TW201540305A - ５’末端具有非天然核苷酸之寡核苷酸 - Google Patents

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Fumikazu Shinohara
Asana Makino
Junichiro Yamamoto
Takahiro Nakajima
Taiji Oashi
Michihiko Suzuki
Jun-Ichi Saito
Tomoyuki Nishikawa
Masayoshi Nakoji
Yuichi Takahashi
Yasuo Kouda
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Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
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Abstract

本發明提供一種寡核苷酸等，其於寡核苷酸之5'末端具有式(I)所表示之核苷酸殘基或核苷殘基，該核苷酸殘基或核苷殘基經由3位之氧原子而與鄰接之核苷酸殘基鍵結， □(式中，X1為氧原子等，R1為式(IIA) □(式中，R5A為鹵素等，R6A為氫原子等)、式(IVA) □(式中，Y3A為氮原子等，Y4A為CH等)等，R2為氫原子、羥基、鹵素或可具有取代基之低級烷氧基，R3為氫原子或 □(式中，n2為1、2或3)}。

Description

5'末端具有非天然核苷酸之寡核苷酸
本發明係關於一種具有針對標的信使RNA(Ribonucleic Acid，核糖核酸)(mRNA)之減弱(knockdown)活性(例如，RNA干擾活性等)之寡核苷酸等。
短鏈干擾性RNA(small interfering RNA，以下為siRNA)係與RNA干擾(RNA interference，以下為RNAi)相關，且係具有作為用以抑制標的基因之表現之嚮導之功能的RNA[Nature，第411卷，第6836號，494~498頁(2001年)]。siRNA由於經由信使RNA(mRNA)之切斷而可選擇性地抑制(減弱)負責該mRNA表現之蛋白質之表現，因此業界期待將其應用於醫藥[Nature Reviews Cancer、第11卷、59~67頁(2011年)]。
siRNA通常被取入至稱為RNA induced silencing complex(RISC，RNA誘導沈默複合體)之複合體中而表現出其功能。而且，RISC之主要構成成分係稱為Argonaute2(AGO2)之蛋白質，AGO2於RNAi路徑中與siRNA結合，而將mRNA切斷[Trends in Biochemical Sciences，第35卷，第7號，368~376頁(2010年)]。取入至RISC中之siRNA之正義鏈被切斷而成為僅有反義鏈之單鏈後，與和反義鏈具有互補性之標的mRNA相結合。已知標的mRNA被AGO2中之RNase區域切斷，結果抑制蛋白質之表現[Silence，第1卷，3頁(2010年)]。
另一方面，近年來，亦報告有hAGO2MID/AMP複合體、及 hAGO2MID/UMP複合體之立體結構解析[Nature，第465卷，818-822頁(2010年)]、或與hAGO2及RNA寡聚複合體相關之立體結構解析[Science，第336卷，25頁(2012年)]。
又，近年來，尤其盛行使用X射線之蛋白質之結構解析，大量報告有嘗試基於所得之結構資訊，以原子水準闡明蛋白質與以其為標的之化合物之結合方式，從而設計出適合該結構之化合物[Journal of Postgraduate Medicine，第55卷，301~304頁(2009年)]。
然而，雖然提示存在藉由避免使用含有非天然型核苷酸之寡核苷酸之脫靶效應(專利文獻1)或提高與AGO2之親和性，而增強siRNA之活性之可能性(非專利文獻1)，但已知有提高與AGO2之親和性而增強減弱活性之方法(專利文獻2)。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2011/119674號說明書
[專利文獻2]國際公開第2014/034934號說明書
[非專利文獻]
[非專利文獻1]「Molecular Therapy-Nucleic Acids」，2012年，第1卷，p.e5
本發明之目的在於提供一種與AGO2之親和性提高之寡核苷酸等。
本發明係關於以下之(1)~(72)。
(1)一種寡核苷酸，其於寡核苷酸之5'末端具有式(I)所表示之核苷酸殘基或核苷殘基，該核苷酸殘基或核苷殘基經由3位之氧原子而與 鄰接之核苷酸殘基鍵結，
{式中，X1為氧原子、硫原子、硒原子或NR4(式中，R4為氫原子、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷基磺醯基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳醯基或可具有取代基之芳香族雜環羰基)，R1為式(II)
{式中，Y1為氮原子或CR8[式中，R8為氫原子、鹵素、氰基、羧基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷氧基羰基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、-NR9aR9b(式中，R9a及R9b相同或不同，分別為氫原子、可具有取代基之低級烷基或可具有取代基之芳烷基)、或-CONR9cR9d(式中，R9c及R9d相同或不同， 分別為氫原子或可具有取代基之低級烷基)]，R5為氫原子、鹵素、氰基、羧基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之環烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷氧基羰基、可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳香族雜環基、可具有取代基之脂肪族雜環基、-NR10aR10b(式中，R10a及R10b分別與上述R9a及R9b含義相同)、-CONR10cR10d(式中，R10c及R10d分別與上述R9c及R9d含義相同)、-N=C-R10e(式中，R10e為氫原子或可具有取代基之低級烷基)、-C=N-R10f(式中，R10f為氫原子或可具有取代基之低級烷基)或-N=N-R10g(式中，R10g為氫原子或可具有取代基之低級烷基)，R6為氫原子、鹵素、氰基、羧基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷氧基羰基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳氧基、可具有取代基之芳烷氧基、可具有取代基之芳硫基、可具有取代基之芳醯基、可具有取代基之芳香族雜環基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之芳香族雜環氧基、可具有取代基之芳香族雜環硫基、可具有取代基之芳香族雜環羰基、-NR11aR11b(式中，R11a及R11b相同或不同，分別為氫原子、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷基磺醯基、可具有取代基之芳醯基、可具有取代基之芳基磺醯基、可具有取代基之芳香族雜環基、可具有取代基之芳香族雜環羰基或可具有取代基之芳香族雜環磺醯基)、-CONR11cR11d(式 中，R11c及R11d相同或不同，分別為氫原子、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基)、-NHCONR11eR11f(式中，R11e及R11f相同或不同，分別為氫原子、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基)、-NHCO2R11g(式中，R11g為可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基)、-N=C-R11h(式中，R11h為氫原子或可具有取代基之低級烷基)、-C=N-R11i(式中，R11i為氫原子或可具有取代基之低級烷基)或-N=N-R11j(式中，R11j為氫原子或可具有取代基之低級烷基)，R7為氫原子、核酸領域中之氫原子之等效體、鹵素、氰基、羧基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷氧基羰基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳氧基、可具有取代基之芳硫基、可具有取代基之芳醯基、可具有取代基之芳香族雜環基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之芳香族雜環氧基、可具有取代基之芳香族雜環硫基、可具有取代基之芳香族雜環羰基、-NR11aR11b(式中，R11a及R11b相同或不同，分別為氫原子、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷基磺醯基、可具有取代基之芳醯基、可具有取代基之芳基磺醯基、可具有取代基之芳香族雜環基、可具有取代基之芳香族雜環羰基或可具有取代基之芳香族雜環磺醯基)、- CONR11cR11d(式中，R11c及R11d相同或不同，分別為氫原子、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基)、-NHCONR11eR11f(式中，R11e及R11f相同或不同，分別為氫原子、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基)或-NHCO2R11g(式中，R11g為可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基)，於Y1為氮原子、R5為氫原子、R6為-NR11aR11b、R7為氫原子之情形時，不存在R11a及R11b同時為氫原子之情況}、式(III)
(式中，Y2、R6a及R7a分別與上述Y1、R6及R7含義相同)、式(IV)
[式中，R12為氫原子、核酸領域中之氫原子之等效體、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔 基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之低級烷醯基或可具有取代基之低級烷基磺醯基，---為單鍵或雙鍵，於---為單鍵之情形時，Y3為NR13a(式中，R13a為氫原子、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之低級烷醯基或可具有取代基之低級烷基磺醯基)或CR14aR14b(式中，R14a及R14b相同或不同，分別為氫原子、鹵素、氰基、羧基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷氧基羰基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之低級烷基胺基、可具有取代基之二低級烷基胺基、可具有取代基之低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之二低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環基、或可具有取代基之芳香族雜環烷基)，Y4為NR13b(式中，R13b與上述R13a含義相同)或CR14cR14d(式中，R14c及R14d分別與上述R14a及R14b含義相同)，於---為雙鍵之情形時，Y3為氮原子或CR14e(式中，R14e為氫原子、鹵素、氰基、羧基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷氧基羰基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之低級烷基胺基、可具有取代基之二低級烷基胺基、可具有取代基之低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之二低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之 芳香族雜環基、或可具有取代基之芳香族雜環烷基)，Y4為氮原子或CR14f(式中，R14f為氫原子、鹵素、氰基、羧基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷氧基羰基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之低級烷基胺基、可具有取代基之二低級烷基胺基、可具有取代基之低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之二低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環基、或可具有取代基之芳香族雜環烷基)，於R12為氫原子、Y3為CR14e、Y4為CR14f之情形時，不存在R14e及R14f同時為氫原子之情況及R14e為甲基且R14f為氫原子之情況]、或式(V)
(式中，R12a與上述R12含義相同，環A為芳香族環，n1為0~4之整數，R16為鹵素、羥基、巰基、硝基、氰基、羧基、胺甲醯基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷氧基羰基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之低級烷基胺基、可具有取代基之二低級烷基胺基、可具有取代基之低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之二低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之 芳香族雜環基、可具有取代基之芳香族雜環烷基或可具有取代基之低級烷基磺醯基，於n1為2~4之整數之情形時，各R16可相同亦可不同)，R2為氫原子、羥基、鹵素或可具有取代基之低級烷氧基，R3為氫原子或
(式中，n2為1、2或3)}。
(2)如(1)記載之寡核苷酸，其中X1為氧原子。
(3)如(1)或(2)記載之寡核苷酸，其中R1為式(II)。
(4)如(3)記載之寡核苷酸，其中Y1為氮原子。
(5)如(3)或(4)記載之寡核苷酸，其中R5為氫原子、鹵素、氰基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之環烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳香族雜環基、可具有取代基之脂肪族雜環基、-NR10aR10b(式中，R10a及R10b分別與上述含義相同)、-CONR10cR10d(式中，R10c及R10d分別與上述含義相同)、-N=C-R10e(式中，R10e為氫原子或可具有取代基之低級烷基)、-C=N-R10f(式中，R10f為氫原子或可具有取代基之低級烷基)或-N=N-R10g(式中，R10g為氫原子或可具有取代基之低級烷基)。
(6)如(3)或(4)記載之寡核苷酸，其中R5為氫原子、鹵素、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、氰基或-NR10aR10b(式中，R10a及R10b分別與上述含義相同)。
(7)如(3)或(4)記載之寡核苷酸，其中R5為可具有取代基之低級烯基或氰基。
(8)如(3)至(7)中任一項記載之寡核苷酸，其中R6為可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳香族雜環基、-NR11aR11b(式中，R11a及R11b分別與上述含義相同)、-N=C-R11h(式中，R11h為氫原子或可具有取代基之低級烷基)、-C=N-R11i(式中，R11i為氫原子或可具有取代基之低級烷基)或-N=N-R11j(式中，R11j為氫原子或可具有取代基之低級烷基)。
(9)如(3)至(7)中任一項記載之寡核苷酸，其中R6為可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之芳基或-NR11aR11b(式中，R11a及R11b分別與上述含義相同)。
(10)如(3)至(7)中任一項記載之寡核苷酸，其中R6為-NR11aR11b(式中，R11a及R11b相同或不同，分別為氫原子或可具有取代基之低級烷基)。
(11)如(3)至(7)中任一項記載之寡核苷酸，其中R6為可具有取代基之芳基，且取代基存在於芳基之間位或對位。
(12)如(3)至(11)中任一項記載之寡核苷酸，其中R7為氫原子。
(13)如(1)或(2)記載之寡核苷酸，其中R1為式(III)。
(14)如(13)記載之寡核苷酸，其中Y2為氮原子。
(15)如(13)或(14)記載之寡核苷酸，其中R6a為胺基、甲基胺基或二甲胺基。
(16)如(13)至(15)中任一項記載之寡核苷酸，其中R7為氫原子。
(17)如(1)或(2)記載之寡核苷酸，其中R1為式(IV)。
(18)如(17)記載之寡核苷酸，其中R12為氫原子或核酸領域中之氫原子之等效體。
(19)如(18)記載之寡核苷酸，其中---為雙鍵，Y3為CR14e(式中， R14e與上述含義相同)，Y4為氮原子或CR14f(式中，R14f與上述含義相同，但為氰基之情形除外)。
(20)如(19)記載之寡核苷酸，其中R14e為氫原子。
(21)如(19)記載之寡核苷酸，其中R14e為鹵素、氰基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基，R14f為氫原子。
(22)如(19)記載之寡核苷酸，其中R14e為氫原子，R14f為鹵素、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基。
(23)如(1)或(2)記載之寡核苷酸，其中R1為式(V)。
(24)如(23)記載之寡核苷酸，其中環A為式(A1)
(式中，R16及n1分別與上述含義相同)、式(A2)
(式中，R16與上述含義相同，n1為0~2之整數，X2為NH、氧原子或硫原子)、式(A3)
(式中，R16及X2與上述含義相同，n1為0~2之整數)、式(A4)
(式中，R16與上述含義相同，n1為0~3之整數)、式(A5)
(式中，R16與上述含義相同，n1為0~3之整數)、式(A6)
(式中，R16與上述含義相同，n1為0~3之整數)、式(A7)
(式中，R16與上述含義相同，n1為0~3之整數)、式(A8)
(式中，R16與上述含義相同，n1為1)、式(A9)
(式中，R16與上述含義相同，n1為1)、式(A10)
(式中，R16與上述含義相同，n1為1)、式(A11)
(式中，R16與上述含義相同，n1為1)。
(25)如(23)或(24)記載之寡核苷酸，其中R16為鹵素、硝基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烷基胺基或可具有取代基之二低級烷基胺基。
(26)如(25)記載之寡核苷酸，其中R12a為氫原子或核酸領域中之氫原子之等效體。
(27)如(23)至(26)中任一項記載之寡核苷酸，其中n1為1或2。
(28)如(1)至(27)中任一項記載之寡核苷酸，其中R3為
(式中，n2與上述含義相同)。
(29)如(28)記載之寡核苷酸，其中n2為1。
(30)如(1)至(29)中任一項記載之寡核苷酸，其中R2為氫原子、羥基、氟原子或甲氧基。
(31)如(1)至(29)中任一項記載之寡核苷酸，其中R2為羥基。
(32)如(1)至(29)中任一項記載之寡核苷酸，其中R2為氫原子或氟原子。
(33)如(1)記載之寡核苷酸，其中X1為氧原子，R2為氫原子、羥基、氟原子或甲氧基。
(34)如(33)記載之寡核苷酸，其中R1為式(IIA)
(式中，R5A及R6A分別與上述R5及R6含義相同)。
(35)如(34)記載之寡核苷酸，其中R5A為鹵素、胺甲醯基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之環烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷基胺基、可具有取代基之二低級烷基胺基、可具有取代基之低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之二低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳香族雜環基、可具有取代基之脂肪族雜環基或-NR10aR10b(式中，R10a及R10b分別與上述含義相同)。
(36)如(34)記載之寡核苷酸，其中R5A為鹵素、可具有取代基之低 級烷基、可具有取代基之低級烯基、氰基或-NR10aR10b(式中，R10a及R10b分別與上述含義相同)。
(37)如(34)至(36)中任一項記載之寡核苷酸，其中R6A為可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳香族雜環基或-NR11aR11b(式中，R11a及R11b分別與上述含義相同)。
(38)如(34)至(36)中任一項記載之寡核苷酸，其中R6A為NR11aR11b(式中，R11a及R11b分別與上述含義相同)。
(39)如(34)至(36)中任一項記載之寡核苷酸，其中R6A為胺基、可具有取代基之低級烯基或可具有取代基之芳基。
(40)如(33)記載之寡核苷酸，其中R1為式(IVA)
(式中，Y3A及Y4A分別與上述Y3及Y4含義相同，但於Y3A及Y4A為CR14e及CR14f、R14e為氫原子之情形時，R14f不為氰基)。
(41)如(40)記載之寡核苷酸，其中Y3A為CR14e(式中，R14e與上述含義相同)，Y4A為CR14f(式中，R14f與上述含義相同)。
(42)如(41)記載之寡核苷酸，其中R14e為氫原子。
(43)如(41)記載之寡核苷酸，其中R14e為鹵素、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基，R14f為氫原子。
(44)如(41)記載之寡核苷酸，其中R14e為氫原子，R14f為鹵素、可 具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基。
(45)如(33)記載之寡核苷酸，其中R1為式(VA)
(式中，環AA、n1A及R16A分別與上述環A、n1、及R16含義相同，於n1A為2~4之整數之情形時，各R16A可相同亦可不同，但於環AA為苯環、n1A為2之情形時，R16A不為低級烷氧基，於環AA為苯環、n1A為1、R16A為氯原子之情形時，式(A1')
所表示之情形除外)。
(46)如(45)記載之寡核苷酸，其中環AA為苯環或噻吩環。
(47)如(45)或(46)記載之寡核苷酸，其中R16A為鹵素、硝基低級烷基、可具有取代基之低級烷基胺基或可具有取代基之二低級烷基胺基。
(48)如(45)至(47)中任一項記載之寡核苷酸，其中n1A為1或2。
(49)如(33)至(48)中任一項記載之寡核苷酸，其中R3為
(式中，n2A與上述含義相同)。
(50)如(49)記載之寡核苷酸，其中n2A為1。
(51)如(33)至(50)中任一項記載之寡核苷酸，其中R2為氫原子或氟原子。
(52)如(33)至(50)中任一項記載之寡核苷酸，其中R2為羥基。
(53)如(1)至(52)中任一項記載之寡核苷酸，其具有10~80個鹼基長度。
(54)如(1)至(52)中任一項記載之寡核苷酸，其具有20~50個鹼基長度。
(55)如(1)至(52)中任一項記載之寡核苷酸，其具有20~30個鹼基長度。
(56)如(1)至(52)中任一項記載之寡核苷酸，其具有21~25個鹼基長度。
(57)如(1)至(56)中任一項記載之寡核苷酸，其係雙鏈寡核苷酸。
(58)如(1)至(56)中任一項記載之寡核苷酸，其係單鏈寡核苷酸。
(59)如(1)至(56)中任一項記載之寡核苷酸，其中寡核苷酸係短鏈干擾性RNA(siRNA)。
(60)一種提高針對編碼與疾病相關之蛋白質之mRNA之減弱活性之方法，其特徵在於：於具有針對編碼與疾病相關之蛋白質之mRNA之減弱活性的寡核苷酸中，將該寡核苷酸之5'末端之鹼基殘基取代為式(II)[化24]
(式中，Y1、R5、R6及R7分別與上述含義相同)、式(III)
(式中，Y2、R6a及R7a分別與上述含義相同)、式(IV)
(式中，R12、---、Y3及Y4分別與上述含義相同)、或式(V)
(式中，R12a、環A、n1及R16分別與上述含義相同)所表示之鹼基 殘基。
(61)一種提高針對編碼與疾病相關之蛋白質之mRNA之減弱活性之方法，其特徵在於：於具有針對編碼與疾病相關之蛋白質之mRNA之減弱活性、5'末端之鹼基為鳥嘌呤或胞嘧啶之寡核苷酸中，將該寡核苷酸之5'末端之鳥嘌呤殘基或胞嘧啶殘基取代為腺嘌呤殘基(6-胺基嘌呤-9-基)、胸腺嘧啶殘基(5-甲基-1,2,3,4-四氫嘧啶-2,4-二酮-1-基)、尿苷殘基(嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮-1-基)、式(II)
(式中，Y1、R5、R6及R7分別與上述含義相同)、式(III)
(式中，Y2、R6a及R7a分別與上述含義相同)、式(IV)
(式中，R12、---、Y3及Y4分別與上述含義相同)、或式(V)
(式中，R12a、環A、n1及R16分別與上述含義相同)所表示之鹼基殘基。
(62)如(60)或(61)記載之方法，其中寡核苷酸係短鏈干擾性RNA(siRNA)。
(63)一種核酸醫藥，其含有藉由如(60)至(62)中任一項記載之方法而提高寡核苷酸針對標的mRNA之減弱活性之寡核苷酸。
(64)一種核苷酸或核苷、利用保護基對其羥基、羧基及/或胺基進行保護之化合物、或者該等之醯胺、或其鹽，其係用於取代具有針對編碼與疾病相關之蛋白質之mRNA之減弱活性的寡核苷酸之5'末端之核苷酸殘基或核苷殘基、用於提高該寡核苷酸針對標的mRNA之減弱活性，其係由式(Ia)
(式中，X1、R1、R2及R3分別與上述含義相同)所表示。
(65)如(63)記載之核苷酸或核苷、利用保護基對其羥基、羧基及/或胺基進行保護之化合物、或者該等之醯胺、或其鹽，其中寡核苷酸 係短鏈干擾性RNA(siRNA)。
(66)一種核苷酸或核苷、利用保護基對其羥基、羧基及/或胺基進行保護之化合物、或者該等之醯胺、或其鹽，其係用於取代具有針對編碼與疾病相關之蛋白質之mRNA之減弱活性的寡核苷酸之5'末端之核苷酸殘基或核苷殘基、用於提高該寡核苷酸針對標的mRNA之減弱活性，其含有式(II)
(式中，Y1、R5、R6及R7分別與上述含義相同)、式(III)
(式中，Y2、R6a及R7a分別與上述含義相同)、式(IV)
(式中，R12、---、Y3及Y4分別與上述含義相同)、或式(V)
(式中，R12a、環A、n1及R16分別與上述含義相同)所表示之鹼基殘基。
(67)如(66)記載之核苷酸或核苷、利用保護基對其羥基、羧基及/或胺基進行保護之化合物、或者該等之醯胺、或其鹽，其中寡核苷酸係短鏈干擾性RNA(siRNA)。
(68)一種於5'末端具有式(I)所表示之核苷酸殘基或核苷殘基、具有針對編碼與疾病相關之蛋白質之mRNA之減弱活性的寡核苷酸之用途，其係用於製造標的蛋白質之表現抑制劑，
(式中，X1、R1、R2及R3分別與上述含義相同)。
(69)一種將下述式(II)、式(III)、式(IV)、或式(V)所表示之鹼基殘基作為5'末端之鹼基殘基而導入、具有針對編碼與疾病相關之蛋白質之mRNA之減弱活性的寡核苷酸之用途，其係用於製造標的蛋白質 之表現抑制劑，
(式中，Y1、R5、R6及R7分別與上述含義相同)
(式中，Y2、R6a及R7a分別與上述含義相同)
(式中，R12、---、Y3及Y4分別與上述含義相同)
(式中，R12a、環A、n1及R16分別與上述含義相同)。
(70)如(68)或(69)記載之用途，其中寡核苷酸係短鏈干擾性RNA(siRNA)。
(71)如(1)至(7)中任一項記載之寡核苷酸，其中R2為氫原子，R6為可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之芳氧基、可具有取代基之芳烷氧基、可具有取代基之芳香族雜環氧基、可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之芳硫基、可具有取代基之芳香族雜環硫基、-NR30R31(R30及R31相同或不同，分別為氫原子、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳香族雜環、可具有取代基之芳烷基、或可具有取代基之芳香族雜環烷基，其中，R30及R31同時為氫原子之情形除外)、可具有取代基之芳基、或可具有取代基之芳香族雜環。
(72)如(1)至(7)中任一項記載之寡核苷酸，其中R6為可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之芳烷氧基、可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之芳硫基、或-NR30AR31A(R30A及R31A相同或不同，分別為可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之芳基、或可具有取代基之芳烷基，其中，R30A及R31A同 時為氫原子之情形除外)。
(73)如(71)記載之寡核苷酸，其中R6為經包含酸性官能基之取代基取代之低級烷氧基、經包含酸性官能基之取代基取代之芳氧基、經包含酸性官能基之取代基取代之芳烷氧基、經包含酸性官能基之取代基取代之芳香族雜環氧基、經包含酸性官能基之取代基取代之低級烷硫基、經包含酸性官能基之取代基取代之芳硫基、經包含酸性官能基之取代基取代之芳香族雜環硫基、-NR30R31(R30及R31相同或不同，分別為氫原子、可經包含酸性官能基之取代基取代之低級烷基、可經包含酸性官能基之取代基取代之低級烯基、可經包含酸性官能基之取代基取代之低級炔基、可經包含酸性官能基之取代基取代之芳基、可經包含酸性官能基之取代基取代之芳香族雜環、可經包含酸性官能基之取代基取代之芳烷基、或可經包含酸性官能基之取代基取代之芳香族雜環烷基)、經包含酸性官能基之取代基取代之芳基、或經包含酸性官能基之取代基取代之芳香族雜環。
(74)如(72)記載之寡核苷酸，其中R6為經包含酸性官能基之取代基取代之低級烷氧基、經包含酸性官能基之取代基取代之芳烷氧基、經包含酸性官能基之取代基取代之低級烷硫基、經包含酸性官能基之取代基取代之芳硫基、或-NR30AR31A(R30A及R31A相同或不同，分別為可經包含酸性官能基之取代基取代之低級烷基、可經包含酸性官能基之取代基取代之低級炔基、可經包含酸性官能基之取代基取代之芳基、或可經包含酸性官能基之取代基取代之芳烷基，其中，R30A及R31A同時為氫原子之情形除外)。
(75)如(73)或(74)記載之寡核苷酸，其中酸性官能基為羧基及/或-OP(=O)(OH)2。
(75)一種核苷酸或其鹽或者該等之水合物，其係如下述表8~21中記載之化合物編號I-39~I-101中之任一者。
(76)一種核苷或其鹽或者該等之水合物，其係與如(75)記載之核苷酸相對應者。
根據本發明，可提供一種與AGO2之親和性提高之寡核苷酸等。
圖1係於以螢光素酶為標的之siRNA中，對反義鏈之5'末端具有8-Br-dA之siRNA與具有單磷酸腺苷之siRNA之螢光素酶發光水準進行比較之圖(濃度100pmol/L)。縱軸表示將陰性對照群之發光量設為1之情形時之各siRNA之發光比率。
圖2係於以螢光素酶為標的之siRNA中，對反義鏈之5'末端具有8-Br-dA之siRNA(874-BrdA)與具有單磷酸腺苷(874-A)、單磷酸鳥苷(874-G)、單磷酸胞苷(874-C)或單磷酸尿苷(874-U)之siRNA之螢光素酶發光水準進行比較之圖。縱軸表示將陰性對照群之發光量設為1之情形時之各siRNA之發光比率。橫軸之A意指874-A，橫軸之G意指874-G，橫軸之C意指874-C，橫軸之U意指874-U，橫軸之BrdA意指874-BrdA。分別表示於3.2pmol/L、16pmol/L、80pmol/L及400pmol/L之濃度下進行試驗之結果。
圖3係於以D-甘油醛-3-磷酸脫氫酶(D-Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH，基因庫許可號碼NM_001256799)為標的之siRNA中，對反義鏈之5'末端具有8-Br-dA之siRNA與具有單磷酸腺苷之siRNA之GAPDH mRNA之表現水準進行比較之圖。縱軸表示將陰性對照群中之GAPDH之mRNA量設為1之情形時之GAPDH mRNA之相對表現水準。橫軸表示各siRNA，左側表示反義鏈5'末端具有單磷酸腺苷之siRNA(217-A、278-A、516-A、624-A、715-A、816-A、936-A、1096-A、1134-A)，右側表示反義鏈之5'末端具有8-Br-dA之siRNA(217-BrdA、278-BrdA、516-BrdA、624-BrdA、715-BrdA、 816-BrdA、936-BrdA、1096-BrdA、1134-BrdA)。
圖4係表示於以螢光素酶為標的之siRNA中，反義鏈之5'末端具有單磷酸腺苷(454-A)、單磷酸尿苷(454-U)、8-Br-dA(454-BrdA)、I-37(6-NO2,7-Me-dQu)、I-21(6-萘-2-基-dPu)、I-34(6-Me-dU)、或I-25(6-萘基-1-基-dPu)之siRNA之減弱活性之圖。縱軸表示50%抑制濃度(IC50(pM))。橫軸表示所使用之siRNA。
圖5係表示於以螢光素酶為標的之siRNA中，反義鏈之5'末端具有單磷酸腺苷(454-A)、單磷酸尿苷(454-U)、8-Br-dA(454-BrdA)、I-32(2'-OMe-6-苯乙烯基-dA)、或I-19(二甲基噻吩基-dU)之siRNA之減弱活性之圖。縱軸表示50%抑制濃度(IC50(pM))。橫軸表示所使用之siRNA。
圖6係表示於以螢光素酶為標的之siRNA中反義鏈之5'末端具有單磷酸腺苷(454-A)、I-45(8-BnNH-6-苯乙烯基嘌呤)、I-44(N-Bn-N-Me dA)、或I-46(8-furanylmethylamino-6-styryl purine，8-呋喃基甲基胺基-6-苯乙烯基嘌呤)之siRNA之減弱活性之圖。縱軸表示50%抑制濃度(IC50(pM))。橫軸表示所使用之siRNA。
圖7係表示於以螢光素酶為標的之siRNA中，反義鏈之5'末端具有單磷酸腺苷(454-A)、I-39(6-benzothiophenyl purine，6-苯并噻吩基嘌呤)、I-41(6-pyrenyl purine，6-芘基嘌呤)、I-43(N-Bn dA)、或I-40(6-benzyloxynaphtyl purine，6-苄氧基萘基嘌呤)之siRNA之減弱活性之圖。縱軸表示50%抑制濃度(IC50(pM))。橫軸表示所使用之siRNA。
圖8係表示於以螢光素酶為標的之siRNA中，反義鏈之5'末端具有單磷酸腺苷(454-A)、或I-42(6-anthracenyl purine，6-蒽基嘌呤)之siRNA之減弱活性之圖。縱軸表示50%抑制濃度(IC50(pM))。橫軸表示所使用之siRNA。
圖9係表示於以螢光素酶為標的之siRNA中，反義鏈之5'末端具有 單磷酸腺苷(454-A)、或I-47(6-styryl-8-tetrazolylmethylamino purine，6-苯乙烯基-8-四唑基甲基胺基嘌呤)之siRNA之減弱活性之圖。縱軸表示50%抑制濃度(IC50(pM))。橫軸表示所使用之siRNA。
圖10係表示於以螢光素酶為標的之siRNA中，反義鏈之5'末端具有單磷酸腺苷(454-A)、或I-30(6-(m-carboxyphenyl)purine，6-(間羧基苯基)嘌呤)之siRNA之減弱活性之圖。縱軸表示50%抑制濃度(IC50(pM))。橫軸表示所使用之siRNA。
圖11係表示於以螢光素酶為標的之siRNA中，反義鏈之5'末端具有單磷酸腺苷(454-A)、或I-48(6-(m-carboxyethylphenyl)purine，6-(間羧乙基苯基)嘌呤)之siRNA之減弱活性之圖。縱軸表示50%抑制濃度(IC50(pM))。橫軸表示所使用之siRNA。
圖12係表示於以螢光素酶為標的之siRNA中，反義鏈之5'末端具有單磷酸腺苷(454-A)、或I-49(5-呋喃基dU)之siRNA之減弱活性之圖。縱軸表示50%抑制濃度(IC50(pM))。橫軸表示所使用之siRNA。
圖13係表示於以螢光素酶為標的之siRNA中，反義鏈之5'末端具有單磷酸腺苷(454-A)、或I-50(2-胺基rA)之siRNA之減弱活性之圖。縱軸表示50%抑制濃度(IC50(pM))。橫軸表示所使用之siRNA。
圖14係表示於以螢光素酶為標的之siRNA中，反義鏈之5'末端具有單磷酸腺苷(454-A)、I-22或I-51之siRNA之減弱活性之圖。縱軸表示50%抑制濃度(IC50(pM))。橫軸表示所使用之siRNA。
圖15係表示於以螢光素酶為標的之siRNA中，反義鏈之5'末端具有單磷酸腺苷(454-A)、I-52、I-55或I-56之siRNA之減弱活性之圖。縱軸表示50%抑制濃度(IC50(pM))。橫軸表示所使用之siRNA。
圖16係表示於以螢光素酶為標的之siRNA中，反義鏈之5'末端具有單磷酸腺苷(454-A)、I-54、I-57、I-58或I-59之siRNA之減弱活性之圖。縱軸表示50%抑制濃度(IC50(pM))。橫軸表示所使用之siRNA。
圖17係表示於以螢光素酶為標的之siRNA中，反義鏈之5'末端具有單磷酸腺苷(454-A)、I-53、I-60、I-61、I-62、I-63、I-64或I-70之siRNA之減弱活性之圖。縱軸表示50%抑制濃度(IC50(pM))。橫軸表示所使用之siRNA。
圖18係表示於以螢光素酶為標的之siRNA中，反義鏈之5'末端具有單磷酸腺苷(454-A)、I-71、I-72、I-73或I-74之siRNA之減弱活性之圖。縱軸表示50%抑制濃度(IC50(pM))。橫軸表示所使用之siRNA。
圖19係表示於以螢光素酶為標的之siRNA中，反義鏈之5'末端具有單磷酸腺苷(454-A)、I-65、I-66、I-67、I-68或I-69之siRNA之減弱活性之圖。縱軸表示50%抑制濃度(IC50(pM))。橫軸表示所使用之siRNA。
圖20係表示於以螢光素酶為標的之siRNA中，反義鏈之5'末端具有單磷酸腺苷(454-A)、I-78、I-79、I-80或I-81之siRNA之減弱活性之圖。縱軸表示50%抑制濃度(IC50(pM))。橫軸表示所使用之siRNA。
圖21係表示於以螢光素酶為標的之siRNA中，反義鏈之5'末端具有單磷酸腺苷(454-A)、I-75、I-76或I-77之siRNA之減弱活性之圖。縱軸表示50%抑制濃度(IC50(pM))。橫軸表示所使用之siRNA。
圖22係表示於以螢光素酶為標的之siRNA中，反義鏈之5'末端具有單磷酸腺苷(454-A)、I-82或I-83之siRNA之減弱活性之圖。縱軸表示50%抑制濃度(IC50(pM))。橫軸表示所使用之siRNA。
圖23係表示於以螢光素酶為標的之siRNA中，反義鏈之5'末端具有單磷酸腺苷(454-A)、I-84或I-85之siRNA之減弱活性之圖。縱軸表示50%抑制濃度(IC50(pM))。橫軸表示所使用之siRNA。
圖24係表示於以螢光素酶為標的之siRNA中，反義鏈之5'末端具有單磷酸腺苷(454-A)、I-86、I-87、I-88或I-89之siRNA之減弱活性之圖。縱軸表示50%抑制濃度(IC50(pM))。橫軸表示所使用之siRNA。
圖25係表示於以螢光素酶為標的之siRNA中，反義鏈之5'末端具有單磷酸腺苷(454-A)、I-27、I-29、I-90、I-91、I-92或I-93之siRNA之減弱活性之圖。縱軸表示50%抑制濃度(IC50(pM))。橫軸表示所使用之siRNA。
圖26係表示於以螢光素酶為標的之siRNA中，反義鏈之5'末端具有單磷酸腺苷(454-A-dT)、I-94或I-95之siRNA之減弱活性之圖。縱軸表示50%抑制濃度(IC50(pM))。橫軸表示所使用之siRNA。
圖27係表示於以螢光素酶為標的之siRNA中，反義鏈之5'末端具有單磷酸腺苷(454-A)或I-96之siRNA之減弱活性之圖。縱軸表示50%抑制濃度(IC50(pM))。橫軸表示所使用之siRNA。
圖28係表示於以螢光素酶為標的之siRNA中，反義鏈之5'末端具有單磷酸腺苷(454-A)、I-97、I-98、I-99、I-100或I-101之siRNA之減弱活性之圖。縱軸表示50%抑制濃度(IC50(pM))。橫軸表示所使用之siRNA。
以下，將式(I)所表示之化合物稱為化合物(I)。其他式編號之化合物亦為同樣。
於式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(IIA)、(IIIA)、(IVA)、(VA)、(Ia)及(A1)~(A11)之各基之定義中，
(i)鹵素意指氟、氯、溴、及碘之各原子。
(ii)作為低級烷基、以及低級烷氧基、低級烷氧基羰基、低級烷基胺基、二低級烷基胺基、低級烷基胺甲醯基、二低級烷基胺甲醯基、低級烷硫基及低級烷基磺醯基中之低級烷基部分，例如可列舉：直鏈狀或支鏈狀之碳數1~10之烷基。具體而言，可列舉：甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、戊基、異戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等。二低級烷基胺基 及二低級烷基胺基胺甲醯基之2個低級烷基部分各自可相同亦可不同。
(iii)作為環烷基，例如可列舉：碳數3~10之環烷基。具體而言，可列舉：環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基、環辛基、環壬基、環癸基等。
(iv)芳烷基及芳香族雜環烷基之伸烷基部分與自上述低級烷基(ii)中去除一個氫原子而得者含義相同。
(v)作為低級烯基，例如可列舉：直鏈狀或支鏈狀之碳數2~10之烯基。具體而言，可列舉：乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、異丙烯基、甲基丙烯基、丁烯基、巴豆基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基等。
(vi)作為低級炔基，例如可列舉：直鏈狀或支鏈狀之碳數2~10之炔基。具體而言，可列舉：乙炔基、炔丙基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基、辛炔基、壬炔基、癸炔基等。
(vii)作為低級烷醯基，例如可列舉：碳數1~8之直鏈或支鏈狀之低級烷醯基。具體而言，可列舉：甲醯基、乙醯基、丙醯基、丁醯基、異丁醯基、戊醯基、異戊醯基、特戊醯基、己醯基、庚醯基、辛醯基等。
(viii)作為芳基、以及芳烷基、芳醯基、芳氧基、芳硫基及芳基磺醯基之芳基部分，例如可列舉：碳數6~18之芳基。具體而言，可列舉：苯基、萘基、茚基、蒽基、菲基、丙烯合萘基、稠四苯基、芘基、基等，較佳可列舉苯基、萘基、蒽基、芘基等。
(ix)作為芳香族雜環基、以及芳香族雜環烷基、芳香族雜環羰基、芳香族雜環氧基、芳香族雜環硫基及芳香族雜環磺醯基中之芳香族雜環基部分，例如可列舉：含有選自氮原子、氧原子及硫原子中之至少1個原子之5員或6員之單環性芳香族雜環基，3~8員之環進行縮 合而成之二環或三環性且含有選自氮原子、氧原子及硫原子中之至少1個原子之縮環性芳香族雜環基等。具體而言，可列舉：吡啶基、吡基、嘧啶基、嗒基、側氧基嗒基、喹啉基、異喹啉基、呔基、喹唑啉基、喹啉基、萘啶基、啉基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、三基、三唑基、四唑基、噻吩基、呋喃基、噻唑基、異噻唑基、唑基、異唑基、二唑基、噻二唑基、吲哚基、異吲哚基、吲唑基、苯并呋喃基、異苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并咪唑基、苯并三唑基、苯并噻唑基、苯并唑基、吡唑并吡啶基、吡唑并嘧啶基、嘌呤基、二苯并呋喃基、二苯并氮呯基等，較佳可列舉吡啶基、吡咯基、噻吩基、唑基、苯并呋喃基、異苯并呋喃基、苯并噻吩基等。
(x)作為脂肪族雜環基，例如可列舉：含有選自氮原子、氧原子及硫原子中之至少1個原子之5員或6員之單環性脂肪族雜環基，3~8員之環進行縮合而成之二環或三環性且含有選自氮原子、氧原子及硫原子中之至少1個原子之縮環性脂肪族雜環基等，更具體而言，可列舉：氮丙啶基、氮雜環丁基、吡咯啶基、N-六氫吡啶基(piperidino)、哌啶基、氮雜環庚烷基、1,2,5,6-四氫吡啶基、咪唑啶基、吡唑啶基、哌基、高哌基、吡唑啉基、環氧乙烷基、四氫呋喃基、四氫-2H-吡喃基、5,6-二氫-2H-吡喃基、唑啶基、N-嗎啉基、嗎啉基、硫代唑啶基、硫代嗎啉基、2H-唑基、2H-硫代唑基、二氫吲哚基、二氫異吲哚基、二氫苯并呋喃基、苯并咪唑啶基、二氫苯并唑基、二氫苯并硫唑基、苯并間二氧雜環戊烯基(benzodioxolinyl)、四氫喹啉基、四氫異喹啉基、二氫-2H-基、二氫-1H-基、二氫-2H-硫代基、二氫-1H-硫代基、四氫喹啉基、四氫喹唑啉基、二氫苯并二氧雜環己基等，較佳可列舉四氫喹啉基、四氫異喹啉基、二氫吲哚基、二氫異吲哚基、二氫苯并呋喃基等。
(xi)作為芳香族環，例如可列舉：苯環、萘環、芳香族雜環等。芳香族雜環與上述芳香族雜環基之芳香族雜環部分含義相同。
(xii)作為可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷氧基羰基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷基胺基、可具有取代基之二低級烷基胺基、可具有取代基之低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之二低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之低級烷硫基、及可具有取代基之低級烷基磺醯基中之取代基，相同或不同，例如可列舉：取代數為1~3之選自由如下基所組成之群中之取代基等：鹵素、羥基、巰基、硝基、氰基、酸性官能基、胺甲醯基、C3-8環烷基、脂肪族雜環基、C1-10烷氧基、C3-8環烷氧基、C6-14芳氧基、C7-16芳烷氧基、C1-8烷醯氧基、C7-15芳醯氧基、C1-10烷基硫基、-NRXRY{式中，RX及RY相同或不同，分別為氫原子、可具有取代基之C1-10烷基[作為該可具有取代基之C1-10烷基中之取代基，例如可列舉：酸性官能基、可具有取代基之C6-14芳基(作為該可具有取代基之C6-14芳基之取代基，例如可列舉：取代數為1~3之羥基等)等]、可具有取代基之C3-8環烷基(作為該可具有取代基之C3-8環烷基中之取代基，例如可列舉：可具有取代基之C1-10烷基[作為該可具有取代基之C1-10烷基之取代基，可列舉取代數為1~3之酸性官能基、可具有取代基之C6-14芳基(作為該可具有取代基之C6-14芳基之取代基，例如可列舉：取代數為1~3之羥基等)等]等)、可具有取代基之C6-14芳基{作為該可具有取代基之C6-14芳基之取代基，可列舉取代數為1~3之鹵素、羥基、硝基、可具有取代基之C1-10烷基[作為該可具有取代基之C1-10烷基之取代基，可列舉取代數為1~3之酸性官能基、可具有取代基之C6-14芳基(作為該可具有取代基之C6-14芳基之取代基，例如可列舉： 取代數為1~3之羥基等)等]等}、可具有取代基之芳香族雜環基(作為該可具有取代基之芳香族雜環基之取代基，例如可列舉：取代數為1~3之羥基等)、C7-16芳烷基、C1-8烷醯基、C7-15芳醯基、C1-10烷氧基羰基或C7-16芳烷氧基羰基}、芳香族雜環硫基、芳香族雜環亞磺醯基、芳香族雜環磺醯基、C1-8烷醯基、C7-15芳醯基、C1-10烷氧基羰基、C6-14芳氧基羰基、C1-10烷基胺甲醯基及二-C1-10烷基胺甲醯基。
可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷氧基羰基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷基胺基、可具有取代基之二低級烷基胺基、可具有取代基之低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之二低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之低級烷硫基、及可具有取代基之低級烷基磺醯基中之取代基除了上述可具有取代基之低級烷基等中之取代基之例示中所列舉之基以外，亦可為選自由可經被酸性官能基取代之C1-6烷基取代之C6-14芳基及芳香族雜環基所組成之群中之取代基。
(xiii)作為可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳烷氧基、可具有取代基之芳氧基、可具有取代基之芳硫基、可具有取代基之芳基磺醯基、可具有取代基之芳醯基、可具有取代基之芳香族雜環基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之芳香族雜環羰基、可具有取代基之芳香族雜環氧基、可具有取代基之芳香族雜環硫基、可具有取代基之芳香族雜環磺醯基及可具有取代基之苯乙烯基中之取代基，相同或不同，例如可列舉：取代數為1~3之選自由如下基所組成之群中之取代基等：鹵素、羥基、巰基、硝基、氰基、酸性官能基、胺甲醯基、可具有取代基之C1-10烷基[作為該可具有取代基之C1-10烷基之取代基，例如可列舉：取代數為1~3 之羥基、氰基、酸性官能基、C1-10烷基胺甲醯基、二-C1-10烷基胺甲醯基等]、三氟甲基、C3-8環烷基、可具有取代基之C6-14芳基(作為該可具有取代基之C6-14芳基中之取代基，例如可列舉：取代數為1~3之羥基等)、脂肪族雜環基、可具有取代基之芳香族雜環基(作為該可具有取代基之芳香族雜環基中之取代基，例如可列舉：取代數為1~3之羥基等)、芳香族雜環硫基、芳香族雜環亞磺醯基、芳香族雜環磺醯基、可具有取代基之C1-10烷氧基[作為該可具有取代基之C1-10烷氧基中之取代基，例如可列舉：取代數為1~3之酸性官能基、可具有取代基之C6-14芳基(作為該可具有取代基之C6-14芳基中之取代基，例如可列舉：取代數為1~3之羥基等)等]、C3-8環烷氧基、C6-14芳氧基、C7-16芳烷氧基、C1-8烷醯氧基、C7-15芳醯氧基、C1-10烷基硫基、C1-10烷基磺醯基、-NRXaRYa(式中，RXa及RYa相同或不同，分別為氫原子、C1-10烷基、C3-8環烷基、C6-14芳基、芳香族雜環基、芳香族雜環硫基、芳香族雜環亞磺醯基、芳香族雜環磺醯基、可具有取代基之C7-16芳烷基(作為該可具有取代基之C7-16芳烷基中之取代基，例如可列舉：取代數為1~3之羥基等)、C1-8烷醯基、C7-15芳醯基、C1-10烷氧基羰基或C7-16芳烷氧基羰基)、C1-8烷醯基、C7-15芳醯基、C1-10烷氧基羰基、C6-14芳氧基羰基、C1-10烷基胺甲醯基、二-C1-10烷基胺甲醯基、羧基C1-10烷基及C1-10烷氧基羰基C1-10烷基，較佳可列舉取代數為1之鹵素、羥基、巰基、硝基、氰基、羧基、C1-3烷基、三氟甲基、C1-3烷氧基等。
作為此處示出之C1-10烷基以及C1-10烷氧基、C1-10烷基硫基、C1-10烷基磺醯基、C1-10烷氧基羰基、C1-10烷基胺甲醯基及二-C1-10烷基胺甲醯基之C1-10烷基部分，例如可例示上述低級烷基之例示中所列舉之基。二-C1-10烷基胺甲醯基中之2個C1-10烷基部分可相同亦可不同。
作為C1-8烷醯基及C1-8烷醯氧基之C1-8烷醯基部分，例如可例示上 述低級烷醯基之例示中所列舉之基。
作為C3-8環烷基及C3-8環烷氧基之C3-8環烷基部分，例如可列舉：環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基、環辛基等。
