TW201617099A - 促進組織再生之高分子結構 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種可促進組織再生的高分子結構，包含一聚胺酯以及一捲曲螺旋Rho相關蛋白抑制劑。本發明之促進組織再生的高分子結構製作過程中不需使用交聯劑、光起始劑或有機溶劑，即可製成彈性及機械性質優良的高分子支架，並可容易地含入生長因子及水性藥物。

Description

促進組織再生之高分子結構

本發明係關於一種高分子結構，尤其係關於一種由聚胺酯材料製成之可促進組織再生的高分子結構。

當軟骨受損的時候，因為軟骨內缺乏血管生成，軟骨的自我修復是很困難。組織工程利用三維生物可降解支架與細胞之結合，以使移殖組織生長。軟骨細胞因為細胞來源問題以及培養時反分化為纖維母細胞的傾向，於軟骨組織工程的利用非常侷限。間葉幹細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)為幹細胞的一種，可從胎兒或成人的多種組織中分離而得，包括胎盤、臍帶血、骨髓以及脂肪組織。間葉幹細胞可經過多品系分化，其中亦可分化為軟骨細胞，故間葉幹細胞為軟骨組織工程上的一種有潛力的細胞來源。

間葉幹細胞之軟骨分化可經由生物物理與生物化學刺激的方式誘導。轉化生長因子β(TGFβ)家族之成員是最常用於誘導軟骨分化的因子。然而，轉化生長因子β的價格昂貴，且在轉化生長因子β持續的高濃度下會引起軟骨細胞肥大。另一方面，小分子量化合物Y-27632[(1R，4R)-4-((R)-1-氨基乙基)-N-(吡啶-4-基)環己烷甲酰胺)；(1R,4r)-4-((R)-1-aminoethyl)-N-(pyridin-4-yl)cyclohexanecarboxamide,C₁₄H₂₁N₃O,247.34g mol^-1]是含有捲曲螺旋Rho相關蛋白酶(Rho-associated coiled-coil containing protein kinase，ROCK)之抑制劑。Y-27632在臨床試驗中是用於心臟衰竭、高血壓、以及角膜內皮疾病。Y-27632被發現可降低肌動蛋白之聚合作用並 增強軟骨前驅細胞之軟骨生成基因表現，然而，Y-27632在間葉幹細胞上的效果取決於細胞密度與細胞形狀。例如，間葉幹細胞在低密度培養時以Y-27632處理不會影響軟骨分化，這顯示培養條件對Y-27632調節間葉幹細胞之分化是很重要的。

在生物細胞的領域中，通常會認為三維培養比二維單層培養 有更好的生物模擬性。大量的三維細胞培養方法因此應運而生，例如水凝膠(hydrogel)培養、懸浮(suspension)培養、懸滴(hanging drop)培養、微團(micromass)培養、以及無接觸(non-adherent)基質。然而，因為水凝膠內細胞間交互作用低，水凝膠培養與其他的培養方法可能不是很適合用於間葉幹細胞的軟骨化。另一方面，懸浮培養或非接觸基質培養因為缺乏細胞貼附，會造成細胞死亡。先前研究顯示，透明質酸修飾甲殼素成員的高分子生物材料，可用於生成間葉幹細胞之多細胞球體或是聚集體。前述之多細胞聚集體為間葉幹細胞成長於這些基質上的自我組裝，且間葉幹細胞的軟骨分化潛力會經由形成聚集體而提升，惟該些材料與方法皆為二維培養，欲於三維的支架中具有幹細胞的聚集體，仍需將幹細胞的聚集體移植至三維支架內或是找尋方法於支架中形成幹細胞的聚集體。在軟骨組織工程中，多孔支架可提供組織再生必要的機械上支撐與間葉幹細胞生物物理訊號。然而，間葉幹細胞的多細胞聚集體可能會因為微環境的改變而失去其三維結構，難以維持其完整性地植入一多孔支架。因此，在組織修復的植入物領域中，仍待研發一種幹細胞可在其中形成聚集體之多孔支架。

三維列印是一種快速原型設計與製造的技術，可用於製造多 孔支架。一些三維列印方法有用於製造組織工程支架，包括光固化技術(stereolithography，SLA)、雷射燒結技術(selective laser sintering，SLS)、膠水固化噴印技術(power bed and inkjet head 3D printing，PIP)、熔融沉積成形技術(fused deposition manufacturing，FDM)、以及溶液沉積成形技術(liquid- frozen deposition manufacturing，LFDM)。然而，以上述方法製造組織工程支架，除了溶液沉積成形技術之外皆需要具有毒性的光學起始劑、熱、或是具有毒性的有機溶劑。因組織修復的過程中，生物因子或藥物可作為促進修復之用，然而生長因子容易在有機溶劑或熱高溫下變性失活，而一般有機溶劑的加工過程不適用於含入親水性藥物，因而不適用於製造良好的組織工程支架。而在溶液沉積成形技術中，水性加工的優點為可容易地含入親水性藥物，若要含入生長因子也不會造成其失活。

溶液沉積成形技術所製造的組織工程支架雖然不需具有毒 性的光學起始劑、熱、或是具有毒性的有機溶劑，但目前水性加工之材料選擇有限，目前有使用藻酸鹽(alginate)、膠原蛋白(collagen)或是瓊脂糖(agarose)這些水溶性高分子，但這些高分子的機械性質差，且材料成形後通常需要進行交聯使其形狀固定並增加機械性質。然而，交聯劑通常具有毒性，為體內植入物所極力避免的。

適合的組織工程支架應該要能促進細胞增殖與幫助營養物 質和廢物運輸，此外，應提供一物理-化學微環境以促進間葉幹細胞分化與增進組織修復。間葉幹細胞的狀態可經由基質的硬度、生長因子與細胞形狀來調節。然而，目前要能提供時間-空間控制間葉幹細胞行為之微環境，並且在製程中不經具有毒性的物質處理，是非常困難的。

