TW201600606A - 快速偵測活菌之檢測套組及其方法與快速判斷適當性抗生素之檢測套組及其方法 - Google Patents

快速偵測活菌之檢測套組及其方法與快速判斷適當性抗生素之檢測套組及其方法 Download PDF

Info

Publication number
TW201600606A
TW201600606A TW103121935A TW103121935A TW201600606A TW 201600606 A TW201600606 A TW 201600606A TW 103121935 A TW103121935 A TW 103121935A TW 103121935 A TW103121935 A TW 103121935A TW 201600606 A TW201600606 A TW 201600606A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
seq
primer pair
unit
bacteria
fluid storage
Prior art date
Application number
TW103121935A
Other languages
English (en)
Inventor
李國賓
李炫昇
王志宏
張文馨
Original Assignee
國立清華大學
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 國立清華大學 filed Critical 國立清華大學
Priority to TW103121935A priority Critical patent/TW201600606A/zh
Priority to US14/507,842 priority patent/US20150376684A1/en
Publication of TW201600606A publication Critical patent/TW201600606A/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Abstract

本發明提供一種快速偵測活菌之檢測套組，包含溴化乙錠、磁珠、第一引子對及一微流體晶片。本發明另提供一種快速判斷適當性抗生素之檢測套組，包含溴化乙錠、磁珠、4對引子對及微流體晶片。