作為C6-14芳基以及C6-14芳氧基、C7-15芳醯基、C7-15芳醯氧基及C6-14芳氧基羰基之芳基部分，例如可例示上述芳基之例示中所列舉之基。
作為C7-16芳烷氧基、C7-16芳烷基及C7-16芳烷氧基羰基之芳基部分，例如可例示上述芳基之例示中所列舉之基，作為伸烷基部分，例如可列舉：C1-10之伸烷基，更具體而言，可列舉自上述低級烷基之例示中所列舉之基中去除一個氫原子而獲得之基。
脂肪族雜環基、鹵素、芳香族雜環硫基、芳香族雜環磺醯基及芳香族雜環基分別與上述含義相同。
芳香族雜環亞磺醯基之芳香族雜環部分可例示上述芳香族雜環基之例示中所列舉之基。
作為酸性官能基，例如可列舉：羧基、羥肟醯基(hydroxamoyl)、胺基膦醯基、磺醯基胺基羰基、膦醯氧基、-SO3H、亞磺酸基、膦酸基、膦基、胺基磺醯基、-OP(=O)(OH)2、-OP(=O)(OH)-OCH2CH2O-P(=O)(OH)2等。
上述式(I)中之R2較佳為氫原子或羥基，更佳為氫原子。
此處，較佳為：上述式(II)中之Y1為氮原子等；R5為氫原子、鹵素、氰基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、-NR10aR10b(式中，R10a及R10b分別與上述含義相同)等；R6為氫原子、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳香族雜環基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之芳硫基、-NR11aR11b(式中，R11a及R11b與上述含義相同)等； 且R7為氫原子或核酸領域中之氫原子之等效體(例如，氘原子、胺基、羥基、氟原子等)等(其中，於Y1為氮原子、R5為氫原子、R6為-NR11aR11b、且R7為氫原子之情形時，不存在R11a及R11b同時為氫原子之情況)。
此外更佳為：上述式(II)中之Y1為氮原子等；R5為鹵素等；R6為氫原子、-NR11aR11b(式中，R11a及R11b與上述含義相同)、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳香族雜環基等；且R7為氫原子、胺基等；或者上述式(II)中之Y1為氮原子等；R5為氫原子等；R6為氫原子、-NR11aR11b(式中，R11a及R11b與上述含義相同)、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之芳硫基、可具有取代基之芳香族雜環基等；且R7為氫原子、胺基等(其中，於Y1為氮原子、R5為氫原子、R6為-NR11aR11b、且R7為氫原子之情形時，不存在R11a及R11b同時為氫原子之情況)；或者上述式(II)中之Y1為氮原子等；R5為氰基等；R6為氫原子、-NR11aR11b(式中，R11a及R11b與上述含義相同)、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳香族雜環基等；且R7為氫原子、胺基等；或者上述式(II)中之Y1為氮原子等；R5為可具有取代基之低級烷基等；R6為氫原子、-NR11aR11b(式中，R11a及R11b與上述含義相同)、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳香族雜環基等；且R7為氫原子或胺基等；或者上述式(II)中之Y1為氮原子等；R5為-NR11aR11b(式中，R11a及R11b與上述含義相同)等；R6為氫原子、-NR11aR11b(式中，R11a及R11b與上述含義相同)、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之芳基、 可具有取代基之芳香族雜環基等；且R7為氫原子、胺基等；或者上述式(II)中之Y1為氮原子等；R5為鹵素、氫原子、氰基、可具有取代基之低級烷基、-NR11aR11b(式中，R11a及R11b與上述含義相同)等；R6為氫原子、-NR11aR11b(式中，R11a及R11b與上述含義相同)、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之芳硫基、可具有取代基之芳香族雜環基等；且R7為氫原子(其中，於Y1為氮原子、R5為氫原子、R6為-NR11aR11b、且R7為氫原子之情形時，不存在R11a及R11b同時為氫原子之情況)；或者上述式(II)中之Y1為氮原子等；R5為鹵素、氫原子、氰基、可具有取代基之低級烷基、-NR11aR11b(式中，R11a及R11b與上述含義相同)等；R6為氫原子、-NR11aR11b(式中，R11a及R11b與上述含義相同)、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳香族雜環基等；且R7為胺基。進而更佳為：上述式(II)中之Y1為氮原子等；R5為鹵素等；R6為氫原子、-NR11aR11b(式中，R11a及R11b與上述含義相同)等；且R7為氫原子等；或者上述式(II)中之Y1為氮原子等；R5為氫原子等；R6為可具有取代基之低級烯基等；且R7為氫原子等；或者上述式(II)中之Y1為氮原子等；R5為氰基等；R6為氫原子、-NR11aR11b(式中，R11a及R11b與上述含義相同)等；且R7為氫原子等；或者上述式(II)中之Y1為氮原子等；R5為鹵素等；R6為可具有取代基之低級烯基等；且R7為氫原子等；或者上述式(II)中之Y1為氮原子等；R5為氫原子等；R6為可具有取代基之芳基等；且R7為氫原子等；或者上述式(II)中之Y1為氮原子等；R5為氫原子等；R6為可具有 取代基之芳香族雜環基等；且R7為氫原子；者上述式(II)中之Y1為氮原子等；R5為氫原子等；R6為-NR11aR11b(式中，R11a及R11b與上述含義相同)等；且R7為氫原子等；或者上述式(II)中之Y1為氮原子等；R5為氫原子等；R6為可具有取代基之低級烷氧基等；且R7為氫原子等；或者上述式(II)中之Y1為氮原子等；R5為氫原子等；R6為可具有取代基之低級烷硫基等；且R7為氫原子等；或者上述式(II)中之Y1為氮原子等；R5為氫原子等；R6為可具有取代基之芳硫基等；且R7為氫原子等；或者上述式(II)中之Y1為氮原子等；R5為可具有取代基之低級烷基等；R6為可具有取代基之低級烯基等；且R7為氫原子等；或者上述式(II)中之Y1為氮原子等；R5為氫原子等；R6為-NR11aR11b(式中，R11a及R11b與上述含義相同)等；且R7為胺基等；或者上述式(II)中之Y1為氮原子等；R5為-NR10aR10b(式中，R10a及R10b分別與上述含義相同)等；R6為可具有取代基之烯基等；且R7為氫原子等。
再者，於上述R5為-NR11aR11b之情形時，R11a與R11b相同或不同，較佳為未經取代之低級烷基(低級烷基與上述含義相同)、或具有取代基之低級烷基(低級烷基與上述含義相同)，作為該取代基，可列舉上述可具有取代基之芳基或上述可具有取代基之芳香族雜環基等。於上述R6為具有取代基之芳基之情形時，進而較佳為取代基存在於芳基之間位或對位，作為該取代基，較佳為羧基甲基、2-羧基乙基、3-羧基丙基等。
再者，(a1)於上述R6為-NR11aR11b之情形時，作為R11a，較佳為可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳基等，且作為R11b，較佳為氫原子等。作 為上述可具有取代基之烷基之取代基，較佳為-SO3H、-N[CH2CH2OP(=O)(OH)2]2等。作為上述可具有取代基之低級炔基之取代基，較佳為-OP(=O)(OH)2、2-[CH2OP(=O)(OH)2]苯基、3-[CH2OP(=O)(OH)2]苯基、4-[CH2OP(=O)(OH)2]苯基、3,5-[CH2OP(=O)(OH)2]2苯基等。作為上述可具有取代基之芳烷基中之取代基，較佳為羥基、羧基、-CH2OP(=O)(OH)2、-CH2O-P(=O)(OH)-OCH2CH2O-P(=O)(OH)2等。作為上述可具有取代基之芳基中之取代基，較佳為-CH2OP(=O)(OH)2、-OCH2CH2-OP(=O)(OH)2等。
(a2)於上述R6為可具有取代基之芳基之情形時，作為該取代基，較佳為羧基甲基、2-羧基乙基、3-羧基丙基、-CH2OP(=O)(OH)2、-(CH2)3OP(=O)(OH)2等。
(a3)於上述R6為可具有取代基之低級烷氧基之情形時，作為該取代基，較佳為-OP(=O)(OH)2、可具有取代基之芳基等。作為上述可具有取代基之芳基中之取代基，較佳為硝基、氟原子、羥基、-CH2OP(=O)(OH)2等。
(a4)於上述R6為可具有取代基之低級烷硫基之情形時，作為該取代基，較佳為-OP(=O)(OH)2、(1-羧基甲基)環丙烷-1-基等。
(a5)於上述R6為可具有取代基之芳硫基之情形時，作為該取代基，較佳為羥基、-CH2OP(=O)(OH)2、羧基、羧基甲基等。
又，較佳為：上述式(IV)中之R12為氫原子、核酸領域中之氫原子之等效體(例如，氘原子、胺基、羥基、氟原子等)等；---為雙鍵；Y3為CR14e；Y4為氮原子或CR14f；R14e及R14f為氫原子、鹵素、氰基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳香族雜環基等。
進而較佳為：上述式(V)中之R12a為氫、核酸領域中之氫原子等效體(例如，氘原子、胺基、羥基、氟原子等)等；環A為苯環或噻吩 環等；n1為1或2；R16為鹵素、硝基、可具有取代基之烷基、可具有取代基之低級烷基胺基或可具有取代基之二低級烷基胺基。
本發明之寡核苷酸意指含有核苷酸殘基或核苷殘基之聚合物或低聚物。
本發明之寡核苷酸包含單鏈寡核苷酸及雙鏈寡核苷酸中之任一者。於為雙鏈寡核苷酸時，各寡核苷酸鏈之鹼基長度可不同。又，於為雙鏈寡核苷酸時，可含有1對以上之失配鹼基對。進而，由三鏈以上之寡核苷酸所形成之複合體亦包含於本發明之寡核苷酸中。
本發明之寡核苷酸較佳為例如具有針對編碼與疾病相關之蛋白質之mRNA之減弱活性。此處，本說明書中之所謂“具有減弱活性”意指抑制編碼蛋白質等之基因(標的基因)之表現，本發明之寡核苷酸較佳為與寡核苷酸之5'末端含有相對應之天然型核苷酸之siRNA相比，具有較佳為2倍、更佳為5倍、進而較佳為10倍之減弱活性。
作為雙鏈寡核苷酸，例如可列舉：結構基因等雙鏈DNA；以siRNA、miRNA為主之小分子RNA等雙鏈RNA等，但本發明並不限定於該等。
作為單鏈寡核苷酸，例如可列舉：反義寡核苷酸、microRNA、適體、安塔夠妙(antagomir)、單鏈RNAi劑(具有髮夾結構之siRNA等)等，但本發明並不限定於該等。
本發明之寡核苷酸之長度較佳為10~100個鹼基，更佳為10~80個鹼基，進而較佳為10~50個鹼基，尤佳為20~50個鹼基，最佳為20~30個鹼基。
本發明之寡核苷酸除了5'末端之核苷酸殘基或核苷殘基以外，進而1個以上之核苷酸殘基可被修飾。該修飾可包含於鹼基、糖、磷酸中之任一部位。
作為鹼基修飾核苷酸，只要為對於核苷酸之鹼基之化學結構之 一部分或全部，以任意取代基進行修飾而成者，或以任意原子進行取代而成者，則可為任意者，例如可列舉：鹼基內之氧原子被取代為硫原子者、氫原子被取代為碳數1~10之烷基者、甲基被取代為氫原子或碳數2~10之烷基者、胺基經碳數1~10之烷基、碳數1~8之烷醯基等保護基進行保護者等。
作為糖部修飾核苷酸，只要為對於核苷酸之糖之化學結構之一部分或全部，以任意取代基進行修飾而成者，或以任意原子進行取代而成者，則可為任意者，較佳可使用2'-修飾核苷酸。
作為2'-修飾核苷酸，例如可列舉：核糖之2'-OH被取代為選自由氫原子、-OR、-R、-R'、-SH、-SR、胺基、-NHR、-NR2、N3、氰基、及鹵素所組成之群(此處，R為低級烷基或芳基，低級烷基、芳基及鹵素分別與上述含義相同)中之取代基而成之2'-修飾核苷酸。具體而言，可列舉2'-OH被取代為選自由氟原子、甲氧基、2-(甲氧基)乙氧基、3-胺基丙氧基、2-[(N,N-二甲胺基)氧基]乙氧基、3-(N,N-二甲胺基)丙氧基、2-[2-(N,N-二甲胺基)乙氧基]乙氧基、2-(甲基胺基)-2-側氧基乙氧基、2-(N-甲基胺甲醯基)乙氧基及2-氰基乙氧基所組成之群中之取代基而成之2'-修飾核苷酸等。
作為磷酸修飾核苷酸，只要為對於寡核苷酸之磷酸二酯鍵之化學結構之一部分或全部，以任意取代基進行修飾而成者，或以任意原子進行取代而成者，則可為任意者，例如可列舉：磷酸二酯鍵被取代為膦酸烷基酯鍵而成之核苷酸等。
作為對編碼與疾病相關之蛋白質之mRNA具有減弱活性之寡核苷酸，只要為含有例如與編碼蛋白質等之基因(標的基因)之mRNA之一部分鹼基序列互補之鹼基序列、且抑制標的基因之表現之寡核苷酸，則可使用例如siRNA(short interference RNA，短干擾RNA)、miRNA(micro RNA，微RNA)等雙鏈寡核苷酸；shRNA(short hairpin RNA，短髮夾RNA)、反義核酸、核酶等單鏈寡核苷酸等中之任一種核酸，較佳為雙鏈寡核苷酸。
將含有與標的基因之mRNA之一部分鹼基序列互補之鹼基序列的寡核苷酸鏈稱為反義鏈，將含有與反義鏈之鹼基序列互補之鹼基序列之寡核苷酸稱為正義鏈。正義鏈係指包含標的基因之一部分之鹼基序列之寡核苷酸本身等可與反義鏈聯會而形成雙鏈形成部之寡核苷酸。於含有與標的基因之mRNA之一部分之鹼基序列互補之鹼基序列的雙鏈寡核苷酸中，所謂寡核苷酸之5'末端係指反義鏈之5'末端。
於本發明之寡核苷酸中，反義鏈及正義鏈與鹼基聯會所形成之雙鏈形成部通常為15~27個鹼基對，較佳為15~25個鹼基對，更佳為15~23個鹼基對，進而較佳為15~21個鹼基對，尤佳為15~19個鹼基對。該雙鏈形成部只要反義鏈與正義鏈之各鹼基相對向即可，可形成鹼基對，亦可失配，反義鏈之5'末端之鹼基與和其配對之正義鏈之鹼基較佳為腺苷-尿嘧啶(A-U)之鹼基對，或失配。
構成雙鏈寡核苷酸之反義鏈、正義鏈中之任一者，或兩者之寡核苷酸可於與雙鏈形成部相接之3'側或5'側具有不形成雙鏈之追加之核苷酸。亦將該不形成雙鏈之部分稱為懸突(overhang)。
作為具有懸突之雙鏈寡核苷酸，例如可使用至少一條鏈之3'末端或5'末端具有包含1~4個鹼基、通常為1~3個鹼基之懸突者，較佳為使用具有包含2個鹼基之懸突者，更佳為使用具有包含dTdT或UU之懸突者。懸突可僅反義鏈有，僅正義鏈有，及反義鏈與正義鏈兩者均有，較佳為使用反義鏈與正義鏈兩者具有懸突之雙鏈核酸。
又，亦可使用繼雙鏈形成部之後一部分或全部與標的基因之mRNA之鹼基序列一致之序列，或者繼雙鏈形成部之後可使用一部分或全部與標的基因之mRNA之互補鏈之鹼基序列一致之序列。進而，作為雙鏈寡核苷酸，例如亦可使用利用切丁酶(Dicer)等核糖核酸酶之 作用而生成上述具有懸突之雙鏈寡核苷酸之核酸分子(國際公開第2005/089287號說明書)、或不具有3'末端或5'末端之懸突之雙鏈寡核苷酸等。
又，於上述雙鏈寡核苷酸中，較佳為自反義鏈之5'末端側起朝向3'末端側至少第2~17個鹼基(核苷)之序列係與標的基因之mRNA之連續16個鹼基之序列互補之鹼基之序列，更佳為該反義鏈中自5'末端側起朝向3'末端側第2~19個鹼基之序列係與標的基因之mRNA之連續18個鹼基之序列互補之鹼基之序列，或第2~21個鹼基之序列係與標的基因之mRNA之連續20個鹼基之序列互補之鹼基之序列，或第2~25個鹼基之序列係與標的基因之mRNA之連續24個鹼基之序列互補之鹼基之序列。
反義鏈之5'末端之鹼基之序列可與標的基因之mRNA之鹼基之序列互補，亦可與其失配。
進而，於本發明所使用之核酸為siRNA之情形時，較佳為該核酸中之糖之10~70%、更佳為15~60%、進而較佳為20~50%為2'-修飾核苷酸。本發明中之2'-修飾核苷酸較佳為2'-氰基、2'-鹵素、2'-O-氰基、2'-烷基、2'-取代烷基、2'-O-烷基、2'-O-取代烷基、2'-O-烯基、2'-O-取代烯基、2'-Se-烷基、2'-Se-取代烷基等，更佳為2'-氰基、2'-氟、2'-氯、2'-溴、2'-三氟甲基、2'-O-甲基、2'-O-乙基、2'-O-異丙基、2'-O-三氟甲基、2'-O-[2-(甲氧基)乙基]、2'-O-(3-胺基丙基)、2'-O-[2-(N,N-二甲基)胺基氧基]乙基、2'-O-[3-(N,N-二甲胺基)丙基]、2'-O-{2-[2-(N,N-二甲胺基)乙氧基]乙基}、2'-O-[2-(甲基胺基)-2-側氧基乙基]、2'-Se-甲基、氫原子等，進而較佳為2'-O-甲基、2'-O-乙基、2'-氟、氫原子等，最佳為2'-O-甲基及2'-氟。
化合物(Ia)相當於式(I)所表示之核苷酸殘基或核苷殘基之殘基部成為羥基之核苷酸或核苷，作為化合物(Ia)之較佳之形態，可列舉上 述(2)~(52)所表示之相當於式(I)所表示之核苷酸殘基或核苷殘基之核苷酸或核苷，作為更佳之形態，可列舉上述(32)~(52)所表示之相當於式(I)中之X1為氧原子、R2為氫原子、羥基、氟原子或甲氧基之核苷酸殘基或核苷殘基之核苷酸或核苷。
化合物(Ia)例如亦可以酸加成鹽、金屬鹽、銨鹽、有機胺加成鹽、胺基酸加成鹽等鹽之形式而獲得。
作為酸加成鹽，例如可列舉：鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等無機酸鹽，乙酸鹽、順丁烯二酸鹽、反丁烯二酸鹽、檸檬酸鹽、甲磺酸鹽等有機酸鹽；作為金屬鹽，例如可列舉：鈉鹽、鉀鹽等鹼金屬鹽，鎂鹽、鈣鹽等鹼土金屬鹽，鋁鹽、鋅鹽等；作為銨鹽，例如可列舉：銨、四甲基銨等之鹽；作為有機胺加成鹽，例如可列舉：嗎啉、哌啶等之加成鹽；作為胺基酸加成鹽，例如可列舉：離胺酸、甘胺酸、苯丙胺酸等之加成鹽。
化合物(Ia)中亦有可存在幾何異構物、光學異構物等立體異構物、互變異構物等者，可將包括該等全部可能之異構物及該等之混合物用於本發明。
又，化合物(Ia)亦存在以與水或各種溶劑之加成物之形式存在之情況，該等加成物亦可用於本發明。
作為化合物(Ia)之醯胺，例如可列舉：下述之寡核苷酸之製造法中之化合物(B)等。
其次，對本發明之寡核苷酸之製造法進行說明。
寡核苷酸之通常合成法例如包括核苷酸之醯胺化、低聚物化(包括脫保護等步驟)、(視需要)藉由退火所進行之雙鏈化等步驟。
本發明之寡核苷酸例如可藉由以下之製造法而製造。
(1)低聚物化之一般例
[式中，m例如為9~99之整數，Po例如為CPG(controlled pore glass，可控孔徑玻璃)等固相支持體，Ra例如為三苯甲基、p,p'-二甲氧基三苯甲基等可藉由酸處理而去除之保護基，Rb例如為第三丁基二甲基矽烷基等可藉由氟化物離子而去除之保護基，Rc例如為2-氰基乙基等可藉由鹼處理而去除之保護基，Rd為可具有取代基之低級烷基，B為核酸鹼基(該核酸鹼基視需要可利用一個以上之保護基進行保護，於保護基為兩個以上之情形時，各保護基可相同亦可不同)。於m為2以上之情形時，m+1個B、m+1個Rb及m個Rc各自可相同亦可不同，各階段之Ra可相同亦可不同。此處，低級烷基與上述含義相同，可具有取代基之低級烷基中之取代基與上述可具有取代基之低級烷基中之取代基含義相同]
步驟1
化合物(C)可藉由於溶劑中，在反應促進劑之存在下，使化合物(A)與化合物(B)於0℃與50℃之間之溫度下反應10秒至30分鐘而製造。
作為溶劑，例如可列舉：二氯甲烷、乙腈、甲苯、乙酸乙酯、四氫呋喃(THF)、1,4-二烷、N,N-二甲基甲醯胺(DMF)、N-甲基吡咯啶酮(NMP)、水等，可將該等單獨使用，或混合而使用。
作為反應促進劑，可列舉1H-四唑、4,5-二氰基咪唑、5-乙基硫代四唑、5-苄基硫代四唑等。
化合物(A)例如可以市售品之形式獲得。
化合物(B)例如可藉由以下之方法而製造。
(式中，Ra、Rb、Rc、Rd及B分別與上述含義相同，X3為鹵素。該鹵素與上述含義相同)
化合物(B)可藉由於溶劑中，使化合物(M)與化合物(N)於鹼存在下，於0℃與100℃之間之溫度下反應10秒至24小時而製造。
作為溶劑，例如可列舉：二氯甲烷、乙腈、甲苯、乙酸乙酯、THF、1,4-二烷、DMF、NMP等，可將該等單獨使用，或混合而使用。
作為鹼，例如可列舉：三乙胺、N,N-二異丙基乙基胺、吡啶等，可將該等單獨使用，或混合而使用。
又，化合物(B)亦可藉由於溶劑中，使化合物(M)與化合物(O)在反應促進劑存在下，於0℃與100℃之間之溫度下反應10秒至24小時而製造。
作為溶劑，例如可列舉：乙腈、THF等，可將該等單獨使用，或混合而使用。
作為反應促進劑，可列舉如上所述者。
步驟2
步驟1中之未反應之化合物(A)可藉由於溶劑中，使醯化試劑與鹼在0℃與50℃之間之溫度下反應10秒至30分鐘而封端。此時，亦可加入適當之添加物而促進反應。
作為醯化試劑，例如可列舉：乙酸酐或苯氧基乙酸酐。
作為溶劑，例如可列舉：二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯、THF、1,4-二烷、DMF等，可將該等單獨使用，或混合而使用。
作為鹼，例如可列舉：吡啶、2,6-二甲基吡啶等。
作為添加劑，例如可列舉：4-二甲胺基吡啶、1-甲基咪唑等。
步驟3
化合物(D)可藉由於溶劑中，使化合物(C)與氧化劑在鹼存在下，於0℃與50℃之間之溫度下反應10秒至30分鐘而製造。
作為氧化劑，可列舉：碘、過氧化氫水、間氯過苯甲酸、過乙酸、第三丁基過氧化氫、(+)-樟腦磺醯基氧氮環丙烷(CSO)等，可將該等單獨使用，或混合而使用。
作為鹼及溶劑，分別可列舉上述步驟2所記載者。
步驟4
化合物(E)可藉由於溶劑中，使酸與化合物(D)在0℃與50℃之間 之溫度下反應10秒至30分鐘而製造。
作為酸，可列舉二氯乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸等。
作為溶劑，可列舉二氯甲烷、氯仿等。
步驟1~4、及下述之步驟5及6亦可使用核酸合成機進行。
(2)將核苷酸殘基(I)導入5'末端之一般例
(式中，B、m、X1、R1、R2、Po、Ra、Rb、Rc及Rd分別與上述含義相同)
步驟5
步驟5(化合物(F)之保護基Ra之脫保護)可以與上述步驟4同樣之方法進行。
步驟6
步驟5中Ra被脫保護之化合物(F)(以下為化合物(Fa))與化合物(G)之偶合例如可藉由以下方法進行。
可藉由於溶劑中，在反應促進劑存在下，使化合物(Fa)與1當量~大大過量之化合物G於0℃與50℃之間之溫度下反應10秒至30分鐘而製造。
作為溶劑，例如可列舉：二氯甲烷、乙腈、甲苯、乙酸乙酯、THF、1,4-二烷、DMF、NMP、水等，可將該等單獨使用，或混合而使用。
作為反應促進劑，可列舉如上所述者。
化合物G例如可以市售品之形式獲得。
步驟7
藉由與上述步驟3同樣之方法(磷原子之氧化)，可獲得化合物(H)。
步驟8
藉由使鹼對經固相載持之寡核苷酸發揮作用，可自固相切下。即，化合物(J)可藉由於溶劑中，在-80℃與200℃之間之溫度下，以鹼對化合物(H)處理10秒至72小時而製造。
作為鹼，例如可列舉：氨、甲基胺、二甲基胺、乙基胺、二乙基胺、異丙基胺、二異丙基胺、哌啶、三乙胺、乙二胺、1,8-二氮雜雙環[5.4.0]-7-十一烯(DBU)、碳酸鉀等。
作為溶劑，可列舉水、甲醇、乙醇、THF等。
再者，於本步驟中，亦可同時進行B(核酸鹼基)所包含之氮原子之保護基之脫保護。
又，作為步驟8之預處理，亦可以親核性較低之鹼進行預處理，將磷酸部或羧基等保護基去除後，進行切下作業。
作為該親核性較低之鹼，例如可列舉：DBU、三乙胺、三乙胺、N,N-二異丙基乙基胺、二異丙基胺等。
作為溶劑，例如可列舉：乙腈、DMF、THF等，可將該等單獨使用，或混合而使用。
步驟9
化合物(K)可藉由於溶劑中，使化合物(J)與氟試劑在-80℃與200℃之間之溫度下反應10秒至72小時而製造。此時，亦可加入鹼。
作為氟試劑，例如可列舉：氟化氫、氫氟酸三乙胺鹽、氟化四丁基銨(TBAF)等。
作為鹼，例如可列舉：三乙胺、N,N-二異丙基乙基胺等。
作為溶劑，例如可列舉：二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲苯、乙酸乙酯、THF、1,4-二烷、DMF、N,N-二甲基乙醯胺(DMA)、NMP、二甲基亞碸(DMSO)等。
步驟10
化合物(L)可藉由於溶劑中或管柱中，在0℃與50℃之間之溫度下，以酸對化合物(K)處理5分鐘至100小時而製造。
作為酸，可列舉三氟乙酸等。
作為溶劑，可列舉水、甲醇、乙醇、乙腈等，可將該等單獨使用，或混合而使用。
作為管柱，例如可列舉：C18逆相匣式管柱(cartridge column)等。
(3)將磷酸導入5'末端之一般例
[式中，B、m、X1、R1、R2、Po、Ra、Rb、Rc及Rd分別與上述含義相同，Re例如為2-氰基乙基等可藉由鹼處理而去除之保護基或(3-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧基)-2,2-二羧基乙基)丙基等可藉由酸處理而去除之保護基]
步驟1
步驟1可使用製造法(1)之步驟7所獲得之化合物(h)，藉由與製造法(1)之步驟4同樣之方法進行。
步驟2
步驟2可使用上述步驟1所獲得之化合物及化合物(bP)，藉由與製造法(1)之步驟1同樣之方法進行。
化合物(bP)例如可以市售品之形式獲得。
步驟3
步驟3可使用上述步驟(2)所獲得之化合物，藉由與製造法(1)之步驟3同樣之方法進行。
步驟4
步驟4可使用化合物(bQ)，藉由與製造法(2)之步驟8同樣之方法進行。
步驟5
步驟5可使用化合物(bR)，藉由與製造法(2)之步驟9同樣之方法進行。
(4)寡核酸之後轉換
(式中，R2、R5、X1、B及m分別與上述含義相同，Y為硫原子或NRX1(式中，RX1為氫原子、低級烷基或芳烷基，低級烷基及芳烷基與上述含義相同)，R20分別表示上述R6之定義中之可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之芳硫基、或可具有取代基之芳香族雜環硫基中可具有取代基之低級烷基部分、可具有取代基之芳基部分、或可具 有取代基之芳香族雜環基部分，可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之芳硫基、及可具有取代基之芳香族雜環硫基中之取代基與上述可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之芳硫基、及可具有取代基之芳香族雜環硫基中之各取代基含義相同)
化合物(bU)可藉由於溶劑中，在不存在或存在鹼之情況下，使化合物(bS1)與化合物(bT)於0℃與150℃之間之溫度下反應10秒至72小時而製造。
作為溶劑，例如可列舉：乙腈、N,N-二甲基甲醯胺(DMF)、N-甲基吡咯啶酮(NMP)、緩衝水等，可將該等單獨使用，或混合而使用。
作為鹼，可列舉三乙胺、N,N-二異丙基乙基胺、DBU、碳酸氫鈉、三羥甲基胺基甲烷等。
化合物(bS1)可藉由與製造法(3)同樣之方法而製造。
化合物(bT)例如可以市售品之形式獲得。
(5)雙鏈寡核苷酸製造之一般例
於溶劑中，在30℃與120℃之間之溫度下使化合物(L)與和其等莫耳量之單鏈寡核苷酸反應10秒至72小時後，歷經10分鐘至24小時緩冷至室溫，藉此可製造雙鏈寡核苷酸。
作為溶劑，例如可列舉：乙酸緩衝液、三羥甲基胺基甲烷緩衝液、檸檬酸緩衝液、磷酸緩衝液、水等，可將該等單獨使用，或混合而使用。
與化合物(L)進行反應之單鏈寡核苷酸為與化合物(L)互補之寡核苷酸，但可含有1個以上之失配之鹼基之組合。又，鹼基長度可不同。
於上述流程中，藉由對核酸鹼基、各步驟之反應條件等進行各種變更，可獲得所需之寡核苷酸。
該等例如可依照 (i)Tetrahedron，第48卷，第12號，2223~2311頁(1992年)；(ii)Current Protocols in Nucleic Acids Chemistry,John Wiley & Sons(2000年)；(iii)Protocols for Oligonucleotides and Analogs,Human Press(1993年)；(iv)Chemistry and Biology of Artificial Nucleic Acids,Wiley-VCH(2012年)；(v)基因組化學-活用人工核酸之科學方法，講談社(2003年)；(vi)核酸化學之新趨勢，化學同人(2011年)等所記載之方法而進行。
(6)相當於式(I)所表示之核苷酸殘基或核苷殘基之核苷酸或核苷之一般製造法
以下，表示相當於式(I)所表示之核苷酸殘基或核苷殘基之核苷酸或核苷之一般製造法，但可用於本發明之核苷酸殘基或核苷殘基之製造法並不限定於該等。
於如以下所示之製造法中，所定義之基可於該製造法之條件下發生變化，或者於不適合實施該製造法之情形時，可藉由使用有機合成化學中常用之保護基之導入及去除方法[例如，Protective Groups in Organic Synthesis第4版，T.W.Greene著，John Wiley & Sons Inc.(2006年)等]等製造目標化合物。又，亦可視需要而改變取代基導入等反應步驟之順序。
製造法4-1
(式中，Ra及Rb分別與上述含義相同)
步驟1
化合物(b)可藉由於溶劑中，在鹼存在下使化合物(a)與相當之烷基化劑於0℃與150℃之間之溫度下反應10分鐘至3天而製造。亦可藉由適當之活化劑促進反應。
作為溶劑，例如可列舉：DMF、吡啶、二氯甲烷、THF、乙酸乙酯、1,4-二烷、NMP等，可將該等單獨使用，或混合而使用。
作為鹼，例如可列舉：吡啶、三乙胺、N-乙基-N,N-二異丙基胺、2,6-二甲基吡啶等。
作為烷基化劑，例如可列舉：三苯氯甲烷、p,p'-二甲氧基三苯氯甲烷等。
作為活化劑，例如可列舉：4-二甲胺基吡啶等。
化合物(a)例如可藉由公知之方法[Journal of Medicinal Chemistry,2004,47(6),1987~1996]而合成。
步驟2
化合物(c)可藉由於溶劑中，在銀鹽及鹼存在下，使化合物(b)與矽烷化劑於0℃與80℃之間之溫度下反應10分鐘至3天而製造。
作為溶劑，例如可列舉：THF、乙二醇二甲醚(DME)等，可將該等單獨使用，或混合而使用。
作為銀鹽，例如可列舉：硝酸銀、過氯酸銀等。
作為鹼，例如可列舉：三乙胺、1,4-二氮雜雙環[2,2,2]辛烷(DABCO)、吡啶等。
作為矽烷化劑，例如可列舉：第三丁基二甲基氯矽烷等。
製造法4-2
(式中，Ra及Rb分別與上述含義相同，Re例如為乙醯基、苯甲醯基等可藉由鹼去除之保護基，R11a-1為上述R11a之定義中可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、或可具有取代基之芳香族雜環基)
步驟1
化合物(e)可藉由於溶劑中、或無溶劑下，在存在鹼或不存在鹼之情況下，使化合物(c)與化合物(d)於0℃與150℃之間之溫度下反應1小時至1週而製造。
作為溶劑，例如可列舉：DMF、吡啶、二氯甲烷、THF、乙酸乙酯、NMP、乙腈等，可將該等單獨使用，或混合而使用。
作為鹼，例如可列舉：三乙胺、N-乙基-N,N-二異丙基胺等。
步驟2
化合物(f)可藉由於溶劑中，使化合物(e)與矽烷化劑於0℃與100℃之間之溫度下反應10分鐘至3小時後，於0℃與100℃之間與醯化劑反應1小時至72小時，進而以水或醇處理1小時至24小時而製造。亦可藉由使醯化劑與適當之活化劑共存而促進反應。
作為溶劑，例如可列舉：吡啶等。
作為矽烷化劑，例如可列舉：三甲基氯矽烷、三氟甲磺醯基三甲基矽烷、N,O-雙(三甲基矽烷基)乙醯胺、1,1,1,3,3,3-六甲基二矽氮 烷等。
作為醯化劑，例如可列舉：乙酸酐、乙醯氯、苯甲醯氯等。
作為醇，例如可列舉：甲醇、乙醇、1-丙醇等。
作為活化劑，例如可列舉：4-二甲胺基吡啶。
製造法4-3
(式中，Ra、Rb及R11a-1分別與上述含義相同，R11b-1為上述R11b之定義中可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、或可具有取代基之芳香族雜環基)
化合物(h)可藉由於溶劑中、或無溶劑下，在存在鹼或不存在鹼之情況下，使化合物(c)與化合物(g)於0℃與150℃之間之溫度下反應1小時至1週而製造。
作為溶劑，例如可列舉：DMF、吡啶、二氯甲烷、THF、乙酸乙酯、NMP、乙腈等，可將該等單獨使用，或混合而使用。
作為鹼，例如可列舉：三乙胺、N-乙基-N,N-二異丙基胺等。
製造法4-4
(式中，Ra及Rb分別與上述含義相同，R6b為可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基，Xa為氧原子或硫原子，M為鹼金屬原子。此處，低級烷基、芳基及芳香族雜環基分別與上述含義相同，可具有取代基之低級烷基中之取代基與上述可具有取代基之低級烷基中之取代基含義相同，可具有取代基之芳基及可具有取代基之芳香族雜環基中之取代基與上述可具有取代基之芳基及可具有取代基之芳香族雜環基中之取代基含義相同。鹼金屬原子為鋰原子、鈉原子、或鉀原子)
化合物(k)可藉由於溶劑中，使化合物(c)與化合物(i)於0℃與100℃之間之溫度下反應10分鐘至3天，或者於溶劑中，在鹼存在下，使化合物(c)與化合物(j)於0℃與120℃之間之溫度下反應10分鐘至3天而製造。
作為溶劑，例如可列舉：甲醇、乙醇、2-丙醇、THF、DME、DMF、NMP等，可將該等單獨使用，或混合而使用。
作為鹼，例如可列舉：氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、氫化鈉、氫化鉀、第三丁醇鉀等。
製造法4-5
(式中，Ra及Rb分別與上述含義相同，Ar為可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基，Rf為氫原子或可具有取代基之低級烷基。此處，低級烷基、芳基及芳香族雜環基分別與上述含義相同，可具有取代基之低級烷基中之取代基與上述可具有取代基之低級烷基 中之取代基含義相同，可具有取代基之芳基及可具有取代基之芳香族雜環基中之取代基與上述可具有取代基之芳基及可具有取代基之芳香族雜環基中之取代基含義相同)
化合物(m)可藉由於溶劑中，在鹼、及鈀觸媒存在下，使化合物(c)與化合物(1)於0℃與120℃之間之溫度下反應30分鐘至72小時而製造。亦可藉由添加適當之膦而促進反應。
化合物(1)可以市售品之形式獲得，或者可藉由公知之方法[例如，「第5版實驗化學講座18：有機化合物之合成VI-使用金屬之有機合成」，p.97，丸善(2005年)]或依照其而獲得。
作為鹼，例如可列舉：碳酸鉀、磷酸鉀、氫氧化鉀、氫氧化鈉、第三丁醇鉀、三乙胺、二異丙基乙基胺、N-甲基嗎啉、吡啶、DBU等。
作為鈀觸媒，例如可列舉：乙酸鈀、三(二亞苄基丙酮)二鈀、四(三苯基膦)鈀、1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵二氯鈀-二氯甲烷1：1加成物等。
作為溶劑，例如可列舉：甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、甲苯、乙酸乙酯、乙腈、二乙醚、THF、DME、二烷、DMF、DMA、NMP、水等，該等可單獨或混合使用。
作為適當之膦，例如可列舉：1,2-雙(二苯基膦基)乙烷、1,3-雙(二苯基膦基)丙烷、4,5'-雙(二苯基膦基)-9,9'-二甲基(Xantphos)、2,2'-雙(二苯基膦基)-1,1'-聯萘(BINAP)等。
製造法4-6
(式中，Ra、Rb及Rf分別與上述含義相同，R15a、R15b及R15c分別為氫原子、可具有取代基之低級烷基、芳基、或芳香族雜環基。此處，低級烷基、芳基及芳香族雜環基分別與上述含義相同，可具有取代基之低級烷基中之取代基與上述可具有取代基之低級烷基中之取代基含義相同)
化合物(p)可藉由於溶劑中，在鹼、及鈀觸媒存在下，使化合物(c)與化合物(n)於0℃與120℃之間之溫度下反應30分鐘至72小時而製造。亦可藉由添加適當之膦而促進反應。
化合物(n)例如可以市售品之形式獲得。
作為鹼，例如可列舉：碳酸鉀、磷酸鉀、氫氧化鉀、氫氧化鈉、第三丁醇鉀、三乙胺、二異丙基乙基胺、N-甲基嗎啉、吡啶、DBU等。
作為鈀觸媒，可列舉如上所述者。
作為溶劑，例如可列舉：甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、甲苯、乙酸乙酯、乙腈、二乙醚、THF、DME、二烷、DMF、DMA、NMP、水等，該等可單獨或混合使用。
又，化合物(p)亦可藉由於溶劑中，在鹼與鈀觸媒之存在下，使化合物(c)與化合物(o)於0℃與140℃之間之溫度下反應30分鐘至72小時而製造。
作為鹼，例如可列舉：乙酸鉀、碳酸氫鈉、碳酸鉀、氫氧化鉀、氫氧化鈉、甲醇鈉、第三丁醇鉀、三乙胺、二異丙基乙基胺、N-甲基嗎啉、吡啶、DBU等。
作為鈀觸媒，可列舉如上所述者。
作為溶劑，例如可列舉：二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、甲苯、乙酸乙酯、乙腈、二乙醚、THF、DME、二烷、DMF、DMA、NMP等，該等可單獨或混合使用。
作為適當之膦，例如可列舉：1,2-雙(二苯基膦基)乙烷、1,3-雙(二苯基膦基)丙烷、Xantphos、BINAP等。
製造法4-7
(式中，Ra、Rb及R6b分別與上述含義相同)
化合物(r)可藉由於溶劑中，在鈀觸媒存在下，使化合物(c)與化合物(q)於0℃與150℃之間之溫度下進行反應而製造。亦可藉由適當之添加劑及/或適當之膦而促進反應。
作為溶劑，例如可列舉：甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、甲苯、乙酸乙酯、乙腈、二乙醚、THF、DME、二烷、DMF、DMA、NMP等，該等可單獨或混合使用。
化合物(q)例如可以市售品之形式獲得。
作為鈀觸媒，可列舉如上所述者。
作為適當之添加劑，例如可列舉：氯化鋰、氟化銫等。
作為適當之膦，例如可列舉：1,2-雙(二苯基膦基)乙烷、1,3-雙(二苯基膦基)丙烷、Xantphos、BINAP等。
製造法4-8
(式中，Ra、Rb、R11c及R11d分別與上述含義相同)
化合物(t)可藉由於溶劑中，在一氧化碳環境、鹼與鈀觸媒之存在下，使化合物(c)與化合物(s)於室溫與120℃之間之溫度下反應1小時至72小時而製造。亦可藉由添加適當之膦而促進反應。
作為溶劑，例如可列舉：二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、甲苯、乙酸乙酯、乙腈、二乙醚、THF、DME、二烷、DMF、DMA、NMP等，該等可單獨或混合使用。
作為鹼，例如可列舉：乙酸鈉、乙酸鉀、碳酸氫鈉、碳酸鉀、甲醇鈉、第三丁醇鉀、三乙胺、二異丙基乙基胺、N-甲基嗎啉、吡啶、DBU等。
作為鈀觸媒，可列舉如上所述者。
作為膦，例如可列舉：1,2-雙(二苯基膦基)乙烷、1,3-雙(二苯基膦基)丙烷、Xantphos、BINAP等。
製造法4-9
(式中，Ra及Rb分別與上述含義相同，R6c為可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基。此處，低級烷基、芳基及芳香族雜環基分別與上述含義相同，可具有取代基之低級烷基中之取代基與上述可具有取代基之低級烷基中之取代基含義相同，可具有取代基之芳基及可具有取代基之芳香族雜環基中之取代基與上述可具有取代基之芳基及可具有取代基之芳香族雜環基中之取代基含義相同)
步驟1
化合物(w)可藉由於溶劑中，在一氧化碳環境、鹼與鈀觸媒之存在下，使化合物(c)與化合物(u)於室溫與120℃之間之溫度下反應1小時至72小時而製造。亦可藉由添加適當之膦而促進反應。
作為溶劑，例如可列舉：甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、第三丁醇、二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、甲苯、乙酸乙酯、乙腈、二乙醚、THF、DME、二烷、DMF、DMA、NMP等，該等可單獨或混合使用。
作為鹼，例如可列舉：乙酸鈉、乙酸鉀、碳酸氫鈉、碳酸鉀、甲醇鈉、第三丁醇鉀、三乙胺、二異丙基乙基胺、N-甲基嗎啉、吡啶、DBU等。
作為鈀觸媒，可列舉如上所述者。
作為膦，例如可列舉：1,2-雙(二苯基膦基)乙烷、1,3-雙(二苯基膦基)丙烷、Xantphos、BINAP等。
步驟2
化合物(y)可藉由於溶劑中，在鹼之存在下，於0℃與100℃之間之溫度下將化合物(w)處理5分鐘~72小時而製造。
作為鹼，例如可列舉：碳酸鉀、氫氧化鋰、氫氧化鉀、氫氧化鈉、甲醇鈉等。
作為溶劑，例如可列舉：含水之溶劑，作為該溶劑，例如可列舉：甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、甲苯、乙酸乙酯、乙腈、二乙醚、THF、DME、二烷、DMF、DMA、NMP、吡啶等，該等可與水混合、或將各溶劑混合並進一步添加水而使用。
製造法4-10
(式中，Ra及Rb分別與上述含義相同，R6d為可具有取代基之低級烷基、芳基或芳香族雜環基。此處，低級烷基、芳基及芳香族雜環基分別與上述含義相同，可具有取代基之低級烷基中之取代基與上述可具有取代基之低級烷基中之取代基含義相同)
化合物(aa)可藉由於溶劑中，在銅鹽、鹼及鈀觸媒之存在下，使化合物(c)與化合物(z)於室溫與150℃之間之溫度下反應1小時至72小時而製造。亦可藉由添加適當之膦而促進反應。
作為溶劑，例如可列舉：二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、甲苯、乙酸乙酯、乙腈、二乙醚、THF、DME、二烷、DMF、DMA、NMP等，該等可單獨或混合使用。
作為銅鹽，例如可列舉：碘化銅(I)、氟化銅、氯化銅、溴化銅、氧化銅、硫化銅、硒化銅、乙酸銅、氰化銅、硫氰酸銅、三氟甲磺酸銅等。
作為鹼，例如可列舉：乙酸鈉、乙酸鉀、碳酸氫鈉、碳酸鉀、甲醇鈉、第三丁醇鉀、三乙胺、二異丙基乙基胺、N-甲基嗎啉、吡啶、DBU等。
作為鈀觸媒，可列舉如上所述者。
作為膦，例如可列舉：1,2-雙(二苯基膦基)乙烷、1,3-雙(二苯基膦基)丙烷、Xantphos、BINAP等。
製造法4-11
使用藉由以下方法獲得之化合物ae，依照上述製造法4-2~4-10，可獲得本發明之寡核苷酸製造之原料所使用之核苷。
(式中，Ra、Rb及Rc分別與上述含義相同)
步驟1
化合物(ac)可藉由於溶劑中，使化合物(ab)與矽烷化劑於0℃與100℃之間之溫度下反應10分鐘至3小時後，於0℃與100℃之間與醯化劑反應1小時至72小時，進而以水或醇處理1小時至24小時而製造。
作為溶劑，例如可列舉：吡啶等。
作為矽烷化劑，例如可列舉：三甲基氯矽烷、三氟甲磺醯基三甲基矽烷、N,O-雙(三甲基矽烷基)乙醯胺、1,1,1,3,3,3-六甲基二矽氮烷等。
作為醯化劑，例如可列舉：乙酸酐、乙醯氯、苯甲醯氯等。
作為醇，例如可列舉：甲醇、乙醇、1-丙醇等。
化合物(ab)例如可藉由公知之方法[Tetrahedron,1970,26,4251~4259]合成。
步驟2
化合物(ad)可藉由於溶劑中，在鹼存在下，使化合物(ac)與相當之烷基化劑於0℃與150℃之間之溫度下反應10分鐘至3天而製造。亦可藉由適當之活化劑而促進反應。
作為溶劑，例如可列舉：DMF、吡啶、二氯甲烷、THF、乙酸乙酯、1,4-二烷、NMP等，可將該等單獨使用，或混合而使用。
作為鹼，例如可列舉：吡啶、三乙胺、N-乙基-N,N-二異丙基胺、2,6-二甲基吡啶等。
作為烷基化劑，例如可列舉：三苯氯甲烷、p,p'-二甲氧基三苯氯甲烷等。
作為活化劑，例如可列舉：4-二甲胺基吡啶等。
步驟3
化合物(ae)可藉由於溶劑中，在銀鹽、及鹼存在下，使化合物(ad)與矽烷化劑於0℃與80℃之間反應10分鐘至3天而製造。
作為溶劑，例如可列舉：THF、DME等，可將該等單獨使用，或混合而使用。
作為銀鹽，例如可列舉：硝酸銀、過氯酸銀等。
作為鹼，例如可列舉：三乙胺、DABCO、吡啶等。
作為矽烷化劑，例如可列舉：第三丁基二甲基氯矽烷等。
製造法4-12
(式中，Ra及Rb分別與上述含義相同)
步驟1
化合物(ag)可藉由於溶劑中，在鹼存在下，使化合物(af)與相當之烷基化劑於0℃與150℃之間之溫度下反應10分鐘至3天而製造。亦可藉由適當之活化劑而促進反應。
作為溶劑，例如可列舉：DMF、吡啶、二氯甲烷、THF、乙酸乙酯、1,4-二烷、NMP等，可將該等單獨使用，或混合而使用。
作為鹼，例如可列舉：吡啶、三乙胺、N-乙基-N,N-二異丙基胺、2,6-二甲基吡啶等。
作為烷基化劑，例如可列舉：三苯氯甲烷、p,p'-二甲氧基三苯氯甲烷等。
作為活化劑，例如可列舉：4-二甲胺基吡啶等。
化合物(af)例如可藉由公知之方法[Journal of Medicinal Chemistry,2004,50(5),915~921及WO2011/51733]合成。
步驟2
化合物(ah)可藉由於溶劑中，在銀鹽、及鹼存在下，使化合物(ag)與矽烷化劑於0℃與80℃之間反應10分鐘至3天而製造。
作為溶劑，例如可列舉：THF、DME等，可將該等單獨使用，或混合而使用。
作為銀鹽，例如可列舉：硝酸銀、過氯酸銀等。
作為鹼，例如可列舉：三乙胺、DABCO、吡啶等。
作為矽烷化劑，例如可列舉：第三丁基二甲基氯矽烷等。
製造法4-13
(式中，Ra、Rb、Rf及Ar分別與上述含義相同)
化合物(ai)可使用化合物(ah)，依據製造法4-5進行製造。
製造法4-14
(式中，Ra、Rb、Rf、R15a、R15b及R15c分別與上述含義相同)
化合物(aj)可使用化合物(ah)，依據製造法4-6進行製造。
製造法4-15
(式中，Ra、Rb及R6b分別與上述含義相同)
化合物(ak)可使用化合物(ah)，依據製造法4-7進行製造。
製造法4-16
(式中，Ra、Rb及R6d分別與上述含義相同)
化合物(al)可使用化合物(ah)，依據製造法4-10進行製造。
製造法4-17
(式中，Ra、環A、R16、n1及Rb分別與上述含義相同，Rg例如為二第三丁基矽烷基等可藉由氟化物離子去除之保護基，Xa例如為鹵素、醯氧基等脫離基，R17、R18及R19例如分別為醯基等可藉由鹼而脫保護之保護基)
步驟1
化合物(nb)可藉由於溶劑中，在矽烷化劑存在下，使化合物(na)與化合物(naa)於0℃與150℃之間之溫度下反應10分鐘至1天後，在路易士酸存在下，於0℃與150℃之間之溫度下處理10分鐘至1天而製造。
作為溶劑，例如可列舉：乙腈、1,2-二氯乙烷、THF、甲苯等，可將該等單獨使用，或混合而使用。
作為矽烷化劑，例如可列舉：三甲基氯矽烷、三氟甲磺醯基三甲基矽烷、N,O-雙(三甲基矽烷基)乙醯胺、1,1,1,3,3,3-六甲基二矽氮烷等。
作為路易士酸，例如可列舉：三氟甲磺醯基三甲基矽烷、四氯化錫等。
化合物(na)可以市售品之形式獲得，或者例如可藉由公知之方法[Tetrahedron，2012年，68卷，8908~8915頁]、或依據其而獲得。
步驟2
化合物(nc)可藉由於溶劑中或無溶劑下，使化合物(nb)與鹼於室溫與50℃之間之溫度下反應1小時至4天而製造。
作為溶劑，例如可列舉：甲醇、乙醇、THF、DMF、水等，可將該等單獨使用，或混合而使用。
作為鹼，例如可列舉：氨、甲基胺、氫氧化鈉、甲醇鈉等。
步驟3
化合物(nd)可藉由於溶劑中，在鹼存在下，使化合物(nc)與例如 相當之矽烷化劑於0℃與80℃之間之溫度下反應10分鐘至3天而製造。
作為溶劑，例如可列舉：DMF、DMA、NMP等，該等可單獨或混合使用。
作為鹼，例如可列舉：咪唑、三乙胺、二異丙基乙基胺等。
作為矽烷化劑，例如可列舉：雙(三氟甲磺酸)二第三丁基矽烷酯等。
步驟4
化合物(ne)可藉由於溶劑中，在鹼存在下，使化合物(nd)與例如相當之矽烷化劑於0℃與80℃之間反應10分鐘至3天而製造。
作為溶劑，例如可列舉：二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、DMF等，該等可單獨或混合使用。
作為鹼，例如可列舉：咪唑、三乙胺、二異丙基乙基胺等。
作為矽烷化劑，例如可列舉：第三丁基二甲基氯矽烷等。
步驟5
化合物(nf)可藉由於溶劑中，在鹼存在下，於0℃與80℃之間以脫保護試劑對化合物(ne)處理10分鐘至3天而製造。
作為溶劑，例如可列舉：二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、二乙醚、THF、DME、二烷等，該等可單獨或混合使用。
作為鹼，例如可列舉：三乙胺、二異丙基乙基胺、吡啶等。
作為脫保護試劑，例如可列舉：氟化氫-吡啶等。
步驟6
化合物(ng)可藉由於溶劑中，在鹼存在下，使化合物(nf)與相當之烷基化劑於0℃與150℃之間之溫度下反應10分鐘至3天而製造。亦可藉由適當之活化劑而促進反應。
作為溶劑，例如可列舉：二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、THF、二烷、DMF、吡啶等，該等可單獨或混合使用。
作為鹼，例如可列舉：三乙胺、二異丙基乙基胺、吡啶等。
作為烷基化劑，例如可列舉：三苯氯甲烷、p,p'-二甲氧基三苯氯甲烷等。
作為活化劑，例如可列舉：4-二甲胺基吡啶等。
製造法4-18
(式中，Ra與上述含義相同，R為三低級烷基矽烷基，該三低級烷基矽烷基之低級烷基相同或不同，分別與上述低級烷基含義相同)
步驟1
化合物(bb)可藉由於溶劑中，在鹼存在下，使化合物(ba)與相當之烷基化劑於0℃與150℃之間之溫度下反應10分鐘至3天而製造。又，亦可藉由適當之活化劑而促進反應。
作為溶劑，例如可列舉：DMF、吡啶、二氯甲烷、THF、乙酸乙酯、1,4-二烷、NMP等，可將該等單獨使用，或混合而使用。
作為鹼，例如可列舉：吡啶、三乙胺、N,N-二異丙基乙基胺、2,6-二甲基吡啶等。
作為烷基化劑，例如可列舉：三苯氯甲烷、p,p'-二甲氧基三苯氯甲烷等。
作為活化劑，例如可列舉：4-二甲胺基吡啶等。
化合物(ba)例如可由市售而獲得。
步驟2
化合物(bc)可藉由於溶劑中，在鹼存在下，使化合物(bb)與矽烷化劑於0℃與150℃之間之溫度下反應10分鐘至3天而製造。
作為溶劑，例如可列舉：DMF、吡啶、二氯甲烷、THF、乙酸乙酯、1,4-二烷、NMP等，可將該等單獨使用，或混合而使用。
作為鹼，例如可列舉：咪唑、2,6-二甲基吡啶等。
作為矽烷化劑，例如可列舉：第三丁基氯二甲基矽烷、三氟甲磺酸第三丁基二甲基矽烷酯等。
製造法4-19
(式中，Ra及R分別與上述含義相同)
步驟1
化合物(be)可藉由於溶劑中，在鹼存在下，使化合物(bd)與烷基化劑於0℃與150℃之間之溫度下反應10分鐘至3天而製造。又，亦可藉由適當之活化劑而促進反應。
作為溶劑，例如可列舉：DMF、1吡啶、二氯甲烷、THF、乙酸乙酯、1,4-二烷、NMP等，可將該等單獨使用，或混合而使用。
作為鹼，例如可列舉：吡啶、三乙胺、N,N-二異丙基乙基胺、2,6-二甲基吡啶等。
作為烷基化劑，例如可列舉：三苯氯甲烷、p,p'-二甲氧基三苯氯甲烷等。
作為活化劑，例如可列舉：4-二甲胺基吡啶等。
化合物(bd)例如可由市售而獲得。
步驟2
化合物(bf)可使用化合物(be)，藉由J.Am.Chem.Soc,2007年，129卷，782~789頁所記載之方法而獲得。
步驟3
化合物(bg)可使用化合物(bf)，以與製造法4-18之步驟2同樣之方式而獲得。
製造法4-20
(式中，Ra、R及R11a-1分別與上述含義相同，R11b-1為上述R11b之定義中可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、或可具有取代基之芳香族雜環基，L1為氯原子或1-苯并三唑氧基)
化合物(bi)可藉由於溶劑中、或無溶劑下，在存在鹼或不存在鹼之情況下，使化合物(bh)與化合物(g)於0℃與150℃之間之溫度下反應1小時至1週而製造。
作為溶劑，例如可列舉：DMF、吡啶、二氯甲烷、THF、乙酸乙酯、NMP、乙腈等，可將該等單獨使用，或混合而使用。
作為鹼，例如可列舉：三乙胺、N,N-二異丙基乙基胺等。
製造法4-21
(式中，Ra、R及L1分別與上述含義相同，R6b為可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基，Xa為氧原子或硫原子，M為鹼金屬原子。此處，低級烷基、芳基及芳香族雜環基分別與上述含義相同，可具有取代基之低級烷基中之取代基與上述可具有取代基之低級烷基中之取代基含義相同，可具有取代基之芳基及可具有取代基之芳香族雜環基中之取代基與上述可具有取代基之芳基及可具有取代基之芳香族雜環基中之取代基含義相同，該鹼金屬原子為鋰原子、鈉原子、或鉀原子)
