JPWO2015133491A1 - ５’末端に非天然ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド - Google Patents

５’末端に非天然ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド Download PDF

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Abstract

オリゴヌクレオチドの5’末端に、式(I){式中、X1は酸素原子等であり、R1は式(IIA)(式中、R5Aはハロゲン等であり、R6Aは水素原子等である)、式(IVA)(式中、Y3Aは窒素原子等であり、Y4AはCH等である)等であり、R2は水素原子、ヒドロキシ、ハロゲンまたは置換基を有していてもよい低級アルコキシであり、R3は水素原子または式(VI)(式中、n2は1、2または3である)である｝で表されるヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基を有し、該ヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基は3位の酸素原子を介して隣接するヌクレオチド残基と結合する、オリゴヌクレオチド等を提供する。

Description

本発明は、標的メッセンジャーRNA(mRNA)に対するノックダウン活性(例えば、RNA干渉活性等)を有するオリゴヌクレオチド等に関する。
短鎖干渉性RNA(small interfering RNA、以下siRNA)は、RNA干渉(RNAinterference、以下RNAi)に関与しており、標的遺伝子の発現を抑制するためのガイドとしての機能を有するRNAである[ネイチャー(Nature)、第411巻、第6836号、494-498頁(2001年)]。siRNAはメッセンジャーRNA(mRNA)の切断を介して、そのmRNAが発現を担う蛋白質の発現を選択的に抑制(ノックダウン)し得ることから、医薬への応用が期待されている[ネイチャー・レビューズ・キャンサー(Nature Reviews Cancer)、第11巻、59-67頁(2011年)]。
siRNAは通常、RNA inducedsilencingcomplex(RISC)と呼ばれる複合体に取り込まれ、その機能を発現する。そして、RISCの主要構成成分はArgonaute2(AGO2)と呼ばれる蛋白質であり、AGO2は、RNAi経路においてsiRNAに結合し、mRNAを切断する[トレンズ・イン・バイオケミカル・サイエンシーズ(TrendsinBiochemical Sciences)、第35巻、第7号、368-376頁(2010年)]。RISCに取り込まれたsiRNAは、センス鎖が切断されアンチセンス鎖のみの一本鎖となった後、アンチセンス鎖と相補性を有する標的mRNAと結合する。標的mRNAは、AGO2中のRNaseドメインによって切断され、その結果として蛋白質の発現が抑制される[サイレンス(Silence)、第1巻、3頁(2010年)]ことが知られている。
一方、近年、hAGO2MID/AMP複合体、及びhAGO2MID/UMP複合体の立体構造解析[ネイチャー(Nature)、第465巻、818-822頁(2010年)]や、hAGO2とRNAオリゴ複合体に関する立体構造解析も報告されている[サイエンス(Science)、第336巻、25頁(2012年)]。
また、近年、特にX線を用いた蛋白質の構造解析が盛んに行われており、得られた構造情報を基に、蛋白質と、それを標的とする化合物の結合様式を原子レベルで解明し、その構造にフィットする化合物をデザインする試みが多数報告されている[ジャーナル・オブ・ポストグラデュエート・メディシン(JournalofPostgraduate Medicine)、第55巻、301-304頁(2009年)]。
しかしながら、非天然型ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを用いたオフターゲット効果の回避(特許文献1)やAGO2との親和性向上によるsiRNAの活性増強の可能性について示唆されているものの(非特許文献1)、AGO2との親和性を向上させ、ノックダウン活性を増強させる方法が知られている（特許文献2）。
国際公開第2011/119674号パンフレット 国際公開第2014/034934号パンフレット
「モレキュラー・セラピー-ヌクレイック・アシッズ(Molecular Therapy - Nucleic Acids)」、2012年、第1巻、p.e5
本発明の目的は、AGO2との親和性が向上したオリゴヌクレオチド等を提供することにある。
本発明は以下の(1)〜(77)に関する。
（1）オリゴヌクレオチドの5’末端に、式(I)

｛式中、X1は酸素原子、硫黄原子、セレン原子またはNR4(式中、R4は水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルスルホニル、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアロイルまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環カルボニルである)であり、
R1は式(II)

｛式中、Y1は窒素原子またはCR8[式中、R8は水素原子、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、-NR9aR9b(式中、R9a及びR9bは同一または異なって、それぞれ水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキルまたは置換基を有していてもよいアラルキルである)、または-CONR9cR9d(式中、R9c及びR9dは同一または異なって、それぞれ水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)である]であり、
R5は水素原子、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよいシクロアルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、置換基を有していてもよい脂肪族複素環基、-NR10aR10b(式中、R10a及びR10bはそれぞれ前記R9a及びR9bと同義である)、-CONR10cR10d(式中、R10c及びR10dはそれぞれ前記R9c及びR9dと同義である)、-N=C-R10e(式中、R10eは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)、-C=N-R10f(式中、R10fは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)または-N=N-R10g(式中、R10gは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)であり、
R6は水素原子、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよいアリールオキシ、置換基を有していてもよいアラルキルオキシ、置換基を有していてもよいアリールチオ、置換基を有していてもよいアロイル、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環オキシ、置換基を有していてもよい芳香族複素環チオ、置換基を有していてもよい芳香族複素環カルボニル、-NR11aR11b(式中、R11a及びR11bは、同一または異なって、それぞれ水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルスルホニル、置換基を有していてもよいアロイル、置換基を有していてもよいアリールスルホニル、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、置換基を有していてもよい芳香族複素環カルボニルまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環スルホニルである)、-CONR11cR11d(式中、R11c及びR11dは同一または異なって、それぞれ水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基である)、-NHCONR11eR11f(式中、R11e及びR11fは同一または異なって、それぞれ水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基である)、-NHCO2R11g(式中、R11gは置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基である)、-N=C-R11h(式中、R11hは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)、-C=N-R11i(式中、R11iは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)または-N=N-R11j(式中、R11jは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)であり、
R7は水素原子、核酸分野における水素原子の等価体、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよいアリールオキシ、置換基を有していてもよいアリールチオ、置換基を有していてもよいアロイル、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環オキシ、置換基を有していてもよい芳香族複素環チオ、置換基を有していてもよい芳香族複素環カルボニル、-NR11aR11b(式中、R11a及びR11bは、同一または異なって、それぞれ水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルスルホニル、置換基を有していてもよいアロイル、置換基を有していてもよいアリールスルホニル、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、置換基を有していてもよい芳香族複素環カルボニルまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環スルホニルである)、-CONR11cR11d(式中、R11c及びR11dは同一または異なって、それぞれ水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基である)、-NHCONR11eR11f(式中、R11e及びR11fは同一または異なって、それぞれ水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基である)または-NHCO2R11g(式中、R11gは置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基である)であるが、Y1が窒素原子であり、R5が水素原子であり、R6が-NR11aR11bであり、R7が水素原子である場合、R11a及びR11bは同時に水素原子になることはない｝、式(III)

(式中、Y2、R6a及びR7aはそれぞれ前記Y1、R6及びR7と同義である)、式(IV)

[式中、R12は水素原子、核酸分野における水素原子の等価体、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよい低級アルカノイルまたは置換基を有していてもよい低級アルキルスルホニルであり、
---は単結合または二重結合であり、
---が単結合である場合、
Y3はNR13a(式中、R13aは水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよい低級アルカノイルまたは置換基を有していてもよい低級アルキルスルホニルである)またはCR14aR14b(式中、R14a及びR14bは同一または異なって、それぞれ水素原子、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよい低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよいジ低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよい低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいジ低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、または置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキルである)であり、
Y4はNR13b(式中、R13bは前記R13aと同義である)またはCR14cR14d(式中、R14c及びR14dはそれぞれ前記R14a及びR14bと同義である)であり、
---が二重結合である場合、
Y3は窒素原子またはCR14e(式中、R14eは水素原子、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよい低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよいジ低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよい低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいジ低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、または置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキルである)であり、
Y4は窒素原子またはCR14f(式中、R14fは水素原子、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよい低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよいジ低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよい低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいジ低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、または置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキルである)であるが、R12が水素原子であり、Y3がCR14eであり、Y4がCR14fである場合、R14e及びR14fは同時に水素原子になること並びにR14eがメチルであってR14fが水素原子になることはない]、または式(V)

(式中、R12aは前記R12と同義であり、環Aは芳香族環であり、n1は0〜4の整数であり、R16は、ハロゲン、ヒドロキシ、スルファニル、ニトロ、シアノ、カルボキシ、カルバモイル、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよい低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよいジ低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよい低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいジ低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキルまたは置換基を有していてもよい低級アルキルスルホニルであり、n1が2〜4の整数の場合、それぞれのR16は同一でも異なっていてもよい)であり、
R2は水素原子、ヒドロキシ、ハロゲンまたは置換基を有していてもよい低級アルコキシであり、
R3は水素原子または

(式中、n2は1、2または3である)である｝で表されるヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基を有し、該ヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基は3位の酸素原子を介して隣接するヌクレオチド残基と結合する、オリゴヌクレオチド。
（2）X1が酸素原子である、(1)記載のオリゴヌクレオチド。
（3）R1が式(II)である、(1)または(2)記載のオリゴヌクレオチド。
（4）Y1が窒素原子である、(3)記載のオリゴヌクレオチド。
（5）R5が水素原子、ハロゲン、シアノ、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、置換基を有していてもよい脂肪族複素環基、-NR10aR10b(式中、R10a及びR10bはそれぞれ前記と同義である)、-CONR10cR10d(式中、R10c及びR10dはそれぞれ前記と同義である)、-N=C-R10e(式中、R10eは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)、-C=N-R10f(式中、R10fは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)または-N=N-R10g(式中、R10gは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)である、(3)または(4)記載のオリゴヌクレオチド。
（6）R5が水素原子、ハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、シアノまたは-NR10aR10b(式中、R10a及びR10bはそれぞれ前記と同義である)である、(3)または(4)記載のオリゴヌクレオチド。
（7）R5が置換基を有していてもよい低級アルケニルまたはシアノである、(3)または(4)記載のオリゴヌクレオチド。
（8）R6が置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、-NR11aR11b(式中、R11a及びR11bはそれぞれ前記と同義である)、-N=C-R11h(式中、R11hは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)、-C=N-R11i(式中、R11iは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)または-N=N-R11j(式中、R11jは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)である、(3)〜(7)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
（9）R6が置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよいアリールまたは-NR11aR11b(式中、R11a及びR11bはそれぞれ前記と同義である)である、(3)〜(7)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
（10）R6が-NR11aR11b(式中、R11a及びR11bは同一または異なって、それぞれ水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)である、(3)〜(7)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
（11）R6が置換基を有していてもよいアリールであり、置換基がアリールのメタ位またはパラ位に存在する（3）〜(7)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
（12）R7が水素原子である、(3)〜(11)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
（13）R1が式(III)である、(1)または(2)記載のオリゴヌクレオチド。
（14）Y2が窒素原子である、(13)記載のオリゴヌクレオチド。
（15）R6aがアミノ、メチルアミノまたはジメチルアミノである、(13)または(14)記載のオリゴヌクレオチド。
（16）R7が水素原子である、(13)〜(15)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
（17）R1が式(IV)である、(1)または(2)記載のオリゴヌクレオチド。
（18）R12が水素原子または核酸分野における水素原子の等価体である、(17)記載のオリゴヌクレオチド。
(19)---が二重結合であり、Y3がCR14e(式中、R14eは前記と同義である)であり、Y4が窒素原子またはCR14f(式中、R14fは前記と同義であるが、シアノである場合を除く)である、(18)記載のオリゴヌクレオチド。
(20)R14eが水素原子である、(19)記載のオリゴヌクレオチド。
(21)R14eがハロゲン、シアノ、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基であり、R14fが水素原子である、(19)記載のオリゴヌクレオチド。
(22)R14eが水素原子であり、R14fがハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基である、(19)記載のオリゴヌクレオチド。
(23）R1が式(V)である、(1)または(2)記載のオリゴヌクレオチド。
(24）環Aが式(A1)

(式中、R16及びn1はそれぞれ前記と同義である)、式(A2)

(式中、R16は前記と同義であり、n1は0〜2の整数であり、X2はNH、酸素原子または硫黄原子である)、式(A3)

(式中、R16及びX2は前記と同義であり、n1は0〜2の整数である)、式(A4)

(式中、R16は前記と同義であり、n1は0〜3の整数である)、式(A5)

(式中、R16は前記と同義であり、n1は0〜3の整数である)、式(A6)

(式中、R16は前記と同義であり、n1は0〜3の整数である)、式(A7)

(式中、R16は前記と同義であり、n1は0〜3の整数である)、式(A8)

(式中、R16は前記と同義であり、n1は1である)、式(A9)

(式中、R16は前記と同義であり、n1は1である)、式(A10)

(式中、R16は前記と同義であり、n1は1である)、式(A11)

(式中、R16は前記と同義であり、n1は1である)である、(23)記載のオリゴヌクレオチド。
(25）R16が、ハロゲン、ニトロ、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルキルアミノまたは置換基を有していてもよいジ低級アルキルアミノである、(23)または(24)記載のオリゴヌクレオチド。
(26）R12aが水素原子または核酸分野における水素原子の等価体である、(25)記載のオリゴヌクレオチド。
(27）n1が1または2である、(23)〜(26)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(28）R3が

(式中、n2は前記と同義である)である、(1)〜(27)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(29）n2が1である、(28)記載のオリゴヌクレオチド。
(30）R2が水素原子、ヒドロキシ、フッ素原子またはメトキシである、(1)〜(29)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(31）R2がヒドロキシである、(1)〜(29)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(32) R2が水素原子またはフッ素原子である、(1)〜(29)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(33）X1が酸素原子であり、R2が水素原子、ヒドロキシ、フッ素原子またはメトキシである、(１)に記載のオリゴヌクレオチド。
(34）R1が式(IIA)

(式中、R5A及びR6Aはそれぞれ前記R5及びR6と同義である)
である、(33)記載のオリゴヌクレオチド。
(35）R5Aがハロゲン、カルバモイル、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよいシクロアルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよいジ低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよい低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいジ低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、置換基を有していてもよい脂肪族複素環基または-NR10aR10b(式中、R10a及びR10bはそれぞれ前記と同義である)である、(34)記載のオリゴヌクレオチド。
(36）R5Aがハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもより低級アルケニル、シアノまたは-NR10aR10b(式中、R10a及びR10bはそれぞれ前記と同義である)である、(34)記載のオリゴヌクレオチド。
(37）R6Aが置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよい芳香族複素環基または-NR11aR11b(式中、R11a及びR11bはそれぞれ前記と同義である)である、(34)〜(36)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(38）R6AがNR11aR11b(式中、R11a及びR11bはそれぞれ前記と同義である)である、(34)〜(36)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(39）R6Aがアミノ、置換基を有していてもよい低級アルケニルまたは置換基を有していてもよいアリールである、(34)〜(36)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(40）R1が式(IVA)

(式中、Y3A及びY4Aはそれぞれ前記Y3及びY4と同義であるが、Y3A及びY4AがCR14e及びCR14fであり、R14eが水素原子である場合、R14fはシアノではない)である、(33)記載のオリゴヌクレオチド。
(41）Y3AがCR14e(式中、R14eは前記と同義である)であり、Y4AがCR14f(式中、R14fは前記と同義である)である、(40)記載のオリゴヌクレオチド。
(42）R14eが水素原子である、(41)記載のオリゴヌクレオチド。
(43）R14eがハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基であり、R14fが水素原子である、(41)記載のオリゴヌクレオチド。
(44）R14eが水素原子であり、R14fがハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基である、(41)記載のオリゴヌクレオチド。
(45）R1が式(VA)

(式中、環AA、n1A及びR16Aはそれぞれ前記環A、n1、及びR16と同義であり、n1Aが2〜4の整数の場合、それぞれのR16Aは同一でも異なっていてもよいが、環AAがベンゼン環であり、n1Aが2である場合、R16Aは低級アルコキシではなく、環AAがベンゼン環であり、n1Aが1であり、R16Aが塩素原子である場合、式(A1’)

で表される場合を除く)である、(33)記載のオリゴヌクレオチド。
(46）環AAがベンゼン環またはチオフェン環である、(45)記載のオリゴヌクレオチド。
(47）R16Aが、ハロゲン、ニトロ低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルキルアミノまたは置換基を有していてもよいジ低級アルキルアミノである、(45)または(46)記載のオリゴヌクレオチド。
(48）n1Aが1または2である、(45)〜(47)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(49）R3が

(式中、n2Aは前記と同義である)である、(33)〜(48)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(50）n2Aが1である、(49)記載のオリゴヌクレオチド。
(51）R2が水素原子またはフッ素原子である、(33)〜(50)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(52）R2がヒドロキシである、(33)〜(50)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(53）10〜80の塩基長を有する、(1)〜(52)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(54）20〜50の塩基長を有する、(1)〜(52）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(55）20〜30の塩基長を有する、(1)〜(52)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(56）21〜25の塩基長を有する、(1)〜(52)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(57）2本鎖オリゴヌクレオチドである、(1)〜(56)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(58）1本鎖オリゴヌクレオチドである、(1)〜(56)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(59）オリゴヌクレオチドが短鎖干渉性RNA(siRNA)である、(1)〜(56)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(60）疾患に関与する蛋白質をコードするmRNAに対するノックダウン活性を有するオリゴヌクレオチドにおいて、
該オリゴヌクレオチドの5’末端における塩基残基を、
式(II)

(式中、Y1、R5、R6及びR7はそれぞれ前記と同義である)、式(III)

(式中、Y2、R6a及びR7aはそれぞれ前記と同義である)、式(IV)

(式中、R12、---、Y3及びY4はそれぞれ前記と同義である)、または式(V)

(式中、R12a、環A、n1及びR16は、それぞれ前記と同義である)で表される塩基残基に置換することを特徴とする、該ノックダウン活性を向上させる方法。
(61）疾患に関与する蛋白質をコードするmRNAに対するノックダウン活性を有し、5’末端における塩基がグアニンまたはシトシンであるオリゴヌクレオチドにおいて、
該オリゴヌクレオチドの5’末端におけるグアニン残基またはシトシン残基を、アデニン残基(6-アミノプリン-9-イル)、チミン残基(5-メチル-1,2,3,4テトラヒドロピリミジン-2,4ジオン-1-イル)、ウリジン残基(ピリミジン-2,4(1H,3H)ジオン-1-イル)、
式(II)

(式中、Y1、R5、R6及びR7はそれぞれ前記と同義である)、式(III)

(式中、Y2、R6a及びR7aはそれぞれ前記と同義である)、式(IV)

(式中、R12、---、Y3及びY4はそれぞれ前記と同義である)、または式(V)

(式中、R12a、環A、n1及びR16は、それぞれ前記と同義である)で表される塩基残基に置換することを特徴とする該ノックダウン活性を向上させる方法。
(62）オリゴヌクレオチドが短鎖干渉性RNA(siRNA)である、(60)または(61)記載の方法。
(63）(60)〜(62)のいずれかに記載の方法によって、オリゴヌクレオチドの標的 mRNAに対するノックダウン活性を向上させたオリゴヌクレオチドを含有する核酸医薬。
(64）疾患に関与する蛋白質をコードするmRNAに対するノックダウン活性を有するオリゴヌクレオチドの5’末端のヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基を置換することに使用される、該オリゴヌクレオチドの標的mRNAに対するノックダウン活性の向上のための、式(Ia)

(式中、X1、R1、R2及びR3はそれぞれ前記と同義である)で表されるヌクレオチドもしくはヌクレオシド、そのヒドロキシ、カルボキシルおよび/もしくはアミノを保護基で保護した化合物、またはそれらのアミダイト、あるいはその塩。
(65）オリゴヌクレオチドが短鎖干渉性RNA(siRNA)である、(63)記載のヌクレオチドもしくはヌクレオシド、そのヒドロキシ、カルボキシおよび/もしくはアミノを保護基で保護した化合物、またはそれらのアミダイト、あるいはその塩。
(66）疾患に関与する蛋白質をコードするmRNAに対するノックダウン活性を有するオリゴヌクレオチドの5’末端のヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基を置換することに使用される、該オリゴヌクレオチドの標的mRNAに対するノックダウン活性の向上のための、
式(II)

(式中、Y1、R5、R6及びR7はそれぞれ前記と同義である)、式(III)

(式中、Y2、R6a及びR7aはそれぞれ前記と同義である)、式(IV)

(式中、R12、---、Y3及びY4はそれぞれ前記と同義である)、または式(V)

(式中、R12a、環A、n1及びR16は、それぞれ前記と同義である)で表される塩基残基を含有するヌクレオチドもしくはヌクレオシド、そのヒドロキシ、カルボキシおよび/もしくはアミノを保護基で保護した化合物、またはそれらのアミダイト、あるいはその塩。
(67）オリゴヌクレオチドが短鎖干渉性RNA(siRNA)である、(66)記載のヌクレオチドもしくはヌクレオシド、そのヒドロキシ、カルボキシおよび/もしくはアミノを保護基で保護した化合物、またはそれらのアミダイト、あるいはその塩。
(68）標的蛋白質の発現抑制剤の製造のための、式(I)

(式中、X1、R1、R2及びR3はそれぞれ前記と同義である)で表されるヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基を5’末端に有する、疾患に関与する蛋白質をコードする mRNAに対するノックダウン活性を有するオリゴヌクレオチドの使用。
(69）標的蛋白質の発現抑制剤の製造のための、
式(II)

(式中、Y1、R5、R6及びR7はそれぞれ前記と同義である)、式(III)

(式中、Y2、R6a及びR7aはそれぞれ前記と同義である)、式(IV)

(式中、R12、---、Y3及びY4はそれぞれ前記と同義である)、または式(V)