Description

快速偵測活菌之檢測套組及其方法與快速判斷適當性抗生素之檢測套組及其方法
本發明是有關於一種快速檢測細菌之檢測套組及其方法，特別是一種關於快速偵測活菌之檢測套組及其方法與快速判斷適當性抗生素之檢測套組及其方法。
目前醫院由待測樣品確認感染細菌之常規，為進行為期五至七天不等之細菌培養，細菌培養所得結果雖然最準確但很耗時，待確認感染菌種時患者已進行一廣效性抗生素的療程，因廣效性抗生素易造成抗藥性細菌的產生，造成後續治療的困難。
醫院內雖然有快速偵測細菌存在的方法，如測量血清中之C反應蛋白或白介素-6的含量，但此法不具特異性，因此臨床上對於選用抗生素的決策，必須仰賴醫師的猜測與使用廣效性之抗生素後觀察病人的反應，適時調整抗生素，最終再根據細菌之藥敏報告選擇真正適當的抗生 素。如此不但曠日廢時更會因為選擇不當的抗生素造成病人的病情惡化，遑論因為過當使用抗生素而造成抗藥基因的傳遞，引起公共衛生的危機。更有甚者、現今因為抗生素的濫用，許多病人在接受標準的治療之前或許已經接受不同劑量的抗生素治療，因此在進行細菌培養檢驗時，細菌活性因為減低而產生「偽陰性」之反應。
若以聚合酶鏈鎖反應等分子生物技術診斷方式進行偵測，雖可於短時間內快速偵測到待測樣品是否有細菌存在，但因聚合酶連鎖反應可以DNA或RNA為模板，死菌於待測樣品中亦會遺留下DNA，易有偽陽性的結果。若以RNA為模板可避免此問題，但因聚合酶鏈鎖反應必須使用經過純化的檢體，RNA萃取處理不易且非常容易降解，增加偵測方法之複雜度和困難。
因此，本發明提供一種快速偵測活菌之檢測套組及其方法與快速判斷適當性抗生素之檢測套組及其方法，可快速得到細菌檢測結果，以偵測待測樣品中是否具有活菌或正確判斷抗生素的選用。
本發明之一態樣是在提供一種快速偵測活菌之檢測套組，其成組配置以供接續進行檢測，檢測套組包含溴化乙錠(ethidiummonoazide，EMA)、磁珠、第一引子對以及一微流體晶片。其中，溴化乙錠會嵌合入死菌之DNA；磁珠鍵結萬古黴素(Vancomycin)，可抓取革蘭氏陽性菌及革 蘭氏陰性菌之菌體；第一引子對具有如SEQ ID NO：1與SEQ ID NO：2所示序列。而微流體晶片包含：流體儲存單元、反應單元、流體驅流單元及閥門單元。其中流體儲存單元，係包含第一流體儲存槽及第二流體儲存槽，第一流體儲存槽係儲存清洗緩衝液，第二流體儲存槽係儲存聚合酶連鎖反應試劑；反應單元，係包含反應槽、正控制反應槽及負控制反應槽；流體驅流單元，係包含氣動式微幫浦及驅流單元控制氣孔，流體驅流單元設置於流體儲存單元及反應單元之間，用以運輸流體儲存單元之清洗緩衝液或聚合酶連鎖反應試劑至反應單元；以及閥門單元，係包含氣動式微閥門及閥門控制氣孔，其中氣動式微閥門係設置於流體儲存單元與氣動式微幫浦之間，及氣動式微幫浦與反應單元之間，閥門控制氣孔係將氣體注入氣動式微閥門以控制氣動式微閥門之開合。
根據本發明之一實施例，其中微流體晶片更包含一定量單元，其係設置於氣動式微幫浦之上。
本發明之另一態樣是在提供一種利用前述快速偵測活菌之檢測套組快速偵測活菌之檢測方法，包含下列步驟：提供一磁珠，其中磁珠鍵結萬古黴素，可抓取革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌之菌體。混合磁珠、溴化乙錠及待測樣本並照光1至20分鐘，溴化乙錠會嵌合入死菌之DNA，使死菌無法藉由聚合酶連鎖反應放大核酸片段。使用磁鐵收集磁珠。提供清洗緩衝液注入第一流體儲存槽，並啟動流體驅流單元使清洗緩衝液經氣動式微閥門流至反 應槽中，清洗未結合上磁珠之物質。加入第一引子對，其具有SEQ ID NO：1與SEQ ID NO：2所示序列。提供聚合酶連鎖反應試劑注入第二流體儲存槽，並啟動流體驅流單元使聚合酶連鎖反應試劑經氣動式微閥門流至反應槽中進行聚合酶連鎖反應。最後偵測是否有聚合酶連鎖反應產物，其為待測樣本存在活菌之表徵。
根據本發明之一實施例，其中溴化乙錠之濃度為0.01至30mg/mL。
根據本發明之另一實施例，其中偵測聚合酶連鎖反應產物係以膠體電泳系統或吸收光偵測系統進行。
藉此，本發明之快速偵測活菌之檢測套組及其檢測方法，可快速偵測待測樣品是否存在活菌，且其靈敏度高，故能於手術臺旁進行檢測，即時得知患者體內是否有潛在的感染病原，而避免在感染的情況下進行手術。
本發明之再一態樣是在提供一種快速判斷適當性抗生素之檢測套組，其成組配置以供接續進行檢測，檢測套組包含溴化乙錠、磁珠、複數個引子對以及微流體晶片。其中溴化乙錠嵌合入死菌之DNA；磁珠鍵結萬古黴素，可抓取革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌之菌體；複數個引子對包含：具有如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示序列之第一引子對、具有如SEQ ID NO：3與SEQ ID NO：4所示序列之第二引子對、具有如SEQ ID NO：5與SEQ ID NO：6所示序列之第三引子對及具有如SEQ ID NO：7與SEQ ID NO：8所示序列之第四引子對；微流體晶片具有複數個模 組，可同時進行聚合酶連鎖反應，每一個模組包含：流體儲存單元、反應單元、閥門單元及流體驅流單元。其中流體儲存單元，係包含第一流體儲存槽及第二流體儲存槽，第一流體儲存槽係儲存清洗緩衝液，第二流體儲存槽係儲存聚合酶連鎖反應試劑；反應單元，係包含反應槽、正控制反應槽及負控制反應槽；流體驅流單元，係包含氣動式微幫浦及驅流單元控制氣孔，流體驅流單元設置於流體儲存單元及反應單元之間，用以運輸流體儲存單元之清洗緩衝液或聚合酶連鎖反應試劑至反應單元；以及閥門單元，係包含氣動式微閥門及閥門控制氣孔，其中氣動式微閥門係設置於氣動式微幫浦與流體驅流單元之間，及氣動式微幫浦與反應單元之間，閥門控制氣孔係將氣體注入氣動式微閥門以控制氣動式微閥門之開合。
根據本發明之再一實施例，其中更包含如SEQ ID NO：9與SEQ ID NO：10所示序列之一第五引子對、如SEQ ID NO：11與SEQ ID NO：12所示序列之一第六引子對及具有如SEQ ID NO：13與SEQ ID NO：14所示序列之一第七引子對。
根據本發明之又一實施例，其中微流體晶片更包含一定量單元，其係設置於氣動式微幫浦之上。
