TW201622758A - 膠原蛋白傷口敷料的製備方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係為一種以結締組織製備高純度膠原蛋白傷口敷料的方法,其主要是以陸生動物或水生動物之結締組織來萃取一高純度膠原蛋白後,再以該高純度膠原蛋白來製備膠原蛋白傷口敷料;其中該膠原蛋白傷口敷料具有促進止血、傷口癒合及修復組織等作用,適用於一般傷口或手術創傷處理。
Description
本發明係關於一種膠原蛋白的製備方法,特別指一種膠原蛋白傷口敷料的製備方法。
膠原蛋白(collagen)是一種生物性高分子物質,是脊椎動物體內含量最豐富的蛋白質,在人體內約佔蛋白質含量的約30%以上,是人體中非常重要的蛋白質。膠原蛋白在動物細胞中扮演結合組織的角色,主要存在於結締組織(connective tissue)中的細胞外間質(extracellular matrix,ECM),可在軟骨、筋腱、真皮組織以及其它結締組織中發現。細胞外間質環繞在細胞外圍,由醣蛋白、蛋白纖維等蛋白質構成,是細胞與細胞之間的支架,類似鋼筋混凝土,而膠原蛋白是屬於纖維性的蛋白,作用如同鋼筋混凝土中的鋼筋(科學人,2012年12月第130號刊)。
膠原蛋白為一種具生物降解性的蛋白質,大部分以纖維型態存在於動物組織中,它具有很強的伸張能力來維持組織型態並提供組織所需之張力,是韌帶和肌腱的主要成份。
膠原蛋白存在於皮膚、軟骨、角膜、血管壁、內臟器官,並於其中提供支撐細胞的機械強度,使得皮膚與血管壁有彈性、肌腱有力;當身體缺少膠原蛋白,就可能使皮膚出現皺紋、肌肉鬆垮、血管易破裂、
骨骼生長不全。
膠原蛋白的分子結構呈三股螺旋,是由三條多胜肽鏈(polypeptide chain)彼此互相纏繞而成之生物性高分子,每條多胜肽鏈約由一千多個胺基酸聚合而成,主要的胺基酸有甘胺酸、脯胺酸及羥基脯胺酸。至目前為止,已知的膠原蛋白有20多種,各由不同的多胜肽組成;不同組織所含有的膠原蛋白種類也各不相同,例如皮膚、肌腱、韌帶是以第I型和第Ⅲ型混合為主,椎間盤和大部份的軟骨是以第Ⅱ型為主,腎及血管管壁是以第Ⅳ型膠原蛋白為主。
目前膠原蛋白已廣泛運用於工業以及醫藥,為生物科技產業最具關鍵性的原材料之一,也是需求量十分龐大的最佳生醫材料;其應用領域包括生醫材料、食品、化妝品及研究用途等。
一般膠原蛋白係藉由反覆酸溶或鹽析處理,來將非膠原蛋白物質移除,來使膠原蛋白自結締組織中純化出來;此種處理需重複數次以改善膠原蛋白之純度,但重複處理的步驟不僅會拉長純化製程,且會造成低膠原蛋白產率。
因醫藥應用上需要純度較高之膠原蛋白來製備傷口敷料,所以本發明改善了傳統製備膠原蛋白的方法,不需經過重複鹽析或透析等繁複步驟來提高膠原蛋白純度,即可製得高純度之膠原蛋白,並提供品質更佳(純度更高)和更經濟之膠原蛋白來製備醫藥應用上所需之傷口敷料。
首先,本發明係提供一種膠原蛋白傷口敷料的製備方法,其中該方法之步驟包括:
(1)將含有膠原蛋白之陸生動物或水生動物組織以強酸或強鹼溶液清洗後,再以純水洗除殘留的強酸或強鹼溶液,最後得一清洗後之乾淨組織;其中該陸生動物或水生動物係為牛、雞、羊、馬、豬、鴨、鵝、魚類或軟體動物;其中該強酸溶液係為鹽酸、硝酸或硫酸;其中該強鹼溶液係為氫氧化鈉或氫氧化鉀;(2)將該乾淨組織以酸溶液軟化並初步絞碎後,加入純水並加以均質直到該乾淨組織完全溶解,最後得一均質液;其中該酸溶液係為甲酸、羧酸、草酸、醋酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸、硼酸、磷酸、鹽酸或其混合物;其中可於均質液中加入一酵素並以低溫攪拌處理16~24小時,以去除過敏原(telopeptide);其中該酵素係為胰蛋白酶(trypsin)、木瓜酵素(papain)、胃蛋白酵素(pepsin)、鳳梨酵素(bromelain)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)或其混合物;(3)將該均質液過濾後,調整該過濾後均質液之pH值至7-8之間,然後將該過濾後均質液風乾,最後得一風乾後之膠原蛋白;(4)將該風乾後之膠原蛋白於弱鹼溶液中浸泡30-120分鐘後,取出該風乾後之膠原蛋白並以清水清洗,最後得一膠原蛋白片;該弱鹼係為氫氧化鈉(NaOH)、磷酸氫二鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉或其混合物;(5)將該膠原蛋白片冷凍乾燥後,得一高純度膠原蛋白;(6)將該高純度膠原蛋白高速均質溶於酸中,並加入鹼性溶液、交聯劑及磷酸鹽類緩衝溶液,最後得一均質膠原蛋白;(7)將該均質膠原蛋白於烘箱中烘乾使其凝成果凍狀後,以-80℃急速冷凍,得一結凍之膠原蛋白;
(8)將該結凍之膠原蛋白進行冷凍乾燥,得一冷凍乾燥膠原蛋白片;(9)將該冷凍乾燥膠原蛋白片靜置於濕度為55-77%的室溫中24小時,以促使交聯反應持續作用並定形;(10)將步驟(9)定形後之膠原蛋白片清洗去雜質後,冷凍乾燥得一高純度膠原蛋白傷口敷料。
其中該動物組織如帶有毛囊細胞,則於上述步驟(1)後,進行下列步驟:(1)將該乾淨組織以酵素溶液及鹽類進行去毛囊處理,得一去毛囊組織;其中該酵素溶液係為胰蛋白酶(trypsin)、木瓜酵素(papain)、胃蛋白酵素(pepsin)、鳳梨酵素(bromelain)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)或其混合物;其中該鹽類係為氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、磷酸鹽類、碳酸鹽類或其混合物;(2)將該去毛囊組織以1M鹽水清洗1小時,再以純水清洗殘留於該去毛囊組織之溶液,最後得一清洗後之乾淨組織;(3)將該乾淨組織繼續以上述步驟(2)-(10)的方式處理,最後得一高純度膠原蛋白傷口敷料。
本發明的另一目的係提供一種以上述膠原蛋白傷口敷料的製備方法所製備之高純度膠原蛋白傷口敷料。
其中該高純度膠原蛋白傷口敷料之純度為至少99.2%。
S101‧‧‧取膠原蛋白結締組織
S102‧‧‧強酸或強鹼處理
S102a‧‧‧去除毛囊
S103‧‧‧均質-酸處理
S104‧‧‧去除過敏原-酵素處理
S105‧‧‧調整pH值
S106‧‧‧風乾
S107‧‧‧覆水-弱鹼處理
S108‧‧‧清洗
S109‧‧‧凍乾
S120‧‧‧高純度膠原蛋白
S201‧‧‧高純度膠原蛋白
S202‧‧‧製備敷料均質液
S203‧‧‧製備敷料片
S204‧‧‧敷料片凍乾I
S205‧‧‧敷料片覆水
S206‧‧‧敷料片清洗
S207‧‧‧敷料片凍乾II
第1圖 高純度膠原蛋白萃取流程圖。
第2圖 高純度膠原蛋白傷口敷料片製備流程圖。
本發明係以下面的實施例予以示範闡明,但本發明不受下述實施例所限制。