(式中、R12a、環A、n1及びR16は、それぞれ前記と同義である)で表される塩基残基を、5’末端における塩基残基として導入した、疾患に関与する蛋白質をコードする mRNAに対するノックダウン活性を有するオリゴヌクレオチドの使用。
(70）オリゴヌクレオチドが短鎖干渉性RNA(siRNA)である、(68)または(69)記載の使用。
(71) R2が水素原子であり、R6が置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよいアリールオキシ、置換基を有していてもよいアラルキルオキシ、置換基を有していてもよい芳香族複素環オキシ、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよいアリールチオ、置換基を有していてもよい芳香族複素環チオ、-NR30R31(R30およびR31は、同一または異なって、それぞれ水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよい芳香族複素環、置換基を有していてもよいアラルキル、または置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキルである、ただし、R30およびR31が同時に水素原子となる場合を除く)、置換基を有していてもよいアリール、または置換基を有していてもよい芳香族複素環である(1)〜(7)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(72) R6が置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよいアラルキルオキシ、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよいアリールチオ、または-NR30AR31A(R30AおよびR31Aは、同一または異なって、それぞれ置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよいアリール、または置換基を有していてもよいアラルキルである、ただし、R30AおよびR31Aが同時に水素原子となる場合を除く)である(1)〜(7)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(73) R6が酸性官能基を含む置換基が置換した低級アルコキシ、酸性官能基を含む置換基が置換したアリールオキシ、酸性官能基を含む置換基が置換したアラルキルオキシ、酸性官能基を含む置換基が置換した芳香族複素環オキシ、酸性官能基を含む置換基が置換した低級アルキルチオ、酸性官能基を含む置換基が置換したアリールチオ、酸性官能基を含む置換基が置換した芳香族複素環チオ、-NR30R31(R30およびR31は、同一または異なって、それぞれ水素原子、酸性官能基を含む置換基が置換していてもよい低級アルキル、酸性官能基を含む置換基が置換していてもよい低級アルケニル、酸性官能基を含む置換基が置換していてもよい低級アルキニル、酸性官能基を含む置換基が置換していてもよいアリール、酸性官能基を含む置換基が置換していてもよい芳香族複素環、酸性官能基を含む置換基が置換していてもよいアラルキル、または酸性官能基を含む置換基が置換していてもよい芳香族複素環アルキル)、酸性官能基を含む置換基が置換したアリール、または酸性官能基を含む置換基が置換した芳香族複素環である(71)記載のオリゴヌクレオチド。
(74) R6が酸性官能基を含む置換基が置換した低級アルコキシ、酸性官能基を含む置換基が置換したアラルキルオキシ、酸性官能基を含む置換基が置換した低級アルキルチオ、酸性官能基を含む置換基が置換したアリールチオ、または-NR30AR31A(R30AおよびR31Aは、同一または異なって、それぞれ酸性官能基を含む置換基が置換していてもよい低級アルキル、酸性官能基を含む置換基が置換していてもよい低級アルキニル、酸性官能基を含む置換基が置換していてもよいアリール、または酸性官能基を含む置換基が置換していてもよいアラルキルである、ただし、R30AおよびR31Aが同時に水素原子となる場合を除く)である(72)記載のオリゴヌクレオチド。
(75) 酸性官能基がカルボキシおよび／または-OP(=O)(OH)2である(73)または(74)記載のオリゴヌクレオチド。
(76) 後記表8〜21に記載の化合物番号I-39〜I-101のいずれかのヌクレオチドもしくはその塩またはそれらの水和物。
(77) (76)記載のヌクレオチドに対応するヌクレオシドもしくはその塩またはそれらの水和物。
本発明により、AGO2との親和性が向上したオリゴヌクレオチド等が提供される。
ルシフェラーゼを標的とするsiRNAにおいて、アンチセンス鎖の5’末端に8-Br-dAを有するsiRNAと、アデノシン一リン酸を有するsiRNAとのルシフェラーゼ発光レベルを比較する図である(濃度100 pmol/L)。縦軸は、陰性対照群の発光量を1とした場合のそれぞれのsiRNAの発光比率を表す。 ルシフェラーゼを標的とするsiRNAにおいて、アンチセンス鎖の5’末端に8-Br-dAを有するsiRNA(874-BrdA)と、アデノシン一リン酸(874-A)、グアノシン一リン酸(874-G)、シチジン一リン酸(874-C)またはウリジン一リン酸(874-U)を有するsiRNAとのルシフェラーゼ発光レベルを比較する図である。縦軸は、陰性対照群の発光量を1とした場合のそれぞれのsiRNAの発光比率を表す。横軸の、Aは874-A、Gは874-G、Cは874-C、Uは874-U、BrdAは874-BrdAを意味する。それぞれ、3.2 pmol/L、16 pmol/L、80 pmol/L及び400 pmol/Lの濃度において試験を行った結果を示す。 D-グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(D-Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase、GAPDH、ジェンバンク アクセッション番号 NM_001256799)を標的とするsiRNAにおいて、アンチセンス鎖の5’末端に8-Br-dAを有するsiRNAと、アデノシン一リン酸を有するsiRNAとのGAPDH mRNA の発現レベルを比較する図である。縦軸は、陰性対照群におけるGAPDHのmRNA量を1とした場合の、GAPDH mRNAの相対発現レベルを表す。横軸は、各siRNAを表すが、左側がアンチセンス鎖5’末端にアデノシン一リン酸を有するsiRNA(217-A, 278-A,516-A,624-A, 715-A, 816-A, 936-A, 1096-A, 1134-A)を表し、右側がアンチセンス鎖の5’末端に8-Br-dAを有するsiRNA(217-BrdA,278-BrdA,516-BrdA, 624-BrdA, 715-BrdA, 816-BrdA, 936-BrdA, 1096-BrdA,1134-BrdA)を表す。 ルシフェラーゼを標的とするsiRNAにおいて、アンチセンス鎖の5’末端にアデノシン一リン酸(454-A)、ウリジン一リン酸(454-U)、8-Br-dA(454-BrdA)、I-37(6-NO2,7-Me-dQu)、I-21(6-napht-2-yl-dPu)、I-34(6-Me-dU)、またはI-25(6-napht-1-yl-dPu)を有するsiRNAのノックダウン活性を示す図である。縦軸は50%阻害濃度(IC50(pM))を表す。横軸は用いたsiRNAを表す。 ルシフェラーゼを標的とするsiRNAにおいて、アンチセンス鎖の5’末端にアデノシン一リン酸(454-A)、ウリジン一リン酸(454-U)、8-Br-dA(454-BrdA)、I-32(2'-OMe-6-styryl-dA)、またはI-19(di-Me-thienyl-dU)を有するsiRNAのノックダウン活性を示す図である。縦軸は50%阻害濃度(IC50(pM))を表す。横軸は用いたsiRNAを表す。 ルシフェラーゼを標的とするsiRNAにおいて、アンチセンス鎖の5’末端にアデノシン一リン酸(454-A)、I-45 (8-BnNH-6-styryl purine)、I-44(N-Bn-N-MedA)、またはI-46 (8-furanylmethylamino-6-styrylpurine)を有するsiRNAのノックダウン活性を示す図である。縦軸は50%阻害濃度(IC50(pM))を表す。横軸は用いたsiRNAを表す。 ルシフェラーゼを標的とするsiRNAにおいて、アンチセンス鎖の5’末端にアデノシン一リン酸(454-A)、I-39 (6-benzothiophenyl purine)、I-41(6-pyrenylpurine)、I-43 (N-Bn dA)、またはI-40(6-benzyloxynaphtylpurine)を有するsiRNAのノックダウン活性を示す図である。縦軸は50%阻害濃度(IC50(pM))を表す。横軸は用いたsiRNAを表す。 ルシフェラーゼを標的とするsiRNAにおいて、アンチセンス鎖の5’末端にアデノシン一リン酸(454-A)、またはI-42 (6-anthracenyl purine)を有するsiRNAのノックダウン活性を示す図である。縦軸は50%阻害濃度(IC50(pM))を表す。横軸は用いたsiRNAを表す。 ルシフェラーゼを標的とするsiRNAにおいて、アンチセンス鎖の5’末端にアデノシン一リン酸(454-A)、またはI-47 (6-styryl-8-tetrazolylmethylamino purine)を有するsiRNAのノックダウン活性を示す図である。縦軸は50%阻害濃度(IC50(pM))を表す。横軸は用いたsiRNAを表す。 ルシフェラーゼを標的とするsiRNAにおいて、アンチセンス鎖の5’末端にアデノシン一リン酸(454-A)、またはI-30(6-(m-carboxyphenyl) purine)を有するsiRNAのノックダウン活性を示す図である。縦軸は50%阻害濃度(IC50(pM))を表す。横軸は用いたsiRNAを表す。 ルシフェラーゼを標的とするsiRNAにおいて、アンチセンス鎖の5’末端にアデノシン一リン酸(454-A)、またはI-48 (6-(m-carboxyethylphenyl) purine)を有するsiRNAのノックダウン活性を示す図である。縦軸は50%阻害濃度(IC50(pM))を表す。横軸は用いたsiRNAを表す。 ルシフェラーゼを標的とするsiRNAにおいて、アンチセンス鎖の5’末端にアデノシン一リン酸(454-A)、またはI- 49 (5-furyl dU)を有するsiRNAのノックダウン活性を示す図である。縦軸は50%阻害濃度(IC50(pM))を表す。横軸は用いたsiRNAを表す。 ルシフェラーゼを標的とするsiRNAにおいて、アンチセンス鎖の5’末端にアデノシン一リン酸(454-A)、またはI- 50 (2-amino rA)を有するsiRNAのノックダウン活性を示す図である。縦軸は50%阻害濃度(IC50(pM))を表す。横軸は用いたsiRNAを表す。 ルシフェラーゼを標的とするsiRNAにおいて、アンチセンス鎖の5’末端にアデノシン一リン酸(454-A)、I-22またはI-51を有するsiRNAのノックダウン活性を示す図である。縦軸は50%阻害濃度(IC50(pM))を表す。横軸は用いたsiRNAを表す。 ルシフェラーゼを標的とするsiRNAにおいて、アンチセンス鎖の5’末端にアデノシン一リン酸(454-A)、I-52, I-55またはI-56を有するsiRNAのノックダウン活性を示す図である。縦軸は50%阻害濃度(IC50(pM))を表す。横軸は用いたsiRNAを表す。 ルシフェラーゼを標的とするsiRNAにおいて、アンチセンス鎖の5’末端にアデノシン一リン酸(454-A)、I-54, I-57, I-58またはI-59を有するsiRNAのノックダウン活性を示す図である。縦軸は50%阻害濃度(IC50(pM))を表す。横軸は用いたsiRNAを表す。 ルシフェラーゼを標的とするsiRNAにおいて、アンチセンス鎖の5’末端にアデノシン一リン酸(454-A)、I-53, I-60, I-61, I-62, I-63, I-64またはI-70を有するsiRNAのノックダウン活性を示す図である。縦軸は50%阻害濃度(IC50(pM))を表す。横軸は用いたsiRNAを表す。 ルシフェラーゼを標的とするsiRNAにおいて、アンチセンス鎖の5’末端にアデノシン一リン酸(454-A)、I-71, I-72, I-73またはI-74を有するsiRNAのノックダウン活性を示す図である。縦軸は50%阻害濃度(IC50(pM))を表す。横軸は用いたsiRNAを表す。 ルシフェラーゼを標的とするsiRNAにおいて、アンチセンス鎖の5’末端にアデノシン一リン酸(454-A)、I-65, I-66, I-67, I-68またはI-69を有するsiRNAのノックダウン活性を示す図である。縦軸は50%阻害濃度(IC50(pM))を表す。横軸は用いたsiRNAを表す。 ルシフェラーゼを標的とするsiRNAにおいて、アンチセンス鎖の5’末端にアデノシン一リン酸(454-A)、I-78, I-79, I-80またはI-81を有するsiRNAのノックダウン活性を示す図である。縦軸は50%阻害濃度(IC50(pM))を表す。横軸は用いたsiRNAを表す。 ルシフェラーゼを標的とするsiRNAにおいて、アンチセンス鎖の5’末端にアデノシン一リン酸(454-A)、I-75, I-76またはI-77を有するsiRNAのノックダウン活性を示す図である。縦軸は50%阻害濃度(IC50(pM))を表す。横軸は用いたsiRNAを表す。 ルシフェラーゼを標的とするsiRNAにおいて、アンチセンス鎖の5’末端にアデノシン一リン酸(454-A)、I-82またはI-83を有するsiRNAのノックダウン活性を示す図である。縦軸は50%阻害濃度(IC50(pM))を表す。横軸は用いたsiRNAを表す。 ルシフェラーゼを標的とするsiRNAにおいて、アンチセンス鎖の5’末端にアデノシン一リン酸(454-A)、I-84またはI-85を有するsiRNAのノックダウン活性を示す図である。縦軸は50%阻害濃度(IC50(pM))を表す。横軸は用いたsiRNAを表す。 ルシフェラーゼを標的とするsiRNAにおいて、アンチセンス鎖の5’末端にアデノシン一リン酸(454-A)、I-86, I-87, I-88またはI-89を有するsiRNAのノックダウン活性を示す図である。縦軸は50%阻害濃度(IC50(pM))を表す。横軸は用いたsiRNAを表す。 ルシフェラーゼを標的とするsiRNAにおいて、アンチセンス鎖の5’末端にアデノシン一リン酸(454-A)、I-27, I-29, I-90, I-91, I-92またはI-93を有するsiRNAのノックダウン活性を示す図である。縦軸は50%阻害濃度(IC50(pM))を表す。横軸は用いたsiRNAを表す。 ルシフェラーゼを標的とするsiRNAにおいて、アンチセンス鎖の5’末端にアデノシン一リン酸(454-A-dT)、I-94またはI-95を有するsiRNAのノックダウン活性を示す図である。縦軸は50%阻害濃度(IC50(pM))を表す。横軸は用いたsiRNAを表す。 ルシフェラーゼを標的とするsiRNAにおいて、アンチセンス鎖の5’末端にアデノシン一リン酸(454-A)またはI-96を有するsiRNAのノックダウン活性を示す図である。縦軸は50%阻害濃度(IC50(pM))を表す。横軸は用いたsiRNAを表す。 ルシフェラーゼを標的とするsiRNAにおいて、アンチセンス鎖の5’末端にアデノシン一リン酸(454-A)、I-97, I-98, I-99, I-100またはI-101を有するsiRNAのノックダウン活性を示す図である。縦軸は50%阻害濃度(IC50(pM))を表す。横軸は用いたsiRNAを表す。
以下、式(I)で表される化合物を化合物(I)という。他の式番号の化合物についても同様である。
式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(IIA)、(IIIA)、(IVA)、(VA)、(Ia)及び(A1)〜(A11)の各基の定義において、
(i)ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素の各原子を意味する。
(ii)低級アルキル、ならびに低級アルコキシ、低級アルコキシカルボニル、低級アルキルアミノ、ジ低級アルキルアミノ、低級アルキルカルバモイル、ジ低級アルキルカルバモイル、低級アルキルチオ及び低級アルキルスルホニルにおける低級アルキル部分としては、例えば直鎖状または分枝鎖状の炭素数1〜10のアルキルが挙げられる。具体的には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル等が挙げられる。ジ低級アルキルアミノ及びジ低級アルキルアミノカルバモイルの2つの低級アルキル部分はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
(iii)シクロアルキルとしては、例えば炭素数3〜10のシクロアルキルが挙げられる。具体的には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル等が挙げられる。
(iv)アラルキル及び芳香族複素環アルキルのアルキレン部分は、前記低級アルキル(ii)から水素原子を一つ除いたものと同義である。
(v)低級アルケニルとしては、例えば直鎖状または分枝鎖状の炭素数2〜10のアルケニルが挙げられる。具体的には、ビニル、アリル、1-プロペニル、イソプロペニル、メタクリル、ブテニル、クロチル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル等が挙げられる。
(vi)低級アルキニルとしては、例えば直鎖状または分枝鎖状の炭素数2〜10のアルキニルが挙げられる。具体的には、エチニル、プロパルギル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル、ノニニル、デシニル等が挙げられる。
(vii)低級アルカノイルとしては、例えば炭素数1〜8の直鎖または分枝鎖状の低級アルカノイルが挙げられる。具体的には、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル、ヘキサノイル、ヘプタノイル、オクタノイル等が挙げられる。
(viii)アリール、ならびにアラルキル、アロイル、アリールオキシ、アリールチオ及びアリールスルホニルのアリール部分としては、例えば炭素数6〜18のアリールが挙げられる。具体的にはフェニル、ナフチル、インデニル、アントリル、フェナントレニル、フェナレニル、テトラセニル、ピレニル、クリセニル等が挙げられ、好ましくはフェニル、ナフチル、アントリル、ピレニル等が挙げられる。
(ix)芳香族複素環基、ならびに芳香族複素環アルキル、芳香族複素環カルボニル、芳香族複素環オキシ、芳香族複素環チオ及び芳香族複素環スルホニルにおける芳香族複素環基部分としては、例えば窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選ばれる少なくとも1個の原子を含む5員または6員の単環性芳香族複素環基、3〜8員の環が縮合した二環または三環性で窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選ばれる少なくとも1個の原子を含む縮環性芳香族複素環基等が挙げられる。具体的にはピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、オキソピリダジニル、キノリル、イソキノリル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル、シンノリニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、トリアジニル、トリアゾリル、テトラゾリル、チエニル、フリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、ベンゾフリル、イソベンゾフリル、ベンゾチエニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ピラゾロピリジル、ピラゾロピリミジニル、プリニル、ジベンゾフラニル、ジベンゾアゼピニル等が挙げられ、好ましくはピリジル、ピロリル、チエニル、オキサゾリル、ベンゾフリル、イソベンゾフリル、ベンゾチエニル等が挙げられる。
(x)脂肪族複素環基としては、例えば窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選ばれる少なくとも1個の原子を含む5員または6員の単環性脂肪族複素環基、3〜8員の環が縮合した二環または三環性で窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選ばれる少なくとも1個の原子を含む縮環性脂肪族複素環基などがあげられ、より具体的にはアジリジニル、アゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジノ、ピペリジニル、アゼパニル、1,2,5,6-テトラヒドロピリジル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、ピペラジニル、ホモピペラジニル、ピラゾリニル、オキシラニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロ-2H-ピラニル、5,6-ジヒドロ-2H-ピラニル、オキサゾリジニル、モルホリノ、モルホリニル、チオキサゾリジニル、チオモルホリニル、2H-オキサゾリル、2H-チオキサゾリル、ジヒドロインドリル、ジヒドロイソインドリル、ジヒドロベンゾフラニル、ベンゾイミダゾリジニル、ジヒドロベンゾオキサゾリル、ジヒドロベンゾチオキサゾリル、ベンゾジオキソリニル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、ジヒドロ-2H-クロマニル、ジヒドロ-1H-クロマニル、ジヒドロ-2H-チオクロマニル、ジヒドロ-1H-チオクロマニル、テトラヒドロキノキサリニル、テトラヒドロキナゾリニル、ジヒドロベンゾジオキサニルなどが挙げられ、好ましくはテトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、ジヒドロインドリル、ジヒドロイソインドリル、ジヒドロベンゾフラニル等が挙げられる。
(xi)芳香族環としては、例えばベンゼン環、ナフタレン環、芳香族複素環等が挙げられる。芳香族複素環は、前記芳香族複素環基の芳香族複素環部分と同義である。
(xii)置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよいジ低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよい低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいジ低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、及び置換基を有していてもよい低級アルキルスルホニルにおける置換基としては、同一または異なって、例えば置換数1〜3の、ハロゲン、ヒドロキシ、スルファニル、ニトロ、シアノ、酸性官能基、カルバモイル、C3-8シクロアルキル、脂肪族複素環基、C1-10アルコキシ、C3-8シクロアルコキシ、C6-14アリールオキシ、C7-16アラルキルオキシ、C1-8アルカノイルオキシ、C7-15アロイルオキシ、C1-10アルキルスルファニル、
-NRXRY｛式中、RX及びRYは同一または異なって、それぞれ水素原子、置換基を有していてもよいC1-10アルキル［該置換基を有していてもよいC1-10アルキルにおける置換基としては、例えば、酸性官能基、置換基を有していてもよいC6-14アリール（該置換基を有していてもよいC6-14アリールの置換基としては、例えば、置換数1〜3のヒドロキシ等があげられる）等が挙げられる］、置換基を有していてもよいC3-8シクロアルキル（該置換基を有していてもよいC3-8シクロアルキルにおける置換基としては、例えば置換基を有していてもよいC1-10アルキル［該置換基を有していてもよいC1-10アルキルの置換基としては、置換数1〜3の酸性官能基、置換基を有していてもよいC6-14アリール（該置換基を有していてもよいC6-14アリールの置換基としては、例えば、置換数1〜3のヒドロキシ等があげられる）等が挙げられる］等が挙げられる）、置換基を有していてもよいC6-14アリール｛該置換基を有していてもよいC6-14アリールの置換基としては、置換数1〜3のハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、置換基を有していてもよいC1-10アルキル［該置換基を有していてもよいC1-10アルキルの置換基としては、置換数1〜3の酸性官能基、置換基を有していてもよいC6-14アリール（該置換基を有していてもよいC6-14アリールの置換基としては、例えば置換数1〜3のヒドロキシ等があげられる）等が挙げられる］等が挙げられる｝、置換基を有していてもよい芳香族複素環基（該置換基を有していてもよい芳香族複素環基の置換基としては、例えば置換数1〜3のヒドロキシ等があげられる）、C7-16アラルキル、C1-8アルカノイル、C7-15アロイル、C1-10アルコキシカルボニルまたはC7-16アラルキルオキシカルボニルである｝、
芳香族複素環チオ、芳香族複素環スルフィニル、芳香族複素環スルホニル、C1-8アルカノイル、C7-15アロイル、C1-10アルコキシカルボニル、C6-14アリールオキシカルボニル、C1-10アルキルカルバモイル及びジC1-10アルキルカルバモイルからなる群から選ばれる置換基等が挙げられる。
置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよいジ低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよい低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいジ低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、及び置換基を有していてもよい低級アルキルスルホニルにおける置換基は、前記置換基を有していてもよい低級アルキル等における置換基の例示で挙げた基に加え、酸性官能基が置換したC1-6アルキルが置換していてもよいC6-14アリール及び芳香族複素環基からなる群から選ばれる置換基であってもよい。
(xiii)置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよいアラルキルオキシ、置換基を有していてもよいアリールオキシ、置換基を有していてもよいアリールチオ、置換基を有していてもよいアリールスルホニル、置換基を有していてもよいアロイル、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環カルボニル、置換基を有していてもよい芳香族複素環オキシ、置換基を有していてもよい芳香族複素環チオ、置換基を有していてもよい芳香族複素環スルホニル及び置換基を有してもよいスチリルにおける置換基としては、同一または異なって、例えば置換数1〜3のハロゲン、ヒドロキシ、スルファニル、ニトロ、シアノ、酸性官能基、カルバモイル、置換基を有していてもよいC1-10アルキル［該置換基を有していてもよいC1-10アルキルの置換基としては、例えば置換数1〜3のヒドロキシ、シアノ、酸性官能基、C1-10アルキルカルバモイル、ジC1-10アルキルカルバモイル等が挙げられる］、トリフルオロメチル、C3-8シクロアルキル、置換基を有していてもよいC6-14アリール（該置換基を有していてもよいC6-14アリールにおける置換基としては、例えば置換数1〜3のヒドロキシ等が挙げられる）、脂肪族複素環基、置換基を有していてもよい芳香族複素環基（該置換基を有していてもよい芳香族複素環基における置換基としては、例えば置換数1〜3のヒドロキシ等が挙げられる）、芳香族複素環チオ、芳香族複素環スルフィニル、芳香族複素環スルホニル、置換基を有していてもよいC1-10アルコキシ［該置換基を有していてもよいC1-10アルコキシにおける置換基としては、例えば置換数1〜3の酸性官能基、置換基を有していてもよいC6-14アリール（該置換基を有していてもよいC6-14アリールにおける置換基としては、例えば置換数1〜3のヒドロキシ等が挙げられる）等が挙げられる］、C3-8シクロアルコキシ、C6-14アリールオキシ、C7-16アラルキルオキシ、C1-8アルカノイルオキシ、C7-15アロイルオキシ、C1-10アルキルスルファニル、C1-10アルキルスルホニル、-NRXaRYa(式中、RXa及びRYaは同一または異なって、それぞれ水素原子、C1-10アルキル、C3-8シクロアルキル、C6-14アリール、芳香族複素環基、芳香族複素環チオ、芳香族複素環スルフィニル、芳香族複素環スルホニル、置換基を有していてもよいC7-16アラルキル（該置換基を有していてもよいC7-16アラルキルにおける置換基としては、例えば置換数1〜3のヒドロキシ等が挙げられる）、C1-8アルカノイル、C7-15アロイル、C1-10アルコキシカルボニルまたはC7-16アラルキルオキシカルボニルである)、C1-8アルカノイル、C7-15アロイル、C1-10アルコキシカルボニル、C6-14アリールオキシカルボニル、C1-10アルキルカルバモイル、ジC1-10アルキルカルバモイル、カルボキシC1-10アルキル及びC1-10アルコキシカルボニルC1-10アルキルからなる群から選ばれる置換基等が挙げられ、好ましくは置換数1のハロゲン、ヒドロキシ、スルファニル、ニトロ、シアノ、カルボキシ、C1-3アルキル、トリフルオロメチル、C1-3アルコキシ等が挙げられる。
ここで示した、C1-10アルキルならびにC1-10アルコキシ、C1-10アルキルスルファニル、C1-10アルキルスルホニル、C1-10アルコキシカルボニル、C1-10アルキルカルバモイル及びジC1-10アルキルカルバモイルのC1-10アルキル部分としては、例えば前記低級アルキルの例示で挙げた基が例示される。ジC1-10アルキルカルバモイルにおける2つのC1-10アルキル部分は同一でも異なっていてもよい。
C1-8アルカノイル及びC1-8アルカノイルオキシのC1-8アルカノイル部分としては、例えば前記低級アルカノイルの例示で挙げた基が例示される。
C3-8シクロアルキル及びC3-8シクロアルコキシのC3-8シクロアルキル部分としては、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル等が挙げられる。
C6-14アリールならびにC6-14アリールオキシ、C7-15アロイル、C7-15アロイルオキシ及びC6-14アリールオキシカルボニルのアリール部分としては、例えば前記アリールの例示で挙げた基が例示される。
C7-16アラルキルオキシ、C7-16アラルキル及びC7-16アラルキルオキシカルボニルのアリール部分としては、例えば前記アリールの例示で挙げた基が例示され、アルキレン部分としては、例えばC1-10のアルキレンが挙げられ、より具体的には前記低級アルキルの例示で挙げた基から水素原子を一つ除いた基が挙げられる。
脂肪族複素環基、ハロゲン、芳香族複素環チオ、芳香族複素環スルホニル及び芳香族複素環基は、それぞれ前記と同義である。
芳香族複素環スルフィニルの芳香族複素環部分は前記芳香族複素環基の例示で挙げた基が例示される。
酸性官能基としては、例えば、カルボキシ、ヒドロキサモイル、アミノホスホニル、スルホニルアミノカルボニル、ホスホノオキシ、-SO3H、スルフィノ、ホスホノ、ホスフィノ、アミノスルホニル、-OP(=O)(OH)2、-OP(=O)(OH)-OCH2CH2O-P(=O)(OH)2等が挙げられる。
前記式(I)中のR2は水素原子またはヒドロキシであることが好ましく、水素原子がより好ましい。
ここで、前記式(II)中のY1は窒素原子等；R5は水素原子、ハロゲン、シアノ、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、-NR10aR10b(式中、R10a及びR10bはそれぞれ前記と同義である)等；
R6は水素原子、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよいアリールチオ、-NR11aR11b(式中、R11a及びR11bは前記と同義である)等；
かつR7は水素原子または核酸分野における水素原子の等価体（例えば、重水素原子、アミノ、ヒドロキシ、フッ素原子等）等であることが好ましい(但し、Y1が窒素原子であり、R5が水素原子であり、R6が-NR11aR11bであり、かつR7が水素原子である場合、R11a及びR11bは同時に水素原子になることはない)。
そして、前記式(II)中のY1は窒素原子等；R5はハロゲン等；R6は水素原子、-NR11aR11b(式中、R11a及びR11bは前記と同義である)、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよい芳香族複素環基等；かつR7は水素原子、アミノ等であるか、
または前記式(II)中のY1は窒素原子等；R5は水素原子等；R6は水素原子、-NR11aR11b(式中、R11a及びR11bは前記と同義である)、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよいアリールチオ、置換基を有していてもよい芳香族複素環基等；かつR7は水素原子、アミノ等である(但し、Y1が窒素原子であり、R5が水素原子であり、R6が-NR11aR11bであり、かつR7が水素原子である場合、R11a及びR11bは同時に水素原子になることはない)か、
または前記式(II)中のY1は窒素原子等；R5はシアノ等；R6は水素原子、-NR11aR11b(式中、R11a及びR11bは前記と同義である)、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよい芳香族複素環基等；かつR7は水素原子、アミノ等であるか、
または前記式(II)中のY1は窒素原子等；R5は置換基を有していてもよい低級アルキル等；R6は水素原子、-NR11aR11b(式中、R11a及びR11bは前記と同義である)、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよい芳香族複素環基等；かつR7は水素原子またはアミノ等であるか、
または前記式(II)中のY1は窒素原子等；R5は-NR11aR11b(式中、R11a及びR11bは前記と同義である)等；R6は水素原子、-NR11aR11b(式中、R11a及びR11bは前記と同義である)、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよい芳香族複素環基等；かつR7は水素原子、アミノ等であるか、
または前記式(II)中のY1は窒素原子等；R5はハロゲン、水素原子、シアノ、置換基を有していてもよい低級アルキル、-NR11aR11b(式中、R11a及びR11bは前記と同義である)等；
R6は水素原子、-NR11aR11b(式中、R11a及びR11bは前記と同義である)、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよいアリールチオ、置換基を有していてもよい芳香族複素環基等；かつR7は水素原子である(但し、Y1が窒素原子であり、R5が水素原子であり、R6が-NR11aR11bであり、かつR7が水素原子である場合、R11a及びR11bは同時に水素原子になることはない)か、
または前記式(II)中のY1は窒素原子等；R5はハロゲン、水素原子、シアノ、置換基を有していてもよい低級アルキル、-NR11aR11b(式中、R11a及びR11bは前記と同義である)等；R6は水素原子、-NR11aR11b(式中、R11a及びR11bは前記と同義である)、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよい芳香族複素環基等；かつR7はアミノであることがより好ましく、前記式(II)中のY1は窒素原子等；R5はハロゲン等；R6は水素原子、-NR11aR11b(式中、R11a及びR11bは前記と同義である)等；かつR7は水素原子等であるか、
または前記式(II)中のY1は窒素原子等；R5は水素原子等；R6は置換基を有していてもよい低級アルケニル等；かつR7は水素原子等であるか、
または前記式(II)中のY1は窒素原子等；R5はシアノ等；R6は水素原子、-NR11aR11b(式中、R11a及びR11bは前記と同義である)等；かつR7は水素原子等であるか、
または前記式(II)中のY1は窒素原子等；R5はハロゲン等；R6は置換基を有していてもよい低級アルケニル等；かつR7は水素原子等であるか、
または前記式(II)中のY1は窒素原子等；R5は水素原子等；R6は置換基を有していてもよいアリール等；かつR7は水素原子等であるか、
または前記式(II)中のY1は窒素原子等；R5は水素原子等；R6は置換基を有していてもよい芳香族複素環基等；かつR7は水素原子であるか、
または前記式(II)中のY1は窒素原子等；R5は水素原子等；R6は-NR11aR11b(式中、R11a及びR11bは前記と同義である)等；かつR7は水素原子等であるか、
または前記式(II)中のY1は窒素原子等；R5は水素原子等；R6は置換基を有していてもよい低級アルコキシ等；かつR7は水素原子等であるか、
または前記式(II)中のY1は窒素原子等；R5は水素原子等；R6は置換基を有していてもよい低級アルキルチオ等；かつR7は水素原子等であるか、
または前記式(II)中のY1は窒素原子等；R5は水素原子等；R6は置換基を有していてもよいアリールチオ等；かつR7は水素原子等であるか、
または前記式(II)中のY1は窒素原子等；R5は置換基を有していてもよい低級アルキル等；R6は置換基を有していてもよい低級アルケニル等；かつR7は水素原子等であるか、
または前記式(II)中のY1は窒素原子等；R5は水素原子等；R6は-NR11aR11b(式中、R11a及びR11bは前記と同義である)等；かつR7はアミノ等であるか、
または前記式(II)中のY1は窒素原子等；R5は-NR10aR10b(式中、R10a及びR10bはそれぞれ前記と同義である)等；R6は置換基を有していてもよいアルケニル等；かつR7は水素原子等であることがさらにより好ましい。
なお、前記R5が-NR11aR11bである場合、R11aとR11bは同一又は異なって、無置換の低級アルキル（低級アルキルは前記と同義である）であるか、または置換基を有する低級アルキル（低級アルキルは前記と同義である）であることが好ましく、当該置換基としては前記置換基を有していてもよいアリール基または前記置換基を有していてもよい芳香族複素環基等が挙げられる。前記R6が置換基を有するアリールの場合、置換基はアリールのメタ位またはパラ位に存在することがさらに好ましく、当該置換基としては、カルボキシメチル、2-カルボキシエチル、3-カルボキシプロピル等が好ましい。
なお、(a1) 前記R6が-NR11aR11bの場合、R11aとしては、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよいアリール等が好ましく、かつR11bとしては、水素原子等が好ましい。前記置換基を有していてもよいアルキルの置換基としては、-SO3H、-N[CH2CH2OP(=O)(OH)2]2等が好ましい。前記置換基を有していてもよい低級アルキニルの置換基としては、-OP(=O)(OH)2、2-[CH2OP(=O)(OH)2]フェニル、3-[CH2OP(=O)(OH)2]フェニル、4-[CH2OP(=O)(OH)2]フェニル、3,5-[CH2OP(=O)(OH)2]2フェニル等が好ましい。前記置換基を有していてもよいアラルキルにおける置換基としては、ヒドロキシ、カルボキシ、-CH2OP(=O)(OH)2、-CH2O-P(=O)(OH)-OCH2CH2O-P(=O)(OH)2等が好ましい。前記置換基を有していてもよいアリールにおける置換基としては、-CH2OP(=O)(OH)2、-OCH2CH2-OP(=O)(OH)2等が好ましい。
(a2) 前記R6が置換基を有していてもよいアリールの場合、当該置換基としては、カルボキシメチル、2-カルボキシエチル、3-カルボキシプロピル、-CH2OP(=O)(OH)2、-(CH2)3OP(=O)(OH)2等が好ましい。
(a3) 前記R6が置換基を有していてもよい低級アルコキシの場合、当該置換基としては、-OP(=O)(OH)2、置換基を有していてもよいアリール等が好ましい。前記置換基を有していてもよいアリールにおける置換基としては、ニトロ、フッ素原子、ヒドロキシ、-CH2OP(=O)(OH)2等が好ましい。
(a4) 前記R6が置換基を有していてもよい低級アルキルチオの場合、当該置換基としては、-OP(=O)(OH)2、(1-カルボキシメチル)シクロプロパン-1-イル等が好ましい。
(a5) 前記R6が置換基を有していてもよいアリールチオの場合、当該置換基としては、ヒドロキシ、-CH2OP(=O)(OH)2、カルボキシ、カルボキシメチル等が好ましい。
また、前記式（IV）中のR12は水素原子、核酸分野における水素原子の等価体（例えば、重水素原子、アミノ、ヒドロキシ、フッ素原子等）等；---は二重結合；Y3はCR14e；Y4は窒素原子またはCR14f；R14eおよびR14fは水素原子、ハロゲン、シアノ、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有してアリール、置換基を有していてもよい芳香族複素環基等であることが好ましい。
さらに、前記式（V）中のR12ａは水素、核酸分野における水素原子等価体（例えば、重水素原子、アミノ、ヒドロキシ、フッ素原子等）等；環Ａはベンゼン環またはチオフェン環等；n１は１または２；R16はハロゲン、ニトロ、置換基を有していてもよりアルキル、置換基を有していてもよい低級アルキルアミノまたは置換基を有していてもよいジ低級アルキルアミノであることが好ましい。
本発明のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基からなるポリマーまたはオリゴマーを意味する。
本発明のオリゴヌクレオチドは、1本鎖オリゴヌクレオチド及び2本鎖オリゴヌクレオチドのいずれをも包含する。2本鎖オリゴヌクレオチドにあっては、それぞれのオリゴヌクレオチド鎖の塩基長が異なっていてもよい。また、2本鎖オリゴヌクレオチドにあっては、1つ以上のミスマッチ塩基対を含んでいてもよい。さらに、3本鎖以上のオリゴヌクレオチドによって形成される複合体も本発明のオリゴヌクレオチドに包含される。
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば疾患に関与する蛋白質をコードする mRNAに対するノックダウン活性を有することが好ましい。ここで、本明細書における“ノックダウン活性を有する”とは、蛋白質等をコードする遺伝子(標的遺伝子)の発現を抑制することを意味し、本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの5’末端に対応する天然型ヌクレオチドを含むsiRNAに比して、好ましくは２倍、より好ましくは５倍、さらに好ましくは１０倍のノックダウン活性を有することが好ましい。
2本鎖オリゴヌクレオチドとしては、例えば構造遺伝子等の2本鎖DNA、siRNA、miRNAを始めとする小分子RNA等の2本鎖RNA等が挙げられるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
1本鎖オリゴヌクレオチドとしては、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、microRNA、アプタマー、アンタゴマー、1本鎖RNAi剤(ヘアピン構造を有するsiRNA等)等が挙げられるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
本発明のオリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは10〜100塩基であり、10〜80塩基がより好ましく、10〜50塩基がさらに好ましく、20〜50塩基が特に好ましく、20〜30塩基が最も好ましい。
本発明のオリゴヌクレオチドは、5’末端のヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基に加え、さらに1つ以上のヌクレオチド残基が修飾されていてもよい。該修飾は、塩基、糖、リン酸のいずれの部位に含まれていてもよい。
塩基修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの塩基の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、塩基内の酸素原子が硫黄原子で置換されたもの、水素原子が炭素数1〜10のアルキルで置換されたもの、メチルが水素原子もしくは炭素数2〜10のアルキルで置換されたもの、アミノが炭素数1〜10のアルキル基、炭素数1〜8のアルカノイル等の保護基で保護されたもの等が挙げられる。
糖部修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよいが、2’-修飾ヌクレオチドが好ましく用いられる。
2’-修飾ヌクレオチドとしては、例えばリボースの2’-OHが水素原子、-OR、-R、-R’、-SH、-SR、アミノ、-NHR、-NR2、N3、シアノ、及びハロゲンからなる群(ここで、Rは低級アルキルまたはアリールであり、低級アルキル、アリール及びハロゲンはそれぞれ前記と同義である)から選択される置換基で置換された2’-修飾ヌクレオチドが挙げられる。具体的には、2’-OHが、フッ素原子、メトキシ、2-(メトキシ)エトキシ、3-アミノプロポキシ、2-[(N,N-ジメチルアミノ)オキシ]エトキシ、3-(N,N-ジメチルアミノ)プロポキシ、2-[2-(N,N-ジメチルアミノ)エトキシ]エトキシ、2-(メチルアミノ)-2-オキソエトキシ、2-(N-メチルカルバモイル)エトキシ及び2-シアノエトキシからなる群から選択される置換基で置換された2’-修飾ヌクレオチド等が挙げられる。
リン酸修飾ヌクレオチドとしては、オリゴヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、リン酸ジエステル結合がアルキルホスホネート結合に置換されたヌクレオチド等が挙げられる。
疾患に関与する蛋白質をコードするmRNAに対するノックダウン活性を有するオリゴヌクレオチドとしては、例えば蛋白質等をコードする遺伝子(標的遺伝子)のmRNAの一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含み、かつ標的遺伝子の発現を抑制するオリゴヌクレオチドであれば、例えばsiRNA(short interference RNA)、miRNA(microRNA)等の二本鎖オリゴヌクレオチド、shRNA(short hairpin RNA)、アンチセンス核酸、リボザイム等の一本鎖オリゴヌクレオチド等、いずれの核酸を用いてもよいが、2本鎖オリゴヌクレオチドが好ましい。
標的遺伝子のmRNAの一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチド鎖をアンチセンス鎖といい、アンチセンス鎖の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをセンス鎖という。センス鎖は、標的遺伝子の一部の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドそのもの等、アンチセンス鎖と対合して二重鎖形成部ができるオリゴヌクレオチドをいう。標的遺伝子のmRNAの一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む2本鎖オリゴヌクレオチドにおいて、オリゴヌクレオチドの5’末端とは、アンチセンス鎖の5’末端を指す。
本発明のオリゴヌクレオチドにおいて、アンチセンス鎖とセンス鎖が塩基と対合して形成している二重鎖形成部は、通常15〜27塩基対であり、15〜25塩基対が好ましく、15〜23塩基対がより好ましく、15〜21塩基対がさらに好ましく、15〜19塩基対が特に好ましい。該二重鎖形成部は、アンチセンス鎖とセンス鎖のそれぞれの塩基が対向していればよく、塩基対を形成していても、ミスマッチであってもよいが、アンチセンス鎖の5’末端の塩基とそれに対となるセンス鎖の塩基は、アデノシン-ウラシル(A-U)の塩基対であるかミスマッチであることが好ましい。
2本鎖オリゴヌクレオチドを構成するアンチセンス鎖、センス鎖のいずれか一方、または両方のオリゴヌクレオチドは、二重鎖形成部に続く3’側または5’側に二重鎖を形成しない追加のヌクレオチドを有してもよい。この二重鎖を形成しない部分を突出部(オーバーハング)ともいう。
突出部を有する2本鎖オリゴヌクレオチドとしては、例えば少なくとも一方の鎖の3’末端または5’末端に1〜4塩基、通常は1〜3塩基からなる突出部を有するものが用いられるが、2塩基からなる突出部を有するものが好ましく用いられ、dTdTまたはUUからなる突出部を有するものがより好ましく用いられる。突出部は、アンチセンス鎖のみ、センス鎖のみ、およびアンチセンス鎖とセンス鎖の両方に有することができるが、アンチセンス鎖とセンス鎖の両方に突出部を有する二本鎖核酸が好ましく用いられる。
また、二重鎖形成部に続いて標的遺伝子のmRNAの塩基配列と一部または全てが一致する配列、または、二重鎖形成部に続いて標的遺伝子のmRNAの相補鎖の塩基配列と一部または全てが一致する配列を用いてもよい。さらに、2本鎖オリゴヌクレオチドとして、例えばダイサー(Dicer)等のリボヌクレアーゼの作用により前記の突出部を有する2本鎖オリゴヌクレオチドを生成する核酸分子(国際公開第2005/089287号パンフレット)や、3’末端や5’末端の突出部を有していない2本鎖オリゴヌクレオチド等を用いることもできる。
また、前記の2本鎖オリゴヌクレオチドにおいて、好ましくはアンチセンス鎖の5’末端側から3’末端側に向って少なくとも2〜17番目の塩基(ヌクレオシド)の配列が、標的遺伝子のmRNAの連続する16塩基の配列と相補的な塩基の配列であり、より好ましくは、該アンチセンス鎖は、5’末端側から3’末端側に向って2〜19番目の塩基の配列が、標的遺伝子のmRNAの連続する18塩基の配列と相補的な塩基の配列であるか、2〜21番目の塩基の配列が、標的遺伝子のmRNAの連続する20塩基の配列と相補的な塩基の配列であるか、2〜25番目の塩基の配列が、標的遺伝子のmRNAの連続する24塩基の配列と相補的な塩基の配列である。
アンチセンス鎖の5’末端の塩基の配列は、標的遺伝子のmRNAの塩基の配列と相補的であってもミスマッチであっても構わない。
さらに、本発明で用いられる核酸がsiRNAである場合、好ましくは該核酸中の糖の10〜70%、より好ましくは15〜60%、さらに好ましくは20〜50%が、2’-修飾ヌクレオチドである。本発明における2’-修飾ヌクレオチドは、2’-シアノ、2’-ハロゲン、2’-O-シアノ、2’-アルキル、2’-置換アルキル、2’-O-アルキル、2’-O-置換アルキル、2’-O-アルケニル、2’-O-置換アルケニル、2’-Se-アルキル、2’-Se-置換アルキル等が好ましく、2’-シアノ、2’-フルオロ、2’-クロロ、2’-ブロモ、2’-トリフルオロメチル、2’-O-メチル、2’-O-エチル、2’-O-イソプロピル、2’-O-トリフルオロメチル、2'-O-[2-(メトキシ)エチル]、2'-O-(3-アミノプロピル)、2'-O-[2-(N,N-ジメチル)アミノオキシ]エチル、2'-O-[3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピル]、2'-O-{2-[2-(N,N-ジメチルアミノ)エトキシ]エチル}、2'-O-[2-(メチルアミノ)-2-オキソエチル]、2’-Se-メチル、水素原子等がより好ましく、2’-O-メチル、2’-O-エチル、2’-フルオロ、水素原子等がさらに好ましく、2’-O-メチルおよび2’-フルオロが最も好ましい。
化合物(Ia)は、式(I)で表されるヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基の残基部が、ヒドロキシになったヌクレオチドまたはヌクレオシドに相当し、化合物(Ia)の好ましい形態としては、前記(2)〜(52)に示された式(I)で表されるヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基に相当するヌクレオチドまたはヌクレオシドが挙げられ、より好ましい形態としては、前記(32)〜(52)に示された式(I)中のX1が酸素原子であり、R2が水素原子、ヒドロキシ、フッ素原子またはメトキシであるヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基に相当するヌクレオチドまたはヌクレオシドが挙げられる。
化合物(Ia)は、例えば酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等の塩として得ることも可能である。
酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩等の有機酸塩が挙げられ、金属塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等が挙げられ、アンモニウム塩としては、例えばアンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の塩が挙げられ、有機アミン付加塩としては、例えば、モルホリン、ピペリジン等の付加塩が挙げられ、アミノ酸付加塩としては、例えば、リジン、グリシン、フェニルアラニン等の付加塩が挙げられる。
化合物(Ia)の中には、幾何異性体、光学異性体等の立体異性体、互変異性体等が存在し得るものもあるが、これらを含め、全ての可能な異性体及びそれらの混合物を本発明に用いられる。
また、化合物(Ia)は、水または各種溶媒との付加物の形で存在することもあるが、これらの付加物も本発明に用いられる。
化合物(Ia)のアミダイトとしては、例えば、後記のオリゴヌクレオチドの製造法における化合物(B)等が挙げられる。
次に、本発明のオリゴヌクレオチドの製造法について説明する。
オリゴヌクレオチドの一般的合成法は、例えば、ヌクレオチドのアミダイト化、オリゴマー化(脱保護等の工程を含む)、(必要に応じて)アニーリングによる二本鎖化等の工程からなる。
本発明のオリゴヌクレオチドは例えば以下の製造法によって製造することができる。
(1)オリゴマー化の一般例

