TW201631151A - 益於植物生長之包含芽孢桿菌屬微生物之栽植基質 - Google Patents

Abstract

本發明提供組合物，其為益於植物生長之含有芽孢桿菌屬(Bacillus spp.)微生物之孢子的栽植基質。該等芽孢桿菌屬微生物包括以ATCC編號PTA-121722寄存之新鑑別的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)菌株RTI184及以寄存編號DSM 17236寄存之地衣芽孢桿菌CH200。兩個地衣芽孢桿菌菌株均顯示產生先前未報導之豐原素樣(Fengycin-like)及脫羥基豐原素樣環狀脂肽，其在地衣芽孢桿菌菌株當中不均勻產生。所提供之該等栽植基質包括盆栽土。該等盆栽土之pH可在4至8間之範圍內。該等栽植基質所提供之生長效益可由幼苗活力改進、根發育改進、植物生長改進、植物健康改進、產量增加及植物外觀改進展現。

Description

益於植物生長之包含芽孢桿菌屬微生物之栽植基質 相關申請案之交叉參考

本申請案主張2014年12月29日申請的美國臨時申請案第62/097,258號之權益，該案之揭示內容以全文引用的方式併入本文中。

當前所揭示之主題係關於益於植物生長之包含芽孢桿菌屬(Bacillus spp.)微生物之分離菌株的栽植基質。

已知對植物生長及健康具有有益作用之多種微生物存在於土壤中，特定言之與植物聯合存活於根區中(植物根圍促生長細菌「PGPR」)，或以內寄生菌形式存在於植物內。其有益的植物促生長特性包括固氮；鐵螯合；磷酸鹽溶解；抑制非有益微生物；抗蟲害；誘導系統抗性(ISR)；系統獲取抗性(SAR)；植物物質分解於土壤中以增加有用土壤有機物；及合成植物激素，諸如吲哚-乙酸(IAA)、乙偶姻及2,3-丁二醇，其刺激植物生長、發育及對環境壓力(諸如乾旱)作出反應。另外，此等微生物可藉由使前驅體分子1-胺基環丙烷-1-甲酸酯(ACC)分解來干擾植物之乙烯壓力反應，藉此刺激植物生長且減緩果實熟化。此等有益微生物可改進土壤品質、植物生長、產量及作物品質。各種微生物展現生物活性以便適用於控制植物疾病。此類生物 殺蟲劑(活生物體及由此等生物體自然產生之化合物)可比合成肥料及殺蟲劑更安全且更生物可降解。

真菌植物病原體，包括(但不限於)葡萄孢屬(Botrytis spp.)(例如灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea))、鐮刀菌屬(Fusarium spp.)(例如尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)及禾穀鐮刀菌(F.graminearum))、絲核菌屬(Rhizoctonia spp.)(例如立枯絲核菌(R.solani))、稻瘟菌屬(Magnaporthe spp.)、球腔菌屬(Mycosphaerella spp.)、柄鏽菌屬(Puccinia spp.)(例如小麥葉鏽菌(P.recondita))、疫菌屬(Phytopthora spp.)及層鏽菌屬(Phakopsora spp.)(例如豆薯層鏽菌(P.pachyrhizi))為一種類型之植物蟲害，其可在農業及園藝行業中造成嚴重經濟損失。化學劑可用於控制真菌植物病原體，但使用化學劑具有如下缺點，包括成本高、缺乏功效、出現抗真菌菌株及不希望的環境影響。另外，除靶向處理之植物病原體之外，此類化學處理往往為不加選擇的且可不利地影響有益細菌、真菌及節肢動物。第二類型之植物蟲害為細菌病原體，包括(但不限於)歐文氏菌屬(Erwinia spp.)(諸如菊歐文氏菌(Erwinia chrysanthemi))、泛菌屬(Pantoea spp.)(諸如綠檸檬泛菌(P.citrea))、黃單孢菌屬(Xanthomonas)(例如野油菜黃單孢菌(Xanthomonas campestris))、假單孢菌屬(Pseudomonas spp.)(諸如丁香假單孢菌(P.syringae))及青枯病菌屬(Ralstonia spp.)(諸如番茄青枯病菌(R.soleacearum))，其在農業及園藝行業中造成嚴重經濟損失。類似於病原性真菌，使用化學劑處理此等細菌病原體具有缺點。病毒及病毒樣生物體包含第三類型之植物致病劑，其難以控制，但細菌微生物可經由誘導系統抗性(ISR)在植物中提供對其的抗性。因此，可用作生物肥料及/或生物殺蟲劑來控制病原性真菌、病毒及細菌之微生物為合乎需要的且高度需要其用以改進農業可持續性。最終類型之植物病原體包括植物病原性線蟲及昆蟲，其可造成植物嚴重損害及損 失。

芽孢桿菌屬之一些成員已報導為生物控制菌株，且一定已應用於商業產品中(Kloepper等人，2004,Phytopathology第94卷，第11期，1259-1266)。舉例而言，當前用於商業生物控制產品中之菌株包括：地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)菌株QST2808，用作SONATA及BALLAD-PLUS中之活性成分，由BAYER CROP SCIENCE生產；地衣芽孢桿菌菌株GB34，用作YIELDSHIELD中之活性成分，由BAYER CROP SCIENCE生產；枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株QST713，用作SERENADE之活性成分，由BAYER CROP SCIENCE生產；枯草芽孢桿菌菌株GBO3，用作KODIAK及SYSTEM3中之活性成分，由HELENA CHEMICAL COMPANY生產。蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)及強固芽孢桿菌(Bacillus firmus)之各種菌株已用作對抗線蟲及病媒昆蟲之生物控制劑，且此等菌株充當許多市售生物控制產品之基礎，該等產品包括NORTICA及PONCHO-VOTIVO，由BAYER CROP SCIENCE生產。另外，當前用於商業生物刺激產品中之芽孢桿菌菌株包括：解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株FZB42，用作RHIZOVITAL 42中之活性成分，由ABiTEP GmbH生產；以及各種其他枯草芽孢桿菌屬，包括其作為全細胞，包括其在生物刺激產品中之醱酵提取物，諸如由JHBiotech Inc.生產之FULZYME。

當前所揭示之主題提供益於植物生長之用芽孢桿菌屬微生物增強之土壤組合物。

在本發明之一個實施例中，提供一種益於植物生長之栽植基質，該栽植基質包含以適合益於植物生長之量存在的地衣芽孢桿菌菌株之生物學上純培養物。

在本發明之一個實施例中，提供一種益於植物生長之栽植基質，該栽植基質包括以ATCC編號PTA-121722寄存之地衣芽孢桿菌RTI184之生物學上純培養物或其具有其所有鑑別特徵的突變體，以適合益於植物生長之量存在。

在本發明之一個實施例中，提供一種益於植物生長之栽植基質，該栽植基質包含以適合益於植物生長之量存在的以寄存編號DSM 17236寄存之地衣芽孢桿菌CH200之生物學上純培養物或其具有其所有鑑別特徵的突變體。