實施例一 高純度膠原蛋白之萃取
步驟1:取得欲萃取膠原蛋白之結締組織,該組織包含但不限於真皮組織、筋腱、皮下組織及軟骨組織,材料來源可為畜類(牛、雞、羊、馬、豬、鴨、鵝)、魚類及軟體動物(水母、蝸牛)(第1圖S101)。
步驟2:將取得之結締組織,先以人工或機械去除毛髮或含膠原蛋白量低之組織(如黏膜、血管),並以一強酸或強鹼加以溶蝕清洗(第1圖S102)。若有必要,可將組織薄片化,並以酵素溶液軟化結締組織後,再以高鹽類配合超音波或強烈震盪清除殘存之毛髮、毛根(第1圖S102a);其中該酵素溶液包含但不限於胰蛋白酶(trypsin)、木瓜酵素(papain)、胃蛋白酵素(pepsin)、鳳梨酵素(bromelain)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)及其混合物;其中該鹽類包含氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、磷酸鹽類、碳酸鹽類或其混合物。
步驟3:製備膠原蛋白萃取液,將該結締組織溶於酸中均質(第1圖S103),均質後以酵素低溫攪拌處理16~24小時,以去除過敏原(telopeptide)(第1圖S104),最後得到一膠原蛋白萃取液;其中該酸溶液包含但不限於甲酸、羧酸、草酸、醋酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸、硼酸、磷酸、鹽酸或其混合物;而該酵素為胰蛋白酶(trypsin)、木瓜酵素(papain)、胃蛋白酵素(pepsin)、鳳梨酵素(bromelain)、胰凝乳蛋白酶
(chymotrypsin)或其混合物。
步驟4:將該膠原蛋白萃取液之pH值調整至7~8(第1圖S105),過濾去除雜質後,倒入盤中置入烘箱製備膠原蛋白薄片,此烘箱為一可乾燥之設備,具有加熱或風吹功能,使膠原蛋白萃取液可自然風乾成膠原蛋白薄片,但該膠原蛋白薄片仍保有5~25%的水分(第1圖S106)。
步驟5:將風乾之膠原蛋白薄片浸泡於弱鹼溶液中,使其吸足水分形成膠原蛋白薄膜並加以脫膜(將膠原蛋白薄片自弱鹼溶液中取出)(第1圖S107);其中該鹼溶液包含但不限於氫氧化鈉(NaOH)、磷酸氫二鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉或其混合物。
步驟6:脫膜後之膠原蛋白薄片以清洗液或純水清洗,清洗過程可以浸泡、上下震盪或超音波處理,至少清洗2小時(第1圖S108);清洗液可包含但不限於磷酸緩衝溶液(PBS)、碳酸鹽緩衝溶液、Tris-HCl緩衝溶液、十二烷基硫酸鈉(SDS)、Tego化合物(例如介面活性劑Tween、非離子清潔劑Triton)。
步驟7:將清洗完之膠原蛋白薄片冷凍乾燥(第1圖S109),即為具完整結構之高純度膠原蛋白(第1圖S110)。
其中該高純度膠原蛋白的純度經美和科技大學農產品檢驗服務中心之檢測,其純度為99.2%(附件)。
實施例二 膠原蛋白傷口敷料的製備
步驟一:製備敷料均質液(第2圖S201、S202)
1.將實施例一中所製備之膠原蛋白片加入純水並以高速攪拌機攪拌,攪 後加入酸性溶液(可為任何酸性溶液,如甲酸、羧酸、草酸、醋酸、檸檬酸、
乳酸、蘋果酸、硼酸、磷酸、鹽酸或其混合物等),並將pH值調整至1-4,進行攪拌直到膠原蛋白片完全溶解。