化合物(bj)可藉由於溶劑中，使化合物(bh)與化合物(i)於0℃與100℃之間之溫度下反應10分鐘至3天，或於溶劑中，在鹼存在下，使化合物(bh)與化合物(j)於0℃與120℃之間之溫度下反應10分鐘至3天而製造。
作為溶劑，例如可列舉：甲醇、乙醇、2-丙醇、THF、DME、DMF、NMP等，可將該等單獨使用，或混合而使用。
作為鹼，例如可列舉：氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、氫化鈉、氫化鉀、第三丁醇鉀等。
製造法4-22
(式中，Ra及R分別與上述含義相同，Ar為可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基，Rf為氫原子或可具有取代基之低級烷基。該低級烷基、芳基及芳香族雜環基分別與上述含義相同，可具有取代基之低級烷基中之取代基與上述可具有取代基之低級烷基中之取代基含義相同，可具有取代基之芳基及可具有取代基之芳香族雜環基中之取代基與上述可具有取代基之芳基及可具有取代基之芳香族雜環基中之取代基含義相同)
化合物(bk)可藉由於溶劑中，在鹼及鈀觸媒存在下，使化合物(bc)與化合物(1)於0℃與120℃之間之溫度下反應30分鐘至72小時而製造。又，亦可藉由添加適當之膦而促進反應。
化合物(1)可以市售品之形式獲得，或例如可依據「第5版實驗化學講座18：有機化合物之合成VI-使用金屬之有機合成」、p.97、丸善(2005年)等所記載之製造法而獲得。
作為鹼，例如可列舉：碳酸鉀、磷酸鉀、氫氧化鉀、氫氧化鈉、第三丁醇鉀、三乙胺、二異丙基乙基胺、N-甲基嗎啉、吡啶、DBU等。
作為鈀觸媒，例如可列舉：乙酸鈀、三(二亞苄基丙酮)二鈀、四(三苯基膦)鈀、1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵二氯鈀-二氯甲烷1：1加成物等。
作為溶劑，例如可列舉：甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、甲苯、乙酸乙酯、乙腈、二乙醚、THF、DME、二烷、DMF、DMA、NMP、水等，該等可單獨或混合使用。
作為適當之膦，例如可列舉：1,2-雙(二苯基膦基)乙烷、1,3-雙(二苯基膦基)丙烷、4,5'-雙(二苯基膦基)-9,9'-二甲基(Xantphos)、2,2'-雙(二苯基膦基)-1,1'-聯萘(BINAP)等。
製造法4-23
(式中，Rb1及Rb2相同或不同，分別為低級烷基。該低級烷基與上述含義相同)
步驟1
化合物(bm)可藉由於溶劑中，在鹼存在下，使化合物(bl)與矽烷化劑於0℃與150℃之間之溫度下反應10分鐘至3天而製造。
作為溶劑，例如可列舉：DMF、吡啶、二氯甲烷、THF、乙酸乙酯、1,4-二烷、NMP等，可將該等單獨使用，或混合而使用。
作為鹼，例如可列舉：咪唑、2,6-二甲基吡啶等。
作為矽烷化劑，例如可列舉：二氯二第三丁基矽烷等。
製造法4-24
(式中，Rb1及Rb2分別與上述含義相同，Rf與上述含義相同，R15a、R15b及R15c相同或不同，分別為氫原子、可具有取代基之低級烷基、芳基、或芳香族雜環基。該低級烷基、芳基及芳香族雜環基分別與上述含義相同，可具有取代基之低級烷基中之取代基與上述可具有取代基之低級烷基中之取代基含義相同)
化合物(bn)可藉由於溶劑中，在鹼及鈀觸媒存在下，使化合物(bm)與化合物(n)於0℃與120℃之間之溫度下反應30分鐘至72小時而製造。亦可藉由添加適當之膦而促進反應。
化合物(n)例如可以市售品之形式獲得。
作為鹼，例如可列舉：碳酸鉀、磷酸鉀、氫氧化鉀、氫氧化鈉、第三丁醇鉀、三乙胺、二異丙基乙基胺、N-甲基嗎啉、吡啶、DBU等。
作為鈀觸媒，可列舉如上所述者。
作為溶劑，例如可列舉：甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、甲苯、乙酸乙酯、乙腈、二乙醚、THF、DME、二烷、DMF、DMA、NMP、水等，該等可單獨或混合使用。
又，化合物(bn)亦可藉由於溶劑中，在鹼及鈀觸媒存在下，使化合物(bm)與化合物(o)於0℃與140℃之間之溫度下反應30分鐘至72小 時而製造。
作為鹼，例如可列舉：乙酸鉀、碳酸氫鈉、碳酸鉀、氫氧化鉀、氫氧化鈉、甲醇鈉、第三丁醇鉀、三乙胺、二異丙基乙基胺、N-甲基嗎啉、吡啶、DBU等。
作為鈀觸媒，可列舉如上所述者。
作為溶劑，例如可列舉：二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、甲苯、乙酸乙酯、乙腈、二乙醚、THF、DME、二烷、DMF、DMA、NMP等，該等可單獨或混合使用。
作為適當之膦，例如可列舉：1,2-雙(二苯基膦基)乙烷、1,3-雙(二苯基膦基)丙烷、Xantphos、BINAP等。
製造法4-25
(式中，Ra與上述含義相同，R6d為可具有取代基之低級烷基、芳基或芳香族雜環基。此處，低級烷基、芳基及芳香族雜環基分別與上述含義相同，可具有取代基之低級烷基中之取代基與上述可具有取代基之低級烷基中之取代基含義相同)
化合物(bo)可藉由於溶劑中，在銅鹽、鹼及鈀觸媒存在下，使化合物(bc)與化合物(z)於室溫與150℃之間之溫度下反應1小時至72小時而製造。亦可藉由添加適當之膦而促進反應。
作為溶劑，例如可列舉：二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、甲 苯、乙酸乙酯、乙腈、二乙醚、THF、DME、二烷、DMF、DMA、NMP等，該等可單獨或混合使用。
作為銅鹽，例如可列舉：碘化銅、氟化銅、氯化銅、溴化銅、碘化銅、氧化銅、硫化銅、硒化銅、乙酸銅、氰化銅、硫氰酸銅、三氟甲磺酸銅等。
作為鹼，例如可列舉：乙酸鈉、乙酸鉀、碳酸氫鈉、碳酸鉀、甲醇鈉、第三丁醇鉀、三乙胺、二異丙基乙基胺、N-甲基嗎啉、吡啶、DBU等。
作為鈀觸媒，可列舉如上所述者。
作為適當之膦，例如可列舉：1,2-雙(二苯基膦基)乙烷、1,3-雙(二苯基膦基)丙烷、Xantphos、BINAP等。
上述各製造法所包含之化合物中之各基之轉換亦可藉由公知之方法[例如，Comprehensive Organic Transformations第2版，R.C.Larock著，Vch Verlagsgesellscaft Mbh(1999年)等]、或依據該等而進行。
藉由公知之方法對上述各製造法之產物進行羥基之脫保護、及磷酸化[例如，Journal of Medicinal Chemistry，第55卷，1478~1489頁(2012年)等]，藉此可獲得所需之核苷酸或核苷。
上述各製造法中之中間物及目標化合物可利用有機合成化學中常用之分離純化法、例如過濾、萃取、洗淨、乾燥、濃縮、再結晶、各種層析法等進行單離純化。又，中間物亦可不進行特別純化而供於下一反應。
上述核苷酸或核苷例如亦可以酸加成鹽、金屬鹽、銨鹽、有機胺加成鹽、胺基酸加成鹽等鹽之形式而獲得。
作為酸加成鹽，例如可列舉：鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等無機酸鹽；乙酸鹽、順丁烯二酸鹽、反丁烯二酸鹽、檸檬酸鹽、甲磺酸鹽 等有機酸鹽。作為金屬鹽，例如可列舉：鈉鹽、鉀鹽等鹼金屬鹽；鎂鹽、鈣鹽等鹼土金屬鹽；鋁鹽、鋅鹽等。作為銨鹽，例如可列舉：銨、四甲基銨等之鹽。作為有機胺加成鹽，例如可列舉：嗎啉、哌啶等之加成鹽。作為胺基酸加成鹽，例如可列舉：離胺酸、甘胺酸、苯丙胺酸等之加成鹽。
於欲獲得上述核苷酸或核苷之鹽時，於上述核苷酸或核苷以鹽之形式獲得時直接進行純化即可，又，於以游離形式獲得時，將上述核苷酸或核苷溶解或懸浮於適當之溶劑中，並加入酸或鹼進行單離、純化即可。
上述核苷酸或核苷中亦存在有可能存在幾何異構物、光學異構物等立體異構物、互變異構物等者，可將包括該等之全部有可能之異構物及該等之混合物用於本發明。
又，上述核苷酸或核苷亦存在以與水或各種溶劑之加成物之形式存在之情況，該等加成物亦可用於本發明。
將化合物(Ia)之具體例示於表1~21。但本發明之化合物(Ia)及相當之式(I)所表示之核苷酸殘基或核苷殘基並不限定於該等及相當之核苷酸殘基或核苷殘基。
本發明之寡核苷酸可使用轉染用載體、較佳為陽離子性脂質體等陽離子性載體而導入至細胞內。又，亦可藉由磷酸鈣法、電穿孔法或顯微注射法等直接導入至細胞內。
例如siRNA經由mRNA之切斷而可選擇性抑制所有蛋白質之表現，因此業界期待將其應用於醫藥。於具有針對編碼與疾病相關之蛋白質之mRNA之減弱活性的寡核苷酸(例如siRNA)中，藉由將該寡核苷酸之5'末端之核苷酸殘基或核苷殘基取代為式(I)所表示之核苷酸殘基或核苷殘基，而期待提高針對標的mRNA之減弱活性。
又，於具有針對編碼與疾病相關之蛋白質之mRNA之減弱活性的寡核苷酸(例如siRNA)中，藉由將該寡核苷酸之5'末端之鹼基殘基取代為式(II)~(V)所表示之鹼基殘基，而成為與AGO2之親和性提高之寡核苷酸，成為具有針對標的mRNA之較高之減弱活性之寡核苷酸。又，於5'末端之鹼基為鳥嘌呤或胞嘧啶之寡核苷酸中，藉由將該寡核苷酸之5'末端之鳥嘌呤殘基或胞嘧啶殘基取代為腺嘌呤殘基(6-胺基嘌呤-9-基)、胸腺嘧啶殘基(5-甲基-1,2,3,4-四氫嘧啶-2,4-二酮-1-基)、尿苷殘基(嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮-1-基)或式(II)~(V)所表示之鹼基殘基，而成為與AGO2之親和性提高之寡核苷酸，成為具有針對標的mRNA 之較高之減弱活性之寡核苷酸。
藉由本發明而獲得之具有針對標的mRNA之較高之減弱活性之寡核苷酸中5'末端之磷酸部分或糖部可與式(I)相同，亦可不同。
作為本發明中之式(II)~(V)所表示之鹼基殘基之較佳之形態，可列舉上述(4)~(12)、(14)~(16)、(18)~(22)、(24)~(27)、(71)及(72)所表示之式(II)~(V)所表示之鹼基殘基，作為更佳之形態，可列舉上述(35)~(39)、(41)~(44)、(46)~(48)所表示之式(IIA)~(VA)以及(71)及(72)所表示之鹼基殘基。
本發明之寡核苷酸及藉由本發明之方法針對標的mRNA之減弱活性提高之寡核苷酸亦可直接單獨投予，但通常較理想為以各種醫藥製劑之形式提供。又，該等醫藥製劑係用於動物及人。
本發明之醫藥製劑可單獨含有本發明之寡核苷酸作為活性成分，或可以與任意其他用於治療之有效成分之混合物之形式含有本發明之寡核苷酸作為活性成分。又，該等醫藥製劑可將活性成分與藥學上可容許之一種或一種以上載體一併混合，藉由製劑學之技術領域中周知之任意方法而製造。例如作為本發明之醫藥製劑之製造方法，可列舉磷酸鈣法、DEAE(diethylaminoethyl，二乙胺基乙基)-葡聚糖法、電穿孔及顯微注射、病毒法、及使用陽離子脂質體之方法等(Graham,F.L.及van der Eb,A.J.(1973)Virol.52,456；McCutchan,J.H.及Pagano,J.S.(1968)J.Natl.Cancer Inst.41,351；Chu,G.等人(1987)Nucl.Acids Res.15,1311；Fraley,R等人(1980)J.Biol.Chem.255,10431；Capechi,M.R.(1980)Cell 22,479；Felgner,P.L.等人(1987),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,7413)。又，可列舉使用含有核酸之陽離子脂質顆粒(cationic lipid particle)或陽離子聚合物、及封入有核酸之脂質顆粒等之方法。進而，通常以聚乙二醇(PEG)等水溶性高分子對脂質顆粒等之表面進行修飾，上述含有核酸之陽離子脂質顆 粒、陽離子聚合物、封入有核酸之脂質顆粒等亦可製成PEG修飾脂質顆粒。
作為投予路徑，較理想為使用治療時最具有效果者，可列舉經口、或例如靜脈內等非經口。
作為投予形態，例如可列舉：片劑、注射劑等。
適合經口投予之例如片劑等可使用乳糖等賦形劑、澱粉等崩解劑、硬脂酸鎂等潤滑劑、羥丙基纖維素等結合劑等而製造。
適合非經口投予之例如注射劑可使用鹽溶液、葡萄糖溶液或鹽溶液與葡萄糖溶液之混合液等而製造。
本發明之寡核苷酸之投予量及投予次數根據投予形態、患者之年齡、體重、應治療之症狀之性質或嚴重度等而有所不同，通常於靜脈內投予等非經口投予之情形時，以成人每人0.001~100mg、較佳為0.01~10mg之量一天投予一次至數次。然而，該等投予量及投予次數根據前文所述之各種條件而有所變動。
以下，藉由實施例及參考例對本發明之態樣進行說明。於無特別記載之情形時，所使用之原料及試劑可以市售品之形式、或依據已知之方法而獲得。再者，本發明並不限定於該等實施例及參考例。
[實施例1] 實施例1
使用核酸合成裝置(Ultra Fast Parallel Syntheizer，Sigma公司製造，以下稱為UFPS)，以0.5μmol為尺度進行如表8所示之反義鏈之5'末端具有8-溴-2'-單磷酸去氧腺苷(8-Br-dA)之螢光素酶標的siRNA(反義鏈之序列所含之X意指8-Br-dA)之合成。固相載體係使用CPG 500埃，rA.rG(tac),SAFC-PROLIGO。DMT-2'-O-TBDMS-rA(tac)醯胺(SAFC-PROLIGO公司)、DMT-2'-O-TBDMS-rG(tac)醯胺(SAFC-PROLIGO公司)、DMT-2'-O-TBDMS-rC(tac)醯胺(SAFC-PROLIGO公 司)、及DMT-2'-O-TBDMS-rU醯胺(SAFC-PROLIGO公司)係製備為0.1mol/L乙腈溶液而用於縮合反應，8-Br-dA-CE亞磷醯胺(Glen Research公司)係製備為0.1mol/L乙腈溶液而用於縮合反應，化學磷酸化試劑II(Glen Research公司)係製備為0.06mol/L乙腈溶液而用於縮合反應。使用5-苄硫基-1H-四唑(SAFC-PROLIGO公司)作為亞磷醯胺之活化物，縮合時間設為各10分鐘。藉由脫三苯甲基(trityl-off)進行合成後，將其浸於28%氨溶液中，於55℃下放置4小時。於減壓下進行濃縮，並加入31%三乙胺三氫氟酸鹽，於65℃下放置3小時後，加入1-丁醇而停止反應。使用逆相液體層析法(SHISEIDO,CAPSELL PAK C18,SG300,6.0mm×75mm，利用5%乙腈/0.1%乙酸三乙基銨緩衝液、B液：50%乙腈/水進行梯度法)進行純化，而獲得目標寡核苷酸。
所獲得之單鏈寡核苷酸係溶解於混合緩衝液[100mmol/L之乙酸鉀、30mmol/L之2-[4-(2-羥基乙基)哌-1-基]乙磺酸、HEPES)-KOH(pH值為7.4)、2mmol/L之乙酸鎂]中，將濃度設為50μmol/L。將正義鏈、反義鏈各自等量混合，於80℃下靜置10分鐘。緩慢降低溫度，於37℃下靜置1小時，而獲得雙鏈寡核苷酸。
實施例1-1
使用核酸合成裝置(Ultra Fast Parallel Syntheizer，Sigma公司製造，以下為UFPS)，以0.5μmol尺度進行如表22及表40所示之反義鏈之5'末端具有8-溴-2'-單磷酸去氧腺苷(8-Br-dA)之螢光素酶標的siRNA(反義鏈之序列所含之X意指8-Br-dA)之合成。固相載體係使用CPG 500埃，rA.rG(tac),SAFC-PROLIGO。DMT-2'-O-TBDMS-rA(tac)醯胺(SAFC-PROLIGO公司)、DMT-2'-O-TBDMS-rG(tac)醯胺(SAFC-PROLIGO公司)、DMT-2'-O-TBDMS-rC(tac)醯胺(SAFC-PROLIGO公司)、及DMT-2'-O-TBDMS-rU醯胺(SAFC-PROLIGO公司)係製備為0.1mol/L乙腈溶液而用於縮合反應，8-Br-dA-CE亞磷醯胺(Glen Research 公司)係製備為0.1mol/L乙腈溶液而用於縮合反應，化學磷酸化試劑II(Glen Research公司)係製備為0.06mol/L乙腈溶液而用於縮合反應。使用5-苄硫基-1H-四唑(SAFC-PROLIGO公司)作為亞磷醯胺之活化物，縮合時間設為各10分鐘。藉由脫三苯甲基進行合成後，將其浸於28%氨溶液中，於室溫下放置4小時。於減壓下進行濃縮，並加入31%三乙胺三氫氟酸鹽，於65℃下放置3小時後，加入1-丁醇及乙酸鈉水溶液。離心操作後去除上清液，以乙醇將所得之殘渣洗淨2次。再次將殘渣溶解於水中，使用逆相液體層析法(SHISEIDO,CAPSELL PAK C18,SG300,6.0mm×75mm，利用A液：5%乙腈/0.1%乙酸三乙基銨緩衝液、B液：50%乙腈/水進行梯度法)進行純化，而獲得目標寡核苷酸。
所獲得之單鏈寡核苷酸係溶解於混合緩衝液[100mmol/L之乙酸鉀、30mmol/L之2-[4-(2-羥基乙基)哌-1-基]乙磺酸、HEPES)-KOH(pH值為7.4)、2mmol/L之乙酸鎂]中，將濃度設為50μmol/L。將正義鏈、反義鏈各自等量混合，於80℃下靜置10分鐘。緩慢降低溫度，於37℃下靜置1小時，而獲得雙鏈寡核苷酸。
試驗例1：螢光素酶標的siRNA之RNAi活性
以如下所示之方式，以螢光素酶發光抑制水準作為指標對實施例1所獲得之反義鏈之5'末端具有8-Br-dA之螢光素酶標的siRNA之 RNAi活性進行評估。
於培養皿(Costar公司製造之分析盤，96孔，帶蓋，型號3917)中，將導入有螢光素酶表現載體(pGL4.50[luc2/CMV/Hygro] Vector、Promega公司)之源自人類子宮頸癌之細胞株海拉(Hela)細胞(CCL-2，自ATCC購入)懸浮於含有10%胎牛血清之RPMI(Roswell Park Memorial Institute，洛斯維帕克紀念研究所)培養基(Invitrogen Life technologies，11875093)中，以每孔之細胞數成為5000之方式將50μL之細胞懸浮液接種至各孔中。
以OPTI-MEM(Invitrogen Life technologies，31985-070)對siRNA進行稀釋。以OPTI-MEM對脂質體RNAiMAX(Invitrogen Life technologies，13778-075)進行稀釋。將所製備之各稀釋液混合，使之形成siRNA與脂質體RNAiMAX複合體。於含有細胞懸浮液之各孔中添加10μL之所製備之siRNA-脂質體RNAiMAX(Invitrogen Life technologies，13778-075)複合體溶液，藉此將siRNA導入至海拉(Hela)細胞中。siRNA之最終濃度係設為100pmol/L之1點，或設為3.2pmol/L、16pmol/L、80pmol/L及400pmol/L之4點，以N=6進行設定。又，作為陰性對照群而接種僅添加有脂質體RNAiMAX之細胞。又，為了進行比較，對各siRNA之相當於8-Br-dA之位置具有單磷酸腺苷之siRNA(分別稱為239-A、874-A、904-A、1084-A、1203-A及1556-A，表23)亦以同樣之方式進行試驗。進而，對874-BrdA之相當於8-Br-dA之位置具有單磷酸鳥苷、單磷酸胞苷或單磷酸尿苷之siRNA(稱為874-G、874-C及874-U，表24)亦以同樣之方式進行試驗。
[表23]
導入siRNA後之細胞係於37℃、5%CO2條件下培養24小時。
對於培養後之細胞，將作為市售螢光素酶定量試劑之Steady-Glo螢光素酶分析系統(Steady-Glo Luciferase Assay System，Promega，E2520)按照隨附之操作說明，對各孔添加40μL。培養10分鐘後，利用ARVO(PerkinElmer)，按照操作說明測定各孔每1秒之發光量(cps)。
於測定螢光素酶標的siRNA處理群之發光量之同時，亦測定陰性對照群之發光量，藉此以將siRNA未導入群(陰性對照群)之發光量設為1時之相對比率表示siRNA導入檢體之RNAi效果。
將本試驗之結果示於圖1及圖2。圖1係表示對最終濃度100pmol/L下之本發明之siRNA與其序列中相當於8-Br-dA之位置具有單磷酸腺苷之siRNA進行比較之圖。圖2係表示對最終濃度3.2pmol/L、16pmol/L、80pmol/L及400pmol/L下之本發明之siRNA即874-BrdA與其序列中相當於8-Br-dA之位置具有單磷酸腺苷、單磷酸鳥苷、單磷酸 胞苷或單磷酸尿苷之874-A、874-G、874-C及874-U進行比較之圖(於圖1及2中，縱軸係將陰性對照群之發光量設為1之情形時之發光比率)。再者，藉由Kruskal-Wallis檢定(Kruskal-Wallis test)判斷有無有意義差。統計解析係使用統計解析軟體SAS(9.2版，SAS Institute Inc.)。表25表示將239-BrdA、874-BrdA、904-BrdA、1084-BrdA、1203-BrdA及1556-BrdA之發光抑制率分別與239-A、874-A、904-A、1084-A、1203-A及1556-A之發光抑制率進行比較而獲得之有意義差檢定之結果。均顯示為0.05以下之p值，可知於將單磷酸腺苷取代為8-Br-dA之siRNA中，發光抑制率顯著提高。
試驗例2：螢光素酶標的siRNA之RNAi活性
以如下所示之方式測定螢光素酶GL4信使RNA(Luciferase GL4 mRNA)(基因庫許可號碼EU921840)之表現抑制效果，對實施例1中所獲得之反義鏈之5'末端具有8-Br-dA之螢光素酶標的siRNA之RNAi活性進行評估。
於培養皿(Nunc公司製造之Multidish 24孔，型號142475)中，使源自人類子宮頸癌之細胞株海拉(Hela)細胞(CCL-2，自ATCC購入)懸浮於含有10%胎牛血清之RPMI培養基(Invitrogen Life technologies，11875093)中，以每1孔之細胞數成為50000之方式將500μL之細胞懸浮液接種至各孔中。於其中添加100μL之混合於OPTI-MEM(Invitrogen Life technologies，31985-070)中之siRNA-脂質體 RNAiMAX(Invitrogen Life technologies，13778-075)複合體溶液，藉此將siRNA導入至海拉(Hela)細胞中。siRNA之最終濃度設為10000pmol/L、2000pmol/L、400pmol/L、80pmol/L、16pmol/L、3.2pmol/L、0.64pmol/L之7點。又，接種僅添加有脂質體RNAiMAX之細胞作為陰性對照群。
導入siRNA後之細胞係於37℃、5%CO2條件下培養24小時。RNA之回收係使用QIAGEN公司之RNA萃取套組(RNeasy，74106)，以磷酸緩衝液將培養後之細胞洗淨1次後，將細胞溶解於RNeasy套組隨附之RLT緩衝液(RNeasy隨附)中進行回收，按照套組所隨附之說明書回收總RNA。以1μg之總RNA作為模板，使用轉錄因子第一股cDNA合成套組(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit，Roche公司之4897030001)進行反轉錄反應，而製作cDNA。將該cDNA用於PCR(polymerase chain reaction，聚合酶鏈反應)反應之模板，藉由使用ABI7900HT Fast(Applied Biosystems(ABI)公司)之Taqman探針(Taqman probe)法，使GL4(基因庫許可號碼EU921840)基因及作為對照之D-甘油醛-3-磷酸脫氫酶(D-Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH，基因庫許可號碼NM_001256799)進行PCR反應，分別測定mRNA擴增量，以GAPDH之mRNA擴增量作為內部對照，計算出GL4之mRNA之準定量值。GAPDH之測定係使用Taqman探針Hs99999905 m1(Applied Biosystems(ABI)公司)。GL4之測定係使用通用探針庫(Universal probelibrary)之探針#20(Roche公司之04686934001)及作為擴增引子之具有序列編號63所表示之鹼基序列之DNA(前置引子)、具有序列編號64所表示之鹼基序列之DNA(反置引子)。又，同樣地分別測定陰性對照群之GL4之mRNA量及GAPDH之mRNA擴增量，以GAPDH之mRNA擴增量作為內部對照，計算出GL4之mRNA之準定量值。
siRNA導入檢體之標的mRNA量係以將siRNA未導入群(陰性對照群)中之GL4之mRNA量設為1時之相對比率所表示。
IC50值係藉由Logit法而算出。統計解析係使用統計解析軟體SAS(9.2版，SAS Institute Inc.)而進行。
表26表示作為本發明之siRNA之874-BrdA與作為比較之其序列中相當於8-Br-dA之位置具有單磷酸腺苷或單磷酸尿苷之874-A及874-U之IC50值。
根據試驗例1及2之結果可知，反義鏈之5'末端具有8-Br-dA之siRNA(874-BrdA)與反義鏈之5'末端具有相對應之天然型之核苷酸之siRNA相比，對於螢光素酶表現顯示出較高之減弱活性。
實施例2
使用市售之8-側氧基-dA-CE亞磷醯胺，以與實施例1同樣之方式進行合成而獲得如表27所示之反義鏈之5'末端具有8-側氧基-2'-單磷酸去氧腺苷之螢光素酶標的siRNA(稱為874-8-側氧基-dA，反義鏈之序列所含之X意指8-側氧基-2'-單磷酸去氧腺苷)。
實施例3
使用市售之5-Br-dU-CE亞磷醯胺，以與實施例1同樣之方式進行合成而獲得如表27所示之反義鏈之5'末端具有5-溴-2'-單磷酸去氧尿苷之siRNA(稱為874-5-Br-dU，反義鏈之序列所含之X意指5-溴-2'-單磷酸去氧尿苷)。
實施例4
使用市售之5-F-dU-CE亞磷醯胺，以與實施例1同樣之方式進行合成而獲得如表27所示之反義鏈之5'末端具有5-氟-2'-單磷酸去氧尿苷之siRNA(稱為454-5-F-dU及1556-5-F-dU，反義鏈之序列所含之X意指5-氟-2'-單磷酸去氧尿苷)。
MALDI-TOF/MS
454-5-F-dU(反義鏈)：理論值6668.85(M-H)，實測值6673.35
1556-5-F-dU(反義鏈)：理論值6669.03(M-H)，實測值6671.33
試驗例3：螢光素酶標的siRNA之RNAi活性
以與試驗例2同樣之方式測定並評估實施例4中所獲得之螢光素酶標的siRNA(表27，X之位置具有5-F-dU)之RNAi活性。分別與反義鏈之5'末端具有相對應之天然型核苷酸之siRNA(表28)進行比較。
表29表示各siRNA之IC50值。
根據試驗例3之結果可知，反義鏈之5'末端具有5-氟-2'-單磷酸去氧尿苷之siRNA(454-5-F-dU及1556-5-F-dU)分別與反義鏈之5'末端具有相對應之天然型核苷酸之siRNA相比，對於螢光素酶表現顯示出較高之減弱活性。
實施例5
以與實施例1同樣之方式進行合成而獲得如表30所示之反義鏈之5'末端具有8-側氧基-2'-單磷酸去氧腺苷之D-甘油醛-3-磷酸脫氫酶(D-Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)標的siRNA(反義鏈之序列所含之X意指8-側氧基-2'-單磷酸去氧腺苷)。
試驗例4：D-甘油醛-3-磷酸脫氫酶(D-Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)標的siRNA之RNAi活性
以如下所示之方式測定GAPDH mRNA之表現抑制效果，對反義鏈之5'末端具有8-Br-dA之GAPDH標的siRNA之RNAi活性進行評估。
於培養皿(Nunc公司製造之Multidish 24孔，型號142475)中，將源自人類子宮頸癌之細胞株海拉(Hela)細胞(CCL-2，自ATCC購入)懸浮於含有10%胎牛血清之RPMI培養基(Invitrogen Life technologies，11875093)中，以每孔之細胞數成為50000之方式將500μL之細胞懸浮液接種至各孔中。於其中添加100μL之混合於OPTI-MEM(Invitrogen Life technologies，31985-070)中之siRNA-Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen Life technologies，13778-075)複合體溶液，藉此將siRNA導入至海拉(Hela)細胞中。siRNA之最終濃度係設為100pmol/L之1點。又，作為陰性對照群，接種僅添加有脂質體RNAiMAX之細胞。
導入siRNA後之細胞係於37℃、5%CO2條件下培養24小時。RNA之回收係使用QIAGEN公司之RNA萃取套組(RNeasy 74106)，以磷酸緩衝液將培養後之細胞洗淨1次後，將細胞溶解於RNeasy套組隨附之RLT緩衝液(RNeasy隨附)中進行回收，按照套組所隨附之說明書回收總RNA。以1μg之總RNA作為模板，使用轉錄因子第一股cDNA合成套組(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit，Roche公司，4897030001)進行反轉錄反應，從而製作cDNA。將該cDNA用於PCR反應之模板，藉由使用ABI7900HT Fast(ABI公司)之Taqman探針法，使GADPH基因及作為對照之肽基脯胺酸順反異構酶(PPIB)(pepytidyl-prolyl cis-trans isomerase B)基因(基因庫許可號碼NM_000942)進行PCR反應，分別對mRNA擴增量進行測定，以PPIB之mRNA擴增量作為內部對照，計算出GAPDH之mRNA之準定量值。GAPDH之測定係使用Taqman探針Hs99999905 m1(Applied Biosystems(ABI)公司)，PPIB之測定係使用Hs01018502 m1(Applied Biosystems(ABI)公司)。 又，同樣地分別測定陰性對照群之GAPDH之mRNA量及PPIB之mRNA擴增量，以PPIB之mRNA擴增量作為內部對照，計算出GAPDH之mRNA之準定量值。
siRNA導入檢體之標的mRNA量係以將siRNA未導入群(陰性對照群)中之GAPDH之mRNA量設為1時之相對比率所表示。
又，為了進行比較，亦以同樣之方式對各siRNA之相當於8-Br-dA之位置具有單磷酸腺苷之siRNA(表31)進行試驗。
將本試驗之結果示於表32及圖3。
根據試驗例4之結果可知，反義鏈之5'末端具有8-Br-dA之D-甘油醛-3-磷酸脫氫酶(D-Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)標的siRNA與反義鏈之5'末端具有相對應之天然型核苷酸之siRNA相比，對GAPDH之表現顯示出較高之減弱活性。
實施例6
使用如表33所示之反義鏈之5'末端具有5-氟-2'-單磷酸去氧尿苷之D-甘油醛-3-磷酸脫氫酶(D-Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)標的siRNA(反義鏈之序列所含之X意指5-氟-2'-單磷酸去氧尿苷)，以與實施例1同樣之方式進行合成而得。
MALDI-TOF/MS
1096-5-F-dU(反義鏈)：理論值6801.03(M-H)，實測值6797.74
試驗例5：D-甘油醛-3-磷酸脫氫酶(D-Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)標的siRNA之RNAi活性
以與試驗例4同樣之方式測定GAPDH mRNA之表現抑制效果，對實施例6中所獲得之GAPDDH標的siRNA之活性進行評估。
siRNA導入檢體之標的mRNA量係以將siRNA未導入群(陰性對照群)中之GAPDH之mRNA量設為1時之相對比率所表示。GAPDH之mRNA量係以次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1，HPRT1，基因庫許可號碼NM_000194)之mRNA擴增量作為內部對照而算出。HPRT1之測定係使用Taqman探針 Hs99999909_m1(Applied Biosystems(ABI)公司)。
又，為了進行比較，亦以同樣之方式對各siRNA之反義5'末端具有單磷酸尿嘧啶、單磷酸腺苷或單磷酸鳥嘌呤之siRNA(表33)進行試驗。
將本試驗之結果示於表34。
根據試驗例5之結果可知，反義鏈之5'末端具有5-氟-2'-單磷酸去氧尿苷之D-甘油醛-3-磷酸脫氫酶(D-Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)標的siRNA與反義鏈之5'末端具有相對應之天然型核苷酸之siRNA相比，對GAPDH之表現顯示出較高之減弱活性。
參考例1.0：化合物I-5 步驟1
將市售之6,7-二甲氧基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮(220mg，0.991mmol)、1-O-乙醯基-2,3,5-三-O-苯甲醯基-β-D-核呋喃糖(500mg，0.991mmol)溶解於乙腈(5mL)中，加入N,O-雙(三甲基矽烷基)乙醯胺(0.735mL，2.97mmol)，於60℃下攪拌20分鐘。將反應液冷卻至室溫後，加入甲磺醯基三甲基矽烷(0.627mL，3.47mmol)，於60℃下攪拌1小時。將反應液冷卻至室溫後，加入飽和碳酸氫鈉水溶液，以乙酸乙酯進行萃取。藉由飽和食鹽水洗淨有機層，並以硫酸鈉進行乾燥。 藉由庚烷/乙酸乙酯系之管柱層析法純化於減壓下將溶劑蒸餾去除而獲得之殘渣，藉此獲得二苯甲酸(2R,3R,4R,5R)-2-((苯甲醯基氧基)甲基)-5-(6,7-二甲氧基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)四氫呋喃-3,4-二酯(599mg，產率91%)。
步驟2
將步驟1中所獲得之二苯甲酸(2R,3R,4R,5R)-2-((苯甲醯基氧基)甲基)-5-(6,7-二甲氧基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)四氫呋喃-3,4-二酯(599mg，0.899mmol)溶解於甲醇(9mL)中，加入甲基胺/甲醇溶液(4.58mL，44.9mmol)，於室溫下徹夜攪拌。向於減壓下將溶劑蒸餾去除而獲得之殘渣中加入二乙醚，濾取析出物，藉此獲得1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)-6,7-二甲氧基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮(312mg，產率98%)。
ESI-MS(electrospray ionization mass spectrometry，電灑游離質譜)(m/z)：353(M-1)
步驟3
將步驟2中所獲得之1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)-6,7-二甲氧基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮(310mg，0.875mmol)懸浮於丙酮(15mL)中，加入2,2-二甲氧基丙烷(0.536mL，4.37mmol)、4-甲苯磺酸一水合物(183mg，0.962mmol)，於室溫下攪拌2小時。於反應液中加入飽和碳酸氫鈉水溶液後，於減壓下將溶劑蒸餾去除直至溶劑量成為約一半為止，藉由氯仿/甲醇系之管柱層析法純化所得之殘渣，藉此獲得1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(羥基甲基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)-6,7-二甲氧基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮(315mg，產率91%)。
ESI-MS(m/z)：395(M+1)
步驟4
將步驟3中所獲得之1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(羥基甲基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)-6,7-二甲氧基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮(310mg，0.786mmol)溶解於二氯甲烷(8mL)中，加入1H-四唑(138mg，1.97mmol)、二第三丁基二異丙基磷醯胺(0.522mL，1.57mmol)，於室溫下攪拌5小時。將反應液冷卻為0℃，加入間氯過苯甲酸(452mg，1.97mmol)，於0℃下進一步攪拌20分鐘。於反應液中加入飽和碳酸氫鈉水溶液，以氯仿加以萃取後，利用硫酸鈉進行乾燥。利用庚烷/乙酸乙酯系之管柱層析法對藉由於減壓下將溶劑蒸餾去除而獲得之殘渣進行純化，藉此獲得磷酸二第三丁基((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6,7-二甲氧基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(259mg，產率56%)。
ESI-MS(m/z)：587(M+1)
步驟5
將步驟4中所獲得之磷酸二第三丁基((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6,7-二甲氧基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(77.5mg，0.132mmol)溶解於三氟乙酸/水(1：1)(2mL)，於室溫下攪拌2小時。於減壓下將溶劑蒸餾去除後，加入乙酸-三乙胺緩衝液(pH值為6.5)(2mL)，再次於減壓下將溶劑蒸餾去除。將所得之殘渣溶解於乙醇中，並加入乙酸乙酯，濾取析出物，藉此獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6,7-二甲氧基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲基(化合物I-5)三乙基銨鹽(64.9mg，產率92%)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：7.43(s,1H),6.91(s,1H),6.08(d,J=4.0Hz,1H),4.77-4.58(m,1H),4.38(t,J=7.3Hz,1H),4.04-4.02(m,3H),3.90(s,3H),3.81(s,3H),3.08(q,J=7.3Hz,6H),1.16(t,J= 7.3Hz,9H).
ESI-MS(m/z)：435(M+1)
參考例1.1：化合物am-1 步驟1
將參考例1.0之步驟2中所獲得之1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)-6,7-二甲氧基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮(812mg，2.29mmol)溶解於DMF(10.0mL)中，於冰浴冷卻下加入雙(三氟甲磺酸)二第三丁基矽烷酯(1.00mL，2.75mmol)後，於冰浴冷卻下攪拌6小時。於反應混合物中加入飽和碳酸氫鈉水溶液，以乙酸乙酯加以萃取後，藉由飽和食鹽水洗淨有機層，並藉由無水硫酸鎂進行乾燥。於減壓下將溶劑蒸餾去除，藉由乙酸乙酯/庚烷系之矽膠管柱層析法對殘渣進行純化，藉此獲得1-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-羥基四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基]-6,7-二甲氧基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮(1.08g，95.0%)。
ESI-MS(m/z)：493(M-1)
步驟2
將步驟1中所獲得之1-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-羥基四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6,7-二甲氧基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮(1.73mg，3.50mmol)溶解於DMF(18.0mL)中，加入咪唑(1.19g，17.5mmol)、第三丁基二甲基氯矽烷(791mg，5.25mmol)後，於60℃下攪拌3小時。於反應混合物中加入飽和碳酸氫鈉水溶液，以乙酸乙酯加以萃取後，藉由飽和食鹽水洗淨有機層，並藉由無水硫酸鎂進行乾燥。於減壓下將溶劑蒸餾去除，藉由乙酸乙酯/庚烷系之矽膠管柱層析法對殘渣進行純化，藉此獲得1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6,7-二甲氧基喹唑啉- 2,4(1H,3H)-二酮(1.95g，92.0%)。
ESI-MS(m/z)：607(M-1)
步驟3
將步驟2中所獲得之1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6,7-二甲氧基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮(500mg，0.821mmol)溶解於二氯甲烷(8.00mL)中，於冰浴冷卻下加入吡啶(0.531mL，6.57mmol)、氟化氫-吡啶(0.423mL，3.28mmol)，於冰浴冷卻下攪拌1小時。於反應混合物中加入飽和碳酸氫鈉水溶液，以乙酸乙酯加以萃取後，藉由飽和食鹽水洗淨有機層，並藉由無水硫酸鎂進行乾燥。於減壓下將溶劑蒸餾去除，藉由乙酸乙酯/庚烷系之矽膠管柱層析法對殘渣進行純化，藉此獲得1-((2R,3R,4R,5R)-3-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-4-羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)-6,7-二甲氧基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮(336mg，87.0%)。
ESI-MS(m/z)：467(M-1)
步驟4
將步驟3中所獲得之1-((2R,3R,4R,5R)-3-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-4-羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)-6,7-二甲氧基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮(85.0mg，0.181mmol)溶解於吡啶(2.00mL)中，加入p,p'-二甲氧基三苯氯甲烷(184mg，0.544mmol)、4-二甲胺基吡啶(4.43mg，0.0360mmol)，於室溫下攪拌1小時。於反應混合物中加入飽和碳酸氫鈉水溶液，以乙酸乙酯加以萃取後，藉由飽和食鹽水洗淨有機層，並藉由無水硫酸鎂進行乾燥。於減壓下將溶劑蒸餾去除，藉由乙酸乙酯/庚烷系之矽膠管柱層析法對殘渣進行純化，藉此獲得1-((2R,3R,4R,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-4-羥基四氫呋喃-2-基)-6,7-二甲氧基喹唑啉- 2,4(1H,3H)-二酮(138mg，99.0%)。
ESI-MS(m/z)：769(M-1)
步驟5
將步驟4中所獲得之1-((2R,3R,4R,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-4-羥基四氫呋喃-2-基)-6,7-二甲氧基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮(74.0mg，0.0960mmo1)溶解於THF(2.00mL)中，於冰浴冷卻下加入二異丙基胺(0.084mL，0.480mmol)、氯(二異丙胺基)亞膦酸2-氰基乙酯(0.043mL，0.192mmol)後，於室溫下攪拌3小時。於減壓下將溶劑蒸餾去除，藉由乙酸乙酯/庚烷系之胺基矽膠管柱層析法對殘渣進行純化後，進一步藉由乙酸乙酯/庚烷系之矽膠管柱層析法進行純化，藉此獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(6,7-二甲氧基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-1，63.0mg，67.6%)。
1H-NMR(CDCl3,300MHz)δ：7.94(1H,brs),7.55(1H,s),7.47-7.39(2H,m),7.38-7.12(7H,m),6.93(1H,s),6.81-6.70(4H,m),5.94-5.89(1H,m),5.18-5.08(1H,m),4.53-4.38(1H,m),4.37-4.26(1H,m),3.98-3.69(12H,m),3.67-3.48(4H,m),3.46-3.23(2H,m),2.68-2.52(1H,m),2.35-2.27(1H,m),1.20-1.00(12H,m),0.83,0.81(9H,2 s),0.05,0.03,-0.09,-0.10(6H,4 s).
ESI-MS(m/z)：971(M+1)
實施例7
使用參考例1.1中所獲得之化合物am-1，以與實施例1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xu之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-5之siRNA。
MALDI-TOF/MS(反義鏈)：理論值6776.96(M-H)，實測值6776.21
參考例2.0：化合物I-6
使用市售之6-氯喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮，以與參考例1.0同樣之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-氯-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-6)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：7.88(d,J=1.8Hz,1H),7.64(dd,J=9.2,2.6Hz,1H),7.58(d,J=9.2Hz,1H),6.14(d,J=5.5Hz,1H),4.70-4.68(m,1H),4.37(t,J=5.9Hz,1H),4.09-4.02(m,3H).
ESI-MS(m/z)：409(M+1)
參考例2.1：化合物am-2
使用市售之6-氯喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮，以與參考例1.1同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(6-氯-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-2)。
實施例8
使用參考例2.1中所獲得之化合物am-2，以與實施例1同樣之方式合成反義鏈之5'末端具有化合物I-6之siRNA。
參考例3.0：化合物I-7
使用市售之7-氯喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮，以與參考例1.0同樣之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(7-氯-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-7)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：7.95(d,J=8.4Hz,1H),7.61(s,1H),7.30(d,J=8.4Hz,1H),5.99(d,J=4.4Hz,1H),4.79(t,J=5.3Hz,1H),4.38(t,J=6.4Hz,1H),4.04-3.92(m,3H).
ESI-MS(m/z)：409(M+1)
參考例3.1：化合物am-3
使用市售之7-氯喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮，以與參考例1.1同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(7-氯-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-3)。
1H-NMR(CDCl3,500MHz)δ：8.11(d,J=8.5Hz,1H),7.67(7.63)(d,J=1.7Hz,1H),7.45-6.76(m,14H),6.02(m,1H),5.12(5.07)(m,1H),4.45(m,1H),4.32(4.28)(m,1H),3.97-3.25(m,12H),2.70-2.23(m,2H),1.21-1.01(m,12H),0.80(0.82)(s,9H),0.03(0.05)(s,3H),-0.12(s,3H).
實施例9
使用參考例3.1中所獲得之化合物am-3，以與實施例1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xu之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-7之siRNA。
MALDI-TOF/MS(反義鏈)：理論值6751.35(M-H)，實測值6751.83
參考例4.0：化合物I-8
使用市售之5-氯喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮，以與參考例1.0同樣之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(5-氯-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-8)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：7.66(d,J=4.8Hz,2H),7.40(t,J=4.4Hz,1H),6.21(d,J=5.5Hz,1H),4.80(t,J=5.9Hz,1H),4.45(t,J=5.9Hz,1H),4.09(dd,J=14.5,7.1Hz,3H).
ESI-MS(m/z)：409(M+1)
參考例4.1：化合物am-4
使用市售之5-氯喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮，以與參考例1.1同樣之 方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(5-氯-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-4)。
實施例10
使用參考例4.1中所獲得之化合物am-4，以與實施例1同樣之方式合成反義鏈之5'末端具有化合物I-8之siRNA。
參考例5.0：化合物I-9
使用市售之噻吩并[3,2-d]嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，以與參考例1.0同樣之方式獲得磷酸(2R,3S,4R,5R)-5-(2,4-二側氧基-3,4-二氫噻吩并[3,2-d]嘧啶-1(2H)-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲基(化合物I-9)三乙基銨鹽。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：7.96(d,J=5.5Hz,1H),7.45(d,J=4.8Hz,1H),6.14(d,J=6.2Hz,1H),4.73-4.56(m,1H),4.35(t,J=5.7Hz,1H),4.09(brs,1H),4.02(t,J=4.8Hz,2H),3.07(q,J=7.3Hz,6H),1.15(t,J=7.3Hz,9H).