由上述之問題，本發明提供一種促進組織再生之高分子結構，包含：一聚胺酯，其包含一硬鏈段與一軟鏈段，該硬鏈段係藉由一二異氰酸酯(diisocyanate)與一鏈延長劑(chain extender)反應形成；其中，該軟鏈段係包含聚己內酯二元醇(polycaprolactone diol)、聚己二酸乙二醇丁二醇酯二元醇(polyethylene butylene adipate diol)、聚乳酸二元醇(polylactide diol； PLA diol)、或其組合；以及一捲曲螺旋Rho相關蛋白酶(Rho-associated coiled-coil containing protein kinase，ROCK)之抑制劑。

在本發明之一實施例中，該軟鏈段之聚己內酯二元醇與聚己 二酸乙二醇丁二醇酯二元醇之莫耳百分比例為96%：4%至28%：72%的範圍；在本發明之另一實施例中，該軟鏈段之聚己內酯二元醇與聚乳酸二元醇之莫耳百分比例為96%：4%至28%：72%的範圍；該二異氰酸酯(diisocyanate)為異佛爾酮二異氰酸酯(iso-phorone diisocyanate)，該鏈延長劑為2,2-雙(羥甲基)丙酸(2,2-bis(hydro-xymethyl)propionic acid，DMPA)以及乙二胺(ethylenediamine，EDA)。

在本發明之另一實施例中，該二異氰酸酯、該軟鏈段、及該鏈延長劑之莫耳比例為2.82~4.22：0.8~1.2：2.02~3.02。

在本發明之一實施例中，該高分子結構進一步包含一透明質酸，且該聚胺酯與該透明質酸之比例為71.2~80.8：19.2~28.8。

在本發明之另一實施例中，前述之該捲曲螺旋Rho相關蛋白酶(ROCK)之抑制劑為Y-27632，且該Y-27632之含量為15ppm以上。

在本發明之另一實施例中，該高分子結構為一纖維層積結構，且該纖維層積結構之纖維直徑(Φ_n)約為240~360μm，相鄰纖維個別中心之間距(d_h)約為560~840μm，纖維的大孔徑(d_h-Φ_n)約為320~480μm。

本發明亦提供一種利用前述高分子結構用於製備促進一組織再生之植入物的用途。

於本發明之一實施例中，將該高分子結構進一步植入一幹細胞；且當該組織為軟骨組織時，該幹細胞較佳為間葉幹細胞。

由本發明之技術特徵，利用水性配方製作高分子結構，無需 使用習知的轉化生長因子β(TGFβ)，便能達到誘導間葉幹細胞軟骨化之優異效果；且本發明製作過程中不需使用交聯劑、光起始劑及有機溶劑，便可得到優良彈性以及機械性質的高分子結構。此外，本發明之高分子結構容易含入水性藥物以及生長因子，並且能保有其原有性質與活性，並於實施例中證實於原位形成幹細胞聚集並且經由時間-空間的ROCK抑制劑釋放而增進組織再生。

以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

第一圖係為可降解聚胺酯(PU)奈米粒子之化學結構與合成方法。

第二圖係為從PU/PEO與PU/HA水性溶液利用一三維列印平台(LFDM system)三維列印出支架。PEO與HA用於作為三維列印中的黏性增進劑，並於成品中佔有24%重量百分比。支架的參數：支架直徑、支架厚度、堆疊角度、纖維直徑(Φ_n)、以及相鄰纖維的中心間距(d_h)。

第三圖係為培養於組織培養聚苯乙烯(tissue culture polystyrene，TCPS)、PU、以及甲殼素-透明質酸(CS-HA)膜之間葉幹細胞的形態與分化，其中甲殼素-透明質酸膜係為習知可促進間葉幹細胞聚集者。(A)培養於基本培養液中不同膜上3天後的間葉幹細胞之形態。可看出在PU與CS-HA組別有間葉幹細胞的聚集體(球體)形成。(B)在軟骨誘導培養液或含有Y-27632(10μM)之基本培養液7天或14天之Sox9、aggrecan、及Col II(軟骨生成代表基因)，以及Col I(纖維軟骨)與Col X(肥大軟骨細胞)之表現。基因表現的相對比例係基於以基本培養液培養於TCPS上7天之基因表現進行標準化所得。Y-27632的效果未見於任何以TCPS培養的組別。*代表群組間p<0.05。

第四圖係為生長於三維列印支架之間葉幹細胞的形態、軟骨生成標誌基因表現、基質產物、以及增殖結果。(A)PU/PEO或PU/HA支架中植入後3天之間葉幹細胞聚集體的形態。細胞以紅螢光細胞追蹤(PKH26)標記。在以PU/PEO或PU/HA製造的三維支架可看到間葉幹細胞的聚集體形成。(B)在軟骨生成誘導培養液或含有Y-27632(10μM)之基本培養液培養7或14天之間葉幹細胞的Sox9、aggrecan、Col I、Col II、以及Col X表現。基因表現的相對比率是基於以基本培養液培養於PU/PEO上7天的基因表現以標準化。(C)7天及14天後誘導培養的三維列印支架中GAG含量、細胞數、以及以細胞數標準化的GAG含量。*代表群組間p<0.05。

第五圖(A)PU/PEO與PU/HA支架於37℃浸入磷酸鹽緩衝液的重量損失曲線。(B)自含入不同量Y-27632(0~25ppm)的PU/HA支架，其在37℃/PBS中的Y-27632釋放曲線。

第六圖係為間葉幹細胞在PU/HA/Y支架內之自發性聚集與軟骨生成。(A)製造PU/HA/Y支架之流程圖。(B)生長於含入不同數量之Y-27632的PU/HA/Y支架或是生長於以含有Y-27632(10μM)的基本培養液處理的PU/HA支架7天之間葉幹細胞，於Sox9、aggrecan、Col I、Col II、及Col X之表現。基因表現之相對比率是基於以基本培養液培養於PU/HA/Y 0ppm支架上7天的間葉幹細胞基因表現標準化。(C)生長於PU/HA/Y支架內7天與14天後之間葉幹細胞的GAG含量、細胞數、以及以細胞數標準化之GAG含量。*代表群組間p<0.05。

