3、4、5等等)。
凡用於本文中之術語“及/或”包括“及”、“或”與“由該術語所連接的元素之全部或其他任何組合”。
如本文中所用之術語“大約”或“大概”係指位於一給定數值或範圍的10%之內，較佳為8%之內，及更佳為5%之內。
當用於界定產物、組成物與方法時，如本文中所用之術語“包含”(及包含(comprising)的任何形式，諸如“包含(comprise)”與“包含(comprises)”)、“具有”(及具有(having)的任何形式，諸如“具有(have)”及“具有(has)”)、“包括”(及包括(including)的任何形式，諸如“包括(includes)”及“包括(include)”)或“含有”(及含有(containing)的任何形式，諸如“含有(contains)”及“含有(contain)”)，係開放式及不排除額外、未列舉的元素或方法步驟。因此，一種多肽“包含”一胺基酸序列，當該胺基酸序列可能是多肽的最終胺基酸序列的一部分時。“實質上由...所組成”係指將具任何實質意義 的其他組分或步驟排除在外。因此，實質上由所列舉的組分所組成之一種組成物將不排除微量污染物與藥學上可接受的載劑。當此胺基酸序列只隨意地存在一些額外的胺基酸殘基時，則多肽係“實質上由該胺基酸序列所組成”。“由...所組成”係指所排除者不只是其他組分的微量元素或步驟。舉例而言，當多肽不含有所列舉之胺基酸序列以外的任何胺基酸時，則多肽係“由該胺基酸序列所組成”。
術語“多肽”、“胜肽”及“蛋白”係指胺基酸殘基的聚合物，其包括經由肽鍵鍵結的至少9個或更多個胺基酸。該聚合物可為直鏈型、分支型或環狀，及可包含天然存在的胺基酸及/或胺基酸類似物，及其間可中斷而存在非胺基酸。就通用的表示方式而言，設若該胺基酸聚合物所具有的胺基酸殘基超過50個，則較佳稱作多肽或蛋白；若其長度為50個胺基酸以下，則稱作“胜肽”。
在本發明的上下文中，術語“核酸”、“核酸分子”、“多核苷酸”及“核苷酸序列”係以可互換方式使用，及用於界定由聚去氧核糖核苷酸(DNA)(如cDNA、基因體DNA、質體、載體、病毒基因體、經單離的DNA、探針、引子及其任一混合物)或聚核糖核苷酸(RNA)(如mRNA、反義RNA、SiRNA)或混合的聚核糖-聚去氧核糖核苷酸所組成之任何長度的聚合物。其等涵蓋單股或雙股、直鏈或環狀、天然或合成的、經修飾或未經修飾的多核苷酸。此外，多核苷酸可包含非天然存在的核苷酸，及其間可中斷而存在非核苷酸組分。
如本文中所用之術語“類似物”、“突變體”、或“變異體”，係指展現相對於其之天然對應體的一或多種修飾作用之一種組分(多肽或核酸)。可設想任何修飾作用，包括一或多個核苷酸/胺基酸殘基的取代作用、插入作用及/或缺失作用。當預期數種突變作用時，其等可涉及連續殘基及/或非連續殘基。突變作用可藉由熟悉此技藝者所知的一些方式產生，諸如定點誘突變作用(如使用法國雷祖里(Les Ullis)之安瑪西亞(Amersham)公司的Sculptor(TM)活體外誘突變系統)、PCR誘突變作用、DNA重排技術及藉由化學合成技術(如產生一合成核酸分子)。類似物較佳與天然對應體的序列保有至少80%的序列同一性，較佳為至少85%，更佳為至少90%，以及還更佳為至少98%的序列同一性。
以一般的習慣，術語“同一性”係指在二種多肽或核酸序列之間的胺基酸相對於胺基酸或是核苷酸相對於核苷酸之對應。二種序列之間的同一性百分比係該等序列所共享的相同位置之數目，同時將為求最佳整體的排列比對所需納入的缺口數目及各缺口的長度納入考量。在本技藝中可取得各種電腦程式與數學演算法，來測定胺基酸序列之間的同一性百分比，諸如舉例來說，Needleman et Wunsch.J.Mol.Biol.48,443-453,1970之排列比對，可在NCBI取得之基本局部比對搜尋工具(Blast)程式或”蛋白序列與結構圖集(Atlas of Protein Sequence and Structure)”中之ALIGN(Dayhoffed於1981年附刊第3期第482-489頁)，或 是可在ebi.ac.uk world wide取得的名叫«Align»之探針(needle)軟體。亦可在專門資料庫中，取得用於測定核苷酸序列之間的同一性之程式(如基因資料庫(Genbank)、威斯康辛序列分析套組(Wisconsin Sequence Analysis Package)、BESTFIT、FASTA及GAP程式)。為說明之用，如本文中所用之”至少80%的同一性”係指80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或是100%。
如本文中所用之術語“經單離的”，係指將一組分(例如一多肽、胜肽、多核苷酸、載體等)從其天然環境移開(亦即與其天然相關聯或天然存在的至少一組分分離)。一種經單離的組分係指一組分，其維持於異源環境內或是經純化的(部分或大量)。舉例來說，當一種核酸分子與在天然中通常與其為伍的序列分離(如從一染色體或基因體中解離)時，該核酸分子即被單離，但其可與異源序列為伍(例如於一種重組載體之內)。
術語“得自”、“源自(originating)”或是“源自(originate)”係用於辨別一組分(例如一多肽、胜肽、多核苷酸、載體等)之原始來源，但不意謂著侷限該組分之製造方法，其可為，舉例而言，藉由化學合成或重組工具。
如本文中所用之術語“組合”，係指二種或多種實體(例如至少於此所描述之治療疫苗及一或多種免疫查核點調節劑)之任何可能的配置。
如本文中所用之術語“治療疫苗”係指任何物質(例如多肽、多醣、核酸等)之原始來源，包括複合物質(例如細胞、細胞混合物、活的或死的生物像是細菌、病毒及其他微生物等等)，其之一部分(例如免疫原性(immunogenic)片段、抗原決定位、細胞壁、鞭毛等等)，或是其類似物，其能夠成為一免疫反應的標靶。該術語包含“抗原”(亦即天然抗原，以及其之片段及類似物)。
術語“免疫查核點調節劑”係指一種分子，其能夠以正向或負向的方式調節一免疫查核點蛋白質的功能(尤其是在抗原呈現細胞(APC)和免疫T效應細胞之間)。
術語“個體”一般係指需要本發明的任何產物與方法或本發明的任何產物與方法可能對其有益之生物。典型地，該生物為一種哺乳動物，特別是選自於以下所構成的群組之哺乳動物：家畜、農場動物、競賽用動物及靈長類動物。較佳為，個體為人類，其業已診斷為患有一種病理病況或是具有一種病理病況的風險，諸如由該病原生物所造成或與該病原生物相關聯的一種感染性疾病或是一種增生性疾病，如癌症。於提到人類生物時，術語“個體”及“病人”可以以可互換方式使用且含括男性與女性。待治療的個體可以為新生兒、嬰兒、年輕人及成年人。
較佳實施例之詳細說明
在本發明的第一個態樣中提供一種組合產物，其包含至少(i)一種治療疫苗以及(ii)一或多種免疫查核點調節劑。
組合產物
於本發明的上下文內，此一排列包括個別實體之混合物(例如單一組成物)，意思是組成該組合的個別實體於投藥至該個體之前，係一起放置於共同的容器中。相比之下，不同的組合係指個別實體未混合的情況，意思是其等處於不同的容器中(例如不同的組成物)，相伴地、相繼地或是以穿插的方式彼此結合用於投藥。
例示性組合包括但不限於：多肽之組合(例如，以重組多肽的形式之胜肽或蛋白質為基的的治療疫苗及一或多種免疫查核點調節劑)或是核酸分子之組合(例如，一種載體化的治療疫苗及經遺傳工程處理用於編碼及表現免疫查核點調節劑之一或多種載體)，以及多肽與核酸分子二者之組合(例如，一種載體化的治療疫苗及一或多種重組免疫查核點調節劑多肽)。為說明之用，一種單一組成物可以為下列形式a)該治療疫苗及一或多種免疫查核點調節劑之混合物；b)該治療疫苗及編碼該一或多種免疫查核點調節劑之載體的混合物，或是c)一種特殊的設計(例如，該治療疫苗編碼治療感興趣的多肽及該一或多種免疫查核點調節劑二者)。本發明含括了包含等莫耳濃度之各實體之組合，以及具有不同濃度之不同實體之組合。應理解的是，該組合之各實體之最佳化濃度，可由本領域之技術人員來判定。較佳地，該組合係協同作用以提供比各實體單獨更高的效能(例如，存活增加)。
於本發明的上下文內，本發明之組合產物可用於 預防法(例如，降低患一種假定的疾病或病理病況的風險)及/或療法(例如，於業已診斷為患有一種假定的疾病或病理病況之個體內)。治療使用是較佳的。
治療疫苗
在一個具體例中，如本文中所用之“治療疫苗”為一種生物產品，其係設計成要經由存在或是表現一種感興趣的多肽而引出或增加對一特定標靶(例如，癌或感染細胞等等)之免疫性，該感興趣的多肽當適當地投藥至個體時，預期會對疾病或病理病況之病程或是症狀引致有利的功效。
數種類型的治療疫苗可使用於本發明的上下文內，包括但不限於：細胞為基的疫苗、胜肽或多肽為基的疫苗以及載體為基的疫苗。
細胞為基的疫苗之代表性實例可以得自於舉例而言：‧源自幹細胞(例如，由Stemline Therapeutics開發用於治療神經膠質母細胞瘤的SL-701)；‧源自特化的細胞，例如免疫細胞，於活體外重新計畫以攻擊癌細胞(諸如，由Immunocellular Therapeutics開發、靶定涉及神經膠質母細胞瘤之六種腫瘤關聯性抗原(TAA)的樹狀細胞疫苗，以及用於治療晚期前列腺癌之經認可的普羅文奇(Provenge)疫苗)；‧源自病人的癌細胞，於實驗室中改變使得其等更適合被病人的免疫系統攻擊；或是 ‧源自微生物，其等業已經藉由使其等有毒力的性質失能之遺傳工程處理成無毒力或減毒，並且選擇性地表現感興趣的多肽。眾所周知的此等微生物之實例包括但不限於：細菌(諸如，分枝桿菌；乳酸桿菌(諸如，乳酸乳酸桿菌(Lactococcus lactis))；李斯特菌屬(諸如，李斯特單胞菌(Listeria monocytogenes))沙門氏桿菌(salmonellae)與假單胞菌(Pseudomonas))，以及酵母菌(諸如，啤酒酵母菌、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、畢赤酵母菌(Pichia pastoris))。細菌與酵母菌治療疫苗之代表性實例包括牛分枝桿菌BCG以及由GlobeImmune開發的TarmogensR，其係從基因改造以表現一或多種疾病關聯性抗原的酵母菌所製造。
典型地，胜肽或多肽疫苗包括抗原胜肽/多肽，選擇性地混合以一種佐劑。為說明之用，可以列舉一者由Galena and Genentech為乳癌所開發的Newax E75。
於本發明的上下文內載體為基的疫苗為較佳的。如本文中所用之術語“載體”意指一種媒液，較佳為一種核酸分子或一種病毒顆粒，其含有容許生物分子在一宿主細胞或個體內遞送、繁殖及/或表現所需之元素。就本發明之目的而言，該等載體可來自天然存在的基因來源，可為合成或人工型，或為天然與人工基因元素之一些組合。此術語涵蓋染色體外載體(諸如，繼續存在於細胞胞質液或細胞核內)及整合性載體(如經設計整合至細胞的基因體內)，以及選殖與表現載體。
在一個具體例中，該治療疫苗包含一種重組質體或病毒載體。如本文中所用，“質體載體”意指一種可複製的DNA建構物。質體載體通常含有可選擇的標誌基因，此允許支持或對抗存在的相對應選擇性藥物之攜帶質體載體的宿主細胞能被挑選出。各種各樣的正向與負向可選擇的標誌基因在本技藝中為已知的。舉例而言，抗生素抗性基因可使用作為正向可選擇的標誌基因，其可使含質體的細胞於相對應之抗生素存在下進行挑選。合適的質體載體包括但不限於：pREP4、pCEP4(Invitrogene)、pCI(Promega)、pCDM8(Seed,1987,Nature 329：840)、pMT2PC(Kaufman等人，1987,EMBO J.6：187-95)、pVAX(Invitrogen)，以及pgWiz(Gene Therapy System Inc；Himoudi等人，2002,J.Virol.76：12735-46)。
如本文中所用之術語“病毒載體”或“病毒”或是“病毒粒子”意指一種核酸載體，其包括病毒基因體之至少一元件，且包裝至一種病毒顆粒之內。於本發明的上下文內，此等術語必須廣泛理解為包括核酸載體(例如載體DNA)，及其產生之病毒顆粒，以及尤其是感染性病毒顆粒。術語“感染性”意指病毒載體感染與進入宿主細胞或個體之能力。
病毒載體可為複製勝任型或選擇型(例如，經遺傳工程處理以較佳地或選擇性地於特定宿主細胞內複製)，或可為基因方面失能而成為複製缺陷型或複製受損型。在一個較佳具體例中，本發明之組合內所含之治療疫 苗為一種複製缺陷型或複製受損型病毒載體，此意指其無法於正常細胞或個體內複製出任何顯著量，尤其是正常人類細胞。複製功能之陷型或受損可藉由傳統工具評估，譬如經由測量DNA合成，及/或於不可容許的細胞內之病毒效價。可藉由部分或全部缺失或是不活化病毒複製關鍵的區域而使病毒載體成為複製缺陷型。此類複製缺陷型或受損型病毒載體典型上需要可容許的細胞株供繁殖，可容許的細胞株可培養或補充喪失/受損的功能。
病毒載體可由各種各樣的病毒經遺傳工程處理，且尤其是以下所構成的群組之病毒：腺病毒、腺病毒相關病毒(AAV)、痘病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、泡沫病毒(foamy virus)、α病毒、水泡性口炎病毒(vesicular stomatis virus)、新城雞瘟病毒(Newcastle disease virus)、小核糖核酸病毒、辛迪病毒(Sindi virus)，等等。可使用親株以及其之衍生物(亦即一種病毒，其相較於該病毒的親株係經修飾的，諸如透過截斷、缺失、取代及/或插入一或多個核苷酸鄰接病毒的基因體或是於病毒的基因體之外)。修飾可以位於內源性病毒基因內(諸如，編碼及/或調控序列)及/或於基因間的區域內。再者，修飾可以為靜默的或不是靜默的(諸如，引致一種經修飾的病毒基因產物)。可以以熟悉此藝者已知的許多方法、利用習用的分子生物學技術來執行修飾作用。
較佳地，本發明含括的修飾作用會影響，舉例而言與未經此修飾作用的病毒相比，病毒的毒力、毒性或致 病性，但是不會完全抑制新病毒至少於可容許的細胞內之感染與生產作用。該修飾作用較佳會導致合成缺陷型蛋白質(或無法合成)，以使得保證得到未經修飾的基因、於正常條件下生產的蛋白質之活性。文獻中描述例示性的修飾作用，以及特別首選為改變涉及DNA代謝、宿主的毒力及IFN途徑之病毒基因的該等(參見諸如，Guse等人，2011,Expert Opinion Biol.Ther.11(5)：595-608)。其他合適的修飾作用包括插入如於下文所描述之外源性基因(諸如感興趣的核酸分子)。
本文中所用之治療疫苗中所包含的一種特別合適的病毒載體係得自於痘病毒。如本文中所用之術語“痘病毒”意指一種屬於痘病毒(Poxviridae)科病毒，且首選為針對脊椎動物宿主之脊椎動物痘病毒(Chordopoxvirinae)亞科，其包括數種屬，譬如正痘病毒、羊痘病毒(Capripoxvirus)、禽痘病毒(Avipoxvirus)、副痘病毒、兔痘病毒(Leporipoxvirus)及豬痘病毒(Suipoxvirus)。於本發明的上下文內較佳者為正痘病毒，以及禽痘包括金絲雀痘病毒(Canarypoxvirus)(諸如ALVAC)與禽痘病毒(Fowlpoxvirus)(諸如FP9載體)。
在一個較佳具體例中，該治療疫苗包含一種屬於正痘病毒屬的痘病毒載體，以及還更佳為牛痘病毒(VV)種。牛痘病毒為大型、複雜，有套膜病毒，且具有長度大概200kb的直鏈雙股DNA基因體，其編碼許多的病毒酵素及因子而能不依賴宿主細胞機制而複製。存在二種不同的感 染性病毒顆粒，由單一脂質套膜所包圍的細胞內IMV(細胞內成熟的病毒粒子)、其繼續存在於感染細胞胞質液內直到溶解，以及雙重套膜的EEV(細胞外套膜的病毒粒子)、其從感染細胞芽出(buds out)。本發明的上下文內可以使用任何牛痘病毒株，其包括但不限於：西方保留株(Western Reserve)(WR)、哥本哈根(Copenhagen)(Cop)、Lister、LIVP、惠氏(Wyeth)、塔什干(Tashkent)、天壇(Tian Tan)、布來頓(Brighton)、安卡拉(Ankara)、MVA(經修飾安卡拉牛痘病毒)、LC16M8、LC16M0株等等，以及其等之衍生物。
可以使用修飾目標在改良產生的病毒之安全性(諸如，增高減毒作用)及/或效能(諸如，改良對癌細胞的選擇性及/或減少健康的細胞之毒性)之經遺傳工程處理的痘病毒。可以更具體地列舉缺陷型修飾：胸苷激酶(J2R；參見Weir and Moss,1983，Genbank寄存編號AAA48082)、去氧尿苷三磷酸酶(F2L)、病毒血球凝集素(A56R)；核糖核苷酸還原酶之小(F4L)及/或大(I4L)次單元、絲胺酸蛋白酶抑制劑(B13R/B14R)，以及補體4b結合蛋白(C3L)。供此發明使用之合適的VV之代表性實例包括NYVAC(US 5,494,807)，以及TK-缺陷型、TK-及F2L-缺陷型(WO2009/065547)以及TK-及I4L-缺陷型VV(WO2009/065546)。本文中所用之基因命名法為哥本哈根(Copenhagen)牛痘病毒株之基因命名法。除非另有指出，否則本文中亦使用其他痘病毒之同源的基因。然而，基因命名法可根據痘病毒株(pox strain)而不同，但是哥本哈根 (Copenhagen)和其他牛痘病毒株(vaccinia strain)之間的對應一般可得於文獻中。
在本技藝專門資料庫，如Genebank中可得到各種痘病毒(Poxviridae)之基因體序列。舉例而言，牛痘病毒株西方保留株(Western Reserve)、哥本哈根(Copenhagen)、牛痘病毒(Cowpoxvirus)及金絲雀痘病毒(Canarypoxvirus)基因體分別可自Genbank之寄存編號NC_006998、M35027、NC_003663、NC_005309中得到。一種特別適合於本發明的上下文內之病毒載體為MVA，因為其之高度減毒表現型(Mayr等人，1975,Infection 3：6-14；Sutter and Moss,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10847-51)，感染時產生比非減毒載體更明顯的IFN-第1型反應，且於文獻(Antoine等人，1998,Virol.244：365-96)及Genbank(寄存編號U94848)中可得到其之基因體序列。
適合於本發明的上下文內之其他病毒載體可得自於副黏液病毒科的麻疹病毒屬(morbillivirus)，且特別首選為麻疹病毒。在本技藝中可取得各種減毒株(Brandler等人，2008,CIMID,31：271；Singh等人，1999,J.Virol.73(6)：4823)，例如且不限於埃德蒙斯頓(Edmonston)A與B株(Griffin等人，2001,Field’s in Virology,1401-1441)、施瓦茨(Schwartz)株(Schwarz A,1962,Am J Dis Child,103：216)、S-191或C-47株(Zhang等人，2009,J Med Virol.81(8)：1477)。亦可以使用重組新城雞瘟病毒(Newcastle disease virus)(NDV)(Bukreyev and Collins,2008,Curr Opin Mol Ther 10：46-55)，且特別首選為其之減毒株，例如MTH-68，其業已使用於癌症病人中(Csatary等人，1999,Anti Cancer Res 19：635-8)，以及NDV-HUJ，其於神經膠質母細胞瘤病人中顯示出大有可為的結果(isracast.com，2006年三月一日)。
供本發明使用之再另一種合適的病毒載體為腺病毒載體。其可衍生自多種人類或動物腺病毒(例如，犬、綿羊、猴等等)，並且可使用任何血清型。亦可以為一種嵌合腺病毒(WO2005/001103)。熟悉此技藝者會辨識出可以組合於單一腺病毒內之自多種血清型衍生的元素。