本發明之又一態樣是在提供一種利用前述快速判斷適當性抗生素之檢測套組以快速判斷適當性抗生素之檢測方法，包含下列步驟：提供磁珠，其中磁珠鍵結萬古黴素，可抓取革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌之菌體；混合磁 珠、溴化乙錠及待測樣本，將其注入反應槽並照光1至20分鐘，其中溴化乙錠嵌合入死菌之DNA，使死菌無法藉由聚合酶連鎖反應放大核酸片段；使用磁鐵收集磁珠；提供清洗緩衝液注入第一流體儲存槽，啟動流體驅流單元使清洗緩衝液經氣動式微閥門流至反應槽中，以清洗未結合上磁珠之物質；加入引子對，其中引子對係選自下列引子對所組成之一群組：具有如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示序列之第一引子對、具有如SEQ ID NO：3與SEQ ID NO：4所示序列之第二引子對、具有如SEQ ID NO：5與SEQ ID NO：6所示序列之第三引子對及具有如SEQ ID NO：7與SEQ ID NO：8所示序列之第四引子對；提供聚合酶連鎖反應試劑注入第二流體儲存槽，啟動流體驅流單元使聚合酶連鎖反應試劑經氣動式微閥門流至反應槽中進行聚合酶連鎖反應；最後根據增幅出的聚合酶連鎖反應產物判斷使用的抗生素種類。
根據本發明之一實施例，其中引子對更包含如SEQ ID NO：9與SEQ ID NO：10所示序列之一第五引子對、如SEQ ID NO：11與SEQ ID NO：12所示序列之一第六引子對及具有如SEQ ID NO：13與SEQ ID NO：14所示序列之一第七引子對。
根據本發明之另一實施例，其中溴化乙錠之濃度為0.01至30mg/mL。
根據本發明之再一實施例，其中偵測聚合酶連鎖反應產物係以膠體電泳系統或吸收光偵測系統進行。
藉此，本發明之快速判斷適當性抗生素之檢測套組及其檢測方法，可使臨床醫師能於用藥前就能確認患者體內是否有抗藥性的細菌存在，其中所使用之第二引子對至第七引子對之檢測結果可涵蓋臨床上80%致病菌種，故能即時於第一線治療時使用正確的抗生素，避免延誤治療或因錯誤用藥產生抗藥性細菌。
上述發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。
100‧‧‧微流體晶片
110‧‧‧流體儲存單元
112‧‧‧第一流體儲存槽
114‧‧‧第二流體儲存槽
120‧‧‧反應單元
122‧‧‧反應槽
124‧‧‧正控制反應槽
126‧‧‧負控制反應槽
130‧‧‧閥門單元
132‧‧‧氣動式微閥門
134‧‧‧閥門控制氣孔
140‧‧‧流體驅流單元
142‧‧‧定量單元
144‧‧‧氣動式微幫浦
146‧‧‧驅流單元控制氣孔
152‧‧‧氣道
154‧‧‧流道
162‧‧‧微流體晶片上層
164‧‧‧微流體晶片底層
166‧‧‧玻璃基板
170‧‧‧廢棄流體口
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1圖繪示本發明實施例一之微流體晶片之示意圖。
第2圖繪示圖1之微流體晶片之堆疊示意圖。
第3圖繪示圖1之微流體晶片之流體流動示意圖。
第4圖繪示本發明實施例一所得結果之螢光分析圖及膠體電泳圖。
第5圖繪示本發明實施例二之微流體晶片之示意圖。
第6圖繪示本發明實施例二之利用第二引子對所得結果之螢光分析圖及膠體電泳圖。
第7圖繪示本發明實施例二之利用第三引子對所得結果之螢光分析圖及膠體電泳圖。
第8圖繪示本發明實施例二之利用第四引子對所得結果之螢光分析圖及膠體電泳圖。
第9圖繪示本發明實施例二之利用第五引子對所得結果之螢光分析圖及膠體電泳圖。
第10圖繪示本發明實施例二之利用第六引子對所得結果之螢光分析圖及膠體電泳圖。
第11圖繪示本發明實施例二之利用第七引子對所得結果之螢光分析圖及膠體電泳圖。
本說明書揭露內容提出一種快速偵測活菌之檢測套組及其檢測方法，及一種快速速判斷適當性抗生素之檢測套組及其檢測方法。其係利用核酸螢光染劑嵌合入死菌之DNA，使其無法進行聚合酶連鎖反應放大核酸片段。再利用可無區別性抓取細菌之磁珠，將細菌由待測樣品中抓取下來。並配合整合式的微流體晶片，於其上自動化進行包含活死菌區別、病原菌純化、雜質清洗、聚合酶連鎖反應及反應結果判讀等細菌感染檢測程序，可於1小時內即時得到細菌偵測結果。
下列試驗例和實施例用於示範說明本發明，係用以有利於本發明所屬技術領域通常知識者，可在不需過度解讀的情形下完整利用並實踐本發明，而不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制，但用於如何實施本發明的材料及方法。
試驗例1：溴化乙錠之製備
溴化乙錠為一種核酸染劑，能選擇性滲透進入細胞膜不完整的死菌內，以嵌合入死菌的DNA，並在高強度可見光激活下，與死菌之DNA發生共價結合，所形成的DNA-溴化乙錠之共價複合物即使於高溫下(95℃)仍能穩定存在，因此能阻斷下游聚合酶連鎖反應之擴增。而活菌的DNA在完整細胞膜的保護下阻止了溴化乙錠進入進而能進行下游聚合酶連鎖反應之擴增，因此可以將死菌與活菌加以區隔。
將溴化乙錠(Molecular Probes®,USA)溶於酒精以製備濃度為1mg/mL的原液，於診斷分析前再以酒精稀釋為適當的濃度。溴化乙錠原液避光保存於-20℃備用。
試驗例2：磁珠之製備
萬古黴素之結構類似杯狀，可與革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌細胞壁上的肽聚醣(peptidoglycan)末段在立體上有很好的契合，並以五個氫鍵呈現結合的專一性，因此本發明之磁珠表面鍵結萬古黴素，可抓取革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌之菌體。
首先將950μl濃度為4×106beads/ml的磁珠、30μl濃度為100nM的萬古黴素和20μl濃度為120mg/ml的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide,hydrochloride,EDC)於4℃混合隔夜後，分別以1ml含0.02% Tween 20的磷酸鹽緩衝液(Phosphate buffer saline,PBS) 和1ml含0.1% sodium dodecyl sulfate的PBS清洗3分鐘後，以乙醇胺(ethanol amine)覆蓋未鍵結萬古黴素的部分。再加入1ml的PBS以洗去殘留的乙醇胺，並回溶磁珠於1ml的PBS中保存於4℃備用。