第七圖係為再生軟骨的組織學檢查。(A)兔軟骨缺陷再生之實驗參數。由PU/HA/Y或PU/HA水溶液經由三維列印製造訂製的支架。在植入兔膝關節軟骨缺陷之前，將間葉幹細胞植入支架內並培養3天。以1,4-二氧雜環(1,4-dioxane)溶液利用相似三維列印方法製作PLGA支架作為對照組。(B)缺陷內植入建構體一個月後的再生軟骨，以番紅/速綠(safranin O/fast green)染色切片之組織學影像。(C)以影像分析出的GAG染色(番紅染劑)之強度以及(D)染色面積。(E)基於切片作出對軟骨評估的ICRS組織學分數。*代表群組間p<0.05。

第八圖係為在三維列印支架內間葉幹細胞之自發性聚集與軟骨生成之可能機制。在PU/HA/Y支架內，間葉幹細胞形成聚集體(間葉凝聚)並伴隨RhoA活性上調。Y-27632釋放然後下調RhoA活性。HA的釋放防止間葉幹細胞分化為肥大的細胞表型。RhoA訊號的時間依賴調節促進間葉幹細胞軟骨生成。

本發明提供一種促進組織再生之高分子結構，包含：一聚胺酯，其包含一硬鏈段與一軟鏈段，該硬鏈段係藉由一二異氰酸酯(diisocyanate)與一鏈延長劑(chain extender)反應形成；其中，該軟鏈段係包含聚己內酯二元醇(polycaprolactone diol)、聚己二酸乙二醇丁二醇酯二元醇(polyethylene butylene adipate diol)、聚乳酸二元醇(polylactide diol；PLA diol)、或其組合；以及一捲曲螺旋Rho相關蛋白酶(Rho-associated coiled-coil containing protein kinase，ROCK)之抑制劑。

在本發明之一實施例中，該軟鏈段之聚己內酯二元醇與聚己二酸乙二醇丁二醇酯二元醇之莫耳百分比例為96%：4%至28%：72%的範圍。在本發明之又一實施例中，該軟鏈段之聚己內酯二元醇與聚乳酸二元 醇之莫耳百分比例為96%：4%至28%：72%的範圍。該二異氰酸酯(diisocyanate)為異佛爾酮二異氰酸酯(isophorone diisocyanate)，該鏈延長劑為2,2-雙(羥甲基)丙酸(2,2-bis(hydroxymethyl)propionic acid，DMPA)以及乙二胺(ethylenediamine，EDA)。

在本發明之另一實施例中，該二異氰酸酯、該軟鏈段、及該鏈延長劑之莫耳比例為2.82~4.22：0.8~1.2：2.02~3.02。

在本發明之一實施例中，該高分子結構進一步包含一透明質酸，且該聚胺酯與該透明質酸之比例為71.2~80.8：19.2~28.8。

在本發明之另一實施例中，前述之該捲曲螺旋Rho相關蛋白酶(ROCK)之抑制劑為Y-27632，且該Y-27632之含量為15ppm以上。

在本發明之另一實施例中，該高分子結構為一纖維層積結構，且該纖維層積結構之纖維直徑(Φ_n)約為240~360μm，相鄰纖維個別中心之間距(d_h)約為560~840μm，纖維的大孔徑(d_h-Φ_n)約為320~480μm。

本發明亦提供一種利用前述高分子結構用於製備促進一組織再生之植入物的用途。

於本發明之一實施例中，將該高分子結構進一步植入一幹細胞；且當該組織為軟骨組織時，該幹細胞較佳為間葉幹細胞。

以下由實施例1~5，例示本發明高分子結構的配方、製法，並由實驗證實本發明高分子結構能夠促進其中的幹細胞聚集以及促進組織再生，且利用高分子支架作為高分子結構之一例示。

本發明說明書所載實施例中，“約”、”約略”或”近似地”一般係指20%，較佳為10%，最佳為5%的範圍內。本文中之數值因量測儀器的不同，或是量測上的差異，本文中的數值係為近似值，在未明確定義的情 況下可隱含「約」「約略」或「近似地」之含義。

本發明說明書所載實施例中，所有實驗皆以重複樣本(n=3~6)測試。每種實驗皆至少三次獨立試驗以確保再現性。數據以平均值±標準差表示。組別間不同變數所造成統計上差異以學生t測試分析。p值小於0.05為具有統計上的顯著差異。

實施例1 三維聚胺酯支架製作 1-1聚胺酯(PU)水性分散液之合成

生物可降解聚胺酯彈性體的軟鏈段，是聚己內酯二元醇(poly(ε-polycaprolactone)diol，PCL diol；M_n 2000Da；Sigma,USA)與聚己二酸乙二醇丁二醇酯二元醇(polyethylene butylene adipate diol，PEBA diol；M_n 2000Da；Greco,Taiwan)各以莫耳比例4：1、3：2、2：3混合，亦即聚己二酸乙二醇丁二醇酯二元醇(PEBA diol)的莫耳百分比例為20%、40%、60%。在本發明之另一實施例中，聚己內酯二元醇(PCL diol)的莫耳百分比例為100%。本發明之又一實施例中，生物可降解聚胺酯彈性體的軟鏈段，是聚己內酯二元醇(PCL diol)與聚乳酸二元醇(polylactide diol；PLA diol；M_n 2000Da，利用習知方法由dilactic acid合成)各以莫耳比例4：1、3：2、2：3混合，亦即聚乳酸二元醇(polylactide diol；PLA diol)的莫耳百分比例為20%、40%、60%。