[式中、mは例えば9〜99の整数であり、Poは例えばCPG(controlledporeglass)等の固相支持体であり、Raは例えばトリチル、p,p’-ジメトキシトリチル等の酸処理により除去できる保護基であり、Rbは例えばtert-ブチルジメチルシリル等のフッ化物イオンで除去できる保護基であり、Rcは例えば2-シアノエチル等の塩基処理により除去できる保護基であり、Rdは置換基を有してもよい低級アルキルであり、Bは核酸塩基(該核酸塩基は、必要により一つ以上の保護基により保護されていてもよく、保護基が二つ以上の場合、それぞれの保護基は同一でも異なっていてもよい)である。mが2以上の場合、m＋1個のB、m＋1個のRb及びm個のRcはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、各段階におけるRaは同一でも異なっていてもよい。ここで、低級アルキルは前記と同義であり、置換基を有していてもよい低級アルキルにおける置換基は前記置換基を有していてもよい低級アルキルにおける置換基と同義である]
工程1
化合物(C)は、溶媒中、反応促進剤存在下、化合物(A)と化合物(B)を0 ℃と50 ℃の間の温度で、10秒間から30分間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えばジクロロメタン、アセトニトリル、トルエン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン(THF)、1,4-ジオキサン、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)、N-メチルピロリドン(NMP)、水等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
反応促進剤としては、1H-テトラゾール、4,5-ジシアノイミダゾール、5-エチルチオテトラゾール、5-ベンジルチオテトラゾール等が挙げられる。
化合物(A)は、例えば市販品として得られる。
化合物(B)は、例えば以下の方法によって製造することができる。

(式中、Ra、Rb、Rc、Rd及びBはそれぞれ前記と同義であり、X3はハロゲンである。該ハロゲンは前記と同義である)
化合物(B)は、溶媒中、化合物(M)と化合物(N)を、塩基存在下、0 ℃と100 ℃の間の温度で、10秒間から24時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えばジクロロメタン、アセトニトリル、トルエン、酢酸エチル、THF、1,4-ジオキサン、DMF、NMP等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えば、トリエチルアミン、N,N-ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
また、化合物(B)は、溶媒中、化合物(M)と化合物(O)を、反応促進剤存在下、0 ℃と100℃の間の温度で、10秒間から24時間反応させることによっても製造することができる。
溶媒としては、例えばアセトニトリル、THF等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
反応促進剤としては、前記のものが挙げられる。
工程2
工程1における、未反応の化合物(A)は溶媒中、アシル化試薬と塩基を0 ℃と50 ℃の間の温度で、10秒間から30分間反応させることによりキャッピングすることができる。この際、適当な添加物を加え、反応を促進させることもできる。
アシル化試薬としては、例えば無水酢酸や無水フェノキシ酢酸が挙げられる。
溶媒としては、例えばジクロロメタン、アセトニトリル、酢酸エチル、THF、1,4-ジオキサン、DMF等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えばピリジン、2,6-ルチジン等が挙げられる。
添加剤としては、例えば4-ジメチルアミノピリジン、1-メチルイミダゾール等が挙げられる。
工程3
化合物(D)は、化合物(C)を溶媒中、酸化剤と、塩基存在下、0 ℃と50 ℃の間の温度で、10秒間から30分間反応させることにより製造することができる。
酸化剤としては、ヨウ素、過酸化水素水、m-クロロ過安息香酸、過酢酸、tert-ブチルヒドロペルオキシド、(+)-カンファースルホニルオキサジリジン(CSO)等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
塩基および溶媒としては、それぞれ前記工程2に記載のものが挙げられる。
工程4
化合物(E)は、溶媒中、化合物(D)に酸を0 ℃と50 ℃の間の温度で、10秒間から30分間反応させることにより製造することができる。
酸としては、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸等が挙げられる。
溶媒としてはジクロロメタン、クロロホルム等が挙げられる。
工程1〜4、及び下記の工程5及び6は核酸合成機を用いて行うこともできる。
(2)5’末端へのヌクレオチド残基(I)の導入の一般例