2.加入鹼性溶液(可為任何鹼性溶液,如氫氧化鈉(NaOH)、磷酸氫二鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉或其混合物等),來中和酸性,最後將pH值調整為7.2。
3.加入交聯劑(每400ml之膠原蛋白液加入0.2ml之交聯劑乙二醇二縮水甘油醚),並加入磷酸鹽類Buffer使其為等張溶液,然後抽真空均勻攪拌後,即得一膠原蛋白傷口敷料均質液。
步驟二:製備敷料片(第2圖S203)
1.將調配好之膠原蛋白傷口敷料均質液,倒入模具盤,並讓均質液均勻分布在模具盤表面。
2.將模具盤平放於40℃環境中1小時,然後取出降溫。
3.將模具盤分批置入-80℃冰箱中,使其結凍。
步驟三:敷料片凍乾I(第2圖S204)
1.預冷冷凍乾燥機(將冷凍乾燥機內之層板溫度降至-30℃以下)
2.將結凍之膠原蛋白傷口敷料片由-80℃冰箱內取出,並檢查是否結凍破裂,然後放入預冷之冷凍乾燥機中,開啟程式進行凍乾,凍乾時間至少48小時(凍乾溫度為-20℃~25℃)。
步驟四:敷料片覆水(第2圖S205)
1.將膠原蛋白傷口敷料片自模具盤脫模後,平放於鐵架上,並靜置於濕度為55-70%的室溫。
2.靜置至少24小時以上後,即完成覆水。
步驟五:敷料片清洗(第2圖S206)
1.將覆水後之膠原蛋白傷口敷料片,一片一片接續放入清水中,確定每一單位面積之敷料片都有浸水。
2.重覆以清水清洗,直到水的電導度<2μ‧s。
敷料片凍乾II(第2圖S207)
1.將清洗後之膠原蛋白傷口敷料片,放入預冷之冷凍乾燥機中結凍(-30℃以下)。
2.檢查確定結凍後,開啟程式進行凍乾,凍乾時間至少40小時(凍乾溫度為-20℃~25℃)。
3.凍乾完成後之成品即高純度膠原蛋白傷口敷料片(第2圖S208),可直接將該高純度膠原蛋白傷口敷料片進行裁片並包裝,或置於濕度低於30%的乾燥箱中儲存。
綜上所述,本發明改善了傳統製備膠原蛋白的方法,不需經過重複鹽析或透析等繁複步驟,即可製得高純度之膠原蛋白,並提供品質更加(純度更高)和更經濟之膠原蛋白來製備醫藥應用上所需之傷口敷料。
上述實施例及圖式僅為本發明之較佳實施例而已,當不能以之限定本發明實施之範圍,即大凡依本發明申請專利範圍所作之均等變化與修飾,皆應屬本發明專利涵蓋之範圍內。
S201‧‧‧高純度膠原蛋白
S202‧‧‧製備敷料均質液
S203‧‧‧製備敷料片
S204‧‧‧敷料片凍乾I
S205‧‧‧敷料片覆水
S206‧‧‧敷料片清洗
S207‧‧‧敷料片凍乾II
Claims (13)
- 一種膠原蛋白傷口敷料的製備方法,其中該方法之步驟包括:(1)將含有膠原蛋白之組織以強酸或強鹼溶液清洗後,再以純水洗除殘留的強酸或強鹼溶液,最後得一清洗後之乾淨組織;(2)將該乾淨組織以酸溶液軟化並初步絞碎後,加入純水並加以均質直到該乾淨組織完全溶解,最後得一均質液;(3)將該均質液過濾後,調整該過濾後均質液之pH值至7-8之間,然後將該過濾後均質液風乾,最後得一風乾之膠原蛋白;(4)將該風乾後之膠原蛋白於弱鹼溶液中浸泡30-120分鐘後,取出該風乾後之膠原蛋白並以清水清洗,最後得一膠原蛋白片;(5)將該膠原蛋白片冷凍乾燥後,得一高純度膠原蛋白;(6)將該高純度膠原蛋白高速均質溶於酸中,並加入鹼性溶液、交聯劑及磷酸鹽類緩衝溶液,最後得一均質膠原蛋白;(7)將該均質膠原蛋白於烘箱中烘乾使其凝成果凍狀後,以-80℃急速冷凍,得一結凍之膠原蛋白;(8)將該結凍之膠原蛋白進行冷凍乾燥,得一冷凍乾燥膠原蛋白片;(9)將該冷凍乾燥膠原蛋白片靜置於濕度為55-77%的室溫中24小時,以促使交聯反應持續作用並定形,最後得一定形後之膠原蛋白片;(10)將該定形後之膠原蛋白片清洗去雜質後,冷凍乾燥得一高純度膠原蛋白傷口敷料。
