TW201625784A - 組織再生促進劑 - Google Patents

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Abstract

本發明的目的在於提供一種新穎的組織再生促進劑及組織再生促進方法。 本發明是關於一種用以促進組織再生及/或促進細胞增殖的組成物，其包含RGD胜肽；本發明又關於一種用以促進組織再生及/或促進細胞增殖的方法等，其使用了RGD胜肽。

Description

組織再生促進劑
本發明關於下述技術：一種用以促進細胞增殖及/或促進組織再生的組成物，其包含RGD(Arg-Gly-Asp)胜肽；一種用以促進細胞增殖及/或促進組織再生的的方法，其使用了RGD胜肽；及，一種使用了RGD胜肽之細胞培養物的製造方法等。
活體的組織若受到損傷，則會再生以修補損傷部分，使其功能回復。例如肝臟，已知即使切除其一半以上，亦能在短期內再生，回復到幾乎是原本的大小及功能。關於組織再生的研究，從以前開始即以肝臟為主來進行，且已報告有各種發現，但關於組織再生的詳細機制，仍然有許多不明之處。組織的再生，被認為複雜地牽涉到複數種類的細胞，但就連這些細胞中的哪一種是擔任主要任務，仍然未獲得決定性的見解。
組織的再生中，構成組織的細胞或分化為該細胞之幹細胞的增殖是不可或缺的，並且已知HGF(Hepatocyte growth factor，肝細胞生長因子)等細胞生長因子，會透過其細胞增殖能力等而與組織的再 生有所關連(非專利文獻1)。然而，受到近年來對再生醫療的需求提高的影響，正在尋求能進一步有助於促進組織再生或細胞增殖的物質。
[先前技術文獻] (非專利文獻)
非專利文獻1：Nakamura and Mizuno, Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2010；86(6)：588-610
本發明的目的是提供一種新穎的用以促進細胞增殖及/或促進組織再生的組成物及方法等。
本發明人為了解決上述問題而專心進行研究時，發現RGD胜肽會促進細胞的增殖，從而完成本發明。
亦即，本發明是關於以下事項。
(1)一種用以促進細胞增殖之組成物，其包含RGD胜肽。
(2)如(1)所述之組成物，其中，該細胞是組織實質細胞。
(3)一種用以促進組織再生之組成物，其包含RGD胜肽。
(4)如(3)所述之組成物，其中，該組織再生會伴隨 組織實質細胞的增殖。
(5)如(1)~(4)中任一項所述之組成物，其中，進一步包含細胞增殖因子。
(6)一種促進細胞增殖的方法，其包含使RGD胜肽與細胞接觸的步驟。
(7)如(6)所述之方法，其中，使RGD胜肽與細胞接觸的步驟，是在血清及/或細胞增殖因子的存在下實行。
(8)一種細胞培養物的製造方法，其包含：使RGD胜肽與細胞接觸的步驟；及，培養細胞的步驟。
(9)如(8)所述之方法，其中，使RGD胜肽與細胞進行接觸的步驟、及/或培養細胞的步驟，是在血清及/或細胞增殖因子的存在下實行。
藉由本發明，使得促進細胞增殖成為可能，而能夠期待在生物學、細胞工程、醫學、醫療(特別是再生醫療)等領域有重大的貢獻。
第1圖是顯示在RGD胜肽的存在下培養肝細胞時的BrdU陽性細胞的顯微鏡影像的圖。
第2圖是顯示在RGD胜肽的存在下培養肝細胞時的BrdU陽性細胞的比例的圖表。
只要本說明書中未另外定義，本說明書所使用的全部的技術用語及科學用語，與本發明所屬技術領域中具有通常知識者可以通常理解的用語具有相同的意思。本說明書中所參照的全部的專利、專利申請案及其他的出版文件(包含網路資訊)，是藉由參照其全部的內容來援用至本說明書中。
本發明是關於下述技術：一種用以促進組織再生的組成物，其包含RGD胜肽作為有效成分；一種製造用以促進組織再生的組成物的方法，其包含調配RGD胜肽來作為有效成分的步驟；一種RGD胜肽的用以促進細胞增殖的組成物的製造上之用途；一種組成物，其包含用以促進細胞增殖的有效量的RGD胜肽；及，一種使用於促進組織再生的RGD胜肽。
本說明書中，RGD胜肽是意指包含RGD基序，亦即，包含由Arg-Gly-Asp所構成的胺基酸序列之胜肽。RGD胜肽可以是只由Arg-Gly-Asp所構成，亦可以在N端、C端或兩端進一步包含胺基酸殘基。RGD胜肽並無限定，例如，可以是3~100個胺基酸長、3~50個胺基酸長、3~25個胺基酸長、3~20個胺基酸長、3~15個胺基酸長、3~10個胺基酸長、3~8個胺基酸長、3~5個胺基酸長等。從而，RGD胜肽並無限定，例如，可以是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、 40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個胺基酸長等。