ESI-MS(m/z)：381(M+1)
參考例5.1：化合物am-5
使用市售之噻吩并[3,2-d]嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，以與參考例1.1同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(2,4-二側氧基-3,4-二氫噻吩并[3,2-d]嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-5)。
實施例11
使用參考例5.1中所獲得之化合物am-5，以與實施例1同樣之方式合成反義鏈之5'末端具有化合物I-9之siRNA。
參考例6.0：化合物I-10 步驟1
由藉由公知之方法(J.Med.Chem.，2012年，55卷，1478~1489頁)中記載之方法所合成之二乙酸(2R,3R,4R,5R)-2-(乙醯氧基甲基)-5-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3,4-二酯(10.9g，26.4mmol)，藉由公知之方法(J.Org.Chem.，2002年，67卷，6788~6796頁]中記載之方法獲得(2R,3R,4S,5R)-2-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-5-(羥基甲基)四氫呋喃-3,4-二醇(5.47g，產率72%)。
將(2R,3R,4S,5R)-2-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-5-(羥基甲基)四氫呋喃-3,4-二醇(5.48g，19.1mmol)懸浮於丙酮(200mL)中，加入2,2-二甲氧基丙烷(11.7mL，95.5mmol)、4-甲苯磺酸一水合物(9.09g，47.8mmol)，於室溫下攪拌2小時。於反應液中加入飽和碳酸氫鈉水溶液後，於減壓下將溶劑蒸餾去除直至溶劑量成為約一半為止。加入氯仿進行萃取，利用硫酸鈉進行乾燥後，藉由庚烷/乙酸乙酯系之矽膠管柱層析法純化於減壓下將溶劑蒸餾去除而獲得之殘渣，藉此獲得((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(5.17g，產率83%)。
ESI-MS(m/z)：327(M+1)
步驟2
於步驟1中所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(150mg，0.459mmol)、(E)-苯乙烯基硼酸(136mg，0.918mmol)、1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵-二氯化鈀(II)-二氯甲烷錯合物(37.5mg，0.031mmol)、碳酸銫(449mg，1.38mmol)中加入1,4-二烷(2mL)、水(1滴)，於氮氣環境、80℃下攪拌3小時。將反應液冷卻至室溫後，加入飽和食鹽水，以乙酸乙酯加以萃取，利用硫酸鈉進行乾燥。藉由庚烷/乙酸乙 酯系之管柱層析法純化於減壓下將溶劑蒸餾去除而獲得之殘渣，藉此獲得((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-二甲基-6-(6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(90.1mg，產率50%)。
ESI-MS(m/z)：395(M+1)
步驟3
將步驟2中所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-二甲基-6-(6-苯乙烯基-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(90mg，0.228mmol)溶解於二氯甲烷(2mL)中，加入1H-四唑(32.0mg，0.456mmol)、二第三丁基二異丙基磷醯胺(0.144mL，0.456mmol)，於0℃下攪拌2小時。向反應液中加入間氯過苯甲酸(141mg，0.612mmol)，於0℃下攪拌15分鐘。向反應液中加入飽和碳酸氫鈉水溶液與飽和食鹽水，以氯仿加以萃取，藉由硫酸鎂進行乾燥。藉由庚烷/乙酸乙酯系之管柱層析法純化於減壓下將溶劑蒸餾去除而獲得之殘渣，藉此獲得磷酸二第三丁基((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-二甲基-6-(6-苯乙烯基-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(E/Z幾何異構物混合物，73.2mg，產率55%)。
ESI-MS(m/z)：587(M+1)
步驟4
將步驟3中所獲得之磷酸二第三丁基((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-二甲基-6-(6-苯乙烯基-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(73.0mg，0.124mmol)溶解於三氟乙酸/水(1：1)(2mL)中，於室溫下攪拌2小時。向於減壓下將溶劑蒸餾去除而獲得之殘渣中加入乙酸-乙酸銨緩衝液(pH值為5.7)後，利用分取HPLC(high performance liquid chromatography，高效液相層析法)(溶離液，0.01mmol/L，乙酸銨水溶液/甲醇系)進行純化，向由此而獲得之粗純化物中加入2-丙 醇，濾取析出物，藉此獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-二羥基-5-(6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-10，21.3mg，產率39%)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：8.50(s,1H),8.42(s,1H),7.58(d,J=15.6Hz,1H),7.19-7.13(m,2H),7.08-6.97(m,4H),5.92(d,J=4.9Hz,1H),4.60-4.55(m,1H),4.38-4.34(m,1H),4.28-4.23(m,1H),4.10-3.97(m,2H).
ESI-MS(m/z)：435(M+1)
參考例6.1：化合物am-6 步驟1~2
使用市售之(2R,3R,4S,5R)-2-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-5-(羥基甲基)四氫呋喃-3,4-二醇，以與參考例1.1之步驟1~2同樣之方式獲得6-氯-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤。
步驟3
使用步驟2中所獲得之6-氯-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤，以與參考例6.0之步驟2同樣之方式獲得9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤。
步驟4~6
使用步驟3中所獲得之9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤，以與參考例1.1之步驟3~5同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(第三 丁基二甲基矽烷基氧基)-5-(6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-6)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.81,8.79(1H,2 s),8.43-8.35(1H,m),8.33,8.29(1H,2 s),7.77-7.69(3H,m),7.53-7.32(9H,m),7.31-7.18(3H,m),6.85-6.78(4H,m),6.15-6.05(1H,m),5.15-5.08(1H,m),4.48-4.35(2H,m),4.03-3.84(1H,m),3.77(6H,s),3.70-3.53(4H,m),3.38-3.29(1H,m),2.72-2.59(1H,m),2.37-2.24(1H,m),1.23-1.03(12H,m),0.76,0.75(9H,2 s),-0.02,-0.05,-0.21,-0.21(6H,4 s).
實施例12
使用核酸合成裝置(NS-8，Gene Design公司製造)，以0.2μmol尺度進行如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-10之螢光素酶標的siRNA之合成。固相載體係使用U-RNA-CPG(GLEN RESEARCH公司)。DMT-2'-O-TBDMS-rA(Pac)醯胺(GLEN RESEARCH公司)、DMT-2'-O-TBDMS-rG(iPr-Pac)醯胺(GLEN RESEARCH公司)、DMT-2'-O-TBDMS-rC(ac)醯胺(GLEN RESEARCH公司)、及DMT-2'-O-TBDMS-rU醯胺(GLEN RESEARCH公司)係製備為0.1mol/L乙腈溶液而用於縮合反應，6-苯乙烯基-P亞磷醯胺係製備為0.1mol/L乙腈溶液而用於縮合反應，化學磷酸化試劑II(Glen Research公司)係製備為0.1mol/L乙腈溶液而用於縮合反應。使用活化物42(SAFC-PROLIGO公司)作為亞磷醯胺之活化物，縮合時間各為16分鐘，且係於遮光條件下進行。藉由脫三苯甲基進行合成後，將其浸於28%氨溶液中，於55℃下放置4小時。於減壓下進行濃縮，並加入31%三乙胺三氫氟酸鹽，於65℃下放置2小時後，利用NAP-10(GE-Healthcare公司)獲得溶出物，藉由逆相液體層析法(Waters，XBridge C18，4.6mm×250mm，利用A液：100mM三乙胺/乙酸緩衝液、B液：乙腈進行梯度法)對所得之溶出物進行純化，而獲得目標寡核苷 酸。根據利用LC-MS(liquid chromatography-mass spectrometry system，液相層析-質譜系統)(ESI-MS)進行之多元離子解析(反褶積(deconvolution))決定結構。將所獲得之單鏈寡核苷酸溶解於混合緩衝液[10mM三羥甲基胺基甲烷、50mM氯化鈉、1mM乙二胺四乙酸]中，將核酸濃度設為20μmol/L。將義鏈、反義鏈各自等量混合，於80℃下靜置10分鐘。緩慢降低溫度，於37℃下靜置1小時，而獲得雙鏈寡核苷酸。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6777.01，實測值6777.19
參考例7.0：化合物I-11 步驟1
將藉由公知之方法(J.Med.Chem.，2012年，55卷，1478~1489頁)中記載之方法所合成之二乙酸(2R,3R,4R,5R)-2-(乙醯氧基甲基)-5-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3,4-二酯(2.00g，4.85mmol)溶解於THF(15mL)中，加入二甲基胺鹽酸鹽(1.19g，14.5mmol)與三乙胺(2.70mL，19.38mL)，在密封管中於60℃下徹夜攪拌。向反應液中加入二甲基胺鹽酸鹽(1.19g，14.5mmol)與三乙胺(2.70mL，19.38mL)，於60℃下進一步徹夜攪拌。加入水並以氯仿加以萃取後，進行減壓濃縮，藉此獲得二乙酸(2R,3R,4R,5R)-2-(乙醯氧基甲基)-5-(6-(二甲胺基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3,4-二酯(2.2g，產率108%)。
ESI-MS(m/z)：422(M+1)
步驟2
於步驟1中所獲得之二乙酸(2R,3R,4R,5R)-2-(乙醯氧基甲基)-5-(6-(二甲胺基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3,4-二酯(2.00g，4.75mmol)中加入7.0mol/L氨/甲醇溶液(33.9mL)，於室溫下徹夜攪拌。向於減壓下將溶劑蒸餾去除而獲得之殘渣中加入醚/乙酸乙酯混合液，並濾取不溶物，藉此獲得(2R,3R,4S,5R)-2-(6-(二甲胺基)-9H-嘌呤-9-基)-5-(羥 基甲基)四氫呋喃-3,4-二醇(1.2g，產率86%)。
ESI-MS(m/z)：296(M+1)
步驟3
將步驟2中所獲得之(2R,3R,4S,5R)-2-(6-(二甲胺基)-9H-嘌呤-9-基)-5-(羥基甲基)四氫呋喃-3,4-二醇(1.2g，4.06mmol)懸浮於0.5M乙酸-乙酸鈉緩衝液(pH值為4.0)(40mL)中，加入溴水(55.8mL)，並於室溫下攪拌4小時。向反應液中加入硫酸氫鈉直至溴之顏色消失，以碳酸鈉進行中和。於減壓下將溶劑蒸餾去除直至溶劑量成為約一半為止，濾取不溶物後，以水、丙酮依序洗淨，並於減壓下加以乾燥，藉此獲得(2R,3R,4S,5R)-2-(8-溴-6-(二甲胺基)-9H-嘌呤-9-基)-5-(羥基甲基)四氫呋喃-3,4-二醇(1.09g，產率72%)。
ESI-MS(m/z)：374(M+1)
步驟4
將步驟3中所獲得之(2R,3R,4S,5R)-2-(8-溴-6-(二甲胺基)-9H-嘌呤-9-基)-5-(羥基甲基)四氫呋喃-3,4-二醇(2.90g，7.75mmol)懸浮於丙酮(39mL)中，加入2,2-二甲氧基丙烷(4.75mL，38.8mmol)、4-甲苯磺酸一水合物(1.62g，38.8mmol)，於室溫下徹夜攪拌。向反應液中加入飽和碳酸氫鈉水溶液與飽和食鹽水後，於減壓下將溶劑蒸餾去除直至溶劑量成為約一半為止。加入氯仿進行萃取，並利用硫酸鈉進行乾燥後，以氯仿加以萃取，利用硫酸鈉進行乾燥。於減壓下將溶劑蒸餾去除，藉此獲得((3aR,4R,6R,6aR)-6-(8-溴-6-(二甲胺基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(1.96g，產率61%)。
ESI-MS(m/z)：414(M+1)
步驟5
將步驟4中所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(8-溴-6-(二甲胺基)-9H- 嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(200mg，0.483mmol)溶解於二氯甲烷(2mL)中，加入1H-四唑(84.6mg，1.21mmol)、二第三丁基二異丙基磷醯胺(0.321mL，0.966mmol)，於室溫下攪拌0.5小時。將反應液冷卻為0℃，並加入間氯過苯甲酸(222mg，0.966mmol)，於0℃下進一步攪拌15分鐘。向反應液中加入飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和食鹽水，以氯仿加以萃取後，利用硫酸鈉進行乾燥。利用庚烷/乙酸乙酯系之管柱層析法對藉由於減壓下將溶劑蒸餾去除而獲得之殘渣進行純化，藉此獲得磷酸((3aR,4R,6R,6aR)-6-(8-溴-6-(二甲胺基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯二第三丁酯(209mg，產率71%)。
ESI-MS(m/z)：606(M+1)
步驟6
將步驟5中所獲得之磷酸((3aR,4R,6R,6aR)-6-(8-溴-6-(二甲胺基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯二第三丁酯(50.0mg，0.082mol)溶解於三氟乙酸/水(1：1)(2mL)中，於室溫下攪拌3小時。向於減壓下將溶劑蒸餾去除而獲得之殘渣中加入乙酸-乙酸銨緩衝液(pH值為5.7)後，利用分取HPLC(溶離液，0.01mmol/L，乙酸銨水溶液/甲醇系)進行純化，向由此而獲得之粗純化物中加入乙醇，濾取析出物，藉此獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-6-(8-溴-6-(二甲胺基)-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-11，26.2mg，產率70%)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：8.06-7.92(m,1H),5.98-5.93(m,1H),5.15-5.07(m,1H),4.43(dd,J=5.9,5.9Hz,1H),4.09(dd,J=9.8,4.9Hz,1H),3.99-3.91(m,1H),3.90-3.82(m,1H),3.30-3.12(m,6H).
ESI-MS(m/z)：454(M+1)
參考例7.1：化合物am-7
使用參考例7.0之步驟3中所獲得之(2R,3R,4S,5R)-2-(8-溴-6-(二甲胺基)-9H-嘌呤-9-基)-5-(羥基甲基)四氫呋喃-3,4-二醇，以與參考例1.1同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(8-溴-6-(二甲胺基)-9H-嘌呤-9-基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-7)。
實施例13
使用參考例7.1中所獲得之化合物am-7，以與實施例1同樣之方式合成反義鏈之5'末端具有化合物I-11之siRNA。
參考例8.0：化合物I-12 步驟1
將參考例7.0之步驟5中所獲得之磷酸((3aR,4R,6R,6aR)-6-(8-溴-6-(二甲胺基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯二第三丁酯(100mg，0.165mmol)溶解於DMF(1.5mL)中，加入氰化四乙基銨(129mg，0.824mmol)，於100℃下攪拌2小時。將反應液冷卻至室溫後，加入飽和食鹽水，以乙酸乙酯加以萃取，利用硫酸鈉進行乾燥。藉由庚烷/乙酸乙酯系之管柱層析法純化於減壓下將溶劑蒸餾去除而獲得之殘渣，藉此獲得磷酸((3aR,4R,6R,6aR)-6-(8-氰基-6-(二甲胺基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯二第三丁酯(52.6mg，58%)。
ESI-MS(m/z)：558(M+1)
步驟2
將步驟2中所獲得之磷酸((3aR,4R,6R,6aR)-6-(8-氰基-6-(二甲胺基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4- 基)甲酯二第三丁酯(80.0mg，0.145mmol)溶解於三氟乙酸/水(1：1)(4mL)中，於室溫下攪拌3小時。藉由分取HPLC(溶離液，0.01mmol/L，三氟乙酸水溶液/乙腈系)純化於減壓下將溶劑蒸餾去除而獲得之殘渣，向由此而獲得之粗純化物中加入乙醇，濾取析出物，藉此獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-6-(8-氰基-6-(二甲胺基)-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-12，8.4mg，產率15%)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：8.05(s,1H),5.97(d,J=5.9Hz,1H),4.95-4.53(m,1H),4.37-4.29(m,1H),4.24-4.15(m,1H),4.06-3.93(m,2H),3.66-2.83(m,6H).
ESI-MS(m/z)：401(M+1)
參考例8.1：化合物am-8 步驟1~2
使用參考例7.0之步驟3中所獲得之(2R,3R,4S,5R)-2-(8-溴-6-(二甲胺基)-9H-嘌呤-9-基)-5-(羥基甲基)四氫呋喃-3,4-二醇，以與參考例1.1之步驟1~2同樣之方式獲得8-溴-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-N,N-二甲基-9H-嘌呤-6-胺。
ESI-MS(m/z)：628(M+1)
步驟3
將步驟2中所獲得之8-溴-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-N,N-二甲基-9H-嘌呤-6-胺(10.0mg，0.0160mmol)溶解於DMF(1.00mL)中，加入氰化鈉(7.79mg，0.159mmol)、氟化銫(7.25mg，0.0480mmol)，於100℃下攪拌4小時。於反應液中加入飽和碳酸氫鈉水溶液，以乙酸乙酯加以萃取，並利用硫酸鈉進行乾燥。藉由庚烷/乙酸乙酯系之管柱層析法純化於減壓下將溶劑蒸餾去除而獲得之 殘渣，藉此獲得9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-(二甲胺基)-9H-嘌呤-8-甲腈(8.00mg，產率44.8%)。
ESI-MS(m/z)：575(M+1)
步驟4~6
使用步驟3中所獲得之9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-(二甲胺基)-9H-嘌呤-8-甲腈，以與參考例1.1之步驟3~5同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(8-氰基-6-(二甲胺基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-8)。
1H-NMR(CDCl3,500MHz)δ：8.15-8.12(1H,m),7.47-7.46(2H,m),7.36-7.34(4H,m),7.23-7.20(3H,m),6.79-6.77(4H,m),6.02-6.00(1H,m),5.52-5.37(1H,m),4.44-4.40(2H,m),4.01-3.30(19H,m),3.78-3.77(7H,m),2.58-2.42(2H,m),1.20-1.14(13H,m),0.77-0.73(9H,m),-0.10(-0.07)(3H,s),-0.31(-0.28)(3H,s).
實施例14
使用參考例8.1中所獲得之化合物am-8，以與實施例1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-12之siRNA。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6742.95，實測值6742.18
參考例9.0：化合物I-13
使用市售之1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)-6-碘嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(866mg，2.34mmol)，以與參考例1.0之步驟3~5同樣之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-碘-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲酯三乙胺(化 合物I-13)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：6.52(s,1H),5.92(d,J=3.3Hz,1H),4.69-4.60(m,1H),4.33(t,J=6.8Hz,1H),4.02-3.86(m,3H),3.07(q,J=7.3Hz,6H),1.15(t,J=7.3Hz,9H).
ESI-MS(m/z)：451(M+1)
參考例9.1：化合物am-9
使用市售之1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)-6-碘嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，以與參考例1.1同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(6-碘-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-9)。
實施例15
使用參考例9.1中所獲得之化合物am-9，以與實施例1同樣之方式合成反義鏈之5'末端具有化合物I-13之siRNA。
參考例10.0：化合物I-14 步驟1
使用市售之5-溴-1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(3.34g，10.3mmol)，以與參考例1.0之步驟3同樣之方式獲得5-溴-1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(羥基甲基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(2.58g，產率69%)。
ESI-MS(m/z)：363(M+1)
步驟2
將步驟1中所獲得之5-溴-1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(羥基甲基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(200mg，0.551mmol)、四(三苯基膦)鈀(63.6mg，0.055mmol)溶解 於1,4-二烷中，加入三丁基(2-吡啶基)錫(0.62mL，1.93mmol)，於110℃下徹夜攪拌。將反應液冷卻至室溫後，加入飽和碳酸氫鈉水溶液，使其通過Presep(註冊商標，矽藻土，顆粒狀TYPE M，4.5g/25mL)而進行過濾，並於減壓下將溶劑蒸餾去除。藉由氯仿/甲醇系之管柱層析法純化所得之殘渣，藉此獲得1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(羥基甲基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)-5-(吡啶-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(45.2mg，產率23%)。
ESI-MS(m/z)：362(M+1)
步驟3~4
使用步驟2中所獲得之1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(羥基甲基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)-5-(吡啶-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，以與參考例1.0之步驟4~5同樣之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(2,4-二側氧基-5-(吡啶-2-基)-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-14)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：8.66(s,1H),8.56(d,J=5.5Hz,1H),8.40(t,J=7.9Hz,1H),8.20(d,J=8.4Hz,1H),7.77(t,J=6.8Hz,1H),5.92(d,J=4.0Hz,1H),4.35(t,J=4.2Hz,1H),4.27-4.26(m,2H),4.15(dd,J=12.1,2.6Hz,1H),4.04(dd,J=13.0,5.7Hz,1H)
ESI-MS(m/z)：402(M+1)
參考例10.1：化合物am-10 步驟1
使用參考例10.0之步驟2中所獲得之1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(羥基甲基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)-5-(吡啶-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，以與參考例6.1之步驟1同樣之方式獲得1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)-5-(吡啶-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮。
步驟2
使用1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)-5-(吡啶-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，以與參考例1.1同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(2,4-二側氧基-5-(吡啶-2-基)-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-10)。
實施例16
使用參考例10.1中所獲得之化合物am-10，以與實施例1同樣之方式合成反義鏈之5'末端具有化合物I-14之siRNA。
參考例11.0：化合物I-15
使用2-(三正丁基錫烷基)唑，以與參考例10.0之步驟2~4同樣之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-二羥基-5-(5-(唑-2-基)-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-15)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：8.52(s,1H),7.84(s,1H),7.19(s,1H),5.93(d,J=4.9Hz,1H),4.36(t,J=4.9Hz,1H),4.28-4.24(m,2H),4.11(dq,J=11.7,2.0Hz,1H),4.03(dq,J=11.7,2.6Hz,1H).
ESI-MS(m/z)：392(M+1)
參考例11.1：化合物am-11
使用2-(三正丁基錫烷基)唑，以與參考例10.0之步驟2同樣之方式進行合成，使用所合成之1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(羥基甲基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)-5-(唑-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，以與參考例10.1同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(5-(唑-2-基)-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-11)。
實施例17
使用參考例11.1中所獲得之化合物am-11，以與實施例1同樣之方式合成反義鏈之5'末端具有化合物I-15之siRNA。
參考例12.0：化合物I-16 步驟1
使用市售之5-碘嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，以與參考例1.0之步驟1同樣之方式獲得二苯甲酸(2R,3R,4R,5R)-2-((苯甲醯基氧基)甲基)-5-(5-碘-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3,4-二酯。
ESI-MS(m/z)：683(M+1)
步驟2
於步驟1中所獲得之二苯甲酸(2R,3R,4R,5R)-2-((苯甲醯基氧基)甲基)-5-(5-碘-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3,4-二酯(200mg，0.293mmol)、(4-甲氧基苯基)硼酸(134.0mg，0.879mmol)、1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵-二氯化鈀(II)-二氯甲烷錯合物(23.9mg，0.029mmol)、2M碳酸銫水溶液(0.6mL)中加入1,4-二烷(3mL)，於120℃下攪拌1小時。將反應液冷卻至室溫後，加入飽和碳酸氫鈉水溶液，使其通過Presep(註冊商標，矽藻土，顆粒狀TYPE M，4.5g/25mL)而進行過濾，並於減壓下將溶劑蒸餾去除。藉由氯仿/甲醇系之管柱層析法純化所得之殘渣，藉此獲得二苯甲酸(2R,3R,4R,5R)-2-((苯甲醯基氧基)甲基)-5-(5-(4-甲氧基苯基)-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3,4-二酯(118mg，產率61%)。
ESI-MS(m/z)：663(M+1)
步驟3
使用步驟2中所獲得之二苯甲酸(2R,3R,4R,5R)-2-((苯甲醯基氧基)甲基)-5-(5-(4-甲氧基苯基)-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3,4-二酯，以與參考例1.0之步驟2~5同樣之方式獲得磷酸 ((2R,3S,4R,5R)-3,4-二羥基-5-(5-(4-甲氧基苯基)-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-16)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：7.77(s,1H),7.42(d,J=8.8Hz,2H),7.01(d,J=8.8Hz,2H),5.97(d,J=5.5Hz,1H),4.39(t,J=5.9Hz,1H),4.27(t,J=4.4Hz,1H),4.22-4.21(m,1H),4.04-4.02(m,2H),3.81(s,3H).
ESI-MS(m/z)：431(M+1)
參考例12.1：化合物am-12
使用參考例12.0之步驟2中所獲得之二苯甲酸(2R,3R,4R,5R)-2-((苯甲醯基氧基)甲基)-5-(5-(4-甲氧基苯基)-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3,4-二酯，以與參考例1.1同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(5-(4-甲氧基苯基)-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-12)。
實施例18
使用參考例12.1中所獲得之化合物am-12，以與實施例1同樣之方式合成反義鏈之5'末端具有化合物I-16之siRNA。
參考例13.0：化合物I-17 步驟1
使用參考例10.0之步驟1中所獲得之5-溴-1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(羥基甲基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，以與參考例1.0之步驟4同樣之方式獲得磷酸二第三丁酯((3aR,4R,6R,6aR)-6-(5-溴-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯。
ESI-MS(m/z)：555(M+1)
步驟2
將步驟1中所獲得之磷酸二第三丁酯((3aR,4R,6R,6aR)-6-(5-溴-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(200mg，0.360mmol)溶解於DMF(7mL)中，加入氰化鈉(88.0mg，1.801mmol)並於室溫下徹夜攪拌。於反應液中加入飽和碳酸氫鈉水溶液，以乙酸乙酯加以萃取，利用硫酸鈉進行乾燥。藉由庚烷/乙酸乙酯系之管柱層析法純化於減壓下將溶劑蒸餾去除而獲得之殘渣，藉此獲得磷酸二第三丁酯((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-氰基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(150mg，產率83%)。
ESI-MS(m/z)：502(M+1)
步驟3
使用步驟2所獲得之磷酸二第三丁酯((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-氰基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯，以與參考例1.0之步驟5同樣之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-氰基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-17)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：6.51(d,J=0.7Hz,1H),5.81(d,J=4.0Hz,1H),4.28(t,J=6.2Hz,1H),4.01-3.95(m,4H).
ESI-MS(m/z)：350(M+1)
參考例13.1：化合物am-13 步驟1~2
使用市售之5-溴-1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，以與參考例1.1之步驟1~2同樣之方式獲得5-溴-1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲 基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮。
ESI-MS(m/z)：577(M+1)
步驟3
使用步驟2中所獲得之5-溴-1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，以與參考例13.0之步驟2同樣之方式獲得3-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-2,6-二側氧基-1,2,3,6-四氫嘧啶-4-甲腈。
ESI-MS(m/z)：524(M+1)
步驟4
使用步驟3中所獲得之3-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-2,6-二側氧基-1,2,3,6-四氫嘧啶-4-甲腈，以與參考例1.1之步驟3~5同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(6-氰基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-13)。
1H-NMR(CDCl3,500MHz)δ：7.47-6.78(m,13H),6.27(6.26)(s,1H),5.84(m,1H),4.95(4.89)(m,1H),4.35-4.19(m,2H),3.96-3.27(m,12H),2.31(2.59)(m,2H),1.19-1.06(m,12H),0.87(0.88)(s,9H),0.06(0.08)(s,3H),0.01(s,3H).
實施例19
使用參考例13.1中所獲得之化合物am-13，以與實施例1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xu之反義鏈之5'末端之X具有化合物 I-17之siRNA。
MALDI-TOF/MS(反義鏈)：理論值6691.86(M-H)，實測值6691.25
參考例14.0：化合物I-18 步驟1
將參考例6.0之步驟2中所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-二甲基-6-(6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(249mg，0.631mmol)溶解於氯仿(6.00mL)中，於冰浴冷卻下加入咪唑(86mg，1.26mmol)、第三丁基二甲基氯矽烷(105mg，0.694mmol)，於室溫下攪拌3小時。其後，於冰浴冷卻下追加咪唑(86mg，1.26mmol)、第三丁基二甲基氯矽烷(105mg，0.694mmol)，於室溫下進一步攪拌1小時。藉由庚烷/乙酸乙酯系之管柱層析法純化於減壓下將溶劑蒸餾去除而獲得之殘渣，藉此獲得9-((3aR,4R,6R,6aR)-6-((第三丁基二甲基矽烷基氧基)甲基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤(310mg，97.0%)。
ESI-MS(m/z)：509(M+1)
步驟2
將步驟1中所獲得之9-((3aR,4R,6R,6aR)-6-((第三丁基二甲基矽烷基氧基)甲基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤(200mg，0.393mmol)溶解於THF(3.00mL)中，於-78℃下加入二異丙基醯胺鋰(0.393mL，0.786mmol)並攪拌30分鐘後，於-78℃下加入將1,2-二溴-1,1,2,2-四氯乙烷(384mg，1.18mmol)溶解於THF(2.00mL)中而獲得之溶液。其後，一面攪拌一面歷經1小時升溫至室溫。於反應混合物中加入飽和碳酸氫鈉水溶液，以乙酸乙酯加以萃取後，藉由無水硫酸鈉對有機層進行乾燥。藉由庚烷/乙酸乙酯系之管柱層析法純化於減壓下將溶劑蒸餾去除而獲得之殘 渣，藉此獲得8-溴-9-((3aR,4R,6R,6aR)-6-((第三丁基二甲基矽烷基氧基)甲基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤(198mg，86.0%)。
ESI-MS(m/z)：587(M+1)
步驟3
將步驟2中所獲得之8-溴-9-((3aR,4R,6R,6aR)-6-((第三丁基二甲基矽烷基氧基)甲基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤(198mg，0.337mmol)溶解於三氟乙酸/水(1：1)(2mL)中，於室溫下攪拌2小時。藉由庚烷/乙酸乙酯系之管柱層析法純化於減壓下將溶劑蒸餾去除而獲得之殘渣，藉此獲得(2R,3R,4S,5R)-2-(8-溴-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)-5-(羥基甲基)四氫呋喃-3,4-二醇(140mg，96.0%)。
ESI-MS(m/z)：433(M+1)
步驟4
使用步驟3中所獲得之(2R,3R,4S,5R)-2-(8-溴-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)-5-(羥基甲基)四氫呋喃-3,4-二醇(140mg，0.323mmol)，以與參考例1.0之步驟3同樣之方式獲得((3aR,4R,6R,6aR)-6-(8-溴-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(66.0mg，43.2%)。
ESI-MS(m/z)：473(M+1)
步驟5~6
使用步驟4中所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(8-溴-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(65.0mg，0.137mmol)，以與參考例6.0之步驟3~4同樣之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(8-溴-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-18，68.5mg，75.0%)。
1H-NMR(D2O,400MHz)δ：8.45(1H,s),7.54(1H,d,J=15.6Hz),7.24-7.17(2H,m),7.11-7.00(3H,m),6.95(1H,d,J=15.6Hz),5.96(1H,d,J=4.9Hz),5.18(1H,dd,J=5.4,5.4Hz),4.54(1H,dd,J=5.4,5.4Hz),4.19-4.13(1H,m),4.12-3.95(2H,m).
ESI-MS(m/z)：513(M+1)
參考例14.1：化合物am-14
使用參考例14.0之步驟3中所獲得之(2R,3R,4S,5R)-2-(8-溴-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)-5-(羥基甲基)四氫呋喃-3,4-二醇，以與參考例1.1同樣之方式獲得3-(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(8-溴-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-14)。
實施例20
使用參考例14.1中所獲得之化合物am-14，以與實施例1同樣之方式合成反義鏈之5'末端具有化合物I-18之siRNA。
參考例15.0：化合物I-19
使用市售之5,6-二甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，以與參考例1.0同樣之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(5,6-二甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫噻吩并[2,3-d]嘧啶-1(2H)-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲基(化合物I-19)三乙基銨鹽。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：6.10(d,J=5.5Hz,1H),4.75-4.73(m,1H),4.40(t,J=5.7Hz,1H),4.24-4.14(m,3H),2.32(s,3H),2.31(s,3H).
ESI-MS(m/z)：411(M+1)
參考例15.1：化合物am-15
使用市售之5,6-二甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，以與 參考例1.1同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)-5-(5,6-二甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫噻吩并[2,3-d]嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-15)。
1H-NMR(CDCl3,500MHz)δ：7.62(s,1H),7.50-6.78(m,13H),5.98(m,1H),4.92(m,1H),4.34-4.25(m,2H),4.00-3.34(m,12H),2.29(2.64)(m,2H),2.35(s,3H),2.13(s,3H),1.23-1.03(m,12H),0.83(0.84)(s,9H),0.02(d,J=6.0Hz,3H),-0.10(d,J=5.0Hz,3H).
實施例21
使用參考例15.1中所獲得之化合物am-15，以與實施例1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xu之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-19之siRNA(稱為二甲基噻吩基dU)。
MALDI-TOF/MS(反義鏈)：理論值6750.99(M-H)，實測值6754.34
參考例16.0：化合物I-20 步驟1
使用參考例6.0之步驟1中所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(100mg，0.306mmol)及3-異丙基苯基硼酸(100mg，0.612mmol)，以與參考例6.0之步驟2同樣之方式獲得((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-異丙基苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(167mg，133%)。
ESI-MS(m/z)：411(M+1)
步驟2
使用步驟1中所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-異丙基苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(126mg，0.307mmol)，以與參考例6.0之步驟3同樣之方式獲得磷酸 二第三丁酯((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-異丙基苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(96.2mg，52.0%)。
ESI-MS(m/z)：603(M+1)
步驟3
將步驟1中所獲得之磷酸二第三丁酯((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-異丙基苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(96.0mg，0.159mmol)溶解於三氟乙酸/水(1：1)(2mL)中，於室溫下攪拌3小時。藉由分取HPLC(溶離液，0.01mmol/L，乙酸-三乙胺緩衝液(pH值為6.5)/乙腈系)純化於減壓下將溶劑蒸餾去除而獲得之殘渣，藉此獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-二羥基-5-(6-(3-異丙基苯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-2-基)甲基(化合物I-20)三乙基銨鹽(70.0mg，80.0%)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：8.72(2H,d,J=7.0Hz),7.97(1H,s),7.92-7.83(1H,m),7.43-7.33(2H,m),6.14(1H,d,J=5.5Hz),4.73-4.64(14H,m),4.44-4.38(1H,m),4.32-4.25(1H,m),4.08-3.93(2H,m),3.06(11H,q,J=7.3Hz),2.94-2.81(1H,m),1.20-1.08(22H,m).
ESI-MS(m/z)：451(M+1)
參考例16.1：化合物am-16
使用參考例16.0之步驟1中所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-異丙基苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇，以與參考例6.1同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)-5-(6-(3-異丙基苯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-16)。
實施例22
使用參考例16.1中所獲得之化合物am-16，以與實施例1同樣之方式合成反義鏈之5'末端具有化合物I-20之siRNA。
參考例17.0：化合物I-21 步驟1
使用參考例6.0之步驟1中所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(100mg，0.306mmol)及2-萘硼酸(105mg，0.612mmol)，以與參考例6.0之步驟2同樣之方式獲得((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-二甲基-6-(6-(萘-2-基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(147mg，114%)。
ESI-MS(m/z)：419(M+1)
步驟2
使用步驟1中所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-二甲基-6-(6-(萘-2-基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(128mg，0.306mmol)，以與參考例6.0之步驟3同樣之方式獲得磷酸二第三丁酯((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-二甲基-6-(6-(萘-2-基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(90.0mg，48.2%)。
ESI-MS(m/z)：611(M+1)
步驟3
使用步驟2中所獲得之磷酸二第三丁酯((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-二甲基-6-(6-(萘-2-基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(77.0mg，0.126mmol)，以與參考例1.0之步驟5同樣之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-二羥基-5-(6-(萘-2-基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-2-基)甲基(化合物I-21)三乙基銨鹽(20.0mg，29.6%)。
1H-NMR(D2O,400MHz)δ：8.30(1H,s),8.05(1H,s),7.80(1H,s),7.55-7.40(1H,m),7.27-6.92(5H,m),5.73(1H,s),4.52-4.18(3H, m),4.15-3.92(2H,m),3.06-2.96(6H,m),1.16-1.04(9H,m).
ESI-MS(m/z)：459(M+1)
參考例17.1：化合物am-17 步驟1~2
使用市售之(2R,3R,4S,5R)-2-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-5-(羥基甲基)四氫呋喃-3,4-二醇，以與參考例1.1之步驟1~2同樣之方式獲得6-氯-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤。
ESI-MS(m/z)：541(M+1)
步驟3
使用步驟2中所獲得之6-氯-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤，以與參考例17.0之步驟1同樣之方式獲得9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-(萘-2-基)-9H-嘌呤。
ESI-MS(m/z)：633(M+1)
步驟4~6
使用步驟3中所獲得之9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-(萘-2-基)-9H-嘌呤，以與參考例1.1之步驟3~5同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)-5-(6-(萘-2-基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-17)。
1H-NMR(CDCl3,500MHz)δ：9.43(m,1H),8.96(m,1H),8.88(m,1H),8.40(m,1H),8.08(m,1H),8.02(m,1H),7.91(m,1H),7.59-7.52(m,2H),7.52-6.81(m,13H),6.19(6.13)(m,1H),5.11(m,1H), 4.50-4.38(m,2H),4.02-3.32(m,12H),2.67(2.32)(m,2H),1.23-1.05(m,12H),0.76(0.77)(s,9H),-0.03(0.00)(s,3H),-0.19(-0.17)(s,3H).
實施例23
使用參考例17.1中所獲得之化合物am-17，以與實施例1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-21之siRNA(稱為6-萘-2-基-dPu)。
MALDI-TOF/MS(反義鏈)：理論值6801.03(M-H)，實測值6805.40
參考例18.0：化合物I-22 步驟1
使用參考例6.0之步驟1中所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(200mg，0.612mmol)及3-甲醯基苯基硼酸(184mg，1.22mmol)，以與參考例6.0之步驟2同樣之方式獲得((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-甲醯基苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(216mg，89%)。
ESI-MS(m/z)：397(M+1)
步驟2
使用步驟1中所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-甲醯基苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(215mg，0.542mmol)，以與參考例6.0之步驟3同樣之方式獲得磷酸二第三丁酯((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-甲醯基苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(35.0mg，11.0%)。
ESI-MS(m/z)：589(M+1)
步驟3
使用步驟1中所獲得之磷酸二第三丁酯((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3- 甲醯基苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(33.0mg，0.0560mmol)，以與參考例1.0之步驟5同樣之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-二羥基-5-(6-(3-甲醯基苯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-22，20.0mg，29.6%)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：9.93(1H,s),8.88(1H,s),8.76(1H,s),8.67-8.60(1H,m),8.47-8.40(1H,m),8.06-7.99(1H,m),7.74-7.66(1H,m),6.20(1H,d,J=5.5Hz),4.76-4.68(2H,m),4.46-4.41(1H,m),4.34-4.29(1H,m),4.12-4.00(2H,m).
ESI-MS(m/z)：437(M+1)
參考例18.1：化合物am-18
使用參考例18.0之步驟1中所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-甲醯基苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇，以與參考例6.1同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)-5-(6-(3-甲醯基苯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-18)。
參考例18.1：化合物am-18 步驟1
使用參考例17.1之步驟2中所獲得之6-氯-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤(1.00g，1.848mmol)，以與參考例18.0之步驟1同樣之方式獲得9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-(3-甲醯基苯基)-9H-嘌呤(826mg，73.2%)。
步驟2
將步驟1中所獲得之9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三 丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-(3-甲醯基苯基)-9H-嘌呤(720mg，1.179mmol)溶解於二氯甲烷(15mL)中，於冰浴冷卻下加入1,3-丙二醇(0.427mL，5.89mmol)、原甲酸三乙酯(0.294mL，1.768mmol)、及四氯化鈦之二氯甲烷溶液(1mol/L)(0.589mL，0.589mmol)，於室溫下攪拌4小時。於反應混合物中加入飽和碳酸氫鈉水溶液，以乙酸乙酯加以萃取後，藉由飽和食鹽水洗淨有機層，並藉由無水硫酸鎂進行乾燥。於減壓下將溶劑蒸餾去除，藉由乙酸乙酯/庚烷系之矽膠管柱層析法對殘渣進行純化，藉此獲得6-(3-(1,3-二烷-2-基)苯基)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤(690mg，88.0%)。
步驟3~5
使用步驟2中所獲得之6-(3-(1,3-二烷-2-基)苯基)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤，以與參考例1.1之步驟3~5同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-5-(6-(3-(1,3-二烷-2-基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-18)。
實施例24-0
使用參考例18.1中所獲得之化合物am-18，以與實施例1同樣之方式合成反義鏈之5'末端具有化合物I-22之siRNA。
實施例24
使用參考例18.1中所獲得之化合物am-18，與實施例1同樣地固相合成寡核酸後，使用80%乙酸(0.500mL)，於室溫下進行1小時之脫保護。於減壓下進行濃縮後，與實施例1同樣地進行退火，藉此合成如 下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-22之siRNA(稱為6-(間甲醯基)苯基-Pu)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6778.98，實測值6778.23
參考例19.0：化合物I-23
使用市售之6-硝基-1H-喹唑啉-2,4-二酮，以與參考例1.0同樣之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-二羥基-5-(6-硝基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)四氫呋喃-2-基)甲基(化合物I-23)三乙基銨鹽。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：8.82(d,J=2.9Hz,1H),8.49(dd,J=9.3,2.4Hz,1H),7.89(d,J=9.5Hz,1H),6.27(d,J=5.9Hz,1H),4.73(t,J=6.2Hz,1H),4.42(t,J=5.9Hz,1H),4.09-4.04(m,3H),3.08(q,J=7.3Hz,6H),1.16(t,J=7.3Hz,9H).
ESI-MS(m/z)：420(M+1)
參考例19.1：化合物am-19
使用市售之6-硝基-1H-喹唑啉-2,4-二酮，以與參考例1.1同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)-5-(6-硝基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-19)。
實施例25
使用參考例19.1中所獲得之化合物am-19，以與實施例1同樣之方式合成反義鏈之5'末端具有化合物I-23之siRNA。
參考例20.0：化合物I-24 步驟1~4
使用市售之5,6-二甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，以與參考例1之步驟1~4同樣之方式獲得磷酸二第三丁酯((3aR,4R,6R,6aR)-6-(5,6-二甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4- d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯。
ESI-MS(m/z)：505(M+1)
步驟5
將步驟4中所獲得之磷酸二第三丁酯((3aR,4R,6R,6aR)-6-(5,6-二甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(200mg，0.396mmol)溶解於1,4-二烷(4.00mL)中，加入二氧化硒(440mg，3.96mmol)，並於加熱回流下進行徹夜攪拌。對反應液進行矽藻土過濾，藉由庚烷/乙酸乙酯系之管柱層析法純化於減壓下將溶劑蒸餾去除而獲得之殘渣，藉此獲得磷酸二第三丁酯((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(羥基甲基)-5-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(38.6mg，產率19%)。
ESI-MS(m/z)：521(M+1)
步驟6
將步驟5中所獲得之磷酸二第三丁酯((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(羥基甲基)-5-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(38.6mg，0.074mmol)溶解於乙腈(1.00mL)中，加入吡啶(0.06mL，0.742mmol)、戴斯-馬丁過碘烷(62.9mg，0.148mmol)，於60℃下進行徹夜攪拌。將反應液冷卻至室溫後，加入飽和碳酸氫鈉水溶液，使其通過Presep(註冊商標，矽藻土，顆粒狀TYPE M，4.5g/25mL)而進行過濾，並於減壓下將溶劑蒸餾去除。藉由製備薄層層析法(己烷/乙酸乙酯=20/80)對殘渣進行純化，藉此獲得磷酸二第三丁酯((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(羥基甲基)-5-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(32.8mg，產率85%)。
ESI-MS(m/z)：519(M+1)
步驟7
將步驟6中所獲得之磷酸二第三丁酯((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(羥基甲基)-5-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(46.0mg，0.089mmol)溶解於THF(1.00mL)中，加入羥胺鹽酸鹽(30.8mg，0.444mmol)，於60℃下攪拌2小時。將反應液冷卻至室溫後，加入飽和碳酸氫鈉水溶液，使其通過Presep(註冊商標，矽藻土，顆粒狀TYPE M，4.5g/25mL)而進行過濾，並於減壓下將溶劑蒸餾去除。藉由製備薄層層析法(氯仿/甲醇=90/10)對殘渣進行純化，藉此獲得磷酸二第三丁酯((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-((E)-(羥基亞胺基)甲基)-5-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(33.7mg，產率71%)。
ESI-MS(m/z)：534(M+1)
步驟8
將三苯基氧化膦(1.76mg，0.006mmol)溶解於乙酸乙酯(1.00mL)中，加入乙二醯氯(0.017mL，0.19mmol)，並於室溫下攪拌5分鐘而製備反應液。將步驟7中所獲得之磷酸二第三丁酯((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-((E)-(羥基亞胺基)甲基)-5-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(33.7mg，0.063mmol)溶解於乙酸乙酯(1.00mL)中，緩慢加入上述反應液，於室溫下徹夜攪拌。使將溶劑蒸餾去除而獲得之殘渣溶解於三氟乙酸/水(1：1)(2mL)中，於室溫下攪拌2小時。於減壓下將溶劑蒸餾去除後，加入乙酸-三乙胺緩衝液(pH值為6.5)(2mL)，再次於減壓下將溶劑蒸餾去除。將所得之殘渣溶解於乙醇中，並加入乙酸乙酯，濾取析出物，藉此獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-氰基-5-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲基(化合物I- 24)三乙基銨鹽(1.6mg(2次之量)，產率74%)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：5.96(d,J=4.0Hz,1H),4.41(t,J=6.4Hz,1H),4.19-4.06(m,3H),3.21(q,J=7.2Hz,6H),2.19(s,3H),1.28(t,J=7.5Hz,9H).
ESI-MS(m/z)：404(M+1)
參考例20.1：化合物am-20 步驟1
使用參考例20.0之步驟1中所獲得之苯甲酸(2R,3R,4R,5R)-2-(苯甲醯基氧基甲基)-5-(5,6-二甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3,4-二酯，以與參考例20.0之步驟5同樣之方式獲得苯甲酸(2R,3R,4R,5R)-2-(苯甲醯基氧基甲基)-5-(6-(羥基甲基)-5-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3,4-二酯。
ESI-MS(m/z)：601(M+1)
步驟2
使用步驟1中所獲得之苯甲酸(2R,3R,4R,5R)-2-(苯甲醯基氧基甲基)-5-(6-(羥基甲基)-5-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3,4-二酯，以與參考例20.0之步驟6同樣之方式獲得苯甲酸(2R,3R,4R,5R)-2-(苯甲醯基氧基甲基)-5-(6-甲醯基-5-甲基-2,4二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3,4-二酯。
ESI-MS(m/z)：599(M+1)
步驟3
使用步驟2中所獲得之苯甲酸(2R,3R,4R,5R)-2-(苯甲醯基氧基甲基)-5-(6-甲醯基-5-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3,4-二酯，以與參考例20.0之步驟7同樣之方式獲得苯甲酸(2R,3R,4R,5R)-2-(苯甲醯基氧基甲基)-5-(6-((E)-(羥基亞胺基)甲基)-5-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3,4-二酯。
ESI-MS(m/z)：614(M+1)
步驟4
將三苯基氧化膦(11.0mg，0.039mmol)溶解於乙酸乙酯(5.00mL)中，加入乙二醯氯(0.104mL，1.183mmol)，並於室溫下攪拌5分鐘而製備反應液。將步驟3中所獲得之苯甲酸(2R,3R,4R,5R)-2-(苯甲醯基氧基甲基)-5-(6-((E)-(羥基亞胺基)甲基)-5-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3,4-二酯(242mg，0.394mmol)溶解於乙酸乙酯(5.00mL)中，緩慢加入上述反應液，於室溫下攪拌2小時。藉由庚烷/乙酸乙酯系之管柱層析法純化於減壓下將溶劑蒸餾去除而獲得之殘渣，藉此獲得苯甲酸(2R,3R,4R,5R)-2-(苯甲醯基氧基甲基)-5-(6-氰基-5-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3,4-二酯(207mg，產率88%)。
ESI-MS(m/z)：596(M+1)
步驟5
使用步驟4中所獲得之苯甲酸(2R,3R,4R,5R)-2-(苯甲醯基氧基甲基)-5-(6-氰基-5-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3,4-二酯，以與參考例1.0之步驟2同樣之方式獲得3-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)-5-甲基-2,6-二側氧基-1,2,3,6-四氫嘧啶-4-甲腈。
ESI-MS(m/z)：284(M+1)
步驟6~10
使用步驟5中所獲得之3-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)-5-甲基-2,6-二側氧基-1,2,3,6-四氫嘧啶-4-甲腈，以與參考例1.1之步驟1~5同樣之方式獲得(2R,3R,4S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)-5-(6-氰基-5-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙 基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-20)。
實施例26
使用參考例20.1中所獲得之化合物am-20，以與實施例1同樣之方式合成反義鏈之5'末端具有化合物I-24之siRNA。
參考例21.0：化合物I-25 步驟1
使用參考例6.0之步驟1中所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(100mg，0.306mmol)及萘-1-基硼酸(105mg，0.612mmol)，以與參考例6.0之步驟2同樣之方式獲得((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-二甲基-6-(6-(萘-1-基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(150mg，117%)。
ESI-MS(m/z)：419(M+1)
步驟2
使用步驟1中所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-二甲基-6-(6-(萘-1-基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(128mg，0.306mmol)，以與參考例6.0之步驟3同樣之方式獲得磷酸二第三丁酯((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-二甲基-6-(6-(萘-1-基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(70.0mg，37.5%)。
ESI-MS(m/z)：611(M+1)
步驟3
使用步驟2中所獲得之磷酸二第三丁酯((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-二甲基-6-(6-(萘-1-基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(77.0mg，0.126mmol)，以與參考例16.0之步驟3同樣之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-二羥基-5-(6-(萘-1-基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-2-基)甲基(化合物I-25)三乙基銨鹽(10.8mg，15.3%)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：8.87(1H,s),8.60(1H,s),8.07-7.84(2H,m),7.73-7.60(2H,m),7.58-7.40(2H,m),7.38-7.28(1H,m),6.21(1H,d,J=5.5Hz),4.75-4.66(1H,m),4.45-4.38(1H,m),4.35-4.28(1H,m),4.10-3.98(2H,m),3.05(6H,q,J=7.3Hz),1.13(9H,t,J=7.3Hz).
