TW201603815A

TW201603815A - 氧化鐵奈米粒子於抑制困難梭狀芽孢桿菌之孢子發芽的用途

Info

Publication number: TW201603815A
Application number: TW104123035A
Authority: TW
Inventors: 謝達斌; 蔡佩珍; 李威廷; 李宗儒; 葉晨聖; 吳尚蓉
Original assignee: 國立成功大學
Priority date: 2014-07-17
Filing date: 2015-07-16
Publication date: 2016-02-01
Also published as: CN107041125B; WO2016008444A1; AU2015291533A1; US10086015B2; CN107041125A; EP3177300A4; CA2955498A1; JP6385573B2; CA2955498C; EP3177300B1; AU2015291533B2; JP2017523804A; EP3177300A1; TWI569802B; US20170202879A1

Abstract

本揭示內容是關於Fe3 −δ O4 奈米粒子於抑制困難梭狀芽孢桿菌之孢子發芽的用途。Fe3 −δ O4 奈米粒子可專一標的至困難梭狀芽孢桿菌孢子，並破壞其結構。相較於其他已知具有殺菌功效的奈米粒子，Fe3 −δ O4 奈米粒子具有更為顯著的殺孢子活性。因此，本揭示內容之Fe3 −δ O4 奈米粒子可用以作為一種殺菌劑，或者更具體來說，一種用以治療困難梭狀芽孢桿菌感染之殺孢子劑。

Description

氧化鐵奈米粒子於抑制困難梭狀芽孢桿菌之孢子發芽的用途

本揭示內容是關於抑制困難梭狀芽孢桿菌（Clostridium difficile ）。更具體來說，本揭示內容是關於Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子於抑制困難梭狀芽孢桿菌之孢子發芽的新穎用途。

部分細菌會藉由形成孢子存活於諸如紫外光照射、乾燥、高溫、極冷及化學消毒劑處理等嚴峻及養份缺乏的環境中。一旦環境轉換，孢子可再活化為營養狀態（vegetative state）。因此，芽孢桿菌（Bacillus ）及梭狀芽孢桿菌等會形成孢子的病原體乃為臨床疾病治療及預防之一重大挑戰。困難梭狀芽孢桿菌是一種會對健康產生危害的病原體，困難梭狀芽孢桿菌感染（C. difficile infection, CDI）會造成抗生素治療相關腹瀉、偽膜性腸炎（pseudomembranous colitis）、腹痛、發燒及死亡。目前僅有少數抗生素可用以治療困難梭狀芽孢桿菌感染。然而，第一線抗生素的失效率及治療後的復發率往往偏高。有鑑於此，困難梭狀芽孢桿菌於感染後30天的死亡率約為6.9%，感染1年後的死亡率則約為16.7%。

困難梭狀芽孢桿菌的孢子是造成困難梭狀芽孢桿菌感染的主因之一。相較於對氧氣敏感的營養細菌（vegetative bacteria），困難梭狀芽孢桿菌孢子可於嚴峻的環境下存活數個月。已知腸道中的正常菌叢會抑制困難梭狀芽孢桿菌，並藉此抑制困難梭狀芽孢桿菌感染。然而，長期使用抗生素的病患通常是感染困難梭狀芽孢桿菌的主要族群，且其感染源多是源自醫療人員身上的孢子。一旦孢子進入人類的腸胃道，並接觸到牛膽酸鹽（taurocholate）或其衍生物後，該些孢子會發芽（germinate），進而群聚於結腸。困難梭狀芽孢桿菌的毒性多係取決定tcdA 及tcdB 基因的表現，其會分別表現毒素A（toxin A，一種腸毒素）及毒素B（toxin B，一種細胞毒素）。二種毒素皆會造成腸道發炎，並促使嗜中性球（neutrophil）侵潤至感染部位。

有鑑於感染率逐年增加，如何有效控制困難梭狀芽孢桿菌感染已變成一亟需解決的重要議題。已知包含甲硝唑（Metronidazole）、萬古黴素（Vancomycin）及非達黴素（Fidaxomicin）等不同的抗生素可用以治療困難梭狀芽孢桿菌感染。該些抗生素雖可減緩或阻斷困難梭狀芽孢桿菌感染所造成的症狀，然其亦會導致具有抗性之困難梭狀芽孢桿菌增生。此外，對化學消毒劑具有抗性之孢子會加重臨床上困難梭狀芽孢桿菌感染處理的困難性。某些新穎的膽酸鹽（cholate）衍生物或可治療困難梭狀芽孢桿菌感染，然其多屬臨床前研究階段。次氯酸鈉（sodium hypochlorite）為一種消毒劑，具有顯著的抗菌活性，唯其亦同時會對組織產生腐蝕性及刺激性等副作用。

基於目前已知的治療無法有效治療困難梭狀芽孢桿菌感染，相關領域研究人員正亟力研發可用以解決此健康議題的新穎方法。在該些研究中，奈米粒子已證實可藉由產生自由基（reactive oxygen species）、破壞細胞膜、釋放毒性離子及／或與硫基結合等不同機制產生抗菌功效。該些具有抗菌功效的奈米粒子包含銀（Ag）、氧化鋅（ZnO）、二氧化鈦（TiO₂ ）及零價鐵（zero-valent iron）奈米粒子。然而，多數抗菌奈米粒子僅對營養細胞（vegetative cell）具有生物毒殺活性，而不會對孢子產生殺孢子功效。

有鑑於此，相關領域亟需一種有效且具生物相容性的孢子抑制劑，藉以控制孢子的發芽並治療困難梭狀芽孢桿菌感染。

發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。

本揭示內容是關於Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子於抑制困難梭狀芽孢桿菌之孢子發芽的新穎用途，其中δ為一介於0到0.3之間的數值。據此，Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子可用以製備一種用以治療困難梭狀芽孢桿菌感染的藥物。