RGD胜肽可以是直鏈狀，或是環狀，亦可以是支鏈狀。當RGD胜肽是環狀時，可以是結合胜肽的兩端的形狀(head-to-tail型，頭接尾型)，亦可以是至少一端是自由的迴路狀(loop shape)。當RGD胜肽是迴路狀胜肽時，RGD基序可以位在迴路的頂點部分。胺基酸殘基可以是未修飾，亦可以被修飾。當RGD胜肽是6個胺基酸長以上的RGD胜肽時，可以包含一個或兩個以上的RGD基序。RGD胜肽能夠具有下述的拓樸結構：最晚在與細胞接觸前，至少一個RGD基序會被細胞所辨識的拓樸結構。例如，RGD胜肽可以是以下述方法來設計的拓樸結構：在活體外已經有至少一個RGD基序會被細胞所辨識的拓樸結構；拓樸結構，在活體外雖然RGD基序不被細胞所辨識，但在活體內可藉由pH等環境的變化或代謝等，而有至少一個RGD基序會被細胞所辨識的拓樸結構。在此，作為會被細胞所辨識的拓樸結構，並無限定，可列舉例如：當RGD胜肽具有立體結構時，RGD基序不會被其他胺基酸殘基所隱藏的拓樸結構等。在一態樣中，RGD胜肽具有至少一個的RGD基序，該RGD基序是由未修飾的胺基酸殘基所構成。
RGD胜肽可以利用已知者，亦可以重新設計。作為已知的RGD胜肽的非限定例，可列舉例如：Arg-Gly-Asp(例如：Sigma-Aldrich,Cat.No.A8052)、Arg-Gly-Asp-Ser(序列號碼1，例如： Sigma-Aldrich,Cat.No.A9041；胜肽研究所，Cat.No.4171)、Gly-Arg-Gly-Asp-Ser(序列號碼2，例如：Sigma-Aldrich,Cat.No.G4391)、Cyclo(Ala-Arg-Gly-Asp-3-Aminomethylbenzoyl)(序列號碼3，例如：Sigma-Aldrich,Cat.No.C9357)、Gly-Arg-Gly-Asp-Thr-Pro(序列號碼4，例如：Sigma-Aldrich,Cat.No.G5646)、Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro(序列號碼5，例如：Sigma-Aldrich,Cat.No.SCP0157)、Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys(序列號碼6，例如：Sigma-Aldrich,Cat.No.G1269)、鋸鱗蝰素(Echistatin，例如：Sigma-Aldrich,Cat.No.SCP0157)、GRGDS(序列號碼7，例如：胜肽研究所，Cat.No.4189-v)、西侖吉肽(Cilengitide)、RGD4C(ACDCRGDCFCG，序列號碼8)、RGD10(DGARYCRGDCFDG，序列號碼9)、Cyclo(Cys-Arg-Gly-Asp-Cys)(序列號碼10)、SKF107260、G-4120、CYGGRGDTP(序列號碼11)、Cyclo(RGDfK)等。
又，本發明中的RGD胜肽包含以下構成：RGD胜肽模擬物(例如：Duggan et al.,J Med Chem.2000；43(20)：3736-45)，其模擬了RGD胜肽的功能；及，具有RLD(Arg-Leu-Asp)基序或KGD(Lys-Gly-Asp)基 序的胜肽，上述胜肽與RGD胜肽具有類似的功能。作為RGD胜肽的功能，可列舉：如記載在本說明書的實施例1的細胞增殖促進作用、或對於整合素分子(例如整合素αvβ1、αvβ3等)的結合性等。
藉由本發明之組成物來促進再生的組織並無特別限定，可包含全身的各種組織。作為該組織，並無限定，可列舉例如：存在星狀細胞的組織、發生纖維化的組織、存在幹細胞的組織等。作為促進再生的組織的非限定例，可列舉例如：肝臟、胰臟、腎臟、腸管、肺、脾臟、心臟、骨髓、聲帶、皮膚、腹膜、眼、血管、神經組織、軟骨、骨頭、肌肉、乳房、毛囊等。
本發明之組成物，對於在創傷組織或移植組織中所發生的組織再生，相當有用。創傷組織包含了受到組織破壞、發炎、壞死、纖維化、手術性侵入、器官衰竭等的組織。