試驗例3：引子設計及聚合酶連鎖反應條件
本發明所使用的引子對包含：具有如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示序列之第一引子對、具有如SEQ ID NO：3與SEQ ID NO：4所示序列之第二引子對、具有如SEQ ID NO：5與SEQ ID NO：6所示序列之第三引子對、具有如SEQ ID NO：7與SEQ ID NO：8所示序列之第四引子對、具有如SEQ ID NO：9與SEQ ID NO：10所示序列之第五引子對、具有如SEQ ID NO：11與SEQ ID NO：12所示序列之第六引子對及具有如SEQ ID NO：13與SEQ ID NO：14所示序列之第七引子對。其中第一引子對係以細菌之16S rRNA基因為增幅之目標基因，用以判別是否有細菌存在；第二引子對係以葡萄球菌屬細菌(Staphylococcus)之16S rRNA基因為增幅之目標基因，用以鑑別葡萄球菌屬細菌；第三引子對係以葡萄球菌屬細菌之coa基因為增幅之目標基因，若無聚合酶增幅產物則表示為凝固酶陰性葡萄球菌(Coagulase-negative staphylococcus,CoNS)，因此可用以鑑別凝固酶陰性葡萄球菌；第四引子對係以抗藥性金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)之mecA基因為增幅之目標基因，用以鑑別抗藥性金黃色葡萄球菌；第五引子對係以假單胞菌屬細菌(Pseudomonas)之 oprL基因為增幅之目標基因，用以鑑別假單胞菌屬細菌；第六引子對係以大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)之lamB基因為增幅之目標基因，用以鑑別大腸桿菌；第七引子對係以腸球菌(Enterococcus)之ent基因為增幅之目標基因，用以鑑別腸球菌。
聚合酶連鎖反應時，聚合酶連鎖反應試劑為KAPA SYBR FAST kit(KAPABIOSYSTEM,USA)，反應物及聚合酶連鎖反應試劑依下述比例進行：10μl之KAPA SYBR FAST PCR master混合液、10μM之引子各0.4μl、9.2μl之二次去離子水，總體積為20μl，將溶液混合均勻後進行聚合酶連鎖反應。反應條件為變性95℃反應5分鐘，接著進行25個周期之熱循環，包括變性95℃反應10秒、黏合62℃反應20秒、延長72℃反應10秒。
實施例一
根據本發明之實施例一是一種快速偵測活菌之檢測套組，其成組配置以供接續進行檢測，檢測套組包含溴化乙錠、磁珠、第一引子對及一微流體晶片100。為了達到自動化因而將全部的檢驗流程整合在微流體晶片100上，包含檢體純化、檢體混合、雜質清洗、聚合酶連鎖反應及反應結果判讀等實驗步驟。
請參考第1圖，為本發明實施例一之微流體晶片100之示意圖，微流體晶片100包含：流體儲存單元110、反應單元120、流體驅流單元140及閥門單元130。其中流體儲存單元110，係包含第一流體儲存槽112及3個第二流 體儲存槽114，第一流體儲存槽112係儲存清洗緩衝液，第二流體儲存槽114係儲存聚合酶連鎖反應試劑。反應單元120，係包含反應槽122、正控制反應槽124及負控制反應槽126。流體驅流單元140，係包含氣動式微幫浦144及驅流單元控制氣孔146，流體驅流單元140係設置於流體儲存單元110及反應單元120之間，用以運輸流體儲存單元110之清洗緩衝液或聚合酶連鎖反應試劑至反應單元120。閥門單元130，係包含氣動式微閥門132及閥門控制氣孔134，其中氣動式微閥門132係設置於流體儲存單元110與氣動式微幫浦144之間，及氣動式微幫浦144與反應單元120之間，而氣動式微閥門132和氣動式微幫浦144之間具有流道154以供流體流通。閥門控制氣孔134係由氣道152將氣體注入氣動式微閥門132以其之開合。微流體晶片100更包含一定量單元142，其設置於氣動式微幫浦144之上，可調節氣動式微幫浦144的薄膜於流體運輸時被提升的高度，使流體的輸送量一致。
請參考第2圖，為本發明實施例一之微流體晶片100之堆疊示意圖，微流體晶片100由兩層可撓性層和一層玻璃層所組成，上而下為微流體晶片上層162、微流體晶片底層164和玻璃基板166。請再參考第3圖，為本發明實施例一之微流體晶片100之流體流動示意圖。首先將流體注入流體儲存單元110，由靠近流體儲存單元110的閥門控制氣孔134及驅流單元控制氣孔146進氣，氣動式微閥門132和氣動式微幫浦144的薄膜會因真空引起的吸力升高，使 流體儲存單元110中的流體經流道154進入氣動式微幫浦144。接著由靠近反應單元120的閥門控制氣孔134進氣，另一個氣動式微閥門132被升高，使氣動式微幫浦144中的流體經流道154進入反應單元120。最後，供給壓縮空氣到氣動式微幫浦144使所有的流體推入反應單元120。
快速偵測活菌之檢測方法包含下列步驟：分別將清洗緩衝液注入第一流體儲存槽112、聚合酶連鎖反應試劑及第一引子對注入第二流體儲存槽114，及鍵結萬古黴素的磁珠注入反應槽122中。將待測樣品與溴化乙錠混合加入反應槽122中，其中溴化乙錠之濃度為0.01至30mg/mL，照可見光1至20分鐘以觸發形成DNA-溴化乙錠之共價複合物後，使待測樣品、溴化乙錠和鍵結萬古黴素的磁珠再培養10分鐘，於此步驟不論是革蘭氏陽性菌或是革蘭氏陰性菌的菌體皆會與萬古黴素結合而被磁珠抓取。利用磁鐵收集已抓取菌體的磁珠。啟動流體驅流單元140使清洗緩衝液通過氣動式微閥門132經流道154流至反應槽122中，以清洗未結合上磁珠之物質，並從廢棄流體口170將清洗磁珠後的廢棄流體吸走。再啟動流體驅流單元140使已混合第一引子對的聚合酶連鎖反應試劑，通過氣動式微閥門132經流道154流至反應槽122中進行聚合酶連鎖反應，聚合酶連鎖反應的反應條件如試驗例3所述，其中聚合酶連鎖反應的升溫及降溫係由溫度控制模組所調控。最後以螢光偵測是否有聚合酶連鎖反應產物，若有聚合酶連鎖反應產物表示待測樣本中存在活菌。本發明之快速偵測活菌之 檢測方法於整體檢測過程僅需55分鐘，即能完成檢體純化、檢體混合、雜質清洗、聚合酶連鎖反應及反應結果判讀等步驟。