硬鏈為異佛爾酮二異氰酸酯(isophorone diisocyanate，IPDI；Evonik Degussa GmbH,Germany)，二個鏈延長劑為2,2-雙(羥甲基)丙酸(2,2-bis(hydroxymethyl)propionic acid，DMPA；Sigma,USA)以及乙二胺(ethylenediamine，EDA；Tedia,USA)。IPDI/oligodiols/DMPA/EDA的莫耳比例為3.52：1：1：1.52。預聚合的步驟為先添加聚己內酯二元醇、聚己二酸乙二 醇丁二醇酯二元醇、以及含0.03% Sn(Oct)₂催化劑的IPDI，於75℃、氮氣環境中3小時。之後，DMPA與少量的甲基乙基酮(MEK,J.T.Baker,USA)在相同條件下加入反應1小時。將三乙胺(TEA,R.D.H,USA；DMPA/TEA=1：1)在45℃滴入反應器中以中和DMPA的羧基。30分鐘後，將去離子蒸餾水在劇烈攪拌下快速加入。最後，將EDA加入反應器內並反應30分鐘。剩餘的TEA與MEK以真空蒸餾去除。將水性分散液中的聚胺酯固體量調整至30wt%。聚胺酯奈米粒子之流體動力直徑及表面電位利用次微米粒子分析儀(Delsa Nano,Beckman Coulter,USA)以動態光散射與電泳光散射方法量測。測出聚胺酯奈米粒子之流體動力學的直徑為41.4±2.3nm，表面電位為-55.3±2.8mV，如第一圖所示。

平板狀的聚胺酯膜是用300μL的聚胺酯水性分散液置於15mm顯微鏡蓋玻片(Glaswarenfabrik Karl Hecht KG,Germany)上，並於層流櫃中經過2天的乾燥所製成。該膜在使用前以紫外光曝曬4小時以殺菌。

1-2聚胺酯支架之三維列印

利用聚胺酯的奈米水性分散液以水性基底三維列印技術製造出支架。三維列印技術利用液體冷凍沉積製造(liquid frozen deposition manufacturing；LFDM)搭配一計算機輔助設計/計算機輔助製造(CAD/CAM)系統製造(第二圖)，並利用聚乙烯氧化物(polyethylene oxide；PEO)作為一黏度增強劑。支架的結構以CAD/CAM設計，係以纖維層層堆疊而成。複雜形狀的支架(例如耳狀)可經由此三維列印技術製造。進料通常是一具有黏性的聚合物溶液，充滿進料槽，藉由一固定壓力經過200μm的管口擠壓在一低溫平台(-30℃)上，並堆積成纖維狀。本案纖維堆積的樣式顯示於第二圖。在本發明中，我們欲以透明質酸取代聚乙烯氧化物。在製造支 架之前，聚胺酯分散液與2wt%透明質酸溶液於室溫下混合1天，PU/HA混合完成的最後重量比例為76/24，且PU/HA分散液中的總固體含量為6.7wt%。為列印PU/HA支架，將PU/HA水性分散液填滿注射筒並以36kPa的固定壓力用200μm的管口注射至LFDM的低溫平台(-30℃)。為列印PU/PEO支架，聚胺酯分散液與10%的PEO(Mw 900kDa；Scientific Polymer Products,USA)混合，PU/PEO的重量比例為76/24，且PU/PEO分散液中的總固體量為20wt%。PU/PEO支架亦利用相同的LFDM系統製造。支架為直徑6.5mm、厚度2.5mm之圓盤滾筒。支架之纖維直徑(Φ_n)約為300μm，相鄰纖維個別中心之間距(d_h)約為700μm，故堆積纖維支架之大孔徑(d_h-Φ_n)約為400μm。

三維支架之動態壓縮係數以動態力學分析儀(DMA,Q-800,TA Instruments)在0.1%的張力與1Hz的頻率在37℃下量測。為評估其降解速率，將支架於37℃置於磷酸鹽緩衝溶液(pH=7.2~7.4)中。在7、14、21與28天後，以蒸餾去離子水仔細地清洗支架後於室溫下真空乾燥24小時，並秤重(符號以「W_f」表示)。支架剩餘重量的百分比以下列方程式計算：剩餘重量(%)=W_f/W_i×100%，其中W_i為第0天的初始重量。

PU/PEO(76/24)與PU/HA(76/24)組成物支架係由進料為含有聚胺酯奈米粒子分散液與PEO(Mw 900kDa)或HA(Mw 254kDa)其中之一作為黏性增進劑所列印出。支架的外觀與SEM影像顯示於第二圖。支架於37℃時的動態機械性質列於表一。PU/PEO支架的壓縮係數(E’)(0.48±0.06MPa)些微高於PU/HA支架(0.33±0.02MPa)。PU/HA支架在阻尼係數或損耗參數(loss tangent，tanδ；為應力及應變力之間的相位角的正切值)(0.41±0.03)顯著大於PU/PEO支架(0.18±0.02)。

1-3三維列印支架中Y-27632之加入

於相同的PU/HA支架中，將Y-27632以不同的濃度埋入。聚胺酯分散液(30wt%)以不同體積的HA溶液(2wt%)與Y-27632溶液混合，故最終支架含有5~25ppm的Y-27632。這些支架簡稱為PU/HA/Y支架。

以PU/HA/Y支架置於37℃之磷酸鹽緩衝溶液中評估Y-27632之釋放。利用一微讀取器(SpectraMax M5 Microplate Reader,Molecular Devices)偵測紫外光/可見光光譜，以波長240nm處評估釋放於介質中的Y-27632。

實施例2 人類間葉幹細胞的培養

人類間葉幹細胞由健康母體捐贈的胎盤(懷孕38~40周)中分離出來。胎盤組織以磷酸鹽緩衝液(PBS)沖洗數次後，以機械方式絞碎成漿狀。在以0.25%胰蛋白酶(Gibco,USA)於37℃處理10分鐘後，將該均質的漿狀物培養於低葡萄糖的DMEM培養液(Dulbecco’s modified Eagle’s medium-low glucose，DMEM-LG；Gibco,USA)中，並添加10%(v/v)胎牛血清(FBS,Caisson Laboratories,USA)、1%(v/v)青黴素-鏈黴素(Gibco,USA)、0.4%(v/v)、建它黴素(gentamicin)、以及10mg/L左旋麩醯胺酸(L-glutamine)，培養於之37℃/5% CO₂培養箱中。每週更換培養液2次。本發 明實施例係使用13至17代之細胞。