藉由本發明之組成物所進行的組織再生，可伴隨著幹細胞的分化及/或增殖。又，藉由本發明之組成物所進行的組織再生，可伴隨著組織實質細胞的增殖。幹細胞的分化，例如可以藉由下述方式來評估：對於分化細胞具專一性的細胞標記的檢測、分化細胞所顯示的功能的檢測等。細胞的增殖，能夠藉由各種已知的方法來評估，例如：經時性的活細胞數的計數；組織的尺寸、體積或重量的測定；DNA合成量之測定；細胞增殖標記的檢測；WST-1(water soluble tetrazolium salt-1，水溶 性四唑鹽)法；BrdU(5-溴-2'-脫氧尿嘧啶核苷)法、3H胸腺嘧啶核苷摻入法等。
本發明之組成物，能夠使用於具有組織再生受到抑制之狀態的對象。作為組織再生受到抑制之狀態，並無限定，例如包含：發炎、壞死、纖維化、器官衰竭、血小板數量減少、基因異常、正腎上腺素減少等。
本發明之組成物中的RGD胜肽的調配量，當投予組成物時，可以是促進組織再生的量。又，較佳是不發生超過由投予所獲利益之不良影響的量。該量可以是習知，或是藉由使用培養細胞等的體外(in vitro)試驗、或藉由在小鼠、大鼠、犬或豬等模式動物中進行的試驗來適當地決定，這種試驗法已經為發明所屬技術領域中具有通常知識者所熟知。組織再生之促進，可以藉由採用生化檢查、X光照相、超音波、核磁共振、電腦斷層攝影、內視鏡等之圖像診斷等，來評估組織的功能、重量、大小等之回復情形。RGD胜肽的調配量，可以依據組成物的投藥態樣而變化。例如，當一次投予中採用複數單位的組成物時，調配於一單位的組成物中的有效成分的量，能夠設為一次投予中所需的RGD胜肽有效成分的量的複數分之一。該調配量的調整，能夠由所屬技術領域中具有通常知識者適當地進行。
本發明又關於一種於對象中促進組織再生之方法，其包含將RGD胜肽投予至需要該組成物之對象中的步驟。本方法中的對象，可以是組織受到創傷、或受到組織 移植的對象。前述創傷並無限定，例如包含：組織破壞、發炎、壞死、纖維化、手術性侵入、器官衰竭。又，本方法的對象，可以罹患可藉由組織的再生獲得改善的疾病。關於該疾病會於下述進行詳述。
本發明又關於下述：一種用以促進細胞增殖的組成物，其包含RGD胜肽作為有效成分；一種製造用以促進細胞增殖的組成物的方法，其包含調配RGD胜肽來作為有效成分的步驟；一種RGD胜肽的用以促進細胞增殖的組成物的製造上之用途；一種組成物，其包含用以促進細胞增殖的有效量的RGD胜肽；及，一種使用於促進細胞增殖的RGD胜肽。
作為促進增殖的細胞，並無限定，可列舉例如：肝臟、胰臟、腎臟、腸管、肺、脾臟、心臟、骨髓、聲帶、皮膚、腹膜、眼、血管、神經組織、軟骨、骨頭、肌肉、乳房、毛囊等組織的細胞。細胞可以是體細胞(亦即，分化的細胞)，亦可以是幹細胞。體細胞包含實質細胞及非實質細胞。幹細胞並無特別限定，例如包含：組織幹細胞(體幹細胞、成體幹細胞)、胚胎幹細胞、iPS細胞(induced pluripotent stem cells，誘導性多功能幹細胞)等。幹細胞可以是全能性(totipotency)、萬能性(pluripotency)、多能性(multipotency)或單能性(unipotent)。作為組織幹細胞，並無限定，可列舉例如：神經幹細胞、造血幹細胞、間葉幹細胞、肝幹細胞、胰幹細胞、皮膚幹細胞、肌肉幹細胞、生殖幹細胞等。細胞可 以是源自個體本身的細胞，也可以是來自相同物種之其他個體或相異物種之個體的細胞。增殖的細胞，能夠移植至需要該細胞之對象中。又，促進增殖的細胞可以存在於活體內，亦可以存在於活體外。當存在於活體外時，細胞可以存在於由活體單離出的組織中，亦可以是以由組織單離出來的狀態存在。
細胞可以具有可以辨識RGD基序的細胞表面分子。作為該細胞表面分子，可列舉例如：整合素(integrin)。整合素是由α鏈與β鏈的兩個次單元(subunit)所構成之蛋白質。在一態樣中，細胞可以表現具有β1鏈的整合素。在另一態樣中，細胞可以表現具有αv鏈的整合素。在特定的態樣中，細胞可以表現整合素，該整合素是選自由整合素α5β1、α8β1、αIIBβ3、αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6及αvβ8所構成之群組。
細胞的增殖，能夠藉由各種已知的方法來評估，例如：經時性的活細胞數的計數；組織的尺寸、體積或重量的測定；DNA合成量之測定；細胞增殖標記的檢測；WST-1(water soluble tetrazolium salt-1，水溶性四唑鹽)法；BrdU(5-溴-2'-脫氧尿嘧啶核苷)法、3H胸腺嘧啶核苷摻入法等。本發明中，促進細胞增殖是意指：相較於沒有RGD胜肽的存在下的細胞增殖，在RGD胜肽的存在下的細胞增殖(例如：特定期間培養後的細胞數、或從某一時間點的細胞數(例如播種時的細胞數)的增加率等)有增加的情況。細胞增殖的增加的程度，並無限定，例 如可以是在沒有RGD胜肽的存在下的細胞增殖的5%以上、10%以上、15%以上、20%以上、25%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、100%以上、150%以上、200%以上、250%以上、300%以上等。