合意地，腺病毒載體係源自於人類Ad，包括具罕見血清型之該等，或是源自靈長類(諸如，黑猩猩、大猩猩)。人類腺病毒之代表性實例包括亞屬C(諸如，Ad2 Ad5及Ad6)、亞屬B(諸如Ad3、Ad7、Ad11、Ad14、Ad34、Ad35及Ad50)、亞屬D(諸如，Ad19、Ad24、Ad26、Ad48及Ad49)，以及亞屬E(Ad4)。黑猩猩Ad之代表性實例包括但不限於：AdCh3(Peruzzi等人，2009,Vaccine 27：1293-300)及AdCh63(Dudareva等人，2009,Vaccine 27：3501-4)以及本技藝中所述該等之任一者(參閱舉例而言，WO2010/086189；WO2009/105084；WO2009/073104；WO2009/073103；WO2005/071093；以及WO03/046124)。現在一些腺病毒為基因與生物學上特徵界定良好的(Hoffmann等人，2007,Human Gene Ther.18：51-62)。一種人類腺病毒第5型(Ad5)之例示性基因體序列可於GenBank寄存號M73260及 Chroboczek等人(1992,Virol.186：280-5)中找到。
較佳地，此發明中使用之腺病毒為複製缺陷型，例如藉由完全或部分缺失E1區域。適合的E1缺失係自大約位置459延伸至3510，參考GeneBank中寄存編號M 73260所揭示的Ad5序列。較佳地，該病毒保留功能性病毒pIX基因。腺病毒基因體可包含額外的修飾(譬如，全部或部分缺失其他必須的E2及/或E4區域，如W094/28152；Lusky等人，1998,J.Virol 72：2022中所述)。此外，亦可以使非必須的E3區域突變或缺失。
更佳地，本發明的治療疫苗內所含的腺病毒為一種人類血清型5腺病毒(Ad5)，E1及/或E3功能缺陷，以及包含一種感興趣的核酸分子插入E1區域內。
本發明亦含括複合至脂質或聚合物(諸如聚乙二醇)以形成諸如脂質體、脂複合體或奈米粒子之顆粒結構的載體或病毒顆粒，並且含括經修飾以能優先靶定一種特定的宿主細胞之載體或病毒顆粒。靶定的載體之特徵為其等之表面其表面存在一配體，其能夠辨識且結合至一種細胞及表面暴露的組分。合適的配體之實例包括針對細胞特異性、組織特異性以及病原相關標記物之抗體或其片段。靶定作用之進行，可以藉由基因方式將配體插入病毒表面存在之多肽內(例如，腺病毒之纖維或痘病毒p14 IMV暴露的多肽等等)，或是藉由化學修飾病毒表面的套膜。再者，當使用病毒為基的治療疫苗時，該病毒可為活的、減毒、不活化或死的。
感興趣的多肽
本發明之組合產物內含有的治療疫苗較佳包含或編碼一或多種治療感興趣的多肽，其能透過經由毒性效應來限制有害的細胞或從身體移除有害的細胞，透過改善免疫性或是反轉免疫衰竭機轉，而補償病理症狀。可由天然的基因或是得自於後面以下合適的序列修飾之基因編碼此等多肽。於本發明的上下文內，該感興趣的多肽可能源自哺乳動物(諸如人類)或者不是源自哺乳動物(諸如，源自細菌或病毒)。
有利地，本發明中使用的治療疫苗包含或編碼選自於以下所組成的群組之一或多種多肽：自殺基因產物、免疫刺激性多肽及抗原多肽。供本文使用之較佳的抗原多肽為腫瘤關聯性抗原及病原生物的抗原。較佳地，該感興趣的多肽不是致癌性轉錄因子，例如p53。
自殺基因
術語“自殺基因”意指一種核酸分子，其編碼一種蛋白質(諸如酵素)，其能夠使一種藥物的前驅體轉變成細胞毒性化合物。下列表中揭露供此發明使用之合適的自殺基因，以及對應的前驅藥(prodrug)(或藥物前驅體)及活性的(細胞毒性)藥物。
合意地，該治療疫苗包含或編碼一種多肽，其具有至少胞嘧啶去胺酶(CDase)之活性。CDase編碼的核酸分子之可以得自於任何的原核生物與低等真核生物，譬如，啤酒酵母菌(FCY1基因)、白色念珠菌(FCA1基因)以及大腸桿菌(codA基因)。
任擇地或以組合方式，該治療疫苗包含或編碼一種多肽，其具有尿嘧啶磷酸核糖轉移酶(UPRTase)之活性。編碼UPRTase的核酸分子可以得自於大腸桿菌(Andersen等人，1992,European J.Biochem.204：51-56)、乳酸乳酸桿菌(Lactococcus lactis)(Martinussen等人，1994,J.Bacteriol.176：6457-63)、牛分枝桿菌(Kim等人，1997,Biochem.Mol.Biol.Internat.41：1117-24)、枯草桿菌(Martinussen等人，1995,J.Bacteriol.177：271-4)，以及酵母菌(諸如Kern等人，1990,Gene 88：149-57內揭示的啤酒酵母菌FUR1)。
在專門資料庫(SWISSPROT EMBL、Genbank、Medline等等)中可得到此CDase之核苷酸序列以及編碼UPRTase的核酸分子以及編碼酵素的胺基酸。亦可以使用功能性類似物。此等類似物較佳具有之胺基酸序列，與天然的多肽有至少70%，有利地為至少80%，較佳為至少90%，以及最佳為至少95%的之同一性程度。以遺傳工程處理源自公開資料的類似物，並且依據習用技術(參見諸如EP998568)以無細胞或細胞系統來測試酵素之活性，為熟悉此技藝者能力可及的。為說明之用，合適的功能性類似物 包含EP998568中所述之N-端截斷的FUR1突變體(具有35個最前面的殘基到天然的蛋白質之位置36處之第二個Met殘基的缺失)，其展現出比天然的酵素更高的UPRTase活性，以及WO96/16183、EP998568與WO2005/07857中所述的FCY1：：FUR1融合稱為FCU1(以WO2009/065546之序列識別器序列辨識編號：1表示的胺基酸序列)及FCU1-8。
免疫刺激性多肽
如本文中所用之術語“免疫刺激性多肽”，係指具有以專一性或非專一性的方式、刺激免疫系統能力的一種多肽。本技藝中有非常大量的蛋白質因其等行使免疫刺激作用的能力而著名。本發明的上下文內合適的免疫刺激性蛋白之實例包括但不限於：細胞介素(cytokines)，且特別首選為介白素(諸如，IL-2、IL-6、IL-12、IL-15、IL-24)、化學激活素(諸如，CXCL10、CXCL9、CXCL11)、干擾素(諸如，IFNα、IFNβ、IFNγ)、腫瘤壞死因子(TNF)、群落刺激因子(諸如，GM-CSF、C-CSF、M-CSF...)、APC(用於抗原呈現細胞)-暴露的蛋白質(諸如B7.1、B7.2等等)、生長因子(轉形生長因子TGF、纖維母細胞生長因子FGF、血管內皮生長因子VEGF，等等)、第一型或第二型主要組織相容性複合體(MHC)抗原、細胞凋亡誘導劑或抑制劑(諸如，Bax、Bcl2、BcIX...)，以及免疫毒素。較佳地，免疫刺激性蛋白為一種介白素或群落刺激因子(諸如GM-CSF)。
抗原的多肽
於一個具體例中，治療疫苗含有或編碼與待治療 疾病相關的一抗原。術語「抗原的(antigenic)」係指引出或刺激免疫反應(例如細胞媒介式及/或體液性免疫)的能力。抗原刺激身體的免疫系統以辨識如外來物的標靶，以使免疫系統於以後碰到該抗原時，能更容易辨識且毀壞該抗原。本發明含括天然抗原的多肽(活的或死的生物或是細胞之內/上存在者)，以及其之修飾變體(類似物、片段)及如於此所述之其等的組合。
於本發明的上下文內，治療疫苗內含的或編碼的較佳抗原為腫瘤特異或腫瘤相關抗原(亦即腫瘤關聯性抗原)，以及來自病原生物的抗原，例如病毒、細菌、寄生蟲等等及過敏原。
病毒抗原的多肽包括舉例而言，來自以下之抗原：A、B、C、D及E型肝炎病毒、免疫不全病毒(例如HIV)、疱疹病毒、細胞巨大病毒、水痘帶狀疱疹、乳頭狀瘤病毒、艾斯坦-巴爾病毒(Epstein Barr virus)、流行性感冒病毒、副流行性感冒病毒、腺病毒、柯沙奇病毒(coxsakie virus)、小核糖核酸病毒、輪狀病毒、呼吸道融合性病毒、痘病毒、鼻病毒、德國麻疹病毒、乳多空(papovirus)病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒。HIV抗原之一些非限制性實例包括gp120 gp40、gp160、p24、gag、pol、env、vif、vpr、vpu、tat、rev、nef tat、nef。人類疱疹病毒抗原之一些非限制性實例包括gH、gL gM gB gC gK gE或gD，或是立即早期蛋白(Immediate Early protein)，諸如來自HSV1或HSV2之ICP27、ICP47、ICP4、ICP36。細胞巨大病毒抗原之一些非 限制性實例包括gB。衍生自艾斯坦-巴爾病毒(EBV)之一些非限制性實例包括gp350。水痘帶狀疱疹病毒抗原之一些非限制性實例包括gp1、11、111及IE63。C型肝炎病毒抗原之一些非限制性實例包括env E1或E2蛋白、核心蛋白、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a、NS5b、p7。人類乳頭狀瘤病毒(HPV)抗原之一些非限制性實例包括L1、L2、E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7。其他病毒病原體衍生的抗原，諸如呼吸道融合性病毒(例如F及G蛋白)、副流行性感冒病毒、麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、黃病毒(例如黃熱病病毒、登革熱病毒、壁蝨媒腦炎病毒、日本腦炎病毒)，以及流行性感冒病毒細胞(例如HA、NP、NA或M蛋白)亦可以依照本發明來使用。
細菌抗原的多肽包括舉例而言，來自以下之抗原：導致TB及麻風之分枝桿菌、肺炎雙球菌(pneumocci)、好氧性革蘭氏陰性桿菌、黴漿菌、葡萄球菌(staphyloccocus)、鏈球菌、沙門氏桿菌(salmonellae)、披衣菌(chlamydiae)、奈瑟菌(neisseriae)等等。
寄生蟲抗原的多肽包括舉例而言，來自以下之抗原：瘧疾、利什曼病(leishmaniasis)、錐蟲病(trypanosomiasis)、弓蟲病(toxoplasmosis)、血吸蟲病(schistosomiasis)以及絲蟲病(filariasis)。
過敏原多肽係指可誘發易感個體之過敏性反應或哮喘反應之任何物質。過敏原包括花粉、昆蟲毒液、動物皮屑(dander dust)、真菌孢子及藥物(例如青黴素)。
腫瘤關聯性抗原多肽(TAA)包括各種種類的抗原，例如正常細胞內通常靜默(即，不表現)的該等，僅表現低位準或僅於某些分化階段表現的該等及暫時表現的該等，諸如胚胎與胎兒抗原，以及起源於細胞基因突變的該等，例如致癌基因(例如活化的ras致癌基因)、原致癌基因(例如ErbB家族)，或是由染色體移位產生之蛋白質。此等腫瘤關聯性抗原亦包含病原生物編碼的抗原，其等能於一個體體內誘發惡性的病況(尤其是慢性感染的個體)，諸如RNA及DNA腫瘤病毒(例如HPV、HCV、EBV等等)以及細菌(例如幽門螺旋桿菌(Helicobacter pilori))。腫瘤關聯性抗原之一些非限制性實例包括但不限於：MART-1/Melan-A；gp100；二肽基肽酶IV(DPPIV)；腺苷去胺酶結合蛋白(ADAbp)；親環蛋白b(cyclophilin b)；結腸直腸關聯性抗原(CRC)-C017-1A/GA733；癌胚抗原(CEA)及其免疫原性抗原決定位CAP-1及CAP-2；etv6；aml1；前列腺特異性抗原(PSA)及其免疫原性抗原決定位PSA-1、PSA-2及PSA-3；前列腺特異性膜抗原(PSMA)；T細胞受體/CD3-ζ鏈；MAGE家族腫瘤抗原(例如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)；GAGE家族腫瘤抗原(舉例而言GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、 GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)；BAGE；RAGE；LAGE-1；NAG；GnT-V；MUM-1；CDK4；酪胺酸酶；p53；MUC家族(例如MUC-1、MUC16等等；參見舉例而言US6,054,438；WO98/04727；或WO98/37095)；HER2/neu；p21ras；RCAS1；α-胎蛋白；E-鈣黏蛋白；α-鏈蛋白、β-鏈蛋白及γ-鏈蛋白；p120ctn；gp100.sup.Pmel117；PRAME；NY-ESO-1；cdc27；腺瘤性結腸息肉病(adenomatous polyposis coli，APC)蛋白；胞襯蛋白(fodrin)；連接蛋白37；Ig個體基因型；p15；gp75；GM2及GD2神經節苷脂；Smad家族之腫瘤抗原腦肝糖磷酸化酶；SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1及CT-7；及c-erbB-2；以及病毒抗原，諸如HPV-16及HPV-18 E6和E7抗原及EBV編碼的核抗原(EBNA)-1以及標記(β-半乳糖苷酶、螢光素酶....)。
本發明亦包含如上所述之治療疫苗，其含有/表現二種或多種感興趣的多肽，諸如至少兩種抗原，至少一種抗原及一種免疫刺激性多肽，至少兩種抗原及一種免疫刺激性多肽等等。
本發明之組合產物所含之較佳的治療疫苗包含或編碼一種或更多種感興趣的多肽，該感興趣的多肽係選自於以下所構成的群組：‧MUC-1抗原‧HPV E6及E7抗原，特別為其之非致癌性變異體；‧人類IL-2 ‧人類GM-CSF；‧FCU-1自殺基因；‧HBV抗原，特別為HBV pol、HBsAg及/或核心；‧分枝桿菌(諸如MtB或牛分枝桿菌(M bovis))抗原，特別為選自於以下所構成的群組之一者或更多者：RpfB、RpfD、Ag85A、Ag85B、ESAT6、CFP10、TB10.4、Rv0111、Rv0287、Rv0569、Rv1733、Rv1813、Rv2029、Rv2626、Rv3407、Rv3477、RV3478，以及‧HCV NS抗原(諸如NS3、NS4a、NS4b、NS5a、NS5b)。
本發明包含感興趣的天然多肽之使用/表現以及其之類似物(例如其之片段，如胜肽；及經修飾者)，尤其是在天然多肽行使非所欲的性質時(例如，致癌性或轉形的性質、細胞毒性等等)。舉例而言，為了防止HPV E6及E7多肽發生致癌性，可以使用或表現非致癌性類似物，其等分別展現結合p53及Rb能力的降低。此等非致癌性類似物係描述於以下：Munger等人(1989,EMBO J.8：4099-105)；Crook等人(1991,Cell 67：547-56)；Heck等人(1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4442-6)；Munger等人(1991,J.Virol.65：3943-8)；Phelps等人(1992,J.Virol.66,2418-27)，以及WO99/03885。一種適用於本發明目的之非致癌性HPV-16 E6變異體是一或多個胺基酸殘基缺失位於大約位置118至大約位置122(+1表示天然HPV-16 E6多肽之第一個甲硫胺酸殘基)，且特別首選為殘基118至122(CPEEK)之完全缺失。一種適用於本發明目的之非致癌性HPV-16 E7變異體是 一或多個胺基酸殘基缺失位於大約位置21至大約位置26(+1表示天然HPV-16 E7多肽之第一個胺基酸，且特別首選為殘基21至26(DLYCYE)的完全缺失。在一個具體例中，修飾感興趣的多肽或使感興趣的多肽含括額外的特徵，以便改良其之免疫原性活性及/或治療活性會是有利的。舉例而言，使下列結合(例如，透過混合、融合或獨立表現)在同一種治療疫苗(尤其是載體為基的治療性疫苗)內可能是有益的：‧一種編碼一抗原(例如TAA或來自如前所述之病原生物的抗原)的核苷酸序列，以及‧一種核苷酸序列，其編碼一免疫刺激性多肽，例如細胞介素或介白素(舉例而言IL-2；腫瘤壞死因子(TNF)；干擾素(IFN)；群落刺激因子(CSF)，或顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(GMCSF)。
一或多種能夠增強免疫原性的胜肽或多肽，亦可以與感興趣的多肽一起使用或表現。此等胜肽或多肽業已描述於文獻中並且包括但不限於：鈣網伴護蛋白(Cheng等人，2001,J.Clin.Invest.108：669-78)、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)熱休克蛋白70(HSP70)(Chen等人，2000,Cancer Res.60：1035-42)、泛素(Rodriguez等人，1997,J.Virol.71：8497-503)、細菌毒素諸如銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A(ETA(dIII)))之移位領域(Hung等人，2001 Cancer Res.61：3698-703)以及TH Pan-Dr抗原決定位(Sidney等人，1994,Immunity 1：751)、 pstS1 GCG抗原決定位(Vordermeier等人，1992,Eur.J.Immunol.22：2631)、破傷風類毒素P2TT(Panina-Bordignon等人，1989,Eur.J.Immunol.19：2237)及P30TT(Demotz等人，1993,Eur.J.Immunol.23：425)胜肽，以及流行性感冒抗原決定位(Lamb等人，1982,Nature 300：66；Rothbard等人，1989,Int.Immunol.1：479)。
其他合適的結構特徵為對於本發明之治療疫苗使用或是本發明之治療疫苗表現的感興趣的多肽之合成、加工、穩定性及溶解度有益的該等；譬如致力於修飾可能的切割位置、可能的醣化位置及/或膜固著之該等，以便改良第一型MHC及/或第二型MHC之呈現作用。可藉由將膜固著序列併入感興趣的多肽之內，且設若天然多肽缺乏分泌序列(亦即訊息胜肽)則併入分泌序列，而達成膜呈現作用。簡言之，訊息胜肽通常包含15至35個實質疏水性胺基酸，隨後藉由特異性ER(內質網)定位之肽鏈內切酶移除得到成熟多肽。跨膜胜肽在本質上亦為高度疏水的且用來將多肽固著於細胞膜內。本發明上下文中可用的跨膜胜肽及/或訊息胜肽之選擇非常多。其等可得自於細胞或病毒多肽，諸如免疫球蛋白、組織性血漿蛋白原活化劑、胰島素、狂犬病醣蛋白、HIV病毒包膜醣蛋白或是麻疹病毒F蛋白之該等，或者可為合成的。較佳地，分泌序列之插入位點為多肽之起始轉譯之密碼子下游之N端，且膜固著序列之較佳插入位點為C端，較佳為緊接著終止密碼子之上游。
重組載體
在一個較佳具體例中，該治療疫苗包含一種重組載體經遺傳工程以表現至少一種核酸分子，其編碼如於此所述之感興趣的多肽。其可以容易地藉由熟悉此藝者已知的一些方式來產生(例如選殖、PCR擴增、DNA重排)。舉例而言，此一種核酸分子可以使用熟悉此藝者可得的序列資料及於此提供的序列資訊，從任何可得的來源(例如，本技藝所述之生物材料、cDNA及基因體庫、病毒基因體或已知含括其之任何先前技藝載體)獨立地單離出，然後透過傳統的分子生物技術予以適當地選殖。任擇地，其等亦可以藉由自動方法之化學合成來產生(例如，從重疊合成寡核苷酸或合成性基因來組裝)。較佳地，此一種感興趣的核酸分子係得自於cDNA且不包含內含序列(intronic sequences)。可以藉由熟悉此藝者已知的一些方式來產生修飾，例如化學合成、定點誘突變作用、PCR誘突變作用等等。
此外，供此發明使用的核酸分子可經最佳化以在特定的宿主細胞或個體中提供高位準的表現。確實已觀察到生物之密碼子使用模式係高度非隨機的，且不同宿主之間之密碼子使用係明顯不同。由於治療基因可能來自於原核生物(譬如，細菌或病毒抗原)或低等真核生物(譬如自殺基因)來源，其之密碼子使用模式可能不適合在高等真核生物細胞(譬如人類)中有效表現。一般而言，密碼子最佳化之進行係藉由將一或多個對應到要治療的個體中不常使用之密碼子的「天然」密碼子以一或多個於要治療的個體中編碼相同胺基酸之較常使用的密碼子取代。由於即使是部 分的取代亦能達到表現增加，並不需要取代所有對應到不常使用之密碼子的天然密碼子。