圖1A-1B為展示根據本發明之一或多個實施例，由於添加地衣芽孢桿菌CH200孢子至SCOTTS MIRACLE-GRO(SCOTTS MIRACLE GRO,Co；Marysville,OH)盆栽混合土(pH為5.5)而對番茄生長的正面影響之影像。A)在以1×10⁷個孢子/公克土壤添加有地衣芽孢桿菌CH200孢子之土壤中生長之植物。B)在不添加有地衣芽孢桿菌CH200之相同土壤中生長之對照植物。

圖2A-2B為展示根據本發明之一或多個實施例，由於添加地衣芽孢桿菌RTI184孢子至SCOTTS MIRACLE-GRO(SCOTTS MIRACLE GRO,Co；Marysville,OH)盆栽混合土(pH為5.5)而對番茄生長的正面影響之影像。A)在以1×10⁷個孢子/公克土壤添加有地衣芽孢桿菌RTI184孢子之土壤中生長之植物。B)在不添加有地衣芽孢桿菌RTI184之相同土壤中生長之對照植物。

圖3A-3D為展示根據本發明之一或多個實施例，在添加地衣芽孢桿菌RTI184孢子或CH200孢子至土壤之後對在SCOTTS MIRACLE-GRO(SCOTTS MIRACLE GRO,Co；Marysville,OH)盆栽混合土(pH為5.5)中之黃瓜生長的正面影響之影像。A)在不添加有芽孢桿菌屬孢子之土壤中生長之對照植物；B)在添加有1×10⁷個孢子/公克土壤地衣芽 孢桿菌RTI184孢子之土壤中生長之植物；C)在不添加有芽孢桿菌屬孢子之土壤中生長之對照植物；及D)在添加有1×10⁷個孢子/公克土壤地衣芽孢桿菌CH200孢子之土壤中生長之植物。

圖4A-4B為展示根據本發明之一或多個實施例，由於添加地衣芽孢桿菌菌株RTI184至PRO-MIX BX(PREMIER TECH,INC；Quebec,Canada)盆栽土(用石灰處理至pH 6.5)而對黃瓜之生長及活力的正面影響之影像。A)在不添加地衣芽孢桿菌RTI184孢子至土壤之情況下的對照黃瓜植物；及B)在向土壤添加1×10⁷CFU/g土壤地衣芽孢桿菌RTI184孢子之後的黃瓜植物。

圖5A-5B為展示根據本發明之一或多個實施例，由於添加地衣芽孢桿菌菌株RTI184至PRO-MIX BX(PREMIER TECH,INC；Quebec,Canada)盆栽土(用石灰處理至pH 6.5)而對番茄之生長及活力的正面影響之影像。A)在向土壤添加1×10⁷CFU/g土壤地衣芽孢桿菌RTI184孢子之後的番茄植物；及B)在不添加有地衣芽孢桿菌RTI184之相同土壤中之對照番茄植物。

圖6A-6B為展示根據本發明之一或多個實施例，由於添加地衣芽孢桿菌菌株RTI184至PRO-MIX BX(PREMIER TECH,INC；Quebec,Canada)盆栽土(用石灰處理至pH 6.5)而對胡椒之生長及活力的正面影響之影像。A)在向土壤添加1×10⁷CFU/g土壤地衣芽孢桿菌RTI184孢子之後的胡椒植物；及B)在不添加有地衣芽孢桿菌RTI184之相同土壤中之對照胡椒植物。

圖7為展示根據本發明之一或多個實施例，由微生物物種產生之先前報導之豐原素型及脫羥基豐原素型環狀脂肽，包括地衣芽孢桿菌及由地衣芽孢桿菌RTI184分離株產生之新鑑別(以粗體展示)之豐原素型及脫羥基豐原素型分子之示意圖。

圖8為根據本發明之一或多個實施例，地衣芽孢桿菌菌株 CH200、RTI1242、RTI1249、RTI184、RTI1243、RTI1112、FCC1598及RTI239、RTI241及RTI253之基因組DNA的BOX-PCR指紋識別圖案之瓊脂糖凝膠電泳的影像。使用1kb DNA梯度(FERMENTAS)作為分子大小標記。基於BOX-PCR圖案，十個菌株分為三個主要組：組1、組2A至2B及組3(組2A及2B表示凝膠上之位置)。

術語「一(a/an)」及「該」在用於本申請案(包括申請專利範圍)中時係指「一或多個」。因此，除非上下文明確相反，否則例如提及「植物」包括複數種植物，如此類推。

在本說明書及申請專利範圍通篇中，除上下文另外要求之外，術語「包含(comprise/comprises/comprising)」以非排除含義使用。同樣，術語「包括」及其語法變化形式意欲為非限制性的，使得清單中項目之列舉不排除可取代或添加至所列項目中之其他類似項目。

出於本說明書及申請專利範圍之目的，術語「約」在與一或多個數字或數值範圍結合使用時應理解為指所有此類數字，包括範圍內之所有數字，且藉由擴展邊界高於及低於所闡述數值來修改彼範圍。由端點列舉之數值範圍包括包含在彼範圍內及彼範圍內任何範圍之所有數字，例如全部整數，包括其分數(例如，列舉1至5包括1、2、3、4及5，以及其分數，例如1.5、2.25、3.75、4.1及其類似者)。

使鑑別為屬於地衣芽孢桿菌屬之植物相關細菌自在加利福尼亞生長之水稻根分離，且隨後測試植物促生長特性。更特定言之，經由高度保守16S rRNA及rpoB基因之序列分析將分離細菌菌株鑑別為新地衣芽孢桿菌菌株(參見實例1)。新細菌分離株(指定為「RTI184」)之16S RNA序列經測定與地衣芽孢桿菌的兩個其他已知菌株地衣芽孢桿菌菌株9945A(99%，在出自三個不同複本之16S rRNA基因之一個複本中，1545bp中有2bp不同)及地衣芽孢桿菌ATCC 14580(99%，1545 bp中有8bp不同)之16S rRNA基因序列幾乎一致。另外，據測定，RTI184之rpoB序列與已知菌株地衣芽孢桿菌9945A(CP005965)具有100%序列一致性且與以ATCC 14580寄存之地衣芽孢桿菌菌株具有97%序列一致性(3015bp中有97bp不同)。為在菌株RTI184與地衣芽孢桿菌9945A之間進一步區分，將其參與地衣素生物合成之路徑的基因組序列與由地衣芽孢桿菌屬產生之特徵陰離子環狀脂七肽生物界面活性劑進行比較。儘管類似，在菌株RTI184及9945A之lichA與lichB基因之間觀測到一些差異。因此，RTI184菌株鑑別為獨特的地衣芽孢桿菌菌株。地衣芽孢桿菌菌株RTI 184於2014年11月13日根據國際承認用於專利程序的微生物保存布達佩斯條約(Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure)之條款寄存在美國弗吉尼亞馬納薩斯之美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection；ATCC)，且具有專利寄存編號PTA-121722。在一個實施例中，提供一種地衣芽孢桿菌菌株CH200用於本發明之組合物中。地衣芽孢桿菌菌株CH200已於2005年4月7日寄存在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Mascheroder Weg 1 b,D-38124 Braunschweig(DSMZ)且分配有寄存編號DSM 17236。