本發明之組成物中的RGD胜肽的有效成分的調配量或有效量，當投予組成物時，可以是促進細胞增殖的量。又，較佳是不發生超過由投予所獲利益之不良影響的量。該量能夠是習知，或是藉由使用培養細胞等的體外試驗、或藉由在小鼠、大鼠、犬或豬等模式動物中進行的試驗來適當地決定，這種試驗法已經為發明所屬技術領域中具有通常知識者所熟知。促進細胞增殖，能夠藉由上述的各種手法來進行評價。RGD胜肽的調配量，可以依據組成物的投藥態樣而變化。例如，當一次投予中採用複數單位的組成物時，調配於一單位的組成物中的RGD胜肽的量，能夠設為一次投予中所需的RGD胜肽的量的複數分之一。該調配量的調整，能夠由所屬技術領域中具有通常知識者適當地進行。本發明之組成物能夠使用在體外(in vitro)試驗、體內(in vivo)試驗、離體(ex vivo)試驗。本發明之組成物又能夠使用於後述的本發明的細胞培養物製造方法中。
本發明又關於一種於對象中促進細胞增殖之方法，其包含將RGD胜肽的有效量投予至需要該組成物之對象中的步驟。本方法中的對象，可以是組織受到創傷、或 受到組織移植的對象。前述創傷並無限定，例如包含：組織破壞、發炎、壞死、纖維化、手術性侵入、器官衰竭。又，本方法的對象，可以罹患可藉由細胞的增殖獲得改善的疾病。關於該疾病會於下述進行詳述。
本發明又關於下述：一種用以處置疾病的組成物，其中，前述疾病可藉由組織的再生及/或細胞增殖獲得改善，且該組成物包含RGD胜肽作為有效成分；一種製造組成物的方法，該組成物是用以處置前述疾病的組成物，該方法包含調配RGD胜肽來作為有效成分的步驟；一種RGD胜肽的用以處置前述疾病的組成物的製造上之用途；一種處置前述疾病的RGD胜肽；一種組成物，其包含使用於處置前述疾病的有效量的RGD胜肽；及，一種用以處置前述疾病的方法，其包含將RGD胜肽的有效量投予至需要該組成物之對象中的步驟。
作為可以藉由組織的再生及/或細胞的增殖來獲得改善的疾病，並無限定，可列舉例如：伴隨組織中的細胞或基質的消失的疾病、或需要移植組織或細胞的疾病等。細胞或基質的消失，並無限定，例如可以是發生下述情況：由於壞死或細胞凋亡造成的細胞死亡、由於外傷等造成的組織的損傷、由於手術等造成的組織的切除等。藉由組織的再生及/或細胞的增殖來獲得改善的疾病，可以發生在肝臟、胰臟、腎臟、腸管、肺、脾臟、心臟、骨髓、聲帶、皮膚、腹膜、眼、血管、神經組織、軟骨、骨頭、肌肉、乳房、毛囊等組織。作為藉由組織的再生及/或細 胞的增殖來獲得改善的疾病的非限定例，可列舉例如：組織纖維化(例如：肝纖維化(包含肝硬化)、肺纖維化、腎纖維化、胰纖維化、腸管纖維化、骨髓纖維化、腹膜纖維化等)、梗塞性疾病(例如：心肌梗塞、腦梗塞等)、壞死性疾病(例如：壞疽(包含糖尿病性壞疽)、褥瘡、潰瘍等)、神經退化性疾病、外傷、需要進行細胞或組織移植的器官衰竭、需要重建手術的腫瘤疾病(例如：乳癌、頭頸癌、舌癌、口腔癌、食道癌等)等。
本發明的各種組成物，除了RGD胜肽之外，可以進一步包含細胞生長因子作為有效成分，又，亦能夠與細胞生長因子併用。同樣地，本發明的各種方法中，亦能夠將RGD胜肽與細胞生長因子併用。作為細胞生長因子，並無限定，可列舉例如：HGF、EGF(epidermal growth factor，表皮細胞生長因子)、VEGF(vascular endothelial growth factor，血管內皮生長因子)、TGF-α(Transforming growth factor-α，轉化生長因子-α)、PDGF(platelet derived growth factor，血小板衍生生長因子)、HB-EGF(Heparin-Binding Epidermal Growth Factor，肝素結合表皮生長因子)、神經營養因子(neurotrophin)、GDNF(glial cell line derived neurotrophic factor，膠質細胞源性神經營養因子)等。細胞生長因子可以是天然存在者，亦可以是人工製作者。因此，細胞生長因子包含重組細胞生長因子。關於細 胞生長因子的胺基酸資訊、及編碼有該胺基酸之鹼基序列的資訊可以從既存的資料庫(例如：GenBank等)來取得。