實施例3 在聚胺酯膜上間葉幹細胞之自我組裝與Y-27632在軟骨生成的基質依賴作用

將人類間葉幹細胞(5×10⁴個細胞)植入24孔組織培養盤內的聚胺酯膜(由實施例一製造得到)。將細胞植入於組織培養孔(TCPS)內作為控制組。細胞的形態以倒立顯微鏡(Leica DMIRB)觀察。另一個比較的基質為甲殼素-透明質酸膜，係可促進間葉幹細胞的聚集形成與軟骨分化。甲殼素-透明質酸膜以透明質酸接枝於甲殼素膜上而製成，以避免透明質酸溶解於水中。甲殼素膜以1%(w/v)甲殼素溶於1%(v/v)乙酸之溶液，置於15mm蓋玻片(300μL/片)上再經由層流櫃乾燥而成。利用0.5N氫氧化鈉處理5分鐘後以蒸餾去離子水清洗，3mg/mL的透明質酸溶液(Mw 2,500kDa；SciVision Biotech Inc.,Taiwan)300μL滴於有甲殼素膜覆蓋的蓋玻片上，並以乙酯(甲基氨基丙基)碳二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)於4℃反應48小時(HA/EDC/NHS之重量比例為1：1.84：0.23)。甲殼素-透明質酸膜以磷酸鹽緩衝溶液沖洗三次並於使用前以75%酒精滅菌5分鐘。

軟骨分化試驗是將細胞培養於軟骨生成培養液或添加10μM Y-27632的基本培養液中。軟骨生成培養液為含有10ng/mL TGFβ3(CytoLab/Peprotech,Rehovot,Israel)、0.1μM地塞米松(dexamethasone；Sigma,USA)、40μg/mL左旋脯氨酸(L-proline；Sigma,USA)、50μg/mL抗壞血酸-2-磷酸(ascorbate-2-phosphate；Sigma,USA)、1%胰島素-運鐵蛋白質-硒預混物(insuline-transferrine-selenium(ITS)-premix；100x；Sigma,USA),1%(v/v)聚苯乙烯(PS)、以及0.4%(v/v)建它黴素(gentamicin)的DMEM-LG。在間葉幹細胞培養於膜上3天後，將基本培養液更換為誘導培養液。再培養7天後(最 初植入後10天)與14天後(最初植入後17天)，利用Chromo 4 PTC200溫度循環器(MJ Research,USA)與DyNAmo Flash SYBR Green qPCR套組(Finnzymes Oy,Espoo,Finland)以定量反轉錄聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)分析軟骨生成的標誌基因(SRY-box containing gene 9，Sox9)、蛋白聚醣(aggrecan)、以及第二型膠原蛋白(collagen type II；Col II)、細胞肥大之標誌基因(第十型膠原蛋白(collagen type X；Col X)、以及細胞纖維化之標誌基因(第一型膠原蛋白(collagen type I；Col I)的表現。計算其基因表現程度，並以同一樣本中的甘油醛-3-磷酸去氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase；GAPDH)標準化該些表現程度。引子序列列表於表二。

在不同材料上3天的間葉幹細胞形態如第三A圖所示。間葉幹細胞以纖維狀形態貼附於TCPS，而在聚胺酯或CS-HA膜上3天後，間葉幹細胞自組裝為三維聚集狀。間葉幹細胞在CS-HA膜上聚集的形狀較聚胺酯膜上更接近球形。3天後，經由含有TGFβ3的培養液或含有Y-27632的基本培養液誘導軟骨分化。Y-27632的濃度(10μM)係選自對於軟骨生成的最佳作用 濃度。如第三B圖所示，聚胺酯或CS-HA膜上的間葉幹細胞在誘導培養液中培養7天或14天後，其軟骨生成的代表基因(Sox9、aggrecan、及Col II)顯著上調。Y-27632的作用證實其可作為聚胺酯或CS-HA膜上細胞之軟骨誘導培養液。生長於TCPS上的間葉幹細胞，相對於生長於其他二種材料的間葉幹細胞，其Col X基因(肥大標誌)顯著上調。Y-27632引起的軟骨生成效果僅於聚集的間葉幹細胞，且以Y-27632處理的間葉幹細胞之Col X基因表現較軟骨誘導組別低。

實施例4 三維支架內的間葉幹細胞 4-1三維支架內的間葉幹細胞之成長與組裝

支架以紫外光殺菌24小時。人類間葉幹細胞懸浮液(20μL；細胞密度5×10⁷mL；總共10⁶個細胞)滴入每一支架之上方中間位置。植入細胞的支架培養於6孔組織培養盤中5小時，加入3mL的細胞培養液。為使更好觀察支架中的細胞形態，利用紅螢光染劑PKH26(Sigma,USA)標記細胞。首先，間葉幹細胞以磷酸鹽緩衝溶液清洗並於200μL稀釋緩衝液中再懸浮。含有1μL PKH26之標記溶液以相同體積的比例加入細胞懸浮液中。5分鐘後，利用含有胎牛血清的培養液終止反應。以倒立螢光顯微鏡(Leica DMIRB,Germany)觀察細胞形態。