進行實驗，其顯示當各種植物在用各RTI184及CH200菌株的孢子增強之不同栽植基質中生長時，地衣芽孢桿菌RTI184及CH200菌株對植物之實質促進生長活性。實驗結果提供於圖1至6及下文實例2至4中。另外，進行實驗以研究由地衣芽孢桿菌菌株RTI184及CH200產生之環狀脂肽(亦即，含有稱為豐原素及脫羥基豐原素之脂肪酸基團的環狀肽分子)之類型。地衣芽孢桿菌菌株之實驗結果提供於圖7至圖8及下文實例5中。出人意料地，環狀脂肽之研究導致發現RTI184及CH200菌株產生4類先前未報導之豐原素型及脫羥基豐原素型分子。 新種類指定為：1)豐原素H及脫羥基豐原素H；2)脫羥基豐原素I；3)豐原素MA/MB/MC及脫羥基豐原素MA/MB/MC；及4)豐原素MB-Cit及脫羥基豐原素MB-Cit，其細節描述於實例5中且示於圖7中。

除發現RTI184及CH200菌株所產生之新種類環狀脂肽之外，實驗顯示此等先前未報導類型之豐原素型及脫羥基豐原素型代謝物之合成為菌株依賴性而非地衣芽孢桿菌種固有。舉例而言，甚至密切相關之地衣芽孢桿菌菌株產生不同豐原素型及脫羥基豐原素型分子且一個密切相關地衣芽孢桿菌菌株完全不能產生任何豐原素型或脫羥基豐原素型代謝物(參見實例5及圖8)。因此，新發現之地衣芽孢桿菌RTI184菌株及CH200菌株擁有不均勻展現於地衣芽孢桿菌菌株中之益於植物生長及健康之獨特性質。

RTI184菌株之表型特點，諸如植物激素產生、乙偶姻及吲哚乙酸(IAA)，及養分循環描述於實例2中。

存在細菌分離株RTI184及CH200之孢子(當存在於盆栽土中時)對黃瓜及番茄之生長及活力的影響描述於實例3中。在此實驗中，黃瓜及番茄種子栽植於與未增強土壤相比拌有1×10⁷個孢子/公克地衣芽孢桿菌菌株RTI184或1×10⁷個孢子/公克地衣芽孢桿菌菌株CH200之SCOTTS MIRACLE GROW(SCOTTS MIRACLE GRO,Co；Marysville,OH)盆栽混合土(pH約5.5)中。番茄植物在第5週之影像示於圖1至2中，且黃瓜植物之影像示於圖3中。番茄及黃瓜植物之目視檢查顯示在添加有地衣芽孢桿菌RTI184或CH200之SCOTTS MIRACLE GRO盆栽混合土中生長的所有植物之生長增強及生物質量增加超過未改變之SCOTTS MIRACLE GRO盆栽混合土。用RTI184或CH200菌株處理之植物相對於對照植物之大小增加證明用此等菌株處理提供生長之正面影響。

對於不同盆栽土，存在細菌分離株RTI184之孢子(在存在於盆栽 土中時)對黃瓜、番茄及胡椒之生長及活力的影響類似地描述於實例4中。在此實驗中，黃瓜、番茄及胡椒種子栽植於PRO-MIX BX(PREMIER TECH,INC；Quebec,Canada)盆栽土中，盆栽土用石灰處理至pH 6.5且用1×10⁷個孢子/公克土壤地衣芽孢桿菌菌株RTI184增強。對植物進行成像，且收集並量測其乾芽重量且與獲得的非增強對照植物之資料進行比較。經RTI184增強之土壤對生長之正面影響展示於圖4至6及表II中。圖4至6中之影像展示對於所有作物類型而言經RTI184增強之盆栽土中之植物生長實質上大於對照植物，展現RTI184菌株對植物生長之正面影響。在經RTI184增強之土壤中生長之黃瓜、番茄及胡椒植物之所觀測到的乾芽質量相對於對照物分別增加44%、68%及26%(表II)。

實例5描述由地衣芽孢桿菌RTI184及CH200菌株產生之環狀脂肽豐原素及脫羥基豐原素之研究，且出人意料地，鑑別先前未報導之4類此等分子。圖7為展示由包括地衣芽孢桿菌的微生物物種產生之先前報導之豐原素型及脫羥基豐原素型環狀脂肽及由新鑑別之地衣芽孢桿菌RTI184分離株產生之先前未報導之豐原素型及脫羥基豐原素型分子(以粗體展示)的示意圖。先前報導之豐原素型及脫羥基豐原素型脂肽及由RTI184及CH200菌株產生之新鑑別代謝物的概述提供於表III及IV中。

對於第一新種類，確定RTI184菌株產生此等化合物之先前未鑑別衍生物，其中環狀肽鏈之位置8(在圖7中稱為X₃)處的L-異白胺酸經L-甲硫胺酸置換。此新種類豐原素及脫羥基豐原素在本文中稱為MA、MB及MC，係指A類、B類及C類衍生物，其中圖7中X₃處之L-異白胺酸已經L-甲硫胺酸置換。新鑑別之分子以粗體展示於圖7及表III中。另外，鑑別由地衣芽孢桿菌菌株RTI184產生之此等分子之另一先前未鑑別種類，其中豐原素MB及脫羥基豐原素MB(圖7中之位置X₄) 之酪胺酸(Tyr)經α-胺基酸、瓜胺酸置換。此新種類豐原素及脫羥基豐原素在本文中稱為豐原素MB-Cit及脫羥基豐原素MB-Cit，且以粗體展示於圖7及表III中。據進一步確定，地衣芽孢桿菌菌株RTI184產生先前尚未鑑別之額外種類之豐原素及脫羥基豐原素。在此種類中，豐原素B及脫羥基豐原素B(圖7中之位置X₃)之L-異白胺酸經L-高半胱胺酸(Hcy)置換。此等先前未鑑別之豐原素及脫羥基豐原素代謝物在本文中稱為豐原素H及脫羥基豐原素H，且以粗體展示於圖7及表III中。據進一步確定，地衣芽孢桿菌菌株RTI184產生先前尚未鑑別之額外種類之脫羥基豐原素。在此種類中，圖7中之位置X₁經L-異白胺酸置換。此先前未鑑別之脫羥基豐原素代謝物在本文中稱為脫羥基豐原素I，且以粗體展示於圖7及表III中。

除發現由RTI184菌株產生之新種類環狀脂肽之外，實例5中所描述之其他實驗還顯示此等新類型之豐原素型及脫羥基豐原素型代謝物的合成為菌株依賴性的而非地衣芽孢桿菌屬所固有。對於此等實驗，在十個地衣芽孢桿菌菌株之間比較環狀脂肽之合成。為此分析所選之十個細菌菌株基於其高度保守16S rRNA及rpoB基因序列之序列比較而鑑別為地衣芽孢桿菌菌株。使各菌株之基因組DNA分離且藉由BOX-PCR圖案進行比較，且展示菌株之所得BOX-PCR圖案的凝膠影像展示於圖8中。特定言之，圖8展示地衣芽孢桿菌菌株CH200、RTI1242、RTI1249、RTI184、RTI1243、RTI1112、FCC1598及RTI239、RTI241及RTI253之基因組DNA的BOX-PCR指紋識別圖案之瓊脂糖凝膠電泳。基於其BOX-PCR圖案，十個菌株分為三個主要組：組1、組2A至2B(在圖8中組2A及2B表示凝膠上之位置)及組3(其包含不屬於組1或2之菌株)。