本發明中的細胞生長因子，亦包含其功能性突變體。當細胞生長因子是蛋白質時，此功能性突變體，並無限定，可列舉例如下述突變體：(i)於該蛋白質的胺基酸序列上有一個或兩個以上、典型而言有一個或數個變異，但仍具有與該蛋白質同等功能的突變體；(ii)藉由具有編碼有該蛋白質之基因之鹼基序列的核酸所編碼、或藉由在與該核酸同樣編碼有相同多肽的核酸的鹼基序列上有一個或兩個以上，典型而言有一個或數個變異的核酸所編碼，並且具有與該蛋白質同等功能的突變體；(iii)藉由具有編碼有該蛋白質之基因之鹼基序列的核酸、與該核酸同樣編碼有相同多肽的核酸、或編碼有(ii)之突變體的核酸等核酸的互補股(complementary strand)所編碼、或藉由於該些互補股的片段上以嚴苛(stringent)條件進行雜合(hybridize)之核酸所編碼，並且具有與該蛋白質同等功能的突變體；(iv)具有與該蛋白質之胺基酸序列有60%以上、較佳是70%以上、進一步較佳是80%以上、更佳是90%以上、特佳是95%以上的相同性的胺基酸序列，並且具有與該蛋白質同等功能的突變體；(v)藉由與編碼該蛋白質之基因的鹼基序列有60%以上、較佳是70%以上、進一步較佳是80%以上、更佳是90%以上、特佳是95%以上的相同性的核酸所編碼，並且具有與該蛋白質同等功能的突變體等。
發明所屬技術領域中具有通常知識者，能夠基於細胞生長因子的序列資訊，藉由已知的任意方法，例如化學合成、藉限制酶切割或插入核酸、導入具有部位專一性的突變、放射線或紫外線之照射等，來適當地製作上述功能性突變體。
某一突變體是否具有與細胞生長因子同等的功能，可以藉由下述來評估：針對細胞生長因子的已知功能(該功能並無特別限定，例如細胞增殖的誘導能力等)，藉由已知的任意方法來分析該突變體，與適當的陰性對照、或與作為陽性對照的細胞生長因子進行比較，藉此進行評估。例如，當某一突變體在上述功能方面優於陰性對照時，例如，當優異10%以上、25%以上、50%以上、75%以上、甚至100%以上，及/或該機能是陽性對照的1/100以上、1/50以上、1/25以上、1/10以上、1/5以上、甚至1/2以上時，該突變體即包含於細胞生長因子的功能性突變體之中。
本說明書中所使用的「嚴苛條件」之用語，是所屬技術領域中所習知的參數，已記載於標準的實驗程序集，例如Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,3d ed.,Cold Spring Harbor Press(2001)、或是Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992)等。
本發明中的嚴苛條件，例如是指在65℃中藉由下述雜合緩衝液進行之雜合，該緩衝液是由下述所構成：3.5×SSC(0.15M氯化鈉/0.15M檸檬酸鈉，pH值為7)、Ficoll(聚蔗糖)0.02%、聚乙烯吡咯啶酮0.02%、牛血清白蛋白0.02%、NaH2PO425mM(pH值為7)、SDS0.05%、EDTA 2mM。雜合之後，將移置有DNA的膜，以2×SSC在室溫中清洗，繼而以0.1~0.5×SSC/0.1×SDS在68℃下的溫度中進行清洗。或者，嚴苛的雜合，亦可以使用ExpressHyb(R) Hybridization Solution(Clontech公司)等市售的雜合緩衝液，在製造者所記載之雜合及清洗條件下進行。
雖然有其他可使用的條件、試劑等可以產生同等程度之嚴苛度之結果，但發明所屬技術領域中具有通常知識者理應已熟知該條件，因此對於這些其他條件、試劑等，本說明書中並未特別記載。然而，可以操作條件以便能夠明確地鑑別出編碼有蛋白質突變體的核酸。
本發明中的細胞生長因子，除了該蛋白質本身或其功能性突變體以外，亦包含編碼有該蛋白質或其功能性突變體的核酸。
本說明書中所述之本發明之各種組成物、方法等之中，當有效成分包含核酸分子(例如：編碼有細胞生長因子的核酸分子等)時，這些核酸能夠直接使用裸核酸，亦能夠使其承載於各種載體。作為載體，能夠利用下述的習知的任意物：質體載體、噬菌體載體、噬菌質體 (phagemid)載體、黏接質體(cosmid)載體、病毒載體等。載體較佳為至少含有增強所承載之核酸的表現的啟動子(promoter)，此時，該核酸較佳為與該啟動子以能夠操作的方式連接。所謂的與該啟動子以能夠操作的方式連接，是意指：使該核酸與啟動子配置為能夠藉由啟動子的作用而適當地生成該核酸所編碼的蛋白質。載體可以是能在宿主細胞內複製、或不能在宿主細胞內複製，又，基因之轉錄可以在宿主細胞的核外進行，也可以在核內進行。後者的情形中，核酸亦可嵌入於宿主細胞的基因體(genome)之中。