3天後，於植入間葉幹細胞之支架施予誘導軟骨生成培養液(或含有Y-27632的基本培養液)。再經過7天與14天後，進行基因分析及生化分析以分析其架構(DNA及葡萄胺聚醣(glycosaminoglycan，GAG)含量)。支架中的細胞數係依據利用Hoechst 33528螢光染色分析所得到的DNA含量決定，係將樣本以-80℃與37℃之間凍融循環處理5次，再與Hoechst 33528螢光染劑在37℃之黑暗中反應1小時。強度利用微量盤分析儀(SpectraMax M5 Microplate Reader,Molecular Devices)之螢光光譜量測，其激發波長為365nm，發射波長為458nm，細胞數量以已知細胞數量之標準曲線計算。GAG含量以二甲基亞甲基藍(DMMB,Sigma,USA)分析評估，係在凍融循環後加入DMMB染劑於室溫反應30分鐘。強度以波長為525nm之紫外光/可見光光譜量測，且GAG的量以硫酸軟骨素C(Sigma,USA)之標準曲線計算。

因為聚胺酯支架表面的親水性，細胞懸浮液可以在沒有預濕潤的情況下能夠簡單且有效率地植入聚胺酯支架內。植入後第3天，在PU/PEO與PU/HA支架內的間葉幹細胞之形態如第四A圖所示。間葉幹細胞在PU/PEO與PU/HA支架內傾向聚集。PU/PEO與PU/HA支架內的間葉幹細胞聚集的形態相似。

4-2間葉幹細胞PU/PEO與PU/HA支架內之軟骨化

在以軟骨化培養液(含有TGFβ3)誘導後，在PU/PEO及PU/HA三維列印支架內的間葉幹細胞之Sox9、aggrecan、及Col II基因皆些微上調(第四B圖)。然而，不想要的基因Col X也上調。與PU/PEO支架相較，PU/HA支架在軟骨化標誌基因顯示較大幅度的上調，並有較小幅度的Col X上調。在每種支架中，含有Y-27632之培養液的軟骨化效果接近含有TGFβ3之培養液。此外，與軟骨化誘導培養液相較，兩種支架中Y-27632皆減低了間葉幹細胞Col X基因的表現。特別是在PU/HA中，在經過Y-27632處理後Col X的表現非常低。也就是說，PU/HA支架結合Y-27632處理顯示有最佳的Col II/Col X比例。

為進一步確認PU/HA支架在有Y-27632處理下的軟骨化效果，量化間葉幹細胞之GAG產物及細胞增殖，如第四C圖所示。在以Y-27632處理或是軟骨化誘導培養液所誘導7與14天後，PU/HA支架比PU/PEO支架 顯示有較高的GAG量。GAG量及細胞數持續增加直到第14天。PU/HA支架於單位細胞之GAG量在誘導後14天仍然是最高的。結果顯示在PU/HA支架中，Y-27632處理有著與TGFβ3相同顯著的誘導間葉幹細胞軟骨化的效果。

4-3間葉幹細胞在PU/HA/Y支架內自發性軟骨化

支架在磷酸鹽緩衝溶液中經過28天之重量損失曲線如第五A圖所示。PU/PEO與PU/HA支架顯示在一天內大於20%的快速初始重量損失，應是因為PEO與HA之可溶性所致。在第7與第28天之間，支架約有15%的重量損失，應是聚胺酯的降解所致。水性基底的方法與支架之溶解/分解可使包埋的生物活性物質釋放，例如Y-27632。當Y-27632以不同的量(高達25ppm)加入PU/HA支架中，會緩慢釋放並持續至少8天(除了PU/HA/Y 5ppm)(第五B圖)。特別是，含有25ppm之PU/HA/Y支架3天後(間葉幹細胞聚集的時間間隔)累積釋放的Y-27632量接近Y-27632在培養液之誘導間葉幹細胞聚集體軟骨化之有效濃度(~10μM)。

間葉幹細胞在三維列印PU/HA/Y支架內自發性的軟骨化顯示於第六A圖。包埋15ppm或更多的Y-27632之PU/HA/Y支架內的間葉幹細胞在Sox9與aggrecan基因表現顯著上調(第六B圖)。包埋20ppm以上的Y-27632之支架內的間葉幹細胞在Col II基因表現上調。所有組別的Col X表現皆非常低。尤其含有25ppm之PU/HA/Y支架，與外加Y-27632誘導(於培養液中含有10μM之Y-27632)有相似的軟骨化效果。這個結果進一步以每一支架或是逐細胞之GAG分析證實(第六C圖)。基於上述結果，PU/HA/Y支架(25ppm)內間葉幹細胞之自發性軟骨化與PU/HA支架內間葉幹細胞經由TGFβ3誘導之軟骨化同樣顯著。利用這二種支架的培養方法中，GAG產物約為25μg/10⁶cells。

實施例5 動物植入實驗

本實施例使用成年雄性紐西蘭白兔(重量3~3.5kg)。以不鏽鋼鑽頭於股骨髁製造一個直徑4mm、深度2mm圓柱形的缺陷。兔間葉幹細胞取自兔皮下脂肪組織。間葉幹細胞培養於DMEM-LG/營養混合物F-12(DMEM-LG/F12,1：1)(Gibco,USA)，並添加10%(v/v)的胎牛血清(Gibco,USA)、1%青黴素-鏈黴素、以及0.4%(v/v)建它黴素。以第1~2代之間葉幹細胞作為植入之用。聚乳酸-乙醇酸共聚物(polylactic-co-glycolic acid，PLGA)支架之製造，係以PLGA(聚乳酸/乙醇酸=50/50；i.v.=0.54dl/g；Green Square,Taiwan)溶於1,4二氧雜環己烷(1,4 dioxane；Showa,Japan)中，利用相同的LFDM平台搭配不同的溫度/壓力條件。平台的溫度設定於-20℃，壓力固定於27kPa。將PLGA支架於使用前在培養液中1小時預濕潤。每一種支架(PU/HA、PU/HA/Y-27632或PLGA支架)之每一支架皆植入1×10⁶個兔間葉幹細胞，並於植入兔體內之前培養於基本培養液72小時而成為建構體。將建構體植入到缺陷內(每組n=3)。4週後，將該建構體自缺陷位置中取出並施以組織學檢查。