繼密碼子使用之最佳化之後，經由核苷酸序列的額外修飾作用亦可增進表現作用。舉例而言，核酸序列可以予以修飾以阻止集中區內出現罕見、非最佳的密碼子之群聚，及/或對於預期會負向影響表現位準的"負向"序列元素進行抑制或修飾。此等負向序列元素包括但不限於：具有非常高(>80%)或非常低(<30%)GC含量的區域；富含AT或富含GC的序列延伸；不穩定的正向或反向重複序列；R A二級結構；及/或內部隱藏式調控元素，諸如內部TATA盒、chi位址、核糖體進入位址及/或剪接供體/受體位址。
再者，當要表現同源的核酸分子時，此等同源序列全長核酸分子或是其部分可經簡併，以便降低序列同源性。將展現高度序列同一性之核酸序列部位予以簡併確實是可取的(例如，得自於一種假設的病毒之各種血清型的相同抗原，譬如HPV-16及HPV-18 E6及/或E7抗原；重疊的抗原，譬如HBV抗原)，以便避免生產過程中之同源重組的問題，且嫻熟技藝者能夠藉由序列排列比對而辨識出此等部分。
編碼該感興趣的多肽之核酸分子可以插入載體內，例如於病毒基因內、基因間的區域、非必需基因或區域內，或是代替病毒序列。構建及生產重組痘病毒的一般條件為本技藝中所眾所周知的(參閱舉例而言，WO2010/130753；WO03/008533；US 6,998,252；US 5,972,597以及US 6,440,422)。感興趣的核酸分子較佳為插入痘病毒基因組之非必需位置。於哥本哈根(Copenhagen)牛痘載體中，特別適合插入胸腺嘧啶激酶基因；以及在MVA載體中，特別適合插入缺失II或III(WO97/02355；Meyer等人，1991,J.Gen.Virol.72：1031-8)。構建及生產重組麻疹病毒的一般條件係本技藝中所眾所周知的。感興趣的核酸分子特別適合插入P與M基因之間或是H與L基因之間。構建及生產重組腺病毒的一般條件為本技藝中所眾所周知的(參閱例如，Chartier等人，1996,J.Virol.70：4805-10以及WO96/17070)。待表現的核酸分子較佳的插入位置為E1或E3區域，待表現的核酸分子相對於討論中的區域之天然轉錄方向可以以意義或反義定向來放置。
在一個特別佳的具體例中，該治療疫苗係選自於以下所組成的群組：‧一種編碼MUC-1 TAA及人類IL-2之MVA病毒，如同於WO92/07000、US 5,861,381及Limacher and Quoix(2012,OncoImmunology 1(5)：791-2)中所述以TG4010為代表；‧一種編碼融合的NS3及NS4 HCV抗原以及NS5b抗原之MVA病毒(如同於WO2004/111082中所述以TG4040為代表)；‧一種編碼膜固著的HPV-16非致癌性E6及E7抗原以及人類IL-2之MVA病毒，如同於WO99/03885中所述以TG4001為代表；‧一種編碼FCU1基因之MVA病毒，如同以TG4023 (WO99/54481)為代表；以及‧一種編碼組合的TB抗原之MVA病毒(如同於WO2014/009438中所述者)。
編碼該感興趣的多肽之核酸分子之表現
依據本發明，供本發明使用的治療疫苗所表現的核酸分子係可操縱地鏈接到合適的調控元素供表現於一種所欲的宿主細胞或個體內。
如本文中所用之術語"調控元素"或"調控序列"，係指允許、有助於或調節核酸分子在指定的宿主細胞或個體內之表現的任何元素，該表現包括核酸或其衍生物(亦即mRNA)之複製、重複、轉錄、剪接、轉譯、穩定性及/或轉運。如本文中所用之術語"可操縱地鏈接"係指被鏈接的元素被配置成使得其等與其等預期目的一致。舉例而言，設若一種啟動子於可容許的宿主細胞內達成一種核酸分子之轉錄起始至終止之轉錄作用，則該啟動子係可操縱地鏈接至該核酸分子。
熟習此項技術者將瞭解調控序列之選擇可視諸如核酸分子本身、要表現核酸分子之載體、所欲的表現位準等因子而定。啟動子尤其重要。於本發明的上下文內，其可在許多類型的宿主細胞持續引導核酸分子的表現，或特異地於某些類型的細胞或組織中持續引導核酸分子的表現作用，或是回應特定事件或外源性因子(如溫度、營養素添加劑、荷爾蒙等)或依據病毒週期的階段(如晚期或早期)而進行調節。亦可使用在生產步驟期間回應特定事件或外 源性因子而受到抑制之啟動子，以將治療疫苗生產作用最佳化及避開所表現的多肽之潛在毒性。
適合供用於重組腺病毒及質體載體表現的持續型啟動子包括但不限於：細胞巨大病毒(CMV)立即早期啟動子(US 5,168,062)、RSV啟動子、腺病毒主要晚期啟動子、磷甘油激酶(PGK)啟動子(Adra等人，1987,Gene 60：65-74)、單純疱疹病毒(HSV)-1的胸苷激酶(TK)啟動子及T7聚合酶啟動子(WO98/10088)。牛痘病毒啟動子係特別適用於重組痘病毒中的表現作用。代表性實例包括但不限於：牛痘7.5K、H5R、11K7.5(Erbs等人，2008,Cancer Gene Ther.15(1)：18-28)、TK、pB2R、p28、p11及K1L啟動子，以及合成啟動子諸如Chakrabarti等人(1997,Biotechniques 23：1094-7；Hammond等人，1997,J.Virol Methods 66：135-8；及Kumar and Boyle,1990,Virology 179：151-8)中所述之該等，以及早期/晚期嵌合啟動子。適用於麻疹病毒的啟動子包括但不限於引導麻疹轉錄單元的表現作用之任何啟動子(Brandler and Tangy,2008,CIMID 31：271)。
熟悉此藝者會明瞭控制該感興趣的核酸分子表現之調控元素可進一步包含額外元素，供用於轉錄作用的適當起始、調節及/或終止作用(如多腺嘌呤轉錄終止序列)、mRNA運輸作用(如核定位訊息序列)、加工(如剪接訊息)與穩定性(如內含子與非編碼的5'與3'序列)、轉譯作用(如起始子Met、三連體引導序列、IRES核糖體結合位址、訊息胜肽等等)以及純化步驟(如一標籤)。在一個較佳具體 例中，供本發明使用的治療疫苗包含一種MVA載體，其含有下列插入至其基因體內(較佳於缺失II中)：一種編碼如MUC-1(較佳於早期/晚期牛痘病毒pH5R啟動子之轉錄控制下)之腫瘤關聯性抗原之核酸分子，以及一種編碼如人類IL-2(較佳於早期/晚期牛痘病毒p7.5啟動子之轉錄控制下)之免疫刺激性多肽的核酸分子。更佳地，編碼的MUC1抗原包含一胺基酸序列，其與序列辨識編號：1有至少90%的同一性。甚至更佳地，編碼MUC1抗原之核苷酸序列與序列辨識編號：2有至少80%的同一性。
病毒為基的治療疫苗之生產
在一個較佳具體例中，本發明之組合產物內存在的治療疫苗為一種病毒載體。典型地，病毒載體係使用慣用的技術而於合適的宿主細胞株內生產，其包括a)製備一種生產者(譬如，可容許的)宿主細胞，b)轉染或感染該製備的生產者宿主細胞，c)在適宜條件下培養該轉染或感染的宿主細胞，從而容許生產該載體(譬如，感染性病毒顆粒)，d)從該細胞的培養物回收所生產的載體，以及選擇性地e)純化該回收的載體。
如本文中所用之術語"宿主細胞"應從廣義上理解，其在有關組織、器官或所單離的細胞之特定組成方面並無任何限制。此等細胞可為一獨特類型的細胞或為不同類型細胞之群組，諸如培養的細胞株、初代細胞及分裂的細胞。於本發明的上下文內，術語"宿主細胞"包括原核生物細胞；低等真核生物細胞諸如酵母菌；及其他真核生物 細胞諸如昆蟲細胞、植物及哺乳動物(如人類或非人類)細胞；以及可生產質體或病毒為基的治療疫苗及/或免疫查核點調節劑供本發明使用之生產者細胞。此術語亦包括可成為或業已成為於此所述之組合產物的接受體之細胞以及此等細胞的子代。
於步驟a)中，合適的生產者細胞取決於要擴增的病毒載體類型而定。複製缺陷型重組腺病毒典型地在提供反式腺病毒蛋白的細胞中繁殖及生產，該反式腺病毒蛋白係由複製缺陷型腺病毒內業已缺失的該等基因或被不活化的該等基因所編碼，從而允許病毒於細胞中複製。用於互補E1缺失型腺病毒之適宜細胞株包括HEK-293細胞(Graham等人，1997,J.Gen.Virol.36：59-72)以及HER-96與PER-C6細胞(如Fallaux等人，1998,Human Gene Ther.9：1909-1917；WO97/00326)及E1 A549(Imler等人，1996,Gene Ther.3：75-84)或是此等細胞株的任何衍生物。但是本發明的上下文內亦可以使用本技藝中所述之任何其他的細胞株，尤其是經認可用於生產供人類使用產物之細胞株。感染性腺病毒顆粒可自培養物上清液回收及/或自溶解後之細胞回收。其等可進一步根據標準技術來純化(氯化銫之超速離心法、層析法等等，如同舉例而言WO96/27677、WO98/00524、WO98/22588、WO98/26048、WO00/40702、EP1016711以及WO00/50573中所述者)。
MVA為限定宿主嚴格的且典型地於禽類細胞上擴增，不論是初代禽類細胞(譬如，得自於受精雞蛋的雞胚 胎所製備之雞胚胎纖維母細胞(CEF))或是永生的禽類細胞株，且尤其是以鴨TERT基因予以永生化的番鴨細胞株(參閱例如WO2010/130756及WO2012/001075)；按照WO2007/077256或WO2009/004016中所述之方法生產的禽類細胞株；以病毒及/或細胞基因之組合予以永生化的禽類細胞株(參閱例如，WO2005/042728)；一種自發永生的細胞(諸如，US5,879,924中所揭示的雞DF1細胞株)；或是藉由漸進地使胚胎細胞與生長因子及飼養層分離而衍生的永生細胞(諸如，WO2005/007840及WO2008/129058中所揭示的Ebx雞細胞株)。
關於其他的牛痘病毒或是其他的痘病毒株的之，除了禽類初代細胞(例如CEF)與禽類細胞株之外，還有許多其他的非禽類細胞株可用於生產，包括人類細胞株，例如HeLa(ATCC-CRM-CCL-2TM或是ATCC-CCL-2.2TM)、MRC-5、HEK-293；倉鼠細胞株，例如BHK-21(ATCC CCL-10)，以及維洛(Vero)細胞。在一個較佳具體例中，除了MVA，牛痘病毒還會於HeLa細胞內擴增(參見諸如WO2010/130753)。
生產者細胞較佳於沒有動物或人類衍生的產物之培養基內培養，使用沒有動物或人類來源的產物之化學性界定培養基。尤其是，雖然生長因子可能存在，但是其等較佳為重組生產的且不是自動物材料純化的。熟悉此藝者可以端視選出的生產者細胞而容易地選擇出一種適當的無動物培養基。市場上可買到此等培養基。尤其是，當使 用CEF作為生產者細胞時，其等可以於VP-SFM細胞培養基(Invitrogen)內培養。生產者細胞較佳於感染之前，在+30℃和+38℃之間(更佳為於大約+37℃)的溫度下培養歷時1和8天之間(CEF較佳為1至5天，以及永生的細胞為2至7天)。設若需要，1至8天可以生產數個繼代以增加細胞總數。
於步驟b)中，病毒載體係於適當的條件下感染生產者細胞(尤其是利用適當的感染的多樣性(multiplicity of infection，MOI)，以允許生產性感染生產者細胞。特別地，當治療疫苗係以MVA為基且使用CEF予以擴增時，治療疫苗可以以較佳為0.001和0.1之間所含的MOI(更佳為大約0.05)來播種於含有CEF之細胞培養器皿內。感染步驟較佳亦於沒有動物或人類衍生的產物之培養基(其可能與培養生產者細胞的培養基一樣或不一樣)內執行，使用沒有動物或人類來源的產物之化學性界定培養基。
於步驟c)中，感染的生產者細胞繼而於熟悉此藝者熟知的適當條件下培養直到生產子代病毒載體(諸如，感染性病毒顆粒)。感染的生產者細胞之培養較佳亦在+30℃和+37℃之間的溫度下，於沒有動物或人類衍生的產物之培養基(其可能與培養生產者細胞及/或感染步驟的培養基一樣或不一樣)內執行(使用沒有動物或人類來源的產物之化學性界定培養基)歷時1至5天。
於步驟d)中，從培養物上清液及/或生產者細胞收集步驟c)中生產的病毒載體。來自生產者細胞(並且也選擇性地來自培養物上清液)之回收物，可能需要讓生產者細 胞膜破裂的步驟，以允許生產者細胞釋出載體。生產者細胞膜之破裂可以用熟悉此藝者熟知的各種技術來誘導，該等技術包括但不限於：冷凍/解凍、低滲透壓溶胞作用、音波振動處理、微射流作用或高速均質作用。
病毒載體繼而可以使用本技藝熟知的純化步驟予以進一步地純化。可以設想各種純化步驟，其包括澄清作用、酵素處理(諸如，核酸內切酶、蛋白酶等等)、層析及過濾的步驟。本技藝(諸如WO2007/147528；WO2008/138533，WO2009/100521，WO2010/130753，WO2013/022764)中已描述合適的方法。
免疫查核點調節劑
文獻中已描述免疫查核點與其之調節劑以及使用此等化合物的方法。“免疫查核點”係直接或間接地涉及一種免疫途徑的蛋白質，其於正常的生理條件下對於防止未受控制的免疫反應，且因而對於維持自身耐受性及/或組織保護是至關重要的。但是於病理病況下，其等於T細胞衰竭方面扮演關鍵性的角色。
於此使用的一或多種免疫查核點調節劑可以獨立地作用於T細胞媒介的免疫性之任何步驟，其包括抗原專一性細胞之株系選擇、T細胞活化、增殖、運輸至抗原及發炎位置、執行直接的效應功能細胞以及經由細胞介素與膜配體來發送訊息。此等步驟的各者係由刺激性與抑制性訊息之抗衡，以微調反應的方式。於本發明的上下文內，術語含括(i)免疫查核點調節劑，其能夠向下調控一種抑制性 免疫查核點至少部分的功能(諸如，藉由直接結合或抑制配體結合至該靶定的免疫查核點)以便行使拮抗劑的功能，且從而拮抗一種免疫查核點-媒介的抑制性訊息，以及(ii)免疫查核點調節劑，其能夠向上調控一種刺激性免疫查核點至少部分的功能以便行使促效劑的功能，且從而擴增一種免疫查核點-媒介的抑制性訊息。
於此使用的一或多種免疫查核點調節劑可以獨立地為一種多肽或是一種核酸分子；且特別首選為胜肽配體、天然受體的可溶領域、RNAi、反義分子、抗體，以及蛋白支架。
在一個較佳具體例中，該免疫查核點調節劑為一種抗體。於本發明的上下文內，"抗體"("Ab")係以最廣義來使用，並且含括天然存在及人為經遺傳工程處理的以及全長的抗體或功能片段或是其類似物，其等能夠結合標靶免疫查核點或抗原決定位(以此保留結合標靶的部分)。本發明中使用的抗體可以為任何來源的，諸如人類、擬人化、動物(諸如齧齒動物或駱駝(camelid)抗體)或嵌合型。其可以是任一種同型(isotype)(諸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM等等)。此外，其可以是醣化的或非醣化的。術語抗體也包括雙專一性或多專一性抗體，只要其等顯示出本文所述之結合專一性。
為說明之用，全長的抗體為醣蛋白，其包含藉由雙硫鍵而互相連接之至少2個重(H)鏈與2個輕(L)鏈。各重鏈含有一重鏈可變異區域(VH)與一重鏈守恆區域，重鏈守恆 區域由三者CH1、CH2與CH3領域構成(選擇性地在CH1和CH2之間有一樞紐)。各輕鏈含有一輕鏈可變異區域(VL)與包含一個CL領域之輕鏈恆定區域。VH和VL區域包含高度變異區域，稱之為互補性決定區域(CDR)，並且穿插較恆定的區域，稱之為框架區域(FR)。各VH和VL係由三個CDR與四個FR組成，以下列之順序：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。重鏈與輕鏈之CDR區域為結合專一性之決定子(determinants)。
如本文中所用，一種“擬人化抗體”意指為一種非人類(諸如，小鼠、駱駝、大鼠等等)抗體，其之蛋白質序列已經予以修飾以增加與人類抗體(亦即人類天然生產者)的相似性。擬人化的方法為本技藝熟知的(參見諸如，Pestra等人，1997,Cancer Res.57(20)：4593-9；US 5,225,539；US 5,530,101；US 6,180,370；WO2012/110360)。舉例而言，一種開發供人類用的單株抗體可以予以擬人化，其係用看起來像是人類免疫球蛋白序列來取代FR區域的一或多個殘基，而絕大多數可變異區域的殘基(尤其是CDRs)不被修飾並且相應於非人類免疫球蛋白之該等。關於一般指導，此等FR區域之胺基酸取代的數目典型為各個可變異區域VH或VL不超過20個。
如本文中所用，一種“嵌合抗體”意指為一種抗體，其包含一物種之一或多種元素以及另一物種之一或多種元素，舉例而言一種非人類抗體包含人類免疫球蛋白之恆定區域(Fc)的至少一部份。
抗體片段可經遺傳工程處理供使用於本發明之組合內。代表性實例包括但不限於：Fab、Fab’、F(ab’)2、dAb、Fd、Fv、scFv、di-scFv、雙價抗體(diabody)以及任何其他人工抗體。更具體地：(i)一種Fab片段係以一單價片段為代表，該單價片段係由VL、VH、CL及CH1領域所組成；(ii)一種F(ab')2的片段係以一種二價片段為代表，該二價片段包含由至少一雙硫鍵而連接樞紐區域之二個Fab片段；(iii)一種Fd片段係由VH及CH1領域所組成；(iv)一種Fv片段係由一抗體之單臂的VL及VH領域所組成，(v)一種dAb片段係由單一可變異領域片段(VH或VL領域)所組成；(vi)一種單鏈Fv(scFv)包含Fv片段的二個領域，VL及VH，融合在一起，選擇性地具有連接子而構成一種單一蛋白鏈(參見諸如，Bird等人，1988,Science 242：423-6；Huston等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-83；US 4,946,778；US 5,258,498)；以及(vii)任何其他人工抗體。
製造抗體、片段以及其之類似物的方法為本技藝已知的(參見諸如，Harlow and Lane,1988,Antibodies-A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor NY)。在一個具體例中，此一抗體可以連同 靶定的免疫查核點調節劑於宿主動物內生產。任擇地，其可以由融合瘤(參見諸如，Kohler and Milstein,1975,Nature 256：495-7；Cote等人，1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：2026-30；Cole等人，in Monoclonal antibodies and Cancer Therapy；Alan Liss pp77-96)，重組技術(諸如利用噬菌體顯示法)，胜肽合成以及酵素切割來生產。抗體片段可以用於此所述的重組技術來生產。其等亦可以用酵素、藉由蛋白分解切割來生產，譬如用木瓜酶來生產Fab片段或是用胃蛋白酶來生產F(ab')2片段，如同文獻中所述者(參見諸如，Wahl等人，1983,J.Nucl.Med.24：316-25)。類似物(或是其之片段)可藉由習用的分子生物學方法來生產(PCR，誘突變技術)。設若有需要，可以以如同完整抗體相同的方式來篩選此片段以及類似物之功能性(諸如，用標準的ELISA分析法)。
在一個較佳具體例中，供本發明使用的一或多種免疫查核點調節劑之至少一者為一種單株抗體，且特別首選為人類(其中二種框架區域均衍生自人類生殖系列免疫球蛋白序列)，或是依據眾所周知的擬人化方法之擬人化的抗體。
合意地，本發明中使用的一或多種免疫查核點調節劑至少部分地(諸如，超過50%)拮抗抑制性免疫查核點之活性，尤其是由下列的任一者媒介的該等：PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG3、Tim3、BTLA、SLAM、2B4、CD160、KLRG-1及CTLA4，且特別首選為一種專一地結合至此等靶定蛋白 質的任何一者之人類或擬人化單株抗體。術語“專一地結合至”意指對於一特定標靶或抗原決定位之結合專一性的能力及親和力，即使在其他異質群的蛋白質與生物製品存在下。因此，於指定分析法的條件下，本發明中使用的抗體優先地與其標靶結合，且不會大量與測試樣本或個體內存在的其他的組分結合。較佳地，此一抗體顯現與其標靶結合之高度親和力，且平衡解離常數等於或低於1x10-6M(諸如，至少0.5x10-6、1x10-7、1x10-8、1x10-9、1x10-10，等等)。任擇地，本發明中使用的一或多種免疫查核點調節劑行使一種促效劑的功能，在這個意義上，其能夠刺激或強化刺激性訊息，尤其是CD28媒介的該等，且特別首選為ICOS、CD137(4-1BB)、OX40、CD27、CD40及GITR免疫查核點之任何一者。對於免疫查核點的抗體之結合能力之評估的標準分析法為本技藝已知的，包括舉例而言ELISA、西方墨點法、RIAs及流動式細胞測量術。抗體之結合動力學(諸如結合親和力)亦可藉由本技藝中已知的標準分析法予以估定，譬如伯森(Biacore)分析法。