ESI-MS(m/z)：459(M+1)
參考例21.1：化合物am-21 步驟1
使用參考例17.1之步驟2中所獲得之6-氯-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤，以與參考例21.0之步驟1同樣之方式獲得9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-(萘-1-基)-9H-嘌呤。
ESI-MS(m/z)：633(M+1)
步驟2~4
使用步驟1中所獲得之9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-(萘-1-基)-9H-嘌呤，以與參考例1.1之步驟3~5同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)-5-(6-(萘-1-基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-21)。
1H-NMR(CDCl3,500MHz)δ：9.04(m,1H),8.34(m,1H),8.20(m,1H),8.04-7.91(m,2H),7.93(m,1H),7.64(m,1H),7.54-7.45(m,4H),7.39-6.79(m,11H),6.21(6.15)(m,1H),5.16(m,1H),4.51-4.39(m,2H),4.04-3.32(m,12H),2.68(2.32)(m,2H),1.25-1.06(m,12H), 0.76(0.77)(s,9H),-0.01(0.01)(s,3H),-0.16(-0.15)(s,3H).
實施例27
使用參考例21.1中所獲得之化合物am-21，以與實施例1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-25之siRNA(6-萘基-1-基-dPu)。
MALDI-TOF/MS(反義鏈)：理論值6801.03(M-H)，實測值6800.94
參考例22.0：化合物I-26 步驟1
使用參考例6.0之步驟1中所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(100mg，0.306mmol)及(1,1'-聯苯)-3-基硼酸(121mg，0.612mmol)，以與參考例6.0之步驟2同樣之方式獲得((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(聯苯-3-基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(130mg，95%)。
ESI-MS(m/z)：445(M+1)
步驟2
使用步驟1中所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(聯苯-3-基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(125mg，0.281mmol)，以與參考例6.0之步驟3同樣之方式獲得磷酸二第三丁酯((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(聯苯-3-基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(107mg，59.8%)。
ESI-MS(m/z)：637(M+1)
步驟3
使用步驟2中所獲得之磷酸二第三丁酯((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(聯苯-3-基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊 烯-4-基)甲酯(100mg，0.157mmol)，以與參考例1.0之步驟5同樣之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-(聯苯-3-基)-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-26)(47.0mg，61.8%)。
1H-NMR(DMSO-d 6,300MHz)δ：9.14(1H,s),9.06(1H,s),8.89(1H,s),8.82(1H,d,J=7.7Hz),7.89(1H,d,J=7.7Hz),7.79-7.68(3H,m),7.58-7.50(2H,m),7.47-7.40(1H,m),6.15(1H,d,J=5.5Hz),4.72-4.65(1H,m),4.27-4.22(1H,m),4.20-3.98(3H,m).
ESI-MS(m/z)：485(M+1)
參考例22.1：化合物am-22 步驟1
使用參考例17.1之步驟2中所獲得之6-氯-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤(300mg，0.554mmol)，以與參考例22.0之步驟1同樣之方式獲得6-(聯苯-3-基)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤(239mg，65.4%)。
步驟2~4
使用步驟1中所獲得之6-(聯苯-3-基)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤，以與參考例1.1之步驟3~5同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-5-(6-(聯苯-3-基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-22)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：9.05-9.05(m,1H),8.94-8.92(m,1H),8.82-8.80(m,1H),8.36-8.35(m,1H),7.77-7.74(m,3H),7.65-7.63(m,1H),7.49-7.47(m,4H),7.38-7.36(m,3H),7.30-7.21(m,5H),6.83- 6.81(m,4H),6.17-6.12(m,1H),5.14-5.13(m,1H),4.45-4.41(m,2H),3.99-3.97(m,1H),3.77-3.77(m,6H),3.66-3.57(m,4H),3.37-3.35(m,1H),2.66-2.65(m,1H),2.32-2.31(m,1H),1.27-1.06(m,12H),0.86-0.76(m,9H),-0.04(-0.01)(s,3H),-0.21(-0.19)(s,3H).
實施例28
使用參考例22.1中所獲得之化合物am-22，以與實施例1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-26之siRNA。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6827.06，實測值6826.60
參考例23.0：化合物I-27 步驟1
使用參考例6.0之步驟1中所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(100mg，0.306mmol)及(3-胺基苯基)硼酸(84mg，0.612mmol)，以與參考例6.0之步驟2同樣之方式獲得((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-胺基苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(77.2mg，65.8%)。
ESI-MS(m/z)：384(M+1)
步驟2
使用步驟1中所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-胺基苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(77.0mg，0.201mmol)，以與參考例6.0之步驟3同樣之方式獲得磷酸二第三丁酯((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-胺基苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(38.4mg，33.2%)。
ESI-MS(m/z)：576(M+1)
步驟3
使用步驟2中所獲得之磷酸二第三丁酯((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-胺基苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(38.0mg，0.0660mmol)，以與參考例1.0之步驟5同樣之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-(3-胺基苯基)-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-27)(13.0mg，43.3%)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：8.82(1H,s),8.73(1H,s),8.22-8.15(2H,m),7.66-7.58(1H,m),7.55-7.48(1H,m),6.16(1H,d,J=5.5Hz),4.72-4.65(1H,m),4.45-4.38(1H,m),4.35-4.26(1H,m),4.14-3.98(2H,m).
ESI-MS(m/z)：424(M+1)
參考例23.1：化合物am-23 步驟1
使用參考例17.1之步驟2中所獲得之6-氯-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤，以與參考例23.0之步驟1同樣之方式獲得6-(3-胺基苯基)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤。
步驟2~4
使用步驟1中所獲得之9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-(3-胺基苯基)-9H-嘌呤，以與參考例1.1之步驟3~5同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-5-(6-(3-胺基苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-23)。
參考例23.1：化合物am-23 步驟1
使用參考例17.1之步驟2中所獲得之6-氯-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤(1.00g，1.85mmol)及3-胺基苯基硼酸，以與參考例6.0之步驟2同樣之方式獲得6-(3-胺基苯基)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤(622mg，56.3%)。
步驟2
將步驟1中所獲得之6-(3-胺基苯基)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤(590mg，0.987mmol)溶解於DMF(10mL)中，加入N,N-二甲基甲醯胺二甲基縮醛(1.32mL，9.87mmol)，於60℃下攪拌21小時。於反應混合物中加入飽和碳酸氫鈉水溶液，以乙酸乙酯加以萃取後，藉由飽和食鹽水洗淨有機層，並藉由無水硫酸鎂進行乾燥。於減壓下將溶劑蒸餾去除，藉由乙酸乙酯/庚烷系之矽膠管柱層析法對殘渣進行純化，藉此獲得9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-(3-(((二甲胺基)亞甲基)胺基)苯基)-9H-嘌呤(514mg，80.0%)。
步驟3~5
使用步驟2中所獲得之9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-(3-(((二甲胺基)亞甲基)胺基)苯基)-9H-嘌呤，以與參考例1.1之步驟3~5同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基) 甲氧基)甲基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)-5-(6-(3-(((二甲胺基)亞甲基)胺基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-23)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.90,8.88(1H,2 s),8.52-8.46(1H,m),8.36-8.29(2H,m),7.68(1H,s),7.52-7.42(3H,m),7.41-7.33(4H,m),7.32-7.14(4H,m),6.85-6.78(4H,m),6.17-6.08(1H,m),5.16-5.09(1H,m),4.49-4.35(2H,m),4.03-3.85(1H,m),3.76(6H,s),3.70-3.53(4H,m),3.38-3.27(1H,m),3.06(6H,s),2.70-2.62(1H,m),2.33-2.27(1H,m),1.24-1.02(12H,m),0.74,0.72(9H,2 s),-0.02,-0.06,-0.21,-0.23(6H,4 s).
實施例29-0
使用參考例23.1中所獲得之化合物am-23，以與實施例1同樣之方式合成反義鏈之5'末端具有化合物I-27之siRNA。
實施例29
使用參考例23.1中所獲得之化合物am-23，以與實施例1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-27之siRNA。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6765.98，實測值6766.80
參考例24.0：化合物I-28 步驟1
使用參考例6.0之步驟1中所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(100mg，0.306mmol)及(3-嗎啉基苯基)硼酸(127mg，0.612mmol)，以與參考例6.0之步驟2同樣之方式獲得((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-二甲基-6-(6-(3-嗎啉基苯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(127mg，92%)。
ESI-MS(m/z)：454(M+1)
步驟2
使用步驟1中所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-二甲基-6-(6-(3-嗎啉基苯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(120mg，0.265mmol)，以與參考例6.0之步驟3同樣之方式獲得磷酸二第三丁酯((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-二甲基-6-(6-(3-嗎啉基苯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)m甲酯(65.0mg，38.0%)。
ESI-MS(m/z)：646(M+1)
步驟3
使用步驟2中所獲得之磷酸二第三丁酯((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-二甲基-6-(6-(3-嗎啉基苯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(63.0mg，0.0980mmol)，以與參考例16.0之步驟3同樣之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-二羥基-5-(6-(3-嗎啉基苯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-2-基)甲基(化合物I-28)三乙基銨鹽(9.00mg，15.5%)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：8.83(1H,s),8.72(1H,s),7.85-7.75(2H,m),7.52-7.44(1H,m),7.28-7.20(1H,m),6.21-6.19(1H,m),4.76-4.68(1H,m),4.45-4.40(1H,m),4.34-4.28(1H,m),4.06(2H,s),3.88-3.80(4H,m),3.23-3.15(4H,m),3.08(6H,q,J=7.3Hz),1.16(9H,t,J=7.3Hz).
ESI-MS(m/z)：494(M+1)
參考例24.1：化合物am-24 步驟1
使用參考例17.1之步驟2中所獲得之6-氯-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2- d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤，以與參考例24.0之步驟1同樣之方式獲得9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-(3-嗎啉基苯基)-9H-嘌呤。
步驟2~4
使用步驟1中所獲得之9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-(3-嗎啉基苯基)-9H-嘌呤，以與參考例1.1之步驟3~5同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)-5-(6-(3-嗎啉基苯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-24)。
實施例30
使用參考例24.1中所獲得之化合物am-24，以與實施例1同樣之方式合成反義鏈之5'末端具有化合物I-28之siRNA。
參考例25.0：化合物I-29 步驟1
使用參考例6.0之步驟1中所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(100mg，0.306mmol)及(3-(苄氧基)苯基)硼酸(140mg，0.612mmol)，以與參考例6.0之步驟2同樣之方式獲得((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-(苄氧基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(180mg，130%)。
ESI-MS(m/z)：475(M+1)
步驟2
使用步驟1中所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-(苄氧基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基) 甲醇(140mg，0.295mmol)，以與參考例6.0之步驟3同樣之方式獲得磷酸二第三丁酯((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-(苄氧基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(95.0mg，48.3%)。
ESI-MS(m/z)：667(M+1)
步驟3
使用步驟2中所獲得之磷酸二第三丁酯((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-(苄氧基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(95.0mg，0.142mmol)，以與參考例16.0之步驟3同樣之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-(3-(苄氧基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲基(化合物I-29)三乙基銨鹽(32.0mg，36.5%)。
1H-NMR(D2O,400MHz)δ：8.63(1H,s),8.59(1H,s),7.67-7.55(2H,m),7.30-7.16(6H,m),6.94-6.88(1H,m),6.06(1H,d,J=5.9Hz),4.88(2H,s),4.71-4.62(1H,m),4.39-4.34(1H,m),4.28-4.22(1H,m),4.06-3.95(2H,m),3.14-2.95(6H,q,J=7.3Hz),1.12(9H,t,J=7.3Hz).
ESI-MS(m/z)：515(M+1)
參考例25.1-A：化合物am-25 步驟1
使用參考例17.1之步驟2中所獲得之6-氯-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤，以與參考例25.0之步驟1同樣之方式獲得6-(3-(苄氧基)苯基)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤。
步驟2~4
使用步驟1中所獲得之6-(3-(苄氧基)苯基)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤，以與參考例1.1之步驟3~5同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-5-(6-(3-(苄氧基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-25)。
參考例25.1：化合物am-25 步驟1
使用參考例17.1之步驟2中所獲得之6-氯-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤(300mg，0.554mmol)及3-苄氧基苯基硼酸，以與參考例6.0之步驟2同樣之方式獲得6-(3-(苄氧基)苯基)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤(284mg，74.4%)。
步驟2~4
使用步驟1中所獲得之6-(3-(苄氧基)苯基)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤，以與參考例1.1之步驟3~5同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-5-(6-(3-(苄氧基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(0.35g，98%)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.91-8.90(1H,m),8.49-8.45(2H,m),8.35-8.34(1H,m),7.50-7.47(5H,m),7.40-7.20(10H,m),7.16-7.14(1H,m),6.83-6.81(4H,m),6.16-6.11(1H,m),5.21(2H,s),5.13-5.11 (1H,m),4.44-4.41(2H,m),3.99-3.31(12H,m),2.69-2.29(2H,m),1.22-1.05(12H,m),0.82-0.77(9H,m),-0.04 - -0.04(3H,m),-0.12 - -0.21(3H,m).
實施例31-0
使用參考例25.1中所獲得之化合物am-25，以與實施例1同樣之方式合成反義鏈之5'末端具有化合物I-29之siRNA。
實施例31
使用參考例25.1中所獲得之化合物am-25，以與實施例1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-29之siRNA(稱為6-(3-苄氧基)苯基-Pu)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6857.09，實測值6857.18
參考例26.0：化合物I-30 步驟1
使用參考例6.0之步驟1中所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(100mg，0.306mmol)及(3-(甲氧基羰基)苯基)硼酸(110mg，0.612mmol)，以與參考例6.0之步驟2同樣之方式獲得((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-(甲氧基羰基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(160mg，123%)。
ESI-MS(m/z)：427(M+1)
步驟2
使用步驟1中所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-(甲氧基羰基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(130mg，0.305mmol)，以與參考例6.0之步驟3同樣之方式獲得磷酸二第三丁酯((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-(甲氧基羰基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯 (100mg，53.0%)。
ESI-MS(m/z)：619(M+1)
步驟3
使用步驟2中所獲得之磷酸二第三丁酯((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-(甲氧基羰基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(68.7mg，0.111mmol)，以與參考例1.0之步驟5同樣之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-(3-(甲氧基羰基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲酯(45.0mg，87.0%)。
ESI-MS(m/z)：467(M+1)
步驟4
將步驟3中所獲得之磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-(3-(甲氧基羰基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲酯(20.0mg，0.0430mmol)溶解於1當量濃度之氫氧化鈉水溶液(2mL)中，於室溫下攪拌2小時。加入乙酸-三乙胺緩衝液(pH值為6.5)，藉由分取HPLC(溶離液，0.01mmol/L，乙酸銨水溶液/甲醇系)純化於減壓下將溶劑蒸餾去除而獲得之殘渣，藉此獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-(3-(羧基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲基(化合物I-30)三乙基銨鹽(10.0mg，42.1%)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：8.88-8.53(3H,m),8.34-8.22(1H,m),8.03-7.92(1H,m),7.60-7.48(1H,m),6.22-6.15(1H,m),4.76-4.65(1H,m),4.47-4.42(1H,m),4.35-4.30(1H,m),4.15-4.00(2H,m),3.09(6H,q,J=7.2Hz),1.16(9H,t,J=7.3Hz).
ESI-MS(m/z)：453(M+1)
參考例26.1：化合物am-26 步驟1
使用參考例17.1之步驟2中所獲得之6-氯-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2- 二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤，以與參考例26.0之步驟1同樣之方式獲得9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-(3-甲氧基羰基)-9H-嘌呤。
步驟2
使用步驟1中所獲得之9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-(3-甲氧基羰基)-9H-嘌呤，以與參考例26.0之步驟4同樣之方式獲得9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-(3-羧基)-9H-嘌呤。
步驟3~5
使用步驟2中所獲得之9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-(3-羧基)-9H-嘌呤，以與參考例1.1之步驟3~5同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)-5-(6-(3-羧基苯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-26)。
參考例26.1：化合物am-26 步驟1
使用參考例17.1之步驟2中所獲得之6-氯-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤(0.600g，1.11mmol)，以與參考例26.0之步驟1同樣之方式獲得9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西 林-6-基)-6-(3-甲氧基羰基)-9H-嘌呤(0.578g，81%)。
步驟2
使用步驟1中所獲得之9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-(3-甲氧基羰基)-9H-嘌呤(0.578g，0.902mmol)，以與參考例26.0之步驟4同樣之方式獲得3-(9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酸(0.505g，89%)。
步驟3
將步驟2中所獲得之3-(9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酸(0.897g，1.43mmol)溶解於DMF(10mL)中，加入3-羥基丙腈(0.291mL，4.29mmol)及1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二醯亞胺鹽酸鹽(0.411g，2.15mmol)、1-羥基苯并三唑一水合物(0.329g，2.15mmol)、二異丙基乙基胺(0.750mL，4.29mmol)，於室溫下進行徹夜攪拌。向反應液中加入飽和碳酸氫鈉水溶液，藉由乙酸乙酯進行2次萃取。以飽和食鹽水洗淨有機層後，藉由無水硫酸鈉進行乾燥，其後，於減壓下將溶劑蒸餾去除。藉由己烷/乙酸乙酯系之矽膠管柱層析法對所得之殘渣進行純化，藉此獲得3-(9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酸2-氰基乙酯(0.373g，38%)。
步驟4~6
使用步驟3中所獲得之3-(9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酸2-氰基乙酯，以與參考例1.1之步驟3~ 5同樣之方式獲得3-(9-((2R,3R,4R,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酸2-氰基乙酯(化合物am-26)。
實施例32-0
使用參考例26.1中所獲得之化合物am-26，以與實施例1同樣之方式合成反義鏈之5'末端具有化合物I-30之siRNA。
實施例32
使用參考例26.1中所獲得之化合物am-26，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-30之siRNA(稱為6-(3-羧基)苯基-Pu)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6794.98，實測值6792.84
參考例27.0：化合物I-31 步驟1
使用參考例10.0之步驟1中所獲得之5-溴-1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(100mg，0.275mmol)，以與參考例6.0之步驟2同樣之方式獲得1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(羥基甲基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)-5-苯乙烯基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(43.8mg，41%)。
ESI-MS(m/z)：385(M-1)
步驟2
將步驟1中所獲得之1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(羥基甲基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)-5-苯乙烯基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(16.3mg，0.042mmol)溶解於二氯甲烷(2mL)中，加入1H-四唑(7.39mg，0.105mmol)、二第三丁基二異丙基磷醯胺(0.028mL，0.084mmol)，於室溫下攪拌2小時。將反應液冷卻為0℃，加入(2R,8aS)-(+)-(樟腦基磺醯基)氧氮環丙烷(19.4mg，0.084mmol)，於0 ℃下進一步攪拌30分鐘。將反應液冷卻至室溫後，加入飽和碳酸氫鈉水溶液，使其通過Presep(註冊商標，矽藻土，顆粒狀TYPE M，4.5g/25mL)而進行過濾，並於減壓下將溶劑蒸餾去除。藉由庚烷/乙酸乙酯系之管柱層析法對殘渣進行純化，藉此獲得磷酸二第三丁酯((3aR,4R,6R,6aR)-6-(2,4-二側氧基-5-苯乙烯基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(10.0mg，41%)。
ESI-MS(m/z)：577(M-1)
步驟3
使用步驟2中所獲得之磷酸二第三丁酯((3aR,4R,6R,6aR)-6-(2,4-二側氧基-5-苯乙烯基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(10.0mg，0.017mmol)，以與參考例1.0之步驟5同樣之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(2,4-二側氧基-5-苯乙烯基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲基(化合物I-31)三乙基銨鹽(9.30mg，102%)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：7.96(s,1H),7.49(d,J=7.3Hz,2H),7.37-7.19(m,3H),6.88(d,J=16.5Hz,1H),5.91(d,J=5.1Hz,1H),4.32(t,J=5.1Hz,1H),4.26(t,J=4.8Hz,1H),4.21-4.20(m,1H),4.11-3.99(m,2H),3.09(q,J=7.3Hz,6H),1.16(t,J=7.3Hz,9H).
ESI-MS(m/z)：425(M-1)
參考例27.1：化合物am-27 步驟1
使用參考例13.1之步驟2中所獲得之5-溴-1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，以與參考例27.0之步驟1同樣之方式獲得1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁 基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-5-苯乙烯基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮。
步驟2
使用步驟1中所獲得之1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-5-苯乙烯基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，以與參考例1.1之步驟3~5同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(2,4-二側氧基-5-苯乙烯基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺。
實施例33
使用參考例27.1中所獲得之化合物am-27，以與實施例1同樣之方式合成反義鏈之5'末端具有化合物I-31之siRNA。
參考例28.1：化合物am-28 步驟1
將市售之(2R,3R,4S,5R)-2-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-5-(羥基甲基)四氫呋喃-3,4-二醇(5.00g，17.4mmol)溶解於吡啶(42mL)中，加入1,3-二氯-1,1,3,3-四異丙基二矽氧烷(6.70ml，20.9mmol)，於室溫下攪拌2小時。向反應液中加入水，以乙酸乙酯進行萃取。藉由飽和食鹽水洗淨有機層，並以硫酸鈉進行乾燥。藉由己烷/乙酸乙酯系之管柱層析法純化於減壓下將溶劑蒸餾去除而獲得之殘渣，藉此獲得(6aR,8R,9R,9aS)-8-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2,2,4,4-四異丙基四氫-6H-呋喃并[3,2-f][1,3,5,2,4]三氧雜二矽辛(trioxadisilocin)-9-醇(8.64g，產率94%)。
ESI-MS(m/z)：530(M+1)
步驟2
使用步驟1中所獲得之(6aR,8R,9R,9aS)-8-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2,2,4,4-四異丙基四氫-6H-呋喃并[3,2-f][1,3,5,2,4]三氧雜二矽辛-9-醇(6.50g，12.3mmol)，以與參考例6.0之步驟2同樣之方式獲得(6aR,8R,9R,9aS)-2,2,4,4-四異丙基-8-(6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫-6H-呋喃并[3,2-f][1,3,5,2,4]三氧雜二矽辛-9-醇(4.77g，產率65%)。
ESI-MS(m/z)：598(M+1)
步驟3
將步驟2中所獲得之(6aR,8R,9R,9aS)-2,2,4,4-四異丙基-8-(6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫-6H-呋喃并[3,2-f][1,3,5,2,4]三氧雜二矽辛-9-醇(4.50g，7.54mmol)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(50mL)中，於0℃下加入60%氫化鈉(302mg，7.54mmol)、碘甲烷(0.471mL，7.54mmol)，於室溫下攪拌2小時。向反應液中加入水，以乙酸乙酯進行萃取。藉由飽和食鹽水洗淨有機層，並以硫酸鈉進行乾燥。藉由己烷/乙酸乙酯系之管柱層析法純化於減壓下將溶劑蒸餾去除而獲得之殘渣，藉此獲得6-((E)-苯乙烯基)-9-((6aR,8R,9R,9aR)-2,2,4,4-四異丙基-9-甲氧基四氫-6H-呋喃并[3,2-f][1,3,5,2,4]三氧雜二矽辛-8-基)-9H-嘌呤(2.09g，產率45%)。
ESI-MS(m/z)：612(M+1)
步驟4
將步驟3中所獲得之6-((E)-苯乙烯基)-9-((6aR,8R,9R,9aR)-2,2,4,4-四異丙基-9-甲氧基四氫-6H-呋喃并[3,2-f][1,3,5,2,4]三氧雜二矽辛-8-基)-9H-嘌呤(569mg，0.931mmol)溶解於四氫呋喃(10mL)中，加入乙酸(0.117mL，2.049mmol)與四丁基氟化銨之四氫呋喃溶液(1mol/L，2.05ml，2.05mmol)，於室溫下攪拌30分鐘。於減壓下濃縮反應液，藉由氯仿/甲醇系之管柱層析法進行純化，藉此獲得 (2R,3S,4R,5R)-2-(羥基甲基)-4-甲氧基-5-(6-((E)苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(341mf，產率99%)。
1H-NMR(CDCl3,500MHz)δ：8.90(s,1H),8.43(d,J=16.7Hz,1H),8.13(s,1H),7.68-7.75(m,3H),7.37-7.47(m,3H),6.17(dd,J=2.2,11.9Hz,1H),5.95(d,J=7.0Hz,1H),4.77(dd,J=4.7,7.4Hz1H),4.61(d,J=4.4Hz,1H)),4.39-4.41(m,1H),3.99-4.02(m,1H),3.78-3.83(m,1H),3.37(s,3H),2.67(s,1H).
ESI-MS(m/z)：369(M+1)
步驟5
使用步驟4中所獲得之(2R,3S,4R,5R)-2-(羥基甲基)-4-甲氧基-5-(6-((E)苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇，以與參考例1.1同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-甲氧基-5-(6-((E)苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-28)。該化合物無需進行純化而用於下一步驟。
實施例34
使用參考例28.1中所獲得之化合物am-28，以與實施例1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-32之siRNA(稱為2'-OMe-6-苯乙烯基-dA)。
ESI-MS(m/z)：理論值6792.04，實測值6792.18
參考例29.0：化合物I-33
使用市售之5-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，以與參考例1.0同樣之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-二羥基-5-(5-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-33)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：7.67(s,1H),5.86(d,J=5.5Hz,1H),4.23(dt,J=12.8,4.9Hz,2H),4.13(dt,J=6.0,2.6Hz,1H),4.02-3.89 (m,2H),1.80(s,3H).
ESI-MS(m/z)：337(M-1)
參考例29.1：化合物am-29 步驟1
使用市售之5-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，以與參考例1.1同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(5-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺。
實施例35
使用參考例29.1中所獲得之化合物am-29，以與實施例1同樣之方式合成反義鏈之5'末端具有化合物I-33之siRNA。
參考例30.0：化合物I-34
使用市售之6-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，以與參考例1.0同樣之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-二羥基-5-(6-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-2-基)甲酯(化合物I-34)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：5.63(s,1H),5.56(d,J=2.9Hz,1H),4.31(t,J=6.6Hz,1H),4.05-3.90(m,4H),2.27(s,3H),1.95(s,1H).
ESI-MS(m/z)：337(M-1)
參考例30.1：化合物am-30
使用市售之6-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，以與參考例1.1同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(6-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-30)。
1H-NMR(CDCl3,500MHz)δ：7.80(m,1H),7.48-6.78(m,13H),5.55(s,1H),5.50(m,1H),5.10(m,1H),4.31-4.18(m,2H),3.93-3.22 (m,12H),2.66-2.28(m,5H),1.18-1.05(m,12H),0.87(0.86)(s,9H),0.07(0.06)(s,3H),0.00(-0.01)(s,3H).
實施例36
使用參考例30.1中所獲得之化合物am-30，以與實施例1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xu之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-34之siRNA(稱為6-Me-dU)。
MALDI-TOF/MS(反義鏈)：理論值6680.87(M-H)，實測值6681.08
參考例31.0：化合物I-35 步驟1
使用藉由公知之方法[Organic Process Research & Development，2001年，5卷，426~433頁]所記載之方法而合成之7-氯-6-硝基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮(0.626g，1.24mmol)，以與參考例1.0之步驟1同樣之方式獲得二苯甲酸(2R,3R,4R,5R)-2-(苯甲醯基氧基甲基)-5-(7-氯-6-硝基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)四氫呋喃-3,4-二酯(0.292g，34%)。
ESI-MS(m/z)：684(M-1)
步驟2
使用步驟1中所獲得之二苯甲酸(2R,3R,4R,5R)-2-(苯甲醯基氧基甲基)-5-(7-氯-6-硝基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)四氫呋喃-3,4-二酯(3.00g，4.37mmol)，以與參考例7.0之步驟2同樣之方式獲得7-氯-1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)-6-硝基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮(1.26g，77%)。
ESI-MS(m/z)：372(M-1)
步驟3
使用步驟2中所獲得之7-氯-1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)-6-硝基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮，以與參考例7.0 之步驟3~4同樣之方式獲得磷酸二第三丁酯((3aR,4R,6R,6aR)-6-(7-氯-6-硝基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯。
ESI-MS(m/z)：604(M-1)
步驟4
使用步驟3中所獲得之磷酸二第三丁酯((3aR,4R,6R,6aR)-6-(7-氯-6-硝基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(32.5mg，0.054mmol)，以與參考例1.0之步驟5同樣之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(7-氯-6-硝基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲基(化合物I-35)三乙基銨鹽(20.0mg，67%)。
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：8.67(s,1H),7.87(s,1H),6.08(d,J=4.8Hz,1H),4.77(dd,J=6.6,4.8Hz,1H),4.42(t,J=6.4Hz,1H),4.08-3.99(m,4H),3.09(q,J=7.3Hz,6H),1.17(t,J=7.3Hz,9H).
ESI-MS(m/z)：452(M-1)
參考例31.1：化合物am-31 步驟1
使用參考例31.0之步驟2中所獲得之7-氯-1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)-6-硝基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮，以與參考例1.1之步驟1~2同樣之方式獲得7-氯-1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-硝基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮。
步驟2
使用參考例31.1之步驟1中所獲得之7-氯-1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-硝基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮，以與參考 例1.1之步驟3~5同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(7-氯-6-硝基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-31)。
實施例37
使用參考例31.1中所獲得之化合物am-31，以與實施例1同樣之方式合成反義鏈之5'末端具有化合物I-35之siRNA。
參考例32.0：化合物I-36 步驟1
將參考例10.0之步驟3中所獲得之磷酸二第三丁酯((3aR,4R,6R,6aR)-6-(7-氯-6-硝基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(20.0mg，0.033mmol)溶解於THF(1mL)中，加入二甲基胺/THF溶液(1mL，2.00mmol)，於室溫下攪拌30分鐘。於減壓下將溶劑蒸餾去除後，藉由製備薄層層析法(庚烷/乙酸乙酯=25/75)對殘渣進行純化，藉此獲得二第三丁基((3aR,4R,6R,6aR)-6-(7-(二甲胺基)-6-硝基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲基(14.4mg，71%)。
ESI-MS(m/z)：613(M-1)
步驟2
使用步驟1中所獲得之二第三丁基((3aR,4R,6R,6aR)-6-(7-(二甲胺基)-6-硝基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲基(22.0mg，0.036mmol)，以與參考例1.0之步驟5同樣之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(7-(二甲胺基)-6-硝基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲基(化合物I-36)三乙基銨鹽(12.5mg，62%)。
ESI-MS(m/z)：461(M-1)
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：8.46(s,1H),6.75(s,1H),6.05(d,J=4.4Hz,1H),4.79(dd,J=6.6,4.0Hz,1H),4.38(t,J=7.0Hz,1H),4.11-3.98(m,4H),3.09(q,J=7.3Hz,6H),2.92(s,6H),1.17(t,J=7.3Hz,9H).
參考例32.1：化合物am-32 步驟1
使用參考例31.1之步驟1中所獲得之7-氯-1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-硝基喹唑啉)-2,4(1H,3H)-二酮，以與參考例32.0之步驟1同樣之方式獲得1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-7-(二甲胺基)-6-硝基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮。
步驟2
使用步驟1中所獲得之1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-7-(二甲胺基)-6-硝基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮，以與參考例1.1之步驟3~5同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(7-(二甲胺基)-6-硝基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-32)。
實施例38
使用參考例32.1中所獲得之化合物am-32，以與實施例1同樣之方式合成反義鏈之5'末端具有化合物I-36之siRNA。
參考例33.0：化合物I-37 步驟1
使用參考例31.0之步驟1中所獲得之二苯甲酸(2R,3R,4R,5R)-2-(苯甲醯基氧基甲基)-5-(7-氯-6-硝基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)四氫呋喃-3,4-二酯(292mg，0.426mmol)，以與參考例1.0之步驟2同樣之方式獲得1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)-7-(甲基胺基)-6-硝基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮(110mg，71%)。
ESI-MS(m/z)：367(M-1)
步驟2
使用步驟1中所獲得之1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)-7-(甲基胺基)-6-硝基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮，以與參考例1.0之步驟3~5同樣之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-二羥基-5-(7-(甲基胺基)-6-硝基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)四氫呋喃-2-基)甲基(化合物I-37)三乙基銨鹽。
ESI-MS(m/z)：447(M-1)
1H-NMR(D2O,300MHz)δ：8.67(s,1H),6.48(s,1H),6.02(d,J=4.0Hz,1H),4.78(dd,J=6.6,4.0Hz,1H),4.37(t,J=7.0Hz,1H),4.12(dt,J=13.9,5.6Hz,1H),4.03-3.97(m,2H),2.97(s,3H).(未見胺、醯胺之質子)
參考例33.1：化合物am-33
使用參考例33.0之步驟1中所獲得之1-(2R,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基-7-(甲基胺基)-6-硝基喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮，以與參考例1.1同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(7-(甲基胺基)-6-硝基-2,4-二側氧基-3,4-二氫喹唑啉-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-33)。
1H-NMR(CDCl3,500MHz)δ：9.03(s,1H),8.40(m,1H),7.88(m,1H),7.48-6.73(m,13H),6.64(s,1H),5.88(m,1H),5.13(5.16)(m, 1H),4.50-4.29(m,2H),3.93-3.25(m,12H),3.00(2.96)(d,J=5.1Hz,3H),2.60(2.32)(m,2H),1.20-1.05(m,12H),0.85(0.82)(s,9H),0.07(0.05)(s,3H),-0.05(-0.06)(s,3H).
實施例39
使用參考例33.1中所獲得之化合物am-33，以與實施例1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xu之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-37之siRNA(稱為6-NO2,7-Me-dQu)。
MALDI-TOF/MS(反義鏈)：理論值6790.94(M-H)，實測值6794.76
參考例34.0：化合物I-38 步驟1
使用參考例6.0之步驟1中所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(100mg，0.306mmol)及(E)-2-(3-氯苯乙烯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼烷(81.0mg，0.306mmol)，以與參考例6.0之步驟2同樣之方式獲得((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-氯苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(118mg，90%)。
ESI-MS(m/z)：429(M+1)
步驟2
使用步驟1中所獲得之((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-氯苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲醇(115mg，0.268mmol)，以與參考例6.0之步驟3同樣之方式獲得磷酸二第三丁酯((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-氯苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(107mg，59.8%)。
ESI-MS(m/z)：621(M+1)
步驟3
使用步驟2中所獲得之磷酸二第三丁酯((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-氯苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-基)甲酯(120mg，0.193mmol)，以與參考例1.0之步驟5同樣之方式獲得磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-(3-氯苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲基(化合物I-38)三乙基銨鹽(28.0mg，25.4%)。
1H-NMR(D2O,400MHz)δ：8.45(1H,s),8.34(1H,s),7.32-7.20(1H,m),6.86-6.70(3H,m),6.64-6.50(2H,m),5.92-5.85(1H,m),4.60-4.54(1H,m),4.38-4.32(1H,m),4.28-4.20(1H,m),4.10-3.92(2H,m),3.04(6H,q,J=7.5Hz),1.11(9H,t,J=127.8Hz).
ESI-MS(m/z)：469(M+1)
參考例34.1：化合物am-34 步驟1
使用參考例17.1之步驟2中所獲得之6-氯-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤，以與參考例22.0之步驟1同樣之方式獲得6-(3-氯苯乙烯基)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤。
步驟2~4
使用步驟1中所獲得之6-(3-氯苯乙烯基)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤，以與參考例1.1之步驟3~5同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)-5-(6-(3-氯苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-34)。
實施例40
使用參考例34.1中所獲得之化合物am-34，以與實施例1同樣之方式合成反義鏈之5'末端具有化合物I-38之siRNA。
參考例35.1：化合物am-35 步驟1
使用參考例17.1之步驟2中所獲得之6-氯-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤(300mg，0.554mmol)及苯并[b]噻吩-2-硼酸，以與參考例6.0之步驟2同樣之方式獲得6-(苯并[b]噻吩-2-基)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤(315mg，89.0%)。
步驟2~4
使用步驟1中所獲得之6-(苯并[b]噻吩-2-基)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤，以與參考例1.1之步驟3~5同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-5-(6-(苯并[b]噻吩-2-基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-35)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.99,8.98(1H,2 s),8.85,8.83(1H,2 s),8.41,8.38(1H,2 s),7.96-7.91(2H,m),7.53-7.34(8H,m),7.32-7.19(3H,m),6.85-6.79(4H,m),6.17-6.08(1H,m),5.17-5.10(1H,m),4.50-4.36(2H,m),4.02-3.84(1H,m),3.78(6H,s),3.68-3.55(4H,m),3.38-3.30(1H,m),2.69-2.62(1H,m),2.33-2.28(1H,m),1.23-1.03(12H,m),0.76,0.75(9H,2 s),-0.01,-0.04,-0.19,-0.19(6H,4 s).
實施例41
使用參考例35.1中所獲得之化合物am-35，以與實施例1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-39之siRNA(稱為6-benzothiophenyl purine(6-苯并噻吩基嘌呤))。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6807.05，實測值6807.89
參考例36.1：化合物am-36 步驟1
使用參考例17.1之步驟2中所獲得之6-氯-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤(300mg，0.554mmol)及6-苄氧基萘-2-硼酸，以與參考例6.0之步驟2同樣之方式獲得6-(6-(苄氧基)萘-2-基)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤(307mg，74.9%)。
步驟2~4
使用步驟1中所獲得之6-(6-(苄氧基)萘-2-基)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤，以與參考例1.1之步驟3~5同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-5-(6-(6-(苄氧基)萘-2-基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-36)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：9.36(1H,s),8.93,8.91(1H,2 s),8.88-8.83(1H,m),8.40,8.37(1H,2 s),8.02-7.86(2H,m),7.53-7.34(11H,m),7.33-7.18(5H,m),6.86-6.79(4H,m),6.20-6.10(1H,m),5.23(2H,s),5.17-5.12(1H,m),4.50-4.37(2H,m),4.03-3.85(1H,m),3.76(6H,s),3.69-3.55(4H,m),3.40-3.30(1H,m),2.72-2.61(1H,m),2.37-2.25(1H,m),1.24-1.03(12H,m),0.77,0.76(9H,2 s),-0.01,-0.05, -0.18,-0.20(6H,4 s).
實施例42
使用參考例36.1中所獲得之化合物am-36，以與實施例1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-40之siRNA(稱為6-benzyloxynaphtyl purine(6-苄氧基萘基嘌呤))。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6907.15，實測值6909.04
參考例37.1：化合物am-37 步驟1
使用參考例17.1之步驟2中所獲得之6-氯-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤(300mg，0.554mmol)及1-芘硼酸，以與參考例6.0之步驟2同樣之方式獲得9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-(芘-1-基)-9H-嘌呤(202mg，51.5%)。
步驟2~4
使用步驟1中所獲得之9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-(芘-1-基)-9H-嘌呤，以與參考例1.1之步驟3~5同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)-5-(6-(芘-1-基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-37)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：9.13,9.11(1H,2 s),8.57-8.47(2H,m),8.41-8.31(2H,m),8.27-8.O0(7H,m),7.52-7.45(2H,m),7.42-7.32(4H,m),7.31-7.16(2H,m),6.86-6.78(4H,m),6.27-6.16(1H,m),5.22-5.16(1H,m),4.53-4.40(2H,m),4.06-3.88(1H,m),3.76,3.75(6H,2 s),3.72-3.56(4H,m),3.43-3.32(1H,m),2.76-2.61(1H,m),2.38-2.25(1H, m),1.25-1.06(12H,m),0.79,0.78(9H,2 s),0.04,0.02,-0.12,-0.13(6H,4 s).
實施例43
使用參考例37.1中所獲得之化合物am-37，以與實施例1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-41之siRNA(稱為6-pyrenyl purine(6-芘基嘌呤))。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6875.11，實測值6875.62
參考例38.1：化合物am-38 步驟1
使用參考例17.1之步驟2中所獲得之6-氯-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤(310mg，0.573mmol)及2-蒽硼酸，以與參考例6.0之步驟2同樣之方式獲得6-(蒽-2-基)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤(215mg，55.0%)。
步驟2~4
使用步驟1中所獲得之6-(蒽-2-基)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤，以與參考例1.1之步驟3~5同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-5-(6-(蒽-2-基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-38)。
1H-NMR(CDCl3,500MHz)δ：9.69-9.69(1H,m),8.98-8.96(1H,m),8.83-8.82(1H,m),8.71-8.69(1H,m),8.46-8.43(2H,m),8.18-8.16(1H,m),8.05-8.04(2H,m),7.50-7.48(4H,m),7.41-7.37(4H,m),7.31- 7.29(2H,m),7.24-7.22(1H,m),6.84-6.83(4H,m),6.20-6.15(1H,m),5.17-5.15(1H,m),4.47-4.43(2H,m),3.99-3.92(1H,m),3.80-3.79(6H,m),3.68-3.60(4H,m),3.40-3.34(1H,m),2.67-2.32(2H,m),1.19-1.09(12H,m),0.77-0.77(9H,m),0.01(-0.02)(3H,s),-0.18(-0.16)(3H,s).
實施例44
使用參考例38.1中所獲得之化合物am-38，以與實施例1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-42之siRNA(稱為6-anthracenyl purine(6-蒽基嘌呤))。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6851.09，實測值6850.63
參考例39.1：化合物am-39 步驟1
將藉由公知之方法(J.Am.Chem.Soc，1991年，113卷，4329~4331頁)所記載之方法而合成之(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(0.287g，0.500mmol)溶解於THF(2.50mL)中，加入三乙胺(0.279mL，2.00mmol)、苄基胺(0.164mL，1.50mmol)，於50℃下攪拌一晚。於反應混合物中加入飽和碳酸氫鈉水溶液，以乙酸乙酯加以萃取後，藉由飽和食鹽水洗淨有機層，並藉由無水硫酸鈉進行乾燥。於減壓下將溶劑蒸餾去除，藉由乙酸乙酯/己烷系之矽膠管柱層析法對殘渣進行純化，藉此獲得(2R,3S,5R)-5-(6-(苄基胺基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-醇(0.241g，75%)。
步驟2
將步驟1中所獲得之(2R,3S,5R)-5-(6-(苄基胺基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-醇(0.241g，0.374mmol)溶解於THF(3.74mL)中，於0℃下加入DIEA(Diisopropylethylamine，二異丙基乙基胺)(0.196mL，1.12 mmol)、3-(氯(二異丙胺基)膦基氧基)丙腈(0.100mL，0.449mmol)，於室溫、氬氣環境下攪拌2小時。於反應混合物中加入飽和碳酸氫鈉水溶液，以乙酸乙酯加以萃取後，藉由飽和食鹽水洗淨有機層，並藉由無水硫酸鈉進行乾燥。於減壓下將溶劑蒸餾去除，藉由含有1%三乙胺之乙酸乙酯/己烷系之矽膠管柱層析法對殘渣進行純化，藉此獲得(2R,3S,5R)-5-(6-(苄基胺基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(am-39，0.152g，48%)。
1H-NMR(CDCl3,500MHz)δ：8.35(1H,s),7.94-7.92(1H,m),7.41-7.16(14H,m),6.80-6.77(4H,m),6.45-6.42(1H,m),6.00(1H,brs),4.88(2H,brs),4.77-4.75(1H,m),4.29-4.27(1H,m),3.87-3.57(4H,m),3.78-3.76(6H,m),3.44-3.31(2H,m),2.89-2.86(1H,m),2.64-2.59(2H,m),2.46-2.45(1H,m),1.20-1.11(12H,m).
實施例45
使用參考例39.1中所獲得之化合物am-39，以與實施例1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-43之siRNA(稱為N-Bn dA)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6864.01，實測值6765.02
參考例40.1：化合物am-40 步驟1
將藉由公知之方法(J.Am.Chem.Soc，1991年，113卷，4329~4331頁)所記載之方法而合成之(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(0.287g，0.500mmol)溶解於THF(2.50mL)中，加入三乙胺(0.279mL，2.00mmol)、N-甲基苄基胺(0.193mL，1.50mmol)，於50℃下攪拌一晚。於反應混合物中加入飽和碳酸氫鈉水溶液，以乙酸乙酯加以萃取後，藉由飽和 食鹽水洗淨有機層，並藉由無水硫酸鈉進行乾燥。於減壓下將溶劑蒸餾去除，藉由乙酸乙酯/己烷系之矽膠管柱層析法對殘渣進行純化，藉此獲得(2R,3S,5R)-5-(6-(苄基(甲基)胺基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-醇(0.187g，57%)。
步驟2
使用步驟1中所獲得之(2R,3S,5R)-5-(6-(苄基(甲基)胺基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-醇(0.187g，0.284mmol)，以與參考例39.1之步驟2同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-5-(6-(苄基(甲基)胺基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(am-40，0.169g，69%)。
1H-NMR(CDCl3,500MHz)δ：8.33(1H,s),7.91-7.89(1H,m),7.40-7.38(2H,m),7.30-7.16(12H,m),6.79-6.76(4H,m),6.48-6.46(1H,m),5.34(2H,brs),4.73-4.72(1H,m),4.29-4.27(2H,m),3.87-3.56(4H,m),3.76-3.76(6H,m),3.44-3.29(5H,m),2.84-2.78(1H,m),2.65-2.60(2H,m),2.46-2.44(1H,m),1.20-1.10(12H,m).
實施例46
使用參考例40.1中所獲得之化合物am-40，以與實施例1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-44之siRNA(稱為N-Bn-N-Me dA)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6778.04，實測值6778.19
參考例41.1：化合物am-41 步驟1
使用參考例6.1之步驟3中所獲得之9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤(4.90g，8.05 mmol)，以與參考例14.0之步驟2同樣之方式獲得8-溴-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤(4.20g，76%)。
ESI-MS(m/z)：688(M+1)
步驟2
將步驟1中所獲得之8-溴-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤(300mg，0.436mmol)溶解於乙醇(4.4mL)中，加入苄基胺(0.304mL，2.181mmol)、三乙胺(0.143mL，1.308mmol)，於加熱回流下攪拌3小時。將反應液冷卻至室溫後，於減壓下將溶劑蒸餾去除。藉由庚烷/乙酸乙酯系之管柱層析法對殘渣進行純化，藉此獲得N-苄基-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-8-胺(304mg，98%)。
步驟3
使用步驟2中所獲得之N-苄基-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-8-胺，以與參考例1.1之步驟3~5同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-5-(8-(苄基胺基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-41)。
1H-NMR(CDCl3,500MHz)δ：8.59-8.56(m,1H),8.21-8.17(m,1H),7.63-7.61(m,2H),7.55-7.50(m,1H),7.37-7.34(m,4H),7.30-7.18(m,11H),7.15-7.13(m,2H),6.74-6.67(m,4H),6.33-6.19(m,2H), 5.09(m,1H),4.86-4.75(m,1H),4.40-4.27(m,2H),4.13-3.69(m,2H),3.65-3.50(m,4H),3.39(m,1H),2.77-2.24(m,2H),1.25-1.01(m,12H),0.73(m,9H),-0.03(-0.01)(s,3H),-0.23(-0.24)(s,3H).
實施例47
使用參考例41.1中所獲得之化合物am-41，以與實施例12同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-45之siRNA(稱為8-BnNH-6-苯乙烯基嘌呤)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6882.14，實測值6882.50
參考例42.1：化合物am-42 步驟1
使用參考例41.1之步驟1中所獲得之8-溴-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤(300mg，0.436mmol)及呋喃-3-基甲胺(0.121mL，1.308mmol)，以與參考例41.1之步驟2同樣之方式獲得9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-N-(呋喃-3-基甲基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-8-胺(279mg，91%)。
步驟2
使用步驟1中所獲得之9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-N-(呋喃-3-基甲基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-8-胺，以與參考例1.1之步驟3~5同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)-5-(8-(呋喃-3-基甲基胺基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-42)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.58(m,1H),8.28-8.24(m,1H), 7.67-7.65(m,2H),7.60-7.56(m,1H),7.41-7.36(m,4H),7.32-7.23(m,7H),7.00(m,1H),6.81-6.76(m,4H),6.35(m,1H),6.29-6.16(m,1H),6.16-6.08(m,1H),5.05-5.01(m,1H),4.51(m,1H),4.34(m,1H),4.24(m,1H),4.11-4.05(m,1H),3.95(m,1H),3.79(s,6H),3.66-3.52(m,4H),3.46(m,1H),3.39-3.35(m,1H),2.74(m,1H),2.24(m,1H),1.32-0.97(m,14H),0.72(m,9H),-0.04(-0.02)(s,3H),-0.25(-0.27)(s,3H).
實施例48
使用參考例42.1中所獲得之化合物am-42，以與實施例12同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-46之siRNA(稱為8-furanylmethylamino-6-styryl purine(8-呋喃基甲基胺基-6-苯乙烯基嘌呤))。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6872.11，實測值6872.95
參考例43.1：化合物am-43 步驟1
使用參考例41.1之步驟1中所獲得之8-溴-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤(300mg，0.436mmol)及(2H-四唑-5-基)甲胺(0.130mL，1.308mmol)，以與參考例41.1之步驟2同樣之方式獲得N-((2H-四唑-5-基)甲基)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-8-胺(367mg，119%)。
ESI-MS(m/z)：706(M+1)
步驟2
將步驟1中所獲得之N-((2H-四唑-5-基)甲基)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并 [3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-8-胺(366mg，0.518mmol)溶解於DMF(5.2mL)中，加入DBU(0.234mL，1.555mmol)、特戊酸氯甲酯(0.150mL，1.037mmol)，於80℃下攪拌3小時。於反應混合物中加入飽和碳酸氫鈉水溶液，以乙酸乙酯加以萃取後，藉由飽和食鹽水洗淨有機層，並藉由無水硫酸鎂進行乾燥。於減壓下將溶劑蒸餾去除，藉由乙酸乙酯/庚烷系之矽膠管柱層析法對殘渣進行純化，藉此獲得特戊酸(5-((9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-8-基胺基)甲基)-2H-四唑-2-基)甲酯與特戊酸(5-((9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-8-基胺基)甲基)-1H-四唑-1-基)甲酯之混合物(172mg，41%)。
ESI-MS(m/z)：821(M+1)
步驟3
使用步驟2中所獲得之特戊酸(5-((9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-8-基胺基)甲基)-2H-四唑-2-基)甲酯與特戊酸(5-((9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-8-基胺基)甲基)-1H-四唑-1-基)甲酯之混合物，以與參考例1.1之步驟3~5同樣之方式獲得特戊酸(5-((9-((2R,3R,4R,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)-4-((2-氰基乙氧基)(二異丙胺基)膦氧基)四氫呋喃-2-基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-8-基胺基)甲基)-1H-四唑-1-基)甲酯與特戊酸(5-((9-((2R,3R,4R,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲 基)-3-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)-4-((2-氰基乙氧基)(二異丙胺基)膦氧基)四氫呋喃-2-基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-8-基胺基)甲基)-2H-四唑-2-基)甲酯之混合物(化合物am-43)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.63-8.58(m,1H),8.15-8.07(m,1H),7.64-7.62(m,2H),7.50-7.16(m,11H),6.88-6.86(m,1H),6.80-6.78(m,4H),6.67-6.63(m,1H),6.38-6.19(m,1H),5.10-5.03(m,1H),4.68-4.51(m,1H),4.51-4.30(m,3H),4.20-3.94(m,2H),3.80-3.77(m,6H),3.75-3.52(m,4H),3.45-3.43(m,1H),2.82-2.17(m,2H),1.32-1.14(m,12H),1.09-0.96(m,9H),0.88-0.82(m,2H),0.74-0.71(m,9H),-0.02(0.01)(s,3H),-0.24(-0.29)(m,3H).