(式中、B、m、X1、R1、R2、Po、Ra、Rb、Rc及びRdはそれぞれ前記と同義である)
工程5
工程5(化合物(F)の保護基Raの脱保護)は、前記工程4と同様の方法で行うことができる。
工程6
工程5においてRaが脱保護された化合物(F)(以下、化合物(Fa))と化合物(G)のカップリングは例えば、以下の方法によって行うことができる。
溶媒中、反応促進剤存在下、化合物(Fa)と1当量〜大過剰量の化合物Gを0 ℃と50 ℃の間の温度で、10秒間から30分間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えばジクロロメタン、アセトニトリル、トルエン、酢酸エチル、THF、1,4-ジオキサン、DMF、NMP、水等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
反応促進剤としては、前記のものが挙げられる。
化合物Gは、例えば市販品として得られる。
工程7
前記工程3と同様の方法(リン原子の酸化)により、化合物(H)を得ることができる。
工程8
固相担持されたオリゴヌクレオチドに対して、塩基を作用させることにより、固相から切り出すことができる。即ち、化合物(J)は、溶媒中、化合物(H)を-80℃と200 ℃の間の温度で、10秒間から72時間、塩基で処理することにより製造することができる。
塩基としては、例えばアンモニア、メチルアミン、ジメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、イソプロピルアミン、ジイソプロピルアミン、ピペリジン、トリエチルアミン、エチレンジアミン、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン(DBU)、炭酸カリウム等が挙げられる。
溶媒としては、水、メタノール、エタノール、THF等が挙げられる。
なお、本工程において、B(核酸塩基)に含まれる窒素原子の保護基の脱保護も同時に行われる。
また、工程8の前処理として求核性の低い塩基で前処理を行い、リン酸部やカルボキシ基等の保護基を除去した後、切り出し作業を行ってもよい。
該求核性の低い塩基としては、例えばDBU、トリエチルアミン、トリエチルアミン、N,N-ジイソプロピルエチルアミン、ジイソプロピルアミン等が挙げられる。
溶媒としては、例えば、アセトニトリル、DMF、THF等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
工程9
化合物(K)は、溶媒中、化合物(J)とフッ素試薬を-80 ℃と200 ℃の間の温度で、10秒間から72時間反応させることにより製造することができる。このとき、塩基を加えることもできる。
フッ素試薬としては、例えばフッ化水素、フッ化水素酸トリエチルアミン塩、フッ化テトラブチルアンモニウム(TBAF)等が挙げられる。
塩基としては、例えば、トリエチルアミン、N,N-ジイソプロピルエチルアミン等が挙げられる。
溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、トルエン、酢酸エチル、THF、1,4-ジオキサン、DMF、N,N-ジメチルアセトアミド(DMA)、NMP、ジメチルスルホキシド(DMSO)等が挙げられる。
工程10
化合物(L)は、化合物(K)を溶媒中またはカラム中、0 ℃と50 ℃の間の温度で、5分間から100時間、酸で処理することにより製造することができる。
酸としてはトリフルオロ酢酸等が挙げられる。
溶媒としては、水、メタノール、エタノール、アセトニトリル等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
カラムとしては、例えばC18逆相カートリッジカラム等が挙げられる。
(3)5’末端へのリン酸導入の一般例

[式中、B、m、X1、R1、R2、Po、Ra、Rb、Rc及びRdはそれぞれ前記と同義であり、Reは例えば2-シアノエチル等の塩基処理により除去できる保護基や(3-(4,4’-ジメトキシトリチルオキシ)-2,2-ジカルボキシエチル)プロピル等の酸処理により除去できる保護基である]
工程1
工程1は、製造法(1)の工程7で得られる化合物(h)を用いて製造法(1)の工程4と同様の方法で行うことができる。
工程2
工程2は、上記工程1で得られた化合物および化合物(bP)を用いて製造法(1)の工程1と同様の方法で行うことができる。
化合物(bP)は、例えば市販品として得られる。
工程3
工程3は、上記工程(2)で得られた化合物を用いて製造法(1)の工程3と同様の方法で行うことができる。
工程4
工程4は、化合物(bQ)を用いて、製造法(2)の工程8と同様の方法で行うことができる。
工程5
工程5は、化合物(bR)を用いて、製造法(2)の工程9と同様の方法で行うことができる。
(4) オリゴ核酸のポスト変換

(式中、R2、R5、X1、Bおよびmはそれぞれ前記と同義であり、Yは硫黄原子またはNRX1(式中RX1は水素原子、低級アルキルまたはアラルキルであり、低級アルキルおよびアラルキルは前記と同義である）であり、R20は前記R6の定義における置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよいアリールチオ、または置換基を有していてもよい芳香族複素環チオのうち、置換基を有していてもよい低級アルキル部分、置換基を有していてもよいアリール部分、または置換基を有していてもよい芳香族複素環基部分をそれぞれ示し、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよいアリールチオ、および置換基を有していてもよい芳香族複素環チオにおける置換基は、前記置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよいアリールチオ、および置換基を有していてもよい芳香族複素環チオにおけるそれぞれの置換基と同義である)
化合物(bU)は、溶媒中、塩基非存在下または存在下、化合物(bS1)と化合物(bT)を0 ℃と150 ℃の間の温度で、10秒間から72時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えばアセトニトリル、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)、N-メチルピロリドン(NMP)、緩衝水等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、トリエチルアミン、N,N-ジイソプロピルエチルアミン、DBU、炭酸水素ナトリウム、トリス等が挙げられる。
化合物(bS1)は、製造法(3)と同様な方法で製造することができる。
化合物(bT)は、例えば市販品として得られる。
(5)二本鎖オリゴヌクレオチド製造の一般例
化合物(L)と、それに対して等モル量の一本鎖オリゴヌクレオチドとを溶媒中、30 ℃と120 ℃の間の温度で10秒間から72時間反応させた後、10分間から24時間を要しながら室温まで徐冷することにより、二本鎖オリゴヌクレオチドを製造することができる。
溶媒としては、例えば酢酸緩衝液、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、水等が挙げられ、これらを単独または混合して用いられる。
化合物(L)と反応させる一本鎖オリゴヌクレオチドは、化合物(L)と相補的なオリゴヌクレオチドであるが、1つ以上のミスマッチな塩基の組み合わせを含んでいてもよい。また、塩基長が異なっていてもよい。
上記のスキームにおいて、核酸塩基、各工程の反応条件等を種々変更することにより、所望のオリゴヌクレオチドを得ることができる。
これらは、例えば、
(i)テトラへドロン(Tetrahedron)、第48巻、第12号、2223-2311頁(1992年);
(ii)カレント・プロトコールズ・イン・ヌクレイック・アシッズ・ケミストリー(CurrentProtocolsin Nucleic Acids Chemistry)、John Wiley &Sons(2000年);
(iii)プロトコールズ・フォー・オリゴヌクレオチズ・アンド・アナログズ(ProtocolsforOligonucleotides and Analogs)、Human Press(1993年);
(iv)ケミストリー・アンド・バイオロジー・オブ・アーティフィシャル・ヌクレイック・アシッズ(ChemistryandBiology of Artificial Nucleic Acids)、Wiley-VCH(2012年);
(v)ゲノムケミストリー 人工核酸を活用する科学的アプローチ、講談社(2003年);
(vi)核酸化学のニュートレンド、化学同人(2011年)
等に記載の方法に準じて行うことができる。
(6)式(I)で表されるヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基に相当するヌクレオチドまたはヌクレオシドの一般的製造法
以下、式(I)で表されるヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基に相当するヌクレオチドまたはヌクレオシドの一般的製造法を示すが、本発明に用いられるヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基の製造法はこれらに限定されるものではない。
以下に示す製造法において、定義した基が該製造法の条件下で変化するか、または該製造法を実施するのに不適切な場合、有機合成化学で常用される保護基の導入及び除去方法[例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス第4版(Protective Groups in Organic Synthesis, forth edition)、グリーン(T.W.Greene)著、John Wiley & SonsInc.(2006年)等]等を用いることにより、目的化合物を製造することができる。また、必要に応じて置換基導入等の反応工程の順序を変えることもできる。
製造法4-1

(式中、Ra及びRbはそれぞれ前記と同義である)
工程1
化合物(b)は、溶媒中、塩基存在下、化合物(a)と相当するアルキル化剤を、0 ℃と150 ℃の間の温度で、10分間から3日間反応させることにより製造することができる。適当な活性化剤により、反応を促進させることもできる。
溶媒としては、例えばDMF、ピリジン、ジクロロメタン、THF、酢酸エチル、1,4-ジオキサン、NMP等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えば、ピリジン、トリエチルアミン、N-エチル-N,N-ジイソプロピルアミン、2,6-ルチジン等が挙げられる。
アルキル化剤としては、例えば、トリチルクロリド、p,p'-ジメトキシトリチルクロリド等が挙げられる。
活性化剤としては、例えば、4-ジメチルアミノピリジン等が挙げられる。
化合物(a)は、例えば、公知の方法[JournalofMedicinal Chemistry, 2004, 47(6), 1987-1996]によって合成できる。
工程2
化合物(c)は、溶媒中、銀塩及び塩基存在下、化合物(b)とシリル化剤を、0 ℃と80 ℃の間の温度で、10分間から3日間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えば、THF、エチレングリコールジメチルエーテル(DME)等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
銀塩としては、例えば硝酸銀、過塩素酸銀等が挙げられる。
塩基としては、例えば、トリエチルアミン、1,4-ジアザビシクロ[2,2,2]オクタン(DABCO)、ピリジン等が挙げられる。
シリル化剤としては、例えば、tert-ブチルジメチルシリルクロリド等が挙げられる。
製造法4-2

(式中、Ra及びRbはそれぞれ前記と同義であり、Reは、例えばアセチル、ベンゾイル等の塩基により除去できる保護基であり、R11a-1は前記R11aの定義のうち、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、または置換基を有していてもよい芳香族複素環基である)
工程1
化合物(e)は溶媒中、または無溶媒で、化合物(c)と化合物(d)を、塩基存在下または非存在下、0 ℃と150 ℃の間の温度で1時間から1週間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えばDMF、ピリジン、ジクロロメタン、THF、酢酸エチル、NMP、アセトニトリル等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えばトリエチルアミン、N-エチル-N,N-ジイソプロピルアミン等が挙げられる。
工程2
化合物(f)は溶媒中、化合物(e)とシリル化剤を0 ℃と100 ℃の間の温度で10分間から3時間反応させた後、アシル化剤と0 ℃と100℃の間で1時間から72時間反応させ、さらに水またはアルコールで1時間から24時間処理することにより製造することができる。アシル化剤と適当な活性化剤を共存させることにより、反応を促進させることもできる。
溶媒としては、例えばピリジン等が挙げられる。
シリル化剤としては、例えば、トリメチルシリルクロリド、トリフルオロメタンスルホニルトリメチルシリル、N,O-ビス(トリメチルシリル)アセトアミド、1,1,1,3,3,3-ヘキサメチルジシラザン等が挙げられる。
アシル化剤としては、例えば、無水酢酸、酢酸クロリド、ベンゾイルクロリド等が挙げられる。
アルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、1-プロパノール等が挙げられる。
活性化剤としては、例えば、4-ジメチルアミノピリジンが挙げられる。
製造法4-3

(式中、Ra、Rb及びR11a-1はそれぞれ前記と同義であり、R11b-1は前記R11bの定義のうち、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、または置換基を有していてもよい芳香族複素環基である)
化合物(h)は溶媒中、または無溶媒で、化合物(c)と化合物(g)を、塩基存在下または非存在下、0 ℃と150 ℃の間の温度で1時間から1週間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えばDMF、ピリジン、ジクロロメタン、THF、酢酸エチル、NMP、アセトニトリル等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えばトリエチルアミン、N-エチル-N,N-ジイソプロピルアミン等が挙げられる。
製造法4-4

(式中、Ra及びRbはそれぞれ前記と同義であり、R6bは置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基であり、Xaは酸素原子または硫黄原子であり、Mはアルカリ金属原子である。ここで、低級アルキル、アリール及び芳香族複素環基はそれぞれ前記と同義であり、置換基を有していてもよい低級アルキルにおける置換基は前記置換基を有していてもよい低級アルキルにおける置換基と同義であり、置換基を有していてもよいアリール及び置換基を有していてもよい芳香族複素環基における置換基は前記置換基を有していてもよいアリール及び置換基を有していてもよい芳香族複素環基における置換基と同義である。アルカリ金属原子は、リチウム原子、ナトリウム原子、またはカリウム原子である)
化合物(k)は溶媒中、化合物(c)と化合物(i)を0 ℃と100 ℃の間の温度で、10分間から3日間反応させることにより、または溶媒中、化合物(c)と化合物(j)を塩基存在下、0 ℃と120 ℃の間の温度で、10分間から3日間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、2-プロパノール、THF、DME、DMF、NMP等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、水素化ナトリウム、水素化カリウム、tert-ブトキシカリウム等が挙げられる。
製造法4-5

(式中、Ra及びRbはそれぞれ前記と同義であり、Arは置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基であり、Rfは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである。ここで、低級アルキル、アリール及び芳香族複素環基はそれぞれ前記と同義であり、置換基を有していてもよい低級アルキルにおける置換基は前記置換基を有していてもよい低級アルキルにおける置換基と同義であり、置換基を有していてもよいアリール及び置換基を有していてもよい芳香族複素環基における置換基は前記置換基を有していてもよいアリール及び置換基を有していてもよい芳香族複素環基における置換基と同義である)
化合物(m)は、溶媒中、化合物(c)と化合物(l)を塩基、及びパラジウム触媒存在下、0 ℃と120 ℃の間の温度で、30分間から72時間反応させることにより製造することができる。適当なホスフィンを添加することにより、反応を促進させることもできる。
化合物(l)は市販品として得られるか、または公知の方法[例えば、「第5版実験化学講座18有機化合物の合成VI金属を用いる有機合成」、p.97、丸善(2005年)]でもしくはそれに準じて得ることができる。
塩基としては、例えば炭酸カリウム、リン酸カリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、カリウム tert-ブトキシド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリン、ピリジン、DBU等が挙げられる。
パラジウム触媒としては、例えば酢酸パラジウム、トリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム、1,1’-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセンジクロロパラジウム・ジクロロメタン1:1付加物等が挙げられる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、THF、DME、ジオキサン、DMF、DMA、NMP、水等が挙げられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
適当なホスフィンとしては、例えば1,2-ビス(ジフェニルホスフィノ)エタン、1,3-ビス(ジフェニルホスフィノ)プロパン、4,5'-ビス(ジフェニルホスフィノ)-9,9'-ジメチルキサンテン(Xantphos)、2,2'-ビス(ジフェニルホスフィノ)-1,1'-ビナフチル(BINAP)等が挙げられる。
製造法4-6

(式中、Ra、Rb及びRfはそれぞれ前記と同義であり、R15a、R15b及びR15cはそれぞれ、水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、アリール、または芳香族複素環基である。ここで、低級アルキル、アリール及び芳香族複素環基はそれぞれ前記と同義であり、置換基を有していてもよい低級アルキルにおける置換基は前記置換基を有していてもよい低級アルキルにおける置換基と同義である)
化合物(p)は、溶媒中、化合物(c)と化合物(n)を塩基、及びパラジウム触媒存在下、0 ℃と120 ℃の間の温度で、30分間から72時間反応させることにより製造することができる。適当なホスフィンを添加することにより、反応を促進させることもできる。
化合物(n)は、例えば市販品として得られる。
塩基としては、例えば炭酸カリウム、リン酸カリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、カリウム tert-ブトキシド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリン、ピリジン、DBU等が挙げられる。
パラジウム触媒としては、前記のものが挙げられる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、THF、DME、ジオキサン、DMF、DMA、NMP、水等が挙げられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
また、化合物(p)は、化合物(c)と化合物(o)を、溶媒中、塩基とパラジウム触媒の存在下、0 ℃と140 ℃との間の温度で、30分間から72時間反応させることによっても製造することができる。
塩基としては、例えば酢酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、カリウムtert-ブトキシド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリン、ピリジン、DBU等が挙げられる。
パラジウム触媒としては、前記のものが挙げられる。
溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、THF、DME、ジオキサン、DMF、DMA、NMP等が挙げられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
適当なホスフィンとしては、例えば1,2-ビス(ジフェニルホスフィノ)エタン、1,3-ビス(ジフェニルホスフィノ)プロパン、Xantphos、BINAP等が挙げられる。
製造法4-7

(式中、Ra、Rb及びR6bはそれぞれ前記と同義である)
化合物(r)は、溶媒中、化合物(c)と化合物(q)をパラジウム触媒存在下、0 ℃と150℃との間の温度で反応させることにより製造することができる。適当な添加剤及び／または適当なホスフィンにより反応を促進させることもできる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、THF、DME、ジオキサン、DMF、DMA、NMP等が挙げられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
化合物(q)は、例えば市販品として得られる。
パラジウム触媒としては、前記のものが挙げられる。
適当な添加剤としては、例えば、塩化リチウム、フッ化セシウム等が挙げられる。
適当なホスフィンとしては、例えば1,2-ビス(ジフェニルホスフィノ)エタン、1,3-ビス(ジフェニルホスフィノ)プロパン、Xantphos、BINAP等が挙げられる。
製造法4-8

(式中、Ra、Rb、R11c及びR11dはそれぞれ前記と同義である)
化合物(t)は溶媒中、化合物(c)と化合物(s)を一酸化炭素雰囲気下、塩基とパラジウム触媒の存在下、室温と120 ℃の間の温度で1時間から72時間反応させることにより製造することができる。適当なホスフィンを添加することにより、反応を促進させることもできる。
溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、THF、DME、ジオキサン、DMF、DMA、NMP等が挙げられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えば酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、ナトリウムメトキシド、カリウムtert-ブトキシド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリン、ピリジン、DBU等が挙げられる。
パラジウム触媒としては、前記のものが挙げられる。
ホスフィンとしては、例えば1,2-ビス(ジフェニルホスフィノ)エタン、1,3-ビス(ジフェニルホスフィノ)プロパン、Xantphos、BINAP等が挙げられる。
製造法4-9

(式中、Ra及びRbはそれぞれ前記と同義であり、R6cは置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基である。ここで、低級アルキル、アリール及び芳香族複素環基はそれぞれ前記と同義であり、置換基を有していてもよい低級アルキルにおける置換基は前記置換基を有していてもよい低級アルキルにおける置換基と同義であり、置換基を有していてもよいアリール及び置換基を有していてもよい芳香族複素環基における置換基は前記置換基を有していてもよいアリール及び置換基を有していてもよい芳香族複素環基における置換基と同義である)
工程1
化合物(w)は溶媒中、化合物(c)と化合物(u)を一酸化炭素雰囲気下、塩基とパラジウム触媒の存在下、室温と120 ℃の間の温度で1時間から72時間反応させることにより製造することができる。適当なホスフィンを添加することにより、反応を促進させることもできる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、1-プロパノール、2-プロパノール、1-ブタノール、tert-ブチルアルコール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、THF、DME、ジオキサン、DMF、DMA、NMP等が挙げられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えば酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、ナトリウムメトキシド、カリウムtert-ブトキシド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリン、ピリジン、DBU等が挙げられる。
パラジウム触媒としては、前記のものが挙げられる。
ホスフィンとしては、例えば1,2-ビス(ジフェニルホスフィノ)エタン、1,3-ビス(ジフェニルホスフィノ)プロパン、Xantphos、BINAP等が挙げられる。
工程2
化合物(y)は化合物(w)を溶媒中、塩基の存在下、0 ℃と100 ℃との間の温度で、5分間〜72時間処理することにより製造することができる。
塩基としては、例えば炭酸カリウム、水酸化リチウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド等が挙げられる。
溶媒としては、例えば水を含む溶媒が挙げられ、該溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、THF、DME、ジオキサン、DMF、DMA、NMP、ピリジン等が挙げられ、これらは水と混合して、またはそれぞれを混合してさらに水を添加して用いられる。
製造法4-10

(式中、Ra及びRbはそれぞれ前記と同義であり、R6dは置換基を有していてもよい低級アルキル、アリールまたは芳香族複素環基である。ここで、低級アルキル、アリール及び芳香族複素環基はそれぞれ前記と同義であり、置換基を有していてもよい低級アルキルにおける置換基は前記置換基を有していてもよい低級アルキルにおける置換基と同義である)
化合物(aa)は溶媒中、化合物(c)と化合物(z)を銅塩、塩基とパラジウム触媒の存在下、室温と150 ℃の間の温度で1時間から72時間反応させることにより製造することができる。適当なホスフィンを添加することにより、反応を促進させることもできる。
溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、THF、DME、ジオキサン、DMF、DMA、NMP等が挙げられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
銅塩としては、例えばヨウ化銅(I)、フッ化銅、塩化銅、臭化銅、酸化銅、硫化銅、セレン化銅、酢酸銅、シアン化銅、チオシアン化銅、トリフルオロメタンスルホン酸銅等が挙げられる。
塩基としては、例えば酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、ナトリウムメトキシド、カリウムtert-ブトキシド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリン、ピリジン、DBU等が挙げられる。
パラジウム触媒としては、前記のものが挙げられる。
ホスフィンとしては、例えば1,2-ビス(ジフェニルホスフィノ)エタン、1,3-ビス(ジフェニルホスフィノ)プロパン、Xantphos、BINAP等が挙げられる。
製造法4-11
以下の方法で得られる化合物aeを用い、前記製造法4-2〜4-10に準じて、本発明のオリゴヌクレオチド製造の原料に用いられるヌクレオシドを得ることができる。

(式中、Ra、Rb及びRcはそれぞれ前記と同義である)
工程1
化合物(ac)は溶媒中、化合物(ab)とシリル化剤を0 ℃と100 ℃の間の温度で10分間から3時間反応させた後、アシル化剤と0 ℃と100℃の間で1時間から72時間反応させ、さらに水またはアルコールで1時間から24時間処理することにより製造することができる。
溶媒としては、例えばピリジン等が挙げられる。
シリル化剤としては、例えば、トリメチルシリルクロリド、トリフルオロメタンスルホニルトリメチルシリル、N,O-ビス(トリメチルシリル)アセトアミド、1,1,1,3,3,3-ヘキサメチルジシラザン等が挙げられる。
アシル化剤としては、例えば、無水酢酸、酢酸クロリド、ベンゾイルクロリド等が挙げられる。
アルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、1-プロパノール等が挙げられる。
化合物(ab)は、例えば、公知の方法[Tetrahedron,1970,26, 4251-4259]によって合成できる。
工程2
化合物(ad)は、溶媒中、塩基存在下、化合物(ac)と相当するアルキル化剤を、0 ℃と150 ℃の間の温度で、10分間から3日間反応させることにより製造することができる。適当な活性化剤により、反応を促進させることもできる。
溶媒としては、例えばDMF、ピリジン、ジクロロメタン、THF、酢酸エチル、1,4-ジオキサン、NMP等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えば、ピリジン、トリエチルアミン、N-エチル-N,N-ジイソプロピルアミン、2,6-ルチジン等が挙げられる。
アルキル化剤としては、例えば、トリチルクロリド、p,p'-ジメトキシトリチルクロリド等が挙げられる。
活性化剤としては、例えば、4-ジメチルアミノピリジン等が挙げられる。
工程3
化合物(ae)は、溶媒中、銀塩、及び塩基存在下、化合物(ad)とシリル化剤を、0 ℃と80 ℃の間で10分間から3日間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えば、THF、DME等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
銀塩としては、例えば硝酸銀、過塩素酸銀等が挙げられる。
塩基としては、例えば、トリエチルアミン、DABCO、ピリジン等が挙げられる。
シリル化剤としては、例えば、tert-ブチルジメチルシリルクロリド等が挙げられる。
製造法4-12

(式中、Ra及びRbはそれぞれ前記と同義である)
工程1
化合物(ag)は、溶媒中、塩基存在下、化合物(af)と相当するアルキル化剤を、0 ℃と150 ℃の間の温度で、10分間から3日間反応させることにより製造することができる。適当な活性化剤により、反応を促進させることもできる。
溶媒としては、例えばDMF、ピリジン、ジクロロメタン、THF、酢酸エチル、1,4-ジオキサン、NMP等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えば、ピリジン、トリエチルアミン、N-エチル-N,N-ジイソプロピルアミン、2,6-ルチジン等が挙げられる。
アルキル化剤としては、例えば、トリチルクロリド、p,p'-ジメトキシトリチルクロリド等が挙げられる。
活性化剤としては、例えば、4-ジメチルアミノピリジン等が挙げられる。
化合物(af)は、例えば、公知の方法[JournalofMedicinal Chemistry, 2004, 50(5), 915-921及びWO2011/51733]によって合成できる。
工程2
化合物(ah)は、溶媒中、銀塩、及び塩基存在下、化合物(ag)とシリル化剤を、0 ℃と80 ℃の間で10分間から3日間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えば、THF、DME等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
銀塩としては、例えば硝酸銀、過塩素酸銀等が挙げられる。
塩基としては、例えば、トリエチルアミン、DABCO、ピリジン等が挙げられる。
シリル化剤としては、例えば、tert-ブチルジメチルシリルクロリド等が挙げられる。
製造法4-13