本發明之快速偵測活菌之檢測套組更包含正控制組和負控制組，以增加本發明之快速偵測活菌之檢測套組的客觀性。正控制組為以一內含大腸桿菌16S rRNA基因片段的質體，取代待測樣品以作為聚合酶連鎖反應的模版。於上述試驗步驟中，正控制組為加入鍵結萬古黴素的磁珠、溴化乙錠和質體至正控制反應槽124，而負控制組則為僅加入鍵結萬古黴素的磁珠和溴化乙錠至負控制反應槽126，其他如同上述試驗步驟，在此不贅述。
請參照第4圖，第4(A)圖為實施例一的螢光分析圖，第4(B)圖為實施例一的膠體電泳圖，其中*表示P<0.05，M為核酸之分子量標記。組別1為負控制組，組別2至6分別為待測樣品是濃度為106-102 colony formation unit(CFU)/mL的大腸桿菌之活菌。利用第一引子對可於存在活菌之待測樣品中，增幅出大小約為400bp的聚合酶連鎖反應產物。結果顯示，無論以螢光偵測或是膠體電泳分析，本發明之檢測套組只要在菌體濃度為104CFU/ml以上的條件下，即能偵測待測樣品是否存在活菌。
本發明之快速偵測活菌之檢測套組及其檢測方法，可簡化實驗流程及於微流體晶片100上進行全自動化之偵測，可以突破現階段檢驗「偽陰性」之瓶頸，而且能夠快速的得到細菌檢測的結果，不但可縮短反應時間，減 少檢體和試劑的用量，更可避免人為因素造成的誤差。因可於1小時內偵測出帶測樣品是否存在活菌，且其偵測極限為104CFU/mL靈敏度高，故能於手術檯旁進行檢測，即時得知患者體內是否有潛在的感染病原，而避免在感染的情況下進行手術。
實施例二
本發明之實施例二是一種快速判斷適當性抗生素之檢測套組，其成組配置以供接續進行檢測，檢測套組包含溴化乙錠、磁珠、4對引子對、聚合酶連鎖反應試劑及微流體晶片100。
請參照第5圖，為本發明實施例二之微流體晶片100之示意圖。微流體晶片100具有4個完全相同的模組，可以同時進行4組獨立的試驗。微流體晶片100上每個模組包含：流體儲存單元110、反應單元120、流體驅流單元140及閥門單元130。其中流體儲存單元110，係包含第一流體儲存槽112及3個第二流體儲存槽114，第一流體儲存槽112係儲存清洗緩衝液，第二流體儲存槽114係儲存聚合酶連鎖反應試劑。反應單元120，係包含反應槽122、正控制反應槽124及負控制反應槽126。流體驅流單元140，係包含氣動式微幫浦144及驅流單元控制氣孔146，流體驅流單元140係設置於流體儲存單元110及反應單元120之間，用以運輸流體儲存單元110之清洗緩衝液或聚合酶連鎖反應試劑至反應單元120。閥門單元130，係包含氣動式微閥門132及閥門控制氣孔134，其中氣動式微閥門132 係設置於流體儲存單元110與氣動式微幫浦144之間，及氣動式微幫浦144與反應單元120之間，而氣動式微閥門132和氣動式微幫浦144之間具有流道154以供流體流通。閥門控制氣孔134係由氣道152將氣體注入氣動式微閥門132以其之開合。微流體晶片100更包含一定量單元142，其設置於氣動式微幫浦144之上，可調節氣動式微幫浦144的薄膜於流體運輸時被提升的高度，使流體的輸送量一致。
快速判斷適當性抗生素之檢測方法包含下列步驟：將清洗緩衝液注入第一流體儲存槽112、聚合酶連鎖反應試劑注入第二流體儲存槽114及鍵結萬古黴素的磁珠注入反應槽122中，其中分別於4個模組之第二流體儲存槽114中加入不同的引子對，引子對為第一引子對、第二引子對、第三引子對及第四引子對。將待測樣品與溴化乙錠混合加入反應槽122中，其中溴化乙錠之濃度為0.01至30mg/mL，照可見光1至20分鐘以觸發形成DNA-溴化乙錠之共價複合物後，使待測樣品、溴化乙錠和鍵結萬古黴素的磁珠再培養10分鐘，於此步驟不論是革蘭氏陽性菌或是革蘭氏陰性菌的菌體皆會與萬古黴素結合而被磁珠抓取。利用磁鐵收集已抓取菌體的磁珠。啟動流體驅流單元140使清洗緩衝液通過氣動式微閥門132經流道154流至反應槽122中，以清洗未結合上磁珠之物質，並從廢棄流體口170將清洗磁珠後的廢棄流體吸走。再啟動流體驅流單元140使已混合引子對的聚合酶連鎖反應試劑，通過氣動式微閥門132經流道154流至反應槽122中進行聚合酶連鎖反 應，聚合酶連鎖反應的反應條件如試驗例3所述，其中聚合酶連鎖反應的升溫及降溫係由溫度控制模組所調控。最後以螢光偵測聚合酶連鎖反應產物，根據增幅出的聚合酶連鎖反應產物判斷使用的抗生素種類。其中若加入第一引子對的組別有聚合酶連鎖反應產物，表示待測樣本中存在活菌；若加入第二引子對的組別有聚合酶連鎖反應產物，表示待測樣本中存在葡萄球菌屬之活菌；若加入第三引子對的組別無聚合酶增幅產物，但於第二引子對的組別有聚合酶連鎖反應產物，則表示待測樣本中存在凝固酶陰性葡萄球菌之活菌；若加入第四引子對的組別有聚合酶連鎖反應產物，表示待測樣本中存在抗藥性金黃色葡萄球菌之活菌。
本發明之快速判斷適當性抗生素之檢測套組，可將第二引子對、第三引子對及第四引子對置換為第五引子對、第六引子對及第七引子對。於檢測時微流體晶片100之4個模組的引子對分別為第一引子對、第五引子對、第六引子對及第七引子對。若加入第五引子對的組別有聚合酶連鎖反應產物，表示待測樣本中存在假單胞菌屬之活菌；若加入第六引子對的組別有聚合酶連鎖反應產物，表示待測樣本中存在大腸桿菌之活菌；若加入第七引子對的組別有聚合酶連鎖反應產物，表示待測樣本中存在腸球菌之活菌。其中本發明所使用之第二引子對至第七引子對所檢測之結果可涵蓋臨床上80%致病菌種，故能及時於第一線治療時使用正確的抗生素，避免延誤治療或因錯誤用藥 產生抗藥性細菌。
本發明之快速判斷適當性抗生素之檢測套組更包含正控制組和負控制組，以增加本發明檢測套組之客觀性。正控制組為以一內含大腸桿菌16S rRNA基因片段的質體，取代待測樣品以作為聚合酶連鎖反應的模版。於上述試驗步驟中，正控制組為加入鍵結萬古黴素的磁珠、溴化乙錠和質體至正控制反應槽124，而負控制組則為僅加入鍵結萬古黴素的磁珠和溴化乙錠至負控制反應槽126，其他如同上述試驗步驟，在此不贅述。
請參考第6圖至第11圖，為實施例二所得結果的螢光分析圖及膠體電泳圖，其中M為核酸之分子量標記。
第6(A)圖為實施例二之利用第二引子對的螢光分析圖，第6(B)圖為實施例二之利用第二引子對的膠體電泳圖。組別1為負控制組，組別2至7分別為待測樣品是濃度為106-101CFU/mL的葡萄球菌屬之活菌。利用第二引子對可於存在葡萄球菌屬細菌之待測樣品中，增幅出大小約為500bp的聚合酶連鎖反應產物。結果顯示，無論以螢光偵測或是膠體電泳分析，只要在菌體濃度為103CFU/ml以上的條件下，即能偵測待測樣品是否存在葡萄球菌屬細菌。