為確定由十個地衣芽孢桿菌菌株中之每一者產生之豐原素型及脫羥基豐原素型代謝物的類型，使用UHPLC-TOF MS分析菌株。另 外，亦分析針對地衣芽孢桿菌具有特徵性之地衣素型代謝物作為內部對照。UHPLC-TOF MS分析之結果概述於實例5中之表IV中。地衣素及豐原素型及脫羥基豐原素型分子、其脂質修飾(脂肪酸(FA)鏈長)、預測分子質量及其存在或不存在於十個地衣芽孢桿菌菌株中之每一者的培養物上清液中呈現於表IV中。資料展示地衣素型代謝物由所有十個菌株合成，證實其為地衣芽孢桿菌菌株。另一方面，在十個菌株之間觀測到關於產生豐原素型及脫羥基豐原素型代謝物之主要差異。發現具有相同BOX-PCR圖案之菌株RTI184及RTI1112(組2)產生相同類型之豐原素型及脫羥基豐原素型代謝物，包括脫羥基豐原素A/B/C/D/I/S、脫羥基豐原素H/MA/MB/MC、脫羥基豐原素MB-Cit、豐原素H/MA/MB/MC及豐原素MB-Cit，但未能產生豐原素A/B/C/D/I/S型代謝物。另一方面，亦屬於組2之菌株FCC1598產生豐原素A/B/C/D/I/S型代謝物，但未能產生豐原素H/MA/MB/MC型代謝物。出人意料地，亦屬於組2之菌株RTI1243不產生豐原素型及脫羥基豐原素型代謝物中任一者。最後，屬於組1之兩個菌株(RTI1242及RTI1249)及屬於組3之兩個菌株(RTI1241及RTI1253)未能產生豐原素型及脫羥基豐原素型代謝物中任一者，而分別屬於組1及組3之CH200及RTI1239產生所有豐原素型及脫羥基豐原素型代謝物。基於此等結果，推斷不同類型之豐原素型及脫羥基豐原素型代謝物(包括新鑑別之含瓜胺酸代謝物)之合成為菌株依賴性的而非地衣芽孢桿菌屬所固有。舉例而言，偶數密切相關地衣芽孢桿菌組2菌株產生不同豐原素型及脫羥基豐原素型分子且一個密切相關組2菌株完全不能產生任何豐原素型或脫羥基豐原素型代謝物。因此，新發現之地衣芽孢桿菌RTI184菌株及CH200菌株可擁有不均勻展現於地衣芽孢桿菌菌株中之益於植物生長及健康之獨特特性。

在本發明之一個實施例中，提供一種益於植物生長之栽植基 質，該栽植基質包括以適合益於植物生長之量存在的地衣芽孢桿菌菌株之生物學上純培養物。地衣芽孢桿菌之孢子可以適合益於植物生長之量存在於基質中。植物之生長效益可藉由幼苗活力改進、根發育改進、植物生長改進、植物健康改進、產量增加及外觀改進之一者或組合展現。在本發明之一個實施例中，提供一種益於植物生長之栽植基質，該栽植基質包括以適合益於植物生長之量存在的以ATCC編號PTA-121722寄存之地衣芽孢桿菌RTI184之生物學上純培養物或其具有其所有鑑別特徵的突變體。

在本發明之一個實施例中，提供一種益於植物生長之栽植基質，該栽植基質包含以適合益於植物生長之量存在的以寄存編號DSM 17236寄存之地衣芽孢桿菌CH200之生物學上純培養物或其具有其所有鑑別特徵的突變體。

片語「地衣芽孢桿菌CH200之生物學上純培養物」係指以下各者之一者或組合：細菌菌株之生物學上純醱酵培養物之孢子；細菌菌株之生物學上純醱酵培養物之營養細胞；細菌菌株之生物學上純醱酵培養物之一或多種產物；細菌菌株之生物學上純醱酵培養物之培養物固體；細菌菌株之生物學上純醱酵培養物之培養物上清液；細菌菌株之生物學上純醱酵培養物之提取物；及細菌菌株之生物學上純醱酵培養物之一或多種代謝物。

栽值基質為植物生長介質且可為土壤取代物或土壤增強劑。栽植基質可呈盆栽土形式。盆栽土亦稱為盆栽混合土或盆栽用堆肥，其為在容器中用作植物之生長介質的植物生長介質。盆栽土含有有機組分，諸如泥炭蘚(例如海苔蘚泥炭)及/或椰殼纖維，且可進一步含有堆肥、加工林產品、珍珠岩、蛭石、濕潤劑及pH調節劑(諸如石灰石)。

植物之生長效益可藉由幼苗活力改進、根發育改進、植物生長改進、植物健康改進、產量增加及外觀改進之一者或組合展現。

植物可包括(但不限於)以下，其中植物包含漿果、藍莓、黑莓、樹莓、羅甘莓、酸越橘、蔓越橘、醋栗、接骨木果、黑醋栗、蔓越莓、越莓、草莓、蕓薹屬蔬菜、青花菜、甘藍菜、花椰菜、芽甘藍、羽衣甘藍、芥藍、芥菜、球莖甘藍、瓜類蔬菜、黃瓜、哈密瓜、甜瓜、香瓜、南瓜(Squash)、西瓜、南瓜(Pumpkin)、茄子、鱗莖類蔬菜、洋蔥、大蒜、蔥、果類蔬菜、胡椒、番茄、酸漿、黏果酸漿、秋葵、葡萄、香草/香料、葉類蔬菜、萵苣、芹菜、菠菜、香芹、菊苣、豆科植物/蔬菜(多汁且乾燥之豆子及豌豆)、向日葵、根/塊莖及球莖蔬菜、胡蘿蔔、馬鈴薯、甘藷、木薯、甜菜、薑、辣根、蘿蔔、人參、蕪菁、獼猴桃、香蕉、香草、迷迭香(Rosemary)、百里香(Thyme)、芫荽(Cilantro)、牛至(Oregano)、香芹、鼠尾草(Sage)、薄荷(Mint)、檸檬草(Lemon grass)、觀賞植物、一年生植物(Annuals)、一品紅(Poinsettia)、蠟菊(Helichrysum)、天竺葵(Geranium)、秋海棠(Begonia)、假馬齒莧(Bacopa)、鼠麴草(Chrysocephalum)、小花矮牽牛(Calibrachoa)、彩葉草(Coleus)、風蝶草(Cleome)、土丁桂(Evolvulus)、天使花(Angelonia)、木茼蒿(Argyranthemum)、龍面花(Nemesia)、藍眼菊(Osteospermum)、矮牽牛(Petunia)、溪菜花(Pansiola)、天竺葵(Pelargonium)、莎草(Cyperus)、達拉粉屬植物(Dalina)、大理菊(Dahlia)、馬蹄金(Dichondra)、番薯屬植物(lpomoea)、馬纓丹(Lantana)、香雪球(Lobularia)、半邊蓮(Lobelia)、大戟(Euphorbia)、鳳仙花(Impatiens)、馬鞭草(Verbena)、草海桐(Scaevola)、景天(Sedum)、藨草(Scirpus)、穀精草(Setaceum)、龍面花、福祿考(Phlox)、蝴蝶草(Torenia)、過長沙舅(Mecardonia)、多年生植物(Perennials)、繡球花(Hydrangea)、鐵線蓮(Clematis)、薔薇(Rosa)、醉魚草(Buddleia)、丹參(Salvia)、景天、接骨木(Sambucus)、木僅(Hybiscus)、錦帶花(Weigelia)、硬材插、栗樹、橡 樹、楓樹、核果、杏子、櫻桃、油桃、桃子、李子、乾果李、柑橘、橙子、葡萄柚、檸檬、紅橘、橘柚、柚子。