在一個較佳具體例中，供此發明使用的一或多種查核點調節劑之至少一者為一種抗體，其能夠至少部分地拮抗計畫性死亡1(PD-1)蛋白質，以及尤其是一種專一地結合至人類PD-1的抗體。PD-1為免疫球蛋白(Ig)基因超家族的部分且為CD28家族的成員。其為抗原經歷細胞(諸如，活化的B細胞、T細胞與骨髓細胞)上表現的一種55kDa第一型跨膜蛋白(Agata等人，1996,Int.Immunol.8：765-72；Okazaki 等人，2002,Curr.Opin.Immunol.14：391779-82；Bennett等人，2003,J.Immunol 170：711-8)。在正常情況下，其係透過限制發炎反應時之T細胞活性來作用，從而保護正常組織不被破壞(Topalian,2012,Curr.Opin.Immunol.24：207-12)。業已分別地辨識出PD-1的二種配體PD-L1(計畫性死亡配體1)與PD-L2(計畫性死亡配體2)(Freeman等人，2000,J.Exp.Med.192：1027-34；Carter等人，2002,Eur.J.Immunol.32：634-43)。於20-50%的人類癌症中辨識出PD-L1(Dong等人，2002,Nat.Med.8：787-9)。在PD-1與PD-L1之間的交互作用導致引致腫瘤浸潤淋巴球的減少、T-細胞受體媒介的增殖減少，以及癌細胞之免疫逃避(Dong等人，2003,J.MoI.Med.81：281-7；Blank等人，2005,Cancer Immunol.Immunother.54：307-314)。完整的核苷酸及胺基酸PD-1序列可以於GenBank寄存編號U64863與NP_005009.2中找到。在本技藝中可取得一些抗PD1抗體(參見諸如於WO2004/004771；WO2004/056875；WO2006/121168；WO2008/156712；WO2009/014708；WO2009/114335；WO2013/043569；及WO2014/047350中所述的該等)。於此發明的上下文內較佳的抗PD1抗體為經FDA核准的或在先進的臨床發展中，以及尤其可以使用選自於以下所組成的群組之抗PD-1抗體：納武單抗(Nivolumab)(也稱為BMS-936558，Bristol Myer Squibb正在開發)、蘭博利速單抗(Lanbrolizumab)(也稱為MK-3475，Merck正在開發)，及比帝利速單抗(Pidilizumab)(也稱為 CT-011，CureTech正在開發)。
免疫查核點調節劑之另一較佳的實例係以一種調節劑為代表，其能夠至少部分地拮抗被稱為PD-L1之PD-1配體，以及尤其是一種會辨識人類PD-L1之抗體。在本技藝中可取得一些抗PD-L1抗體(參見諸如於EP1907000中所述的該等)。較佳的抗PD-L1抗體為經FDA核准的或在先進的臨床發展中(諸如，Genentech/Roche正在開發的MPDL3280A以及Bristol Myer Squibb正在開發的BMS-936559)。
免疫查核點調節劑之還另一個較佳的實例係以一種調節劑為代表，其能夠至少部分地拮抗CTLA-4蛋白質，以及尤其是一種會辨識人類CTLA-4之抗體。CTLA4(胞毒型T淋巴球關聯性抗原4)亦稱為CD152，係於1987年辨識出(Brunet等人，1987,Nature 328：267-70)，並且由CTLA4基因所編碼(Dariavach等人，Eur.J.Immunol.18：1901-5)。其表現於T細胞的表面上，主要調節T細胞活化早期的幅度。進來的工作已暗示CTLA-4可能在活體內行使從抗原呈現細胞捕獲且移除B7-1與B7-2的作用，因而使此等不可用於觸發CD28(Qureshi等人，Science,2011,332：600-3)。完整的CTLA-4核酸序列可以於GenBank寄存編號L1 5006中找到。在本技藝中可取得一些抗CTLA-4抗體(參見諸如於US 8,491,895中所述的該等)。於此發明的上下文內較佳的抗CTLA-4抗體為經FDA核准的或在先進的臨床發展中。可以更具體地列舉通過Bristol Myer Squibb銷售為益伏 (Yervoy)之伊匹單抗(ipilimumab)(參見諸如，US 6,984,720；US 8,017,114)，Pfizer正在開發的摧麥拉單抗(tremelimumab)(參見諸如US 7,109,003及US 8,143,379)，以及單鏈抗CTLA4抗體(參見諸如WO97/20574及WO2007/123737)。
用於拮抗TIM3受體之免疫查核點調節劑亦可以使用於本發明之組合產物內(參見諸如，Ngiow等人，2011,Cancer Res.71：3540-51；US2012-0189617)。
另一種用於拮抗LAG3受體之免疫查核點調節劑亦可以使用於本發明之組合內。(參見諸如，Toni-Jun等人，2011,2014,ACCR poster LB266；Woo等人，2012,Cancer Res.72：917-27)。
免疫查核點調節劑之還另一個實例係以一種OX40促效劑為代表，譬如OX40促效劑配體(OX40L)(參見諸如，US 5,457,035、US 7,622,444；WO03/082919)，或是一種針對OX40受體之抗體(參見諸如US 7,291,331及WO03/106498)。
免疫查核點調節劑之其他的實例係以抗-KIR或抗-CD96抗體為代表，其靶定CD8+ T細胞及NK細胞庇護之抑制性受體。
本發明包含一種組合，其包含超過一種免疫查核點調節劑。一個較佳的實例包括但不限於：使用一種抗-CTLA-4抗體與一種抗-PD-1或抗-PD-L1抗體組合以於此所描述之治療疫苗。
編碼所欲的免疫查核點調節劑相關部分之核酸分子可以使用本技藝可得的序列資料及於此提供的資訊，藉由標準的分子生物學技術來獲得。舉例而言，編碼抗體重鏈與輕鏈或其等之CDRs的cDNAs可以從生產融合瘤、免疫球蛋白基因庫或任何可得的來源單離。
在一個具體例中，供本發明使用的一或多種免疫查核點調節劑可以包含於此描述之治療疫苗內。舉例而言，該編碼的核酸分子可以插入至一種載體為基的治療疫苗(諸如，編碼抗原的病毒載體)內。於此上下文內，編碼該興趣的多肽及該免疫查核點調節劑之核酸分子較佳使用不同的調控元素而獨立地表現。任擇地，供本發明使用的一或多種免疫查核點調節劑可以由獨立的載體系統表現，譬如於此描述有關於治療疫苗之該等中之一者，用於分開的或相伴的投藥至需要其之個體內。
還有任擇地，供本發明使用的一或多種免疫查核點調節劑可以藉由重組手段、使用合適的表現載體及宿主細胞來生產為重組多肽，供投藥至需要其之該個體內。
免疫查核點調節劑之生產
插入至表現載體之內可以藉由例行的分子生物學來執行，舉例而言如同Sambrook等人(2001,Molecular Cloning-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory)中所述者。插入至病毒為基的治療疫苗內可以通過同源重組來執行，如同Chartier等人(1996,J.Virol.70：4805-10)以及Paul等人(2002,Cancer Gene Ther.9：470-7)中 所述者。
可採用或建構各種各樣的宿主-載體系統來表現供用於本發明之一或多種免疫查核點調節劑，其包括原核生物，例如細菌(諸如大腸桿菌或枯草桿菌)；酵母菌(諸如，啤酒酵母菌、粟酒裂殖酵母(Saccharomyces pombe)、畢赤酵母菌(Pichia pastoris))；昆蟲細胞系統(諸如，Sf 9細胞及桿狀病毒)；植物細胞系統(諸如，花椰菜嵌紋病毒(cauliflower mosaic virus)CaMV、菸草嵌紋病毒TMV)以及哺乳動物細胞系統(諸如，培養的細胞)。典型地，市場上可買到此等載體(諸如，Invitrogen、Stratagene、Amersham Biosciences、Promega等等)，或是可自諸如美國菌種保存中心(ATCC，Rockville，Md.)的寄存機構取得，或是業已為許多出版物之主題，該等出版物述及其等的序列、組成及生產方法，使得專業人員可加以應用。關於一般的目的，此等載體通常包含一或多種元素，能夠使該核酸分子維持、繁殖或表現於宿主細胞內。代表性實例包括但不限於：標誌基因俾以辨識及單離重組宿主細胞(諸如，細胞營養缺陷性之互補作用或抗生素抗性)、穩定元素(諸如DAP系統，如同U.S.5,198,343中所述者)，以及整合元素(諸如，LTR病毒序列與轉位子)。
合適供原核生物細胞使用的質體載體包括但不限於：pBR322(Gibco BRL)、pUC(Gibco BRL)、pbluescript(Stratagene)、p Poly(Lathe等人，1987,Gene 57：193-201)、pTrc(Amann等人，1988,Gene 69：301-15)；pET lid(Studier 等人，1990,Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185：60-89)；pIN(Inouye等人，1985,Nucleic Acids Res.13：3101-9；Van Heeke等人，1989,J.Biol.Chem.264：5503-9)；以及pGEX載體，核酸分子能與融合麩胱甘肽S-轉移酶而於該載體內表現(GST)(Amersham Biosciences Product)。合適於酵母菌(諸如啤酒酵母(S.cerevisiae))表現的載體包括但不限於：pYepSec1(Baldari等人，1987,EMBO J.6：229-34)、pMFa(Kujan等人，1982,Cell 30：933-43)、pJRY88(Schultz等人，1987,Gene 54：113-23)、pYES2(Invitrogen Corporation)以及pTEF-MF(Dualsystems Biotech Product)。質體與病毒載體，例如於此所描述與該治療疫苗有關的該等，亦可以藉由重組手段用來生產該免疫查核點調節劑。
重組DNA技術亦可以用來改善該編碼免疫查核點調節劑之核酸分子於宿主細胞內之表現，諸如透過利用高複製數的載體、取代或修飾一或多種轉錄調控序列(諸如，啟動子、增強子等等)，最佳化密碼子使用，以及對可使於此所述有關於該編碼感興趣的多肽之核酸分子的轉錄本動搖之負向序列進行抑制)。
如前，編碼該免疫查核點調節劑之核酸分子係處於合適其於宿主細胞內表現的形式，此意指該核酸分子係在適合如上所述之載體、宿主細胞及/或所欲的表現位準之一或多種的調控序列之控制下。持續型啟動子(諸如，PGK、CMV啟動子等等)、外源供應的化合物調控之誘導型 真核細胞啟動子(諸如，TRP與IPTG-誘導型pTAC啟動子、鋅-誘導型金屬硫蛋白(MT)啟動子、地塞米松(dexamethasone)(Dex)-誘導型小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)啟動子、四環黴素-可抑制型與雷帕黴素(rapamycin)-誘導型啟動子，等等)，以及下文所描述用於表現編碼該感興趣的多肽之核酸分子之任一啟動子均可以使用。
用於重組生產該免疫查核點調節劑的方法為本技藝中習用的。典型地此等方法包含(a)將於此所描述之表現載體導入一種合適的生產者細胞內，以產生一種轉染或感染的生產者細胞，(b)在合適其生長的條件下於活體外培養該轉染或感染的生產者細胞，(c)從該細胞培養物回收該免疫查核點調節劑，並且(d)選擇性地純化該回收的免疫查核點調節劑。
於本發明的上下文內，生產者細胞包括原核生物細胞；低等真核生物細胞，例如酵母菌；以及其他真核生物細胞，譬如昆蟲細胞、植物及哺乳動物(如人類或非人類)細胞。較佳的大腸桿菌細胞包括但不限於：大腸桿菌BL21(Amersham Biosciences)。較佳的酵母菌生產者細胞包括但不限於：啤酒酵母菌、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、畢赤酵母菌(Pichia pastoris)。較佳的哺乳動物生產者細胞包括但不限於：BHK-21(幼倉鼠腎)、CV-1(非洲猴腎細胞株)、COS(諸如COS-7)細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、小鼠NIH/3T3細胞、HeLa細胞、維洛(Vero)細胞、HEK293細胞及PERC.6細胞，以及對應的融合瘤細胞。
生產者宿主細胞之轉染/感染作用為習用的且可以使用額外的化合物以便改善載體的轉染效率及/或穩定性。文獻中廣泛記錄此等化合物，譬如聚陽離子聚合物(諸如幾丁聚醣、聚甲基丙烯酸酯、PEI等)，陽離子脂質(例如，DC-Chol/DOPE、現今可自Promega取得之轉染坦(transfectam)脂質感染素(lipofectin))以及脂質體。
可以於習用的發酵反應器、燒瓶與培養皿中培養生產者細胞。培養可以於適合一特定宿主細胞的溫度、pH值及氧含量下進行。本文並未企圖詳細描述原核生物及真核生物細胞內各種已知的蛋白質生產方法。免疫查核點調節劑可以生產於周質的、細胞內的或是較佳分泌至生產者細胞外部(諸如，於培養基內)。設若需要，尤其是當免疫查核點調節劑不會分泌至生產者細胞外部或分泌不完全時，可以藉由標準的溶解程序予以回收，溶解程序包括冷凍解凍、音波振動處理、機械破裂作用、使用溶解劑等等。設若會分泌，可以直接從培養基予以回收。
選擇性地，免疫查核點調節劑繼而可以藉由眾所周知的純化方法予以純化，包括硫酸銨沉澱作用、酸萃取作用、凝膠電泳、過濾作用及層析方法(諸如，逆相、粒徑篩析、離子交換、親和性、磷酸纖維素、疏水性作用或是羥磷灰石層析術等)。純化特定的蛋白質採用的條件與技術會取決於，譬如淨電荷、分子量、疏水性、親水性等因素，及其等係熟悉此技藝者所顯而易見。再者，純化的程度將依預定用途而定。也瞭解到取決於而定生產者細胞， 免疫查核點調節劑蛋白質會有各種醣化模式，或者如於此所述者可能為非醣化的(諸如當生產於細菌內時)。
合意地，本發明中使用的免疫查核點調節劑係至少部分地予以純化的，在這個意義上，其係實質沒有其他具有不同抗原專一性的抗體及/或其他的細胞物質。再者，免疫查核點調節劑可以按照本技藝慣常使用的條件予以調配(諸如WO2009/073569)。
依據本發明，可以引入各種各樣的修飾於免疫查核點抑制劑內以便增高其之生物半生期、其之親和力、其之穩定性及/或其之生產。舉例而言，如於此所述，可以引入訊息胜肽以促進免疫查核點調節劑分泌於細胞培養物內。作為額外的實例，亦可以加入一種標籤胜肽(典型為一種短胜肽序列，其能夠被可得到的抗血清或化合物辨識出)用於促進重組免疫查核點調節劑之純化。本發明的上下文內可以使用多種標籤胜肽，包括但不限於：PK標籤、FLAG八肽、MYC標籤、HIS標籤(通常為一段4至10個組胺酸殘基)，以及e-標籤(US 6,686,152)。標籤胜肽可以獨立地放置於蛋白質之N端或是任擇地於其之C端或任擇地於內部，或是使用數個標籤時，位於這些位置的任一者。標籤胜肽可以藉由使用抗標籤抗體的免疫偵測分析法來偵測。
於本發明的上下文內可以進行的另一種方法，是使免疫查核點調節劑與一種外部製劑偶合，譬如一種放射敏化劑、一種細胞毒性劑及/或一種標記劑。偶合作用可為共價或不共價的。如本文中所用之術語"放射敏化劑"，係 指一種使細胞對放射療法更敏感的分子。放射敏化劑包括但不限於：甲硝唑(metronidazole)、醚醇硝唑(misonidazole)、去甲基醚醇硝唑(desmethylmisonidazole)、哌莫硝唑(pimonidazole)、依他硝唑(etanidazole)、尼莫拉唑(nimorazole)、絲裂黴素(mitomycin)C、RSU 1069、SR 4233、E09、RB 6145、菸鹼醯胺(nicotinamide)、5-溴化去氧尿苷(BUdR)、5-碘化去氧尿苷(5-iododeoxyuhdine)(IUdR)、溴化去氧胞苷、氟化去氧尿苷(FUdR)、羥基尿素以及順鉑(cisplatin)。如本文中所用之術語"細胞毒性劑"，係指一種對於細胞直接有毒的化合物，妨礙其等之生殖或生長，譬如毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源之酵素上活性的毒素，或其片段)。如本文中所用，“一種標記劑”意指一種可偵測的化合物。標記劑可以為可被其自身偵測的(例如，放射性同位素標記或螢光標記)或者，於酵素標記的情況中，可以催化一種可偵測到的受質化合物之化學修飾。
另一種修飾為聚乙二醇化，舉例而言以增加抗體的生物半生期。聚乙二醇化蛋白質的方法為本技藝已知的(參見諸如，EP154316；EP401384；WO98/15293，WO01/23001等等)。
組合產物及療法
術語“組合療法”及任何的變體例如“組合使用”，係意指在同一個體中投藥至少二種實體，其係本發明的一標的且於此所描述。
在一個具體例中，本發明係有關於一種組成物形 式之組合產物，其包含一種治療有效量的於此所描述之至少該治療疫苗及一或多種免疫查核點調節劑實體，以及一種藥學上可接受的媒液。在另一個具體例中，本發明係有關於組合使用之不同組成物，一者包含至少治療有效量的該治療疫苗，及一種藥學上可接受的媒液，以及另一者包含治療有效量的該一或多種免疫查核點調節劑及一種藥學上可接受的媒液。各個實體(或其之組成物)可以經由相同的或不同的途徑，相伴、相繼或是穿插的進行一次或多次投藥。
“治療有效量”係相當於本發明之組合或組成物內所含的每個活性實體(治療疫苗及一或多種免疫查核點調節劑)，足以產生一或多種有益的結果之量。此治療有效量可以如各種參數之函數而變化，譬如投藥模式；個體的年齡與體重；症狀的性質與程度；個體對治療的反應能力，並行的治療類型；治療的頻率及/或預防或療法的需求，等等。
當涉及“預防(prophylactic)”使用時，該組合係以足以預防或延遲一種病理病況之發生及/或確立及/或復發之一劑量，尤其是於有風險的個體內。於“治療”使用方面，治療疫苗及免疫查核點調節劑二者均投藥至診斷為患有一種疾病或是病理病況的一個體，該疾病或是病理病況為治療的目標，選擇性地與一或多種習知治療模態結合。
術語“藥學上可接受的媒液”意指包括可與哺乳類動物及尤其人類個體的投藥作用相容之任何及所有的載 劑、溶劑、稀釋劑、賦形劑、佐劑、分散介質、塗層、抗菌與抗真菌劑、吸收劑，以及類似物。