實施例49
使用參考例43.1中所獲得之化合物am-43，以與實施例12同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-47之siRNA(稱為6-styryl-8-tetrazolylmethylamino purine(6-苯乙烯基-8-四唑基甲基胺基嘌呤))。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6874.08，實測值6873.91
參考例44.1：化合物am-44 步驟1
使用參考例17.1之步驟2中所獲得之6-氯-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤(900mg，1.66mmol)及3-(2-甲氧基羰基乙基)苯基硼酸，以與參考例6.0之步驟2同樣之方式獲得9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-(3-(3-甲氧基-3-側氧基丙基)苯基)-9H-嘌呤(905mg，81%)。
步驟2~6
使用步驟1中所獲得之9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-(3-(3-甲氧基-3-側氧基丙基)苯基)-9H-嘌呤，以與參考例26.1之步驟2~6同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)-5-(6-(3-(3-(2-氰基乙氧基)-3-側氧基丙基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-44)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.91,8.89(1H,2 s),8.72-8.57(2H,m),8.38,8.34(1H,2 s),7.53-7.45(3H,m),7.41-7.33(5H,m),7.32-7.19(3H,m),6.85-6.79(4H,m),6.19-6.09(1H,m),5.15-5.09(1H,m),4.49-4.35(2H,m),4.31-4.24(2H,m),4.03-3.84(1H,m),3.76(6H,s),3.68-3.55(4H,m),3.38-3.28(1H，m),3.15-3.08(2H,m),2.83-2.77(2H,m),2.69-2.62(3H,m),2.34-2.27(1H,m),1.24-1.02(12H,m),0.76,0.75(9H,2 s),-0.01,-0.05,-0.20,-0.20(6H,4 s).
實施例50
使用參考例44.1中所獲得之化合物am-44，以與實施例1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-48之siRNA(稱為6-(m-carboxyethylphenyl)purine(6-(間羧乙基苯基)嘌呤))。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6823.03，實測值6824.53
實施例51
使用市售之5-(2-呋喃基)-dU CEP(Berry & Associates公司)，以與實施例1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-49之siRNA(稱為5-呋喃基dU)。
MALDI-TOF/MS(反義鏈)：理論值6717.94，實測值6717.65
實施例52
使用市售之2,6-二胺嘌呤-TOM-CE亞磷醯胺(Glen Research公司)、及Zebularine-CE亞磷醯胺(Glen Research公司)，以與實施例12同樣之方式合成如下述之表38所示的454-XY之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-51、自義鏈之3'末端起第3個鹼基之Y具有Zebularine-5'-單磷酸酯之siRNA(稱為2-胺基rA)。
MALDI-TOF/MS(反義鏈)：理論值6704.62，實測值6704.90
MALDI-TOF/MS(義鏈)：理論值6725.85，實測值6725.08
參考例47.1：化合物am-47 步驟1
使用藉由J.Am.Chem.Soc，1991年，第113卷，4329~4331頁所記載之方法而合成之(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(0.573g，1.00mmol)及(3-(胺基甲基)苯基)甲醇(0.412g，3.00mmol)，以與參考例39.1之步驟1同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-((3-(羥基甲基)苄基)胺基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(678mg，100%)。
ESI-MS(m/z)：675(M+1)
步驟2
使用步驟1中所獲得之(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-((3-(羥基甲基)苄基)胺基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(0.337g，0.500mmol)，以與參考例1.1之步驟2同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-((3-(第三丁基二甲基矽烷氧基)甲基)苄基胺基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(0.192g，39%)。
ESI-MS(m/z)：789(M+1)
步驟3
使用步驟2中所獲得之(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-((3-(第三丁基二甲基矽烷氧基)甲基)苄基胺基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇，以與參考例39.1之步驟2同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-((3-(第三丁基二甲基矽烷氧基)甲基)苄基胺基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺後，用於實施例53。
實施例53
使用參考例47.1中所獲得之化合物am-47，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-51之siRNA(稱為N6-(3-羥甲基)Bn dA)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6794.04，實測值6794.45
參考例48.1：化合物am-48 步驟1
使用參考例48.1之步驟1中所獲得之(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-((3-(羥基甲基)苄基)胺基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(0.337g，0.500mmol)，以與參考例1.1之步驟4同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-((3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)苄基)胺基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(0.195g，40%)。
ESI-MS(m/z)：977(M+1)
步驟2
使用步驟1中所獲得之(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-((3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)苄基)胺基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇，以與參考例39.1之步驟2同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-((3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)苄基)胺基)-9H-嘌呤-9-基)四氫 呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺後，用於實施例54。
實施例54
使用參考例48.1中所獲得之化合物am-48，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-52之siRNA(稱為N6-(3-膦醯氧基甲基)Bn dA)。
MALDI-TOF/MS(反義鏈)：理論值6873.01，實測值6876.34
參考例49.1：化合物am-49 步驟1
使用市售之(2R,3S,5R)-5-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2-(羥基甲基)四氫呋喃-3-醇(2.00g，7.39mmol)，以與參考例1.1之步驟1同樣之方式獲得6-氯-9-((4aR,6R,7aS)-2,2-二第三丁基四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤(2.77g，91%)。
步驟2
使用步驟1中所獲得之6-氯-9-((4aR,6R,7aS)-2,2-二第三丁基四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤(2.00g，4.87mmol)，以與參考例6.0之步驟2同樣之方式獲得9-((4aR,6R,7aS)-2,2-二第三丁基四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤(1.74g，75%)。
步驟3~5
使用步驟2中所獲得之9-((4aR,6R,7aS)-2,2-二第三丁基四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤，以與參考例1.1之步驟3~5同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-49)。
ESI-MS(m/z)：841(M+1)
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.84-8.84(m,1H),8.41-8.37(m, 1H),8.28-8.26(m,1H),7.73-7.71(m,3H),7.42-7.39(m,6H),7.31-7.22(m,37H),6.79-6.77(m,4H),6.53-6.52(m,1H),4.82-4.75(m,1H),4.34-4.32(m,1H),3.89-3.56(m,14H),3.49-3.33(m,4H),2.98-2.93(m,1H),2.75-2.62(m,2H),2.48-2.47(m,1H),1.27-1.24(m,2H),1.20-1.19(m,9H),1.14-1.12(m,3H).
實施例55
使用參考例49.1中所獲得之化合物am-49，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-53之siRNA(稱為6-苯乙烯基-dPu)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6761.01，實測值6762.51
參考例50.1：化合物am-50 步驟1
使用藉由J.Am.Chem.Soc，1991年，第113卷，4329~4331頁所記載之方法而合成之(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(5.73g，10.0mmol)，以與參考例1.1之步驟2同樣之方式獲得9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫呋喃-2-基)-6-氯-9H-嘌呤(6.87g，100%)。
步驟2
將藉由Bioorg.Med.Chem.，2009年，第17卷，1974~1981頁所記載之方法而合成之(3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)苯基)甲醇(0.529g，1.20mmol)溶解於THF(6.00mL)中，於0℃下加入氫化鈉(0.053g，1.32mmol)，並於室溫下攪拌10分鐘。繼而，於0℃下加入步驟1中所獲得之9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫呋喃-2-基)-6-氯-9H-嘌呤(0.412g，0.600mmol)，於室溫下攪拌1.5小時。向反應液中加入水， 以乙酸乙酯進行萃取。藉由飽和食鹽水洗淨有機層，並藉由無水硫酸鈉進行乾燥，於減壓下將溶劑蒸餾去除，從而獲得9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫呋喃-2-基)-6-((3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)苄基)氧基)-9H-嘌呤之粗純化物。
步驟3
將步驟2中所獲得之9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫呋喃-2-基)-6-((3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)苄基)氧基)-9H-嘌呤溶解於THF(6.00mL)中，加入四丁基氟化銨之THF溶液(1mol/L，1.20ml，1.20mmol)，於室溫下攪拌30分鐘。於反應液中加入飽和氯化銨水溶液，以乙酸乙酯進行萃取。藉由飽和食鹽水洗淨有機層，並藉由無水硫酸鈉進行乾燥，於減壓下將溶劑蒸餾去除，藉由己烷/乙酸乙酯系之管柱層析法進行純化，從而獲得(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-((3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)苄基)氧基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(0.525g，90%)。
ESI-MS(m/z)：978(M+1)
步驟4
使用步驟3中所獲得之(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-((3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)苄基)氧基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(0.525g，0.537mmol)，以與參考例39.1之步驟2同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-((3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)苄基)氧基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-50)(0.475g，75%)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.47(1H,d,J=1.3Hz),8.09(1H, d,J=9.1Hz),7.52-7.00(22H,m),6.85-6.75(8H,m),6.49-6.45(1H,m),5.66(2H,s),4.76(1H,s),4.31-4.30(1H,m),4.17(2H,s),3.88-3.56(16H,m),3.41-3.33(2H,m),2.89-2.85(1H,m),2.62-2.61(2H,m),2.47(1H,t,J=6.2Hz),1.20-1.11(12H,m).
實施例56
使用參考例50.1中所獲得之化合物am-50，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-54之siRNA(稱為O6-(3-膦醯氧基甲基)Bn dI)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6875.00，實測值6874.56
參考例51.1：化合物am-51 步驟1
使用參考例17.1之步驟2中所獲得之6-氯-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤(1.00g，1.848mmol)及(3-(2-甲氧基-2-側氧基乙基)苯基)硼酸(538mg，2.77mmol)，以與參考例6.0之步驟2同樣之方式獲得9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-(3-(2-甲氧基-2-側氧基乙基)苯基)-9H-嘌呤(860mg，71.1%)。
步驟2~6
使用步驟1中所獲得之9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-(3-(2-甲氧基-2-側氧基乙基)苯基)-9H-嘌呤，以與參考例26.1之步驟2~6同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)-5-(6-(3-(2-(2-氰基乙氧基)-2-側氧基乙基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-51)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.90,8.88(1H,2 s),8.78-8.66(1H,m),8.37,8.34(1H,2 s),7.58-7.42(4H,m),7.40-7.31(4H,m),7.30-7.16(3H,m),6.84-6.77(4H,m),6.18-6.07(1H,m),5.14-5.08(1H,m),4.48-4.35(2H,m),4.34-4.28(2H,m),4.00-3.86(1H,m),3.83(2H,s),3.76(6H,s),3.68-3.53(4H,m),3.37-3.27(1H,m),2.72-2.62(3H,m),2.32-2.26(1H,m),1.23-1.01(12H,m),0.75,0.74(9H,2 s),-0.03,-0.06,-0.21,-0.23(6H,4 s).
實施例57
使用參考例51.1中所獲得之化合物am-51，於自固相樹脂切下及保護基之脫保護時使用AMA(40%甲基胺水溶液：28%氨水=1：1之混合溶液)代替氨水，除此以外，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-55之siRNA(稱為6-(3-(N-甲基胺甲醯基)苯基)-Pu)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6823.09，實測值6821.94
參考例52.1：化合物am-52 步驟1
使用參考例41.1之步驟1中所獲得之8-溴-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤(500mg，0.727mmol)，以與參考例6.0之步驟2同樣之方式獲得9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-8-(4-硝基苯基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤(490mg，92%)。
步驟2~4
使用步驟1中所獲得之9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林- 6-基)-8-(4-硝基苯基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤，以與參考例1.1之步驟3~5同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)-5-(8-(4-硝基苯基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-52)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.68,8.63(1H,2s),8.44-8.38(m,3H),8.15-8.12(m,2H),7.82-7.72(m,3H),7.51-7.43(m,10H),7.20-7.16(m,1H),6.82-6.79(m,5H),5.92-5.83(m,2H),4.54-4.44(m,1H),4.41-4.38(m,1H),3.86-3.78(m,7H),3.65-3.59(m,4H),3.42-3.30(m,1H),2.54-2.52(m,1H),2.29-2.28(m,1H),1.17-1.11(m,12H),0.68,0.67(9H,2s),-0.06,0.07,-0.32,-0.35(6H,4s)
實施例58
使用參考例52.1中所獲得之化合物am-52，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-56之siRNA(稱為8-(4-硝基)苯基-6-苯乙烯基-Pu)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6898.10，實測值6897.83
參考例53.1：化合物am-53 步驟1
使用參考例51.1之步驟1中所獲得之9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫呋喃-2-基)-6-氯-9H-嘌呤(0.500g，0.727mmol)及2-胺基-N-甲基乙醯胺(0.192g，2.18mmol)，以與參考例39.1之步驟1同樣之方式獲得2-((9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)胺基)-N-甲基乙醯胺之粗純化物。
步驟2
使用步驟1中所獲得之2-((9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)胺基)-N-甲基乙醯胺，以與參考例50.1之步驟3同樣之方式獲得2-((9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羥基四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)胺基)-N-甲基乙醯胺(0.290g，57%)。
ESI-MS(m/z)：625(M+1)
步驟3
使用步驟2中所獲得之2-((9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羥基四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)胺基)-N-甲基乙醯胺(0.370g，0.592mmol)，以與參考例39.1之步驟2同樣之方式獲得(2R,3R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-((2-甲基胺基)-2-側氧基乙基胺基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-53)(0.121g，25%)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.35-8.34(1H,m),8.01-7.97(1H,m),7.42-7.36(2H,m),7.31-7.18(7H,m),6.81-6.74(4H,m),6.47-6.36(2H,m),6.27-6.19(1H,m),4.82-4.73(1H,m),4.35-4.26(3H,m),3.90-3.54(9H,m),3.46-3.30(2H,m),2.95-2.85(1H,m),2.84-2.78(3H,m),2.71-2.54(2H,m),2.46(1H,t,J=6.4Hz),1.21-1.10(12H,m).
實施例59
使用參考例53.1中所獲得之化合物am-53，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-57之siRNA(稱為N6-(2-甲基胺基-2-側氧基)乙基dA)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6744.97，實測值6745.41
參考例54.1：化合物am-54 步驟1
使用參考例51.1之步驟1中所獲得之9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫呋喃-2-基)-6-氯-9H-嘌呤(0.500g，0.727mmol)及3-(胺基甲基)吡啶-2(1H)-酮(0.256g，2.18mmol)，以與參考例39.1之步驟1同樣之方式獲得3-(((9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)胺基)甲基)吡啶-2(1H)-酮之粗純化物。
步驟2
使用步驟1中所獲得之3-(((9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)胺基)甲基)吡啶-2(1H)-酮，以與參考例50.1之步驟3同樣之方式獲得3-(((9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羥基四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)胺基)甲基)吡啶-2(1H)-酮(0.370g，69%)。
ESI-MS(m/z)：661(M+1)
步驟3
使用步驟2中所獲得之3-(((9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羥基四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)胺基)甲基)吡啶-2(1H)-酮(0.360g，0.486mmol)，以與參考例39.1之步驟2同樣之方式獲得(2R,3R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(((2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)胺基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-54)(0.265g，63%)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.32(1H,brs),7.97,7.95(1H,2 s),7.55(1H,d,J=6.9Hz),7.41-7.37(2H,m),7.31-7.15(9H,m),6.80-6.75(4H,m),6.45-6.41(1H,m),6.19-6.13(1H,m),4.86-4.70(3H,m),4.30-4.23(1H,m),3.93-3.51(10H,m),3.46-3.27(2H,m),2.90-2.80 (1H,m),2.68-2.54(2H,m),2.45(1H,t,J=6.4Hz),1.19-1.09(12H,m).
31P-NMR(CDCl3,162MHz)δ：149.5,149.4.
實施例60
使用參考例54.1中所獲得之化合物am-54，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-58之siRNA(稱為N6-(2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基dA)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6781.00，實測值6781.94
參考例55.1：化合物am-55 步驟1
使用參考例51.1之步驟1中所獲得之9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫呋喃-2-基)-6-氯-9H-嘌呤(0.500g，0.727mmol)及藉由J.Org.Chem，2005年，70卷，9198~9206頁所記載之方法而合成之2-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)乙烷-1-醇(0.220g，0.602mmol)，以與參考例50.1之步驟1-2同樣之方式獲得(2R,4S,5R)-5-(6-(2-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)乙氧基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-醇(0.305g，54%)。
步驟2
使用步驟1中所獲得之(2R,4S,5R)-5-(6-(2-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)乙氧基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-醇(0.300g，0.318mmol)，以與參考例39.1之步驟2同樣之方式獲得(2R,4S,5R)-5-(6-(2-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)乙氧基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-55)(0.240g，68%)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.44,8.43(1H,2 s),8.13,8.10 (1H,2 s),7.46-7.14(18H,m),6.80-6.76(8H,m),6.51-6.47(1H,m),4.85-4.72(3H,m),4.34-4.28(1H,m),3.93-3.48(18H,m),3.44-3.32(2H,m),2.92-2.84(1H,m),2.71-2.58(2H,m),2.47(1H,t,J=6.6Hz),1.21-1.11(12H,m).
31P-NMR(CDCl3,162MHz)δ：149.6,149.4.
實施例61
使用參考例55.1中所獲得之化合物am-55，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-59之siRNA(稱為O6-(2-膦醯氧基乙基)dI)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6798.91，實測值6798.98
參考例56.1：化合物am-56 步驟1
將8-溴-2'-去氧-腺苷(1g，3.03mmol)溶解於乙醇(15.2mL)中，加入二異丙基乙基胺(2.65mL，15.2mmol)及苄基胺(1.32mL，12.1mmol)，於回流下攪拌5小時。於減壓下將溶劑蒸餾去除，從而獲得8-苄基胺基-2'-去氧-腺苷之粗純化物。
步驟2
將步驟1中所獲得之8-苄基胺基-2'-去氧-腺苷溶解於DMF(15.2mL)中，加入1,1-二甲氧基-N,N-二甲基甲胺(6.04mL，45.5mmol)，於室溫下攪拌2小時。於減壓下將溶劑蒸餾去除，藉由氯仿/甲醇系之矽膠管柱層析法對殘渣進行純化，從而獲得(E)-N'-(8-(苄基胺基)-9-((2R,4S,5R)-4-羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)-N,N-二甲基甲醯亞胺醯胺(0.743g，60%)。
步驟3
使用步驟2中所獲得之(E)-N'-(8-(苄基胺基)-9-((2R,4S,5R)-4-羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)-N,N-二甲基甲醯亞胺醯 胺(0.743g，1.81mmol)，以與參考例1.1之步驟4同樣之方式獲得N-(8-(苄基胺基)-9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羥基四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)甲醯胺(0.216g，17%)。
ESI-MS(m/z)：688(M+1)
步驟4
使用步驟3中所獲得之N-(8-(苄基胺基)-9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羥基四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)甲醯胺(0.210g，0.306mmol)，以與參考例39.1之步驟2同樣之方式獲得(2R,4S,5R)-5-(8-(苄基胺基)-6-甲醯胺-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-56)(0.169g，62%)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：9.79(1H,d,J=10.6Hz),8.30(1H,d,J=2.5Hz),8.13(1H,d,J=10.6Hz),7.33-7.31(2H,m),7.24-7.17(10H,m),7.08-7.04(2H,m),6.73-6.68(4H,m),6.50-6.48(1H,m),6.34-6.31(1H,m),4.86-4.85(1H,m),4.35-4.31(1H,m),4.21-4.16(1H,m),4.04-3.94(1H,m),3.88-3.73(7H,m),3.65-3.50(4H,m),3.39-3.34(1H,m),3.04-3.00(1H,m),2.64-2.62(1H,m),2.56-2.40(2H,m),1.21-1.05(12H,m).
實施例62
使用參考例56.1中所獲得之化合物am-56，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-60之siRNA(稱為8-苄基胺基dA)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6779.03，實測值6779.44
參考例57.1：化合物am-57 步驟1
使用(5-((第三丁基二苯基矽烷基)氧基)-1,3-伸苯基)二甲醇(1.00 g，2.55mmol)，以與參考例1.1之步驟4同樣之方式獲得(3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-((第三丁基二苯基矽烷基)氧基)苯基)甲醇(0.977g，55%)。
步驟2
使用步驟1中所獲得之(3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-((第三丁基二苯基矽烷基)氧基)苯基)甲醇(0.977g，1.41mmol)及參考例51.1之步驟1中所獲得之9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫呋喃-2-基)-6-氯-9H-嘌呤(0.483g，0.703mmol)，以與參考例50.1之步驟2同樣之方式獲得9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫呋喃-2-基)-6-((3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-((第三丁基二苯基矽烷基)氧基)苄基)氧基)-9H-嘌呤之粗純化物。
步驟3
使用步驟2中所獲得之9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫呋喃-2-基)-6-((3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-((第三丁基二苯基矽烷基)氧基)苄基)氧基)-9H-嘌呤，以與參考例50.1之步驟3同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-((3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-羥基苄基)氧基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(0.514g，74%)。
步驟4
將步驟3中所獲得之(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-((3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-羥基苄基)氧基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(0.186g，0.187mmol)溶解於THF(0.935mL)中，加入氫氧化鈉水溶液(1mol/L，0.206mL，0.206 mmol)及1-(1H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-1-基)乙酮(0.036g，0.224mmol)，於室溫下攪拌4小時。向反應液中加入飽和氯化鈉水溶液，並以乙酸乙酯加以反萃取。藉由飽和食鹽水洗淨有機層，以無水硫酸鈉進行乾燥，並於減壓下將溶劑蒸餾去除。藉由己烷/乙酸乙酯系之矽膠管柱層析法對殘渣進行純化，從而獲得乙酸3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(((9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羥基四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)氧基)甲基)苯酯(0.082g，42%)。
ESI-MS(m/z)：1035(M+1)
步驟5
使用步驟4中所獲得之乙酸3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(((9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羥基四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)氧基)甲基)苯酯(0.080g，0.077mmol)，以與參考例39.1之步驟2同樣之方式獲得乙酸3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(((9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(((2-氰基乙氧基)(二異丙胺基)膦基)氧基)四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)氧基)甲基)苯酯(化合物am-57)(0.039g，41%)。
1H-NMR(CDCl3400MHz)δ：8.46(1H,d,J=1.0Hz),8.10(1H,d,J=8.9Hz),7.49-7.47(2H,m),7.40-7.17(18H,m),7.12-7.10(1H,m),6.85-6.75(8H,m),6.48-6.46(1H,m),5.65(2H,s),4.76-4.74(1H,m),4.31-4.29(1H,m),4.17(2H,s),3.78-3.34(18H,m),2.61-2.47(4H,m),2.29(3H,s),1.20-1.11(12H,m).
實施例63
使用參考例57.1中所獲得之化合物am-57，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-61之siRNA(稱為O6-(3-羥基-5-膦醯氧基甲基)Bn dI)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6890.02，實測值6889.9
參考例58.1：化合物am-58 步驟1
使用參考例51.1中所獲得之9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫呋喃-2-基)-6-氯-9H-嘌呤(0.781g，1.136mmol)及(3-(羥基甲基)苯基)硼酸(0.259g，1.70mmol)，以與參考例6.0之步驟2同樣之方式獲得(3-(9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯基)甲醇(0.721g，84%)。
步驟2
使用步驟1中所獲得之(3-(9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯基)甲醇(0.721g，0.950mmol)，以與參考例1.1之步驟4同樣之方式獲得9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫呋喃-2-基)-6-(3-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)苯基)-9H-嘌呤之粗純化物。
步驟3
使用步驟2中所獲得之9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫呋喃-2-基)-6-(3-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)苯基)-9H-嘌呤，以與參考例50.1之步驟3同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(0.809g，90%)。
ESI-MS(m/z)：948(M+1)
步驟4
使用步驟3中所獲得之(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(0.189g，0.200mmol)，以與參考例39.1之步驟2同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-58)(0.154g，67%)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.92(1H,d,J=1.8Hz),8.70(1H,d,J=7.6Hz),8.66(1H,d,J=1.3Hz),8.29(1H,d,J=9.9Hz),7.68(1H,d,J=7.6Hz),7.58-7.52(3H,m),7.46-7.38(6H,m),7.31-7.15(10H,m),6.85-6.83(4H,m),6.78-6.75(4H,m),6.56-6.53(1H,m),4.79-4.77(1H,m),4.34-4.32(3H,m),3.79-3.68(16H,m),3.47-3.32(2H,m),2.97-2.94(1H,m),2.64-2.62(2H,m),2.48-2.47(1H,m),1.19-1.14(12H,m).
實施例64
使用參考例58.1中所獲得之化合物am-58，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-62之siRNA(稱為O6-(3-羥基-5-膦醯基甲基)Bn dI)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6844.98，實測值6844.96
參考例59.1：化合物am-59 步驟1
使用參考例51.1中所獲得之9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫呋喃-2-基)-6-氯-9H-嘌呤(0.825g，1.20mmol)及(3-(3-乙氧基-3-側氧基丙基)苯基)硼酸(0.400g，1.80mmol)，以與參考例6.0之步驟2同樣之方式獲得3-(3-(9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4- ((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯基)丙酸乙酯(0.899g，90%)。
步驟2~3
使用步驟1中所獲得之3-(3-(9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯基)丙酸乙酯，以與參考例26.1之步驟2~3同樣之方式獲得3-(3-(9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羥基四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯基)丙酸2-氰基乙酯。
ESI-MS(m/z)：741(M+1)
步驟4
使用步驟3中所獲得之3-(3-(9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羥基四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯基)丙酸2-氰基乙酯(0.148g，0.200mmol)，以與參考例39.1之步驟2同樣之方式獲得3-(3-(9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(((2-氰基乙氧基)(二異丙胺基)膦基)氧基)四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯基)丙酸2-氰基乙酯(化合物am-59)(0.115g，61%)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.92(1H,d,J=1.3Hz),8.70(1H,s),8.68(1H,s),8.30(1H,d,J=10.4Hz),7.41-7.40(4H,m),7.31-7.18(7H,m),6.79-6.76(4H,m),6.56-6.54(1H,m),4.80-4.79(1H,m),4.35-4.27(3H,m),3.89-3.58(10H,m),3.48-3.33(2H,m),3.07-3.05(2H,m),2.98-2.93(1H,m),2.78-2.61(6H,m),2.48-2.47(1H,m),1.19-1.14(12H,m).
實施例65
使用參考例59.1中所獲得之化合物am-59，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-63之siRNA(稱為6-(3-羧乙基苯基)-Pu)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6807.03，實測值6807.48
參考例60.1：化合物am-60 步驟1
使用參考例17.1之步驟2中所獲得之6-氯-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-9H-嘌呤(1.10g，2.032mmol)及(3-(3-甲氧基-3-側氧基丙基)苯基)硼酸(634mg，3.05mmol)，以與參考例6.0之步驟2同樣之方式獲得9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-(3-(3-甲氧基-3-側氧基丙基)苯基)-9H-嘌呤(620mg，45.6%)。
步驟2
將步驟1中所獲得之9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-(3-(3-甲氧基-3-側氧基丙基)苯基)-9H-嘌呤(620mg，0.927mmol)溶解於四氫呋喃(10mL)中，於冰浴冷卻下加入氫硼化鋰之THF溶液(3mol/L)(1.545mL，4.63mmol)，於室溫下攪拌3小時。進一步加入氫硼化鋰之THF溶液(3mol/L)(1.545mL，4.63mmol)，於室溫下攪拌2小時。於冰浴冷卻下向反應混合物中加入飽和碳酸氫鈉水溶液，以乙酸乙酯加以萃取，藉由飽和食鹽水洗淨有機層，並藉由無水硫酸鎂進行乾燥，於減壓下將溶劑蒸餾去除，藉由乙酸乙酯/庚烷系之矽膠管柱層析法對殘渣進行純化，從而獲得9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-(3-(3-羥基丙基)苯基)-9H-嘌呤(207mg，34.8%)。
步驟3~5
使用步驟2中所獲得之9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-二第三丁基-7-(第 三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-(3-(3-羥基丙基)苯基)-9H-嘌呤，以與參考例1.1之步驟3~5同樣之方式獲得(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(3-(3-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)丙基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-60)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.90,8.88(1H,2 s),8.68-8.50(2H,m),8.35,8.31(1H,2 s),7.53-7.15(20H,m),6.85-6.77(8H,m),6.18-6.07(1H,m),5.16-5.10(1H,m),4.46-4.38(2H,m),4.02-3.85(1H,m),3.80-3.74(12H,m),3.70-3.54(4H,m),3.38-3.28(1H,m),3.17-3.11(2H,m),2.91-2.84(2H,m),2.69-2.62(1H,m),2.34-2.25(1H,m),2.07-1.96(2H,m),1.23-1.03(12H,m),0.75,0.74(9H,2 s),-0.02,-0.06,-0.21,-0.23(6H,4 s).
實施例66
使用參考例60.1中所獲得之化合物am-60，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-64之siRNA(稱為6-(間膦醯氧基丙基苯基)-Pu)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6889.03實測值6890.19
參考例61.1：化合物am-61 步驟1
使市售之(2R,3S,5R)-5-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2-(羥基甲基)四氫呋喃-3-醇(3.00g，11.1mmol)懸浮於吡啶(55mL)中，加入4,4'-二甲氧基三苯氯甲烷(4.51g，13.3mmol)，於室溫下攪拌3小時。於反應液中加入甲醇並攪拌15分鐘。加入甲苯，於減壓下將溶劑蒸餾去除。藉由己烷/乙酸乙酯系之管柱層析法對殘渣進行純化，從而獲得(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-氯-9H-嘌呤 -9-基)四氫呋喃-3-醇(4.89g，82%)。
ESI-MS(m/z)：573(M+1)
步驟2
將步驟1中所獲得之(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(250mg，0.436mmol)溶解於二甲基甲醯胺(2.5mL)中，加入水(0.5mL)、磷酸三鉀(185mg，0.872mmol)、吲哚-2-硼酸頻那醇酯(0.037mL，0.523mmol)及[1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯化鈀(II)二氯甲烷加成物(35.6mg，0.044mmol)，於80℃下攪拌1小時。將反應液過濾，以乙酸乙酯對濾液進行萃取，並藉由無水硫酸鎂進行乾燥。於減壓下將反應液之溶劑蒸餾去除，藉由己烷/乙酸乙酯系之矽膠管柱層析法對殘渣進行純化，從而獲得(2R,3S,5R)-5-(6-(1H-吲哚-2-基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-醇(151mg，53%)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：10.38(s,1H),8.84(s,1H),8.28(s,1H),7.83-7.83(m,1H),7.74-7.76(m,1H)7.50-7.52(m,1H),7.39-7.42(m,2H),7.13-7.34(m,9H),6.79-6.83(m,4H),6.53(t,J=6.4Hz,1H),4.71-4.75(m,1H),4.15-4.19(m,1H),3.76(d,J=1.3Hz,6H),3.44-3.45(m,2H),2.91-2.97(m,1H),2.57-2.64(m,1H).
ESI-MS(m/z)：654(M+1)
步驟3
使用步驟2中所獲得之(2R,3S,5R)-5-(6-(1H-吲哚-2-基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-醇，以與參考例1.1同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-5-(6-(1H-吲哚-2-基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-61)。該化合物無需進行純化而用於下一步驟。
實施例67
使用參考例61.1中所獲得之化合物am-61，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-65之siRNA(稱為6-(1H-吲哚-2-基-dPu)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6775.01，實測值6774.64
參考例62.1：化合物am-62 步驟1
將市售之9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羥基四氫呋喃-2-基)-1H-嘌呤-6(9H)-酮(5.02g，9.05mmol)懸浮於THF(250mL)中，加入二異丙基乙基胺(4.74mL，27.2mmol)及六氟磷酸1H-苯并三唑-1-基氧基-三(二甲胺基)鏻(4.83g，10.9mmol)，於室溫下攪拌2天，進一步加入六氟磷酸1H-苯并三唑-1-基氧基-三(二甲胺基)鏻(8.00g，18.1mmol)並攪拌一晚。向反應液中加入飽和碳酸氫鈉水溶液，於減壓下將溶劑蒸餾去除直至溶劑量成為約一半為止，以乙酸乙酯加以萃取，並藉由無水硫酸鎂進行乾燥。於減壓下將溶劑蒸餾去除，藉由己烷/乙酸乙酯系之矽膠管柱層析法對殘渣進行純化，從而獲得(2R,3S,5R)-5-(6-(1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-基氧基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-醇(5.77g，95%)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.34(s,1H),8.28(s,1H),8.14(d,J=8.3Hz,1H),7.20-7.56(m,12H),6.79-6.85(m,4H),6.52(t,J=6.5Hz,1H),4.70-4.73(m,1H),4.16-4.19(m,1H),3.78(s,6H),3.39-3.48(m,2H),2.84-2.91(m,1H),2.58-2.64(m,1H).
ESI-MS(m/z)：672(M+1)
步驟2
將步驟1中所獲得之(2R,3S,5R)-5-(6-(1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-基 氧基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-醇(250mg，0.436mmol)溶解於乙醇(5mL)中，加入二異丙基乙基胺(0.152mL，0.872mmol)及2-巰基乙醇(0.037mL，0.523mmol)，於60℃下攪拌1小時。進一步加入2-巰基乙醇(0.061mL，0.872mmol)，於60℃下攪拌4天。以乙酸乙酯對反應液進行萃取，並藉由無水硫酸鎂進行乾燥。於減壓下將反應液之溶劑蒸餾去除，藉由己烷/乙酸乙酯系之管柱層析法對殘渣進行純化，從而獲得(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(2-羥基乙硫基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(207mg，77%)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.57(s,1H),8.08(s,1H),7.13-7.47(m,18H),6.77-6.81(m,8H),6.45(t,J=6.5Hz,1H),4.65-4.70(m,1H),4.09-4.14(m,1H),3.77(d,J=2.8Hz,12H),3.60-3.64(m,2H),3.35-3.45(m,4H),2.80-2.87(m,1H),2.51-2.57(m,1H).
步驟3
使用步驟2中所獲得之(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(2-羥基乙硫基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇，以與參考例1.1同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-5-(6-(2-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)乙硫基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-62)。該化合物無需進行純化而用於下一步驟。
實施例68
使用參考例62.1中所獲得之化合物am-62，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-66之siRNA(稱為6-(膦醯氧基乙基)硫基-dPu)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6815.98，實測值6815.44
參考例63.1：化合物am-63 步驟1
將參考例63之步驟1中所獲得之(2R,3S,5R)-5-(6-(1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-基氧基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-醇(400mg，0.689mmol)溶解於乙醇(8mL)中，加入二異丙基乙基胺(0.247mL，1.40mmol)及4-巰基-1-丁醇(0.086mL，0.838mmol)，於60℃下攪拌3小時。進一步加入4-巰基-1-丁醇(0.144mL，1.40mmol)，於60℃下攪拌4天。進一步加入二異丙基乙基胺(0.247mL，1.40mmol)及4-巰基-1-丁醇(0.144mL，1.40mmol)，於60℃下攪拌1晚。以乙酸乙酯對反應液進行萃取，並藉由無水硫酸鎂進行乾燥。於減壓下將反應液之溶劑蒸餾去除，藉由己烷/乙酸乙酯系之矽膠管柱層析法對殘渣進行純化，從而獲得(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(4-羥基丁硫基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(341mg，76%)。
ESI-MS(m/z)：643(M+1)
步驟2
將步驟1中所獲得之(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(4-羥基丁硫基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(304mg，0.530mmol)溶解於二氯甲烷(7mL)中，加入三乙胺(0.369mL，2.65mmol)及4,4'-二甲氧基三苯氯甲烷(269mg，0.795mmol)，於室溫下攪拌一晚。向反應液中加入甲醇並攪拌30分鐘。以氯仿對反應液加以萃取，藉由無水硫酸鎂進行乾燥。於減壓下將溶劑蒸餾去除，藉由己烷/乙酸乙酯系之矽膠管柱層析法對殘渣進行純化，從而獲得(2R,3S,5R)-5-(6-(4-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)丁硫基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-醇(437mg，87%)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.59(s,1H),8.08(s,1H),7.13- 7.44(m,18H),6.78-6.82(m,8H),6.45(t,J=6.5Hz,1H),4.65-4.70(m,1H),4.11-4.14(m,1H),3.77(s,12H),3.41-3.45(m,1H),3.35-3.39(m,3H),3.10(t,J=6.2Hz,1H),2.81-2.87(m,1H),1.98-2.01(m,1H),2.51-2.57(m,1H),1.86-1.93(m,2H),1.76-1.83(m,2H).
步驟3
使用步驟2中所獲得之(2R,3S,5R)-5-(6-(4-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)丁硫基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-醇，以與參考例1.1同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-5-(6-(2-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)丁硫基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-63)。該化合物無需進行純化而用於下一步驟。
實施例69
使用參考例63.1中所獲得之化合物am-63，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-67之siRNA(稱為6-(膦醯氧基丁基)硫基-dPu)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6844.03，實測值6843.73
參考例64.1：化合物am-64 步驟1
將參考例63之步驟1中所獲得之(2R,3S,5R)-5-(6-(1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-基氧基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-醇(90.0mg，0.134mmol)溶解於乙醇(1mL)中，加入二異丙基乙基胺(0.047mL，0.268mmol)及苯硫酚(0.012mL，0.121mmol)，於60℃下攪拌1小時。於減壓下將溶劑蒸餾去除，藉由己烷/乙酸乙酯系之矽膠管柱層析法對殘渣進行純化，從而獲得(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(苯硫基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(70.1mg，71%)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.54(s,1H),8.14(s,1H),7.63-7.69(m,2H),7.45-7.49(m,3H)7.13-7.40(m,9H),6.78-6.82(m,4H),6.46(t,J=6.4Hz,1H),4.67-4.71(m,1H),4.11-4.15(m,1H),3.78(s,6H),3.34-3.45(m,2H),2.84-2.90(m,1H),2.51-2.58(m,1H).
步驟2
使用步驟1中所獲得之(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(苯硫基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇，以與參考例1.1同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(苯硫基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-64)。該化合物無需進行純化而用於下一步驟。
實施例70
使用參考例64.1中所獲得之化合物am-64，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-68之siRNA(稱為6-苯硫基-dPu)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6768.04，實測值6767.68
參考例65.1：化合物am-65 步驟1
將參考例62之步驟1中所獲得之(2R,3S,5R)-5-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2-(羥基甲基)四氫呋喃-3-醇(250mg，0.436mmol)溶解於二甲基甲醯胺(2.5mL)中，加入水(0.5mL)、磷酸三鉀(185mg，0.872mmol)、4-(羥基甲基)苯基硼酸(99.4mg，0.648mmol)及[1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯化鈀(II)二氯甲烷加成物(35.6mg，0.044mmol)，於80℃下攪拌1小時。將反應液過濾，以乙酸乙酯對濾液進行萃取，並藉由無水硫酸鎂進行乾燥。於減壓下將反應液之溶劑蒸餾去除，藉由己烷/乙酸乙酯系之管柱層析法對殘渣進行純化，從而獲得(2R,3S,5R)-2- ((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(4-(羥基甲基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(166mg，61%)。
ESI-MS(m/z)：654(M+1)
步驟2
將步驟1中所獲得之(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(4-(羥基甲基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(165mg，0.256mmol)溶解於二氯甲烷(3mL)中，加入三乙胺(0.178mL，1.28mmol)及4,4'-二甲氧基三苯氯甲烷(130mg，0.384mmol)，於室溫下攪拌一晚。向反應液中加入甲醇並攪拌30分鐘。以氯仿對反應液加以萃取，並藉由無水硫酸鎂進行乾燥。於減壓下將溶劑蒸餾去除，藉由己烷/乙酸乙酯系之矽膠管柱層析法對殘渣進行純化，從而獲得(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(4-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(產量180mg，74%)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.93(s,1H),8.73-8.75(d,J=8.4Hz,2H),8.26(s,1H),7.59(d,J=8.6Hz,2H),7.52-7.54(m,2H),7.39-7.44(m,6H),7.14-7.33(m,11H),6.83-6.87(m,4H),6.78-6.82(m,4H),6.55(t,J=6.5Hz,1H),4.70-4.74(m,1H),4.15-4.18(dd,J=3.8Hz,1H),3.76-3.80(m,12H),3.40-3.48(m,2H),2.90-2.96(m,1H),2.57-2.63(m,1H).
ESI-MS(m/z)：947(M+1)
步驟3
使用步驟2中所獲得之(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(4-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇，以與參考例1.1同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(4-((雙(4-甲氧基苯 基)(苯基)甲氧基)甲基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-65)。該化合物無需進行純化而用於下一步驟。
實施例71
使用參考例65.1中所獲得之化合物am-65，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-69之siRNA(稱為6-(4-膦醯氧基甲基)苯基-dPu)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6845.98，實測值6845.62
實施例72
使用參考例51.1中所獲得之化合物am-51，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-70之siRNA(稱為6-(3-羧乙基苯基)-Pu)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6809.00，實測值6804.3
參考例66.1：化合物am-66 步驟1
使用參考例51.1之步驟1中所獲得之9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫呋喃-2-基)-6-氯-9H-嘌呤(0.500g，0.727mmol)及4-胺基丁-2-炔-1-醇鹽酸鹽(0.265g，2.18mmol)，以與參考例53.1之步驟1同樣之方式獲得4-((9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)胺基)丁-2-炔-1-醇(0.280g，52%)。
步驟2~3
使用步驟1中所獲得之4-((9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)胺基)丁-2-炔-1-醇(0.280g，0.380mmol)，以與參考例 1.1之步驟4及參考例50.1之步驟3同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-5-(6-((4-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)丁-2-炔-1-基)胺基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-醇(0.240g，68%)。
ESI-MS(m/z)：924(M+1)
步驟4
使用步驟3中所獲得之(2R,3S,5R)-5-(6-((4-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)丁-2-炔-1-基)胺基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-醇(0.240g，0.260mmol)，以與參考例39.1之步驟2同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-5-(6-((4-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)丁-2-炔-1-基)胺基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-66)(0.168g，57%)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.35(1H,s),7.97,7.95(1H,2 s),7.46-7.17(18H,m),6.84-6.76(8H,m),6.45-6.41(1H,m),5.82(1H,brs),4.78-4.71(1H,m),4.47(2H,brs),4.30-4.26(1H,m),3.95-3.54(18H,m),3.44-3.30(2H,m),2.91-2.83(1H,m),2.68-2.55(2H,m),2.46(1H,t,J=6.4Hz),1.20-1.11(12H,m).
實施例73
使用參考例66.1中所獲得之化合物am-66，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-71之siRNA(稱為N6-(4-膦醯氧基-2-丁炔基)dA)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6821.66，實測值6823.08
參考例67.1：化合物am-67 步驟1
使用(2-碘苯基)甲醇(3.00g，12.8mmol)，以與參考例1.1之步驟4 同樣之方式獲得4,4'-(((2-碘苄基)氧基)(苯基)亞甲基)雙(甲氧基苯)之粗純化物(7.67g)。
步驟2
將步驟1中所獲得之4,4'-(((2-碘苄基)氧基)(苯基)亞甲基)雙(甲氧基苯)(2.00g)溶解於THF(19.0mL)中，加入三乙胺(19mL)、炔丙基胺(1.43mL，22.4mmol)及碘化銅(71.8mg，0.337mmol)，吹入10分鐘之氬氣進行脫氣。向混合物中加入四(三苯基膦)鈀(0.216g，0.187mmol)，於室溫下攪拌23小時。藉由矽藻土過濾反應液，並於減壓下將濾液濃縮。將殘渣溶解於二氯甲烷中，以水洗淨，並藉由二氯甲烷進一步對水層進行萃取後，合併有機層，藉由無水硫酸鈉進行乾燥，並於減壓下進行濃縮。藉由矽膠管柱層析法(展開溶劑：僅含有1%三乙胺之氯仿)對所得之粗產物進行純化，從而獲得3-(2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)苯基)丙-2-炔-1-胺(0.650g，35%)。
步驟3~4
使用參考例51.1之步驟1中所獲得之9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫呋喃-2-基)-6-氯-9H-嘌呤(0.400g，0.582mmol)及步驟2中所獲得之3-(2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)苯基)丙-2-炔-1-胺(0.650g，1.40mmol)，以與參考例53.1之步驟1及參考例50.1之步驟3同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-((3-(2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)苯基)丙-2-炔-1-基)胺基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(0.240g，36%)。
ESI-MS(m/z)：1000(M+1)
步驟5
使用步驟4中所獲得之(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-((3-(2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)苯基)丙 -2-炔-1-基)胺基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(0.240g，0.211mmol)，以與參考例39.1之步驟2同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-((3-(2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)苯基)丙-2-炔-1-基)胺基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-67)(0.106g，42%)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.33(1H,s),7.97,7.95(1H,2 s),7.73,7.71(1H,2brs),7.52-7.48(2H,m),7.42-7.35(8H,m),7.31-7.16(11H,m),6.85-6.75(8H,m),6.48-6.42(1H,m),5.76(1H,brs),4.80-4.71(1H,m),4.54(2H,brs),4.29(3H,brs),3.94-3.31(18H,m),3.04-2.56(3H,m),2.46(1H,t,J=6.4Hz),1.29-1.11(12H,m).
實施例74
使用參考例67.1中所獲得之化合物am-67，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-72之siRNA(稱為N6-(2-膦醯氧基甲基)苯基炔丙基dA)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6897.76，實測值6898.86
參考例68.1：化合物am-68 步驟1~5
使用(3-碘苯基)甲醇，以與參考例67.1之步驟1~5同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-((3-(3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)苯基)丙-2-炔-1-基)胺基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-68)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.38(1H,s),7.98,7.96(1H,2 s),7.51-7.16(22H,m),6.85-6.76(8H,m),6.46-6.42(1H,m),5.96(1H,brs),4.79-4.65(3H,m),4.32-4.26(1H,m),4.15-4.10(2H,m),3.96-3.32(18H,m),2.92-2.84(1H,m),2.69-2.56(2H,m),2.46(1H,t,J=6.6Hz), 1.20-1.10(12H,m).
實施例75
使用參考例68.1中所獲得之化合物am-68，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-73之siRNA(稱為N6-(3-膦醯氧基甲基)苯基炔丙基dA)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6897.76，實測值6898.90
參考例69.1：化合物am-69 步驟1~5
使用(4-碘苯基)甲醇，以與參考例67.1之步驟1~5同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-((3-(4-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)苯基)丙-2-炔-1-基)胺基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-69)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.38(1H,s),7.99,7.96(1H,2 s),7.51-7.47(2H,m),7.40-7.18(20H,m),6.85-6.76(8H,m),6.46-6.42(1H,m),5.96(1H,brs),4.80-4.64(3H,m),4.31-4.26(1H,m),4.15(2H,s),3.96-3.31(18H,m),2.93-2.56(3H,m),2.46(1H,t,J=6.4Hz),1.20-1.11(12H,m).
實施例76
使用參考例69.1中所獲得之化合物am-69，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-74之siRNA(稱為N6-(4-膦醯氧基甲基)苯基炔丙基dA)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6897.76，實測值6899.02
參考例70.1：化合物am-70 步驟1
將參考例63之步驟1中所獲得之(2R,3S,5R)-5-(6-(1H-苯并 [d][1,2,3]三唑-1-基氧基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-醇(350mg，0.521mmol)溶解於乙醇(5.2mL)中，加入二異丙基乙基胺(0.273mL，1.56mmol)及4-羥基苯硫酚(78.9mg，0.625mmol)，於60℃下攪拌1小時。進一步加入4-羥基苯硫酚(32.9mg，0.261mmol)並攪拌1小時。於減壓下將反應液之溶劑蒸餾去除，對析出物進行過濾。於減壓下將濾液之溶劑蒸餾去除，藉由胺基矽膠管柱層析法(氯仿/甲醇)對殘渣進行純化，從而獲得(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(4-羥基苯硫基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(282mg，82%)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.55(s,1H),8.15(s,1H),7.45-7.49(m,2H),7.36-7.39(m,2H),7.18-7.30(m,7H),6.83-6.87(m,2H),6.78-6.82(m,4H),6.46(t,J=6.5Hz,1H),6.40(s,1H),4.66-4.71(m,1H),4.12-4.15(m,1H),3.78(s,6H),3.35-3.45(m,2H),2.82-2.89(m,1H),2.52-2.58(m,1H).