組織學標本以磷酸鹽緩衝溶液清洗並以3.7%(v/v)甲醛固定。24小時以後，該建構體利用10%(v/v)甲酸去除鈣質至少1週，於漸進濃度的乙醇中脫水，包埋於石蠟中，切割成6μm厚的切片，並以蘇木素與伊紅(hematoxylin and eosin，H&E)或是番紅/速綠(safranin O/fast green)染色。染色的切片以光學顯微鏡觀察。照片以光源的相同強度拍攝。紅色染色部份的強度與面積以LabWorks^TM影像系統分析與量化。為經由國際軟骨修復協會(International Cartilage Repair Society，ICRS)評估軟骨再生，取得照片並由兩位觀察員盲評(blindly graded)其透明基質形成與軟骨/軟骨下骨結構。

因為三維列印PU/HA/Y支架的突出軟骨化效果，選擇此支架植入兔軟骨缺陷中以初步評估其於體內的效果(第七A圖)。基於組織染色後一個月，植入間葉幹細胞之PU/HA/Y支架相較於植入間葉幹細胞之PU/HA或PLGA支架有較佳的再生效果(第七B圖)。GAG染色(番紅)量化的強度也有相似的趨勢(第七C圖)。平均染色區域最高的是在PU/HA/Y組別，但不具有顯著差異(第七D圖)。ICRS組織學分數最高的是在PU/HA/Y組別，接著是PU/HA與PLGA組別(第七E圖)。

由以上實施例及實驗結果可知，間葉幹細胞聚集通常代表比單一間葉幹細胞有較佳的分化能力。間葉幹細胞之凝聚(condensation)是其軟骨分化的一個重要條件。生長於HA膜上的間葉幹細胞可自組裝為三維聚集體或球體，而交聯是避免其於培養液中崩解的一個必要步驟。雖然有其他不同的方法用於產生與培養間葉幹細胞的聚集體，但未有研究成功於三維支架中使間葉幹細胞呈現自發性聚集。間葉幹細胞的聚集體，一旦注射至三維支架內，可能因微環境改變而喪失其三維結構。本案帶負電的水性聚胺酯彈性體相較於其他聚合物有幾個優點，包括綠色合成/製程、親水性、可調的生物降解率、以及可含入親水或非親水的藥物。在本案中，我們將間葉幹細胞植入於聚胺酯膜上可自組裝為三維聚集體，可能是因為聚胺酯膜表面的親水性及負電性所造成。此外，在聚胺酯膜上的間葉幹細胞聚集體之軟骨化標誌基因(Sox9、aggrecan、及Col II)表現相較於生長於TCPS上的單一間葉幹細胞顯著上調。間葉幹細胞的這種自組裝行為，已在甲殼素及透明質酸接枝的甲殼素膜上培養的間葉幹細胞中被發現。因為本發明之聚胺酯支架的彈性性質與軟骨類似，間葉幹細胞同樣可以在聚胺酯支架上自組裝，且在支架內自發性三維自組裝的間葉幹細胞在軟骨組織工程中有較佳的應用。

雖然先前研究發現以Y-27632處理軟骨前驅細胞可促進軟骨 化基因表現。然而，Y-27632在間葉幹細胞上的效果取決於細胞密度與細胞形狀。本發明實施例顯示Y-27632處理並未促進培養於TCPS上的間葉幹細胞軟骨分化。相對地，在聚胺酯或HA接枝的甲殼素膜上的間葉幹細胞聚集體以Y-27632處理，會與以TGFβ3處理有相似程度的誘導軟骨生成基因的表現與GAG分泌。

三維列印在製造組織工程支架上有許多優點，例如製作快速與高精密度。通常三維列印支架在製程中會利用高溫與具毒性的溶劑。水溶性聚合物亦可列印，但需要一交聯劑以形成支架。因為間葉幹細胞的聚集體，一旦注射至三維支架內，可能因微環境改變而喪失其三維結構，因此，間葉幹細胞在PU/PEO與PU/HA支架內的自發性的細胞自組裝與聚集可視為比植入支架前預先形成間葉幹細胞聚集體更好。PEO缺乏生物活性。軟骨化誘導後的PU/PEO支架內肥大基因(Col X)表現上調。透明質酸是成體關節軟骨中所含有的一種多醣類。透明質酸對軟骨形成很重要，且於間葉細胞凝聚期間調節其分化。透明質酸也防止間葉幹細胞分化成肥大的性狀。本案中，透明質酸用於替代PEO以達到適於列印的流變狀態(rheological state)。PU/PEO與PU/HA支架的壓縮係數係於天然軟骨的範圍內。軟骨化基因表現與GAG量的結果顯示PU/HA支架促進間葉幹細胞軟骨生成的效果比PU/PEO支架更佳。此外，於PU/HA支架內生長的間葉幹細胞相較於生長於PU/PEO支架之間葉幹細胞，其Col X之表現程度顯著下調。

PU/PEO與PU/HA支架皆在一天之內顯示有22%的初始重量損失，應是支架內PEO或HA的快速溶解所導致。7天後，PEO或是HA幾乎釋放完畢。7天後支架的重量損失皆來自於聚胺酯的降解。因為支架由水性分散液所列印，Y-27632可以經由添加至進料分散液的方式方便地加入支架中。另外，Y-27632會持續釋放八天。藥物的併入與釋放應是Y-27632的胺基與HA或聚胺酯上的羧基之交互作用而成。然而，顯著的促進軟骨分化效果 只顯示於支架內含入的量大於15ppm。特別是，當含入支架的Y-27632量為25ppm時，支架的軟骨生成作用與利用含有Y-27632之培養液誘導之效果相等。從PU/HA/Y-27632 25ppm支架中釋放出的Y-27632的總濃度是低於用於含有Y-27632之培養液的。應是從支架中釋放出來的Y-27632化合物有高的局部濃度，因此能更有效率地影響細胞功能。

於PU/HA支架中增進軟骨生成以及相關機制列於第八圖。在間葉幹細胞聚集期間，RhoA訊號上調。然後支架中釋放的Y-27632可能下調RhoA活性。RhoA活性短暫增加然後抑制的過程可能會促進間葉幹細胞的軟骨生成。同時，HA的釋放可防止間葉幹細胞肥大。