(式中、Ra、Rb、Rf及びArはそれぞれ前記と同義である)
化合物(ai)は、化合物(ah)を用い、製造法4-5に準じて製造することができる。
製造法4-14

(式中、Ra、Rb、Rf、R15a、R15b及びR15cはそれぞれ前記と同義である)
化合物(aj)は、化合物(ah)を用い、製造法4-6に準じて製造することができる。
製造法4-15

(式中、Ra、Rb及びR6bはそれぞれ前記と同義である)
化合物(ak)は、化合物(ah)を用い、製造法4-7に準じて製造することができる。
製造法4-16

(式中、Ra、Rb及びR6dはそれぞれ前記と同義である)
化合物(al)は、化合物(ah)を用い、製造法4-10に準じて製造することができる。
製造法4-17

(式中、Ra、環A、R16、n1及びRbはそれぞれ前記と同義であり、Rgは例えばジ-tert-ブチルシリル等のフッ化物イオンで除去できる保護基であり、Xaは例えばハロゲン、アシルオキシ基等の脱離基であり、R17、R18及びR19は、それぞれ例えばアシル基等の、塩基で脱保護できる保護基である)
工程1
化合物(nb)は、溶媒中、シリル化剤存在下、化合物(na)と化合物(naa)を、0 ℃と150 ℃の間の温度で、10分間から1日間反応させた後、ルイス酸存在下、0 ℃と150 ℃の間の温度で、10分間から1日間処理することにより製造することができる。
溶媒としては、例えば、アセトニトリル、1,2-ジクロロエタン、THF、トルエン等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
シリル化剤としては、例えばトリメチルシリルクロリド、トリフルオロメタンスルホニルトリメチルシリル、N,O-ビス(トリメチルシリル)アセトアミド、1,1,1,3,3,3-ヘキサメチルジシラザン等が挙げられる。
ルイス酸としては、例えば、トリフルオロメタンスルホニルトリメチルシリル、四塩化スズ等が挙げられる。
化合物(na)は市販品として得られるか、または例えば、公知の方法[テトラへドロン(Tetrahedron)、 2012年、68巻、8908-8915頁]で、もしくはそれに準じて得ることができる。
工程2
化合物(nc)は、溶媒中または無溶媒で、化合物(nb)と塩基を室温と50 ℃の間の温度で、1時間から4日間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、THF、DMF、水等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えばアンモニア、メチルアミン、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド等が挙げられる。
工程3
化合物(nd)は、溶媒中、塩基存在下、化合物(nc)と例えば相当するシリル化剤を、0 ℃と80 ℃の間の温度で、10分間から3日間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えばDMF、DMA、NMP等が挙げられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えばイミダゾール、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン等が挙げられる。
シリル化剤としては、例えば、ビス(トリフルオロメタンスルホン酸)ジ-tert-ブチルシリル等が挙げられる。
工程4
化合物(ne)は、溶媒中、塩基存在下、化合物(nd)と例えば相当するシリル化剤を、0 ℃と80 ℃の間で10分間から3日間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、DMF等が挙げられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えばイミダゾール、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン等が挙げられる。
シリル化剤としては、例えば、tert-ブチルジメチルシリルクロリド等が挙げられる。
工程5
化合物(nf)は、溶媒中、塩基存在下、化合物(ne)を脱保護試薬で、0 ℃と80 ℃の間で10分間から3日間処理することにより製造することができる。
溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、ジエチルエーテル、THF、DME、ジオキサン等が挙げられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えばトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン等が挙げられる。
脱保護試薬としては、例えば、フッ化水素-ピリジン等が挙げられる。
工程6
化合物(ng)は、溶媒中、塩基存在下、化合物(nf)と相当するアルキル化剤を、0 ℃と150 ℃の間の温度で、10分間から3日間反応させることにより製造することができる。適当な活性化剤により、反応を促進させることもできる。
溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、THF、ジオキサン、DMF、ピリジン等が挙げられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えばトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン等が挙げられる。
アルキル化剤としては、例えば、トリチルクロリド、p,p'-ジメトキシトリチルクロリド等が挙げられる。
活性化剤としては、例えば、4-ジメチルアミノピリジン等が挙げられる。
製造法4-18

(式中、Raは前記と同義であり、Rはトリ低級アルキルシリルであり、該トリ低級アルキルシリルの低級アルキルは、同一または異なって、それぞれ前記低級アルキルと同義である)
工程1
化合物(bb)は、溶媒中、塩基存在下、化合物(ba)と相当するアルキル化剤を、0 ℃と150 ℃の間の温度で、10分間から3日間反応させることにより製造することができる。また適当な活性化剤により、反応を促進させることもできる。
溶媒としては、例えばDMF、ピリジン、ジクロロメタン、THF、酢酸エチル、1,4-ジオキサン、NMP等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えば、ピリジン、トリエチルアミン、N,N-ジイソプロピルエチルアミン、2,6-ルチジン等が挙げられる。
アルキル化剤としては、例えば、トリチルクロリド、p,p'-ジメトキシトリチルクロリド等が挙げられる。
活性化剤としては、例えば、4-ジメチルアミノピリジン等が挙げられる。
化合物(ba)は、例えば市販により得られる。
工程2
化合物(bc)は、溶媒中、塩基存在下、化合物(bb)とシリル化剤を、0 ℃と150 ℃の間の温度で、10分間から3日間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えばDMF、ピリジン、ジクロロメタン、THF、酢酸エチル、1,4-ジオキサン、NMP等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えば、イミダゾール、2,6-ルチジン等が挙げられる。
シリル化剤としては、例えば、tert-ブチルクロロジメチルシラン、tert-ブチルジメチルシリル トリフラート等が挙げられる。
製造法4-19

(式中、RaおよびRはそれぞれ前記と同義である)
工程1
化合物(be)は、溶媒中、塩基存在下、化合物(bd)とアルキル化剤を、0 ℃と150 ℃の間の温度で、10分間から3日間反応させることにより製造することができる。また適当な活性化剤により、反応を促進させることもできる。
溶媒としては、例えばDMF、ピリジン、ジクロロメタン、THF、酢酸エチル、1,4-ジオキサン、NMP等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えば、ピリジン、トリエチルアミン、N,N-ジイソプロピルエチルアミン、2,6-ルチジン等が挙げられる。
アルキル化剤としては、例えば、トリチルクロリド、p,p'-ジメトキシトリチルクロリド等が挙げられる。
活性化剤としては、例えば、4-ジメチルアミノピリジン等が挙げられる。
化合物(bd)は、例えば市販により得られる。
工程2
化合物(bf)は、化合物(be)を用いてJ.Am.Chem.Soc、2007年,129巻,782-789頁に記載の方法により得られる。
工程3
化合物(bg)は、化合物(bf)を用いて、製造法4-18の工程2と同様にして得られる。
製造法4-20

(式中、Ra、RおよびR11a-1は、それぞれ前記と同義であり、R11b-1は前記R11bの定義のうち、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、または置換基を有していてもよい芳香族複素環基であり、L1は塩素原子または1-ベンゾトリアゾリルオキシである)
化合物(bi)は溶媒中、または無溶媒で、化合物(bh)と化合物(g)を、塩基存在下または非存在下、0 ℃と150 ℃の間の温度で1時間から1週間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えばDMF、ピリジン、ジクロロメタン、THF、酢酸エチル、NMP、アセトニトリル等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えばトリエチルアミン、N,N-ジイソプロピルエチルアミン等が挙げられる。
製造法4-21

(式中、Ra、RおよびL1は、それぞれ前記と同義であり、R6bは置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基であり、Xaは酸素原子または硫黄原子であり、Mはアルカリ金属原子である。ここで、低級アルキル、アリールおよび芳香族複素環基はそれぞれ前記と同義であり、置換基を有していてもよい低級アルキルにおける置換基は、前記置換基を有していてもよい低級アルキルにおける置換基と同義であり、置換基を有していてもよいアリールおよび置換基を有していてもよい芳香族複素環基における置換基は前記置換基を有していてもよいアリールおよび置換基を有していてもよい芳香族複素環基における置換基と同義であり、該アルカリ金属原子は、リチウム原子、ナトリウム原子、またはカリウム原子である)
化合物(bj)は溶媒中、化合物(bh)と化合物(i)を0 ℃と100 ℃の間の温度で、10分間から3日間反応させることにより、または溶媒中、化合物(bh)と化合物(j)を塩基存在下、0℃と120 ℃の間の温度で、10分間から3日間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、2-プロパノール、THF、DME、DMF、NMP等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、水素化ナトリウム、水素化カリウム、tert-ブトキシカリウム等が挙げられる。
製造法4-22

(式中、RaおよびRは、それぞれ前記と同義であり、Arは置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基であり、Rfは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである。該低級アルキル、アリールおよび芳香族複素環基はそれぞれ前記と同義であり、置換基を有していてもよい低級アルキルにおける置換基は前記置換基を有していてもよい低級アルキルにおける置換基と同義であり、置換基を有していてもよいアリールおよび置換基を有していてもよい芳香族複素環基における置換基は前記置換基を有していてもよいアリールおよび置換基を有していてもよい芳香族複素環基における置換基と同義である)
化合物(bk)は、溶媒中、化合物(bc)と化合物(l)を塩基およびパラジウム触媒存在下、0 ℃と120 ℃の間の温度で、30分間から72時間反応させることにより製造することができる。また適当なホスフィンを添加することにより、反応を促進させることもできる。
化合物(l)は市販品として得られるか、または例えば、「第5版実験化学講座18有機化合物の合成VI 金属を用いる有機合成」、p.97、丸善(2005年)等に記載の製造法に準じて得ることができる。
塩基としては、例えば炭酸カリウム、リン酸カリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、カリウム tert-ブトキシド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリン、ピリジン、DBU等が挙げられる。
パラジウム触媒としては、例えば酢酸パラジウム、トリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム、1,1’-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセンジクロロパラジウム・ジクロロメタン1:1付加物等が挙げられる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、THF、DME、ジオキサン、DMF、DMA、NMP、水等が挙げられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
適当なホスフィンとしては、例えば1,2-ビス(ジフェニルホスフィノ)エタン、1,3-ビス(ジフェニルホスフィノ)プロパン、4,5'-ビス(ジフェニルホスフィノ)-9,9'-ジメチルキサンテン(Xantphos)、2,2'-ビス(ジフェニルホスフィノ)-1,1'-ビナフチル(BINAP)等が挙げられる。
製造法4-23

(式中、Rb1およびRb2は同一または異なって、それぞれ低級アルキルである。該低級アルキルは前記と同義である)
工程1
化合物(bm)は、溶媒中、塩基存在下、化合物(bl)とシリル化剤を、0 ℃と150 ℃の間の温度で、10分間から3日間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えばDMF、ピリジン、ジクロロメタン、THF、酢酸エチル、1,4-ジオキサン、NMP等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えば、イミダゾール、2,6-ルチジン等が挙げられる。
シリル化剤としては、例えば、ジクロロジ-tert-ブチルシラン等が挙げられる。
製造法4-24

(式中、Rb1およびRb2は、それぞれ前記と同義であり、Rfは前記と同義であり、R15a、R15bおよびR15cは、同一または異なって、それぞれ、水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、アリール、または芳香族複素環基である。該低級アルキル、アリールおよび芳香族複素環基は、それぞれ前記と同義であり、置換基を有していてもよい低級アルキルにおける置換基は前記置換基を有していてもよい低級アルキルにおける置換基と同義である)
化合物(bn)は、溶媒中、化合物(bm)と化合物(n)を塩基およびパラジウム触媒存在下、0 ℃と120 ℃の間の温度で、30分間から72時間反応させることにより製造することができる。適当なホスフィンを添加することにより、反応を促進させることもできる。
化合物(n)は、例えば市販品として得られる。
塩基としては、例えば炭酸カリウム、リン酸カリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、カリウム tert-ブトキシド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリン、ピリジン、DBU等が挙げられる。
パラジウム触媒としては、前記のものが挙げられる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、THF、DME、ジオキサン、DMF、DMA、NMP、水等が挙げられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
また、化合物(bn)は、化合物(bm)と化合物(o)を、溶媒中、塩基およびパラジウム触媒存在下、0 ℃と140 ℃との間の温度で、30分間から72時間反応させることによっても製造することができる。
塩基としては、例えば酢酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、カリウムtert-ブトキシド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリン、ピリジン、DBU等が挙げられる。
パラジウム触媒としては、前記のものが挙げられる。
溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、THF、DME、ジオキサン、DMF、DMA、NMP等が挙げられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
適当なホスフィンとしては、例えば1,2-ビス(ジフェニルホスフィノ)エタン、1,3-ビス(ジフェニルホスフィノ)プロパン、Xantphos、BINAP等が挙げられる。
製造法4-25

(式中、Raは前記と同義であり、R6dは置換基を有していてもよい低級アルキル、アリールまたは芳香族複素環基である。ここで、低級アルキル、アリールおよび芳香族複素環基はそれぞれ前記と同義であり、置換基を有していてもよい低級アルキルにおける置換基は前記置換基を有していてもよい低級アルキルにおける置換基と同義である)
化合物(bo)は溶媒中、化合物(bc)と化合物(z)を銅塩、塩基およびパラジウム触媒存在下、室温と150 ℃の間の温度で1時間から72時間反応させることにより製造することができる。適当なホスフィンを添加することにより、反応を促進させることもできる。
溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、THF、DME、ジオキサン、DMF、DMA、NMP等が挙げられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
銅塩としては、例えばヨウ化銅、フッ化銅、塩化銅、臭化銅、ヨウ化銅、酸化銅、硫化銅、セレン化銅、酢酸銅、シアン化銅、チオシアン化銅、トリフルオロメタンスルホン酸銅等が挙げられる。
塩基としては、例えば酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、ナトリウムメトキシド、カリウムtert-ブトキシド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリン、ピリジン、DBU等が挙げられる。
パラジウム触媒としては、前記のものが挙げられる。
適当なホスフィンとしては、例えば1,2-ビス(ジフェニルホスフィノ)エタン、1,3-ビス(ジフェニルホスフィノ)プロパン、Xantphos、BINAP等が挙げられる。
上記各製造法に含まれる化合物中の各基の変換は、公知の方法[例えば、コンプリヘンシブ・オーガニック・トランスフォーメーションズ第2版(Comprehensive Organic Transformations2ndedition)、R. C. ラロック(Larock)著、Vch Verlagsgesellscaft Mbh(1999年)等]で、またはそれらに準じて行うこともできる。
上記各製造法の生成物に対し、公知の方法によってヒドロキシの脱保護、及びリン酸化[例えば、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー(Journal of Medicinal Chemistry)、第55巻、1478-1489頁(2012年)等]を行うことにより、所望のヌクレオチドまたはヌクレオシドを得ることができる。
上記各製造法における中間体及び目的化合物は、有機合成化学で常用される分離精製法、例えば、ろ過、抽出、洗浄、乾燥、濃縮、再結晶、各種クロマトグラフィー等に付して単離精製することができる。また、中間体においては特に精製することなく次の反応に供することも可能である。
上記ヌクレオチドまたはヌクレオシドは、例えば酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等の塩として得ることも可能である。
酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩等の有機酸塩が挙げられ、金属塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等が挙げられ、アンモニウム塩としては、例えばアンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の塩が挙げられ、有機アミン付加塩としては、例えば、モルホリン、ピペリジン等の付加塩が挙げられ、アミノ酸付加塩としては、例えば、リジン、グリシン、フェニルアラニン等の付加塩が挙げられる。
上記ヌクレオチドまたはヌクレオシドの塩を取得したいとき、上記ヌクレオチドまたはヌクレオシドが塩の形で得られるときはそのまま精製すればよく、また、遊離の形で得られるときは、上記ヌクレオチドまたはヌクレオシドを適当な溶媒に溶解または懸濁し、酸または塩基を加えて単離、精製すればよい。
上記ヌクレオチドまたはヌクレオシドの中には、幾何異性体、光学異性体等の立体異性体、互変異性体等が存在し得るものもあるが、これらを含め、全ての可能な異性体及びそれらの混合物を本発明に用いられる。
また、上記ヌクレオチドまたはヌクレオシドは、水または各種溶媒との付加物の形で存在することもあるが、これらの付加物も本発明に用いられる。
化合物(Ia)の具体例を表1〜21に示す。ただし、本発明の化合物(Ia)および相当する式(I)で表されるヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基は、これらにおよび相当するヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基に限定されるものではない。





















本発明のオリゴヌクレオチドは、トランスフェクション用の担体、好ましくはカチオン性リポソーム等のカチオン性担体を用いて細胞内に導入することができる。また、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法またはマイクロインジェクション法等により、直接細胞内に導入することもできる。
例えばsiRNAはmRNAの切断を介してあらゆる蛋白質の発現を選択的に抑制し得ることから、医薬への応用が期待されている。疾患に関与する蛋白質をコードする mRNAに対するノックダウン活性を有するオリゴヌクレオチド(例えばsiRNA)において、該オリゴヌクレオチドの5’末端のヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基を、式(I)で表されるヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基に置換することで、標的mRNAに対するノックダウン活性を向上させることが期待される。
また、疾患に関与する蛋白質をコードするmRNAに対するノックダウン活性を有するオリゴヌクレオチド(例えばsiRNA)において、該オリゴヌクレオチドの5’末端における塩基残基を、式(II)〜(V)で表される塩基残基に置換することで、AGO2との親和性が向上したオリゴヌクレオチドになり、標的mRNAに対する高いノックダウン活性を有するオリゴヌクレオチドになる。また、5’末端における塩基がグアニンまたはシトシンであるオリゴヌクレオチドにおいて、該オリゴヌクレオチドの5’末端におけるグアニン残基またはシトシン残基を、アデニン残基(6-アミノプリン-9-イル)、チミン残基(5-メチル-1,2,3,4テトラヒドロピリミジン-2,4ジオン-1-イル)、ウリジン残基(ピリミジン-2,4(1H,3H)ジオン-1-イル)または式(II)〜(V)で表される塩基残基に置換することで、AGO2との親和性が向上したオリゴヌクレオチドになり、標的mRNAに対する高いノックダウン活性を有するオリゴヌクレオチドになる。
本発明によって得られる標的mRNAに対する高いノックダウン活性を有するオリゴヌクレオチドは、5’末端におけるリン酸部分や糖部が式(I)と同じであっても、異なっていても構わない。
本発明における式(II)〜(V)で表される塩基残基の好ましい形態としては、前記(4)〜(12)、(14)〜(16)、(18)〜(22)、(24)〜(27)、(71)および(72)に示された式(II)〜(V)で表される塩基残基が挙げられ、より好ましい形態としては、前記(35)〜(39)、(41)〜(44)、(46)〜(48)に示された式(IIA)〜(VA)ならびに(71)および(72)で表される塩基残基が挙げられる。
本発明のオリゴヌクレオチド及び本発明の方法により標的mRNAに対するノックダウン活性が向上したオリゴヌクレオチドは、そのまま単独で投与することも可能であるが、通常各種の医薬製剤として提供するのが望ましい。また、それら医薬製剤は、動物及び人に使用されるものである。
本発明に係わる医薬製剤は、活性成分として本発明のオリゴヌクレオチドを単独で、または任意の他の治療のための有効成分との混合物として含有することができる。また、それらの医薬製剤は、活性成分を薬学的に許容される一種もしくはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造される。例えば本発明の医薬製剤の製造方法としては、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーションおよびマイクロインジェクション、ウイルス法、ならびにカチオンリポソームを使用する方法などが挙げられる（Graham, F.L.およびvan der Eb, A.J.（1973）Virol. 52, 456；McCutchan,J.H.およびPagano, J.S.（1968）J.Natl. Cancer Inst. 41, 351；Chu, G.ら（1987）Nucl. Acids Res. 15, 1311；Fraley, Rら（1980）J.Biol.Chem. 255, 10431；Capechi, M.R.（1980）Cell 22, 479；Felgner,P.L.ら（1987）, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 84, 7413）。また、核酸を含有するカチオニックリピッドパーティクルやカチオニックポリマー、および核酸封入リピッドパーティクルなどを用いる方法が挙げられる。さらにポリエチレングリコール(PEG)等の水溶性高分子で、リピッドパーティクル等の表面を修飾することが、一般に行われており、前記核酸を含有するカチオニックリピッドパーティクル、カチオニックポリマー、核酸封入リピッドパーティクル等においても、PEG修飾リピッドパーティクルとすることができる。
投与経路としては、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口または、例えば静脈内等の非経口を挙げることができる。
投与形態としては、例えば錠剤、注射剤等が挙げられる。
経口投与に適当な、例えば錠剤等は、乳糖等の賦形剤、澱粉等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、ヒドロキシプロピルセルロース等の結合剤等を用いて製造できる。
非経口投与に適当な、例えば注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩溶液とブドウ糖溶液の混合液等を用いて製造できる。
本発明のオリゴヌクレオチドの投与量及び投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度等により異なるが、通常、静脈内投与等の非経口投与の場合、成人1人当たり0.001〜100 mg、好ましくは0.01〜10 mgを一日一回ないし数回投与する。しかしながら、これら投与量及び投与回数は、前述の種々の条件により変動する。
以下に、本発明の態様を実施例及び参考例で説明する。特に記載のない場合、用いた原料及び試薬は市販品として、または既知の方法に準じて得た。なお、本発明はこれら実施例及び参考例に限定されるものではない。
実施例１
表8に示すアンチセンス鎖の5’末端に8-ブロモ-2’-デオキシアデノシン一リン酸(8-Br-dA)を有する、ルシフェラーゼ標的siRNA(アンチセンス鎖の配列に含まれるXは、8-Br-dAを意味する)の合成を、核酸合成装置(Ultra Fast Parallel Syntheizer、シグマ社製、以下UFPS)を用いて、0.5μmolスケールで行った。固相担体にはCPG 500オングストローム, rA.rG(tac), SAFC-PROLIGOを用いた。DMT-2’-O-TBDMS-rA(tac)アミダイト(SAFC-PROLIGO社)、DMT-2’-O-TBDMS-rG(tac)アミダイト(SAFC-PROLIGO社)、DMT-2’-O-TBDMS-rC(tac)アミダイト(SAFC-PROLIGO社)、及びDMT-2’-O-TBDMS-rUアミダイト(SAFC-PROLIGO社)は0.1mol/Lアセトニトリル溶液、8-Br-dA-CE ホスホロアミダイト(Glen Research社)は0.1mol/Lアセトニトリル溶液、化学的リン酸化試薬II(GlenResearch社)は0.06mol/Lアセトニトリル溶液に調製して縮合反応に用いた。ホスホロアミダイトのアクチベーターとして5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(SAFC-PROLIGO社)を用い、縮合時間は、各10分間とした。トリチルオフにて合成後、28%アンモニア溶液に浸し、55 ℃で4時間放置した。減圧下濃縮し、31%トリエチルアミン三フッ化水素酸塩を加えて、65 ℃で3時間放置した後、1-ブタノールを加えて反応を停止した。逆相液体クロマトグラフィー(SHISEIDO, CAPSELL PAK C18, SG300, 6.0 mmx75 mm、5%アセトニトリル/0.1%酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液, B液:50%アセトニトリル/水によるグラジエント)を用いて精製し、目的のオリゴヌクレオチドを得た。
得られた1本鎖のオリゴヌクレオチドは、混合緩衝液[100mmol/L酢酸カリウム、30 mmol/L 2-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]エタンスルホン酸、HEPES)-KOH(pH7.4)、2 mmol/L酢酸マグネシウム]に溶解し、濃度50 μmol/Lとした。センス鎖、アンチセンス鎖を各々等量混合し、80 ℃で10分間静置した。徐々に温度を下げ、37 ℃で1時間静置し、2本鎖オリゴヌクレオチドを得た。
実施例1-1
表22および表40に示すアンチセンス鎖の5’末端に8-ブロモ-2’-デオキシアデノシン一リン酸(8-Br-dA)を有する、ルシフェラーゼ標的siRNA(アンチセンス鎖の配列に含まれるXは、8-Br-dAを意味する)の合成を、核酸合成装置(Ultra Fast Parallel Syntheizer、シグマ社製、以下UFPS)を用いて、0.5μmolスケールで行った。固相担体にはCPG 500オングストローム, rA.rG(tac), SAFC-PROLIGOを用いた。DMT-2’-O-TBDMS-rA(tac)アミダイト(SAFC-PROLIGO社)、DMT-2’-O-TBDMS-rG(tac)アミダイト(SAFC-PROLIGO社)、DMT-2’-O-TBDMS-rC(tac)アミダイト(SAFC-PROLIGO社)、及びDMT-2’-O-TBDMS-rUアミダイト(SAFC-PROLIGO社)は0.1mol/Lアセトニトリル溶液、8-Br-dA-CE ホスホロアミダイト(Glen Research社)は0.1mol/Lアセトニトリル溶液、化学的リン酸化試薬II(GlenResearch社)は0.06mol/Lアセトニトリル溶液に調製して縮合反応に用いた。ホスホロアミダイトのアクチベーターとして5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(SAFC-PROLIGO社)を用い、縮合時間は、各10分間とした。トリチルオフにて合成後、28%アンモニア溶液に浸し、室温で4時間放置した。減圧下濃縮し、31%トリエチルアミン三フッ化水素酸塩を加えて、65 ℃で3時間放置した後、1-ブタノール及び酢酸ナトリウム水溶液を加えた。遠心操作後に上清を除去し、得られた残渣をエタノールで2回洗浄した。残渣を再び水に溶解し、逆相液体クロマトグラフィー(SHISEIDO,CAPSELLPAK C18, SG300, 6.0 mmx75 mm、A液:5%アセトニトリル/0.1%酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液, B液:50%アセトニトリル/水によるグラジエント)を用いて精製し、目的のオリゴヌクレオチドを得た。
得られた1本鎖のオリゴヌクレオチドは、混合緩衝液[100mmol/L酢酸カリウム、30 mmol/L 2-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]エタンスルホン酸、HEPES)-KOH(pH7.4)、2 mmol/L酢酸マグネシウム]に溶解し、濃度50 μmol/Lとした。センス鎖、アンチセンス鎖を各々等量混合し、80 ℃で10分間静置した。徐々に温度を下げ、37 ℃で1時間静置し、2本鎖オリゴヌクレオチドを得た。