栽植基質可呈盆栽土形式。栽植基質之pH可在約pH 4至約pH 8、約pH 5至約pH 7或約pH 5.5至pH 6.5之範圍內。

在本發明之栽植基質中，地衣芽孢桿菌RTI184或地衣芽孢桿菌CH200可呈孢子形式。地衣芽孢桿菌RTI184孢子或地衣芽孢桿菌CH200孢子可以約1.0×10⁵CFU/g至約1.0×10⁹CFU/g之量存在於栽植基質中。地衣芽孢桿菌RTI184孢子或地衣芽孢桿菌CH200孢子可以約1.0×10⁶CFU/g至約1.0×10⁸CFU/g之量存在。

栽植基質可進一步包括以適合益於植物生長或健康之量存在的微生物或化學殺昆蟲劑、殺真菌劑、殺線蟲劑或殺細菌劑中之一或多者。栽植基質可進一步包括以適合益於植物生長或健康之量存在的植物提取物、植物生長調節劑或肥料中之一或兩者。

實例

包括以下實例以為一般技術者實施當前所揭示主題之代表性實施例提供指導。鑒於本發明及此項技術中之一般技術水準，一般技術者可瞭解，以下實例意欲僅為例示性的且可在不背離當前所揭示主題之範疇的情況下採用許多變化、修改及改變。

實例1 經由序列分析鑑別細菌分離株為地衣芽孢桿菌

自在加利福尼亞生長之水稻的根分離植物相關細菌菌株(在本文中指定為RTI184)。使RTI184菌株之16S rRNA及rpoB基因定序，且隨後使用BLAST與NCBI及RDP資料庫中之其他已知細菌菌株進行比較。據測定，RTI184(SEQ ID NO：1)之16S RNA部分序列與地衣芽孢桿菌之兩個其他已知菌株地衣芽孢桿菌菌株9945A(99%，在出自三個不同複本之16S rRNA基因之一個複本中，1545bp中有2bp不同)及地 衣芽孢桿菌ATCC 14580(99%，1545bp中有8bp不同)之16S rRNA基因序列幾乎一致。另外，據測定，RTI184(SEQ ID NO：2)之rpoB序列與已知菌株地衣芽孢桿菌9945A(CP005965)具有100%序列一致性且與以ATCC 14580寄存之地衣芽孢桿菌菌株具有97%序列一致性(3015bp中有97bp不同)。為在菌株RTI184與地衣芽孢桿菌9945A之間進一步區分，將其參與地衣素生物合成之路徑的基因組序列與由地衣芽孢桿菌屬產生之特徵陰離子環狀脂七肽生物界面活性劑進行比較。儘管極其類似，在菌株RTI184及9945A之lichA與lichB基因之間觀測到微小差異。因此，RTI184菌株鑑別為獨特的地衣芽孢桿菌菌株。

實例2 地衣芽孢桿菌RTI184分離株之表型特點

除拮抗特性之外，亦量測地衣芽孢桿菌RTI184菌株之不同表型特點，且資料如下展示於表I中。根據表I下方文字中所描述之程序進行分析。

+++極強，++強，+有些，+-弱，-未觀測到

酸及乙偶姻測試. 將富集869培養基中之20μl起始培養物轉移至1ml甲基紅-伏-普二氏(Voges Proskauer)培養基(Sigma Aldrich 39484)。在30℃、200rpm下培育培養物2天。轉移0.5ml培養物，且添加50μl 0.2g/l甲基紅。紅色指示產酸。使其餘0.5ml培養物與0.3ml 5% α-萘酚(Sigma Aldrich N1000)隨後0.1ml 40% KOH混合。培育30分鐘後解譯樣品。紅色顯現指示乙偶姻生產。對於酸及乙偶姻測試，非接種培養基用作陰性對照(Isenberg,H.D.(編)2004,Clinical microbiology procedures handbook，第1卷、第2卷及第3卷，第2版American Society for Microbiology,Washington,D.C.)。

吲哚-3-乙酸. 將富集869培養基中之20μl起始培養物轉移至補充有0.5g/l色胺酸之1ml 1/10 869培養基(Sigma Aldrich T0254)。培養物在暗處在30℃、200RPM下培育4-5天。將樣品離心，且將0.1ml上清液與0.2ml薩爾科夫斯基氏試劑(Salkowski's Reagent)(35%過氯酸，10mM FeCl3)混合。在暗處培育30分鐘後，產生粉紅色之樣品記錄為IAA合成陽性。IAA稀釋液(Sigma Aldrich I5148)用作陽性對比物；非接種培養基用作陰性對照(Taghavi等人，2009,Applied and Environ-mental Microbiology 75：748-757)。

溶磷測試. 將細菌接種於皮科夫斯卡婭(PVK)瓊脂培養基上，該培養基由每公升10g葡萄糖、5g三磷酸鈣、0.2g氯化鉀、0.5g硫酸銨、0.2g氯化鈉、0.1g硫酸鎂七水合物、0.5g酵母提取物、2mg硫酸錳、2mg硫酸鐵及15g瓊脂組成，pH 7，經高壓滅菌。清除區指示溶磷細菌(Sharma等人，2011,Journal of Microbiology and Biotechnology Research 1：90-95)。

殼質酶活性. 將10%濕重膠狀殼質添加至經修飾之PVK瓊脂培養基(每公升10g葡萄糖、0.2g氯化鉀、0.5g硫酸銨、0.2g氯化鈉、0.1g硫酸鎂七水合物、0.5g酵母提取物、2mg硫酸錳、2mg硫酸鐵及15g瓊脂，pH 7，經高壓滅菌)中。細菌接種於此等殼質培養盤上；清除區指示殼質酶活性(N.K.S.Murthy & Bleakley,2012,The Internet Journal of Microbiology.10(2))。

蛋白酶活性. 細菌接種於補充有10%牛奶之869瓊脂培養基上。清除區指示分解蛋白質之能力，表明蛋白酶活性(Sokol等人，1979,Journal of Clinical Microbiology.9：538-540)。

實例3 黃瓜及番茄在用地衣芽孢桿菌RTI184及CH200分離株之孢子增強之盆栽土中生長時之生長效果

地衣芽孢桿菌RTI184及地衣芽孢桿菌CH200之分離菌株改進番茄及黃瓜之生長及健康的能力係由在已添加各地衣芽孢桿菌RTI184及地衣芽孢桿菌CH200菌株孢子之盆栽土中栽植各自種子來確定。

地衣芽孢桿菌CH200菌株於2005年4月7日寄存在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Mascheroder Weg 1 b,D-38124 Braunschweig(DSMZ)且給予寄存編號DSM 17236。