體內實驗顯示植入PU/HA/Y支架之間葉幹細胞，比起植入PU/HA(未添加Y-27632)支架或傳統PLGA支架之間葉幹細胞有較佳的再生能力。在體內條件下Y-27632的釋放應是連續釋放，因為PU/HA/Y支架有適當的降解速率。另一方面，植入於PU/HA支架的間葉幹細胞比植入於PLGA支架的間葉幹細胞有更高的再生作用。間葉幹細胞傾向於貼附並散佈於PLGA支架堆疊的纖維上。因為間葉幹細胞聚集體比散佈的間葉幹細胞有更佳的再生能力，PU/HA支架促進自發性間葉幹細胞聚集，因此在體內比PLGA支架更好。

本發明揭露一支架以促進間葉幹細胞之自發性軟骨生成。該支架是由含有HA及Y-27632之聚胺酯分散液，以水性基底的三維列印方法製造。支架在植入細胞之前並不需要預濕潤，即可使細胞聚集並有效率地進行軟骨生成。在兔軟骨缺陷內植入含有間葉幹細胞的PU/HA/Y支架後顯著增進軟骨新生，顯示利用這新穎三維列印PU/HA/Y支架在修復軟骨缺陷的好處。

另外，合成聚胺酯的軟鍊段除了使用聚己內酯二元醇與聚己 二酸乙二醇丁二醇酯二元醇之外，僅使用聚己內酯二元醇或是僅使用聚己二酸乙二醇丁二醇酯二元醇所合成的聚胺酯在培養幹細胞之聚集效果、支架植入修復效果等各方面亦有相同的效果。

綜上所述，經由本發明之技術特徵，利用水性的聚胺酯配方並經由三維列印製作成高分子支架(高分子結構)。本案之高分子結構無需使用習知的轉化生長因子β(TGFβ)，便能達到誘導間葉幹細胞軟骨化之優異效果；且本發明製作過程中不需使用具有毒性的交聯劑、光起始劑、及有機溶劑，便可得到優良彈性以及機械性質的高分子結構。此外，本發明之高分子結構容易含入水性藥物以及生長因子，並且因為不需要經過會使生物活性分子失活的高溫製程，而能保有其原有性質與活性，並於實施例中證實植入於本案高分子結構內的幹細胞能自發性地形成幹細胞聚集體且經由時間-空間的ROCK抑制劑釋放而增進組織修復與再生。

<110> 國立臺灣大學

<120> 促進組織再生之高分子結構

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

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Claims (19)

1. 一種促進組織再生之高分子結構，包含：一聚胺酯，其包含一硬鏈段與一軟鏈段，該硬鏈段係藉由一二異氰酸酯(diisocyanate)與一鏈延長劑(chain extender)反應形成；其中，該軟鏈段係包含聚己內酯二元醇(polycaprolactone diol)、聚己二酸乙二醇丁二醇酯二元醇(polyethylene butylene adipate diol)、聚乳酸二元醇(polylactide diol；PLA diol)、或其組合；以及一捲曲螺旋Rho相關蛋白酶(Rho-associated coiled-coil containing protein kinase，ROCK)之抑制劑。
2. 如申請專利範圍第1項所述之高分子結構，其中該軟鏈段之聚己內酯二元醇與聚己二酸乙二醇丁二醇酯二元醇之莫耳百分比例為96%：4%至28%：72%的範圍。
3. 如申請專利範圍第1項所述之高分子結構，其中該軟鏈段之聚己內酯二元醇與聚乳酸二元醇之莫耳百分比例為96%：4%至28%：72%的範圍。
4. 如申請專利範圍第1項所述之高分子結構，其中該二異氰酸酯(diisocyanate)為異佛爾酮二異氰酸酯(isophorone diisocyanate)。
5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之高分子結構，其中該鏈延長劑為2,2-雙(羥甲基)丙酸(2,2-bis(hydroxymethyl)propionic acid，DMPA)以及乙二胺(ethylenediamine，EDA)。
6. 如申請專利範圍第1項所述之高分子結構，其中該二異氰酸酯、該軟鏈段、及該鏈延長劑之莫耳比例為2.82~4.22：0.8~1.2：2.02~3.02。
7. 如申請專利範圍第1項所述之高分子結構，其中進一步包含一透明質酸。
8. 如申請專利範圍第7項所述之高分子結構，其中該聚胺酯與該透明質酸之比例為71.2~80.8：19.2~28.8。
9. 如申請專利範圍第1項所述之高分子結構，其中該捲曲螺旋Rho相關蛋白酶(ROCK)之抑制劑為Y-27632。
10. 如申請專利範圍第9項所述之高分子結構，其中該Y-27632之含量為15ppm以上。
11. 如申請專利範圍第1項所述之高分子結構，其中該高分子結構為一纖維層積結構。
12. 如申請專利範圍第11項所述之高分子結構，其中該纖維層積結構之纖維直徑(Φ_n)約為240~360μm，相鄰纖維個別中心之間距(d_h)約為560~840μm。
13. 如申請專利範圍第11項所述之高分子結構，其中該纖維層積結構之纖維的大孔徑(d_h-Φ_n)約為320~480μm。
14. 如申請專利範圍第1項所述之高分子結構，其中該高分子結構為一高分子支架。
15. 如申請專利範圍第1項所述之高分子結構，其中該高分子結構為一薄膜。
16. 一種利用如申請專利範圍第1項至第15項中任一項所述之高分子結構用於製備促進一組織再生之植入物的用途。
17. 如申請專利範圍第16項所述之用途，其中該高分子結構進一步植入一幹細胞。
18. 如申請專利範圍第16項所述之用途，其中該幹細胞為間葉幹細胞。
19. 如申請專利範圍第16項至第17項中任一項所述之用途，其中該組織為軟骨組織。