ESI-MS(m/z)：663(M+1)
步驟2
將步驟1中所獲得之(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(4-羥基苯硫基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(280mg，0.422mmol)溶解於二氯甲烷(4.2mL)中，加入三乙胺(0.178mL，1.27mmol)及特戊醯氯(0.078mL，0.643mmol)，於室溫下攪拌1小時。向反應液中加入飽和碳酸氫鈉水溶液(4mL)並攪拌30分鐘。以氯仿對反應液加以萃取，藉由無水硫酸鎂進行乾燥。於減壓下將溶劑蒸餾去除，藉由己烷/乙酸乙酯系之管柱層析法對殘渣進行純化，從而獲得特戊酸4-(9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羥基四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基硫基)苯酯(304mg，78%)。
ESI-MS(m/z)：747(M+1)
步驟3
使用步驟2中所獲得之特戊酸4-(9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羥基四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基硫基)苯酯，以與參考例1.1同樣之方式獲得特戊酸4-(9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((2-氰基乙氧基)(二異丙胺基)膦基氧基)四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基硫基)苯酯(化合物am-70)。該化合物無需進行純化而用於下一步驟。
實施例77
使用參考例70.1中所獲得之化合物am-70，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-75之siRNA(稱為6-(4-羥基)苯硫基-dPu)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6784.04，實測值6784.15
參考例71.1：化合物am-71 步驟1
將參考例63之步驟1中所獲得之(2R,3S,5R)-5-(6-(1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-基氧基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-醇(350mg，0.521mmol)溶解於乙醇(5.2mL)中，加入二異丙基乙基胺(0.273mL，1.56mmol)及3-羥基苯硫酚(0.063mL，0.625mmol)，於60℃下攪拌1小時。進一步加入3-羥基苯硫酚(0.026mL，0.261mmol)並攪拌1小時。於減壓下將反應液之溶劑蒸餾去除，並對所得之殘渣進行過濾。於減壓下將濾液之溶劑蒸餾去除，藉由氯仿/甲醇系之NH管柱層析法對殘渣進行純化，從而獲得(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(3-羥基苯硫基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(267mg，77%)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.55(s,1H),8.15(s,1H),7.16-7.39(m,11H),7.07-7.08(m,1H),6.88-6.91(m,1H),6.77-6.82(m, 4H),6.64(bs,1H),6.45(t,J=6.4Hz,1H),4.69-4.72(m,1H),4.11-4.15(m,1H),3.78(s,6H),3.35-3.44(m,2H),2.85-2.91(m,1H),2.53-2.59(m,1H).
ESI-MS(m/z)：663(M+1)
步驟2
將步驟1中所獲得之(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(3-羥基苯硫基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(265mg，0.400mmol)溶解於二氯甲烷(4mL)中，加入三乙胺(0.167mL，1.20mmol)及特戊醯氯(0.073mL，0.600mmol)，於室溫下攪拌1小時。向反應液中加入飽和碳酸氫鈉水溶液(4mL)並攪拌30分鐘。以氯仿對反應液加以萃取，並藉由無水硫酸鎂進行乾燥。於減壓下將溶劑蒸餾去除，藉由己烷/乙酸乙酯系之矽膠管柱層析法對殘渣進行純化，從而獲得特戊酸3-(9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羥基四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基硫基)苯酯(263mg，88%)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.55(s,1H),8.14(s,1H),7.20-7.56(m,13H),6.78-6.82(m,4H),6.46(t,J=6.5Hz,1H),4.66-4.71(m,1H),4.11-4.15(m,1H),3.78(s,6H),3.35-3.45(m,2H),2.84-2.90(m,1H),2.52-2.58(m,1H),1.35(s,9H).
ESI-MS(m/z)：747(M+1)
步驟3
使用步驟2中所獲得之特戊酸3-(9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羥基四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基硫基)苯酯，以與參考例1.1同樣之方式獲得特戊酸3-(9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((2-氰基乙氧基)(二異丙胺基)膦基氧基)四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基硫基)苯酯(化合物am-71)。該化合物無需進行純化而用於下一步驟。
實施例78
使用參考例71.1中所獲得之化合物am-71，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-76之siRNA(稱為6-(3-羥基苯基)硫基-dPu)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6784.04，實測值6783.69
參考例72.1：化合物am-72 步驟1
將參考例63之步驟1中所獲得之(2R,3S,5R)-5-(6-(1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-基氧基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-醇(350mg，0.521mmol)溶解於乙醇(5.2mL)中，加入二異丙基乙基胺(0.273mL，1.56mmol)及2-巰基苄醇(124mg，0.886mmol)，於60℃下攪拌1小時。於減壓下將反應液之溶劑蒸餾去除，並對所得之殘渣進行過濾。於減壓下將濾液之溶劑蒸餾去除，藉由氯仿/甲醇系之NH管柱層析法對殘渣進行純化，從而獲得(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(3-(羥基甲基)苯硫基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(310mg，98%)。
ESI-MS(m/z)：677(M+1)
步驟2
將步驟1中所獲得之(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(3-(羥基甲基)苯硫基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(304mg，0.449mmol)溶解於二氯甲烷(4.5mL)中，加入三乙胺(0.313mL，2.46mmol)及4,4'-二甲氧基三苯氯甲烷(305mg，0.898mmol)，並於室溫下攪拌2小時。向反應液中加入甲醇並攪拌30分鐘。以氯仿對反應液加以萃取，藉由無水硫酸鎂進行乾燥。於減壓下將溶劑蒸餾去除，藉由己烷/乙酸乙酯系之矽膠管柱層析法對殘渣進行純化，從而獲得(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(3- ((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)苯硫基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(301mg，59%)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.55(s,1H),8.14(s,1H),7.14-7.66(m,22H),6.78-6.84(m,8H),6.46(t,J=6.5Hz,1H),4.66-4.70(m,1H),4.22(s,2H),4.12-4.15(m,1H),3.78(d,J=2.5Hz,12H),3.34-3.45(m,2H),2.83-2.89(m,1H),2.52-2.58(m,1H).
ESI-MS(m/z)：979(M+1)
步驟3
使用步驟2中所獲得之(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)苯硫基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇，以與參考例1.1同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)苯硫基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-72)。該化合物無需進行純化而用於下一步驟。
實施例79
使用參考例72.1中所獲得之化合物am-72，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-77之siRNA(稱為6-(3-膦醯氧基甲基)苯硫基-dPu)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6878.05，實測值6877.67
參考例73.1：化合物am-73 步驟1
使用藉由J.Am.Chem.Soc，1991年，第113卷，4329~4331頁所記載之方法而合成之(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(0.400g，0.698mmol)及3-(甲氧基羰基)苯硼酸(0.380g，2.09mmol)，以與參考例6.0之步驟2同 樣之方式獲得3-(9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羥基四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酸甲酯(0.275g，57%)。
ESI-MS(m/z)：673(M+1)
步驟2
使用步驟1中所獲得之3-(9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羥基四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酸甲酯(0.275g，0.401mmol)，以與參考例39.1之步驟2同樣之方式獲得3-(9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(((2-氰基乙氧基)(二異丙胺基)膦基)氧基)四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酸甲酯(化合物am-73)(97.0mg，28%)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：9.41(1H,brs),9.03,9.01(1H,2 brs),8.97,8.97(1H,2 s),8.34,8.31(1H,2 s),8.23-8.19(1H,m),7.65(1H,t,J=8.0Hz),7.42-7.38(2H,m),7.32-7.16(7H,m),6.82-6.75(4H,m),6.58-6.54(1H,m),4.84-4.76(1H,m),4.38-4.31(1H,m),3.98(3H,s),3.93-3.56(10H,m),3.49-3.34(2H,m),3.01-2.93(1H,m),2.78-2.61(2H,m),2.48(1H,t,J=6.4Hz),1.22-1.13(12H,m).
實施例80
使用參考例73.1中所獲得之化合物am-73，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-78之siRNA(稱為6-(3-胺甲醯基)苯基-Pu)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6777.71，實測值6778.90
實施例81
使用參考例73.1中所獲得之化合物am-73，以與實施例57同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-79之siRNA(稱為6-(3-(N-甲基胺甲醯基))苯基-Pu)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6791.74，實測值6793.01
參考例74：化合物am-74 步驟1~2
使用3-(甲基磺醯基)苯基硼酸，以與參考例73.1之步驟1~2同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(3-(甲基磺醯基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-74)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：9.43(1H,brs),9.20-9.17(1H,m),8.98,8.98(1H,2 s),8.37,8.34(1H,2 s),8.12,8.10(1H,2 brs),7.78(1H,dd,J=8.0,8.0Hz),7.45-7.15(9H,m),6.83-6.75(4H,m),6.60-6.55(1H,m),4.89-4.76(1H,m),4.39-4.32(1H,m),3.95-3.56(10H,m),3.52-3.33(2H,m),3.17(3H,s),3.02-2.94(1H,m),2.80-2.62(2H,m),2.49(1H,t,J=6.4Hz),1.25-1.14(12H,m).
實施例82
使用參考例74.1中所獲得之化合物am-74，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-80之siRNA(稱為6-(3-甲基磺醯基)苯基-Pu)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6812.78，實測值6814.23
參考例75：化合物am-75 步驟1~2
使用3-氰基甲基苯基硼酸，以與參考例73.1之步驟1~2同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(3-(氰基甲基)苯基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-75)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.95,8.94(1H,2 s),8.80,8.78(1H,2 brs),8.72(1H,brs),8.34,8.32(1H,2 s),7.61-7.52(2H,m), 7.41-7.38(2H,m),7.31-7.16(7H,m),6.80-6.77(4H,m),6.58-6.54(1H,m),4.85-4.76(1H,m),4.38-4.31(1H,m),3.90(2H,s),3.90-3.58(10H,m),3.49-3.34(2H,m),3.00-2.93(1H,m),2.78-2.61(2H,m),2.48(1H,t,J=6.4Hz),1.22-1.13(12H,m).
實施例83
使用參考例75.1中所獲得之化合物am-75，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-81之siRNA(稱為6-(3-氰基甲基)苯基-Pu)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6773.72，實測值6775.60
參考例76.1：化合物am-76 步驟1
於氬氣環境下，使1,2,4-苯三甲醇(4.55g，27.1mmol)懸浮於2,2-二甲氧基丙烷(14.0mL)中，加入對甲苯磺酸一水合物(0.256g，1.35mmol)，並於室溫下攪拌35分鐘。加入三乙胺(0.250mL，1.79mmol)而停止反應，並於減壓下將反應液濃縮。藉由矽膠管柱層析法(含有1%三乙胺之氯仿/甲醇=1/0→10/1)對所得之粗產物進行純化，從而獲得(3,3-二甲基-1,5-二氫苯并[e][1,3]二庚英-7-基)甲醇(2.73g，48%)。
步驟2
使用步驟1中所獲得之(3,3-二甲基-1,5-二氫苯并[e][1,3]二庚英-7-基)甲醇(1.18g，5.65mmol)及藉由Org.Lett.，2005年，7卷，999~1002頁所記載之方法而合成之6-氯-9-(2'-去氧-3',5'-雙-O-(第三丁基二甲基矽烷基)-β-D-赤型戊呋喃糖基)嘌呤(1.50g，3.01mmol)，以與參考例50.1之步驟2同樣之方式獲得9-((2R,4S,5R)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)甲基)四氫呋喃-2-基)-6-((3,3-二甲基-1,5-二氫苯并[e][1,3]二庚英-7-基)甲氧基)-9H-嘌呤 (1.37g，68%)。
步驟3
對步驟2中所獲得之9-((2R,4S,5R)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)甲基)四氫呋喃-2-基)-6-((3,3-二甲基-1,5-二氫苯并[e][1,3]二庚英-7-基)甲氧基)-9H-嘌呤(1.30g，1.94mmol)進行冰浴冷卻，加入80%(v/v)乙酸水溶液(26.0mL)，並於室溫下攪拌20分鐘。歷經20分鐘將反應液逐次加入經冰浴冷卻之飽和碳酸氫鈉水溶液中而停止反應，並以乙酸乙酯進行萃取。藉由飽和食鹽水洗淨有機層，並藉由無水硫酸鈉進行乾燥，於減壓下進行濃縮，從而獲得(4-(((9-((2R,4S,5R)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)甲基)四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)氧基)甲基)-1,2-伸苯基)二甲醇之粗產物。
步驟4
使用步驟3中所獲得之(4-(((9-((2R,4S,5R)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)甲基)四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)氧基)甲基)-1,2-伸苯基)二甲醇之粗產物，以與參考例1.1之步驟4同樣之方式獲得6-((3,4-雙((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)苄基)氧基)-9-((2R,4S,5R)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)甲基)四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤之粗產物。
步驟5
使用步驟4中所獲得之6-((3,4-雙((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)苄基)氧基)-9-((2R,4S,5R)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)甲基)四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤之粗產物，以與參考例50.1之步驟3同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-5-(6-((3,4-雙((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)苄基)氧基)-9H-嘌呤-9-基)-2- (羥基甲基)四氫呋喃-3-醇(1.22g，56%)。
步驟6
使用步驟5中所獲得之(2R,3S,5R)-5-(6-((3,4-雙((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)苄基)氧基)-9H-嘌呤-9-基)-2-(羥基甲基)四氫呋喃-3-醇(1.22g，1.10mmol)，以與參考例1.1之步驟4同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-5-(6-((3,4-雙((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)苄基)氧基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-醇(0.732g，48%)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.50(1H,s),8.06(1H,s),7.71(1H,d,J=1.6Hz),7.61(1H,d,J=7.8Hz),7.53(1H,dd,J=7.8,1.6Hz),7.41-7.16(27H,m),6.81-6.79(4H,m),6.74-6.69(8H,m),6.48(1H,t,J=6.4Hz),5.74(2H,s),4.70-4.66(1H,m),4.16-4.12(1H,m),4.03(4H,s),3.77(6H,s),3.76(6H,s),3.76(6H,s),3.45(1H,dd,J=10.3,4.8Hz),3.38(1H,dd,J=10.3,5.3Hz),2.84(1H,ddd,J=13.7,6.4,6.4Hz),2.57-2.52(1H,m).
步驟7
使用步驟6中所獲得之(2R,3S,5R)-5-(6-((3,4-雙((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)苄基)氧基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-醇(0.732g，0.525mmol)，以與參考例39.1之步驟2同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-5-(6-((3,4-雙((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)苄基)氧基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙氧基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-76)(0.566g，71%)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.45(1H,s),8.11,8.09(1H,2 s),7.70(1H,brs),7.60(1H,d,J=7.8Hz),7.53(1H,dd,J=7.8,1.8Hz),7.40-7.15(27H,m),6.79-6.75(4H,m),6.73-6.68(8H,m),6.50-6.46 (1H,m),5.73(2H,s),4.80-4.72(1H,m),4.33-4.29(1H,m),4.02(4H,s),3.93-3.55(22H,m),3.43-3.32(2H,m),2.92-2.84(1H,m),2.70-2.57(2H,m),2.47(1H,t,J=6.4Hz),1.21-1.11(12H,m).
實施例84
使用參考例76.1中所獲得之化合物am-76，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-82之siRNA(稱為O6-(3,4-二膦醯氧基甲基)Bn dI)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6984.72，實測值6986.66
參考例77.1：化合物am-77 步驟1
使用5-氟-1,3-苯三甲醇(0.638g，4.09mmol)，以與參考例1.1之步驟4同樣之方式獲得(3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-氟苯基)甲醇(0.898g，48%)。
步驟2
使用步驟1中所獲得之(3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-氟苯基)甲醇(0.400g，0.872mmol)及藉由J.Am.Chem.Soc，1991年，113卷，4329~4331頁所記載之方法而合成之(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-氯-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(0.333g，0.582mmol)，以與參考例50.1之步驟2同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-((3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-氟苄基)氧基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(0.180g，31%)。
ESI-MS(m/z)：995(M+1)
步驟3
使用步驟2中所獲得之(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-((3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-氟苄基) 氧基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(0.180g，0.181mmol)，以與參考例39.1之步驟2同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-((3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-氟苄基)氧基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙氧基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-77)(0.135g，62%)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.46,8.45(1H,2 s),8.12,8.09(1H,2 s),7.50-7.12(21H,m),6.85-6.76(8H,m),6.49-6.45(1H,m),5.63(2H,s),4.80-4.72(1H,m),4.33-4.28(1H,m),4.16(2H,s),3.96-3.55(16H,m),3.42-3.32(2H,m),2.92-2.84(1H,m),2.70-2.57(2H,m),2.47(1H,t,J=6.4Hz),1.20-1.11(12H,m).
實施例85
使用參考例77.1中所獲得之化合物am-77，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-83之siRNA(稱為O6-(3-氟-5-膦醯氧基甲基)Bn dI)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6892.71，實測值6894.36
參考例78.1：化合物am-78 步驟1~3
將參考例58.1之步驟1中所獲得之(3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-((第三丁基二苯基矽烷基)氧基)苯基)甲醇(2.60g，3.74mmol)溶解於二氯甲烷(37.0mL)中。加入三乙胺(1.04mL，7.48mmol)後進行冰浴冷卻，緩慢滴加甲磺醯氯(0.347mL，4.49mmol)，於冰浴冷卻下攪拌50分鐘。於冰浴冷卻下向反應液中加入水而停止反應，以二氯甲烷加以萃取。藉由飽和食鹽水(50mL)洗淨有機層，並藉由無水硫酸鈉進行乾燥，於減壓下進行濃縮，從而獲得甲磺酸3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-((第三丁基二苯基矽烷基)氧基)苄酯之粗產物。將所得之粗產物溶解於DMF(37.0mL)中，加入疊 氮化鈉(0.291g，4.49mmol)並於60℃下攪拌4小時。向反應液中加入乙酸乙酯，藉由飽和食鹽水洗淨2次。藉由無水硫酸鈉對有機層進行乾燥，於減壓下進行濃縮，向所得之粗產物中加入甲醇(37.0mL)而使其懸浮，並加入三苯基膦(0.980g，3.74mmol)，回流55分鐘。將反應液放置冷卻後，於減壓下進行濃縮，於殘渣中加入庚烷(50.0mL)及三乙胺(0.100mL)，於40℃下進行懸浮清洗後過濾，於減壓下將濾液濃縮。將加入庚烷及三乙胺進行懸浮清洗、直至減縮濃縮為止之操作進一步重複進行3次。藉由矽膠管柱層析法(展開溶劑：含有1%三乙胺之正庚烷/氯仿=1/0→0/1→氯仿/甲醇=1/0→10/1)對所得之殘渣進行純化，從而獲得(3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-((第三丁基二苯基矽烷基)氧基)苯基)甲胺(1.62g，含有三苯基氧化膦)。
步驟4
使用步驟3中所獲得之(3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-((第三丁基二苯基矽烷基)氧基)苯基)甲胺(0.784g，含有三苯基氧化膦)，以與參考例39.1之步驟1同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-((3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-((第三丁基二苯基矽烷基)氧基)苄基)胺基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(0.285g，58%)。
ESI-MS(m/z)：1230(M+1)
步驟5
使用步驟4中所獲得之(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-((3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-((第三丁基二苯基矽烷基)氧基)苄基)胺基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(0.285g，0.232mmol)，以與參考例39.1之步驟2同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-((3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-((第三丁基二苯基矽烷基)氧基)苄 基)胺基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙氧基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-78)(0.240g，72%)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.28(1H,s),7.93,7.90(1H,2 s),7.69(4H,d,J=6.4Hz),7.42-7.15(24H,m),6.82-6.72(11H,m),6.46-6.42(1H,m),5.84(1H,brs),4.79-4.57(3H,m),4.31-4.26(1H,m),3.94(2H,s),3.89-3.31(16H,m),3.45-3.31(2H,m),2.90-2.81(1H,m),2.68-2.54(2H,m),2.46(1H,t,J=6.6Hz),1.20-1.11(12H,m),1.09(9H,s).
實施例86
使用參考例78.1中所獲得之化合物am-78，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-84之siRNA(稱為N6-(3-羥基-5-膦醯氧基甲基)Bn dA)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6889.73，實測值6891.42
參考例79.1：化合物am-79 步驟1
將參考例48.1之步驟1中所獲得之(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-((3-(羥基甲基)苄基)胺基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(0.337g，0.500mmol)溶解於DMF(11.7mL)中，加入二異丙基乙基胺(1.02mL，5.86mmol)及乙醯丙酸(0.144mL，1.41mmol)、以及1-[雙(二甲胺基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓-3-氧化物六氟磷酸鹽(HATU)(0.892g，2.35mmol)，於室溫下進行徹夜攪拌。向反應液中加入飽和碳酸氫鈉水溶液，以乙酸乙酯進行萃取。藉由水及飽和食鹽水洗淨有機層，並藉由無水硫酸鈉進行乾燥，於減壓下進行濃縮。藉由氯仿/甲醇系之矽膠管柱層析法對殘渣進行純化，從而獲得4-側氧基戊酸3-(((9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羥基四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)胺基)甲基)苄酯(0.350g，39%)。
ESI-MS(m/z)：772(M+1)
步驟2
使用步驟1中所獲得之4-側氧基戊酸3-(((9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羥基四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)胺基)甲基)苄酯(0.350g，0.453mmol)，以與參考例39.1之步驟2同樣之方式獲得4-側氧基戊酸3-(((9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(((2-氰基乙氧基)(二異丙胺基)膦基)氧基)四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)胺基)甲基)苄酯(化合物am-79)(0.110g，25%)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.35(1H,s),7.94(1H,d,J=9.4Hz),7.41-7.16(13H,m),6.79-6.77(4H,m),6.46-6.42(1H,m),6.02(1H,brs),5.09(2H,s),4.88(2H,brs),4.78-4.71(1H,m),4.29-4.27(1H,m),4.23-3.30(13H,m),2.91-2.44(7H,m),2.17(3H,s),1.17-1.12(12H,m).
實施例87
與實施例1同樣地使用化合物am-79而固相合成反義鏈後，浸漬於肼溶液(0.5mol/L，於乙酸/吡啶=3：2中，500μL)，於室溫下靜置20分鐘。藉由乙腈洗淨樹脂後，藉由核酸合成機使市售之2-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)乙基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺及磷酸化試劑依序偶合。對所得之固相樹脂進行與參考例1同樣之後處理，從而合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-85之siRNA。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6998.05，實測值6998.23
參考例80.1：化合物am-80 步驟1
將市售之3-胺基苄醇(500mg，4.06mmol)溶解於DMF(40mL)中，加入咪唑(415mg，6.09mmol)及第三丁基二甲基氯矽烷(734 mg，4.87mmol)，於室溫下攪拌1小時。向反應液中加入水並攪拌15分鐘。以乙酸乙酯對反應液進行萃取，並藉由無水硫酸鎂進行乾燥，於減壓下將溶劑蒸餾去除，藉由己烷/乙酸乙酯系之矽膠管柱層析法對殘渣進行純化，從而獲得3-((第三丁基二甲基矽烷基氧基)甲基)苯胺(893mg，93%)。
ESI-MS(m/z)：238(M+1)
步驟2
將市售之9-((2R,4S,5R)-4-羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)-1H-嘌呤-6(9H)-酮(500mg，1.98mmol)懸浮於DMF(13mL)中，加入咪唑(944.7mg，13.9mmol)及第三丁基二甲基氯矽烷(1.20g，7.93mmol)，於室溫下攪拌一晚。向反應液中加入水並攪拌30分鐘。以乙酸乙酯對反應液進行萃取，並藉由無水硫酸鎂進行乾燥。於減壓下將溶劑蒸餾去除，將殘渣溶解於第三丁基甲基醚中，並加入己烷，濾取析出物，從而獲得9-((2R,4S,5R)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)-5-((第三丁基二甲基矽烷基氧基)甲基)四氫呋喃-2-基)-1H-嘌呤-6(9H)-酮(886mg，93%)。
ESI-MS(m/z)：481(M+1)
步驟3
將步驟2中所獲得之9-((2R,4S,5R)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)-5-((第三丁基二甲基矽烷基氧基)甲基)四氫呋喃-2-基)-1H-嘌呤-6(9H)-酮(878mg，1.83mmol)溶解於THF(44mL)中，加入二異丙基乙基胺(956mL，5.48mmol)及六氟磷酸1H-苯并三唑-1-基氧基-三(二甲胺基)鏻(2.42g，5.48mmol)，於室溫下攪拌2天。向反應液中加入飽和碳酸氫鈉水溶液，並對反應液進行過濾。藉由乙酸乙酯對濾液進行萃取，並藉由無水硫酸鎂進行乾燥。於減壓下將溶劑蒸餾去除，並進行過濾。於減壓下將溶劑蒸餾去除，藉由己烷/乙酸乙酯系之管柱層 析法對殘渣進行純化，從而獲得6-(1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-基氧基)-9-((2R,4S,5R)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)-5-((第三丁基二甲基矽烷基氧基)甲基)四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤(535mg，49%)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.54(s,1H),8.41(s,1H),8.13-8.16(m,1H),7.44-7.56(m,3H),6.55(t,J=6.3Hz,1H),4.63-4.66(m,1H),4.05-4.08(m,1H),3.90-3.94(m,1H),3.78-3.82(m,1H),2.62-2.68(m,1H),2.45-2.55(m,1H),0.91-0.94(m,18H),0.10-0.12(m,18H).
步驟4
將步驟3中所獲得之6-(1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-基氧基)-9-((2R,4S,5R)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)-5-((第三丁基二甲基矽烷基氧基)甲基)四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤(179mg，0.300mmol)及步驟1中所獲得之3-((第三丁基二甲基矽烷基氧基)甲基)苯胺(142mg，0.600mmol)溶解於乙醇(3mL)中，加入二異丙基乙基胺(0.104mL，0.600mmol)，於60℃下攪拌1晚，進而於80℃下攪拌5小時。於減壓下將反應液之溶劑蒸餾去除，藉由己烷/乙酸乙酯系之矽膠管柱層析法對殘渣進行純化，從而獲得9-((2R,4S,5R)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)-5-((第三丁基二甲基矽烷基氧基)甲基)四氫呋喃-2-基)-N-(3-((第三丁基二甲基矽烷基氧基)甲基)苯基)-9H-嘌呤-6-胺(164mg，78%)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.52(s,1H),8.18(s,1H),7.83(bs,1H),7.66-7.69(m,2H),7.34(t,J=7.9Hz,1H),7.04-4.07(m,1H),6.49(t,J=6.5Hz,1H),4.79(s,2H),4.61-4.64(m,1H),4.01-4.05(m,1H),3.88-3.91(m,1H),3.77-3.81(m,1H),2.63-2.70(m,1H),2.43-2.49(m,1H),0.91-0.97(m,27H),0.14-0.09(m,18H).
步驟5
將步驟4中所獲得之9-((2R,4S,5R)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧 基)-5-((第三丁基二甲基矽烷基氧基)甲基)四氫呋喃-2-基)-N-(3-((第三丁基二甲基矽烷基氧基)甲基)苯基)-9H-嘌呤-6-胺(162m，0.231mmol)溶解於THF(2.3mL)中，加入四丁基氟化銨(1.00mol/L之THF溶液，0.810mL)，於室溫下攪拌2小時。於減壓下將反應液之溶劑蒸餾去除，藉由氯仿/甲醇系之管柱層析法對殘渣進行純化，從而獲得(2R,3S,5R)-2-(羥基甲基)-5-(6-(3-(羥基甲基)苯基胺基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(88.9mg，107%)。
ESI-MS(m/z)：358(M+1)
步驟6
將步驟5中所獲得之(2R,3S,5R)-2-(羥基甲基)-5-(6-(3-(羥基甲基)苯基胺基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(88.9mg，0.231mmol)溶解於吡啶(2.3mL)中，加入4,4'-二甲氧基三苯氯甲烷(196mg，0.577mmol)，於室溫下攪拌一晚。進一步加入4,4'-二甲氧基三苯氯甲烷(78.3mg，0.231mmol)，於室溫下攪拌數小時。向反應液中加入甲醇並攪拌15分鐘。加入甲苯，於減壓下將溶劑蒸餾去除，向殘渣中加入適量之水後，以乙酸乙酯加以萃取，並藉由無水硫酸鎂對有機層進行乾燥，於減壓下將溶劑蒸餾去除，藉由己烷/乙酸乙酯系之矽膠管柱層析法對殘渣進行純化，從而獲得(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)苯基胺基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(95.4mg，43%)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.47(s,1H),8.00(s,1H),7.90(bs,1H),7.71-7.75(m,2H),7.52-7.56(m,2H),7.10-7.45(m,18H),6.79-6.87(m,8H),6,46(t,J=6.4Hz,1H),4.68-4.74(m,1H),4.21(s,2H),4.11-4.16(m,1H),3.78(d,J=11.3Hz,12H),3.38-3.47(m,2H),2.86-2.92(m,1H),2.53-2.59(m,1H).
步驟7
使用步驟6中所獲得之(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)苯基胺基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇，以與參考例1.1同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)苯基胺基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-80)。該化合物無需進行純化而用於下一步驟。
實施例88
使用參考例80.1中所獲得之化合物am-80，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-86之siRNA(稱為N6-(3-膦醯氧基甲基)苯基dA)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6861.00，實測值6862.08
參考例81.1：化合物am-81 步驟1
將參考例63之步驟1中所獲得之(2R,3S,5R)-5-(6-(1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-基氧基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-醇(250mg，0.372mmol)溶解於乙醇(3.7mL)中，加入二異丙基乙基胺(0.194mL，1.12mmol)及8-巰基-1-辛醇(0.077mL，0.447mmol)，於80℃下攪拌1小時。進一步加入8-巰基-1-辛醇(0.032mL，0.186mmol)並攪拌1小時，於室溫下進一步攪拌一晚。於減壓下將反應液之溶劑蒸餾去除，藉由己烷/乙酸乙酯系之管柱層析法對殘渣進行純化，從而獲得(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(8-羥基辛硫基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(186mg，71%)。
ESI-MS(m/z)：699(M+1)
步驟2
將步驟1中所獲得之(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(6-羥基辛硫基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(183mg，0.262mmol)溶解於二氯甲烷(3.7mL)中，加入三乙胺(0.182mL，1.31mmol)及4,4'-二甲氧基三苯氯甲烷(133mg，0.393mmol)，於室溫下攪拌一晚。進一步加入4,4'-二甲氧基三苯氯甲烷(17.8mg，0.052mmol)，於室溫下攪拌2小時。向反應液中加入甲醇並攪拌30分鐘。以氯仿對反應液加以萃取，並藉由無水硫酸鎂對有機層進行乾燥，於減壓下將溶劑蒸餾去除，藉由己烷/乙酸乙酯系之矽膠管柱層析法對殘渣進行純化，從而獲得(2R,3S,5R)-5-(6-(6-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)辛硫基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-醇(208mg，79%)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.61(s,1H),8.07(s,1H),7.14-7.44(m,18H),6.78-6.84(m,8H),6.45(t,J=6.5Hz,1H),4.66-4.70(m,1H),4.11-4.14(m,1H),3.78(s,12H),3.34-3.45(m,4H),3.02(t,J=6.6Hz,2H),2.81-2.88(m,1H),2.51-2.57(m,1H),1.73-1.80(m,2H),1.56-1.63(m,2H),1.42-1.45(m,2H),1.22-1.39(m,6H).
步驟3
使用步驟2中所獲得之(2R,3S,5R)-5-(6-(6-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)辛硫基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-醇，以與參考例1.1同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-5-(6-(6-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)辛硫基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-81)。該化合物無需進行純化而用於下一步驟。
實施例89
使用參考例81.1中所獲得之化合物am-81，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合 物I-87之siRNA(稱為6-(8-膦醯氧基辛基)硫基-dPu)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6900.14，實測值6899.92
參考例82.1：化合物am-82 步驟1
將2-(3-胺基苯氧基)乙醇(300mg，1.96mmol)溶解於DMF(20mL)中，加入咪唑(200mg，1.94mmol)及第三丁基二甲基氯矽烷(354mg，2.35mmol)，於室溫下攪拌90分鐘。向反應液中加入水並攪拌30分鐘。以乙酸乙酯對反應液進行萃取，並藉由無水硫酸鎂進行乾燥，於減壓下將溶劑蒸餾去除，藉由己烷/乙酸乙酯系之矽膠管柱層析法對殘渣進行純化，從而獲得3-(2-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)乙氧基)苯胺(522mg，99%)。
ESI-MS(m/z)：268(M+1)
步驟2
將步驟1中所獲得之3-(2-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)乙氧基)苯胺(382mg，1.43mmol)及參考例83之步驟3中所獲得之6-(1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-基氧基)-9-((2R,4S,5R)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)-5-((第三丁基二甲基矽烷基氧基)甲基)四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤(427mg，0.714mmol)溶解於乙醇(7.1mL)中，加入二異丙基乙基胺(0.249mL，1.43mmol)，於80℃下攪拌一晚。進一步加入6-(1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-基氧基)-9-((2R,4S,5R)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)-5-((第三丁基二甲基矽烷基氧基)甲基)四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤(139mg，0.520mmol)及乙醇(0.9mL)並攪拌2.5小時。於減壓下將反應液之溶劑蒸餾去除，藉由己烷/乙酸乙酯系之矽膠管柱層析法對殘渣進行純化，從而獲得9-((2R,4S,5R)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)-5-((第三丁基二甲基矽烷基氧基)甲基)四氫呋喃-2-基)-N-(3-(2-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)乙氧基)苯基)-9H-嘌呤-6-胺(326mg，63%)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.53(s,1H),8.19(s,1H),7.66(bs,1H),7.56(t,J=2.2Hz,1H),7.30-7.33(m,2H),6.66-6.68(m,1H),6.49(t,J=6.4Hz,1H),4.61-4.64(m,1H),3.98-4.10(m,5H),3.88-3.92(m,1H),3.77-3.82(m,1H),2.63-2.71(m,1H),2.43-2.49(m,1H),0.91-0.93(m,27H),0.09-0.12(m,18H).
ESI-MS(m/z)：730(M+1)
步驟3
將步驟2中所獲得之9-((2R,4S,5R)-4-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)-5-((第三丁基二甲基矽烷基氧基)甲基)四氫呋喃-2-基)-N-(3-(2-(第三丁基二甲基矽烷基氧基)乙氧基)苯基)-9H-嘌呤-6-胺(324mg，0.446mmol)溶解於THF(4.5mL)中，加入四丁基氟化銨(1.00mol/L之THF溶液，1.56mL)，於室溫下攪拌2小時。於減壓下將反應液之溶劑蒸餾去除，藉由氯仿/甲醇系之矽膠管柱層析法對殘渣進行純化，從而獲得(2R,3S,5R)-5-(6-(3-(2-羥基乙氧基)苯基胺基)-9H-嘌呤-9-基)-2-(羥基甲基)四氫呋喃-3-醇(194mg，113%)。
ESI-MS(m/z)：388(M+1).
步驟4
將步驟3中所獲得之(2R,3S,5R)-5-(6-(3-(2-羥基乙氧基)苯基胺基)-9H-嘌呤-9-基)-2-(羥基甲基)四氫呋喃-3-醇(0.446mmol)溶解於吡啶(4.5mL)中，加入4,4'-二甲氧基三苯氯甲烷(378mg，1.12mmol)，於室溫下攪拌一晚。向反應液中加入甲醇並攪拌15分鐘。加入甲苯，於減壓下將溶劑蒸餾去除，於殘渣中加入適量之水，以乙酸乙酯進行萃取，並藉由無水硫酸鎂進行乾燥。於減壓下將溶劑蒸餾去除，藉由己烷/乙酸乙酯系之矽膠管柱層析法對殘渣進行純化，從而獲得(2R,3S,5R)-5-(6-(3-(2-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)乙氧基)苯基胺基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃- 3-醇(167mg，38%)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.47(s,1H),8.00(s,1H),7.62-7.68(m,2H),7.14-7.41(m,20H),6.78-6.85(m,8H),6.68-6.71(m,1H),6.46(t,J=6.5Hz,1H),4.68-4.73(m,1H),4.19(t,J=5.1Hz,2H),4.12-4.15(m,1H),3.77(d,J=5.5Hz,12H),3.37-3.50(m,4H),2.86-2.92(m,1H),2.51-2.59(m,1H).
ESI-MS(m/z)：992(M+1)
步驟5
使用步驟4中所獲得之(2R,3S,5R)-5-(6-(3-(2-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)乙氧基)苯基胺基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-醇，以與參考例1.1同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-5-(6-(3-(2-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)乙氧基)苯基胺基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-82)。該化合物無需進行純化而用於下一步驟。
實施例90
使用參考例82.1中所獲得之化合物am-82，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-88之siRNA(稱為N6-(3-膦醯氧基乙氧基)苯基dA)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6891.02，實測值6892.22
參考例83.1：化合物am-83 步驟1
將參考例63之步驟1中所獲得之(2R,3S,5R)-5-(6-(1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-基氧基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-醇(250mg，0.372mmol)溶解於乙醇(3.7mL)中，加入二異丙基乙基胺(0.194mL，1.12mmol)及6-巰基-1-己醇 (0.061mL，0.447mmol)，於80℃下攪拌1小時。進一步加入6-巰基-1-己醇(0.025mL，0.186mmol)並攪拌1小時。進一步加入6-巰基-1-己醇(0.025mL，0.186mmol)並攪拌2小時。於減壓下將反應液之溶劑蒸餾去除，藉由己烷/乙酸乙酯系之矽膠管柱層析法對殘渣進行純化，從而獲得(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(6-羥基己硫基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(198mg)。
步驟2
將步驟1中所獲得之(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-(6-羥基己硫基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-醇(0.372mmol)溶解於二氯甲烷(3.7mL)中，加入三乙胺(0.259mL，1.861mmol)及4,4'-二甲氧基三苯氯甲烷(252mg，0.744mmol)，於室溫下攪拌2小時，向反應液中加入甲醇並攪拌30分鐘。以氯仿對反應液加以萃取，有機層係藉由無水硫酸鎂進行乾燥，於減壓下將溶劑蒸餾去除，藉由己烷/乙酸乙酯系之矽膠管柱層析法對殘渣進行純化，從而獲得(2R,3S,5R)-5-(6-(6-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)己硫基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-醇(231mg，59%)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.61(s,1H),8.08(s,1H),7.14-7.44(m,18H),6.78-6.83(m,8H),6.45(t,J=6.5Hz,1H),4.66-4.70(m,1H),4.11-4.14(m,1H),3.78(s,12H),3.32-3.45(m,4H),3.04(t,J=6.6Hz,2H),2.81-2.88(m,1H),2.51-2.57(m,1H),1.73-1.80(m,2H),1.57-1.66(m,2H),1.50-1.37(m,4H).
步驟3
使用步驟2中所獲得之(2R,3S,5R)-5-(6-(6-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)己硫基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-醇，以與參考例1.1同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-5-(6- (6-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)己硫基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-83)。該化合物無需進行純化而用於下一步驟。
實施例91
使用參考例83.1中所獲得之化合物am-83，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-89之siRNA(稱為6-(6-膦醯氧基)己硫基-dPu)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6872.08，實測值6871.82
參考例84.1：化合物am-84 步驟1
使用參考例50.1之步驟2中所獲得之9-((4aR,6R,7aS)-2,2-二第三丁基四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤(1.38g，2.87mmol)，以與參考例14.0之步驟2同樣之方式獲得8-溴-9-((4aR,6R,7aS)-2,2-二第三丁基四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤(922mg，56%)。
步驟2
使用步驟1中所獲得之8-溴-9-((4aR,6R,7aS)-2,2-二第三丁基四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤(300mg，0.538mmol)，以與參考例41.1之步驟2同樣之方式獲得N-苄基-9-((4aR,6R,7aS)-2,2-二第三丁基四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-8-胺(342mg，109%)。
ESI-MS(m/z)：584(M+1)
步驟3~5
使用步驟2中所獲得之N-苄基-9-((4aR,6R,7aS)-2,2-二第三丁基四氫-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二苯唑西林-6-基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-8-胺，以與參考例1.1之步驟3~5同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-5-(8- (苄基胺基)-6-((E)-苯乙烯基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-84)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.58,8.58(1H,2s),8.22,8.18(1H,2s),7.63-7.61(m,2H),7.53-7.49(m,1H),7.37-7.21(m,14H),6.72-6.70(m,5H),6.54-6.48(m,1H),6.36-6.32(m,1H),4.87-4.78(m,1H),4.57-4.51(m,1H),4.20-4.06(m,3H),3.92-3.74(m,7H),3.64-3.49(m,4H),3.36-3.34(m,2H),3.10-2.99(m,1H),2.58,2.46(m,3H),1.21-1.04(m,12H).
實施例92
使用參考例84.1中所獲得之化合物am-84，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-90之siRNA(稱為8-BnNH-6-苯乙烯基-dPu)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6866.14，實測值6866.99
參考例85.1：化合物am-85 步驟1~4
以與參考例50.1之步驟1~4同樣之方式，使用苯三甲醇而獲得(2R,3S,5R)-5-(6-((3,5-雙((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)苄基)氧基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物am-85)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.48-8.45(1H,m),8.09-8.07(1H,m),7.52-7.50(5H,m),7.42-7.37(12H,m),7.29-7.14(13H,m),6.83-6.75(12H,m),6.49-6.45(1H,m),5.65(2H,s),4.76-4.73(1H,m),4.31-4.30(1H,m),4.18(4H,s),3.87-3.56(22H,m),3.41-3.33(2H,m),2.87-2.84(1H,m),2.62-2.45(3H,m),1.18-1.13(12H,m).
實施例93
使用參考例85.1中所獲得之化合物am-85，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-91之siRNA(稱為O6-(3,5-二膦醯氧基甲基)Bn dI)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6985.01，實測值6985.44
參考例86.1：化合物am-86 步驟1~4
以與參考例50.1之步驟1~4同樣之方式，使用(5-硝基-1,3-伸苯基)二甲醇而獲得(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-((3-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-硝基苄基)氧基)-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(am-86)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.47-8.45(1H,m),8.27(1H,brs),8.18(1H,brs),8.13,8.11(1H,2brs),7.80(1H,brs),7.50-7.45(2H,m),7.42-7.34(6H,m),7.32-7.15(10H,m),6.87-6.75(8H,m),6.50-6.46(1H,m),5.72(2H,s),4.81-4.72(1H,m),4.34-4.27(3H,m),3.96-3.55(16H,m),3.43-3.32(2H,m),2.92-2.84(1H,m),2.72-2.57(2H,m),2.88(1H,t,J=6.6Hz),1.20-1.11(12H,m).
實施例94
使用參考例86.1中所獲得之化合物am-86，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-92之siRNA(稱為O6-(3-硝基-5-膦醯氧基甲基)Bn dI)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6920.00，實測值6920.75
參考例87.1：化合物am-87 步驟1
使用藉由J.Am.Chem.Soc，2007年，第129卷，782~789頁所記載之方法而合成之(2R,3S,5R)-5-(6-((1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-基)氧 基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-醇(0.403g，0.600mmol)及3-(胺基甲基)苯甲酸(0.181g，1.20mmol)，以與參考例39.1之步驟1同樣之方式獲得3-(((9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羥基四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)胺基)甲基)苯甲酸(153mg，37%)。
ESI-MS(m/z)：689(M+1)
步驟2
使用步驟1中所合成之3-(((9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羥基四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)胺基)甲基)苯甲酸(153mg，0.222mmol)，以與參考例26.1之步驟2同樣之方式獲得3-(((9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羥基四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)胺基)甲基)苯甲酸2-氰基乙酯(97.0mg，61%)。
ESI-MS(m/z)：742(M+1)
步驟3
使用步驟2中所合成之3-(((9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羥基四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)胺基)甲基)苯甲酸2-氰基乙酯(97.0mg，0.131mmol)，以與參考例39.1之步驟2同樣之方式獲得3-(((9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(((2-氰基乙氧基)(二異丙胺基)膦基)氧基)四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)胺基)甲基)苯甲酸2-氰基乙酯(化合物am-87)(60.0mg，49%)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.35(1H,s),8.07(1H,s),7.99-7.95(2H,m),7.64-7.62(1H,m),7.42-7.40(3H,m),7.31-7.17(7H,m),6.80-6.77(4H,m),6.45-6.43(1H,m),6.05(1H,s),4.93(2H,s),4.78-4.75(1H,m),4.52-4.50(2H,m),4.29-4.28(1H,m),3.78-3.69(10H,m), 3.45-3.31(2H,m),2.90-2.59(5H,m),2.47-2.45(1H,m),1.20-1.10(12H,m).
實施例95
使用參考例87.1中所獲得之化合物am-87，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-93之siRNA(稱為N6-(3-羧基)Bn dA)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6808.02，實測值
參考例88.1：化合物am-88 步驟1
使用參考例63之步驟1中所獲得之(2R,3S,5R)-5-(6-(1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-基氧基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-醇，以與參考例1.1同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-5-(6-(1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-基氧基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-基-2-氰基乙基二異丙基亞磷醯胺(化合物am-88)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.34(d,J=2.2Hz,1H),8.32(d,J=10.2Hz,1H),8.13-8.15(m,1H),7.56-7.13(m,12H),6.77-6.82(m,4H),6.51-6.55(m,1H),4.76-4.84(m,1H),4.32-4.38(m,1H),3.78-3.79(m,6H),3.34-3.47(m,2H),2.89-2.96(m,1H),2.66-2.78(m,1H),2.47-2.63(m,2H),2.36(s,2H)1.13-1.32(m,14H).
ESI-MS(m/z)：872(M+1)
實施例96 步驟1
使用參考例88中所獲得之化合物am-88，以與實施例1同樣之方式合成反義鏈之5'末端之X具有2-(((((2R,3S,5R)-5-(6-(1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-基氧基)-9H-嘌呤-9-基)-3-羥基四氫呋喃-2-基)甲氧 基)(羥基)磷醯氧基)甲基)-2-(羥基甲基)丙二酸二乙酯之單鏈寡核苷酸。
步驟2
於65℃下，使10mmol/L之2-(3-巰基苯基)乙酸之DMSO溶液及50mmol/L三乙胺之DMSO溶液與步驟1中所獲得之單鏈寡核苷酸反應5小時，從而合成如下述之表39所示的454-Xa-dT之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-94之siRNA。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6824.10，實測值6824.00
實施例97 步驟1
使用參考例88中所獲得之化合物am-88及3-胺基-1-丙磺酸，以與實施例96同樣之方式合成如下述之表39所示的454-Xa-dT之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-95之siRNA。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6795.07，實測值6794.00
參考例89.1：化合物am-89 步驟1~4
使用(3-(4-甲氧基-4-側氧基丁基)苯基)硼酸，以與參考例59.1之步驟1~4同樣之方式獲得4-(3-(9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(((2-氰基乙氧基)(二異丙胺基)膦基)氧基)四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯基)丁酸2-氰基乙酯(am-89)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.94-8.94(1H,m),8.66-8.64(1H,m),8.54(1H,s),8.32-8.30(1H,m),7.51-7.48(1H,m),7.41-7.39(2H,m),7.36-7.34(1H,m),7.31-7.16(7H,m),6.78-6.77(4H,m),6.58-6.54(1H,m),4.83-4.76(1H,m),4.36-4.32(1H,m),4.26-4.24(2H,m),3.91-3.56(10H,m),3.47-3.42(1H,m),3.36-3.34(1H,m),2.98-2.93(1H,m),2.82-2.80(2H,m),2.76-2.61(4H,m),2.47-2.43(3H,m),2.09-2.05(2H, m),1.17(12H,dt,J=21.9,7.9Hz).
實施例98
使用參考例89.1中所獲得之化合物am-89，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-96之siRNA(稱為6-(3-羧丙基苯基)-dPu)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6822.10，實測值6816.08
參考例90.1：化合物am-90 步驟1~2
使用N,N-雙(2-羥基乙基)乙二胺，以與參考例62.1之步驟2~3同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-5-(6-((2-(雙(2-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)乙基)胺基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-醇。
ESI-MS(m/z)：1290.04(M+1)
步驟3
使用步驟2中所獲得之(2R,3S,5R)-5-(6-((2-(雙(2-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)乙基)胺基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-醇，以與參考例39.1之步驟2同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-5-(6-((2-(雙(2-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)乙基)胺基)乙基)胺基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(am-90)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.38(1H,s),7.98-7.95(1H,m),7.70-7.16(30H,m),6.84-6.76(12H,m),6.45-6.43(1H,m),5.91(1H,s),4.76-4.73(3H,m),4.30-4.28(1H,m),4.13-4.12(4H,m),3.89-3.54(24H,m),3.41-3.34(2H,m),2.90-2.87(1H,m),2.69-2.55(2H,m),2.47-2.45(1H,m),1.20-1.10(12H,m).
實施例99
使用參考例90.1中所獲得之化合物am-90，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-97之siRNA(稱為N6-(N,N-二膦醯氧基乙基)胺基乙基dA)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6966.06，實測值6965.21
參考例91.1：化合物am-91 步驟1~4
使用(5-碘-1,3-伸苯基)二甲醇，以與參考例67.1之步驟1~4同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-5-(6-((3-(3,5-雙((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)苯基)丙-2-炔-1-基)胺基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(am-91)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.26(1H,s),7.84-7.82(1H,m),7.52-7.00(27H,m),6.80-6.72(12H,m),6.42-6.40(1H,m),6.03(1H,brs),4.75-4.69(1H,m),4.28-4.27(1H,m),3.90-3.54(24H,m),3.44-3.29(2H,m),3.16-3.15(4H,m),2.84-2.78(7H,m),2.65-2.54(2H,m),2.46-2.44(1H,m),1.20-1.10(12H,m).
實施例100
使用參考例91.1中所獲得之化合物am-91，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-98之siRNA(稱為N6-(3,5-二膦醯氧基甲基)苯基炔丙基dA)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值7009.08，實測值7009.53
參考例92.1：化合物am-92 步驟1~3
使用N,N-雙(2-羥基乙基)-1,3丙二胺，以與參考例90.1之步驟1~3同樣之方式獲得(2R,3S,5R)-5-(6-((3-(雙(2-(雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)乙基)胺基)丙基)胺基)-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲 氧基)甲基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(am-92)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.27(1H,s),7.79,7.77(1H,2 s),7.42-7.36(6H,m),7.31-7.11(21H,m),6.79-6.73(12H,m),6.42-6.38(1H,m),6.32(1H,brs),4.78-4.70(1H,m),4.30-4.25(1H,m),3.91-3.30(26H,m),3.18(4H,t,J=6.2Hz),2.90-2.81(1H,m),2.71(4H,t,J=6.0Hz),2.66-2.52(4H,m),2.45(1H,t,J=6.4Hz),1.76-1.69(2H,m),1.20-1.11(12H,m).
實施例101
使用參考例92.1中所獲得之化合物am-92，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-99之siRNA(稱為N6-(N,N-二膦醯氧基乙基胺基丙基dA)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6980.08，實測值6979.20
參考例93.1：化合物am-93 步驟1~3
使用2-(1-(巰基甲基)環丙基)乙酸，以與參考例87.1之步驟1~3同樣之方式獲得2-(1-(((9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(((2-氰基乙氧基)(二異丙胺基)膦基)氧基)四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)硫基)甲基)環丙基)乙酸2-氰基乙酯(am-93)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.57(1H,s),8.16,8.14(1H,2 s),7.40-7.38(2H,m),7.31-7.17(7H,m),6.80-6.77(4H,m),6.48-6.44(1H,m),4.80-4.72(1H,m),4.33-4.27(1H,m),4.30(2H,t,J=6.4Hz),3.90-3.30(14H,m),2.93-2.86(1H,m),2.70-2.58(4H,m),2.49(2H,s),2.47(1H,t,J=6.4Hz),1.20-1.11(12H,m),0.80(2H,t,J=5.5Hz),0.63(2H,t,J=5.5Hz).