治療疫苗及一或多種免疫查核點調節劑或其之組成物的各者可獨立地放置於適合供人類及動物使用之溶劑或稀釋劑內。尤其，各者或二者均可以予以調配以便確保其安定性，尤其是於冷凍(諸如，-70℃，-20℃)、冷藏(諸如4℃)或或環境溫度(諸如20-25℃)下，在製造及長期儲存(亦即至少6個月及首選為至少二年)之條件下。此等調配物一般包括液體載劑，譬如水溶液。可以使用生理食鹽水、林格氏溶液、漢克氏(Hank)溶液、蔗糖溶液(諸如，葡萄糖、海藻糖、蔗糖、右旋糖等等)，以及其他含水的生理平衡鹽溶液(參閱舉例而言，最新版本的Remington：The Science and Practice of Pharmacy,A.Gennaro,Lippincott,Williams& Wilkins)。動物或植物油、礦物或合成油亦是合適的。有利地，適合治療疫苗及一或多種免疫查核點調節劑或其之組成物的調配物，係經適當地緩衝供人類使用，較佳為在生理或弱鹼性pH值(諸如，大概pH 7至大概pH 9，且特別首選為在7和8之間的pH，以及更特定為接近7.5)。合適的緩衝液包括但不限於：TRIS(參(羥甲)甲胺)、TRIS-HCl(參(羥甲)甲胺-HCl)、HEPES(4-2-羥乙基-1-哌乙磺酸)、磷酸鹽緩衝液(諸如PBS)、ACES(N-(2-乙醯胺基)-胺乙磺酸)、PIPES(哌-N,N’-雙(2-乙磺酸))、MOPSO(3-(N-嗎福啉基)-2-羥基丙磺酸)、MOPS(3-(N-嗎福啉基)丙磺酸)、TES(2-{[參(羥甲)甲基]胺基}乙磺酸)、DIPSO(3-[雙(2- 羥乙基)胺基]-2-羥丙基-1-磺酸)、MOBS(4-(N-嗎福啉基)丁磺酸)、TAPSO(3-[N-參(羥甲)甲胺]-2-羥基丙磺酸)、HEPPSO(4-(2-羥乙基)-哌-1-(2-羥基)-丙磺酸)、POPSO(2-羥基-3-[4-(2-羥基-3-磺丙基)哌-1-基]丙基-1-磺酸)、TEA(三乙醇胺)、EPPS(N-(2-羥乙基)-哌-N’-3-丙磺酸)，以及TRICINE(N-[參(羥甲)-甲基]-甘胺酸)。較佳地，緩衝液係選自於TRIS-HCl、TRIS、Tricine、HEPES，以及包含Na2HPO4與KH2PO4的混合物或是Na2HPO4及NaH2PO4的混合物之磷酸鹽緩衝液。緩衝液(尤其是以上提及的該等，且尤其為TRIS-HCl)存在的濃度較佳為10至50mM。為了確保適當的滲透壓，此調配物亦含括一種單價鹽類會是有益的。單價鹽類特別可以選自於NaCl及KCl，較佳為NaCl，較佳濃度為10至500mM。
合適供本發明上下文使用的調配物，且尤其是液體或冷凍的調配物，亦可以包括一種低溫保護劑以便於低儲存溫度下保護治療疫苗及/或一或多種免疫查核點調節劑(尤其是病毒為基的組成物)，例如於大約+5℃ ℃及更低。合適的低溫保護劑包括但不限於：蔗糖(sucrose)(或蔗糖(saccharose))、海藻糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇、山梨醇及甘油，較佳濃度為0.5至20%(以克計的重量/以公升計的體積，稱為w/v)。舉例而言，蔗糖存在的濃度較佳為5至15%(w/v)，且特別首選為大約10%。
合適供本發明使用的調配物，且尤其是液體調配物，可以進一步包含一種藥學上可接受的螯合劑，且尤其 是一種螯合雙正離子的製劑用於改善穩定性。藥學上可接受的螯合劑尤其可以為選自於下列：乙二胺四乙酸(EDTA)、1,2-雙(o-胺基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)、二巰基丁二酸(DMSA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)，以及2,3-二巰基-1-丙磺酸(DMPS)。藥學上可接受的螯合劑存在的濃度較佳為至少50μM，且特別首選為50至1000μM的濃度。較佳地，藥學上可接受的螯合劑為存在濃度接近150μM之EDTA。
可以進一步存在額外的化合物以增加調配的治療疫苗及/或免疫查核點調節劑或其之組成物的穩定性。此等額外的化合物包括但不限於：C2-C3醇類(合意地濃度為0.05至5%(體積/體積或v/v))；麩酸鈉(合意地濃度為低於10mM)；非離子界面活性劑(Evans等人，2004,J Pharm Sci.93：2458-75，Shi等人，2005,J Pharm Sci.94：1538-51，US7,456,009，US2007/0161085)，例如低於0.1%的低濃度妥文80(亦也稱為聚山梨醇酯80)。業已發現二價鹽類，譬如MgCl2或CaCl2，能誘導各種生物產物於液體狀態的穩定性(參見Evans等人，2004,J Pharm Sci.93：2458-75及US7,456,009)。業已發現胺基酸，且尤其是組胺酸、精胺酸或甲硫胺酸，能誘導各種病毒於液體狀態的穩定性(參見Evans等人，2004,J Pharm Sci.93：2458-75，US7,456,009，US2007/0161085，US7,914,979，WO2014/029702以及WO2014/053571)。
高分子量聚合物，譬如聚葡萄醣或聚乙烯氫吡咯 酮(PVP)，之存在特別適合冷凍乾燥調配物。冷凍乾燥的調配物一般係獲得自涉及真空乾燥與冷凍乾燥的方法(參見諸如，WO03/053463；WO2006/0850082；WO2007/056847；WO2008/114021)，以及存在此等聚合物協助餅狀物於冷凍乾燥的期間形成(參見EP1418942及WO2014/053571)。
在本技藝中可取得的各種冷凍、液體或冷凍乾燥形式之調配物，可以獨立地用來保存治療疫苗及/或免疫查核點調節劑或其之組成物(諸如，WO98/02522，WO00/29024，WO00/34444，WO01/66137，WO03/053463，WO2006/0850082，WO2007/056847以及WO2008/114021，等等)。為說明之用，無菌的組胺酸、檸檬酸乙酸鹽(acetate citrate)或磷酸鹽緩衝液食鹽水，其含有界面活性劑譬如聚山梨醇酯80及保護劑例如蔗糖或山梨醇，係適合保存重組抗體，以及包括NaCl及/或糖的緩衝調配物特別適合保存載體化的(vectorised)治療疫苗(諸如，Tris-HCl 10mM pH 8加上蔗糖5%(w/v)，麩酸鈉10mM，以及NaCl 50mM或磷酸鹽緩衝鹽水加上甘油(10%)及NaCl)。
可以使調配物適合投藥模式以確保在活體內合適的分布或延遲釋放。可以使用生物可降解的、生物相容性的聚合物，譬如乙烯/乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯、聚乳酸，以及聚乙二醇。本技藝中說明了許多製備此調配物的方法(諸如，J.R.Robinson in “Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems”,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978；WO01/23001； WO2006/93924；WO2009/53937)。耐胃膠囊及顆粒特別適合口服投藥，栓劑適合直腸或陰道投藥，選擇性地組合以增加黏膜孔徑有用的吸收增進劑。此吸收增進劑典型為結構相似於黏膜的磷脂質領域的物質(例如去氧膽酸鈉、甘膽酸鈉、二甲基-β-環糊精、月桂基-1-溶血卵磷脂)。
治療疫苗及/或免疫查核點調節劑或其之組成物的各者亦可以包含藥學上可接受的賦形劑用於提供所欲的藥學或藥效動力學性質，包括舉例來說滲透性、黏度、透明度、顏色、無菌性、穩定性、溶解、釋放或吸收至個體內，或是遞送至特定器官。
治療疫苗及免疫查核點調節劑適當的劑量，以及各個實體之最佳比率可以由本技藝熟知的技術來判定。再者，可以由執業醫生根據相關情況，例行地進行精細計算，來決定個體或個體組別適當的劑量。
免疫查核點調節劑合適的劑量係自大約0.01mg/kg變化至大約50mg/kg，有利地為自大約0.1mg/kg至大約30mg/kg，合意地為自大約0.5mg/kg至大約25mg/kg，較佳為自大約1mg/kg至大約20mg/kg，更佳為自大約2mg/kg至大約15mg/kg，且當不經腸的注射使用時，特別首選為劑量自大約3mg/kg至大約10mg/kg。然而，可以透過1.5和100之間的變更因數，以使劑量適合投藥途徑及待治療的個體。於一些具體例中，結合專一性不同的二種或多種單株抗體係同時地投藥，於該情況中各抗體的投藥劑量係落在指示的範圍內。
病毒為基的治療疫苗合適的劑量係自大概105變化至大概1013vp(病毒顆粒)，iu(感染單位)或pfu(溶菌斑形成單位)，取決於所用的定量技術。作為一般性導引，腺病毒的劑量自大概106至大概5x1012vp是合適的，較佳為自大概107vp至大概1012vp，更佳為自大概108vp至大概5x1011vp；劑量大概5x108vp至大概1011vp為特別佳的，尤其是供人類使用。MVA-為基的治療疫苗合適的個別劑量係包含大概104至大概1012pfu，較佳為自大概105pfu至大概1011pfu，更佳為自大概106pfu至大概1010pfu；劑量大概107pfu至大概109pfu為特別佳的，尤其是供人類使用。牛痘為基的治療疫苗合適的個別劑量係包含自大概105至大概1013pfu，較佳為自大概106pfu至大概1011pfu，更佳為自大概107pfu至大概1010pfu；劑量大概108pfu至大概5x109vp為特別佳的，尤其是供人類使用。樣本中所存在的病毒量可藉由例行的滴定技術來判定，諸如，於可容許的細胞(諸如，Ad為293或PER6C6，MVA為BHK-21或CEF，VV為HeLa)之感染後藉由計數溶菌斑的數目，藉由測量A260吸光度(vp效價)，或是還有藉由諸如利用抗病毒的抗體(iu效價)之定量免疫螢光法。質體為基的治療疫苗之合適的劑量係自10μg變化至20mg，有利地為自100μg至10mg，以及較佳為自大概0.5mg至大概5mg。
投藥
本發明之組合產物係合適於單一投藥或一系列的投藥。尤其是當預期為不同的組成物時，治療疫苗及免 疫查核點調節劑可以一起或是分別地投藥至個體，並且以單一劑量或重複劑量的方式。投藥可以為相伴的方式(諸如，在大概相同的時間混合於相同的組成物或不同的組成物予以投藥)、相繼的方式(治療疫苗接著免疫查核點調節劑，或者反之亦然)或是穿插的方式(以各種間隔來混合投藥)，以及藉由相同或不同的途徑、在相同的位置或替代的位置執行。
任何習用的投藥途徑，包括不經腸的、局部或黏膜途徑，皆可用於本發明上下文中用於本發明之組合產物或組成物。不經腸的途徑係針對投藥作為注射或灌注且含括全身性的及局部途徑。可用於投藥本發明的組合產物之不經腸的注射類型為靜脈內(至靜脈內，諸如送往肝臟的門靜脈)、血管內(至血管內)、動脈內(至動脈內，例如肝動脈)、皮內(至真皮內)、皮下的(皮膚下)、肌肉內(至肌肉內)、腹膜內的(至腹膜內)以及腫瘤內(至腫瘤內或靠近腫瘤的地方)或還有透過劃痕。輸液典型地透過靜脈內途徑來提供。黏膜投藥包括但不限於：口腔/消化道、鼻內、氣管內、肺內、陰道內或直腸內途徑。局部投藥亦可利用透皮工具(例如，貼片等等)進行。免疫查核點調節劑較佳的投藥途徑包括靜脈內(諸如，靜脈內注射或灌注)以及腫瘤內。治療疫苗較佳的投藥途徑包括靜脈內、肌肉內、皮下的以及腫瘤內。舉例來說，治療疫苗之腫瘤內接種組合以免疫查核點調節劑之靜脈內注射會是有利地。
投藥可用習用的針筒及針頭(諸如Quadrafuse注 射針頭)，或是本技藝中可取得、能夠幫助或改善活性劑於該個體內的遞送之任何化合物或裝置(如電穿孔作用用於肌肉內投藥)進行。替代方案為使用無針頭注射裝置來投藥本發明之組合產物內含有的活性實體的之至少一者(諸如，Biojector TM裝置)。亦可以考慮透皮貼片。
在一個具體例中，該治療疫苗及該一或多種免疫查核點調節劑或其之組成物係相繼地投藥，譬如先投藥該疫苗且其次投藥該免疫查核點調節劑，或者反之亦然(先投藥免疫查核點調節劑且其次投藥該治療疫苗)。次序可以改變。舉例而言，每個投藥時間點的投藥順序可以顛倒或者保持相同的順序。
該治療疫苗及該免疫查核點調節劑亦可以進行穿插投藥。在該治療疫苗第一次投藥和該免疫查核點調節劑第一次投藥之間的一段時間可以從大概數分鐘變化到數星期。各個實體亦可經由連續週期式的投藥來進行，其於休停期間後重複投藥。在每次投藥之間的間隔可以從一小時至一年(諸如，24小時、48小時、72小時、每星期、每二星期、每月或者每年)。間隔也可為不規則的(諸如，在測量病人血液單株抗體位準之後)。每次投藥劑量可以於以上所述的範圍內變化。較佳地，每次治療疫苗投藥之間的時間間隔可以自大概1天變化至大概8個星期，有利地為自大概2天至大概6個星期，較佳為自大概3天至大概4個星期，以及還更佳為自大概1個星期至大概3個星期，且特別首選為大概一個星期。於組合方面，每次免疫查核點調節劑投藥之 間的時間間隔可以自大概2天變化至大概8個星期，有利地為自大概1個星期至大概6個星期，較佳為每3個星期。
較佳的治療方案涉及於大概1至3個星期間隔以107或109pfu之MVA-為基的治療疫苗投藥4至15(4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15)次，穿插每2或3個星期以3至10mg/kg的抗免疫查核點抗體投藥2至6次。為說明之用，較佳的投藥計劃包含每星期以大概108pfu的劑量來皮下投藥表現MUC1的MVA載體(例如TG4010)歷時6個星期，以及繼而每3個星期穿插靜脈內投藥一種抗-CTLA4抗體，譬如伊匹單抗(ipilimumab)以每3個星期大概3mg/kg的劑量總共四個劑量。
本發明之組合產物或組成物係用於治療或是預防疾病或是病理病況，尤其是依據本文所述的模態由病原生物或是不需要的細胞分裂引致的該等。一種“疾病”(以及任何形式的疾病，譬如“障礙”或是“病理病況”)典型地特徵在於可辨識的症狀。例示性的疾病包括但不限於：起因於病原生物(諸如，細菌、寄生蟲、病毒、真菌等等)感染的感染性疾病及涉及異常的細胞增殖之增生性疾病，例如腫瘤性疾病(諸如癌症)、類風溼性關節炎以及再狹窄(restenosis)。
本發明亦有關於一種治療方法，其包含以足以治療或預防一種疾病或是一種病理病況的量，或是減輕該疾病及該病理病況相關或關聯性的一或多種症狀的量，投藥治療疫苗及/或一或多種免疫查核點調節劑之組合產物或 組成物於需要其之一個體內，依據本文所述的模態。在一個較佳具體例中，待治療的疾病或是病理病況為一種增生性或感染性疾病(諸如，尤其是慢性感染)。因此，本發明亦有關於一種抑制腫瘤細胞生長的方法，其包含投藥治療疫苗及/或一或多種免疫查核點調節劑之一種組合產物或組成物至需要其之個體內。於本發明的上下文內，依據本發明之方法與使用旨在減慢、治癒、改良或控制靶定疾病的發生或進展。
如本文中所用之術語"癌症(cancer)"包括但不限於：實性瘤及血源性腫瘤。術語"癌症"含括原發性和轉移性癌症二者。可使用本發明之組合及方法治療的癌症之代表性實例包括但不限於：癌(carcinoma)、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤及白血病，以及更具體為：骨癌、胃腸癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、結腸直腸癌、食道癌、口咽癌、喉癌、唾液腺癌、甲狀腺癌、肺癌、頭頸部癌症、皮膚癌、鱗狀細胞癌、黑色素瘤、子宮癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、外陰癌、卵巢癌、乳癌、前列腺癌、內分泌系統癌症、軟組織肉瘤、膀胱癌、腎癌(kidney cancer)、神經膠質母細胞瘤，以及中樞神經系統(CNS)的各種類型等等。本發明對於治療表現PD-L1的癌症是特別有用的(Iwai等人，2005,Int.Immunol.17：133-44)，尤其是轉移性癌症及過度表現MUC1的該等(尤其是其之低醣化形式)，例如腎癌(renal cancer)(諸如透明細胞癌)、前列腺癌(諸如激素不反應前列腺癌)、乳癌(諸如轉移性乳癌)、結腸直腸癌、肺癌(諸如非小細胞肺 癌)肝癌(liver cancer)(諸如肝癌(hepatocarcinoma))、胃癌、膽管癌、子宮內膜癌、胰腺癌與卵巢癌。該癌症較佳為非小細胞肺癌(NSCL)。
可使用本發明之組合及方法治療的感染性疾病之代表性實例包括但不限於：a)病毒疾病，譬如起源於下列感染之該等：疱疹病毒(HSV1、HSV2或VZV)、乳突瘤病毒(HPV)、引致天花或水痘之痘病毒、腸病毒、反轉錄病毒例如引致AIDS之HIV、巨細胞病毒、黃病毒(諸如，引致日本腦炎、C型肝炎、登革及黃熱病)、肝去氧核糖核酸病毒(Hepadnavirus)(諸如HBV)、正黏液病毒(諸如流行性感冒病毒)、副黏液病毒(諸如副流行性感冒病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒及呼吸道融合性病毒(RSV))、冠狀病毒(諸如SARS)、棒狀病毒與輪狀病毒；b)起源於細菌感染的疾病，舉例而言大腸桿菌屬、腸桿菌屬、沙門桿菌屬、葡萄球菌屬、志賀桿菌屬、李斯特菌屬、產氣桿菌屬、螺旋桿菌屬(Helicobacter)、克留氏菌屬(Klebsiella)、變形桿菌屬、假單胞菌屬、鏈球菌屬、披衣菌屬、黴漿菌屬、肺炎雙球菌屬、奈瑟菌屬、芽胞梭菌屬、芽胞桿菌屬、棒狀桿菌屬、分枝桿菌屬、曲桿菌屬、弧菌屬、鋸桿菌屬(Serratia)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、色桿菌屬、布氏桿菌屬、耶氏桿菌、嗜血桿菌屬或博德氏桿菌；以及(c)真菌疾病，包括但不限於：念珠菌病、麴菌病、組織漿菌病、隱球菌腦膜炎；以及d)寄生蟲疾病，包括但不限於：瘧疾、肺囊蟲肺炎(Pneumocystis carnii pneumonia)、利什曼病 (leishmaniasis)、隱胞子蟲病、弓蟲病(toxoplasmosis)，以及錐蟲感染。
典型地，當依據本文所述的模態投藥時，本發明之組合產物提供治療個體超過基線狀態或超過若未治療之預期狀態之治療效益，可藉由臨床狀態超過基線狀態或超過若未以於此所述之組合來治療之預期狀態可觀察到的改善，來證明治療效益。臨床狀態之改善可藉由典型地醫師或其他熟習之醫護人員，使用任何相關的臨床測量法而容易地估定。於本發明的上下文內，治療效益可為短暫性(停止投藥後一或數個月)或持續性(數月或數年)。由於個體彼此之間臨床狀態之自然病程差異大，因此各個體於治療後毋須全部觀察到治療效益，但應有顯著數量之個體出現治療效益(例如，可藉由本技藝已知的任何統計檢測，如塔基參數檢定、克拉斯卡-瓦立斯檢定、依據曼-懷特尼之U檢定、司徒頓t檢定、威爾卡森檢定等，確定兩組別間之統計上顯著差異)。
當該方法旨在治療一增生性疾病，尤其是特別為癌症時，可藉由舉例而言，腫瘤數目降低；腫瘤尺寸降低、轉移數目或程度的降低、緩解期期間的增長、疾病狀態的穩定(亦即未惡化)、延遲或減慢疾病的進展或嚴重性、延長存活、對於標準的治療之較佳的反應、生活品質的改善、降低死亡率等等，來證明治療效益。
當該方法旨在治療一感染性疾病時，可藉由舉例而言以下來證明治療效益：經治療個體之血液、血漿或血 清中所定量的感染病原生物數量之減少，及/或感染性疾病穩定的(未惡化)狀態(諸如，與感染性疾病典型關聯的病況，譬如發炎狀態之穩定)，及/或特異性血清(seric)標誌位準之降低(諸如，於慢性的C型肝炎經常觀察到的肝臟狀況不佳關聯的丙胺酸轉胺酶(ALT)及/或天門冬胺酸轉胺酶(AST)的減少)，與感染性疾病發生有關聯的任何抗原位準之減少及/或對病原生物的抗體位準之出現或修正，及/或治療個體對於習用療法(諸如抗生素)之反應改善及/或延長存活，其係相較於若未接受組合治療之預期的存活而言。
可以使用適當的測量法，譬如血液試驗、生物流體與活體組織切片之分析法，以及醫學成像技術來估定臨床的效益。其等可以在投藥之前(基線)及在治療期間的各種時間點執行，及在治療作用停止後執行。就一般指導而言，此等測量法係在醫學實驗室及醫院中進行例行性評估，並且市場上可買到多種套組(諸如免疫分析法，定量PCR分析法)。
較佳地，本發明之組合產物係使用於或投藥用於引出或刺激及/或重定向(redirecting)治療的個體內之免疫反應。因此，本發明亦含括一種用於引出或刺激及/或重新定向(re-orienting)(諸如對於腫瘤或感染細胞)免疫反應的方法，其包含將足夠量的依據本文所述的模態之治療疫苗及/或一或多種免疫查核點調節劑之一種組合產物或組成物投藥至需要其之個體內，以便以活化病人的免疫性。
在一個特定的具體例中，本發明之組合產物及方 法可以依據本文所述的模態予以使用，以打破慢性感染及得癌的個體常常遭遇到的免疫耐受性。
該引出、刺激或重定向的(redirected)免疫反應可為專一性(亦即針對抗原決定位/抗原)及/或非專一性(先天性)、體液性及/或細胞性的。在本發明的上下文中，該免疫反應較佳係針對多肽/抗原決定位，尤其是與腫瘤或感染病原生物有關連，之CD4+或CD8+媒介或二者所媒介的一種T細胞反應。