對於使用RTI184或CH200之孢子的實驗，菌株各自在14L醱酵槽中之2XSG中形成孢子。收集孢子，但之後不洗，濃度為至少1.0×10⁷至10⁹CFU/mL。

確定存在細菌分離株RTI184及CH200之孢子(在存在於盆栽土中時)對黃瓜及番茄之生長及活力的影響。在此實驗中，黃瓜及番茄種子栽植於拌有1×10⁷個孢子/公克土壤地衣芽孢桿菌菌株RTI184或1×10⁷個孢子/公克土壤地衣芽孢桿菌菌株CH200之SCOTTS MIRACLE-GRO(SCOTTS MIRACLE GRO,Co；Marysville,OH)盆栽混合土中。特定言之，已添加RTI184或CH200孢子之土壤為SCOTTS MIRACL-GRO土壤(pH為約5.5)。在4"盆中測試番茄且在6"盆中測試黃瓜。每個盆栽植一顆種子，且每個處理存在8個複本。番茄植物在第5週之影像展示於圖1至2中，且黃瓜植物之影像展示於圖3中。番茄及黃瓜植物之目視檢查展示在添加有地衣芽孢桿菌RTI184或CH200之SCOTTS MIRACLE-GRO盆栽混合土中生長的所有植物之生長增強及生物質量 增加超過未改變之SCOTTS MIRACLE-GRO盆栽混合土。特定言之，圖1A-1B為展示由於添加地衣芽孢桿菌CH200孢子至SCOTTS MIRACLE-GRO盆栽混合土(pH為5.5)而對番茄生長的正面影響之影像。A)在以1×10⁷個孢子/公克土壤添加有地衣芽孢桿菌CH200孢子之土壤中生長之植物。B)在不添加有地衣芽孢桿菌CH200之相同土壤中生長之對照植物。圖2A-2B為展示根據本發明之一或多個實施例，由於添加地衣芽孢桿菌RTI184孢子至SCOTTS MIRACLE-GRO(SCOTTS MIRACLE GRO,Co；Marysville,OH)盆栽混合土(pH為5.5)而對番茄生長的正面影響之影像。A)在以1×10⁷個孢子/公克土壤添加有地衣芽孢桿菌RTI184孢子之土壤中生長之植物。B)在不添加有地衣芽孢桿菌RTI184土壤之相同土壤中生長之對照植物。圖3A-3D為展示在添加地衣芽孢桿菌RTI184孢子或CH200孢子至土壤之後對在SCOTTS MIRACLE-GRO(SCOTTS MIRACLE GRO,Co；Marysville,OH)盆栽混合土(pH為5.5)中之黃瓜生長的正面影響之影像。A)在不添加有芽孢桿菌屬孢子之土壤中生長之對照植物；B)在添加有1×10⁷個孢子/公克土壤地衣芽孢桿菌RTI184孢子之土壤中生長之植物；C)在不添加有芽孢桿菌屬孢子之土壤中生長之對照植物；及D)在添加有1×10⁷個孢子/公克土壤地衣芽孢桿菌CH200孢子之土壤中生長之植物。用RTI184或CH200菌株處理之植物相對於對照植物之大小增加展現藉由用此等菌株處理所提供之積極生長影響。

實例4 地衣芽孢桿菌分離株RTI184在黃瓜、番茄及胡椒中之生長效果

確定應用細菌分離株RTI184對黃瓜、番茄及胡椒之生長及活力的影響。在此實驗中，將黃瓜、番茄及胡椒種子栽植於PRO-MIX BX(PREMIER TECH,INC；Quebec,Canada)盆栽土中，盆栽土用石灰處理至pH 6.5且用1×10⁷個孢子/公克土壤地衣芽孢桿菌菌株RTI184增 強。在6"盆中將種子栽植於經RTI184增強之PROMIX BX土壤中。每個盆栽植一顆種子，且每個處理存在8個複本。收集植物，且量測其乾芽重量，且與針對非接種對照植物所獲得之資料進行比較。乾芽生物質量確定為每8株植物之總重量。資料如下展示於表II及圖4至6中，且展現對於所有作物類型，在經RTI184孢子增強之土壤中生長的植物勝過對照土壤。

特定言之，圖4A-4B為展示在經RTI184增強之土壤中栽植A)對照黃瓜植物及B)在經地衣芽孢桿菌RTI184增強之土壤中生長的黃瓜植物之後對黃瓜之生長及活力的正面影響之黃瓜資料的影像。影像展示在經RTI184增強之土壤中生長的植物相對於對照植物之葉子大小及整個植物大小顯著增加。在經RTI184增強之土壤中生長的植物之芽生物質量乾重(公克)相對於對照植物之芽生物質量乾重增加44%(表II)。

圖5A-5B為展示在經RTI184增強之土壤中栽植A)在經地衣芽孢桿菌RTI184增強之土壤中生長的番茄植物及B)對照番茄植物之後對番茄之生長及活力的正面影響之番茄資料的影像。影像展示在經RTI184增強之土壤中生長的植物相對於對照植物之整個植物大小顯著增加。在經RTI184增強之土壤中生長的植物之芽生物質量乾重(公克)相對於對照植物之芽生物質量乾重增加68%(表II)。

圖6A-6B為展示在經RTI184增強之土壤中栽植A)在經地衣芽孢桿菌RTI184增強之土壤中生長的胡椒植物及B)對照胡椒植物之後對胡椒之生長及活力的正面影響之胡椒資料的影像。影像展示在經RTI184增強之土壤中生長的植物相對於對照植物之整個植物大小顯著增加。在經RTI184增強之土壤中生長的植物之芽生物質量乾重(公克)相對於對照植物之芽生物質量乾重增加26%(表II)。

實例5 鑑別由地衣芽孢桿菌RTI184及CH200分離株產生之新代謝物

先前已報導五種豐原素型代謝物及脫羥基豐原素型代謝物係由包括地衣芽孢桿菌之微生物物種產生(Pecci,Y.等人，2010；Li,Xing-Yu等人，2013)。此等屬於環狀脂肽類之代謝物為亦含有脂肪酸基團之環狀肽分子。五種豐原素型及脫羥基豐原素型代謝物稱為A、B、C、D及S。此等代謝物之骨架結構以及五個種類中之每一者的特定胺基酸序列展示於圖7中。使用UHPLC-TOF MS分析由地衣芽孢桿菌菌株RTI184產生之豐原素型及脫羥基豐原素型代謝物。將由RTI184菌株產生之豐原素型代謝物在富集培養基中(在869或M2培養基中)在30℃下生長3及6天之後的分子量與針對豐原素型及脫羥基豐原素型代謝物所預期的理論分子量進行比較。另外，為確定由RTI184菌株產生之不同豐原素型代謝物之胺基酸組成，對先前經由UHPLC-TOF MS鑑別之豐原素型代謝物中之每一者進行使用LC-MS-MS之肽定序。此等資料展示於下表III中。以此方式，確定地衣芽孢桿菌菌株RTI184不產生豐原素A、B、C、D或S。