第7(A)圖為實施例二之利用第三引子對的螢光分析圖，第7(B)圖為實施例二之利用第三引子對的膠體電泳圖。組別1為負控制組，組別2至7分別為待測樣品是濃度為106-101CFU/mL的葡萄球菌屬之活菌。利用第三引子對可於存在葡萄球菌屬細菌之待測樣品中，增幅出大小約 為700bp的聚合酶連鎖反應產物，若無聚合酶增幅產物則表示為凝固酶陰性葡萄球菌。其可搭配第二引子對，用以鑑別凝固酶陰性葡萄球菌。結果顯示，無論以螢光偵測或是膠體電泳分析，只要在菌體濃度為104CFU/ml以上的條件下，即能判別待測樣品是否存在凝固酶陰性葡萄球菌。
第8(A)圖為實施例二之利用第四引子對的螢光分析圖，第8(B)圖為實施例二之利用第四引子對的膠體電泳圖。組別1為負控制組，組別2至7分別為待測樣品是濃度為106-101CFU/mL的抗藥性金黃色葡萄球菌之活菌。利用第四引子對可於存在抗藥性金黃色葡萄球菌之待測樣品中，增幅出大小約為500bp的聚合酶連鎖反應產物。結果顯示，無論以螢光偵測或是膠體電泳分析，只要在菌體濃度為103CFU/ml以上的條件下，即能偵測待測樣品是否存在抗藥性金黃色葡萄球菌。
第9(A)圖為實施例二之利用第五引子對的螢光分析圖，第9(B)圖為實施例二之利用第五引子對的膠體電泳圖。組別1為負控制組，組別2至7分別為待測樣品是濃度為106-101CFU/mL的假單胞菌屬之活菌。利用第四引子對可於存在假單胞菌屬細菌之待測樣品中，增幅出大小為153bp的聚合酶連鎖反應產物。結果顯示，無論以螢光偵測或是膠體電泳分析，只要在菌體濃度為102CFU/ml以上的條件下，即能偵測待測樣品是否存在假單胞菌屬細菌。
第10(A)圖為實施例二之利用第六引子對的螢光分析圖，第10(B)圖為實施例二之利用第六引子對的膠體電泳 圖。組別1為負控制組，組別2至7分別為待測樣品是濃度為106-101CFU/mL的大腸桿菌之活菌。利用第六引子對可於存在大腸桿菌之待測樣品中，增幅出大小為200bp的聚合酶連鎖反應產物。結果顯示，無論以螢光偵測或是膠體電泳分析，只要在菌體濃度為102CFU/ml以上的條件下，即能偵測待測樣品是否存在大腸桿菌。
第11(A)圖為實施例二之利用第七引子對的螢光分析圖，第11(B)圖為實施例二之利用第七引子對的膠體電泳圖。組別1為負控制組，組別2至5分別為待測樣品是濃度為104-101CFU/mL的腸球菌之活菌。利用第七引子對可於存在腸球菌之待測樣品中，增幅出大小為100bp的聚合酶連鎖反應產物。結果顯示，無論以螢光偵測或是膠體電泳分析，只要在菌體濃度為103CFU/ml以上的條件下，即能偵測待測樣品是否存在腸球菌。
根據上述實施例，本發明之快速判斷適當性抗生素之檢測方法於整體檢測過程僅需55分鐘，即能完成檢體純化、檢體混合、雜質清洗、聚合酶連鎖反應及反應結果判讀等步驟。而葡萄球菌屬、凝固酶陰性葡萄球菌及抗藥性金黃色葡萄球菌，為最常見造成院內感染且感染時難以治療的主要致病菌，治療時所需使用的抗生素也不同。故可利用本發明之快速判斷適當性抗生素之檢測套組及其方法，使臨床醫師能於用藥前就能確認患者體內是否有抗藥性的細菌存在，可針對病症及時給予適當的用藥，以免延誤病情。
本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作各種的更動與潤飾，因此本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。
<110> 國立清華大學
<120>
<160> 14
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅細菌16S rRNA基因片段的引子(forward)
<400> 1
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅細菌16S rRNA基因片段的引子(reversed)
<400> 2
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅葡萄球菌屬16S rRNA基因片段的引子(forward)
<400> 3
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅葡萄球菌屬16S rRNA基因片段的引子(reversed)
<400> 4
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅凝固酶陰性葡萄球菌coa基因片段的引子(forward)
<400> 5
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅凝固酶陰性葡萄球菌coa基因片段的引子(reversed)
<400> 6
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅抗藥性金黃色葡萄球mecA基因片段的引子(forward)
<400> 7
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅抗藥性金黃色葡萄球mecA基因片段的引子(reversed)
<400> 8
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅假單胞菌屬oprL基因片段的引子(forward)
<400> 9
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅假單胞菌屬oprL基因片段的引子(reversed)
<400> 10
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅大腸桿菌lamB基因片段的引子(forward)
<400> 11
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅大腸桿菌lamB基因片段的引子(reversed)
<400> 12
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅腸球菌ent基因片段的引子(forward)
<400> 13
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> primer
<223> 進行PCR增幅腸球菌ent基因片段的引子(reversed)
<400> 14