又，有效成分亦能夠承載於各種非病毒性脂質或蛋白質攜帶體上。作為該攜帶體，並無限定，可列舉例如：膽固醇、微脂體、抗體之原體(protomer)、環狀糊精奈米粒子、融合肽、適體(aptamer)、生物可分解性聚乳酸共聚物、聚合物等，而能夠提高被攝入細胞內的效率(例如參照Pirollo and Chang,Cancer Res.2008；68(5)：1247-50等)。其中以陽離子性微脂體或聚合物(例如聚乙烯亞胺等)特別有用。作為該攜帶體而言有用的聚合物，其進一步的例示則可列舉例如美國專利US 2008/0207553號、US 2008/0312174號申請案等所記載者。
在本說明書所記載的本發明的各種組成物，能夠用於活體內的組織再生、疾病處置等醫療用途。因此，本發明的各種組成物能夠作為醫藥組成物。醫藥組成物 中，只要不妨礙有效成分的效果，則亦可將有效成分與其他任意成分組合。作為此種任意成分，可列舉例如：其他化學處置劑、藥理學上可容許的攜帶體、賦形劑、稀釋劑等。而且，視投予路徑或藥物釋放形式等而定，亦可將上述組成物以適當的材料被覆，例如以腸溶性的塗覆物、或經時分解性的材料來被覆，或者亦可組合於適當的藥物釋放系統。
在本說明書所記載的本發明的各種組成物(包含各種醫藥組成物)中，可以藉包括經口及非經口之兩者在內的各種路徑來投予，並無限定而可列舉例如：經口、靜脈內、肌肉內、皮下、局部、腫瘤內、直腸內、動脈內、門脈內、心室內、經黏膜、經皮膚、鼻內、腹腔內、肺內及子宮內等路徑，並且可以製成適合於各投予路徑的劑型。該劑型及製劑方法，可適當採用任意的習知者(例如參照：標準藥劑學，渡邊喜照等人編輯，南江堂於2003年出版)。
例如，作為適合於經口投予的劑型，並不受限定而可列舉：散劑、顆粒劑、錠劑、膠囊、液劑、懸浮劑、乳劑、凝膠劑、糖漿等，又，作為適合於非經口投予的劑型，則可列舉溶液性注射劑、懸浮性注射劑、乳濁性注射劑、用時調製型注射劑等注射劑。非經口投予用製劑，能夠是移植片、水性或非水性之等張性無菌溶液或懸浮液的形態。
本說明書所記載的本發明的各種組成物(包含各種醫藥組成物)，雖然可以用任一形態來提供，但從保存安定性的觀點來看，較佳是能夠於使用時調製的形態，例如能夠在醫療現場或附近，由醫師及/或藥師、護理師、或其他醫務人員等進行調製的形態來提供。該形態，在本發明之組成物含有脂質或蛋白質、核酸等難以安定保存的成分時特別有用。此時，本發明之組成物，是以一個或兩個以上的容器來提供，該容器含有本發明之組成物之必要構成要素的至少一個，並且本發明之組成物是在使用之前，例如24小時前以內、較佳為3小時前以內、以及更佳為正要使用前進行調製。於調製之際，可適當地使用在調製場所中通常可取得的試藥、溶劑、調劑器具等。
因此，本發明，又關於一種組成物的調製套件(kit)或套組(pack)，其中包含一個或兩個以上的容器，該容器是單獨或組合地含有本發明之各種組成物中所能含有的活性成分，本發明亦關於以此種套件或套組之形態來提供的各種組成物的必要構成要素。本發明之套件或套組，除了上述之外，亦可含有記載了關於本發明之各種組成物之調製方法或投予方法等的指示，例如說明書、或CD、DVD、藍光光碟、記憶卡、USB記憶體等電子記錄媒體等。又，本發明之套件或套組雖然可包含用以完成本發明之各種組成物的全部構成要素，但並不一定需含有全部的構成要素。因此，本發明之套件或套組中，亦可不含有在醫療現場或實驗設施等通常可取得的試藥或溶劑，例 如無菌水、生理食鹽水、或葡萄糖溶液等。本發明之套件或套組，能夠使用於本發明之組成物的上述各種用途，例如：促進細胞增殖、促進組織再生、製造細胞培養物等。
本說明書所記載之本發明的各種方法中，所謂的有效量，例如：在關於組織再生方面，是可以促進組織再生、或消除組織再生延遲情形的量；在關於細胞的增殖方面，是可以促進細胞的增殖、或消除細胞增殖延遲情形的量；在關於疾病處置方面，是可以減輕疾病症狀、或能延遲或停止疾病惡化的量，較佳是抑制或治癒疾病的量。又，較佳是不發生超過由投予所獲利益之不良影響的量。該量能夠藉由使用培養細胞等之體外試驗、或藉由在小鼠、大鼠、犬或豬等模式動物中進行的試驗來適當地決定，這些試驗方法為發明所屬技術領域中具有通常知識者所熟知。又，本發明的處置方法中所使用的藥物的用量，為發明所屬技術領域中具有通常知識者所習知，或者能夠藉由上述試驗等來適當地決定。RGD胜肽的1日總投予量，並無限定，例如可以是：約1μg/kg~約1000mg/體重kg、約10μg/kg~約100mg/體重kg、約100μg/kg~約10mg/體重kg等。