本揭示內容的第一態樣因此是關於一種於活體外抑制困難梭狀芽孢桿菌之孢子發芽的方法。該方法包含將困難梭狀芽孢桿菌之孢子與一有效量之Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子共同培養，其中δ為一介於0到0.3之間的數值。

依據本揭示內容某些實施方式，奈米粒子為一平截八面體粒子（truncated octahedron nanoparticle）；其中，平截八面體的各邊長度約為5到25奈米。在一實施方式中，各邊長度約為14奈米。在另一實施方式中，各邊長度約為22奈米。

依據本揭示內容某些實施方式，奈米粒子的有效量至少為每毫升5微克；較佳的情況是，約為每毫升5到500微克。

本揭示內容亦提供一種用以治療困難梭狀芽孢桿菌感染的醫藥組合物及／或用以治療一罹患或疑以患有困難梭狀芽孢桿菌感染之個體的方法。據此，該組合物包含一有效量之Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子，其中δ為一介於0到0.3之間的數值；以及一藥學上可接受之載體。依據本揭示內容某些實施方式，該奈米粒子為一平截八面體粒子，且八面體的各邊長度約為5到25奈米。在一較佳實施方式中，各邊長度約為14奈米。在另一特定實施方式中，各邊長度約為22奈米。

該方法包含投予該個體一治療有效量之本發明組合物，藉以減緩困難梭狀芽孢桿菌感染的病徵。依據本揭示內容某些實施方式，約投予該個體每公斤體重0.4到4毫克的Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子；較佳的情況是，約投予該個體每公斤體重2到4毫克的Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子。

依據本揭示內容某些實施方式，可以口服、鼻腔或非口服方式投予本發明Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子。一般來說，非口服方法可以是經由肌肉注射、靜脈注射、皮下注射或腹腔注射來投予。

在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數界是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比（例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者）均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一段點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。

除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。

在本說明書中，「非化學計量」（nonstoichiometric）一詞係用以闡述一具有元素組成的化學化合物，其中該元素組成無法以明確定義之自然數比例來表示，因此違反定比定律。亦即，一非化學計量化合物在重量上不包含完全相同比例的元素。

「治療」(treating)一詞包含部份或完全預防、改善、減輕及／或處理困難梭狀芽孢桿菌感染之相關病徵(symptom)、次要病徵(secondary disorder)或症狀(condition)。「治療」(treating)一詞於本說明書中亦指應用或投予本揭示內容之Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子及／或其醫藥組合物至一個體，其係患有困難梭狀芽孢桿菌感染之相關病徵、次要病徵或症狀，以達到部份或完全減輕、減緩、治癒疾病、延遲發病、抑制病程發展、降低疾病嚴重性，及／或降低一或多個癌症之相關病徵、症狀、或次要病徵的發生。困難梭狀芽孢桿菌感染之相關病徵、次要病徵及／或症狀包含，但不侷限於，腹瀉、腹痛、發燒、糞便味道異常、偽膜性腸炎及死亡。在此「治療」(treating)亦可以是施用至患有早期該些病徵或症狀之個體，以降低該個體發展成為困難梭狀芽孢桿菌感染之相關病徵、次要病徵及／或症狀的風險。在此「治療」(treating)為可以有效地減少一個或多個病徵或臨床標記。換句話說，在此治療亦可以是降低、減緩或終止疾病病程、病徵或症狀的發展。

「有效量」(effective amount)在此處係指一藥物的用量足以產生所欲的療效反應。具體的有效量取決於多種因素，如欲治療的特定狀況、患者的生理條件(如患者體重、年齡或性別)、接受治療的哺乳動物或動物的類型、治療持續時間、目前療法(如果有的話)的本質以及所用的具體配方和化合物或其衍生物的結構。有效量亦指一種化合物或組合物，其治療利益效果超越其毒性或有害影響。舉例來說，可將有效量表示成藥物的總重量(譬如以克(g)、毫克(mg)或微克(μg)為單位)，或表示成藥物重量與體重之比例(其單位為毫克／公斤(mg/kg))。亦或是，有效量可以醫藥組合物中活性成份的濃度來表示，例如莫耳濃度(molar concentration)、重量濃度(mass concentration)、體積濃度(volume concentration)、重量莫耳濃度(molality)、莫耳分率(mole fraction)、重量分率(mass fraction)及混合比例(mixing ratio)。習知技藝者可依據動物模式的劑量來計算藥物(如本揭示內容之奈米粒子)的人體等效劑量(human equivalent dose, HED)。舉例來說，習知技藝者可依據美國食品藥物管理局(US Food and Drug Administration, FDA)所公告之「估算成人健康志願者在初始臨床治療測式之最大安全起始劑量」(Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers)來估算人體使用之最高安全劑量。

「個體」(subject)一詞是指包含人類的動物，其係依據本揭示內容之方法，能接受本揭示內容之奈米粒子的治療。除非特定指出，否則「個體」(subject)一詞同時意指男性及女性，且可以是任何年齡，例如兒童或成人。

本發明是關於Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子於抑制困難梭狀芽孢桿菌之孢子發芽的新穎用途，其中δ為一介於0到0.3之間的數值。據此，Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子可用以治療困難梭狀芽孢桿菌感染。