試験例1:ルシフェラーゼ標的siRNAのRNAi活性
実施例1で得られたアンチセンス鎖の5’末端に8-Br-dAを有する、ルシフェラーゼ標的siRNAのRNAi活性を、以下に示したようにルシフェラーゼ発光抑制レベルを指標に評価した。
培養ディッシュ(コスター (Costar)社製アッセイプレート, 96ウェル, 蓋つき、型番3917)で、ルシフェラーゼ発現ベクター(pGL4.50 [luc2/CMV/Hygro] Vector、プロメガ(Promega)社)を導入したヒト子宮頸がん由来細胞株ヒーラ(Hela)細胞(CCL-2、ATCCより購入)を、10%ウシ胎仔血清を含むアールピーエムアイ(RPMI)培地(インビトロジェン(Invitrogen Life technologies)、11875093)中に懸濁し、1ウェルあたり5000細胞数となるように50μLの細胞懸濁液を各ウェルに播種した。
siRNAをオプティ-MEM(OPTI-MEM)(インビトロジェン (Invitrogen Life technologies)、31985-070)で希釈した。リポフェクタミンRNAi マックス (lipofectamine RNAiMAX、インビトロジェン(Invitrogen Life technologies)、13778-075)をオプティ-MEM(OPTI-MEM)で希釈した。調製したそれぞれの希釈液を混合し、siRNAとリポフェクタミンRNAi マックス複合体を形成させた。細胞懸濁液を含む各ウェルに、調製したsiRNA-ポフェクタミンRNAi マックス(インビトロジェン(InvitrogenLifetechnologies)、13778-075)複合体溶液を10μL添加することでsiRNAをヒーラ(Hela)細胞に導入した。siRNAの最終濃度は100pmol/Lの1点、または3.2 pmol/L、16pmol/L、80 pmol/L及び400 pmol/Lの4点とし、N=6で設定した。また陰性対照群としてリポフェクタミンRNAi マックスのみを添加した細胞を播種した。また、比較のために、各siRNAの8-Br-dAに相当する位置にアデノシン一リン酸を有するsiRNA(それぞれ239-A、874-A、904-A、1084-A、1203-A及び1556-Aという、表23)についても同様に試験を行った。さらに、874-BrdAの8-Br-dAに相当する位置にグアノシン一リン酸、シチジン一リン酸またはウリジン一リン酸を有するsiRNA(874-G、874-C及び874-Uという、表24)についても同様に試験を行った。


siRNA導入後の細胞は、37 ℃、5%CO2条件下で24時間培養した。
培養後の細胞に対して市販ルシフェラーゼ定量試薬であるステディーグロルシフェラーゼアッセイシステム(Steady-GloLuciferase Assay System、プロメガ(Promega)、 E2520)を、添付のプロトコルに則り各ウェルに40μL添加した。10分間のインキュベーション後、ARVO (パーキンエルマー (PerkinElmer))でプロトコルに則り、各ウェルの1秒あたり発光量(cps)を測定した。
ルシフェラーゼ標的siRNA処理群の発光量と同時に、陰性対照群の発光量も測定することでsiRNA導入検体のRNAi効果を、siRNA未導入群(陰性対照群)における発光量を1としたときの相対的な割合として表した。
本試験の結果を図1及び図2に示す。図1は、最終濃度100 pmol/Lにおける、本発明のsiRNAとその配列中の8-Br-dAに相当する位置にアデノシン一リン酸を有するsiRNAとの比較を示す図である。図2は、最終濃度3.2 pmol/L、16 pmol/L、80 pmol/L及び400 pmol/Lにおける、本発明のsiRNAである874-BrdAと、その配列中の8-Br-dAに相当する位置にアデノシン一リン酸、グアノシン一リン酸、シチジン一リン酸またはウリジン一リン酸を有する874-A、874-G、874-C及び874-Uとの比較を示す図である(図1及び2において、縦軸は陰性対照群の発光量を1とした場合の発光比率である)。なお、クラスカル-ウォリス検定(Kruskal-Wallistest)により有意差の有無を判断した。統計解析には、統計解析ソフトサス(SAS、リリース 9.2、サスインスティチュート (SASInstitute Inc.))を用いた。表25に、239-BrdA、874-BrdA、904-BrdA、1084-BrdA、1203-BrdA及び1556-BrdAによる発光抑制率を、それぞれ239-A、874-A、904-A、1084-A、1203-A及び1556-Aによる発光抑制率と比較した有意差検定の結果を示す。いずれも0.05以下のp値を示し、アデノシン一リン酸を8-Br-dAに置換したsiRNAでは、発光抑制率が有意に向上したことがわかる。

試験例2:ルシフェラーゼ標的siRNAのRNAi活性
実施例1で得られたアンチセンス鎖の5’末端に8-Br-dAを有する、ルシフェラーゼ標的siRNAのRNAi活性を、以下に示したようにルシフェラーゼ ジーエルフォー メッセンジャーRNA(LuciferaseGL4 mRNA)(ジェンバンク アクセッション番号 EU921840)の発現抑制効果を測定して評価した。
培養ディッシュ(ヌンク (Nunc)社製マルチディッシュ24ウェル、型番142475)で、ヒト子宮頸がん由来細胞株ヒーラ細胞(CCL-2、ATCCより購入)を10%ウシ胎仔血清を含むアールピーエムアイ(RPMI)培地(インビトロジェン(Invitrogen Life technologies)、11875093)中に懸濁し、1ウェルあたり50000細胞数となるように500μLの細胞懸濁液を各ウェルに播種した。そこに、オプティ-MEM(OPTI-MEM)(インビトロジェン(InvitrogenLifetechnologies)、31985-070)中で混合したsiRNA-リポフェクタミン RNAiマックス(インビトロジェン(InvitrogenLife technologies)、13778-075)複合体溶液を100μL添加することでsiRNAをヒーラ (Hela)細胞に導入した。siRNAの最終濃度は10000 pmol/L、2000 pmol/L、400 pmol/L、80 pmol/L、16 pmol/L、3.2pmol/L、0.64 pmol/Lの7点とした。また陰性対照群としてリポフェクタミンRNAi マックスのみを添加した細胞を播種した。
siRNA導入後の細胞は、37 ℃、5%CO2条件下で24時間培養した。RNAの回収にはキアゲン (QIAGEN)社RNA抽出キット(アールエヌイージー（RNeasy）、74106)を用い、培養後の細胞をリン酸緩衝液で1回洗浄した後、細胞をRNeasyキット添付のRLT バッファー(アールエヌイージー（RNeasy）添付)に溶解して回収し、キットに添付された説明書に従って全RNAを回収した。全RNA 1 μgを鋳型として、トランスクリプターファーストストランドcDNA合成キット (Transcriptor First StrandcDNASynthesis Kit(ロシュ (Roche)社4897030001)を用いて逆転写反応を行い、cDNAを作成した。このcDNAをPCR反応の鋳型に用い、ABI7900HT Fast(アプライドバイオシステムズ (ABI)社)を用いたタックマンプローブ (Taqman probe)法によりGL4 (ジェンバンク アクセッション番号 EU921840)遺伝子及び対照としてD-グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵(D-Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase、GAPDH、ジェンバンク アクセッション番号 NM_001256799)をPCR反応させてmRNA増幅量をそれぞれ測定し、GAPDHのmRNA増幅量を内部対照として、GL4のmRNAの準定量値を算出した。GAPDHの測定には、タックマンプローブHs99999905 m1(アプライドバイオシステムズ (ABI)社)を用いた。GL4の測定には、ユニバーサルプローブライブラリーのプローブ#20(ロシュ社 (Roche) 04686934001)及び、増幅プライマーとして、配列番号63で表される塩基配列を有するDNA(フォワードプライマー)、配列番号64で表される塩基配列を有するDNA(リバースプライマー)を用いた。また、陰性対照群における、GL4のmRNA量及びGAPDHのmRNA増幅量を同様にそれぞれ測定し、GAPDHのmRNA増幅量を内部対照として、GL4のmRNAの準定量値を算出した。 siRNA導入検体の標的mRNA量は、siRNA未導入群(陰性対照群)における、GL4のmRNA量を1としたときの相対的な割合として表した。
IC50値はロジット法により算出した。統計解析は統計解析ソフトサス (SAS、リリース 9.2、サスインスティチュート (SAS Institute Inc.))を用いて行った。
表26に、本発明のsiRNAである874-BrdAと、比較として、その配列中の8-Br-dAに相当する位置にアデノシン一リン酸またはウリジン一リン酸を有する874-A及び874-UのIC50値を示す。

試験例1及び2の結果から、アンチセンス鎖の5’末端に8-Br-dAを有するsiRNA(874-BrdA)は、アンチセンス鎖の5’末端に対応する天然型のヌクレオチドを有するsiRNAと比較して、ルシフェラーゼ発現に対して高いノックダウン活性を示すことが分かる。
実施例2
表27に示すアンチセンス鎖の5’末端に8-オキソ-2’-デオキシアデノシン一リン酸を有する、ルシフェラーゼ標的siRNA(874-8-oxo-dAという、アンチセンス鎖の配列に含まれるXは、8-オキソ-2’-デオキシアデノシン一リン酸を意味する)を、市販の8-オキソ-dA-CE ホスホロアミダイトを用いて、実施例1と同様に合成して得た。
実施例3
表27に示すアンチセンス鎖の5’末端に5-ブロモ-2’-デオキシウリジン一リン酸を有するsiRNA(874-5-Br-dUという、アンチセンス鎖の配列に含まれるXは、5-ブロモ-2’-デオキシウリジン一リン酸を意味する)を、市販の5-Br-dU-CE ホスホロアミダイトを用いて、実施例1と同様に合成して得た。
実施例4
表27に示すアンチセンス鎖の5’末端に5-フルオロ-2’-デオキシウリジン一リン酸を有するsiRNA(454-5-F-dUおよび1556-5-F-dUという、アンチセンス鎖の配列に含まれるXは、5-フルオロ-2’-デオキシウリジン一リン酸を意味する)を、市販の5-F-dU-CEホスホロアミダイトを用いて、実施例1と同様に合成して得た。
MALDI-TOF/MS
454-5-F-dU(アンチセンス鎖) 理論値6668.85(M-H)実測値 6673.35
1556-5-F-dU(アンチセンス鎖) 理論値6669.03(M-H)実測値 6671.33

試験例3:ルシフェラーゼ標的siRNAのRNAi活性
実施例4で得られたルシフェラーゼ標的siRNA(表27、Xの位置に5-F-dUを有する) のRNAi活性を、試験例2と同様に測定して評価した。それぞれアンチセンス鎖の5’末端に対応する天然型のヌクレオチドを有するsiRNA(表28)と比較した。
表29に、それぞれのIC50値を示す。


試験例3の結果から、アンチセンス鎖の5’末端に5-フルオロ-2’-デオキシウリジン一リン酸を有するsiRNA(454-5-F-dU及び1556-5-F-dU)は、それぞれアンチセンス鎖の5’末端に対応する天然型のヌクレオチドを有するsiRNAと比較して、ルシフェラーゼ発現に対して高いノックダウン活性を示すことが分かる。
実施例5
表30に示すアンチセンス鎖の5’末端に8-オキソ-2’-デオキシアデノシン一リン酸を有する、D-グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(D-Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase、GAPDH)標的siRNA(アンチセンス鎖の配列に含まれるXは、8-オキソ-2’-デオキシアデノシン一リン酸を意味する)を、実施例1と同様に合成して得た。

試験例4: D-グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(D-Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、GAPDH)標的siRNAのRNAi活性
アンチセンス鎖の5’末端に8-Br-dAを有する、GAPDH標的siRNAのRNAi活性を、以下に示したようにGAPDH mRNAの発現抑制効果を測定して評価した。
培養ディッシュ(ヌンク (Nunc)社製マルチディッシュ 24ウェル、型番142475)で、ヒト子宮頸がん由来細胞株ヒーラ (Hela)細胞(CCL-2、ATCCより購入)を10%ウシ胎仔血清を含むアールピーエムアイ(RPMI)培地(インビトロジェン(InvitrogenLife technologies)、11875093)中に懸濁し、1ウェルあたり50000細胞数となるように500μLの細胞懸濁液を各ウェルに播種した。そこに、オプティ-MEM(OPTI-MEM)(インビトロジェン (Invitrogen Life technologies)31985-070)中で混合したsiRNA-リポフェクタミンRNAiマックス (Lipofectamine RNAiMAX、インビトロジェン13778-075)複合体溶液を100μL添加することでsiRNAをヒーラ (Hela)細胞に導入した。siRNAの最終濃度は100 pmol/Lの1点とした。また陰性対照の群としてリポフェクタミンRNAi マックスのみを添加した細胞を播種した。
siRNA導入後の細胞は、37 ℃、5%CO2条件下で24時間培養した。RNAの回収はキアゲン社RNA抽出キット(アールエヌイージー（RNeasy） 74106)を用い、培養後の細胞はリン酸バッファーで1回洗浄した後、細胞をRNeasyキット添付のRLT バッファー(アールエヌイージー（RNeasy）添付)に溶解して回収し、キットに添付された説明書に従って全RNAを回収した。全RNA 1μgを鋳型として、トランスクリプターファーストストランドcDNA合成キット (Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、ロシュ社、4897030001)を用いて逆転写反応を行い、cDNAを作成した。このcDNAをPCR反応の鋳型に用い、ABI7900HTFast(ABI社)を用いたタックマンプローブ法によりGADPH遺伝子及び対照としてペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ（PPIB）(pepytidyl-prolyl cis-trans isomeraseB)遺伝子(ジェンバンク アクセッション番号NM_000942)をPCR反応させてmRNA増幅量をそれぞれ測定し、PPIBのmRNA増幅量を内部対照として、GAPDHのmRNAの準定量値を算出した。GAPDHの測定には、タックマンプローブHs99999905 m1(アプライドバイオシステムズ (ABI)社)、PPIBの測定には、Hs01018502 m1(アプライドバイオシステムズ (ABI)社)を用いた。また、陰性対照の群における、GAPDHのmRNA量及びPPIBのmRNA増幅量を同様にそれぞれ測定し、PPIBのmRNA増幅量を内部対照として、GAPDHのmRNAの準定量値を算出した。
siRNA導入検体の標的mRNA量は、siRNA未導入群(陰性対照群)における、GAPDHのmRNA量を1としたときの相対的な割合として表した。
また、比較のために、各siRNAの8-Br-dAに相当する位置にアデノシン一リン酸を有するsiRNA(表31)についても同様に試験を行った。
本試験の結果を表32および図3に示す。


試験例4の結果から、アンチセンス鎖の5’末端に8-Br-dAを有するD-グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(D-Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase、GAPDH)標的siRNAは、アンチセンス鎖の5’末端に対応する天然型のヌクレオチドを有するsiRNAと比較して、GAPDHの発現に対して高いノックダウン活性を示すことが分かる。
実施例6
表33に示すアンチセンス鎖の5’末端に5-フルオロ-2’-デオキシウリジン一リン酸を有する、D-グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(D-Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase、GAPDH)標的siRNA(アンチセンス鎖の配列に含まれるXは、5-フルオロ-2’-デオキシウリジン一リン酸を意味する)を用いて、実施例1と同様に合成して得た。
MALDI-TOF/MS
1096-5-F-dU(アンチセンス鎖) 理論値6801.03(M-H)実測値 6797.74

試験例 5 D-グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(D-Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、GAPDH)標的siRNAのRNAi活性
実施例6で得られたGAPDDH標的siRNAの活性を、試験例4と同様にGAPDHmRNAの発現抑制効果を測定して評価した。
siRNA導入検体の標的mRNA量は、siRNA未導入群(陰性対照群)における、GAPDHのmRNA量を1としたときの相対的な割合として表した。GAPDHのmRNA量は、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1、HPRT1、ジェンバンク アクセッション番号NM_000194)のmRNA増幅量を内部対照として、算出した。HPRT1の測定には、タックマンプローブHs99999909_m1(アプライドバイオシステムズ (ABI)社)を用いた。
また、比較のために、各siRNAのアンチセンス5’末端にウラシル一リン酸、アデノシン一リン酸またはグアニン一リン酸を有するsiRNA(表33)についても同様に試験を行った。
本試験の結果を表34に示す。