Claims (12)

  1. 一種快速偵測活菌之檢測套組，其成組配置以供接續進行檢測，該檢測套組包含：一溴化乙錠(ethidiummonoazide，EMA)，其中該溴化乙錠嵌合入一死菌之DNA；一磁珠，其中該磁珠鍵結一萬古黴素(Vancomycin)，可抓取革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌之菌體；一第一引子對，其具有如SEQ ID NO：1與SEQ ID NO：2所示序列；以及一微流體晶片，其包含：一流體儲存單元，係包含一第一流體儲存槽及一第二流體儲存槽，其中該第一流體儲存槽係儲存一清洗緩衝液，該第二流體儲存槽係儲存一聚合酶連鎖反應試劑；一反應單元，係包含一反應槽、一正控制反應槽及一負控制反應槽；一流體驅流單元，係包含一氣動式微幫浦及一驅流單元控制氣孔，該流體驅流單元設置於該流體儲存單元及該反應單元之間，用以運輸該流體儲存單元之該清洗緩衝液或該聚合酶連鎖反應試劑至該反應單元；及一閥門單元，係包含複數個氣動式微閥門及複數個閥門控制氣孔，其中該些氣動式微閥門係設置於該流體儲存單元及該氣動式微幫浦之間，及該氣動式微幫浦與該反應單元之間，該些閥門控制氣孔係將氣體注入該些氣動 式微閥門以控制該些氣動式微閥門之開合。
  2. 如請求項1所述之檢測套組，其中該微流體晶片更包含一定量單元，其係設置於該氣動式微幫浦之上。
  3. 一種利用請求項1所述之檢測套組快速偵測活菌之檢測方法，包含：提供一磁珠，其中該磁珠鍵結一萬古黴素，可抓取革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌之菌體；混合該磁珠、一溴化乙錠及一待測樣本並照光1至20分鐘，其中該溴化乙錠嵌合入一死菌之DNA，使該死菌無法藉由聚合酶連鎖反應放大核酸片段；收集該磁珠；提供一清洗緩衝液注入一第一流體儲存槽，啟動一流體驅流單元使該清洗緩衝液經一氣動式微閥門流至該反應槽中，清洗未結合上該磁珠之物質；加入一第一引子對，其具有如SEQ ID NO：1與SEQ ID NO：2所示序列；提供一聚合酶連鎖反應試劑注入一第二流體儲存槽，啟動該流體驅流單元使該聚合酶連鎖反應試劑經該氣動式微閥門流至該反應槽中進行聚合酶連鎖反應；以及偵測是否有一聚合酶連鎖反應產物，其為該待測樣本存在活菌之表徵。
  4. 如請求項3所述之檢測方法，其中該溴化乙錠之濃度為0.01至30mg/mL。
  5. 如請求項3至4所述之檢測方法，其中偵測該聚合酶連鎖反應產物係以膠體電泳系統或吸收光偵測系統進行。
  6. 一種快速判斷適當性抗生素之檢測套組，其成組配置以供接續進行檢測，該檢測套組包含：一溴化乙錠，其中該溴化乙錠嵌合入一死菌之DNA；一磁珠，其中該磁珠鍵結一萬古黴素，可抓取革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌之菌體；複數個引子對，該些引子對包含：具有如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示序列之一第一引子對、具有如SEQ ID NO：3與SEQ ID NO：4所示序列之一第二引子對、具有如SEQ ID NO：5與SEQ ID NO：6所示序列之一第三引子對及具有如SEQ ID NO：7與SEQ ID NO：8所示序列之一第四引子對；以及一微流體晶片，該微流體晶片具有複數個模組，可同時進行聚合酶連鎖反應，各該模組包含：一流體儲存單元，係包含一第一流體儲存槽及一第二流體儲存槽，其中該第一流體儲存槽係儲存一清洗緩衝液，該第二流體儲存槽係儲存一聚合酶連鎖反應試劑；一反應單元，係包含一反應槽、一正控制反應槽 及一負控制反應槽；一流體驅流單元，係包含一氣動式微幫浦及一驅流單元控制氣孔，該流體驅流單元設置於該流體儲存單元及該反應單元之間，用以運輸該流體儲存單元之該清洗緩衝液或該聚合酶連鎖反應試劑至該反應單元；及一閥門單元，係包含複數個氣動式微閥門及複數個閥門控制氣孔，其中該些氣動式微閥門係設置於該流體儲存單元及該氣動式微幫浦之間，及該氣動式微幫浦與該反應單元之間，該些閥門控制氣孔係將氣體注入該些氣動式微閥門以控制該些氣動式微閥門之開合。
  7. 如請求項6所述之檢測套組，其中更包含如SEQ ID NO：9與SEQ ID NO：10所示序列之一第五引子對、如SEQ ID NO：11與SEQ ID NO：12所示序列之一第六引子對及具有如SEQ ID NO：13與SEQ ID NO：14所示序列之一第七引子對。
  8. 如請求項6所述之檢測套組，其中該微流體晶片更包含一定量單元，其係設置於該氣動式微幫浦之上。
  9. 一種利用請求項6所述之檢測套組快速判斷適當性抗生素之檢測方法，包含：提供一磁珠，其中該磁珠鍵結一萬古黴素，可抓取革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌之菌體； 混合該磁珠、一溴化乙錠及一待測樣本，將其注入一反應槽並照光1至20分鐘，其中該溴化乙錠嵌合入一死菌之DNA，使該死菌無法藉由聚合酶連鎖反應放大核酸片段；收集該磁珠；提供一清洗緩衝液注入一第一流體儲存槽，啟動一流體驅流單元使該清洗緩衝液經一氣動式微閥門流至該反應槽中，清洗未結合上該磁珠之物質；加入一引子對，其中該引子對係選自下列引子對所組成之一群組：具有如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示序列之一第一引子對、具有如SEQ ID NO：3與SEQ ID NO：4所示序列之一第二引子對、具有如SEQ ID NO：5與SEQ ID NO：6所示序列之一第三引子對及具有如SEQ ID NO：7與SEQ ID NO：8所示序列之一第四引子對；提供一聚合酶連鎖反應試劑注入一第二流體儲存槽，啟動該流體驅流單元使該聚合酶連鎖反應試劑經該氣動式微閥門流至該反應槽中進行聚合酶連鎖反應；以及根據增幅出的聚合酶連鎖反應產物判斷使用的抗生素種類。
  10. 如請求項9所述之檢測方法，其中該引子對更包含如SEQ ID NO：9與SEQ ID NO：10所示序列之一第五引子對、如SEQ ID NO：11與SEQ ID NO：12所示序列之一第六引子對及具有如SEQ ID NO：13與SEQ ID NO：14所示序列之一第七引子對。
  11. 如請求項9所述之檢測方法，其中該溴化乙錠之濃度為0.01至30mg/mL。
  12. 如請求項9至11所述之檢測方法，其中偵測該聚合酶連鎖反應產物係以膠體電泳系統或吸收光偵測系統進行。
TW103121935A 2014-06-25 2014-06-25 快速偵測活菌之檢測套組及其方法與快速判斷適當性抗生素之檢測套組及其方法 TW201600606A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW103121935A TW201600606A (zh) 2014-06-25 2014-06-25 快速偵測活菌之檢測套組及其方法與快速判斷適當性抗生素之檢測套組及其方法
US14/507,842 US20150376684A1 (en) 2014-06-25 2014-10-07 Test kit and method for rapidly detecting live bacterium and test kit and method for rapidly determining appropriate antibiotic