本說明書所記載之本發明的處置方法中所投予的有效成分之具體用量，可以考慮關於需要處置之對象的各種條件來決定，該條件是例如：是否有阻礙組織再生或細胞增殖之狀態、症狀的嚴重度、對象的一般健康狀態、年齡、體重、對象的性別、飲食、投予的時期及頻率、所 併用的醫藥、對治療的反應性、劑型、及對治療的遵從性等。
作為投予路徑，包含經口及非經口之兩者在內的各種路徑，例如可包含：經口、靜脈內、肌肉內、皮下、局部、腫瘤內、直腸內、動脈內、門脈內、心室內、經黏膜、經皮膚、鼻內、腹腔內、肺內及子宮內等路徑。
投予頻率是依照所使用之組成物的性狀、或者包括上述在內的對象的條件而異，例如可以是1日多次(亦即1日2、3、4次或5次以上)、1日1次、每數日(亦即每2、3、4、5、6、7日等)1次、每週1次、每隔數週(亦即每2、3、4週等)1次。
在本說明書中使用的情形中，用語「對象」的意指任意的生物個體，較佳是動物、更佳是哺乳動物、進一步更佳是人類之個體。在本發明中，雖然對象可以是健康者也可以是罹患某種疾病者，但當目的為處置特定疾病時，典型而言是意指已罹患該疾病、或是具有罹患風險的對象。
又，用語「處置」，在本說明書中使用時，是以疾病之治癒、暫時緩解或預防等為目的，而包含了醫學上所容許之全部種類的預防性及/或治療性之介入。例如，「處置」之用語，包含了各種目的之醫學上可容許之介入，其中包含了疾病惡化的延遲或停止、病變之消退或消失、發病之預防或復發之防止等。
本發明又關於一種促進細胞增殖的方法，其包含使RGD胜肽與細胞接觸的步驟。該方法可以在體外試驗、體內試驗、離體試驗中實行。使RGD胜肽與細胞接觸的步驟，能夠在血清及/或細胞增殖因子的存在下實行。關於RGD胜肽、細胞、促進細胞增殖及細胞增殖因子的內容，如同上述用以促進細胞增殖的組成物的內容。
血清包含異種血清和同種血清。異種血清是意指：源自與細胞不同種類之生物的血清，該細胞是與RGD胜肽接觸的細胞。例如：當該細胞是人類細胞時，例如：胎牛血清(FBS、FCS)、小牛血清(CS)、馬血清(HS)等相當於異種血清。又「同種血清」是意指：源自與細胞同一種類的生物的血清。例如：當該細胞是人類細胞時，人類血清相當於同種血清。同種血清包含自體血清(autologus serum)，亦即，是該細胞原來個體的血清、及源自同一個體以外之同種類個體的同種異體血清。再者，本說明書中，有時會將自體血清以外的血清，亦即，異種血清與同種血清總稱為非自體血清。血清的濃度，並無限定，例如可以是0.1~50v/v%，0.5~40v/v%、1~30v/v%、2~20v/v%等範圍。
RGD胜肽與細胞的接觸，只要是RGD胜肽可促進該細胞的增殖的樣式則無限制，例如，可以是下述樣式：對包含該細胞的媒介(例如：培養基或生理緩衝液等)添加RGD胜肽來實行；對包含該細胞的對象或組織投予RGD胜肽來實行。與細胞接觸時的RGD胜肽的濃度，並無限定， 可以是例如：0.1μg/ml~100mg/ml、1μg/ml~10mg/ml、10μg/ml~1mg/ml、20μg/ml~500μg/ml、25μg/ml~400μg/ml、50μg/ml~100μg/ml等範圍。
本發明又關於一種細胞培養物的製造方法，其包含：使RGD胜肽與細胞接觸的步驟；及，培養細胞的步驟。使RGD胜肽與細胞接觸的步驟、及/或培養細胞的步驟，能夠在血清及/或細胞增殖因子的存在下來實行。關於RGD胜肽、細胞、細胞增殖的促進、使RGD胜肽與細胞接觸的步驟、血清及細胞增殖因子等內容，如同上述用以促進細胞增殖的組成物或促進細胞增殖的方法的內容。
本發明中的細胞的培養，能夠在適合該細胞的生存或增殖的條件來實行。該條件可以是本發明所屬技術領域中具有通常知識者已知的條件，亦可以是本發明所屬技術領域中具有通常知識者適當調整而獲得的條件。作為該條件的非限定例，可列舉：在細胞培養基中，以37℃、5%CO2的培養等。作為細胞培養基，並無限定，可列舉例如：DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's medium)、MEM(Minimal Essential Medium)、F12、DME(Dulbecco's Modified Eagle's medium)、RPMI1640、MCDB(MCDB102、104、107、131、153、199等)、L15、SkBM、RITC80-7、DMEM/F12等。培養基可以不包含血清，亦可以包含血清。