試験例5の結果から、アンチセンス鎖の5’末端に5-フルオロ-2’-デオキシウリジン一リン酸を有するD-グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(D-Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase、GAPDH)標的siRNAは、アンチセンス鎖の5’末端に対応する天然型のヌクレオチドを有するsiRNAと比較して、GAPDHの発現に対して高いノックダウン活性を示すことが分かる。
参考例1.0; 化合物I-5
工程1
市販の6,7-ジメトキシキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオン(220 mg、0.991 mmol)、1-O-アセチル-2,3,5-トリ-O-ベンゾイル-β-D-リボフラノース(500 mg、0.991 mmol)をアセトニトリル(5 mL)に溶解し、N,O-ビス(トリメチルシリル)アセトアミド(0.735 mL、2.97mmol)を加えて60℃で20分間攪拌した。反応液を室温に冷却後、メタンスルホニルトリメチルシリル(0.627 mL、3.47 mmol) を加えて60℃で1時間攪拌した。反応液を室温に冷却後、飽和重曹水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下で溶媒を留去して得られた残渣をヘプタン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製することにより、(2R,3R,4R,5R)-2-((ベンゾイルオキシ)メチル)-5-(6,7-ジメトキシ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイル ジベンゾエート(599 mg、収率91 %)を得た。
工程2
工程1で得られた(2R,3R,4R,5R)-2-((ベンゾイルオキシ)メチル)-5-(6,7-ジメトキシ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイル ジベンゾエート(599 mg、0.899 mmol)をメタノール(9 mL)に溶解し、メチルアミン/メタノール溶液(4.58 mL、44.9 mmol)を加えて室温で終夜攪拌した。減圧下、溶媒を留去して得られた残渣にジエチルエーテルを加え、析出物を濾取することにより、1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-6,7-ジメトキシキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオン(312 mg、収率98 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 353(M-1)
工程3
工程2で得られた1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-6,7-ジメトキシキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオン(310 mg、0.875 mmol)をアセトン(15 mL)に懸濁し、2,2-ジメトキシプロパン(0.536 mL, 4.37 mmol)、4-トルエンスルホン酸 一水和物(183 mg、0.962 mmol)を加え、室温で2時間攪拌した。反応液に飽和重曹水を加えた後、溶媒量が約半分になるまで減圧下で溶媒を留去し、得られた残渣をクロロホルム/メタノール系のカラムクロマトグラフィーで精製することにより、1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(ヒドロキシメチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)-6,7-ジメトキシキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオン(315 mg、収率91 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 395(M+1)
工程4
工程3で得られた1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(ヒドロキシメチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)-6,7-ジメトキシキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオン(310 mg、0.786 mmol)をジクロロメタン(8 mL)に溶解し、1H-テトラゾール(138 mg、1.97mmol)、ジ-tert-ブチル ジイソプロピルホスホールアミド(0.522 mL、1.57 mmol)を加え、室温で5時間攪拌した。反応液を0℃に冷却し、m-クロロ過安息香酸(452mg、1.97 mmol)を加え、0℃でさらに20分間攪拌した。反応液に飽和重曹水を加え、クロロホルムで抽出した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下で溶媒を留去することにより得られた残渣をヘプタン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製することにより、リン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6,7-ジメトキシ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(259 mg、収率56 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 587(M+1)
工程5
工程4で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6,7-ジメトキシ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(77.5 mg、0.132 mmol)をトリフルオロ酢酸/水(1:1)(2 mL)に溶解し、室温で2時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去した後、酢酸-トリエチルアミン緩衝液(pH 6.5)(2mL)を加え、再度減圧下、溶媒を留去した。得られた残渣をエタノールに溶解し、酢酸エチルを加え、析出物を濾取することにより、リン酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6,7-ジメトキシ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-5) トリエチルアンモニウム塩(64.9 mg、収率92 %)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 7.43(s, 1H), 6.91(s, 1H),6.08(d,J= 4.0 Hz, 1H), 4.77 - 4.58(m, 1H), 4.38(t, J= 7.3 Hz, 1H), 4.04 -4.02(m, 3H),3.90(s, 3H), 3.81(s, 3H), 3.08(q, J= 7.3 Hz, 6H), 1.16(t, J=7.3 Hz,9H).
ESI-MS(m/z): 435(M+1)
参考例1.1; 化合物am-1
工程1
参考例1.0の工程2で得られる1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-6,7-ジメトキシキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオン(812 mg、2.29 mmol)をDMF(10.0 mL)に溶解し、氷冷下ビス(トリフルオロメタンスルホン酸)ジ-tert-ブチルシリル(1.00 mL、2.75 mmol)を加えた後、氷冷下6時間攪拌した。反応混合物に飽和重曹水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣を酢酸エチル/ヘプタン系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、1-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-ヒドロキシテトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル]-6,7-ジメトキシキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオン(1.08 g、95.0 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 493(M-1)
工程2
工程1で得られた1-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-ヒドロキシテトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6,7-ジメトキシキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオン(1.73 mg、3.50 mmol)をDMF(18.0 mL)に溶解し、イミダゾール(1.19 g、17.5 mmol)、tert-ブチルジメチルシリルクロリド(791 mg、5.25 mmol)を加えた後、60 ℃で3時間攪拌した。反応混合物に飽和重曹水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣を酢酸エチル/ヘプタン系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6,7-ジメトキシキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオン(1.95 g、92.0 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 607(M-1)
工程3
工程2で得られた1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6,7-ジメトキシキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオン(500 mg、0.821 mmol)をジクロロメタン(8.00 mL)に溶解し、氷冷下ピリジン(0.531 mL、6.57 mmol)、フッ化水素-ピリジン(0.423 mL, 3.28 mmol)を加え、氷冷下1時間攪拌した。反応混合物に飽和重曹水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣を酢酸エチル/ヘプタン系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、1-((2R,3R,4R,5R)-3-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-4-ヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-6,7-ジメトキシキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオン(336 mg、87.0 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 467(M-1)
工程4
工程3で得られた1-((2R,3R,4R,5R)-3-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-4-ヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-6,7-ジメトキシキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオン(85.0 mg, 0.181 mmol)をピリジン(2.00 mL)に溶解し、p,p'-ジメトキシトリチルクロリド(184 mg、0.544 mmol)、4-ジメチルアミノピリジン(4.43 mg、0.0360 mmol)を加え、室温で1時間攪拌した。反応混合物に飽和重曹水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣を酢酸エチル/ヘプタン系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、1-((2R,3R,4R,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-3-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)-6,7-ジメトキシキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオン(138 mg、99.0 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 769(M-1)
工程5
工程4で得られた1-((2R,3R,4R,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-3-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)-6,7-ジメトキシキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオン(74.0 mg、 0.0960 mmol)をTHF(2.00 mL)に溶解し、氷冷下ジイソプロピルアミン(0.084 mL, 0.480 mmol)、クロロ(ジイソプロピルアミノ)亜ホスフィン酸2-シアノエチル(0.043mL、0.192 mmol)を加えた後、室温で3時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去し、残渣を酢酸エチル/ヘプタン系のアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製後、さらに酢酸エチル/ヘプタン系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(6,7-ジメトキシ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-1、63.0 mg、 67.6%)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 300MHz) δ: 7.94 (1H, br s), 7.55 (1H,s),7.47-7.39 (2H, m), 7.38-7.12 (7H, m), 6.93 (1H, s), 6.81-6.70 (4H,m),5.94-5.89 (1H, m), 5.18-5.08 (1H, m), 4.53-4.38 (1H, m), 4.37-4.26 (1H,m),3.98-3.69 (12H, m), 3.67-3.48 (4H, m), 3.46-3.23 (2H, m), 2.68-2.52 (1H,m),2.35-2.27 (1H, m), 1.20-1.00 (12H, m), 0.83, 0.81 (9H, 2 s), 0.05, 0.03,-0.09,-0.10 (6H, 4 s).
ESI-MS(m/z): 971(M+1)
実施例7
後述の表38に示す454-Xuのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-5を有するsiRNAを、参考例1.1で得られる化合物am-1を用いて、実施例1と同様に合成した。
MALDI-TOF/MS(アンチセンス鎖)：理論値6776.96(M-H)実測値 6776.21
参考例2.0; 化合物I-6
市販の6-クロロキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1.0と同様にしてリン酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-クロロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-6)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 7.88(d, J=1.8 Hz, 1H), 7.64(dd,J=9.2, 2.6 Hz, 1H), 7.58(d, J= 9.2 Hz, 1H), 6.14(d, J= 5.5 Hz, 1H),4.70-4.68(m,1H), 4.37(t, J=5.9 Hz, 1H), 4.09-4.02(m, 3H).
ESI-MS(m/z): 409(M+1)
参考例2.1:化合物am-2
市販の6-クロロキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1.1と同様にして(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(6-クロロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-2)を得る。
実施例8
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-6を有するsiRNAを、参考例2.1で得られる化合物am-2を用いて、実施例1と同様に合成する。
参考例3.0; 化合物I-7
市販の7-クロロキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1.0と同様にしてリン酸((2R,3S,4R,5R)-5-(7-クロロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-7)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 7.95(d, J=8.4 Hz, 1H), 7.61(s,1H),7.30(d, J=8.4 Hz, 1H), 5.99(d, J= 4.4 Hz, 1H), 4.79(t, J= 5.3 Hz, 1H),4.38(t,J= 6.4 Hz, 1H), 4.04-3.92(m, 3H).
ESI-MS(m/z): 409(M+1)
参考例3.1:化合物am-3
市販の7-クロロキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1.1と同様にして(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(7-クロロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-3)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 500MHz) δ: 8.11(d, J=8.5 Hz,1H),7.67(7.63)(d, J= 1.7 Hz, 1H), 7.45-6.76(m, 14H), 6.02(m, 1H),5.12(5.07)(m,1H), 4.45(m, 1H), 4.32(4.28)(m, 1H), 3.97-3.25(m, 12H),2.70-2.23(m, 2H),1.21-1.01(m, 12H), 0.80(0.82)(s, 9H), 0.03(0.05)(s, 3H),-0.12(s, 3H).
実施例9
後述の表38に示す454-Xuのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-7を有するsiRNAを、参考例3.1で得られる化合物am-3を用いて、実施例1と同様に合成した。
MALDI-TOF/MS(アンチセンス鎖)： 理論値6751.35(M-H)実測値 6751.83
参考例4.0; 化合物I-8
市販の5-クロロキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1.0と同様にしてリン酸((2R,3S,4R,5R)-5-(5-クロロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-8)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 7.66(d, J=4.8 Hz, 2H), 7.40(t,J=4.4 Hz, 1H), 6.21(d, J= 5.5 Hz, 1H), 4.80(t, J= 5.9 Hz, 1H), 4.45(t, J= 5.9Hz,1H), 4.09(dd, J= 14.5, 7.1 Hz, 3H).
ESI-MS(m/z): 409(M+1)
参考例4.1:化合物am-4
市販の5-クロロキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1.1と同様にして(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(5-クロロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-4)を得る。
実施例10
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-8を有するsiRNAを、参考例4.1で得られる化合物am-4を用いて、実施例1と同様に合成する。
参考例5.0; 化合物I-9
市販のチエノ[3,2-d]ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1.0と同様にしてリン酸(2R,3S,4R,5R)-5-(2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロチエノ[3,2-d]ピリミジン-1(2H)-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-9) トリエチルアンモニウム塩を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 7.96(d, J=5.5 Hz, 1H), 7.45(d,J=4.8 Hz, 1H), 6.14(d, J= 6.2 Hz, 1H), 4.73-4.56(m, 1H), 4.35(t, J=5.7 Hz,1H),4.09(brs, 1H), 4.02(t, J=4.8 Hz, 2H), 3.07(q, J= 7.3 Hz, 6H), 1.15(t, J=7.3Hz, 9H).
ESI-MS(m/z): 381(M+1)
参考例5.1:化合物am-5
市販のチエノ[3,2-d]ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1.1と同様にして(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロチエノ[3,2-d]ピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-5)を得る。
実施例11
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-9を有するsiRNAを、参考例5.1で得られる化合物am-5を用いて、実施例1と同様に合成する。
参考例6.0; 化合物I-10
工程1
公知の方法[ジャーナル・オブ・メディシナルケミストリー(J.Med.Chem.)、2012年,55巻,1478-1489頁]に記載された方法で合成した(2R,3R,4R,5R)-2-(アセトキシメチル)-5-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイル ジアセテート(10.9 g、26.4 mmol)から、公知の方法[ジャーナル・オブ・オーガニックケミストリー(J.Org.Chem.)、2002年、67巻、6788-6796頁]に記載された方法で(2R,3R,4S,5R)-2-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-3,4-ジオール(5.47g、収率72 %)を得た。
(2R,3R,4S,5R)-2-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-3,4-ジオール(5.48 g、19.1mmol)をアセトン(200 mL)に懸濁し、2,2-ジメトキシプロパン(11.7 mL、95.5 mmol)、4-トルエンスルホン酸 一水和物(9.09 g、47.8 mmol)を加え、室温で2時間攪拌した。反応液に飽和重曹水を加えた後、溶媒量が約半分になるまで減圧下で溶媒を留去した。クロロホルムを加え抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶媒を留去して得られた残渣をヘプタン/酢酸エチル系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(5.17 g、収率83%)を得た。
ESI-MS(m/z): 327(M+1)
工程2
工程1で得られた((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(150 mg、0.459mmol)、(E)-スチリルボロン酸(136 mg、0.918mmol)、1,1′-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン-パラジウム(II)ジクロリド-ジクロロメタン錯体(37.5 mg、0.031mmol)、炭酸セシウム(449 mg、1.38 mmol)に1,4-ジオキサン(2 mL)、水(1滴)を加え、窒素雰囲気下、80℃で3時間攪拌した。反応液を室温に冷却後、飽和食塩水を加え、酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下で溶媒を留去して得られた残渣をヘプタン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製することにより((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-ジメチル-6-(6-((E)-スチリル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(90.1 mg、収率50 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 395(M+1)
工程3
工程2で得られた((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-ジメチル-6-(6-スチリル-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(90 mg、0.228 mmolをジクロロメタン(2 mL)に溶解し、1H-テトラゾール(32.0 mg,、0.456mmol)、ジ-tert-ブチル ジイソプロピルホスホールアミド(0.144 mL、0.456 mmol)を加えて、0℃で2時間攪拌した。反応液に、m-クロロ過安息香酸(141 mg、0.612mmol)を加えて0℃で15分間攪拌した。反応液に飽和重曹水と飽和食塩水を加え、クロロホルムで抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒を留去して得られた残渣をヘプタン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製することにより、リン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-ジメチル-6-(6-スチリル-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(E/Z幾何異性体混合物、73.2mg、収率55 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 587(M+1)
工程4
工程3で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-ジメチル-6-(6-スチリル-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(73.0 mg、0.124mmol)をトリフルオロ酢酸/水(1:1)(2 mL)に溶解し、室温で2時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去して得られた残渣に酢酸-酢酸アンモニウム緩衝液(pH 5.7)を加えた後、分取HPLC(溶離液 0.01mmol/L 酢酸アンモニウム水溶液/メタノール系)にて精製することにより得られた粗精製物に2-プロパノールを加え、析出物を濾取することにより、リン酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(6-((E)-スチリル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-10、21.3 mg、収率39 %)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 8.50(s, 1H), 8.42(s, 1H),7.58(d,J=15.6 Hz, 1H), 7.19 - 7.13(m, 2H), 7.08 - 6.97(m, 4H), 5.92(d, J= 4.9Hz, 1H),4.60 - 4.55(m, 1H), 4.38 - 4.34(m, 1H), 4.28 - 4.23(m, 1H), 4.10 -3.97(m, 2H).
ESI-MS(m/z): 435(M+1)
参考例6.1:化合物am-6
工程1〜2
市販の(2R,3R,4S,5R)-2-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-3,4-ジオールを用い、参考例1.1の工程1〜2と同様にして、6-クロロ-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリンを得た。
工程3
工程2で得られた6-クロロ-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリンを用い、参考例6.0の工程2と同様にして、9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-((E)-スチリル)-9H-プリンを得た。
工程4〜6
工程3で得られた9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-((E)-スチリル)-9H-プリンを用い、参考例1.1の工程3〜5と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-5-(6-((E)-スチリル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチル ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-6)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 8.81, 8.79 (1H, 2 s),8.43-8.35(1H, m), 8.33, 8.29 (1H, 2 s), 7.77-7.69 (3H, m), 7.53-7.32 (9H, m),7.31-7.18(3H, m), 6.85-6.78 (4H, m), 6.15-6.05 (1H, m), 5.15-5.08 (1H, m),4.48-4.35(2H, m), 4.03-3.84 (1H, m), 3.77 (6H, s), 3.70-3.53 (4H, m), 3.38-3.29(1H, m),2.72-2.59 (1H, m), 2.37-2.24 (1H, m), 1.23-1.03 (12H, m), 0.76, 0.75(9H, 2 s),-0.02, -0.05, -0.21, -0.21 (6H, 4 s).
実施例12
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-10を有する、ルシフェラーゼ標的siRNAの合成を、核酸合成装置(NS-8、ジーンデザイン社製)を用いて、0.2μmolスケールで行った。固相担体にはU-RNA-CPG (GLEN RESEARCH社)を用いた。DMT-2’-O-TBDMS-rA(Pac)アミダイト(GLEN RESEARCH社)、DMT-2’-O-TBDMS-rG(iPr-Pac)アミダイト(GLEN RESEARCH社)、DMT-2’-O-TBDMS-rC(ac)アミダイト(GLEN RESEARCH社)、及びDMT-2’-O-TBDMS-rUアミダイト(GLEN RESEARCH社)は0.1mol/Lアセトニトリル溶液、6-styryl-P ホスホロアミダイトは0.1 mol/Lアセトニトリル溶液、化学的リン酸化試薬II(GlenResearch社)は0.1mol/Lアセトニトリル溶液に調製して縮合反応に用いた。ホスホロアミダイトのアクチベーターとしてアクチベーター42(SAFC-PROLIGO社)を用い、縮合時間は、各16分間、遮光条件下で行った。トリチルオフにて合成後、28%アンモニア溶液に浸し、55 ℃で4時間放置した。減圧下濃縮し、31%トリエチルアミン三フッ化水素酸塩を加えて、65 ℃で2時間放置した後、NAP−10(GE−Healthcare社)にて得られた溶出物を逆相液体クロマトグラフィー(Waters, XBridge C18, 4.6 mmx250 mm、A液: 100 mMトリエチルアミン/酢酸緩衝液, B液:アセトニトリルによるグラジエント)にて精製し、目的のオリゴヌクレオチドを得た。LC-MS(ESI-MS)による多価イオン解析（デコンボリューション）から構造決定した。
得られた1本鎖のオリゴヌクレオチドは、混合緩衝液[10 mMトリス, 50 mM 塩化ナトリウム, 1mM エチレンジアミン4酢酸]に溶解し、核酸濃度を20μmol/Lとした。センス鎖、アンチセンス鎖を各々等量混合し、80 ℃で10分間静置した。徐々に温度を下げ、37 ℃で1時間静置し、2本鎖オリゴヌクレオチドを得た。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6777.01 実測値6777.19
参考例7.0; 化合物I-11
工程1
公知の方法[ジャーナル・オブ・メディシナルケミストリー(J.Med.Chem.)、2012年,55巻,1478-1489頁]に記載された方法で合成した(2R,3R,4R,5R)-2-(アセトキシメチル)-5-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイル ジアセテート(2.00 g、4.85 mmol)をTHF(15mL)に溶解し、ジメチルアミン塩酸塩(1.19 g、14.5mmol)とトリエチルアミン(2.70 mL、19.38mL)を加え、封管中、60℃で終夜攪拌した。反応液にジメチルアミン 塩酸塩(1.19 g、14.5 mmol)とトリエチルアミン(2.70 mL、19.38 mL)を加え、60℃でさらに終夜攪拌した。水を加えクロロホルムで抽出した後、減圧濃縮することにより(2R,3R,4R,5R)-2-(アセトキシメチル)-5-(6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイルジアセテート(2.2 g、収率 108 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 422(M+1)
工程2
工程1で得られた(2R,3R,4R,5R)-2-(アセトキシメチル)-5-(6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイルジアセテート(2.00 g、4.75 mmol)に7.0mol/L アンモニア/メタノール溶液(33.9 mL)を加え、室温で終夜攪拌した。減圧下で溶媒を留去して得られた残渣にエーテル/酢酸エチル混合液を加え、不溶物を濾取することにより(2R,3R,4S,5R)-2-(6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-9-イル)-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-3,4-ジオール(1.2g、収率86 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 296(M+1)
工程3
工程2で得られた(2R,3R,4S,5R)-2-(6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-9-イル)-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-3,4-ジオール(1.2g、4.06 mmol)を0.5M 酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液(pH 4.0)(40 mL)に懸濁し、臭素水(55.8 mL)を加え、室温で4時間攪拌した。反応液に、臭素の色が消えるまで硫酸水素ナトリウムを加え、炭酸ナトリウムで中和した。減圧下で溶媒量が約半分になるまで溶媒を留去し、不溶物を濾取した後、水、アセトンで順に洗浄し、減圧下で乾燥することにより(2R,3R,4S,5R)-2-(8-ブロモ-6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-9-イル)-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-3,4-ジオール(1.09g、収率72 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 374(M+1)
工程4
工程3で得られた(2R,3R,4S,5R)-2-(8-ブロモ-6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-9-イル)-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-3,4-ジオール(2.90 g、7.75mmol)をアセトン(39 mL)に懸濁し、2,2-ジメトキシプロパン(4.75 mL,38.8 mmol)、4-トルエンスルホン酸・一水和物(1.62 g、38.8 mmol)を加え、室温で終夜攪拌した。反応液に飽和重曹水と飽和食塩水を加えた後、溶媒量が約半分になるまで減圧下で溶媒を留去した。クロロホルムを加え抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、クロロホルムで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下で溶媒を留去することにより、((3aR,4R,6R,6aR)-6-(8-ブロモ-6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(1.96 g、収率61%)を得た。
ESI-MS(m/z): 414(M+1)
工程5
工程4で得られた((3aR,4R,6R,6aR)-6-(8-ブロモ-6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(200 mg、0.483 mmol)をジクロロメタン(2 mL)に溶解し、1H-テトラゾール(84.6 mg、1.21mmol)、ジ-tert-ブチル ジイソプロピルホスホールアミド(0.321 mL、0.966 mmol)を加え、室温で0.5時間攪拌した。反応液を0℃に冷却し、m-クロロ過安息香酸(222mg、0.966mmol)を加え、0℃でさらに15分間攪拌した。反応液に飽和重曹水、飽和食塩水を加え、クロロホルムで抽出した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下で溶媒を留去することにより得られた残渣をヘプタン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製することにより、リン酸((3aR,4R,6R,6aR)-6-(8-ブロモ-6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル ジ-tert-ブチル(209 mg、収率71 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 606(M+1)
工程6
工程5で得られたリン酸((3aR,4R,6R,6aR)-6-(8-ブロモ-6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル ジ-tert-ブチル(50.0 mg、0.082 mol))をトリフルオロ酢酸/水(1:1)(2 mL)に溶解し、室温で3時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去して得られた残渣に酢酸-酢酸アンモニウム緩衝液(pH 5.7)を加えた後、分取HPLC(溶離液 0.01mmol/L 酢酸アンモニウム水溶液/メタノール系)にて精製することにより得られた粗精製物にエタノールを加え、析出物を濾取することにより、リン酸((2R,3S,4R,5R)-6-(8-ブロモ-6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシトトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-11、26.2 mg、収率70 %)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 8.06 - 7.92(m, 1H), 5.98 -5.93(m,1H), 5.15 - 5.07(m, 1H), 4.43(dd, J= 5.9, 5.9 Hz, 1H), 4.09(dd, J= 9.8,4.9 Hz,1H), 3.99 - 3.91(m, 1H), 3.90 - 3.82(m, 1H), 3.30 - 3.12(m, 6H).
ESI-MS(m/z): 454(M+1)
参考例7.1:化合物am-7
参考例7.0の工程3で得られる(2R,3R,4S,5R)-2-(8-ブロモ-6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-9-イル)-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-3,4-ジオールを用い、参考例1.1と同様にして(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(8-ブロモ-6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-9-イル-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-7)を得る。
実施例13
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-11を有するsiRNAを、参考例7.1で得られる化合物am-7を用いて、実施例1と同様に合成する。
参考例8.0; 化合物I-12
工程1
参考例7.0の工程5で得られるリン酸((3aR,4R,6R,6aR)-6-(8-ブロモ-6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル ジ-tert-ブチル(100mg、0.165 mmol)をDMF(1.5 mL)に溶解し、テトラエチルアンモニウムシアニド(129 mg、0.824 mmol)を加え、100℃で2時間攪拌した。反応液を室温に冷却後、飽和食塩水を加え、酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去して得られた残渣を、ヘプタン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製することにより、リン酸((3aR,4R,6R,6aR)-6-(8-シアノ-6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル ジ-tert-ブチル(52.6 mg、58 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 558(M+1)
工程2
工程2で得られるリン酸((3aR,4R,6R,6aR)-6-(8-シアノ-6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル ジ-tert-ブチル(80.0 mg、0.145 mmol)をトリフルオロ酢酸/水(1:1)(4 mL)に溶解し、室温で3時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去して得られた残渣を、分取HPLC(溶離液 0.01mmol/L トリフルオロ酢酸水溶液/アセトニトリル系)にて精製した粗精製物にエタノールを加え、析出物を濾取することにより、リン酸((2R,3S,4R,5R)-6-(8-シアノ-6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシトトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-12、8.4 mg、収率15 %)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 8.05(s, 1H), 5.97(d, J= 5.9Hz,1H), 4.95 - 4.53(m, 1H), 4.37 - 4.29(m, 1H), 4.24 - 4.15(m, 1H), 4.06 -3.93(m,2H), 3.66 - 2.83(m, 6H).
ESI-MS(m/z): 401(M+1)
参考例8.1:化合物am-8
工程1〜2
参考例7.0の工程3で得られる(2R,3R,4S,5R)-2-(8-ブロモ-6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-9-イル)-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-3,4-ジオールを用い、参考例1.1の工程1〜2と同様にして、8-ブロモ-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-N,N-ジメチル-9H-プリン-6-アミンを得た。
ESI-MS(m/z): 628(M+1)
工程3
工程2で得られた8-ブロモ-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-N,N-ジメチル-9H-プリン-6-アミン(10.0 mg, 0.0160 mmol)をDMF(1.00 mL)に溶解し、シアン化ナトリウム(7,79 mg,0.159mmol)、フッ化セシウム(7.25 mg, 0.0480 mmol) を加え、100 ℃で4時間撹拌した。反応液に飽和重曹水を加え、酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下で溶媒を留去して得られた残渣をヘプタン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製することにより、9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-8-カルボニトリル(8.00 mg、収率44.8 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 575(M+1)
工程4〜6
工程3で得られた9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-8-カルボニトリルを用い、参考例1.1の工程3〜5と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(8-シアノ-6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル (2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-8)を得た。
1H-NMR (CDCl3, 500MHz) δ: 8.15-8.12 (1H, m),7.47-7.46(2H, m), 7.36-7.34 (4H, m), 7.23-7.20 (3H, m), 6.79-6.77 (4H, m),6.02-6.00(1H, m), 5.52-5.37 (1H, m), 4.44-4.40 (2H, m), 4.01-3.30 (19H, m),3.78-3.77(7H, m), 2.58-2.42 (2H, m), 1.20-1.14 (13H, m), 0.77-0.73 (9H, m),-0.10(-0.07)(3H, s), -0.31(-0.28) (3H, s).
実施例14
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-12を有するsiRNAを、参考例8.1で得られる化合物am-8を用いて、実施例1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6742.95 実測値6742.18
参考例9.0; 化合物I-13
市販の1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-6-ヨードピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオン(866 mg、2.34 mmol)を用い、参考例1.0の工程3〜5と同様にして、リン酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-ヨード-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル トリエチルアミン(化合物I-13)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 6.52(s, 1H), 5.92(d, J= 3.3Hz,1H), 4.69 - 4.60(m, 1H), 4.33(t, J=6.8 Hz, 1H), 4.02 - 3.86(m, 3H),3.07(q,J=7.3 Hz, 6H), 1.15(t, J= 7.3 Hz, 9H).
ESI-MS(m/z): 451(M+1)
ESI-MS(m/z): 451(M+1)
参考例9.1:化合物am-9
市販の1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-6-ヨードピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1.1と同様にして(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(6-ヨード-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-9)を得る。
実施例15
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-13を有するsiRNAを、参考例9.1で得られる化合物am-9を用いて、実施例1と同様に合成する。
参考例10.0; 化合物I-14
工程1
市販の5-ブロモ-1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオン(3.34 g、10.3 mmol)を用い、参考例1.0の工程3と同様にして、5-ブロモ-1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(ヒドロキシメチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオン(2.58 g、収率 69%)を得た。