本揭示內容的一態樣因此是關於一種活體外抑制困難梭狀芽孢桿菌之孢子發芽的方法。該方法包含將困難梭狀芽孢桿菌之孢子與一有效量之Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子共同培養，其中δ為一介於0到0.3之間的數值，藉此抑制困難梭狀芽孢桿菌孢子的發芽。相較於Fe₃ O₄ （即磁鐵礦，magnetite）或γ-Fe₂ O₃ （即磁赤鐵礦，maghemite），本揭示內容之Fe₃ −_δ O₄ 為一部份氧化且非化學計量的奈米粒子，其δ為一介於0到0.3之間的非正數數值。

可利用任何習知技藝人士所熟知的方法來製備本發明Fe₃ −_δ O₄ 。舉例來說，可以利用本揭示內容實施例所述之方法來進行製備。一般來說，該方法包含： (1)將乙醯丙酮鐵（iron acetylacetonate）溶於油酸（oleic acid）及三辛胺（trioctylamine）中，以形成一混合溶液； (2)於惰性環境（例如真空或包含氮氣或氬氣的環境）中，分餾步驟(1)之混合液約30分鐘； (3)以磁鐵收集步驟(2)之沉澱物； (4)以甲苯（toluene）洗滌步驟(3)所收集的沉澱物； (5)以磁鐵收集步驟(4)所洗滌的沉澱物； (6)將步驟(5)收集的沉澱物加至包含聚苯乙烯順丁烯二酸（poly(styrene-alt-maleic acid)）的氯仿溶液中，以形成Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子；以及 (7)以磁鐵收集步驟(6)中的Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子。

依據上述方法所製得的Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子為一平截八面體（truncated octahedron nanoparticle）粒子，其中平截八面體的各邊長度約為5到25奈米。舉例來說，該平截八面體的各邊長度可以是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25奈米。在一實施方式中，Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子的邊長約為14奈米。在另一實施方式中，Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子的邊長約為22奈米。

依據本揭示內容某些實施方式，不論邊長為14奈米或22奈米，二種Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子皆可有效抑制困難梭狀芽孢桿菌孢子的發芽。在一實施例中，該困難梭狀芽孢桿菌孢子是源自CCUG 37780菌株。在另一實施例中，該困難梭狀芽孢桿菌孢子是源自CCUG 19126菌株。在再另一實施例中，該困難梭狀芽孢桿菌孢子是源自ATCC BAA-1805菌株。

依據其他實施方式，本揭示內容之Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子具有殺孢子活性，而不會干擾正常菌落中營養細胞的生長。

在本揭示內容的實施方式中，相較於氧化鋅奈米粒子、銀奈米粒子、Fe₂ O₃ 奈米粒子、Fe₃ O₄ 奈米粒子及Fe@Au奈米粒子，Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子更可有效地抑制困難梭狀芽孢桿菌孢子的發芽。

依據本揭示內容一實施方式，Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子可直接結合至困難梭狀芽孢桿菌的孢子表面，藉以破壞孢子的內部結構，造成孢子內蛋白的釋出。

依據本揭示內容某些實施方式，為抑制困難梭狀芽孢桿菌孢子的發芽，需投予每毫升至少5微克的奈米粒子至標的位置；較佳的情況是，約投予每毫升5到500微克的奈米粒子。在一實施例中，奈米粒子的有效量為每毫升50微克；在另一實施例中，奈米粒子的有效量為每毫升500微克。

本揭示內容的另一態樣是關於一種用以治療一罹患或疑以患有困難梭狀芽孢桿菌感染之個體的方法。該方法包含投予該個體一治療有效量的Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子，以減緩困難梭狀芽孢桿菌感染的相關症狀；其中該Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子為一部份氧化的奈米粒子，且δ為一介於0到0.3之間的非整數數值。

依據本揭示內容某些實施方式，Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子的治療功效並不侷限於由特定困難梭狀芽孢桿菌菌株（例如CCUG 37780、CCUG 19126或BAA-1805菌株）之孢子所引起的感染，而是可治療由任何困難梭狀芽孢桿菌菌秼之孢子所引發的感染。

適用於投予至個體的Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子為一邊長為5到25奈米的平截八面體粒子；舉例來說，該邊長可以是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25奈米。在本揭示內容一實施方式中，Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子的邊長約為14奈米；在另一實施方式中，Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子的邊長約為22奈米。

依據本揭示內容某些實施方式，可利用口服、鼻腔或非口服等方式將Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子投予至個體；投予的劑量約為每公斤體重0.4到4毫克；亦即，投予的劑量可以是每公斤體重0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1,2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9或4.0毫克。較佳的情況是，投予的劑量約為每公斤2到4毫克。

可於困難梭狀芽孢桿菌感染時及／或感染後投予本揭示內容Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子。在一實施方式中，是於困難梭狀芽孢桿菌感染時投予本發明Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子；在該情況下，投予每公斤2毫克的Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子即足以減緩由困難梭狀芽孢桿菌感染所引發的症狀。在另一實施方式中，是於困難梭狀芽孢桿菌感染後投予本發明Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子；在該實施方式中，不論是投予每公斤2毫克或每公斤4毫克的Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子皆可有效治療困難梭狀芽孢桿菌感染。

在某些實施方式中，是利用非口服的方式將Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子投予至個體，其中非口服的方式包含，但不限於，肌肉注射、靜脈注射、皮下注射及腹腔注射。在其他實施方式中，則是利用口服方式來投予Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子。

本揭示內容提供了一種用以解決困難梭狀芽孢桿菌感染及相關臨床醫療問題的方法。下文提出多個實驗例將用以闡述Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子於抑制困難梭狀芽孢桿菌孢子之發芽及／或治療困難梭狀芽孢桿菌感染的用途。在本揭示內容較佳的實施方式中，Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子可用以減緩困難梭狀芽孢桿菌孢子所引發的結腸炎。該些實驗例僅為說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。