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW103121935A TW201600606A (zh) 2014-06-25 2014-06-25 快速偵測活菌之檢測套組及其方法與快速判斷適當性抗生素之檢測套組及其方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW201600606A true TW201600606A (zh) 2016-01-01

Family

ID=54929872

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW103121935A TW201600606A (zh) 2014-06-25 2014-06-25 快速偵測活菌之檢測套組及其方法與快速判斷適當性抗生素之檢測套組及其方法

Country Status (2)

Country Link
US (1) US20150376684A1 (zh)
TW (1) TW201600606A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI631338B (zh) * 2016-11-17 2018-08-01 國立清華大學 微流體體外篩選晶片系統及其使用方法
CN109136349A (zh) * 2018-08-29 2019-01-04 北京大学第医院 一种实时检测感染的微流芯片
US10610863B2 (en) 2016-11-24 2020-04-07 National Tsing Hua University Automatic microfluidic system for antibiotic susceptibility testing and method of operating thereof

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI631338B (zh) * 2016-11-17 2018-08-01 國立清華大學 微流體體外篩選晶片系統及其使用方法
US10610863B2 (en) 2016-11-24 2020-04-07 National Tsing Hua University Automatic microfluidic system for antibiotic susceptibility testing and method of operating thereof
CN109136349A (zh) * 2018-08-29 2019-01-04 北京大学第医院 一种实时检测感染的微流芯片

Also Published As

Publication number Publication date
US20150376684A1 (en) 2015-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10745763B2 (en) Target capture system
US11016086B2 (en) Sample entry
CA2895945C (en) Target capture system
CN101848765B (zh) 分析方法
CN102027367B (zh) 促进生物反应的屏障
Dong et al. Rapid identification and susceptibility testing of uropathogenic microbes via immunosorbent ATP-bioluminescence assay on a microfluidic simulator for antibiotic therapy
US20100112549A1 (en) Microorganism Detection Method and Apparatus
JP2019515662A (ja) 細菌の同定、および抗生物質感受性プロファイリング装置
CA3074506A1 (en) Method of determining the presence of an antibiotic resistant cell
CN106916906B (zh) 一种检测感染性腹泻病原体的引物组合物及其试剂盒
Sykes et al. Isolation and identification of aerobic and anaerobic bacteria
TW201600606A (zh) 快速偵測活菌之檢測套組及其方法與快速判斷適當性抗生素之檢測套組及其方法
CN106399486B (zh) 用于多重pcr检测致腹泻寄生虫的引物组及试剂盒
CN107629951B (zh) 微流控基因检测芯片
CN113684118A (zh) 一种集成核酸分析芯片
TWI691593B (zh) 用於自動化進行抗生素感受性試驗之微流體晶片系統及其操作方法
CN113637781B (zh) 猪易感相关致病菌检测的lamp引物组及基于此的试剂盒和lamp芯片和应用
CN108138218B (zh) 使用噬菌体的细菌检测
EP3652350A1 (en) Methods to detect cells latently infected with hiv
CN210803495U (zh) 一种微流控芯片
CN1273613C (zh) 一种分枝杆菌的检测方法及其检测装置
WO2019222217A1 (en) Portable microfludic system for biological and analytical testing
CN115747114B (zh) 分离培养牛种布鲁氏菌的方法
CN115747113B (zh) 分离培养羊种布鲁氏菌的方法
TW201812017A (zh) 快速檢測細胞樣品內細菌及黴漿菌含量之方法