於此所述之組合產物引出、刺激或是重定向免疫反應的能力，可以於活體外(諸如，利用從個體採集的生物樣本)或是於活體內利用各種本技藝標準的直接或間接分析法予以評估。關於可用於評估免疫反應的起始與活化作用的技術之一般說明，參閱舉例而言Coligan等人(1992與1994,Current Protocols in Immunology；ed J Wiley & Sons Inc,National Institute of Health或後續版本)。刺激體液性反應之能力可藉由抗體結合及/或結合競爭來判定(參閱舉例而言Harlow,1989,Antibodies,Cold Spring Harbor Press)。可藉由例如測量NK/NKT-細胞(如代表性及活化位準)以及IFN相關細胞介素及/或生產化學激活素的級聯反應、TLR及其他先天免疫性標誌的活化作用(Scott-Algara等人，2010 PLOS One 5(1),e8761；Zhou等人，2006,Blood 107,2461-2469；Chan,2008,Eur.J.Immunol.38,2964-2968)，而執行非專一性免疫性之評估。舉例來說可藉由使用例行性生物分析法(如藉由ELISpot、藉由多參數流動式細胞測量 術或ICS、藉由使用多套式技術或ELISA的細胞介素廓型分析所進行之T細胞特徵分析及/或量化作用），而量化由活化T細胞及包括該等從CD4+與CD8+T細胞所衍生者所產生的細胞介素；藉由測定T細胞的增殖能力(如藉由[3H]胸苷嵌入分析法進行之T細胞增殖分析法)；藉由分析對於敏化個體中之抗原專一性T淋巴球的細胞毒性能力；或是藉由適當動物模式之免疫作用，而評估細胞免疫性。舉例而言，可以使用實驗室中例行使用的技術(諸如，流動式細胞測量術、組織學)來執行腫瘤的監測。亦可以使用各種可得到的抗體以便辨識治療的個體體內存在、涉及抗腫瘤反應之不同的免疫細胞族群，譬如，胞毒型T細胞、活化的胞毒型T細胞、自然殺手細胞及活化的自然殺手細胞。
設若希望，本發明之組合產物、組成物或方法與能有效用於治療或預防待治療或預防的疾病或病理病況有效的一或多種習知治療模態(例如化學治療、放射及/或手術)，可以結合來使用或進行。此等習知療法可在如本發明之組合或方法之後或同時投藥至個體。
可用於結合本發明之組合產物、組成物或方法之習用的治療藥物的代表性實例包括尤其是亞硝基脲(nitrosourea)、抗生素、抗代謝劑、抗有絲分裂劑、抗病毒藥物(諸如干擾素α)、單株抗體、訊息發送抑制劑，以及癌症療法中例行使用的化療藥物。可以更詳細地列舉：围烷化劑例如舉例而言，絲裂黴素(mitomycin)C、環磷醯胺(cyclophosphamide)、白消安(busulfan)、異環磷醯胺 (ifosfamide)、異環磷醯胺(isosfamide)、黴法蘭(melphalan)、六甲三聚氰胺(hexamethylmelamine)、噻替派(thiotepa)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)或氮烯唑胺(dacarbazine)；围抗代謝劑例如舉例而言，吉西他濱(gemcitabine)、卡培他濱(capecitabine)、5-氟脲嘧啶(5-fluoruracil)、阿糖胞苷(cytarabine)、2-氟脫氧胞苷(2-fluorodeoxy cytidine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、艾達曲沙(idatrexate)、妥妙得適(tomudex)或三甲曲沙(trimetrexate)；围拓撲異構酶II抑制劑例如舉例而言，多索魯濱(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依託泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)或米托蒽醌(mitoxantrone)；围拓撲異構酶I抑制劑例如舉例而言，伊立替康(irinotecan)(CPT-11)、7-乙基-10-羥基-喜樹鹼(7-ethyl-10-hydroxy-camptothecin)(SN-38)或拓撲替康(topotecan)；围抗有絲分裂藥物例如舉例而言，太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多烯紫杉醇(docetaxel)、長春花鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)或脫水長春花鹼(vinorelbine)；围鉑衍生物例如舉例而言，順鉑(cisplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、螺鉑(spiroplatinum)或是卡鉑(carboplatinum)；围酪胺酸激酶受體抑制劑例如，舒尼替尼(sunitinib)(Pfizer)、索拉非尼(sorafenib)(Bayer)、吉菲替尼(gefitinib)、爾羅替尼(erlotinib)及拉帕替尼(lapatinib)；以及围抗體(尤其是抗腫瘤性西妥昔單抗(cetuximab)、帕尼 單抗(panitumumab)、扎魯木單抗(zalutumumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、馬妥珠單抗(matuzumab)或是人類表皮生長因子受體-2抑制劑(尤其是曲妥珠單抗(trastuzumab))；以及影響血管形成的製劑，例如舉例而言，血管內皮生長因子抑制劑(尤其是貝伐單抗(bevacizumab)或蘭尼單抗(ranibizumab)；围傳統用來對抗感染性病原生物的抗生素，例如尤其是胺基苷類、安莎黴素(Ansamycins)、碳青黴烯(Carbapenems)、頭孢菌素(Cephalosporins)、醣肽、大環內酯(Macrolides)、青黴素(Penicillin)、喹諾酮(Qionolone)及四環黴素(tetracycline)；可以特別地列舉治療Mtb感染之第一線療法中現在使用的抗生素，例如異煙肼(isoniazid)、利福黴素(rifamycin)(諸如，利福平(rifampin)、環戊利福平(rifapentine)及利福布汀(rifabutin))、乙胺丁醇(ethambutol)、鏈黴素(streptomycin)、吡嗪醯胺(pyrazinamide)及氟喹諾酮(fluoroquinolone)，以及已經展現抗藥性的Mtb-感染的個體之"第二線"療法中使用的該等，例如氧氟沙星(ofloxacin)、環丙沙星(ciprofloxacin)、乙硫異煙胺(ethionamide)、胺基水楊酸、環絲胺酸、艾米康絲菌素(amikacin)、卡那黴素(kanamycin)及卷曲黴素(capreomycin)；围抗病毒治療例如，干擾素α(IFNa與聚乙二醇化的衍生物)以及核苷/核苷酸類似物(NUCs)。舉例而言，拉米呋啶(lamivudine)、恩替卡韋(entecavir)、替比夫定 (telbivudine)、阿德福韋(adefovir)以及替諾福韋(tenofovir)為目前用於治療HBV。其他的抗病毒劑包括合適用於治療C型肝炎之蛋白酶抑制劑(諸如絲胺酸蛋白酶抑制劑，如Vertex的VX950)、聚合酶抑制劑以及解旋酶抑制劑；围TLR促效劑及N-醣化抑制劑；围介白素(諸如IL-2、IL-6、IL-15、IL-24等等)、干擾素(諸如IFN α、IFN β或IFN γ)、腫瘤壞死因子(TNF)、群落刺激因子(諸如GM-CSF、C-CSF、M-CSF等等)及化學激活素(諸如CXCL10、CXCL9、CXCL11等等)；围靶定與標靶疾病有關連之感染性病原生物基因或細胞基因之siRNA及反義寡核苷酸。
根據一個有利的具體例，尤其是當該治療疫苗配備有自殺基因時，依據本發明之組合產物或方法可以與對應的前驅藥(見表1)結合使用。前驅藥係依照標準的實施(諸如，口服、系統性等等)予以投藥。較佳地，於治療疫苗投藥之後，進行前驅藥投藥(諸如，於投藥編碼自殺基因的治療疫苗至少3天之後)。口服途徑為較佳的。投藥單一劑量的前驅藥或是一段時間後予以重複的劑量，經歷時足夠長的時間可能於個體內生產毒性代謝物。作為實例說明，50至500mg/kg/天的劑量，有利地200mg/kg/天的劑量，或是較佳地100mg/kg/天的劑量是適當的。
本發明之組合產物及方法亦可以組合以一或多種佐劑或"免疫刺激物"使用來提升免疫力(尤其是T細胞媒介的免疫性)，諸如經由像是TLR-7、TLR-8及TLR-9之類鐸 受體(TLR)。為說明之用，此等佐劑包括但不限於：明礬；礦物油乳劑諸如弗氏(Freund)完全與不完全佐劑(IFA)；脂多醣(Ribi等人，1986,Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins,Plenum Publ.Corp.,NY,p407-419)；皂素諸如ISCOMATRIX、AbISCO、QS21(Sumino等人，1998,J.Virol.72：4931；WO98/56415)；咪唑-喹啉化合物，諸如咪喹莫特(Imiquimod)(Suader,2000,J.Am Acad Dermatol.43：S6)；S-27609(Smorlesi,2005,Gene Ther.12：1324)及諸如WO2007/147529中所述的該等相關化合物；陽離子胜肽諸如IC-31(Kritsch等人，2005,J.Chromatogr Anal.Technol.Biomed.Life Sci.822：263-70)；多醣，例如Adjuvax及鯊烯，如MF59。其他合適的佐劑包括ds RNA像NAB2及脂質感染素(Lipofectin)(Claudepierre等人，2014,J.Virol 88：5242-55)或是3pRNA(Hornung等人，2006,Science 314：994-7)，二者均會經由活化細胞質的解旋酶MDA-5及RIG-1來刺激IFNα反應。
任擇地或以組合方式，如本發明之組合或方法亦可以與放射療法結合。熟悉此藝者可容易地制定適當的放射療法方案及參數(參閱舉例而言，Perez and Brady,1992,Principles and Practice of Radiation Oncology，第2版，JB Lippincott Co；使用如熟習此技術領域者顯而易見之適當改進及修正)。癌症治療可使用之放射療法類型為本技藝熟知的，且包括電子束、來自直線加速器或來自放射性源之高 能光子，例如鈷或銫、質子及中子。
本發明亦提供套組，其包括套組形式之本發明的組合產物之活性實體。一種套組為一種包裝組合，選擇性地，包括使用說明，選擇性地加上其他的組分。在一個具體例中，一種套組包括至少於此所討論之治療疫苗於一容器內，以及於此所描述之一或多種免疫查核點調節劑於另一容器內。此等容器較佳為無菌的玻璃或塑膠小瓶。一種較佳的套組包含一種MVA-為基的治療疫苗(諸如，一種表現腫瘤關聯性MUC1抗原及人類IL-2之MVA病毒)及一種免疫查核點調節劑，其係專一地結合至CTLA-4(諸如抗-CTLA-4抗體，例如伊匹單抗(ipilimumab))。另一種較佳的套組包含一種MVA-為基的治療疫苗(諸如，一種表現腫瘤關聯性MUC1抗原及人類IL-2之MVA病毒)及一種免疫查核點調節劑，其係專一地結合至PD-1(諸如抗PD-1抗體，例如納武單抗(nivolumab)或蘭博利速單抗(lanbrolizumab))。另一種較佳的提供套組包含一種MVA-為基的治療疫苗(諸如，一種表現腫瘤關聯性MUC1抗原及人類IL-2之MVA病毒)及一種免疫查核點調節劑，其係專一地結合至PD-L1(諸如抗-PD-L1抗體，例如MPDL3280A或BMS936559)。選擇性地，該套組可包括合適用於執行活性劑的投藥之裝置。該套組可亦包括包裝說明書，其包括關於套組內組成或個別的組分及劑量形式的資訊。
上文所引述的所有專利案、發表文獻及資料庫項目的揭露內容係在此完整地逐一併入本案以為參考資 料，如同各專利案、發表文獻及資料庫項目係逐一與個別地顯示併入本案以為參考資料。
圖1係說明投藥調配物緩衝液(媒液)、MVATG18124單獨、抗PD-1殖株RMP1.14單獨、MVATG18124及抗PD-1殖株RMP1.14二者之組合，以及MVATG18124及大鼠IgG2a同型對照二者之組合，於皮下CT26-CL25腫瘤模式中對於腫瘤體積(圖1A)及小鼠存活(圖1B)的效應。
圖2係說明投藥空的MVA(MVATGN33.1)、MVATG18124單獨、抗CTLA-4抗體單獨、其之IgG2b同型對照、MVATG18124及抗CTLA-4二者之組合，以及MVATG18124及IgG2a同型對照二者之組合，於轉移性CT26-CL25腫瘤模式中對於小鼠存活的效應。
圖3A係說明得自於未治療的(亦即初始的(naïve))小鼠或是用MVATG18124、抗-CTLA-4以及MVATG18124與抗-CTLA-4二者治療的小鼠解離的肺內，圈選的CD8+CD3暗淡的細胞(以下稱為CD8暗淡的CD3暗淡的)百分率。圖3B係說明來自用抗-CTLA-4以及MVATG18124治療的小鼠之CD3/CD8點墨跡肺細胞內，CD8暗淡的CD3暗淡的(於圖中稱為CD8+CD3暗淡的)族群之實例。
圖4描繪得自於未治療的(亦即初始的(naïve))小鼠或是用MVATG18124、抗-CTLA-4以及二者治療的小鼠之肺樣本，於ConA誘導後獲得的IFN-γ陽性的CD8暗淡的CD3暗淡的細胞 族群。圖4A：用bmDCs孵育肺細胞以幫助活化後，ConA-誘導IFNγ+CD8暗淡的CD3暗淡的細胞百分率之誘導倍數。圖4B：用抗-CD28孵育肺細胞以幫助活化後，ConA-誘導IFNγ+CD8暗淡的CD3暗淡的細胞百分率之誘導倍數。
圖5係說明用β-gal-專一性胜肽T9L3刺激的脾臟淋巴球之ELIspot分析法，其顯示用MVATG18124治療的脾臟淋巴球之β-gal專一性反應。原始數據轉換成直方圖。結果係表現為各三重複或四重複之每1 x 106個脾細胞之斑點形成單位(sfu)數目(平均)。
圖6描繪CD8暗淡的CD3暗淡的細胞族群內的IFN-γ、CD107a及KLRG1陽性細胞之誘導，該細胞族群係獲得自用T9L-3胜肽(劃影線的)或不相關的T8G胜肽(劃點的)予以刺激，接著用空的載體MVATGN33.1單獨或組合以抗-CTLA-4、MVATG18124單獨或組合以抗-CTLA-4或是抗-CTLA-4單獨予以治療的肺樣本。
圖7係說明用TG4010治療於CT26-MUC1腫瘤模式中對於小鼠存活及腫瘤體積提供的效應。圖7A：CT26-MUC1肺腫瘤模式。CT26-MUC1細胞係經iv.注射。於第2天與第9天，5.107pfu TG4010、空的MVA載體(MVATGN33.1)或是緩衝液(SO8)係經靜脈內注射。每星期秤重小鼠二次且當損失(loosing)10%重量時犧牲小鼠。監測存活百分比。圖7B：CT26-MUC1 s.c.腫瘤模式。CT26-MUC1細胞係經s.c.注射。於第2天與第9天，1.107pfu TG4010、空的MVA現載體(MVATGN33.1)或是緩衝液(SO8)係經s.c.注射於相同側 的。腫瘤大小達到2000mm3時犧牲小鼠。顯示平均腫瘤體積加上SEM。
圖8係說明用TG4010治療組合以抗PD-1抗體於CT26-MUC1 s.c.腫瘤模式中對於小鼠存活(圖8A)及腫瘤體積(圖8B)提供的效應。BALB/c小鼠係以2.105個CT26-MUC1細胞予以s.c.注射。於第2天與第9天腫瘤植入之後，小鼠係以次最佳劑量1.106pfu的TG4010(亦稱為MVATG9931)或是空的對照載體予以s.c.治療，接著於第10天、第13天、第15天與第17天，經由i.P.投藥250μg抗PD-1(RMP1.14，IgG2a，BioXCell)。腫瘤大小達到2000mm3時犧牲小鼠。隨時間監測存活百分比及平均腫瘤體積。
圖9係說明BALB/C小鼠之存活，經s.c.注射CT26-MUC1腫瘤細胞，以及於第2天與第9天用1 x 107PFU的MVATGN33.1或MVATG9931二次注射予以免疫，接著於第10天、第13天、第15天與第17天i.p.投藥250μg的抗-PD-1 Ab。(*：p<0.05；**：：p<0.01；***：p<0.001)。
較佳實施例之詳細說明
吾人提出要組合免疫查核點封阻方法與治療MVA載體，目標是以MVA誘發抗原專一性T細胞免疫反應且用免疫查核點抗體來釋放對T細胞產生之箝制。於小鼠腫瘤模式中展示了免疫查核點阻斷劑組合病毒載體之協同效應的預臨床證明。此暗示i)小鼠-專一性抗免疫查核點抗體，以及ii)一種表現抗原MVA載體之用途。
此等研究所挑選的MVA載體(MVATG18124)含有編碼β-半乳糖苷酶Ag模型之細菌LacZ基因(序列辨識編號：3)，於痘病毒啟動子pH5R(序列辨識編號：4)的控制之下。利用適當的引子、藉由PCR擴增而自牛痘病毒哥本哈根株單離pH5R啟動子。利用引子otg19678(序列辨識編號：5)及otg19679(序列辨識編號：6)且用pCMVBeta(Clontech)作為DNA模版，透過PCR擴增而獲得大腸桿菌LacZ基因。將pH5R及LacZ基因選殖至穿梭載體內，依據GenBank序列EF675191.1係介於位置142006延伸至至142987之間的MVA序列以及介於位置142992延伸至143992之間的MVA序列。藉由使穿梭載體轉染至事先經MVA-感染的CEF之內，引致穿梭載體DNA及MVA的基因體之間的同源重組，以及插入pH5R-LacZ匣至於缺失III中，而於雞胚胎纖維母細胞(CEF)細胞內生產MVATG18124。使用習用的技術(Lullo等人，2010,J Virol Methods 163：195-204)來單離重組MVA殖株，並且選擇出的殖株係於PCR的控制之下，接著於CEF細胞內擴增。病毒原液係藉由溶菌斑分析法而於DF1細胞上滴定。藉由DNA定序法來檢查插入的DNA及周圍區域內沒有突變係。
首先挑選用一種適當的抗體來靶定免疫查核點阻斷劑小鼠PD-1(mPD-1)。挑選大鼠抗mPD-1抗體RMP1-14(BioXcell)。此抗體顯示出封阻mPD1與其之配體的交互作用(Yamazaki等人，2005,J.Immunol.175(3)：1586-92)。
以二種小鼠模式，分別為轉移性及皮下的腫瘤模式，於活體內測試mPD-1抑制劑與表現抗原的MVATG18124之組合。以LacZ基因轉導且穩定表現β-半乳糖苷酶之結腸癌細胞株CT26.CL25(ATCC CRL-2639)，予以皮下注射以產生可觸知的腫瘤(皮下的模式)或是靜脈內注射以產生肺轉移。繼而用表現β-半乳糖苷酶之MVATG18124及小鼠-專一性免疫查核點阻斷劑像是抗PD-1或是抗CTLA-4抗體，來治療小鼠。
實施例1：MVATG18124偕同抗-PD-1 Mab之組合
以皮下的腫瘤模式在活體內測試mPD-1抑制劑(商業殖株RMP1-14；BioXCell)偕同表現β-gal-MVATG18124之組合。Balb/c小鼠皮下注射2x105個CT26.CL25細胞。於細胞植入之後第2天與第9天，小鼠繼而用1x104pfu的MVATG18124或是作為陰性對照之調配物媒液予以靜脈內免疫，組合以第10天、第13天、第15天與第17天4次腹膜內(ip)投藥250μg的小鼠抗PD1抗體RMP1.14(BioXcell)或是其之同型對照IgG2a(殖株2A3)。換句話說，具有10隻小鼠的5個組係予以測試；第一組用接受2次iv注射之MVATG18124治療(第1組)；第二組用4次ip注射抗PD-1抗體予以治療(第2組)；第三組用MVATG18124與抗PD-1抗體二者治療，接受2次iv注射治療MVA及4次ip注射抗PD-1抗體(第3組)；第四組接受2次iv注射治療MVATG18124及4次ip注射同型的抗體(第4組)，以及對照組接受調配物緩衝液(第5組)。隨時間測量腫瘤生長及存活， 如同圖1中所說明者。