實施例

材料及方法

培養細菌及純化孢子

由哥德堡大學的菌種保存中心（Göteborg,瑞典）購買困難梭狀芽孢桿菌CCUG37780及CCUG19126，由美國菌種保存中心（ Manassas, VA）購買ATCC BAA1805。所有菌種皆係培養於包含0.5%酵母萃（yeast extract, 212750, BD Difco）及0.1% L-半胱胺酸（7048046, Amresco, Solon, HO）之補充腦心浸液（supplemented brain heart infusion medium, BHIS; 237500, BD Difco, Franklin Lakes, NJ）中，並培養於37°C厭氧環境下。依據先前研究方法（“Bile Salts and Glycine as Cogerminants for Clostridium difﬁcile Spores.“J Bacteriol 2008, 190: 2505-2512），並佐以些微的修改來製備及純化孢子。簡單來說，加入新鮮BHIS培養液來稀釋培養於BHIS培養液中的困難梭狀芽孢桿菌，至到其光學密度600奈米（optic density 600 nm, OD₆₀₀ ）的數值達0.2。將900微升之稀釋細胞懸浮液加至包含BHIS洋菜膠的6孔盤中，並將其培養於37°C的厭氧罐（O-HP011A, Thermo Oxoid, Oxoid Ltd., Basingstoke,英國）中4天。以1毫升之冰無菌水收集6孔盤中的細胞，而後置於4°C至隔日。以冰無菌水洗滌5次後，加入3毫升之冰無菌水。於一離心管中加入10毫升之50%（重量／體積）蔗糖溶液（409704, J.T. Baker Chemical Co., Phillipsburg, PA）後，將懸浮液加至該蔗糖溶液的上方，以3,500 g的轉速離心20分鐘，將孢子與營養細胞分離。以冰無菌水洗滌位於離心管底部之純化孢子5次，藉以移除蔗糖。將純化的孢子置於4°C保存，以供後續分析使用。

孢子發芽

本發明是利用2至10 mM的牛膽酸鹽來檢測困難梭狀芽孢桿菌CCUG 37780的孢子發芽反應。相較於其他種菌株，CCUG 37780由於缺乏tcdA 及tcdB 基因，往往被視為較為安全的菌株。本發明即是利用CCUG 37780菌株來測試奈米粒子於抑制孢子發芽之活性。相較於其他濃度，以10 mM之牛膽酸鹽處理後的困難梭狀芽孢桿菌孢子可觀察到最為顯著的發芽曲線（p ＜ 0.0001, 杜克多重比較試驗（Tukey’s Multiple Comparison test））。因此，後續的分析即以10 mM之牛膽酸鹽來預處理困難梭狀芽孢桿菌孢子。

製備奈米粒子

本發明是利用熱分解（thermal decomposition）來製備Fe_3- _d O₄ 奈米粒子。簡單來說，將1.42克的乙醯丙酮鐵（iron acetylacetonate, 517003, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）、0.57毫升之油酸（oleic acid, 27726, Sigma-Aldrich）及20毫升之三辛胺（trioctylamine, T81000, Sigma-Aldrich）均勻混合。在含氬的環境中，以325°C分餾溶液30分鐘。將溶液冷卻至室溫後，以磁鐵收集沉澱物，並以甲苯洗滌3次。以磁鐵收集Fe_3- _d O₄ 奈米粒子後，將其轉置於包含每毫升0.4毫克之聚苯乙烯順丁烯二酸（662631, Sigma-Aldrich）的氯仿溶液（UN1888, Merck, Whitehouse Station, NJ）中作用2小時。收集Fe_3- _d O₄ 奈米粒子，並以純水洗滌3次。

以下述方法來製備Fe@Au奈米粒子。將包含6克溴化十六烷基三甲銨（cetyltrimethylammonium bromide, CTAB, H6269, Sigma-Aldrich）之 2.4毫升FeSO₄ （0.5 M, 31236, Riedel-de Haën, Seelze,德國）、5克1-丁醇（1-butanol, 33065, Sigma-Aldrich）、15克辛烷（octane, 296988, Sigma-Aldrich）及2.4毫升之1.0 M NaBH₄ （71320, Sigma-Aldrich）均勻混合於純水中，作用5分鐘以形成鐵奈米粒子溶液。將1.8毫升之0.44 M HAuCl₄ (16961-25-4, Alfa Aesar, Ward Hill, MA)及1.8毫升之1.6 M NaBH₄ 加至鐵奈米粒子溶液中，持續攪拌30分鐘。以99.9%乙醇（800605, J.T. Baker Chemical Co.）及磁鐵洗滌該Fe@Au奈米粒子。

利用化學浴沉澱系統（chemical bath deposition system）來製備氧化鋅奈米粒子。將0.1 M之六水合硝酸鋅（zinc nitrate hexahydrate, 263-00335, Wako, Osaka,日本）、0.1 M之六亞甲四胺（hexamethylenetetramine, 081-00332, Wako）與Si(100)受質（Wafer Works Corporation,台灣）於95^o C作用8小時。之後，以無菌水洗滌氧化鋅奈米粒子5次。

依據下述方法製備銀奈米粒子。簡單來說，將3.4 mM之硝酸銀（s6506, Sigma-Aldrich）及0.46 mM之檸檬酸鈉（sodium citrate tribasic dihydrate, s4641, Sigma-Aldrich）於室溫持續攪拌以均勻混合。將8.8 mM之硼氫化鈉（sodium borohydride）加至混合液中，並於室溫持續攪拌10分鐘。之後將合成的銀奈米粒子保存於99.9%乙醇中。