以本發明的製造方法製造出的細胞培養物，能夠使用在各種的移植療法。因此，以本發明的製造方法製造出的細胞培養物，可以是用以使用於移植療法者。本發明的製造方法，因為能夠迅速地製造具有期望細胞數的細胞培養物，對於移植療法等之中的細胞培養物的製造相當有用。
[實施例]
藉由以下的例子進一步詳細地說明本發明，但是以下的例子只是例示，本發明絕非限定於該等實施例。
[實施例1]RGD胜肽對於肝細胞增殖之影響
在以10μg/cm2的濃度將源自大鼠尾部之第一型膠原蛋白(Sigma-Aldrich)被覆於60mm培養皿中，以包含10%胎牛血清的DME/F12培養基中2×105個/ml的濃度來播種大鼠肝實質細胞，並加入不同濃度的胜肽(RGD胜肽(Sigma-Aldrich,Cat.No.A8052)：50μg/ml、100μg/ml；GRGES胜肽(胜肽研究所，Cat.No.PFA-3907-PI)：100μg/ml；GRGDS胜肽(胜肽研究所，Cat.No.4189-v)：50μg/ml、100μg/ml)，以37℃、5%CO2培養48小時；該大鼠肝實質細胞是源自GFP基因轉殖大鼠(Slc Japan)的肝臟，藉由從門脈灌流膠原蛋白酶溶液所採集的肝實質細胞(Seglen,MethodsCell.Biol.(1976)13：29-83)。於培養後的第48小時，將培養基置換為包含10 μM BrdU和10%FBS的DME/F12培養基，以37℃、5%CO2進一步培養24小時。於培養後第24小時，去除培養基，以PBS清洗後，加入4%PFA，於室溫固定30分鐘。固定後，以PBS清洗，並加入包含0.2N HCl和0.1%Triton X-100的PBS，來進行穿透處理。
以PBS清洗後，以5%山羊血清實行阻斷，並加入小鼠抗BrdU單株抗體(MBL)及兔抗GFP多株抗體(Life Technologies)，於37℃實行一級抗體(primary antibody)反應60分鐘。一級抗體反應後，以PBS清洗，加入Alexa Fluor (R)488標記山羊抗兔IgG(Life Technologies)及Alexa Fluor (R)555標記山羊抗小鼠IgG(Life Technologies)，於37℃實行二級抗體(secondary antibody)反應60分鐘。二級抗體反應後，以PBS清洗，並使用含有DAPI之封片劑將細胞進行封片。螢光顯微鏡影像顯示於第1圖。圖中，箭頭標示了BrdU陽性細胞。又，為了算出BrdU陽性細胞的比例，對BrdU陽性細胞數及GFP陽性細胞數進行計數。第2圖中，表示GFP陽性細胞(全部的肝細胞)相對於BrdU陽性細胞(增殖的肝細胞)的比例。
從第1圖及第2圖顯示的結果，可知藉由RGD胜肽可促進肝細胞的增殖。
<110> Nitto Denko Corporation
<120> Agent for promoting tissue regeneration
<130> 2729ND
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<220>
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Claims (9)

  1. 一種用以促進細胞增殖的組成物，其包含RGD胜肽。
  2. 如請求項1所述之組成物，其中，該細胞是組織實質細胞。
  3. 一種用以促進組織再生的組成物，其包含RGD胜肽。
  4. 如請求項3所述之組成物，其中，該組織再生會伴隨組織實質細胞的增殖。
  5. 如請求項1~4中任一項所述之組成物，其中，進一步包含細胞增殖因子。
  6. 一種促進細胞增殖的方法，其包含使RGD胜肽與細胞接觸的步驟。
  7. 如請求項6所述之方法，其中，使RGD胜肽與細胞接觸的步驟，是在血清及/或細胞增殖因子的存在下實行。
  8. 一種細胞培養物的製造方法，其包含：使RGD胜肽與細胞接觸的步驟；及，培養細胞的步驟。
  9. 如請求項8所述之方法，其中，使RGD胜肽與細胞接觸的步驟、及/或培養細胞的步驟，是在血清及/或細胞增殖因子的存在下實行。
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