出人意料地，確定RTI184菌株產生此等化合物之先前未鑑別衍生物，其中環狀肽鏈(在圖7中稱為X₃)之位置8處的L-異白胺酸經L-甲硫胺酸置換。新種類豐原素及脫羥基豐原素在本文中稱為MA、MB及 MC，係指A類、B類及C類衍生物，其中圖7中X₃處之L-異白胺酸已經L-甲硫胺酸置換。新鑑別之分子以粗體展示於圖7及表III中。

除此等新衍生物之外，還鑑別由地衣芽孢桿菌菌株RTI184產生之另一先前未鑑別種類，其中豐原素MB及脫羥基豐原素MB(圖7中之位置X₄)之酪胺酸(Tyr)經α-胺基酸、瓜胺酸置換。此新種類豐原素及脫羥基豐原素在本文中稱為豐原素MB-Cit及脫羥基豐原素MB-Cit，且以粗體展示於圖7及表III中。

據進一步確定，地衣芽孢桿菌菌株RTI184產生先前尚未鑑別之額外種類之豐原素及脫羥基豐原素。在此種類中，豐原素B及脫羥基豐原素B(圖7中之位置X₃)之L-異白胺酸經L-高半胱胺酸(Hcy)置換。此等先前未鑑別之豐原素及脫羥基豐原素代謝物在本文中稱為豐原素H及脫羥基豐原素H，且以粗體展示於圖7及表III中。

據進一步確定，地衣芽孢桿菌菌株RTI184產生先前尚未報導之額外種類之脫羥基豐原素。在此種類中，圖7中之位置X₁經L-異白胺酸置換。此先前未報導之脫羥基豐原素代謝物在本文中稱為脫羥基豐原素I，且以粗體展示於圖7及表III中。

下表III中提供先前報導之豐原素型及脫羥基豐原素型脂肽及新鑑別之代謝物(以粗體展示)之胺基酸序列的概述。

為判定新鑑別類型之豐原素型及脫羥基豐原素型代謝物之合成是否為地衣芽孢桿菌屬所固有或替代地為地衣芽孢桿菌之個別菌株所特有，在10個地衣芽孢桿菌菌株之間比較此等類型分子之合成。為此分析所選之十個細菌菌株基於其高度保守16S rRNA及rpoB基因序列之序列比較而鑑別為地衣芽孢桿菌菌株。使各菌株之基因組DNA分離且藉由BOX-PCR圖案使用先前所描述之方法進行比較(Vinuesa,P.等人，1998,Applied and Environmental Microbiology,64,2096-2104)，且展示菌株之所得BOX-PCR圖案的凝膠影像展示於圖8中。特定言之，圖8展示地衣芽孢桿菌菌株CH200、RTI1242、RTI1249、RTI184、 RTI1243、RTI1112、FCC1598及RTI239、RTI241及RTI253之基因組DNA的BOX-PCR指紋識別圖案之瓊脂糖凝膠電泳。使用1kb DNA梯度(FERMENTAS)作為分子大小標記。基於其BOX-PCR圖案，十個菌株分為三個主要組：組1、組2A至2B(組2A及2B表示圖8中凝膠上之位置)及組3。

為確定由十個地衣芽孢桿菌菌株中之每一者產生之豐原素型及脫羥基豐原素型代謝物的類型，使用UHPLC-TOF MS分析菌株。另外，亦分析針對地衣芽孢桿菌具有特徵性之地衣素型代謝物作為內部對照。UHPLC-TOF MS分析之結果概述於下表IV中。表IV呈現地衣素及豐原素型及脫羥基豐原素型分子、其脂質修飾(脂肪酸(FA)鏈長)、所預測之分子質量及其存在或不存在於在M2培養基中生長6天的十個地衣芽孢桿菌菌株中之每一者的培養物上清液中。資料展示地衣素型代謝物由所有十個菌株合成，證實其為真實地衣芽孢桿菌菌株。另一方面，在十個菌株之間觀測到關於產生豐原素型及脫羥基豐原素型代謝物之主要差異。

發現具有相同BOX-PCR圖案之菌株RTI184及RTI1112(組2)產生相同類型之豐原素型及脫羥基豐原素型代謝物，包括脫羥基豐原素A/B/C/D/I/S、脫羥基豐原素H/MA/MB/MC、脫羥基豐原素MB-Cit、豐原素H/MA/MB/MC及豐原素MB-Cit，但未能產生豐原素A/B/C/D/I/S型代謝物。另一方面，亦屬於組2之菌株FCC1598產生豐原素A/B/C/D/I/S型代謝物，但未能產生豐原素H/MA/MB/MC型代謝物。出人意料地，亦屬於組2之菌株RTI1243不產生豐原素型及脫羥基豐原素型代謝物中任一者。最後，屬於組1之兩個菌株(RTI1242及RTI1249)及屬於組3之兩個菌株(RTI1241及RTI1253)未能產生豐原素型及脫羥基豐原素型代謝物中任一者，而分別屬於組1及組3之CH200及RTI1239產生所有豐原素型及脫羥基豐原素型代謝物。基於此等結果，推斷不同類型之豐原素型及脫羥基豐原素型代謝物(包括新鑑別之含瓜胺酸代謝物)之合成為菌株依賴性的而非地衣芽孢桿菌屬所固有。舉例而言，偶數密切相關地衣芽孢桿菌組2菌株產生不同豐原素型及脫羥基豐原素型分子且一個密切相關組2菌株完全不能產生任何豐原素型或脫羥基豐原素型代謝物。

參考文獻

本文所引用之所有公開案、專利申請案、專利及其他參考文獻皆以全文引用的方式併入本文中。

<110> 美商富曼西公司

<120> 益於植物生長之包含芽孢桿菌屬微生物之栽植基質

<130> 121-20PROV

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1545

<212> DNA

<213> 地衣芽孢桿菌

<400> 1

<210> 2

<211> 3015

<212> DNA

<213> 地衣芽孢桿菌

<400> 2

Claims (21)