由台灣圓點奈米技術（Taiwan Advanced Nanotech, TANBead^® USPIO-101）購買6奈米的Fe₃ O₄ 奈米粒子。

以光學密度 600 奈米來測量孢子發芽

在進行相關測試前，先將孢子懸浮液置於60°C的環境中30分鐘，以去除營養細胞。將該些熱處理後的孢子置於冰上。將包含孢子之懸浮液調至OD₆₀₀ 為0.5的濃度後，與不同及／或不同濃度（每毫升5到500微克）的奈米粒子共同培養於含有BHIS之96孔盤中20分鐘。在本實驗中，是以3%漂白劑（197-02206, Wako）處理孢子作為正對照組，而以培養於BHIS的孢子作為負對照組。經共同培養後，加入10 mM的牛膽酸鹽（T4009, Sigma），引發孢子發芽。於室溫下，利用分光光度計（16039400, TECAN, Grödig, Austria）來觀測孢子的OD₆₀₀ 讀值，每分鐘觀察1次，持續觀察12分鐘。依據不同時間點所觀察到的OD讀值來繪示孢子發芽的動力曲線圖。

發芽動力試驗

將純化且經熱處理後的孢子在有或無Fe_3-δ O₄ （每毫升50微克）處理的情況下，培養於包含BHIS的96孔盤中20分鐘；之後，分別以2、5、10、20、40或50 mM 牛膽酸鹽進行處理。在本實驗中，係以3%漂白劑作為抑制發芽的正對照組。加入牛膽酸鹽後立即檢測OD₆₀₀ 的讀值。

孢子結合試驗

將OD₆₀₀ 讀值為0.5的困難梭狀芽孢桿菌BAA 1805孢子與Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子（每毫升500微克）共同培養於包含BHIS的96孔盤中20分鐘。無添加Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子的孢子係作為本實驗之對照組。利用磁鐵與各檢體作用5分鐘，以移除各檢體的上清液。以1倍生理食鹽水分別洗滌會與磁鐵作用的檢體及其上清液，各3次。將檢體溶於無菌之去離子水中。利用穿透式電子顯微鏡（transmission electron microscope, TEM, JEM-1400, JEOL,日本)來觀察孢子及奈米粒子。

蛋白滲漏試驗（ Protein leakage assay ）

將OD₆₀₀ 讀值為0.5的孢子與Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子（每毫升500微克）共同培養於包含無菌水之96孔盤中20分鐘。以3,500 g的轉速離心檢體10分鐘。移除上清液後，回溶沉澱物並進行音波振盪處理。利用離心（8000 g, 4^° C, 10分鐘）的方式收集細菌的溶解產物，藉以測量孢子內的蛋白含量。之後，以15%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染套組（17-1150-01, Amersham Biosciences, Sppsala,瑞士）分析各細菌孢子的蛋白含量。

活體內 困難梭狀 芽孢桿菌感染

本實驗動物是飼養於無菌空間，所有試驗皆是在國立成功大學動物實驗管理委員會（Instritutional Animal Care and Use Committe, IACUC）許可下進行。各小鼠在試驗起啟階段的體重約為25克。

為直接檢測結腸的發炎反應。本實驗是利用NF-κB-相關報導小鼠來進行，其中該小鼠包含利用NF-κB來調控轉錄表現的螢光素酶（luciferase）轉殖基因（NF-κB-RE-螢光素酶）；並以困難梭狀芽孢桿菌孢子來進行感染。在餵食孢子前，先將抗生素混合液（每毫升0.4毫克的康黴素(kanamycin)、每毫升0.035毫克的建它黴素(gentamicin)及每毫升0.057毫克的柯利黴素(colistin)）加至小鼠飲用水中48小時；之後每24小時置換一次新鮮抗生素混合液，共置換2次。每12小時灌食小鼠200微升之質子泵抑制劑（proton pump inhibitor, PPI, 每毫升2毫克）一次，共進行2天；之後，感染困難梭狀芽孢桿菌孢子。

分別以CCUG 19126及BAA-1805二種困難梭狀芽孢桿菌孢子來感染小鼠。在感染CCUG 19126的組別中，係分別將2 x 10⁵ 菌落形成單位（colony forming unit, CFU）之困難梭狀芽孢桿菌孢子CCUG 19126與包含或不包含每毫升500微克之Fe_3-δ O₄ 的100微升無菌水共同培養20分鐘；之後餵食小鼠（約每公斤體重2毫克）。在孢子與Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子共同培養的同時，先灌食小鼠50微升之質子泵抑制劑（每毫升2毫克），並以腹腔注射的方式注入氯林絲菌素（clindamycin, 每公斤4毫克）。在感染困難梭狀芽孢桿菌孢子後，將包含抗生素混合液的飲用水置換為一般飲用水。

在感染BAA-1805的組別中，先灌食小鼠50微升之質子泵抑制劑（每毫升2毫克），並以腹腔注射的方式注入氯林絲菌素（每公斤4毫克）；之後，餵食小鼠困難梭狀芽孢桿菌孢子BAA-1805（2 x 10⁵ CFU）。24小時後，分別投予各小鼠100微升之每毫升0、500及1000微克的Fe_3-δ O₄ 奈米粒子（每公斤體重約為0、2及4毫克）；每24小時投予一次，共2天。