實施例102
使用參考例93.1中所獲得之化合物am-93，以與實施例1-1同樣之 方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-100之siRNA(稱為6-(1-羧甲基)環丙基甲基-dPu)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6804.10，實測值6798.26
參考例94.1：化合物am-94 步驟1~3
使用3-巰基苯甲酸，以與參考例87.1之步驟1~3同樣之方式獲得3-((9-((2R,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(((2-氰基乙氧基)(二異丙胺基)膦基)氧基)四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)硫基)苯甲酸(am-94)。
1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ：8.53(1H,s),8.34(1H,s),8.22,8.20(1H,2 s),8.16(1H,d,J=7.8Hz),7.88(1H,d,J=7.8Hz),7.57(1H,t,J=7.8Hz),7.41-7.36(2H,m),7.29-7.17(7H,m),6.80-6.77(4H,m),6.50-6.45(1H,m),4.80-4.72(1H,m),4.54(2H,t,J=6.4Hz),4.34-4.28(1H,m),3.89-3.31(12H,m),2.95-2.88(1H,m),2.84(2H,t,J=6.4Hz),2.73-2.67(1H,m),2.62(1H,t,J=6.4Hz),2.47(1H,t,J=6.4Hz),1.20-1.11(12H,m).
實施例103
使用參考例94.1中所獲得之化合物am-94，以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表38所示的454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有化合物I-101之siRNA(稱為6-(3-羧基)苯硫基-dPu)。
ESI-MS(反義鏈)：理論值6812.07，實測值6811.50
實施例104
以與實施例1-1同樣之方式合成如下述之表40所示的反義鏈之5'末端之X具有化合物I-1之siRNA。
試驗例6：
關於實施例1~4中所獲得之對反義鏈之5'末端導入有非天然型核 苷酸殘基之螢光素酶標的siRNA之與AGO2之親和性，如以下所示般，使用Biacore T100及T200系統(GE Healthcare Science(GE)公司)，對與固定於基盤表面之寡DNA之5'末端之競爭進行測定，藉此評估siRNA與AGO2-MID區域之親和性。
(1)試樣之製備
以純水將電泳緩衝液原液(HBS-EP+10X，GE公司，BR-1006-69)稀釋10倍，利用過濾器進行過濾，藉此製成HPS-EP+(10mM HEPES(4-(2-羥基乙基)-1-哌乙磺酸)，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05%(v/v)界面活性劑(Surfactant)P20，pH值為7.4)，將其用作電泳緩衝液。
以最終濃度成為2mM之方式向HBS-EP+加入二硫蘇糖醇(dithiothreitol(DTT))，藉由該溶液將siRNA溶液稀釋為200nM、100nM、50nM、25nM，並與以同樣方式稀釋之5μg/mL之AGO2-MID區域進行等量混合，藉此製備分別含有100nM、50nM、25nM、12.5nM之siRNA之2.5μg/mL之AGO2-MID區域溶液。
(2)測定方法 (2-1)生物素化寡之固定化
藉由晶片(Series S Sensor Chip SA，GE公司之BR-1005-31)進行生物素化單鏈DNA(dT(16)-Biotin)之固定化。流速(Flow rate)恆定為10μL/min，藉由以下程式將由HBS-EP+稀釋為100nM之生物素化單鏈DNA溶液固定化於Fc2或Fc4。同時Fc1、Fc3係進行空白之固定化操作。
1. 1M NaCl/50mM NaOH，60秒(注入(INJECT)指令)，3次
2. 電泳緩衝液(沖洗(WASH)指令)
3. 電泳緩衝液，120秒(注入(INJECT)指令)
4. 將目標固定化量(Aim for Immobilized Level)設定為750RU而進行固定化(配體注入(LIGAND INJECT)指令)
5. 1M NaCl/50mM NaOH/50%異丙醇(WASH指令)
於經固定化之細胞中確認到約700RU之固定量。
(2-2)寡核苷酸(siRNA)之競爭實驗
使用固定化有生物素化單鏈DNA之晶片，進行siRNA之競爭實驗。於流速全部為30μL/min下進行，1個週期係以60秒結合、5秒背離、5秒再生1M NaCl而進行。
為了機械穩定化，起初之10個週期係僅添加HBS-EP+，其後對於各siRNA，係依序測定HBS-EP+(空白(BLANK))、2.5μg/mL AGO2-MID區域溶液(對照(CONTROL))、分別含有100nM、50nM、25nM、12.5nM之siRNA之2.5μg/mL AGO2-MID區域溶液(樣品(Sample))。解析中係使用經固定化之細胞之曲線圖減去進行空白固定之曲線圖而獲得之曲線圖之結合量(binding level)，藉由([Sample]-[BLANK])/([CONTROL]-[BLANK])×100計算出殘存結合率(%)，由100-(殘存結合率)計算出阻礙率(%)。
又，為了進行比較，對各siRNA之反義鏈之5'末端具有相對應之天然型核苷酸之siRNA亦以同樣之方式進行試驗。
表35表示各阻礙率(%)。
根據試驗例6之結果明確可知，實施例1~4中所獲得之反義鏈之5'末端導入有非天然型核苷酸殘基之螢光素酶標的siRNA(874-8-Br-dA、874-8-oxo-dA、874-5-Br-dU、454-5-F-dU及1556-5-F-dU)與各自之5'末端具有作為相對應之天然型核苷酸之單磷酸腺苷或單磷酸尿苷之siRNA(874-A及874-U)相比，阻礙率(%)均較高，且與AGO2之親和性均較高。
試驗例7：核苷酸(單體)之Biacore
關於實施例1及4中所獲得之作為siRNA之5'末端之非天然型核苷酸的8-Br-dA(化合物I-1)及5-氟-2'-單磷酸去氧尿苷(化合物I-4)之與AGO2之親和性，如以下所示般，使用Biacore T100及T200系統(GE公司)，對與固定於基盤表面之寡DNA之5'末端之競爭進行測定，藉此評估siRNA與AGO2-MID區域之親和性。
(1)試樣之製備
以純水將HBS-EP+10X稀釋10倍，以最終濃度成為2mM之方式加入DTT，以過濾器進行過濾，藉此製成HBS-EP+之2mM DTT水溶液。以最終濃度成為1%之方式向該溶液中加入二甲基亞碸(Dimethyl sulfoxide(DMSO))，而製成電泳緩衝液。
以成為200μM、40μM、8μM、1.6μM/(2%DMSO,HBS-EP+,2mM DTT)之方式對溶解於DMSO或蒸餾水中之單體溶液進行稀釋，並與經HBS-EP+,2mM DTT溶液稀釋之5μg/mL之AGO2-MID區域進行等量混合，藉此利用HBS-EP+,2mM DTT,1%DMSO溶液製備分別含有100μM、20μM、4μM、0.8μM之單體之2.5μg/mL AGO2-MID區域溶液。
(2)核苷酸(單體)之競爭實驗
使用以與試驗例6同樣之方式固定化有dT(16)-Biotin寡之晶片，進行siRNA之競爭實驗。於流速全部為30μL/min下進行，1個週期係 以60秒結合、5秒背離、5秒再生1M NaCl而進行。
為了機械穩定化，起初之10個週期係僅添加HBS-EP+，其後對於各單體，係依序測定HBS-EP+(BLANK)、2.5μg/mL AGO2-MID區域溶液(CONTROL)、分別含有100μM、20μM、4μM、0.8μM之單體之2.5μg/mL AGO2-MID區域溶液(Sample)、2.5μg/mL AGO2-MID區域溶液(CONTROL)。
解析係使用經固定化之細胞之曲線圖減去進行空白固定之曲線圖而獲得之曲線圖之binding level，藉由([Sample]-[BLANK])/([CONTROL]-[BLANK])×100計算出殘存結合率(%)，由100-(殘存結合率)計算出阻礙率(%)。
表36表示8-Br-dA(化合物I-1)及5-氟-2'-單磷酸去氧尿苷(化合物I-4)、以及作為各自之比較之單磷酸腺苷(AMP)及單磷酸尿苷(UMP)之阻礙率(%)。
根據試驗例7之結果明確可知，作為導入至本發明之siRNA之反義鏈之5'末端之非天然型核苷酸的8-Br-dA及5-氟-2'-單磷酸去氧尿苷與作為天然核苷酸之單磷酸腺苷或單磷酸尿苷相比，阻礙率(%)均較高，且與AGO2之親和性均較高。
試驗例8：單體之Biacore
以與試驗例7同樣之方式對實施例7~33、及35~40中所獲得之 作為siRNA之5'末端之非天然型核苷酸的化合物I-5~I-31、及I-33~I-38之與AGO2之親和性進行評估。
表37表示分別測得之阻礙率(%)。
根據試驗例8之結果明確可知，實施例7~33、及35~40中所獲得之作為siRNA之5'末端之非天然型核苷酸的化合物I-5~I-31、及I-33~I-38之阻礙率(%)均較高，且與AGO2之親和性均較高。因此，可期待實施例7~33、及35~40中所獲得之siRNA成為與AGO2之親和性提高之寡核苷酸，且成為具有針對標的mRNA之較高之減弱活性之寡核苷酸。
試驗例9：螢光素酶標的siRNA之減弱活性
將每孔之細胞數設為7500個細胞，將siRNA之最終濃度設為10000pmol/L、1000pmol/L、100pmol/L、10pmol/L、1pmol/L之5點，以N=5進行設定，除此以外，以與試驗例1同樣之方式測定反義鏈之5'末端具有實施例39、23、36、或27中所獲得之各化合物之siRNA之活性並進行評估。將反義鏈之5'末端具有I-37(6-NO2,7-Me-dQu)、I-21(6-萘-2-基-dPu)、I-34(6-Me-dU)、或I-25(6-萘基-1-基-dPu)之siRNA之減弱活性示於圖4。
再者，使用8-Br-dA，以與實施例1同樣之方式合成表38中之454-Xa之反義鏈之5'末端之X具有8-Br-dA之siRNA(稱為454-BrdA)，測定siRNA之活性並進行評估。進而，對於反義鏈之5'末端具有單磷酸腺苷、或單磷酸尿苷之具有天然型核苷酸之siRNA(稱為454-A、或454-U)，亦以同樣之方式測定siRNA之活性並進行評估。
根據試驗例9之結果可知，反義鏈之5'末端具有Ago2高親和性鹼基類似物之siRNA與反義5'末端具有天然型核苷酸之siRNA相比，顯示出較高之減弱活性。
試驗例10：螢光素酶標的siRNA之減弱活性
將每孔之細胞數設為7500個細胞，將siRNA之最終濃度設為10000pmol/L、1000pmol/L、100pmol/L、10pmol/L、1pmol/L之5點，以N=5進行設定，除此以外，以與試驗例1同樣之方式測定反義 鏈之5'末端具有實施例34、及21中所獲得之各化合物之siRNA之活性並進行評估。將反義鏈之5'末端具有I-32(2'-OMe-6-苯乙烯基-dA)、或I-19(二甲基噻吩基-dU)之siRNA之減弱活性示於圖5。
根據試驗例10之結果可知，反義鏈之5'末端具有Ago2高親和性鹼基類似物之siRNA與反義5'末端具有相對應之天然型核苷酸之siRNA相比，顯示出較高之減弱活性。
試驗例11：螢光素酶標的siRNA之減弱活性
將每孔之細胞數設為7500個細胞，將siRNA之最終濃度設為1000pmol/L、100pmol/L、10pmol/L、1pmol/L、0.1pmol/L之5點，以N=5進行設定，除此以外，以與試驗例1同樣之方式，測定反義鏈之5'末端具有實施例32及41~51中所獲得之各化合物之siRNA之活性並進行評估。將反義鏈之5'末端具有I-45(8-BnNH-6-苯乙烯基嘌呤)、I-44(N-Bn-N-Me dA)或I-46(8-furanylmethylamino-6-styryl purine，8-呋喃基甲基胺基-6-苯乙烯基嘌呤)之siRNA之減弱活性示於圖6。然後，將反義鏈之5'末端具有I-39(6-benzothiophenyl purine，6-苯并噻吩基嘌呤)、I-41(6-pyrenyl purine，6-芘基嘌呤)、I-43(N-Bn dA)或I-40(6-benzyloxynaphtyl purine，6-苄氧基萘基嘌呤)之siRNA之減弱活性示於圖7；將反義鏈之5'末端具有I-42(6-anthracenyl purine，6-蒽基嘌呤)之siRNA之減弱活性示於圖8；將反義鏈之5'末端具有I-47(6-styryl-8-tetrazolylmethylamino purine，6-苯乙烯基-8-四唑基甲基胺基嘌呤)之siRNA之減弱活性示於圖9；將反義鏈之5'末端具有I-30(6-(m-carboxyphenyl)purine，6-(間羧基苯基)嘌呤)之siRNA之減弱活性示於圖10；將反義鏈之5'末端具有I-48(6-(m-carboxyethylphenyl)purine，6-(間羧乙基苯基)嘌呤)之siRNA之減弱活性示於圖11；及將反義鏈之5'末端具有I-49(5-呋喃基dU)之siRNA之減弱活性示於圖12。再者，對於表38中之454-Xa之反義鏈之5'末端為單磷酸腺苷之天然型siRNA(454-A)，亦於同樣之條件下測定siRNA之活性並進行評估。
根據試驗例11之結果可知，反義鏈之5'末端具有Ago2高親和性鹼基類似物之siRNA與反義5'末端具有相對應之天然型核苷酸之siRNA相比，顯示出較高之減弱活性。
試驗例12：螢光素酶標的siRNA之減弱活性
將每孔之細胞數設為7500個細胞，將siRNA之最終濃度設為500 pmol/L、100pmol/L、20pmol/L、4pmol/L、0.8pmol/L之5點，以N=5進行設定，除此以外，以與試驗例1同樣之方式測定反義鏈之5'末端具有實施例52中所獲得之化合物之siRNA之活性並進行評估。將反義鏈之5'末端具有I-50(2-胺基rA)之siRNA之減弱活性示於圖13。再者，對於表38中之454-Xa之反義鏈之5'末端為單磷酸腺苷之天然型siRNA(454-A)，亦於同樣之條件下測定siRNA之活性並進行評估。
根據試驗例12之結果可知，反義鏈之5'末端具有Ago2高親和性鹼基類似物之siRNA與反義5'末端具有相對應之天然型核苷酸之siRNA相比，顯示出較高之減弱活性。
根據上述試驗例9~12之結果，藉由將利用本發明而提高活性之siRNA應用於醫藥，與使用天然型siRNA之情形相比，可期待對投予量進行抑制。
試驗例13：螢光素酶標的siRNA之RNAi活性
如以下所示般，以螢光素酶發光抑制水準作為指標，對實施例24及53中所獲得之反義鏈之5'末端具有I-22或I-51之螢光素酶標的siRNA之RNAi活性進行評估。
將試驗例1所使用之導入有螢光素酶表現載體之海拉(Hela)細胞懸浮於含有10%胎牛血清之RPMI 1640培養基(RPMI 1640 Medium(ATCC改良)(Invitrogen Life technologies，型號A10491-01))中，以每孔之細胞數成為7500之方式將50μL之細胞懸浮液接種至培養皿(CulturPlateTM 96細胞培養用微量盤，型號6005688)之各孔中。
以OPTI-MEM(Invitrogen Life technologies，31985-070)對siRNA進行稀釋。以OPTI-MEM對脂質體RNAiMAX(Invitrogen Life technologies，13778-150)進行稀釋。將所製備之各稀釋液混合，使之形成siRNA與脂質體RNAiMAX複合體。於含有細胞懸浮液之各孔中添加10μL之所製備之siRNA-脂質體RNAiMAX複合體溶液，藉此將 siRNA導入至海拉(Hela)細胞中。siRNA之最終濃度係設為1000pmol/L、100pmol/L、10pmol/L、1pmol/L及100fmol/L之5點，以N=5進行設定。又，作為陰性對照群，接種僅添加有脂質體RNAiMAX之細胞。又，為了進行比較，對於各siRNA之相當於I-22或I-51之位置具有單磷酸腺苷之454-A，亦以同樣之方式進行試驗。
導入siRNA後之細胞係於37℃、5%CO2條件下培養24小時。
對於培養後之細胞，將作為市售螢光素酶定量試劑之Steady-Glo螢光素酶分析系統(Steady-Glo Luciferase Assay System，Promega，E2520)按照隨附之操作說明對各孔添加40μL，藉由ARVO(PerkinElmer)，按照操作說明測定各孔每0.5秒之發光量(cps)。
於測定螢光素酶標的siRNA處理群之發光量之同時，亦測定陰性對照群之發光量，藉此以將siRNA未導入群(陰性對照群)之發光量設為1時之相對比率計算出siRNA導入檢體之RNAi效果。
將本試驗之結果示於圖14。圖14係表示作為本發明之siRNA之I-22、I-51、及其序列中相當於I-22或I-51之位置具有單磷酸腺苷之454-A之減弱活性之圖。縱軸表示50%抑制濃度(IC50(pM))，橫軸表示所使用之siRNA。統計解析係使用統計解析軟體SAS(9.2版，SAS Institute Inc.)。
根據試驗例13之結果可知，反義鏈之5'末端具有I-22或I-51之siRNA與反義5'末端具有相對應之天然型核苷酸之siRNA相比，顯示出較高之減弱活性。
試驗例14：螢光素酶標的siRNA之減弱活性
以作為發光測定機器之2104 EnvisionTM多標記計數儀(PerkinElmer)測定各孔每0.8秒之發光量，除此以外，以與試驗例13同樣之方式測定反義鏈之5'末端具有實施例54、57及58中所獲得之化合物之siRNA之活性並進行評估。將反義鏈之5'末端具有I-52、I-55或I- 56之siRNA、以及其序列中相當於I-52、I-55或I-56之位置具有天然型單磷酸腺苷之454-A之減弱活性示於圖15。
根據試驗例14之結果可知，反義鏈之5'末端具有I-52、I-55或I-56之siRNA與反義5'末端具有相對應之天然型核苷酸之siRNA相比，顯示出較高之減弱活性。
試驗例15：螢光素酶標的siRNA之減弱活性
以與試驗例13同樣之方式，測定反義鏈之5'末端具有實施例56、59、60及61中所獲得之化合物siRNA之活性並進行評估。將反義鏈之5'末端具有I-54、I-57、I-58或I-59之siRNA、以及其序列中相當於I-54、I-57、I-58或I-59之位置具有天然型單磷酸腺苷之454-A之減弱活性示於圖16。
根據試驗例15之結果可知，反義鏈之5'末端具有I-54、I-57、I-58或I-59之siRNA與反義5'末端具有相對應之天然型核苷酸之siRNA相比，顯示出較高之減弱活性。
試驗例16：螢光素酶標的siRNA之減弱活性
以與試驗例13同樣之方式，測定反義鏈之5'末端具有實施例55、62、63、64、65、66及72中所獲得之化合物之siRNA之活性並進行評估。將反義鏈之5'末端具有I-53、I-60、I-61、I-62、I-63、I-64或I-70之siRNA、以及其序列中相當於I-53、I-60、I-61、I-62、I-63、I-64或I-70之位置具有天然型單磷酸腺苷之454-A之減弱活性示於圖17。
根據試驗例16之結果可知，反義鏈之5'末端具有I-53、I-60、I-61、I-62、I-63、I-64或I-70之siRNA與反義5'末端具有相對應之天然型核苷酸之siRNA相比，顯示出較高之減弱活性。
試驗例17：螢光素酶標的siRNA之減弱活性
以與試驗例13同樣之方式，測定反義鏈之5'末端具有實施例73、74、75及76中所獲得之化合物之siRNA之活性並進行評估。將反義鏈 之5'末端具有I-71、I-72、I-73或I-74之siRNA、以及其序列中相當於I-71、I-72、I-73或I-74之位置具有天然型單磷酸腺苷之454-A之減弱活性示於圖18。
根據試驗例17之結果可知，反義鏈之5'末端具有I-71、I-72、I-73或I-74之siRNA與反義5'末端具有相對應之天然型核苷酸之siRNA相比，顯示出較高之減弱活性。
試驗例18：螢光素酶標的siRNA之減弱活性
以與試驗例13同樣之方式，測定反義鏈之5'末端具有實施例67、68、69、70及71中所獲得之化合物之siRNA之活性並進行評估。將反義鏈之5'末端具有I-65、I-66、I-67、I-68或I-69之siRNA、以及其序列中相當於I-65、I-66、I-67、I-68或I-69之位置具有天然型單磷酸腺苷之454-A之減弱活性示於圖19。
根據試驗例18之結果可知，反義鏈之5'末端具有I-65、I-66、I-67、I-68或I-69之siRNA與反義5'末端具有相對應之天然型核苷酸之siRNA相比，顯示出較高之減弱活性。
試驗例19：螢光素酶標的siRNA之減弱活性
以與試驗例13同樣之方式，測定反義鏈之5'末端具有實施例80、81、82及83中所獲得之化合物之siRNA之活性並進行評估。將反義鏈之5'末端具有I-78、I-79、I-80或I-81之siRNA、以及其序列中相當於I-78、I-79、I-80或I-81之位置具有天然型單磷酸腺苷之454-A之減弱活性示於圖20。
根據試驗例19之結果可知，反義鏈之5'末端具有I-78、I-79、I-80或I-81之siRNA與反義5'末端具有相對應之天然型核苷酸之siRNA相比，顯示出較高之減弱活性。
試驗例20：螢光素酶標的siRNA之減弱活性
以與試驗例13同樣之方式，測定反義鏈之5'末端具有實施例77、 78及79中所獲得之化合物之siRNA之活性並進行評估。將反義鏈之5'末端具有I-75、I-76或I-77之siRNA、以及其序列中相當於I-75、I-76或I-77之位置具有天然型單磷酸腺苷之454-A之減弱活性示於圖21。
根據試驗例20之結果可知，反義鏈之5'末端具有I-75、I-76或I-77之siRNA與反義5'末端具有相對應之天然型核苷酸之siRNA相比，顯示出較高之減弱活性。
試驗例21：螢光素酶標的siRNA之減弱活性
以與試驗例13同樣之方式，測定反義鏈之5'末端具有實施例84及85中所獲得之化合物之siRNA之活性並進行評估。將反義鏈之5'末端具有I-82或I-83之siRNA、以及其序列中相當於I-82或I-83之位置具有天然型單磷酸腺苷之454-A之減弱活性示於圖22。
根據試驗例21之結果可知，反義鏈之5'末端具有I-82或I-83之siRNA與反義5'末端具有相對應之天然型核苷酸之siRNA相比，顯示出較高之減弱活性。
試驗例22：螢光素酶標的siRNA之減弱活性
以與試驗例13同樣之方式，測定反義鏈之5'末端具有實施例86及87中所獲得之化合物之siRNA之活性並進行評估。將反義鏈之5'末端具有I-84或I-85之siRNA、以及其序列中相當於I-84或I-85之位置具有天然型單磷酸腺苷之454-A之減弱活性示於圖23。
根據試驗例22之結果可知，反義鏈之5'末端具有I-84或I-85之siRNA與反義5'末端具有相對應之天然型核苷酸之siRNA相比，顯示出較高之減弱活性。
試驗例23：螢光素酶標的siRNA之減弱活性
以與試驗例13同樣之方式，測定反義鏈之5'末端具有實施例88、89、90及91中所獲得之化合物之siRNA之活性並進行評估。將反義鏈之5'末端具有I-86、I-87、I-88或I-89之siRNA、以及其序列中相當於I- 86、I-87、I-88或I-89之位置具有天然型單磷酸腺苷之454-A之減弱活性示於圖24。
根據試驗例23之結果可知，反義鏈之5'末端具有I-86、I-87、I-88或I-89之siRNA與反義5'末端具有相對應之天然型核苷酸之siRNA相比，顯示出較高之減弱活性。
試驗例24：螢光素酶標的siRNA之減弱活性
以與試驗例13同樣之方式，測定反義鏈之5'末端具有實施例29、31、92、93、94及95中所獲得之化合物之siRNA之活性並進行評估。將反義鏈之5'末端具有I-27、I-29、I-90、I-91、I-92或I-93之siRNA、以及其序列中相當於I-27、I-29、I-90、I-91、I-92或I-93之位置具有天然型單磷酸腺苷之454-A之減弱活性示於圖25。
根據試驗例24之結果可知，反義鏈之5'末端具有I-27、I-29、I-90、I-91、I-92或I-93之siRNA與反義5'末端具有相對應之天然型核苷酸之siRNA相比，顯示出較高之減弱活性。
試驗例25：螢光素酶標的siRNA之減弱活性
以與試驗例13同樣之方式，測定反義鏈之5'末端具有實施例96及97中所獲得之化合物之siRNA之活性並進行評估。將反義鏈之5'末端具有I-94或I-95之siRNA、以及其序列中相當於I-94或I-95之位置具有天然型單磷酸腺苷且3'末具有DNA體之胸腺嘧啶之454-A-dT之減弱活性示於圖26。
根據試驗例25之結果可知，反義鏈之5'末端具有I-94或I-95之siRNA與反義5'末端具有相對應之天然型核苷酸之siRNA相比，顯示出較高之減弱活性。
試驗例26：螢光素酶標的siRNA之減弱活性
以與試驗例13同樣之方式，測定反義鏈之5'末端具有實施例98中所獲得之化合物之siRNA之活性並進行評估。將反義鏈之5'末端具有 I-96之siRNA、以及其序列中相當於I-96之位置具有天然型單磷酸腺苷之454-A之減弱活性示於圖27。
根據試驗例26之結果可知，反義鏈之5'末端具有I-96之siRNA與反義5'末端具有相對應之天然型核苷酸之siRNA相比，顯示出較高之減弱活性。
試驗例27：螢光素酶標的siRNA之減弱活性
以與試驗例13同樣之方式，測定反義鏈之5'末端具有實施例99、100、101、102及103中所獲得之化合物之siRNA之活性並進行評估。將反義鏈之5'末端具有I-97、I-98、I-99、I-100或I-101之siRNA、以及其序列中相當於I-97、I-98、I-99、I-100或I-101之位置具有天然型單磷酸腺苷之454-A之減弱活性示於圖28。
根據試驗例27之結果可知，反義鏈之5'末端具有I-97、I-98、I-99、I-100或I-101之siRNA與反義5'末端具有相對應之天然型核苷酸之siRNA相比，顯示出較高之減弱活性。
[產業上之可利用性]
根據本發明，可提供與AGO2之親和性提高之寡核苷酸等。
<110> 日商協和醱酵麒麟有限公司
<120> 5'末端具有非天然核苷酸之寡核苷酸
<130> 1000P12332WO0
<150> JP2014040872
<151> 2014-03-03
<160> 69
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 239-BrdA義鏈
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<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 239-BrdA反義鏈
<400> 2
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 4
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 21
<212> RNA
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<220>
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<211> 21
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<220>
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<220>
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> 1084-A反義鏈
<400> 16
<210> 17
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1203-A反義鏈
<400> 17
<210> 18
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1556-A反義鏈
<400> 18
<210> 19
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 874-G正義鏈
<400> 19
<210> 20
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 874-G反義鏈
<400> 20
<210> 21
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 874-C正義鏈
<400> 21
<210> 22
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 874-C反義鏈
<400> 22
<210> 23
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 874-U正義鏈
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<210> 24
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 874-U反義鏈
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 454-5-F-dU正義鏈
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<210> 26
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 454-5-F-dU反義鏈
<400> 26
<210> 27
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1556-5-F-dU正義鏈
<400> 27
<210> 28
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 454-U反義鏈
<400> 28
<210> 29
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1556-U反義鏈
<400> 29
<210> 30
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 217-BrdA正義鏈
<400> 30
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 217-BrdA反義鏈
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<210> 32
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 278-BrdA正義鏈
<400> 32
<210> 33
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 278-BrdA反義鏈
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<210> 34
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 516-BrdA正義鏈
<400> 34
<210> 35
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 516-BrdA反義鏈
<400> 35
<210> 36
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 624-BrdA正義鏈
<400> 36
<210> 37
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 624-BrdA反義鏈
<400> 37
<210> 38
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 715-BrdA正義鏈
<400> 38
<210> 39
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 715-BrdA反義鏈
<400> 39
<210> 40
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 816-BrdA正義鏈
<400> 40
<210> 41
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 816-BrdA反義鏈
<400> 41
<210> 42
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 936-BrdA正義鏈
<400> 42
<210> 43
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 936-BrdA反義鏈
<400> 43
<210> 44
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1096-BrdA正義鏈
<400> 44
<210> 45
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1096-BrdA反義鏈
<400> 45
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1134-BrdA正義鏈
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<210> 47
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1134-BrdA反義鏈
<400> 47
<210> 48
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 217-A反義鏈
<400> 48
<210> 49
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 278-A反義鏈
<400> 49
<210> 50
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 516-A反義鏈
<400> 50
<210> 51
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 624-A反義鏈
<400> 51
<210> 52
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 715-A反義鏈
<400> 52
<210> 53
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 816-A反義鏈
<400> 53
<210> 54
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 936-A反義鏈
<400> 54
<210> 55
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1096-A反義鏈
<400> 55
<210> 56
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1134-A反義鏈
<400> 56
<210> 57
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1096-5-F-dU正義鏈
<400> 57
<210> 58
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1096-U反義鏈
<400> 58
<210> 59
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1096-A正義鏈
<400> 59
<210> 60
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1096-A反義鏈
<400> 60
<210> 61
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1096-G正義鏈
<400> 61
<210> 62
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1096-G反義鏈
<400> 62
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 前置引子
<400> 63
<210> 64
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 後置引子
<400> 64
<210> 65
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 454-A正義鏈
<400> 65
<210> 66
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 454-A反義鏈
<400> 66
<210> 67
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 454-XY正義鏈
<400> 67
<210> 68
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 454-A-dT，結合DNA/RNA分子：合成寡核苷酸
<220>
<221> 未分類之特徵
<222> (21)..(21)
<223> 去氧胸苷
<400> 68
<210> 69
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 454-Xa-dT，結合DNA/RNA分子：合成寡核苷酸
<220>
<221> 未分類之特徵
<222> (21)..(21)
<223> 去氧胸苷
<400> 69

Claims (72)

  1. 一種寡核苷酸，其於寡核苷酸之5'末端具有式(I)所表示之核苷酸殘基或核苷殘基，該核苷酸殘基或核苷殘基經由3位之氧原子而與鄰接之核苷酸殘基鍵結， {式中，X1為氧原子、硫原子、硒原子或NR4(式中，R4為氫原子、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷基磺醯基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳醯基或可具有取代基之芳香族雜環羰基)，R1為式(II) {式中，Y1為氮原子或CR8[式中，R8為氫原子、鹵素、氰基、羧基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷氧基羰基、可具有取代基之低級烷醯基、可 具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、-NR9aR9b(式中，R9a及R9b相同或不同，分別為氫原子、可具有取代基之低級烷基或可具有取代基之芳烷基)、或-CONR9cR9d(式中，R9c及R9d相同或不同，分別為氫原子或可具有取代基之低級烷基)]，R5為氫原子、鹵素、氰基、羧基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之環烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷氧基羰基、可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳香族雜環基、可具有取代基之脂肪族雜環基、-NR10aR10b(式中，R10a及R10b分別與上述R9a及R9b含義相同)、-CONR10cR10d(式中，R10c及R10d分別與上述R9c及R9d含義相同)、-N=C-R10e(式中，R10e為氫原子或可具有取代基之低級烷基)、-C=N-R10f(式中，R10f為氫原子或可具有取代基之低級烷基)或-N=N-R10g(式中，R10g為氫原子或可具有取代基之低級烷基)，R6為氫原子、鹵素、氰基、羧基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷氧基羰基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳氧基、可具有取代基之芳烷氧基、可具有取代基之芳硫基、可具有取代基之芳醯基、可具有取代基之芳香族雜環基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之芳香族雜環氧基、可具有取代基之芳香族雜環硫基、可具有取代基之芳香族 雜環羰基、-NR11aR11b(式中，R11a及R11b相同或不同，分別為氫原子、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷基磺醯基、可具有取代基之芳醯基、可具有取代基之芳基磺醯基、可具有取代基之芳香族雜環基、可具有取代基之芳香族雜環羰基或可具有取代基之芳香族雜環磺醯基)、-CONR11cR11d(式中，R11c及R11d相同或不同，分別為氫原子、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基)、-NHCONR11eR11f(式中，R11e及R11f相同或不同，分別為氫原子、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基)、-NHCO2R11g(式中，R11g為可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基)、-N=C-R11h(式中，R11h為氫原子或可具有取代基之低級烷基)、-C=N-R11i(式中，R11i為氫原子或可具有取代基之低級烷基)或-N=N-R11j(式中，R11j為氫原子或可具有取代基之低級烷基)，R7為氫原子、核酸領域中之氫原子之等效體、鹵素、氰基、羧基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷氧基羰基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳氧基、可具有取代基之芳硫基、可具有取代基之芳醯基、可具有取代基之芳香族雜環基、 可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之芳香族雜環氧基、可具有取代基之芳香族雜環硫基、可具有取代基之芳香族雜環羰基、-NR11aR11b(式中，R11a及R11b相同或不同，分別為氫原子、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷基磺醯基、可具有取代基之芳醯基、可具有取代基之芳基磺醯基、可具有取代基之芳香族雜環基、可具有取代基之芳香族雜環羰基或可具有取代基之芳香族雜環磺醯基)、-CONR11cR11d(式中，R11c及R11d相同或不同，分別為氫原子、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基)、-NHCONR11eR11f(式中，R11e及R11f相同或不同，分別為氫原子、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基)或-NHCO2R11g(式中，R11g為可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基)，於Y1為氮原子、R5為氫原子、R6為-NR11aR11b、R7為氫原子之情形時，不存在R11a及R11b同時為氫原子之情況}、式(III) (式中，Y2、R6a及R7a分別與上述Y1、R6及R7含義相同)、式(IV) [式中，R12為氫原子、核酸領域中之氫原子之等效體、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之低級烷醯基或可具有取代基之低級烷基磺醯基，---為單鍵或雙鍵，於---為單鍵之情形時，Y3為NR13a(式中，R13a為氫原子、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環烷基、可具有取代基之低級烷醯基或可具有取代基之低級烷基磺醯基)或CR14aR14b(式中，R14a及R14b相同或不同，分別為氫原子、鹵素、氰基、羧基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷氧基羰基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之低級烷基胺基、可具有取代基之二低級烷基胺基、可具有取代基之低級 烷基胺甲醯基、可具有取代基之二低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環基、或可具有取代基之芳香族雜環烷基)滿Y4為NR13b(式中，R13b與上述R13a含義相同)或CR14cR14d(式中，R14c及R14d分別與上述R14a及R14b含義相同)，於---為雙鍵之情形時，Y3為氮原子或CR14e(式中，R14e為氫原子、鹵素、氰基、羧基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷氧基羰基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之低級烷基胺基、可具有取代基之二低級烷基胺基、可具有取代基之低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之二低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環基、或可具有取代基之芳香族雜環烷基)，Y4為氮原子或CR14f(式中，R14f為氫原子、鹵素、氰基、羧基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷氧基羰基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之低級烷基胺基、可具有取代基之二低級烷基胺基、可具有取代基之低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之二低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環基、或可具有取代基之芳香族雜環烷基)，於R12為氫原子、Y3為CR14e、Y4為CR14f之情形時，不存在R14e及R14f同時為氫原子之情況及R14e為甲基且R14f為氫原子之情況]、或式(V) (式中，R12a與上述R12含義相同，環A為芳香族環，n1為0~4之整數，R16為鹵素、羥基、巰基、硝基、氰基、羧基、胺甲醯基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷氧基羰基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之低級烷基胺基、可具有取代基之二低級烷基胺基、可具有取代基之低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之二低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳烷基、可具有取代基之芳香族雜環基、可具有取代基之芳香族雜環烷基或可具有取代基之低級烷基磺醯基，於n1為2~4之整數之情形時，各R16可相同亦可不同，但於環A為苯環、n1為2之情形時，R16不為低級烷氧基)，R2為氫原子、羥基、鹵素或可具有取代基之低級烷氧基，R3為氫原子或 (式中，n2為1、2或3)}。
  2. 如請求項1之寡核苷酸，其中X1為氧原子。
  3. 如請求項1或2之寡核苷酸，其中R1為式(II)。
  4. 如請求項3之寡核苷酸，其中Y1為氮原子。
  5. 如請求項3或4之寡核苷酸，其中R5為氫原子、鹵素、氰基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之環烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳香族雜環基、可具有取代基之脂肪族雜環基、-NR10aR10b(式中，R10a及R10b分別與上述含義相同)、-CONR10cR10d(式中，R10c及R10d分別與上述含義相同)、-N=C-R10e(式中，R10e為氫原子或可具有取代基之低級烷基)、-C=N-R10f(式中，R10f為氫原子或可具有取代基之低級烷基)或-N=N-R10g(式中，R10g為氫原子或可具有取代基之低級烷基)。
  6. 如請求項3或4之寡核苷酸，其中R5為氫原子、鹵素、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、氰基或-NR10aR10b(式中，R10a及R10b分別與上述含義相同)。
  7. 如請求項3或4之寡核苷酸，其中R5為可具有取代基之低級烯基或氰基。
  8. 如請求項3至7中任一項之寡核苷酸，其中R6為可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳香族雜環基、-NR11aR11b(式中，R11a及R11b分別與上述含義相同)、-N=C-R11h(式中，R11h為氫原子或可具有取代基之低級烷基)、-C=N-R11i(式中，R11i為氫原子或可具有取代基之低級烷基)或-N=N-R11j(式中，R11j為氫原子或可具有取代基之低級烷基)。
  9. 如請求項3至7中任一項之寡核苷酸，其中R6為可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之芳基或-NR11aR11b(式中，R11a及R11b分別與上述含義相同)。
  10. 如請求項3至7中任一項之寡核苷酸，其中R6為-NR11aR11b(式中，R11a及R11b相同或不同，分別為氫原子或可具有取代基之低級烷基)。
  11. 如請求項3至7中任一項之寡核苷酸，其中R6為可具有取代基之芳基，且取代基存在於芳基之間位或對位。
  12. 如請求項3至11中任一項之寡核苷酸，其中R7為氫原子。
  13. 如請求項1或2之寡核苷酸，其中R1為式(III)。
  14. 如請求項13之寡核苷酸，其中Y2為氮原子。
  15. 如請求項13或14之寡核苷酸，其中R6a為胺基、甲基胺基或二甲胺基。
  16. 如請求項13至15中任一項之寡核苷酸，其中R7為氫原子。
  17. 如請求項1或2之寡核苷酸，其中R1為式(IV)。
  18. 如請求項17之寡核苷酸，其中R12為氫原子或核酸領域中之氫原子之等效體。
  19. 如請求項18之寡核苷酸，其中---為雙鍵，Y3為CR14e(式中，R14e與上述含義相同)，Y4為氮原子或CR14f(式中，R14f與上述含義相同，但為氰基之情形除外)。
  20. 如請求項19之寡核苷酸，其中R14e為氫原子。
  21. 如請求項19之寡核苷酸，其中R14e為鹵素、氰基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基，R14f為氫原子。
  22. 如請求項19之寡核苷酸，其中R14e為氫原子，R14f為鹵素、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代 基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基。
  23. 如請求項1或2之寡核苷酸，其中R1為式(v)。
  24. 如請求項23之寡核苷酸，其中環A為式(A1) (式中，R16及n1分別與上述含義相同，但式(A1') 所表示之情形除外)、式(A2) (式中，R16與上述含義相同，n1為0~2之整數，X2為NH、氧原子或硫原子)、或式(A3) (式中，R16及X2與上述含義相同，n1為0~2之整數)。
  25. 如請求項23或24之寡核苷酸，其中R16為鹵素、硝基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烷基胺基或可具有取代 基之二低級烷基胺基。
  26. 如請求項25之寡核苷酸，其中R12a為氫原子或核酸領域中之氫原子之等效體。
  27. 如請求項23至26中任一項之寡核苷酸，其中n1為1或2。
  28. 如請求項1至27中任一項之寡核苷酸，其中R3為 (式中，n2與上述含義相同)。
  29. 如請求項28之寡核苷酸，其中n2為1。
  30. 如請求項1至29中任一項之寡核苷酸，其中R2為氫原子、羥基、氟原子或甲氧基。
  31. 如請求項1至29中任一項之寡核苷酸，其中R2為羥基。
  32. 如請求項1至29中任一項之寡核苷酸，其中R2為氫原子或氟原子。
  33. 如請求項1之寡核苷酸，其中X1為氧原子，R2為氫原子、羥基、氟原子或甲氧基。
  34. 如請求項33之寡核苷酸，其中R1為式(IIA) (式中，R5A及R6A分別與上述R5及R6含義相同)。
  35. 如請求項34之寡核苷酸，其中R5A為鹵素、胺甲醯基、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之環烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之低級烷醯基、可具有取代基之低級烷基胺基、可具有取代基之二低級烷基胺基、可具有取代基之低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之二低級烷基胺甲醯基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳香族雜環基、可具有取代基之脂肪族雜環基或-NR10aR10b(式中，R10a及R10b分別與上述含義相同)。
  36. 如請求項34之寡核苷酸，其中R5A為鹵素、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、氰基或-NR10aR10b(式中，R10a及R10b分別與上述含義相同)。
  37. 如請求項34至36中任一項之寡核苷酸，其中R6A為可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳香族雜環基或NR11aR11b(式中，R11a及R11b分別與上述含義相同)。
  38. 如請求項34至36中任一項之寡核苷酸，其中R6A為NR11aR11b(式中，R11a及R11b分別與上述含義相同)。
  39. 如請求項34至36中任一項之寡核苷酸，其中R6A為胺基、可具有取代基之低級烯基或可具有取代基之芳基。
  40. 如請求項33之寡核苷酸，其中R1為式(IVA) (式中，Y3A及Y4A分別與上述Y3及Y4含義相同，但於Y3A及Y4A為CR14e及CR14f、R14e為氫原子之情形時，R14f不為氰基)。
  41. 如請求項40之寡核苷酸，其中Y3A為CR14e(式中，R14e與上述含義相同)，Y4A為CR14f(式中，R14f與上述含義相同)。
  42. 如請求項41之寡核苷酸，其中R14e為氫原子。
  43. 如請求項41之寡核苷酸，其中R14e為鹵素、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基，R14f為氫原子。
  44. 如請求項41之寡核苷酸，其中R14e為氫原子，R14f為鹵素、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之芳基或可具有取代基之芳香族雜環基。
  45. 如請求項33之寡核苷酸，其中R1為式(VA) (式中，環AA、n1A及R16A分別與上述環A、n1、及R16含義相同，於n1A為2~4之整數之情形時，各R16A可相同亦可不同，但於環AA為苯環、n1A為2之情形時，R16A不為低級烷氧基，於環AA為苯環、n1A為1、R16A為氯原子之情形時，式(A1') 所表示之情形除外)。
  46. 如請求項45之寡核苷酸，其中環AA為苯環或噻吩環。
  47. 如請求項45或46之寡核苷酸，其中R16A為鹵素、硝基低級烷基、可具有取代基之低級烷基胺基或可具有取代基之二低級烷基胺基。
  48. 如請求項45至47中任一項之寡核苷酸，其中n1A為1或2。
  49. 如請求項33至48中任一項之寡核苷酸，其中R3為 (式中，n2A與上述含義相同)。
  50. 如請求項49之寡核苷酸，其中n2A為1。
  51. 如請求項33至50中任一項之寡核苷酸，其中R2為氫原子或氟原子。
  52. 如請求項33至50中任一項之寡核苷酸，其中R2為羥基。
  53. 如請求項1至52中任一項之寡核苷酸，其具有10~80個鹼基長度。
  54. 如請求項1至52中任一項之寡核苷酸，其具有20~50個鹼基長度。
  55. 如請求項1至52中任一項之寡核苷酸，其具有20~30個鹼基長度。
  56. 如請求項1至52中任一項之寡核苷酸，其具有21~25個鹼基長度。
  57. 如請求項1至56中任一項之寡核苷酸，其係雙鏈寡核苷酸。
  58. 如請求項1至56中任一項之寡核苷酸，其係單鏈寡核苷酸。
  59. 如請求項1至56中任一項之寡核苷酸，其中寡核苷酸係短鏈干擾性RNA(siRNA)。
  60. 一種提高針對編碼與疾病相關之蛋白質之信使RNA(mRNA)之減弱活性之方法，其特徵在於：於具有針對編碼與疾病相關之蛋白質之信使RNA(mRNA)之減弱活性的寡核苷酸中，將該寡核苷酸之5'末端之鹼基殘基取代為式(II) (式中，Y1、R5、R6及R7分別與上述含義相同)、式(III) (式中，Y2、R6a及R7a分別與上述含義相同)、式(IV) (式中，R12、---、Y3及Y4分別與上述含義相同)、或式(V) (式中，R12a、環A、n1及R16分別與上述含義相同)所表示之鹼基殘基。
  61. 一種提高針對編碼與疾病相關之蛋白質之信使RNA(mRNA)之減弱活性之方法，其特徵在於：於具有針對編碼與疾病相關之蛋白質之信使RNA(mRNA)之減弱活性、5'末端之鹼基為鳥嘌呤或胞嘧啶之寡核苷酸中，將該寡核苷酸之5'末端之鳥嘌呤殘基或胞嘧啶殘基取代為腺嘌呤殘基(6-胺基嘌呤-9-基)、胸腺嘧啶殘基(5-甲基-1,2,3,4-四氫嘧啶-2,4-二酮-1-基)、尿苷殘基(嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮-1-基)、式(II) (式中，Y1、R5、R6及R7分別與上述含義相同)、式(III) (式中，Y2、R6a及R7a分別與上述含義相同)、式(IV) (式中，R12、---、Y3及Y4分別與上述含義相同)、或式(V) (式中，R12a、環A、n1及R16分別與上述含義相同)所表示之鹼基殘基。
  62. 如請求項60或61之方法，其中寡核苷酸係短鏈干擾性RNA(siRNA)。
  63. .一種核酸醫藥，其含有藉由如請求項60至62中任一項之方法而提高寡核苷酸針對標的信使RNA(mRNA)之減弱活性之寡核苷酸。
  64. 一種核苷酸或核苷、利用保護基對其羥基、羧基及/或胺基進行保護者、或者其醯胺、或其鹽，其係用於取代具有針對編碼與疾病相關之蛋白質之信使RNA(mRNA)之減弱活性的寡核苷酸之5'末端之核苷酸殘基或核苷殘基、用於提高該寡核苷酸針對標的mRNA之減弱活性的式(Ia)所表示者， (式中，X1、R1、R2及R3分別與上述含義相同)。
  65. 如請求項64之核苷酸或核苷、利用保護基對其羥基、羧基及/或胺基進行保護之化合物、或者其醯胺、或其鹽，其中寡核苷酸係短鏈干擾性RNA(siRNA)。
  66. 一種核苷酸或核苷、利用保護基對其羥基、羧基及/或胺基進行保護之化合物、或者其醯胺、或其鹽，其係用於取代具有針對編碼與疾病相關之蛋白質之信使RNA(mRNA)之減弱活性的寡核苷酸之5'末端之核苷酸殘基或核苷殘基、用於提高該寡核苷酸針對標的mRNA之減弱活性的含有式(II) (式中，Y1、R5、R6及R7分別與上述含義相同)、式(III) (式中，Y2、R6a及R7a分別與上述含義相同)、式(IV) (式中，R12、---、Y3及Y4分別與上述含義相同)、或式(V) (式中，R12a、環A、n1及R16分別與上述含義相同)所表示之鹼 基殘基者。
  67. 如請求項66之核苷酸或核苷、利用保護基對其羥基、羧基及/或胺基進行保護之化合物、或者其醯胺、或其鹽，其中寡核苷酸係短鏈干擾性RNA(siRNA)。
  68. 一種於5'末端具有式(I)所表示之核苷酸殘基或核苷殘基、具有針對編碼與疾病相關之蛋白質之信使RNA(mRNA)之減弱活性的寡核苷酸之用途，其係用於製造標的蛋白質之表現抑制劑， (式中，X1、R1、R2及R3分別與上述含義相同)。
  69. 一種將下述式(II)、式(III)、式(IV)、或式(V)所表示之鹼基殘基作為5'末端之鹼基殘基而導入、具有針對編碼與疾病相關之蛋白質之信使RNA(mRNA)之減弱活性的寡核苷酸之用途，其係用於製造標的蛋白質之表現抑制劑， (式中，Y1、R5、R6及R7分別與上述含義相同) (式中，Y2、R6a及R7a分別與上述含義相同) (式中，R12、---、Y3及Y4分別與上述含義相同) (式中，R12a、環A、n1及R16分別與上述含義相同)。
  70. 如請求項68或69之用途，其中寡核苷酸係短鏈干擾性RNA(siRNA)。
  71. 如請求項1至7中任一項之寡核苷酸，其中R2為氫原子，R6為可具 有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之芳氧基、可具有取代基之芳烷氧基、可具有取代基之芳香族雜環氧基、可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之芳硫基、可具有取代基之芳香族雜環硫基、-NR30R31(R30及R31相同或不同，分別為氫原子、可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級烯基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之芳基、可具有取代基之芳香族雜環、可具有取代基之芳烷基、或可具有取代基之芳香族雜環烷基，其中，R30及R31同時為氫原子之情形除外)、可具有取代基之芳基、或可具有取代基之芳香族雜環。
  72. 如請求項1至7中任一項之寡核苷酸，其中R6為可具有取代基之低級烷氧基、可具有取代基之芳烷氧基、可具有取代基之低級烷硫基、可具有取代基之芳硫基、-NR30AR31A(R30A及R31A相同或不同，分別為可具有取代基之低級烷基、可具有取代基之低級炔基、可具有取代基之芳基、或可具有取代基之芳烷基，其中，R30A及R31A同時為氫原子之情形除外)。
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