- 如申請專利範圍第1項所述之膠原蛋白傷口敷料的製備方法,其中該膠原蛋白之組織係陸生動物或水生動物之組織。
- 如申請專利範圍第2項所述之膠原蛋白傷口敷料的製備方法,其中該膠原蛋白之組織係為牛、雞、羊、馬、豬、鴨、鵝、魚類或軟體動物之組織。
- 如申請專利範圍第1項所述之膠原蛋白傷口敷料的製備方法,其中該動物組織如帶有毛囊細胞,則於步驟(1)後,進行下列步驟:(1)將該乾淨組織以酵素溶液及鹽類進行去毛囊處理,得一去毛囊組織;(2)將該去毛囊組織以1M鹽水清洗1小時,再以純水清洗殘留於該去毛囊組織之溶液,最後得一清洗後之乾淨組織;(3)將該乾淨組織以如申請專利範圍第1項步驟(2)-(10)所述的方式處理,最後得一高純度膠原蛋白傷口敷料。
- 如申請專利範圍第4項所述之膠原蛋白傷口敷料的製備方法,其中該酵素溶液係為胰蛋白酶(trypsin)、木瓜酵素(papain)、胃蛋白酵素(pepsin)、鳳梨酵素(bromelain)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)或其混合物,其中該鹽類係為氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、磷酸鹽類、碳酸鹽類或其混合物。
- 如申請專利範圍第1項所述之膠原蛋白傷口敷料的製備方法,其中該強酸溶液係為鹽酸、硝酸或硫酸;其中該強鹼溶液係為氫氧化鈉或氫氧化鉀。
- 如申請專利範圍第1項所述之膠原蛋白傷口敷料的製備方法,其中步驟(2)中之該酸溶液係為甲酸、羧酸、草酸、醋酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸、硼酸、磷酸、鹽酸或其混合物。
- 如申請專利範圍第1項所述之膠原蛋白傷口敷料的製備方法,其中可於步驟(2)中之均質液,加入一酵素並以低溫攪拌處理16~24小時,以去除過敏原(telopeptide)。
- 如申請專利範圍第8項所述之膠原蛋白傷口敷料的製備方法,其中該酵素係為胰蛋白酶(trypsin)、木瓜酵素(papain)、胃蛋白酵素(pepsin)、鳳梨酵素(bromelain)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)或其混合物。
- 如申請專利範圍第1項所述之膠原蛋白傷口敷料的製備方法,其中步驟(3)中該風乾後之膠原蛋白之水分含量為5~25%。
- 如申請專利範圍第1項所述之膠原蛋白傷口敷料的製備方法,其中步驟(4)中之該弱鹼係為氫氧化鈉(NaOH)、磷酸氫二鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉或其混合物。
- 一種以申請專利範圍第1項所述之方法製備之高純度膠原蛋白傷口敷料。
- 如申請專利範圍第12項所述之高純度膠原蛋白傷口敷料,其中該高純度膠原蛋白傷口敷料之純度為至少99.2%。
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