藉由觀察小鼠之腹瀉、體重變化、駝背姿勢及死亡來量測困難梭狀芽孢桿菌感染後的病症。感染72小時後，以腹腔注射方式注入每公斤150毫克的螢光素酶受質－螢光素（luciferin, Xenogen, PerkinElmer, Waltham, MA），藉以引發NF-κB活化所導致的發光表現。利用異氟醚（isoflurane）／氧氣麻醉小鼠後，以活體影像系統（In Vivo Imaging Systems, IVIS, Xenogen)進行觀察。藉由活體影像軟體（LivingImage^® software, Xenogen）來分析結果，螢光素酶活體係以質子／秒／平方公分／立體弧度（p/s/cm² /sr）來表示。得到IVIS影像後，以TRI試劑（T9424, Sigma）來萃取結腸RNA。再利用即時聚合酶鏈鎖反應（real-time PCR, StepOnePlus, Applied Biosystems）來分析發炎基因的表現量。為評估困難梭狀芽孢桿菌感染率，收集糞便，藉由DNA萃取套組（11814770001, Roche）純化其中DNA。利用PCR來偵測小鼠糞便中的tcdB 基因。

組織病理分析

利用組織病理分析來評估經困難梭狀芽孢桿菌感染後，黏膜的損傷情況及發炎反應。以4%甲醛（以生食鹽水稀釋）固定結腸組織後，再將其包埋於石蠟中。製作厚度為6微米的檢體切片，將其去石蠟後，以蘇木精（hematoxylin）及伊紅（eosin）進行染色，再利用顯微鏡進行組織病理分析。孢子組及經Fe_3-δ O₄ 處理之孢子組皆是隨機選取10個視野來計數視野中的嗜中性球數量。

統計分析

利用GraphPad Prism 5.01版本進行統計分析。本研究所有的實驗皆是三重覆，並以平均值±標準差（means ± standard error of the mean (SEM)）來表示。在孢子發芽曲線分析中，是利用單向ANOVA（one-way ANOVA）及杜克多重比較試驗（Tukey’s Multiple Comparison test）來計算；在其他感染抑制的試驗中，則是利用Student’s t-test來分析。二種統計方法皆是以P ＜ 0.05、0.01或0.001來表示顯著性。

實施例1 Fe_3-δ O₄ 奈米粒子的殺孢子活性

本實施例將評估Fe_3-δ O₄ 奈米粒子於抑制困難梭狀芽孢桿菌之孢子發芽的功效。

1.1 Fe_3-δ O₄ 奈米粒子對於困難梭狀芽孢桿菌孢子的毒殺活性

已知不同的奈米粒子具有殺菌特性，而不會對周遭組織造成傷害。然而，奈米粒子與細菌孢子發芽間的關聯性仍尚待研究釐清。為了解孢子發芽與殺菌奈米粒子間的作用，本研究將分別測試氧化鋅奈米粒子、銀奈米粒子、Fe₂ O₃ 奈米粒子、Fe₃ O₄ 奈米粒子、Fe@Au奈米粒子及Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子的毒殺功效。以漂白劑處理孢子20分鐘以去除其活性係為本實驗之正對照組。將細菌孢子與每毫升5、50或500微克之奈米粒子共同培養20分鐘後，加入10 mM牛膽酸鹽引發孢子發芽。

第1圖的結果指出，包含氧化鋅（第1A圖）、銀（第1B圖）及Fe₃ O₄ （第1D圖）等已知具有殺菌功效的奈米粒子，僅能產生些微之抑制孢子發芽功效。此外，本研究亦發現，困難梭狀芽孢桿菌CCUG 37780不會對完全氧化的Fe₂ O₃ 奈米粒子（第1C圖）及Fe@Au奈米粒子（第1E圖）產生反應。雖然每毫升5微克之Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子亦僅產生微量的抑制功效，然而，每毫升50及500微克的Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子可明顯觀察到抑制孢子發芽之功效（第1F圖）。特別是每毫升500微克的Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子，其所產生的抑制功效與漂白劑正對組組所產生的抑制效果在統計上並無顯著的差異（p ＞ 0.5，杜克多重比較試驗，第1F圖）。

該些結果指出，相較於已知的殺菌奈米粒子，本揭示內容之Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子具有優越的殺孢子活性；不論是每毫升50或500微克的Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子皆可有效抑制孢子形成具有活性的營養細胞。

1.2 不同大小之Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子的殺孢子活性

有鑑於Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子可合成為具有不同邊長（由5到25奈米）的平截八面體粒子，本實施例將進一步了解不同大小之Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子在抑制孢子發芽時所產生的功效。據此，利用二種Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子（邊長分別為14及22奈米）來治療CCUG 37780孢子的感染。第2圖的結果顯示，二種奈米粒子於抑制孢子發芽之活性並不具有顯著的差異（每毫升500微克濃度的差異為p = 0.5195，每毫升50微克濃度的差異則為p ＞ 0.99，利用杜克多重比較試驗來分析統計）。因此，相較於奈米粒子的大小，Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子的濃度在抑制困難梭狀芽孢桿菌孢子發芽時扮演著更為關鍵的角色。

1.3 Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子於抑制不同菌株之困難梭狀芽孢桿菌孢子時所產生的殺孢子活性

本實施例將檢測Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子對於具有tcdA 及tcdB 基因之困難梭狀芽孢桿菌（即CCUG 19126及ATCC BAA-1805）所產生的抑制活性。據此，分別將CCUG 19126及ATCC BAA-1805與不同濃度（即每毫升5、50及500微克）之Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子共同培養20分鐘後，以10 mM牛膽酸鹽進行處理。結果繪示於第3圖。

如第3圖所示，每毫升500微克之Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子對於CCUG 19126（第3A圖）及ATCC BAA-1805（第3B圖）具有相似的抑制功效；而CCUG 19126則會對每毫升50微克以下之Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子具有抗性（第3A圖）。

該些結果顯示，Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子對於孢子發芽的抑制活性並不侷限於特定的困難梭狀芽孢桿菌菌株。換言之，Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子可有效抑制不同的困難梭狀芽孢桿菌菌株。