不出所料，接受調配物緩衝液的對照組之腫瘤體積增加非常快速。接受mPD-1抗體的組別亦觀察到快速的腫瘤生長。接受MVATG18124單獨或是組合以同型對照之組別中察看到腫瘤體積之稍微延遲。於注射MVATG18124及mPD-1抗體二者之“組合”的組別中，腫瘤生長大大地降低(圖1A)。對於小鼠存活之效應是更明顯的，因用MVATG18124與mPD-1抗體二者治療之大約70%的小鼠於腫瘤細胞植入後超過100天仍然活著，相對於MVATG18124治療動物組之10%(顯著差異)。對比之下，對照、抗體治療及同型治療動物於少於50天內均死亡(圖1B)。
實施例2：MVATG18124偕同抗-CTLA-4 Mab之組合
以轉移性CT26-CL25模式在活體內測試CTLA-4抑制劑(商業殖株9D9；BioXCell)偕同表現抗原MVATG18124之組合。Balb/c小鼠靜脈內(iv)注射2x105個CT26.CL25細胞。於第2天與第9天，編碼β-半乳糖苷酶之MVATG18124或是其之空載體對照MVAN33.1係以1.104pfu的劑量予以iv投藥。於第3天與第10天，腹膜內(ip)注射250μg的小鼠抗-CTLA4抗體9D9(BioXCell)或是其之IgG2b同型對照(殖株MPC-11 BioXCell)。小鼠之存活追蹤超過60天。確認病毒劑量1.104pfu為增高此腫瘤模式的存活率之最佳劑量(數據未顯示)。
如同圖2中所說明，用抗CTLA-4抗體或其之同型對照單獨治療者顯示出微弱的效應，比得上空的MVA載體 MVATGN33.1觀察到的該等效應(於第20天全部三組為35%存活)。對比之下，用MVATG18124單獨或組合以同型對照治療，使小鼠的存活增高(於第35天二組均為35%存活)。MVATG18124及抗-CTLA4抗體之組合治療的小鼠組別使35%存活百分率大幅地增加至超過60天。
因此，吾人明確地展現出治療性MVA-為基的免疫治療疫苗及免疫查核點阻斷劑抗CTLA4之明顯的抗腫瘤效應。
實施例3：於治療小鼠解離的肺內之淋巴細胞族群研究 IFNγ陽性CD8 暗淡的 CD3 暗淡的 細胞之判定
檢查抗-CTLA-4抗體表現抗原MVA或是二者治療的小鼠，以及未治療的(亦即初始的(naïve))小鼠內之細胞反應。每組五隻BALB/c小鼠於第1天及第8天iv注射MVATG18124(1.104pfu)或是於第2天與第9天ip注射250μg抗CTLA-4(殖株9D9，BioXCell)或是二者。第15天犧牲小鼠，並且單離肺臟。將每組五隻全體的肺臟匯集，於C形管(Miltenyi)內切成小塊，以及使用Gentle OctoMACS(Miltenyi)、按照製造商的建議、利用組織解離套組(Miltenyi，130-096-730)進行酵素解離。
肺衍生的細胞係以2.106個細胞/井(96井平盤)予以平盤培養於T細胞專一性培養基(TexMACS，Miltenyi)內。藉由與裝載胜肽的骨髓衍生小鼠樹狀細胞(bmDCs)：源自BALB/c小鼠的bmDCs係產自於小鼠GM-CSF(Peprotech，100μg/ml)存在歷時10天之下而成熟的 骨髓細胞，共培養來活化細胞。任擇地，可透過以1μg的抗CD28(殖株PV-1)予以孵育來促進活化。刀豆球蛋白A(ConA，5μg/ml)擔任非特異性活化劑。添加抗CD107a抗體(殖株eBiolD4B)來標示去顆粒細胞。藉由添加GolgiPlug/Brefeldin(1：1000，BD Biosciences)孵育一小時之後，阻斷細胞介素之分泌。於5小時總孵育時間之後，清洗細胞以及染色生存力(LiveDead，Fixable violet死細胞染色套組)及表面標誌CD8a(殖株53-6.7)與CD3 ε(殖株145-2C11)。細胞係使用BD Cytofix/Cytoperm套組(BD Biosciences)進行細胞內染色IFN-γ(殖株XMG1.2)。固定細胞以及透過流動式細胞測量術(Navios,Beckman Coulter)予以分析。
MVATG18124與抗CTLA-4於初始的BALB/c小鼠之組合治療導致肺臟中出現淋巴球細胞亞群稱為CD8暗淡的CD3暗淡的。圖3B係描繪來自用抗CTLA-4以及MVATG18124治療的小鼠之CD3/CD8點墨跡肺細胞內，CD8暗淡的CD3暗淡的族群之實例。圈選活的淋巴球，二個獨立實驗中圈選的CD8暗淡的CD3暗淡的細胞之百分率係描繪於圖3A中。更明確地，於用MVATG18124治療之後且甚至是用MVATG18124+抗CTLA-4的組合治療之後，CD8暗淡的CD3暗淡的之族群明確地增加。
然後，估定CD8暗淡的CD3暗淡的族群中細胞內IFN γ+細胞之百分率。於此CD8暗淡的CD3暗淡的族群內，MVATG18124+抗CTLA-4治療的小鼠觀察到IFN-γ+細胞之最高的誘導 (圖4A與4B)。
總而言之，初始的BALB/c小鼠之MVATG18124及抗CTLA-4的組合治療導致導致肺臟中出現CD8暗淡的CD3暗淡的淋巴球細胞族群。當用ConA刺激以及來自MVATG18124+抗CTLA-4治療的小鼠之高百分率的CD8暗淡的CD3暗淡的可以誘導以分泌IFN-γ。
CD3暗淡的CD8暗淡的細胞族群係予以更詳細地分析。
‧在吾人的分析過程中，吾人觀察到CD3暗淡的CD8暗淡的族群為類殺手細胞凝集素受體G1(KLRG1+)陽性及CD127(IL-7Rα)陰性或低的(CD127-/低)。此表現型與經歷過抗原的短壽命效應細胞(short lived effector cells)(SLECs)有關聯(Obar等人，2011,J Immunol.,doi：10.4049/jimmunol.1102335；Sarkar等人，2008,J Exp Med 205(3)：625-40)。
‧浸潤/出現於MVATG18124及抗-CTLA-4治療的小鼠之肺臟內之CD3暗淡的CD8暗淡的KLRG1+族群，對抗原-專一性刺激反應以及IFN-γ分泌與去顆粒(CD107a)。
CD8 暗淡的 CD3 暗淡的 細胞族群之IFN-γ、CD107a及KLRG1陽性細胞的判定
如上所述，BALB/c小鼠係以1.104pfu之MVA-β-gal或是空的載體MVATGN33.1予以i.v.注射。於第3天與第10天，小鼠經i.p.接受250μg的抗CTLA-4。第14天取得肺臟以及予以酵素解離。肺衍生的細胞係以2.106個細胞/井(96井平盤)予以平盤培養於T細胞專一性培養基 (TexMACS,Miltenyi)內，透過用1μg的抗CD28(殖株PV-1)孵育來活化，以及用β-gal專一性胜肽(T9L-3)或是對照胜肽(T8G)予以刺激，於抗CD107a抗體(殖株eBiolD4B)存在下以標示去顆粒細胞。藉由添加GolgiPlug/Brefeldin(1：1000，BD Biosciences)孵育一小時之後，阻斷細胞介素之分泌。於5小時總孵育時間之後，清洗細胞以及染色生存力(LiveDead，Fixable violet死細胞染色套組)及表面標誌CD8a(殖株53-6.7)、CD3 ε(殖株145-2C11)與KLRG1(殖株2F1/KLRG1)。細胞係使用BD Cytofix/Cytoperm套組(BD Biosciences)進行細胞內染色IFN-γ(殖株XMG1.2)。固定細胞以及透過流動式細胞測量術(Navios,Beckman Coulter)予以分析。於5小時之後，細胞及染色的CD8a，。
以MVATG18124或是空的對照載體，且甚至是MVATG18124及抗CTLA-4之組合治療初始的(naïve)BALB/c小鼠，導致肺臟中出現CD8暗淡的CD3暗淡的KLRG1+淋巴球細胞族群。擬體內以β-gal胜肽T9L-3刺激時，此族群會分泌IFNγ且去顆粒(CD107a)，以及如同圖6中所說明，用MVATG18124與抗CTLA-4治療之後的百分率，比用對照載體(MVATGN33.1單獨或是偕同抗CTLA-4)、用MVATG18124單獨或是用抗CTLA-4單獨治療的其他組別更高。不出所料，用不相關的胜肽(T8G胜肽)刺激不會產生此種誘導。
總之，以MVATG18124與抗CTLA-4治療使肺臟中CD3暗淡的CD8暗淡的KLRG1+細胞族群之b-gal專一性反應增 高。
實施例4：IFN-γ之分泌
再者，以1.104pfu(D1及8)之MVATG18124或是MVAN33.1以及抗CTLA-4或是其之同型對照(D2及D9，250μg ip)治療BALB/c小鼠以後，調查IFNγ分泌的脾臟淋巴球的數目。於第14天用ELISpot(酶聯免疫斑點法)分析法來執行測量。
平盤製備
在實驗前一天，膜ELISpot平盤(Millipore，ref.MSIPS4W10)係以每井15μL的35%乙醇予以預潤濕且孵育時間為2分鐘。平盤係以每井200μL的無菌水予以清洗五次。
以無菌的DPBS(Sigma,ref.D8357)(100μL/井)稀釋、15μg/mL之大鼠抗小鼠IFN-γ單株抗體(AN18 Mabtech,ref.3321-3-1000)來塗覆ELISpot平盤。將平盤覆蓋且於4℃下孵育過夜。第二天，平盤用無菌的PBS(200μL/井)予以清洗3次，以及於37℃下以200μL/井的完全RPMI1640培養基(RPMI1640培養基，(Sigma R0883)；L-麩醯胺酸2mM、(Sigma G6392)；健他黴素0.01g/L(Schering Plough U570036)；胎牛血清10%(JRH 12003-1000M)550μl的5x10-2M b巰乙醇(bmercaptoethanol))溶液，予以飽和歷時1小時。
樣本製備
為了評估免疫作用所誘導的擬體內專一性CD8+ T細胞之頻率，於最後的免疫作用7天之後，安樂死的動物進行脾切除術。相同組別的脾臟予以匯集於含有5mL的完全培養基之6井培養平盤的細胞濾網內。用注射器活塞來壓碎脾臟，且丟棄細胞濾網。用8mL的完全培養基收集脾細胞，以及轉移至15mL法爾康(falcon)管中。脾細胞懸浮液覆蓋4mL的Lympholyte®-M分離細胞培養基(Cedarlane，ref.CL5035)並且離心(20分鐘，1500 xg，室溫)。收集含有淋巴球之分界面，以及用10mL的PBS予以沖洗3次。在每次沖洗步驟之間，離心細胞(以400 xg歷時4分鐘)且丟棄上清液。藉由添加無菌水稀釋的2mL的RBC緩衝液1 x(10 x溶液：BD Pharm LyseTM溶解溶液，ref.555899)於淋巴球片狀沈澱物上，來溶解剩餘的紅血球。於添加溶解溶液之後立即溫和地震盪各管，且於室溫下孵育15分鐘。添加10mL DPBS來停止(topped)溶解作用，接著以400 xg.離心4分鐘，使細胞再懸浮於10mL的完全RPMI 1640培養基內。用Z2細胞計數器(Beckman Coulter)來計數細胞，以及調整成每mLRPMI 1640培養基內1 x 107個細胞之細胞濃度。
分析法
為了執行ELISpot分析法，將各組100μL的淋巴球懸浮液(1x 106個細胞)添加至經塗覆的96-井平盤之各井中。以三重複或四重複方式測試一假定的條件。將一百微升各種指示的的胜肽(2μg/mL配於完全RPMI 1640培養基內)添加至細胞懸浮液。ConA(Sigma，ref.C5275)係使用作為陽性對照(5μg/mL的終濃度)MVA-專一性胜肽(S9L-8)係 使用為免疫作用對照。平盤繼而於5% CO2中、在37℃下孵育16至20小時。接著，平盤係用DPBS(200μL)清洗3次。生物素化的大鼠抗小鼠IFN-γ單株抗體(Mabtech，ref.3321-6-1000)係以抗體混合緩衝液(PBS,0.5% SVF)稀釋成1μg/mL，以及以100μL/井分配。平盤係於室溫下在黑暗中孵育2小時，然後以DPBS(200μL)清洗3次。將一百微升的Extravidin-磷酸鹽緩衝液(SIGMA，ref.E2636)(以抗體混合緩衝液1/5000稀釋)添加至各井且平盤在黑暗中於室溫下孵育1小時。平盤最後以DPBS(200μL)清洗3次。將一百微升BCIP/NBT(Sigma，ref.B5655，一劑(caps)配於10mL MilliQ水內)添加至各井直到藍色斑點顯現，然後以自來水徹底地清洗平盤，以及乾燥。
資料獲取
用一種ELISpot讀數器(CTL免疫斑點讀數器，S5 UV)來計數斑點。各井執行視覺品質管制(比較機器掃描及平盤)以確保ELISpot讀數器提供的總數與圖像的實際狀況匹配。結果係表現為各三重複或四重複之每1 x 106個脾淋巴球之斑點形成單位(sfu)數目(平均)。用DFR(eq)方法(Moodie等人，Cancer Immunol Immunother.2010 Oct；59(10)：1489-501)或是由空白井之斑點平均數加上此斑點平均數的二倍標準偏差而計算出的經驗截止，來判定專一性ELISpot反應。
如同圖5中所示，用β-gal-專一性胜肽T9L3刺激的脾臟淋巴球之ELIspot分析法，顯示用MVATG18124治療 的脾臟淋巴球之β-gal專一性反應。於偕同抗CTLA-4之組合治療後，專一性反應進一步地增高，但是偕同其之同型對照之組合治療後之專一性反應並未進一步增高。非專一性胜肽T8G之刺激顯示IFN-β分泌細胞沒有增加。實施例5：TG4010(MVA-MUC1-IL-2)及抗PD-1(RMP1.14)於MU1-陽性CT26-為基的腫瘤模式之組合效應
TG4010為一種MVA載體編碼人類MUC1及人類IL-2之完整的cDNA序列。此載體提供的抗腫瘤效能係於一種CT26-為基的MUC1-陽性細胞株中進行測試，該細胞株於s.c.注射之後產生MUC1-陽性腫瘤，以及於i.v.注射之後產生肺腫瘤。
CT26-MUC1細胞株之生成
小鼠結腸癌細胞株CT26 WT(ATCC CRL-2638)係穩定地轉染以質體pTG5077，質體pTG5077編碼處於CMV啟動子控制下的人類MUC1以及處於SV40啟動子控制下的G418-抗性基因之完整的cDNA序列。CT26細胞係藉著Lipofectamine LTX偕同pTG5077予以轉染，以及於0.4mg/ml G418存在下進行培養以選擇出穩定的轉染物(transfectant)。於14天之後，活細胞係用一種對抗MUC1單株抗體(H23+二級抗體山羊抗小鼠-FITC)予以標示。分選出陽性細胞(FACS ARIA)、以1個細胞/井轉移於96井平盤內。藉著流動式細胞測量術來分析過度生長的殖株之穩定的MUC1表現，一直到轉染後第60天。繼而四個穩定表現MUC1殖株測試其等於sc注射後以及於iv注射後於BALB/c 小鼠內誘導腫瘤生長的能力。於驗證s.c.-植入的腫瘤及iv注射後獲得的肺腫瘤為MUC1-陽性之後，保留一殖株。
TG4010於CT26-MUC1腫瘤模式內之治療效能
2.105個CT26-MUC1細胞係經s.c或i.v.注射至BALB/c小鼠以分別產生sc腫瘤或肺腫瘤。於第2天與第9天腫瘤挑戰之後，小鼠分別以1.107 TG4010或空的對照載體MVATGN33.1予以s.c.或i.v.治療。隨時間監測平均腫瘤體積及存活百分比。TG4010於iv/iv肺腫瘤模式中顯示出存活的顯著改善(p=0,00642)，以及於sc/sc腫瘤模式中顯示出腫瘤生長顯著縮減(分別參見圖7A及7B)。
TG4010組合以抗-PD1於CT26-MUC1腫瘤模式內之治療效能
BALB/c小鼠係以2.105個CT26.MUC1細胞予以s.c.注射。於第2天與第9天腫瘤植入之後，小鼠係以次最佳劑量1.106pfu的TG4010(亦稱為MVATG9931)或是空的對照載體(MVATGN33.1)予以s.c.治療。於第10天、第13天、第15天與第17天，小鼠接受250μg抗PD-1(RMP1.14，IgG2a，BioXCell)。腫瘤大小達到2,000mm3時犧牲小鼠。隨時間追蹤腫瘤體積及動物存活。
如同圖8B中所說明，不出所料，於接受調配物緩衝液的對照組中，腫瘤於第16天開始生長，以及腫瘤體積隨時間快速地且規律地增加。於接受mPD-1抗體、TG4010單獨及空的MVATGN33.1單獨或是偕同抗-PD-1之組別中，觀察到腫瘤生長的延遲。對比之下，於注射TG4010及 mPD-1抗體二者之“組合”組別中，腫瘤生長大大地降低。亦觀察到對小鼠存活之效應，如同圖8A中所示。實際上，用TG4010及mPD-1抗體二者治療小鼠，腫瘤植入後超過60天有大約70%仍然活著，然而用空的對照(沒有或是有抗PD-1抗體)治療動物的大概10%及20%仍然活著。分別用TG4010單獨或是偕同抗PD-1抗體治療的動物，只有30及40%於腫瘤植入2個月之後存活。對比之下，用調配物緩衝液治療的對照組在少於45天內死亡。由組合治療提供的增加的存活維持超過時間(於腫瘤植入後120天)(數據未顯示)。
亦進行如以上相同的實驗，除了小鼠治療係用2次注射1.107pfu的MVATG9931(即TG4010)或是陰性MVATGN33.1對照載體，選擇性地接著四次250μg的抗-PD1之i.p.投藥。如同圖9中所說明，與46及49.5天分別用MVATG9931及抗-PD-1治療的小鼠比較，組合治療之存活中位數70天之實質增加仍然是值得注意的。也注意到，當MVATG9931及抗-PD-1治療之組合與對照空的病毒MVATGN33.1及抗-PD-1模態比較，存活增加是顯著的(p=0.008)，暗示著此病毒劑量之MUC-1專一性交互作用。於最高的MVATG9931劑量1 x 107PFU，該組合達到全部測試條件中最好的治療活性，且相比於各治療模態單獨均達到顯著性(p=0.014相比於MVATG9931，以及p<0.001相比於抗-PD-1；圖9)。總之，與各治療單獨比較，MVATG9931偕同抗PD-1抗體之組合允許異位的CT26-MUC1模式得到最好的治療指數，此為這組合療法方法之臨床評估奠定了 基礎。
熟悉此藝者僅僅使用例行實驗，會明瞭或是能夠確定，於此所描述之具體方法及試劑之許多的均等物，其包括替代物、變體、添加、刪除、修飾及取代。此等均等物被認為是落在發明之範疇內，以及由下列的請求項所涵蓋。
<110> 傳斯堅公司
<120> 免疫治療疫苗及抗體之組合治療
<130> B369863-D35869
<150> EP15305215.4
<151> 2015-02-13
<150> EP15305570.2
<151> 2015-04-16
<160> 6
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 557
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
<210> 2
<211> 1674
<212> DNA
<213> 智人
<400> 2
<210> 3
<211> 1047
<212> PRT
<213> 大腸桿菌
<400> 3
<210> 4
<211> 114
<212> DNA
<213> 牛痘病毒
<400> 4
<210> 5
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LacZ選殖用之PCR引子
<400> 5
<210> 6
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LacZ選殖用之PCR引子
<400> 6

Claims (25)

  1. 一種組合產物，其包含至少(i)一治療疫苗以及(ii)一或多個免疫查核點調節劑。
  2. 如請求項1之組合產物，其中該治療疫苗包含一重組質體或病毒載體。
  3. 如請求項2之組合產物，其中該治療疫苗包含一痘病毒，較佳為牛痘病毒，以及更佳為經修飾安卡拉牛痘病毒(MVA)。
  4. 如請求項2之組合產物，其中該治療疫苗包含一人類或動物腺病毒，較佳為選自於以下所組成的群組：腺病毒(Ad)2、Ad3、Ad5、Ad11、Ad24、Ad26、Ad34、Ad35、Ad48、Ad49及Ad50，以及黑猩猩Ad3及Ad63腺病毒。
  5. 如請求項4之組合產物，其中該腺病毒為複製缺陷型。
  6. 如請求項1至5中任一項之組合產物，其中該治療疫苗包含或編碼選自於以下所組成的群組之一或多個多肽：自殺基因產物、免疫刺激性多肽如介白素或群落刺激因子，以及抗原多肽，尤其為腫瘤關聯性抗原或一病原生物的抗原，例如病毒、細菌、寄生蟲等及過敏原。