1. 一種益於植物生長之栽植基質，該栽植基質包含以適合益於植物生長之量存在的ATCC編號PTA-121722寄存之地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)RTI184之生物學上純培養物或具有其所有鑑別特徵的突變體。
2. 如請求項1之栽植基質，其中該植物之生長效益係由幼苗活力改進、根發育改進、植物生長改進、植物健康改進、產量增加、外觀改進或其組合展現。
3. 如請求項1之栽植基質，其中該栽植基質呈盆栽土形式。
4. 如請求項1之栽植基質，其中該地衣芽孢桿菌RTI184呈孢子形式。
5. 如請求項4之栽植基質，其中該地衣芽孢桿菌RTI184以約1.0×10⁵CFU/g至約1.0×10⁹CFU/g之量存在。
6. 如請求項4之栽植基質，其中該地衣芽孢桿菌RTI184以約1.0×10⁶CFU/g至約1.0×10⁸CFU/g之量存在。
7. 如請求項1之栽植基質，其中該栽植基質之pH在約pH 4至約pH 8、約pH 5至約pH 7、或約pH 5.5至pH 6.5之範圍內。
8. 如請求項1之栽植基質，其進一步包含以適合益於植物生長或健康之量存在的微生物或化學殺昆蟲劑、殺真菌劑、殺線蟲劑或殺細菌劑中之一或多者。
9. 如請求項1之栽植基質，其進一步包含以適合益於植物生長或健康之量存在的植物提取物、植物生長調節劑或肥料中之一或多者。
10. 如請求項1之栽植基質，其中該植物包含漿果、藍莓、黑莓、樹莓、羅甘莓、酸越橘(Huckleberry)、蔓越橘(Cranberry)、醋栗 (Gooseberry)、接骨木果(Elderberry)、醋栗(Currant)、蔓越莓(Caneberry)、越莓(Bushberry)、草莓、蕓薹屬(Brassica)蔬菜、青花菜(Broccoli)、甘藍菜、花椰菜、芽甘藍、羽衣甘藍(Collards)、芥藍(Kale)、芥菜、球莖甘藍、瓜類蔬菜、黃瓜、哈密瓜(Cantaloupe)、甜瓜(Melon)、香瓜(Muskmelon)、南瓜(Squash)、西瓜、南瓜(Pumpkin)、茄子、鱗莖類(Bulb)蔬菜、洋蔥、大蒜、蔥、果類蔬菜(Fruiting vegetables)、胡椒、番茄、酸漿(Ground Cherry)、黏果酸漿(Tomatillo)、秋葵、葡萄、香草/香料、葉類蔬菜、萵苣、芹菜、菠菜、香芹、菊苣(Radicchio)、豆科植物/蔬菜(多汁且乾燥之豆子及豌豆)、向日葵、根/塊莖及球莖蔬菜、胡蘿蔔、馬鈴薯、甘藷、木薯、甜菜、薑、辣根、蘿蔔、人參、蕪菁、獼猴桃、香蕉、香草、迷迭香(Rosemary)、百里香(Thyme)、芫荽(Cilantro)、牛至(Oregano)、香芹、鼠尾草(Sage)、薄荷(Mint)、檸檬草(Lemon grass)、觀賞植物、一年生植物(Annuals)、一品紅(Poinsettia)、蠟菊(Helichrysum)、天竺葵(Geranium)、秋海棠(Begonia)、假馬齒莧(Bacopa)、鼠麴草(Chrysocephalum)、小花矮牽牛(Calibrachoa)、彩葉草(Coleus)、風蝶草(Cleome)、土丁桂(Evolvulus)、天使花(Angelonia)、木茼蒿(Argyranthemum)、龍面花(Nemesia)、藍眼菊(Osteospermum)、矮牽牛(Petunia)、溪菜花(Pansiola)、天竺葵(Pelargonium)、莎草(Cyperus)、達拉粉屬植物(Dalina)、大理菊(Dahlia)、馬蹄金(Dichondra)、番薯屬(Ipomoea)、馬纓丹(Lantana)、香雪球(Lobularia)、半邊蓮(Lobelia)、大戟(Euphorbia)、鳳仙花(Impatiens)、馬鞭草(Verbena)、草海桐(Scaevola)、景天(Sedum)、藨草(Scirpus)、穀精草(Setaceum)、龍面花、福祿考(Phlox)、蝴蝶草(Torenia)、過長沙舅 (Mecardonia)、多年生植物(Perennials)、繡球花(Hydrangea)、鐵線蓮(Clematis)、薔薇(Rosa)、醉魚草(Buddleia)、丹參(Salvia)、景天、接骨木(Sambucus)、木槿(Hybiscus)、錦帶花(Weigelia)、硬材插(Hardwood cuttings)、栗樹、橡樹、楓樹、核果、杏子、櫻桃、油桃、桃子、李子、乾果李(Prune)、柑橘、橙子、葡萄柚、檸檬、紅橘、橘柚或柚子。
11. 一種益於植物生長之栽植基質，該栽植基質包含以適合益於植物生長之量存在的寄存編號DSM 17236寄存之地衣芽孢桿菌CH200之生物學上純培養物或其具有其所有鑑別特徵的突變體。
12. 如請求項11之栽植基質，其中該植物之生長效益係由幼苗活力改進、根發育改進、植物生長改進、植物健康改進、產量增加、外觀改進或其組合展現。
13. 如請求項11之栽植基質，其中該栽植基質呈盆栽土形式。
14. 如請求項11之栽植基質，其中該地衣芽孢桿菌CH200呈孢子形式。
15. 如請求項14之栽植基質，其中該地衣芽孢桿菌CH200以約1.0×10⁵CFU/g至約1.0×10⁹CFU/g之量存在。
16. 如請求項14之栽植基質，其中該地衣芽孢桿菌CH200以約1.0×10⁶CFU/g至約1.0×10⁸CFU/g之量存在。
17. 如請求項11之栽植基質，其中該栽植基質之pH在約pH 4至約pH 8、約pH 5至約pH 7、或約pH 5.5至pH 6.5之範圍內。
18. 如請求項11之栽植基質，其進一步包含以適合益於植物生長或健康之量存在的微生物或化學殺昆蟲劑、殺真菌劑、殺線蟲劑或殺細菌劑中之一或多者。
19. 如請求項11之栽植基質，其進一步包含以適合益於植物生長或健康之量存在的植物提取物、植物生長調節劑或肥料中之一或兩 者。
20. 如請求項11之栽植基質，其中該植物包含漿果、藍莓、黑莓、樹莓、羅甘莓、酸越橘、蔓越橘、醋栗、接骨木果、黑醋栗、蔓越莓、越莓、草莓、蕓薹屬蔬菜、青花菜、甘藍菜、花椰菜、芽甘藍、羽衣甘藍、芥藍、芥菜、球莖甘藍、瓜類蔬菜、黃瓜、哈密瓜、甜瓜、香瓜、南瓜、西瓜、南瓜、茄子、鱗莖類蔬菜、洋蔥、大蒜、蔥、果類蔬菜、胡椒、番茄、酸漿、黏果酸漿、秋葵、葡萄、香草/香料、葉類蔬菜、萵苣、芹菜、菠菜、香芹、菊苣、豆科植物/蔬菜(多汁且乾燥之豆子及豌豆)、向日葵、根/塊莖及球莖蔬菜、胡蘿蔔、馬鈴薯、甘藷、木薯、甜菜、薑、辣根、蘿蔔、人參、蕪菁、獼猴桃、香蕉、香草、迷迭香、百里香、芫荽、牛至、香芹、鼠尾草、薄荷、檸檬草、觀賞植物、一年生植物、一品紅、蠟菊、天竺葵、秋海棠、假馬齒莧、鼠麴草、小花矮牽牛、彩葉草、風蝶草、土丁桂、天使花、木茼蒿、龍面花、藍眼菊、矮牽牛、溪菜花、天竺葵、莎草、達拉粉屬植物、大理菊、馬蹄金、番薯屬植物、馬纓丹、香雪球、半邊蓮、大戟、鳳仙花、馬鞭草、草海桐、景天、藨草、穀精草、龍面花、福祿考、蝴蝶草、過長沙舅、多年生植物、繡球花、鐵線蓮、薔薇、醉魚草、丹參、景天、接骨木、木槿、錦帶花、硬材插、栗樹、橡樹、楓樹、核果、杏子、櫻桃、油桃、桃子、李子、乾果李、柑橘、橙子、葡萄柚、檸檬、紅橘、橘柚或柚子。
21. 一種益於植物生長之栽植基質，該栽植基質包含以適合益於植物生長之量存在的地衣芽孢桿菌菌株之生物學上純培養物。