1.4 Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子對困難梭狀芽孢桿菌之營養細胞的殺菌活性

除了抑制孢子發芽之功效，本實施例將進一步利用不同的困難梭狀芽孢桿菌菌株，來了解Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子對營養細胞的殺菌活性。以每毫升500微克之Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子處理營養細胞20分鐘後，將其塗佈於BHIS洋菜膠盤，並進行後續的菌落形成單位分析。如第4圖所示，以Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子處理後的細胞與負對照組細胞具有相似的生長量；相較之下，以3%漂白劑處理後的細胞則幾乎完全死亡。

總結上述，本揭示內容Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子可有效抑制包含CCUG 37780、CCUG 19126及ATCC BAA-1805等各種困難梭狀芽孢桿菌菌株的孢子，而不會影響其營養細胞的生長。

實施例2 Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子對困難梭狀芽孢桿菌孢子的抑制機制

為了解Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子與孢子間的作用，本實施例利用穿透式電子顯微鏡（transmission electron microscopy, TEM）來檢測經Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子處理後的孢子。結果顯示，每毫升50微克之Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子即會與孢子結合。隨著濃度的增加（如每毫升500微克的Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子），過量的Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子會完全覆蓋孢子表面（第5圖）。亦即，Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子與困難梭狀芽孢桿菌孢子的結合量是與奈米粒子的濃度呈正相關。

為進一步了解Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子的結合是否會對孢子產生損害，進而破壞孢子的結構，利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳來分析經Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子處理或未經Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子處理之孢子，其滲漏蛋白的量。第6圖繪示出該結果。

相較於未經處理的孢子，以Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子處理之孢子可明顯觀察到二蛋白帶（第6圖，第1到3蛋白條與第4到6蛋白條）。該結果指出，一旦Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子結合至孢子，會造成孢子結構的損傷，進而導致蛋白滲漏至上清液。

整體來看，該些結果指出本揭示內容之Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子可直接結合至困難梭狀芽孢桿菌孢子，並損傷其結構。

實施例3 Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子於治療困難梭狀芽孢桿菌感染的用途

在本實施例中，將依據「材料及方法」所述之步驟，利用NF-κB-相關報導小鼠來檢測Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子於治療活體感染困難梭狀芽孢桿菌的療效。在實施例3.1中，是以困難梭狀芽孢桿菌孢子CCUG 19126感染小鼠，第7圖繪示該治療功效。實施例3.1則是以困難梭狀芽孢桿菌孢子BAA-1805感染小鼠，第8圖繪示相關結果。

3.1 感染CCUG 19126

如第7A圖所示，感染困難梭狀芽孢桿菌後的小鼠體重會顯著下降，以Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子治療（每公斤體重2毫克）則可有效減緩體重的減少（p = 0.0119, Student’s t-test）。此外，亦檢測小鼠盲腸的重量來確認觀察到的治療功效；結果顯示，相較於對照組，經Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子治療之小鼠的盲腸會較重且較為健康（p = 0.0024, Student’s t-test,第7B圖），並呈現較輕微的發炎反應（p = 0.0406, Student’s t-test,第7C圖）。組織病理照片則指出，相較於照組，經Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子治療之小鼠，其結腸組織中嗜中性球浸潤的數量會明顯減少（第7D圖）。另外，在基因表現上，即時聚合酶鏈鎖反應的分析結果顯示，經Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子治療後，小鼠結腸內包含腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、干擾素-γ（interferon-γ, IFN-γ）及介白素-1β（interleukin-1β, IL-1β）等發炎基因的表現皆會顯著地低於對照組小鼠結腸內的基因表現（TNF-α之p = 0.0088，IFN-γ之p = 0.0276，而IL-1β之p = 0.0097，Student’s t-test，以上皆是與未經處理的孢子組進行比較分析，第7E圖）。相對於對照組，Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子治療可減少困難梭狀芽孢桿菌的感染率（對照組為66%，治療組為33%）（結果未顯示）。

該些結果證明每公斤2毫克的Fe₃ -_δ O₄ 可有效減緩由困難梭狀芽孢桿菌孢子CCUG 19126所引發的發炎反應。

3.2 感染BAA-1805

本實施例將檢測Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子對另一種困難梭狀芽孢桿菌孢子－BAA-1805的治療功效。為更進一步模擬臨床狀況，先以孢子BAA-1805感染小鼠24小時後，再以每公斤0、2或4毫克之Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子進行治療。

依據第8圖的結果，對照組小鼠（即未經處理的孢子組）結腸中的發炎反應會較Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子治療組更為嚴重（p ＜ 0.05）。不論是投予每公斤2或4毫克之Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子皆可有效抑制困難梭狀芽孢桿菌孢子BAA-1805所引發的發炎反應。

因此，可於困難梭狀芽孢桿菌感染時或感染後投予本發明Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子，且不論投予的時間點為何，皆可有效抑制由困難梭狀芽孢桿菌感染所引發的相關症狀。

總結上述，Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子可抑制困難梭狀芽孢桿菌的胞子發芽。相較於其他具有殺菌活性的奈米粒子，Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子具有顯著的殺孢子活性。更重要的是，Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子的抑制功效並不侷限於特定的困難梭狀芽孢桿菌菌株，而是可有效抑制各種困難梭狀芽孢桿菌菌株之孢子的發芽及／或感染。此外，低劑量（例如活體外之每毫升5微克，及活體內之每公斤2毫克）的 Fe₃ -_δ O₄ 奈米粒子即足以抑制困難梭狀芽孢桿菌孢子的發芽，並治療感染困難梭狀芽孢桿菌的病患，而不會影響正常菌落中營養細胞的生長。

雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。

無

為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1圖是依據本揭示內容實施例1.1所繪示之困難梭狀芽孢桿菌的孢子發芽動態，其中該孢子是分別以(A)氧化鋅（ZnO）奈米粒子，(B)銀（Ag）奈米粒子，(C)三氧化二鐵（Fe₂ O₃ ）奈米粒子，(D)四氧化三鐵（Fe₃ O₄ ）奈米粒子，(E)非氧化鐵核-金殼層奈米粒子（以下簡稱為Fe@Au奈米粒子），及(F)本發明Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子進行處理；第2圖是依據本揭示內容實施例1.2所繪示之困難梭狀芽孢桿菌的孢子發芽動態，其中該孢子是分別以每毫升500微克之22奈米的Fe_3- _δ O₄ (▲)、每毫升500微克之14奈米的Fe_3- _δ O₄ (■)、每毫升50微克之22奈米的Fe_3- _δ O₄ (□)、每毫升50微克之14奈米的Fe_3- _δ O₄ (△)及3%漂白劑(●)進行處理；第3圖是依據本揭示內容實施例1.3所繪示之困難梭狀芽孢桿菌的孢子發芽動態，其中菌株CCUG 19126(A)及ATCC BAA-1805(B)是分別以每毫升500微克之Fe_3- _δ O₄ 、每毫升50微克之Fe_3- _δ O₄ 、每毫升5微克之Fe_3- _δ O₄ 及3%漂白劑進行處理；第4圖是依據本揭示內容實施例2所繪示之細胞存活柱狀圖，其中困難梭狀芽孢桿菌營養細胞（vegetative cell）是分別以控制組、Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子及漂白劑進行處理；第5圖是依據本揭示內容實施例2所繪示之困難梭狀芽孢桿菌孢子的電子顯微照片，其中該困難梭狀芽孢桿菌孢子係分別以對照組（未經處理之孢子）、每毫升50微克之Fe₃ −_δ O₄ 及每毫升500微克之Fe₃ −_δ O₄ 進行處理；上方照片是以10,000倍的放大倍率拍攝，下方照片則是以30,000倍的放大倍率拍攝；第6圖是依據本揭示內容實施例2所繪示之十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）照片，其係關於未經（第1-3蛋白條）或經（第4-6蛋白條）Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子處理之困難梭狀芽孢桿菌孢子的胞外蛋白（上圖）及胞內蛋白（下圖）表現量；第7A圖是依據本揭示內容實施例3.1所繪示之柱狀圖，其係關於經困難梭狀芽孢桿菌孢子感染之小鼠的平均體重改變量，其中白色柱狀代表接受Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子處理的小鼠，而黑色柱狀則代表未接受Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子處理的小鼠；第7B圖是依據本揭示內容實施例3.1所繪示之柱狀圖，其係關於經困難梭狀芽孢桿菌孢子感染之小鼠的盲腸重量，其中白色柱狀代表接受Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子處理的小鼠，而黑色柱狀則代表未接受Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子處理的小鼠；第7C圖是依據本揭示內容實施例3.1所繪示之盲腸的發炎狀態，該些盲腸是分別取自接受及未接受Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子處理的小鼠，並利用活體影像系統（In Vivo Imaging Systems，IVIS，左圖）偵測後，以柱狀圖分析表示（右圖）；第7D圖是依據本揭示內容實施例3.1所繪示之結腸組織病理照片，該些結腸是分別取自經困難梭狀芽孢桿菌孢子感染，且接受（右圖）或不接受（左圖）Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子治療的小鼠；照片是以物鏡20倍或40倍之放大倍率拍攝；第7E圖是依據本揭示內容實施例3.1所繪示之柱狀圖，其係關於特定發炎基因的RNA相對表現量，其中該些RNA是分別取自經困難梭狀芽孢桿菌孢子感染，且接受（黑色柱狀）或不接受（白色柱狀）Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子治療之小鼠的結腸；以及第8圖是依據本揭示內容實施例3.2所繪示之盲腸的發炎狀態，該些盲腸是分別取自經困難梭狀芽孢桿菌感染，且分別以每公斤體重0、2或4毫克之Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子治療的小鼠，並利用活體影像系統（上圖）偵測後，以柱狀圖分析表示（下圖）。

根據慣常的作業方式，圖中各種特徵與元件並未依比例繪製，其繪製方式是為了以最佳的方式呈現與本發明相關的具體特徵與元件。此外，在不同圖式間，以相同或相似的元件符號來指稱相似的元件/部件。

Claims

一種於活體外抑制困難梭狀芽孢桿菌（Clostridium difficile ）之孢子發芽的方法，包含將困難梭狀芽孢桿菌之孢子與一有效量之Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子共同培養，其中δ為一介於0到0.3之間的數值。
如請求項1所述之方法，其中該奈米粒子為一平截八面體（truncated octahedron）粒子。
如請求項2所述之方法，其中該平截八面體的各邊長度約為5到25奈米。
如請求項3所述之方法，其中該平截八面體的各邊長度約為14奈米。
如請求項3所述之方法，其中該平截八面體的各邊長度約為22奈米。
如請求項1所述之方法，其中該奈米粒子的有效量約為每毫升5到500微克。
一種Fe₃ −_δ O₄ 奈米粒子的用途，其可用以製備一種用以治療一罹患或疑以患有困難梭狀芽孢桿菌感染之個體的藥物，其中δ為一介於0到0.3之間的數值。
如請求項7所述之用途，其中該奈米粒子為一平截八面體粒子。
如請求項8所述之用途，其中該平截八面體的各邊長度約為5到25奈米。
如請求項9所述之用途，其中該平截八面體的各邊長度約為14奈米。
如請求項9所述之用途，其中該平截八面體的各邊長度約為22奈米。