  7. 如請求項6之組合產物，其中該治療疫苗包含或編碼選自於以下所構成的群組之一或多個多肽：黏蛋白1(MUC1)抗原、人類乳頭狀瘤病毒(HPV)E6及E7抗原，特別為其之非致癌性變異體；人類介白素-2(IL-2)；人類顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)；FCU1自殺 基因；B型肝炎病毒(HBV)抗原，特別為B型肝炎病毒聚合酶(HBV pol)、B型肝炎表面抗原(HbsAg)及/或核心；分枝桿菌抗原；以及C型肝炎病毒(HCV)非結構抗原。
  8. 如請求項7之組合產物，其中該治療疫苗包含：編碼MUC-1抗原及IL-2之MVA病毒；編碼融合的NS3及NS4 HCV抗原以及NS5b抗原之MVA病毒；編碼膜固著的HPV-16非致癌性E6及E7抗原以及IL-2之MVA病毒；編碼FCU1自殺基因之MVA病毒；編碼結核分枝桿菌(TB)抗原之組合的MVA病毒或是編碼HBV抗原之組合的腺病毒(Ad)載體。
  9. 如請求項1至8中任一項之組合產物，其中該一或多個免疫查核點調節劑係選自於以下所組成的群組：胜肽配體、天然受體的可溶領域、RNAi、反義分子、抗體以及蛋白支架。
  10. 如請求項9之組合產物，其中該一或多個免疫查核點調節劑為人類或擬人化單株抗體，其係專一地結合至下列的任一者：計畫性死亡-1(PD-1)、計畫性死亡-配體1(PD-L1)、計畫性死亡-配體2(PD-L2)、淋巴球活化基因3(LAG3)、T細胞免疫球蛋白含黏蛋白領域蛋白質3(Tim3)、BTLA、SLAM、2B4、CD160、類殺手細胞凝集素受體G1(KLRG-1)及胞毒型T淋巴球關聯性抗原4(CTLA4)。
  11. 如請求項10之組合產物，其中該一或多個免疫查核點調節劑之至少一者係選自於以下所組成的群組：(a)一專一 地結合至人類PD-1之抗體，且尤其是選自於以下所組成的群組之抗PD-1抗體：納武單抗(Nivolumab)、蘭博利速單抗(Lanbrolizumab)及比帝利速單抗(pidilizumab)；(b)一專一地結合至人類PD-L1的抗體，以及(c)一專一地結合至人類CTLA-4之抗體，且尤其是選自於以下所組成的群組之抗CTLA4抗體：伊匹單抗(ipilimumab)、摧麥拉單抗(tremelimumab)以及單鏈抗CTLA4抗體。
  12. 如請求項9至11中任一項之組合產物，其中該一或多個免疫查核點調節劑係由該治療疫苗表現。
  13. 如請求項1至12中任一項之組合產物，其中該組合產物為一組成物，其包含治療有效量的至少該治療疫苗及該一或多個免疫查核點調節劑以及一藥學上可接受的媒液(vehicle)。
  14. 如請求項1至13中任一項之組合產物，其包含自大約0.5毫克/公斤(mg/kg)至大約25mg/kg的該免疫查核點調節劑，較佳為自大約1mg/kg至大約20mg/kg，更佳為自大約2mg/kg至大約15mg/kg，且特別首選為自大約3mg/kg至大約10mg/kg的劑量。
  15. 如請求項1至14中任一項之組合產物，其中該組合包含自大概108病毒顆粒(vp)至大概5x1011vp；以及較佳為自大概5x108vp至大概1011vp的腺病毒載體，或者自大概106溶菌斑形成單位(pfu)至大概1010pfu；以及較佳為自大概107pfu至大概109pfu的MVA載體。
  16. 如請求項15之組合產物，其中該組合所含的該免疫查核 點調節劑係予以調配供靜脈內或腫瘤內投藥，以及其中該組合所含的該治療疫苗係予以調配供靜脈內、肌肉內、皮下的或腫瘤內投藥。
  17. 如請求項1至16中任一項之組合產物，其中該治療疫苗及該一或多個免疫查核點抑制劑係相伴、相繼或是穿插的投藥。
  18. 如請求項17之組合產物，其中該治療疫苗的投藥係在該免疫查核點抑制劑投藥之前開始。
  19. 如請求項1至18中任一項之組合產物，其包含於大概1至3個星期間隔投藥4至15次的107或109pfu之MVA-為基的治療疫苗，穿插每2或3個星期投藥2至6次的3至10mg/kg的抗免疫查核點抗體。
  20. 一種組成物，其包含有效量的如請求項2至8及15中任一項所定義之該治療疫苗，以及如請求項9至12及14中任一項所定義之該一或多個免疫查核點調節劑。
  21. 如請求項1至19中任一項之組合產物或是如請求項20之組成物，供使用於治療增生性或感染性疾病。
  22. 如請求項21使用之組合產物或組成物，其中該增生性疾病為癌症，以及尤其是腎癌、前列腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、肝癌、胃癌、膽管癌、子宮內膜癌、胰腺癌與卵巢癌，尤其是非小細胞肺癌(NSCL)，以及其中該感染性疾病係起源於選自於以下所組成的群組之病毒的感染：疱疹病毒乳突瘤病毒、痘病毒、反轉錄病毒、HCV、HBV及流行性感冒病毒。
  23. 一種用於引出或刺激及/或重新定向免疫反應的方法，其包含投藥如請求項1至19中任一項之組合產物或是如請求項20之組成物至需要其之個體內以便活化病人的免疫性。
  24. 如請求項21或22使用之組合產物或組成物或是如請求項23之方法，其係與一或多個習知治療模態聯合使用或進行。
  25. 一種套組，其包含至少(i)如請求項2至8及15中任一項所定義之治療疫苗於一容器內，以及如請求項9至12及14中任一項所定義之一或多個免疫查核點調節劑於另一容器內。
TW105104277A 2015-02-13 2016-02-15 免疫治療疫苗及抗體之組合治療 TWI823828B (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15305215.4 2015-02-13
EP15305215 2015-02-13
EP15305570.2 2015-04-16
EP15305570 2015-04-16

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201634059A true TW201634059A (zh) 2016-10-01
TWI823828B TWI823828B (zh) 2023-12-01

Family

ID=55353205

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW105104277A TWI823828B (zh) 2015-02-13 2016-02-15 免疫治療疫苗及抗體之組合治療

Country Status (6)

Country Link
US (2) US20180028626A1 (zh)
EP (1) EP3256156A1 (zh)
CN (1) CN107949397A (zh)
CA (1) CA2975432A1 (zh)
TW (1) TWI823828B (zh)
WO (1) WO2016128542A1 (zh)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6843736B2 (ja) * 2014-07-16 2021-03-17 トランジェーヌＴｒａｎｓｇｅｎｅ 腫瘍溶解性ウイルスと免疫チェックポイントモジュレーターとの組合せ
CN115300622A (zh) 2015-02-25 2022-11-08 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 使用灭活的修饰的痘苗病毒安卡拉作为实体肿瘤的单一免疫疗法或与免疫检查点阻断剂组合
EP3283088A4 (en) 2015-04-17 2018-10-24 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Use of mva or mvadeltae3l as immunotherapeutic agents against solid tumors
CN109069561A (zh) * 2016-01-11 2018-12-21 图恩斯通有限合伙公司 溶瘤病毒和检查点抑制剂组合疗法
US20170224796A1 (en) 2016-02-05 2017-08-10 Xeme Biopharma Inc. Therapeutic Cancer Vaccine Containing Tumor-Associated Neoantigens and Immunostimulants in a Delivery System
SG11201807022XA (en) 2016-02-25 2018-09-27 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Recombinant mva or mvadele3l expressing human flt3l and use thereof as immuno-therapeutic agents against solid tumors
JP7025339B2 (ja) 2016-02-25 2022-02-24 メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター 癌免疫療法のための、チミジンキナーゼの欠失を伴い、ヒトｆｌｔ３ｌまたはｇｍ－ｃｓｆの発現を伴うかまたは伴わない、複製可能な弱毒化ワクシニアウイルス
MA45123A (fr) 2016-05-27 2019-04-10 Agenus Inc Anticorps anti-tim-3 et leurs méthodes d'utilisation
MX2019002925A (es) 2016-09-15 2019-09-05 Idera Pharmaceuticals Inc Modulacion inmune con agonistas de tlr9 para el tratamiento del cancer.
CN110023337B (zh) 2016-10-11 2024-01-05 艾吉纳斯公司 抗lag-3抗体及其使用方法
CN110520156A (zh) * 2017-01-29 2019-11-29 唐泽群 针对外源抗原和/或自身抗原的免疫调控方法
US20190076460A1 (en) * 2017-02-22 2019-03-14 Enyu Ding An mRNA cancer vaccine encoding human GM-CSF fused to multiple tandem epitopes
JP2020509037A (ja) * 2017-02-28 2020-03-26 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ ワクチンに対する免疫応答を増強するための、ａｄｃｃが増強された抗ｃｔｌａ−４抗体の使用
CN106955352A (zh) * 2017-03-27 2017-07-18 顺昊细胞生物技术（天津）股份有限公司 一种用于治疗癌症的药物组合物和试剂盒
WO2018209315A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Vaccinia virus mutants useful for cancer immunotherapy
US11839655B2 (en) * 2017-09-01 2023-12-12 Microvax, Llc Combination cancer therapy
FR3072973B1 (fr) * 2017-10-26 2022-02-11 Univ Pierre Et Marie Curie Paris 6 Particules pseudo-virales utiles pour traiter des dysfonctionnements immunitaires
EP3706768A4 (en) * 2017-11-06 2021-08-25 Memorial Sloan Kettering Cancer Center USE OF THE HEAT-INACTIVATED VACCINE VIRUS AS A VACCINE IMMUNE ADJUDENT
JP2021514678A (ja) * 2018-03-06 2021-06-17 ペップバックス・インコーポレイテッド 核酸分子およびそれを使用する方法
MX2020009262A (es) * 2018-03-07 2021-01-08 Transgene Vectores de parapoxvirus.
CN110624106A (zh) * 2018-06-22 2019-12-31 嘉和生物药业有限公司 Pd-1信号通路拮抗剂与艾滋病疫苗的联合应用
AU2019356940A1 (en) * 2018-10-10 2021-05-13 President And Fellows Of Harvard College Uses of modified RNA encoding retinaldehyde dehydrogenase
CN109395077A (zh) * 2018-10-30 2019-03-01 北京汇医馆疑难病研究院 211生物免疫克毒技术
TW202043256A (zh) 2019-01-10 2020-12-01 美商健生生物科技公司 前列腺新抗原及其用途
WO2021053207A1 (en) 2019-09-20 2021-03-25 Transgene Combination of a poxvirus encoding hpv polypeptides and il-2 with an anti-pd-l1 antibody
CN117843811A (zh) * 2019-09-30 2024-04-09 吉利德科学公司 Hbv疫苗和治疗hbv的方法
CN111676244B (zh) * 2020-06-05 2024-02-23 成都生物制品研究所有限责任公司 以麻疹病毒为载体的麻疹、风疹联合疫苗
TW202224689A (zh) * 2020-12-28 2022-07-01 財團法人工業技術研究院 免疫刺激性脂質複合體、包含免疫刺激性脂質複合體的醫藥組合物以及其用途
CN114191560B (zh) * 2022-02-09 2023-04-07 中山大学 用于治疗实体肿瘤的免疫治疗组合药物

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005007857A1 (en) * 2003-07-21 2005-01-27 Transgene S.A. Polypeptide having an improved cytosine deaminase activity
SI2161336T1 (sl) * 2005-05-09 2013-11-29 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Humana monoklonska protitelesa za programirano smrt 1 (PD-1) in postopki za zdravljenje raka ob uporabi anti-PD-1 protiteles samih ali v kombinaciji z drugimi imunoterapevtiki
US7919079B2 (en) * 2006-03-31 2011-04-05 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Cancer immunotherapy compositions and methods of use
BR112013006699A2 (pt) * 2010-09-24 2016-06-14 Oncos Therapeutics Oy vetor adenoviral oncolítico que codifica anticorpos anti-ctl4-4 monoclonais, célula e composição farmacêutica compreendendo o mesmo, método de produção de anticorpo monoclonal humano específico para ctla-4 em uma célula e uso do referido vetor adenoviral
US20150250837A1 (en) * 2012-09-20 2015-09-10 Morningside Technology Ventures Ltd. Oncolytic virus encoding pd-1 binding agents and uses of the same
TWI690322B (zh) * 2012-10-02 2020-04-11 法商傳斯堅公司 含病毒的調配物及其使用
RU2714142C2 (ru) * 2013-11-05 2020-02-12 Бавариан Нордик А/С Комбинированное лекарственное средство для лечения рака с использованием поксвируса, экспрессирующего опухолевый антиген, и антагониста и/или агониста ингибитора имунной контрольной точки
IL248507B (en) * 2014-05-13 2022-07-01 Bavarian Nordic As Combined therapy for the treatment of cancer with a recombinant focovirus that expresses an antigen and an antagonist or agonist for an immune control molecule

Also Published As

Publication number Publication date
US20240024437A1 (en) 2024-01-25
TWI823828B (zh) 2023-12-01
CN107949397A (zh) 2018-04-20
CA2975432A1 (en) 2016-08-18
US20180028626A1 (en) 2018-02-01
EP3256156A1 (en) 2017-12-20
WO2016128542A1 (en) 2016-08-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240024437A1 (en) Immunotherapeutic vaccine and antibody combination therapy
JP7146852B2 (ja) 腫瘍溶解性ウイルスと免疫チェックポイントモジュレーターとの組合せ
JP7077377B2 (ja) 免疫チェックポイントモジュレーターの発現用腫瘍溶解性ウイルス
JP2024050588A (ja) パラポックスウイルスベクター
US20220056481A1 (en) M2-defective poxvirus
WO2016131945A1 (en) Combination product with autophagy modulator
WO2023213764A1 (en) Fusion polypeptide comprising an anti-pd-l1 sdab and a member of the tnfsf