ESI-MS(m/z): 363(M+1)
工程2
工程1で得られた5-ブロモ-1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(ヒドロキシメチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオン(200 mg、0.551 mmol)、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(63.6 mg、0.055 mmol)を1,4-ジオキサンに溶解し、トリブチル(2-ピリジル)スズ(0.62 mL、1.93mmol)を加えて110℃で終夜攪拌した。反応液を室温に冷却後、飽和重曹水を加え、Presep(登録商標; けいそう土、顆粒状タイプM, 4.5g/25mL)を通してろ過し、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をクロロホルム/メタノール系のカラムクロマトグラフィーで精製することにより、1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(ヒドロキシメチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)-5-(ピリジン-2-イル)ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオン(45.2 mg、収率23 %)を得た。
ESI-MS(m/z)： 362(M+1)
工程3〜4
工程2で得られた1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(ヒドロキシメチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)-5-(ピリジン-2-イル)ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用いて参考例1.0の工程4〜5と同様にして、リン酸((2R,3S,4R,5R)-5-(2,4-ジオキソ-5-(ピリジン-2-イル)-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-14)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 8.66(s, 1H), 8.56(d, J= 5.5Hz,1H), 8.40(t, J=7.9 Hz, 1H), 8.20(d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.77(t, J= 6.8 Hz,1H),5.92(d, J= 4.0 Hz, 1H), 4.35(t, J= 4.2 Hz, 1H), 4.27 - 4.26(m, 2H),4.15(dd, J=12.1, 2.6 Hz, 1H), 4.04(dd, J= 13.0, 5.7 Hz, 1H)
ESI-MS(m/z): 402(M+1)
参考例10.1:化合物am-10
工程1
参考例10.0の工程2で得られる1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(ヒドロキシメチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)-5-(ピリジン-2-イル)ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例6.1の工程1と同様にして1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-5-(ピリジン-2-イル)ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを得る。
工程2
1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-5-(ピリジン-2-イル)ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1.1と同様にして(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(2,4-ジオキソ-5-(ピリジン-2-イル)-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-10)を得る。
実施例16
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-14を有するsiRNAを、参考例10.1で得られる化合物am-10を用いて、実施例1と同様に合成する。
参考例11.0; 化合物I-15
2-(トリ-n-ブチルスタンニル)オキサゾールを用いて参考例10.0の工程2〜4と同様にして、リン酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(5-(オキサゾール-2-イル)-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-15)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 8.52(s, 1H), 7.84(s, 1H),7.19(s,1H), 5.93(d, J=4.9 Hz, 1H), 4.36(t, J= 4.9 Hz, 1H), 4.28-4.24(m, 2H),4.11(dq,J=11.7, 2.0 Hz, 1H), 4.03(dq, J=11.7, 2.6 Hz, 1H).
ESI-MS(m/z): 392(M+1)
参考例11.1:化合物am-11
2-(トリ-n-ブチルスタンニル)オキサゾールを用いて参考例10.0の工程2と同様にして合成した1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(ヒドロキシメチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)-5-(オキサゾル-2-イル)ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例10.1と同様にして(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(5-(オキサゾル-2-イル)-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-11)を得る。
実施例17
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-15を有するsiRNAを、参考例11.1で得られる化合物am-11を用いて、実施例1と同様に合成する。
参考例12.0; 化合物I-16
工程1
市販の5-ヨードピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1.0の工程1と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-((ベンゾイルオキシ)メチル)-5-(5-ヨード-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイル ジベンゾエートを得た。
ESI-MS(m/z): 683(M+1)
工程2
工程1で得られた(2R,3R,4R,5R)-2-((ベンゾイルオキシ)メチル)-5-(5-ヨード-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイル ジベンゾエート(200 mg、0.293 mmol)、(4-メトキシフェニル)ボロン酸(134.0 mg、0.879mmol)、1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン-パラジウム(II)ジクロリド-ジクロロメタン錯体(23.9 mg、0.029mmol)、2M炭酸セシウム水溶液(0.6mL)に1,4-ジオキサン(3 mL)を加え、120℃で1時間攪拌した。反応液を室温に冷却後、飽和重曹水を加え、Presep(登録商標; けいそう土、顆粒状タイプM, 4.5g/25mL)を通してろ過し、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をクロロホルム/メタノール系のカラムクロマトグラフィーで精製することにより、(2R,3R,4R,5R)-2-((ベンゾイルオキシ)メチル)-5-(5-(4-メトキシフェニル)-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイルジベンゾエート(118 mg、収率61 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 663(M+1)
工程3
工程2で得られた(2R,3R,4R,5R)-2-((ベンゾイルオキシ)メチル)-5-(5-(4-メトキシフェニル)-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイルジベンゾエートを用い、参考例1.0の工程2〜5と同様にして、リン酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(5-(4-メトキシフェニル)-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-16)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 7.77(s, 1H), 7.42(d, J= 8.8Hz,2H), 7.01(d, J= 8.8 Hz, 2H), 5.97(d, J= 5.5 Hz, 1H), 4.39(t, J= 5.9 Hz,1H),4.27(t, J= 4.4 Hz, 1H), 4.22 - 4.21(m, 1H), 4.04 - 4.02(m, 2H), 3.81(s,3H).
ESI-MS(m/z): 431(M+1)
参考例12.1:化合物am-12
参考例12.0の工程2で得られる(2R,3R,4R,5R)-2-((ベンゾイルオキシ)メチル)-5-(5-(4-メトキシフェニル)-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイル ジベンゾエートを用い、参考例1.1と同様にして(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(5-(4-メトキシフェニル)-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-12)を得る。
実施例18
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-16を有するsiRNAを、参考例12.1で得られる化合物am-12を用いて、実施例1と同様に合成する。
参考例13.0; 化合物I-17
工程1
参考例10.0の工程1で得られる5-ブロモ-1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(ヒドロキシメチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用いて、参考例1.0の工程4と同様にして、リン酸 ジ-tert-ブチル ((3aR,4R,6R,6aR)-6-(5-ブロモ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチルを得た。
ESI-MS(m/z): 555(M+1)
工程2
工程1で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(5-ブロモ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(200 mg、0.360 mmol)をDMF(7mL)に溶解し、シアン化ナトリウム(88.0 mg、1.801 mmol) を加えて室温で終夜攪拌した。反応液に飽和重曹水を加え、酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下で溶媒を留去して得られた残渣をヘプタン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製することによりリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-シアノ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(150 mg、収率83 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 502(M+1)
工程3
工程2で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-シアノ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチルを用い、参考例1.0の工程5と同様にして、リン酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-シアノ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-17)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 6.51(d, J= 0.7 Hz, 1H), 5.81(d,J=4.0 Hz, 1H), 4.28(t, J= 6.2 Hz, 1H), 4.01-3.95(m, 4H).
ESI-MS(m/z): 350(M+1)
参考例13.1:化合物am-13
工程1〜2
市販の5-ブロモ-1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1.1の工程1〜2と同様にして、5-ブロモ-1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを得た。
ESI-MS(m/z): 577(M+1)
工程3
工程2で得られた5-ブロモ-1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例13.0の工程2と同様にして、3-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-2,6-ジオキソ-1,2,3,6-テトラヒドロピリミジン-4-カルボニトリルを得た。
ESI-MS(m/z): 524(M+1)
工程4
工程3で得られた3-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-2,6-ジオキソ-1,2,3,6-テトラヒドロピリミジン-4-カルボニトリルを用い、参考例1.1の工程3〜5と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(6-シアノ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-13)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 500MHz) δ: 7.47-6.78(m, 13H),6.27(6.26)(s,1H), 5.84(m, 1H), 4.95(4.89)(m, 1H), 4.35-4.19(m, 2H),3.96-3.27(m, 12H),2.31(2.59)(m, 2H), 1.19-1.06(m, 12H), 0.87(0.88)(s, 9H),0.06(0.08)(s, 3H),0.01(s, 3H).
実施例19
後述の表38に示す454-Xuのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-17を有するsiRNAを、参考例13.1で得られる化合物am-13を用いて、実施例1と同様に合成した。
MALDI-TOF/MS(アンチセンス鎖)： 理論値6691.86(M-H)実測値 6691.25
参考例14.0; 化合物I-18
工程1
参考例6.0の工程2で得られる((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-ジメチル-6-(6-((E)-スチリル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(249 mg、0.631mmol)をクロロホルム(6.00 mL)に溶解し、氷冷下イミダゾール(86 mg、1.26 mmol)、tert-ブチルジメチルシリルクロライド(105 mg、0.694 mmol)を加え、室温で3時間攪拌した。その後、氷冷下イミダゾール(86 mg、1.26 mmol)、tert-ブチルジメチルシリルクロライド(105 mg、0.694 mmol)を追加し、室温でさらに1時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去して得られた残渣を、ヘプタン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製することにより、9-((3aR,4R,6R,6aR)-6-((tert-ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)- 6-((E)-スチリル)-9H-プリン(310 mg、97.0 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 509(M+1)
工程2
工程1で得られた9-((3aR,4R,6R,6aR)-6-((tert-ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)-6-((E)-スチリル)-9H-プリン(200 mg、0.393 mmol)をTHF(3.00mL)に溶解し、-78 ℃でリチウムジイソプロピルアミド(0.393mL, 0.786 mmol)を加え30分間攪拌後、1,2-ジブロモ-1,1,2,2-テトラクロロエタン(384 mg, 1.18 mmol) をTHF(2.00 mL)に溶解させた溶液を-78 ℃で加えた。その後、撹拌しながら1時間かけて室温まで昇温した。反応混合物に飽和重曹水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去して得られた残渣を、ヘプタン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製することにより、8-ブロモ-9-((3aR,4R,6R,6aR)-6-((tert-ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)-6-((E)-スチリル)-9H-プリン (198 mg、86.0 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 587(M+1)
工程3
工程2で得られた8-ブロモ-9-((3aR,4R,6R,6aR)-6-((tert-ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)-6-((E)-スチリル)-9H-プリン(198 mg、0.337 mmol)をトリフルオロ酢酸/水(1:1)(2 mL)に溶解し、室温で2時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去して得られた残渣を、ヘプタン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製することにより、(2R, 3R, 4S, 5R)-2-(8-ブロモ-6-((E)-スチリル)-9H-プリン-9-イル)-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-3,4-ジオール(140mg、96.0 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 433(M+1)
工程4
工程3で得られた(2R, 3R, 4S, 5R)-2-(8-ブロモ-6-((E)-スチリル)-9H-プリン-9-イル)-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-3,4-ジオール(140 mg、0.323mmol)を用い、参考例1.0の工程3と同様にして、((3aR,4R,6R,6aR)-6-(8-ブロモ-6-((E)-スチリル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(66.0 mg、43.2%)を得た。
ESI-MS(m/z): 473(M+1)
工程5〜6
工程4で得られた((3aR,4R,6R,6aR)-6-(8-ブロモ-6-((E)-スチリル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(65.0 mg、0.137 mmol)を用い、参考例6.0の工程3〜4と同様にして、リン酸((2R,3S,4R,5R)-5-(8-ブロモ-6-((E)-スチリル)-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-18、68.5 mg、75.0 %)を得た。
1H-NMR(D2O, 400MHz) δ: 8.45(1H, s), 7.54(1H, d, J=15.6Hz), 7.24-7.17(2H, m), 7.11-7.00(3H, m), 6.95(1H, d, J= 15.6 Hz), 5.96(1H,d,J= 4.9 Hz), 5.18(1H, dd, J= 5.4, 5.4 Hz), 4.54(1H, dd, J= 5.4, 5.4Hz),4.19-4.13(1H, m), 4.12-3.95(2H, m).
ESI-MS(m/z): 513(M+1)
参考例14.1:化合物am-14
参考例14.0の工程3で得られる(2R, 3R, 4S, 5R)-2-(8-ブロモ-6-((E)-スチリル)-9H-プリン-9-イル)-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-3,4-ジオール を用い、参考例1.1と同様にして、3-((2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(8-ブロモ-6-((E)-スチリル)-9H-プリン-9-イル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-14)を得る。
実施例20
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-18を有するsiRNAを、参考例14.1で得られる化合物am-14を用いて、実施例1と同様に合成する。
参考例15.0; 化合物I-19
市販の5,6-ジメチルチエノ[2,3-d]ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1.0と同様にしてリン酸((2R,3S,4R,5R)-5-(5,6-ジメチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロチエノ[2,3-d]ピリミジン-1(2H)-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-19) トリエチルアンモニウム塩を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 6.10(d, J=5.5 Hz, 1H),4.75-4.73(m,1H), 4.40(t, J=5.7 Hz, 1H), 4.24-4.14(m, 3H), 2.32(s, 3H), 2.31(s,3H).
ESI-MS(m/z): 411(M+1)
参考例15.1:化合物am-15
市販の5,6-ジメチルチエノ[2,3-d]ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1.1と同様にして(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-5-(5,6-ジメチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロチエノ[2,3-d]ピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-15)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 500MHz) δ: 7.62(s, 1H), 7.50-6.78(m,13H),5.98(m, 1H), 4.92(m, 1H), 4.34-4.25(m, 2H), 4.00-3.34(m, 12H),2.29(2.64)(m,2H), 2.35(s, 3H), 2.13(s, 3H), 1.23-1.03(m, 12H), 0.83(0.84)(s,9H), 0.02(d, J=6.0 Hz, 3H), -0.10(d, J= 5.0 Hz, 3H).
実施例21
後述の表38に示す454-Xuのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-19を有するsiRNA(di-Me-thienyl-dUという)を、参考例15.1で得られる化合物am-15を用いて、実施例1と同様に合成した。
MALDI-TOF/MS(アンチセンス鎖)： 理論値6750.99(M-H)実測値 6754.34
参考例16.0; 化合物I-20
工程1
参考例6.0の工程1で得られる((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(100 mg、0.306mmol)及び3-イソプロピルフェニルボロン酸(100mg、0.612 mmol)を用い、参考例6.0の工程2と同様にして、((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-イソプロピルフェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(167 mg、133 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 411(M+1)
工程2
工程1で得られた((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-イソプロピルフェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール (126 mg、0.307mmol)を用い、参考例6.0の工程3と同様にして、リン酸ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-イソプロピルフェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(96.2 mg、52.0 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 603(M+1)
工程3
工程1で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-イソプロピルフェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(96.0 mg、0.159mmol)をトリフルオロ酢酸/水(1:1)(2 mL)に溶解し、室温で3時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去して得られた残渣を分取HPLC(溶離液 0.01mmol/L 酢酸-トリエチルアミン緩衝液(pH 6.5) /アセトニトリル系)にて精製することにより、リン酸((2R,3S,4R,5R)- 3,4-ジヒドロキシ-5-(6-(3-イソプロピルフェニル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-20) トリエチルアンモニウム塩(70.0 mg、80.0 %)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 8.72(2H, d, J=7.0 Hz), 7.97(1H,s),7.92-7.83(1H, m), 7.43-7.33(2H, m), 6.14(1H, d, J= 5.5 Hz), 4.73-4.64(14H,m),4.44-4.38(1H, m), 4.32-4.25(1H, m), 4.08-3.93(2H, m), 3.06(11H, q, J= 7.3Hz),2.94-2.81(1H, m), 1.20-1.08(22H, m).
ESI-MS(m/z): 451(M+1)
参考例16.1:化合物am-16
参考例16.0の工程1で得られる((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-イソプロピルフェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノールを用い、参考例6.1と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-5-(6-(3-イソプロピルフェニル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチル ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-16)を得る。
実施例22
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-20を有するsiRNAを、参考例16.1で得られる化合物am-16を用いて、実施例1と同様に合成する。
参考例17.0; 化合物I-21
工程1
参考例6.0の工程1で得られる((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(100 mg、0.306mmol)及び2-ナフタレンボロン酸(105 mg、0.612 mmol)を用い、参考例6.0の工程2と同様にして、((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-ジメチル-6-(6-(ナフタレン-2-イル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(147 mg、114 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 419(M+1)
工程2
工程1で得られた((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-ジメチル-6-(6-(ナフタレン-2-イル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(128 mg、 0.306 mmol)を用い、参考例6.0の工程3と同様にして、リン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-ジメチル-6-(6-(ナフタレン-2-イル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(90.0 mg、48.2 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 611(M+1)
工程3
工程2で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-ジメチル-6-(6-(ナフタレン-2-イル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル (77.0 mg、0.126 mmol)を用い、参考例1.0の工程5と同様にして、リン酸((2R,3S,4R,5R)- 3,4-ジヒドロキシ-5-(6-(ナフタレン-2-イル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-21) トリエチルアンモニウム塩(20.0 mg、29.6 %)を得た。
1H-NMR(D2O, 400MHz) δ: 8.30(1H, s), 8.05(1H, s),7.80(1H,s), 7.55-7.40(1H, m), 7.27-6.92(5H, m), 5.73(1H, s), 4.52-4.18(3H,m),4.15-3.92(2H, m), 3.06-2.96(6H, m), 1.16-1.04(9H, m).
ESI-MS(m/z): 459(M+1)
参考例17.1:化合物am-17
工程1〜2
市販の(2R,3R,4S,5R)-2-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-3,4-ジオールを用い、参考例1.1の工程1〜2と同様にして、6-クロロ-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリンを得た。
ESI-MS(m/z): 541(M+1)
工程3
工程2で得られた6-クロロ-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリンを用い、参考例17.0の工程1と同様にして、9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(ナフタレン-2-イル)-9H-プリンを得た。
ESI-MS(m/z): 633(M+1)
工程4〜6
工程3で得られた9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(ナフタレン-2-イル)-9H-プリンを用い、参考例1.1の工程3〜5と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-5-(6-(ナフタレン-2-イル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチル ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-17)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 500MHz) δ: 9.43(m, 1H), 8.96(m, 1H),8.88(m,1H), 8.40(m, 1H), 8.08(m, 1H), 8.02(m, 1H), 7.91(m, 1H), 7.59-7.52(m,2H),7.52-6.81(m, 13H), 6.19(6.13)(m, 1H), 5.11(m, 1H), 4.50-4.38(m,2H),4.02-3.32(m, 12H), 2.67(2.32)(m, 2H), 1.23-1.05(m, 12H), 0.76(0.77)(s,9H),-0.03(0.00)(s, 3H), -0.19(-0.17)(s, 3H).
実施例23
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-21を有するsiRNA(6-napht-2-yl-dPuという)を、参考例17.1で得られる化合物am-17を用いて、実施例1と同様に合成した。
MALDI-TOF/MS(アンチセンス鎖)： 理論値6801.03(M-H)実測値 6805.40
参考例18.0; 化合物I-22
工程1
参考例6.0の工程1で得られる((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(200 mg、0.612mmol)及び3-ホルミルフェニルボロン酸(184mg、1.22 mmol)を用い、参考例6.0の工程2と同様にして、((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-ホルミルフェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(216 mg、89 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 397(M+1)
工程2
工程1で得られた((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-ホルミルフェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(215 mg、0.542mmol)を用い、参考例6.0の工程3と同様にして、リン酸ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-ホルミルフェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(35.0 mg、11.0 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 589(M+1)
工程3
工程1で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-ホルミルフェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(33.0 mg、0.0560mmol)を用い、参考例1.0の工程5と同様にして、リン酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(6-(3-ホルミルフェニル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-22、20.0 mg、29.6 %)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 9.93(1H, s), 8.88(1H, s),8.76(1H,s), 8.67-8.60(1H, m), 8.47-8.40(1H, m), 8.06-7.99(1H, m), 7.74-7.66(1H,m),6.20(1H, d, J= 5.5 Hz), 4.76-4.68(2H, m), 4.46-4.41(1H, m), 4.34-4.29(1H,m),4.12-4.00(2H, m).
ESI-MS(m/z): 437(M+1)
参考例18.1:化合物am-18
参考例18.0の工程1で得られる((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-ホルミルフェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノールを用い、参考例6.1と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-5-(6-(3-ホルミルフェニル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチル ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-18)を得る。
参考例18.1:化合物am-18
工程1
参考例17.1の工程2で得られた6-クロロ-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリン(1.00 g、1.848 mmol)を用い、参考例18.0の工程1と同様にして、9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(3-ホルミルフェニル)-9H-プリン(826 mg、73.2 %)を得た。
工程2
工程1で得られた9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(3-ホルミルフェニル)-9H-プリン(720 mg、1.179 mmol)をジクロロメタン(15 mL)に溶解し、氷冷下1,3-プロパンジオール(0.427 mL、5.89 mmol)、オルトギ酸トリエチル(0.294 mL、1.768 mmol)、および四塩化チタンのジクロロメタン溶液(1 mol/L)(0.589 mL、0.589 mmol)を加え、室温で4時間撹拌した。反応混合物に飽和重曹水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣を酢酸エチル/ヘプタン系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、6-(3-(1,3-ジオキサン-2-イル)フェニル)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリン(690 mg、88.0 %)を得た。
工程3〜5
工程2で得られた6-(3-(1,3-ジオキサン-2-イル)フェニル)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリンを用い、参考例1.1の工程3〜5と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-5-(6-(3-(1,3-ジオキサン-2-イル)フェニル)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチル ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-18)を得た。
実施例24-0
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-22を有するsiRNAを、参考例18.1で得られる化合物am-18を用いて、実施例1と同様に合成する。
実施例24
参考例18.1で得られる化合物am-18を用いて、実施例1と同様にオリゴ核酸を固相合成した後、80%酢酸 (0.500 mL)を用いて、室温で1時間脱保護を行った。減圧下濃縮を行った後、実施例1と同様にアニーリングを行うことで、後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-22を有するsiRNA (6-(m-formyl)phenyl-Puという)を合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6778.98 実測値 6778.23
参考例19.0; 化合物I-23
市販の6-ニトロ-1H-キナゾリン-2,4-ジオンを用い、参考例1.0と同様にしてリン酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(6-ニトロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-23) トリエチルアンモニウム塩を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 8.82(d, J=2.9 Hz, 1H),8.49(dd,J=9.3, 2.4 Hz, 1H), 7.89(d, J=9.5 Hz, 1H), 6.27(d, J=5.9 Hz, 1H),4.73(t, J=6.2Hz, 1H), 4.42(t, J=5.9 Hz, 1H), 4.09-4.04(m, 3H), 3.08(q, J=7.3Hz, 6H), 1.16(t,J=7.3 Hz, 9H).
ESI-MS(m/z): 420(M+1)
参考例19.1:化合物am-19
市販の6-ニトロ-1H-キナゾリン-2,4-ジオンを用い、参考例1.1と同様にして(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-5-(6-ニトロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチル ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-19)を得る。
実施例25
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-23を有するsiRNAを、参考例19.1で得られる化合物am-19を用いて、実施例1と同様に合成する。
参考例20.0; 化合物I-24
工程1〜4
市販の5,6-ジメチルピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1の工程1〜4と同様にしてリン酸ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(5,6-ジメチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチルを得た。
ESI-MS(m/z): 505(M+1)
工程5
工程4で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(5,6-ジメチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(200 mg、0.396 mmol)を1,4-ジオキサン(4.00 mL)に溶解し、二酸化セレン(440 mg、3.96 mmol)を加え、加熱還流下で終夜攪拌した。反応液をセライトろ過し、減圧下、溶媒を留去して得られた残渣を、ヘプタン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製することにより、リン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(ヒドロキシメチル)-5-メチル2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(38.6 mg、収率19 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 521(M+1)
工程6
工程5で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(ヒドロキシメチル)-5-メチル2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(38.6 mg、0.074mmol)をアセトニトリル(1.00 mL)に溶解し、ピリジン(0.06mL、0.742 mmol)、デス-マーチンペルヨージナン(62.9 mg、0.148 mmol)を加え、60℃で終夜攪拌した。反応液を室温に冷却後、飽和重曹水を加え、Presep(登録商標; けいそう土、顆粒状タイプM, 4.5g/25mL)を通してろ過し、溶媒を減圧下留去した。残渣をプレパラティブ薄層クロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=20/80)で精製することにより、リン酸ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(ヒドロキシメチル)-5-メチル2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(32.8 mg、収率85 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 519(M+1)
工程7
工程6で得られるリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(ヒドロキシメチル)-5-メチル2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(46.0 mg、0.089mmol)をTHF(1.00 mL)に溶解し、ヒドロキシルアミン塩酸塩(30.8 mg、0.444 mmol)を加え、60℃で2時間攪拌した。反応液を室温に冷却後、飽和重曹水を加え、Presep(登録商標; けいそう土、顆粒状タイプM, 4.5g/25mL)を通してろ過し、溶媒を減圧下留去した。残渣をプレパラティブ薄層クロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール=90/10)で精製することにより、リン酸ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-((E)-(ヒドロキシイミノ)メチル)-5-メチル2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(33.7 mg、収率71 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 534(M+1)
工程8
トリフェニルホスフィンオキシド(1.76 mg、0.006mmol)を酢酸エチル(1.00 mL)に溶解し、塩化オキサリル(0.017mL、0.19 mmol)を加え、室温で5分間撹拌し反応液を調製した。工程7で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-((E)-(ヒドロキシイミノ)メチル)-5-メチル2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(33.7 mg、0.063 mmol)を酢酸エチル(1.00 mL)に溶解し、上記反応液をゆっくり加え、室温で終夜攪拌した。溶媒を留去して得られた残渣をトリフルオロ酢酸/水(1:1)(2 mL)に溶解し、室温で2時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去した後、酢酸-トリエチルアミン緩衝液(pH 6.5)(2mL)を加え、再度減圧下、溶媒を留去した。得られた残渣をエタノールに溶解し、酢酸エチルを加え、析出物を濾取することにより、リン酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-シアノ-5-メチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-24) トリエチルアンモニウム塩(1.6 mg(2回分)、収率74 %)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 5.96(d, J=4.0 Hz, 1H),4.41(t,J=6.4 Hz, 1H), 4.19-4.06(m, 3H), 3.21(q, J=7.2 Hz, 6H), 2.19(s, 3H),1.28(t,J=7.5 Hz, 9H).
ESI-MS(m/z): 404(M+1)
参考例20.1:化合物am-20
工程1
参考例20.0の工程1で得られる(2R,3R,4R,5R)-2-(ベンゾイルオキシメチル)-5-(5,6-ジメチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイルベンゾエートを用い、参考例20.0の工程5と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-(ベンゾイルオキシメチル)-5-(6-(ヒドロキシメチル)-5-メチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイルベンゾエートを得た。
ESI-MS(m/z): 601(M+1)
工程2
工程1で得られた(2R,3R,4R,5R)-2-(ベンゾイルオキシメチル)-5-(6-ヒドロキシメチル)-5-メチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイルベンゾエートを用い、参考例20.0の工程6と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-(ベンゾイルオキシメチル)-5-(6-ホルミル-5-メチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイルベンゾエートを得た。
ESI-MS(m/z): 599(M+1)
工程3
工程2で得られた(2R,3R,4R,5R)-2-(ベンゾイルオキシメチル)-5-(6-ホルミル-5-メチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイル ベンゾエートを用い、参考例20.0の工程7と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-(ベンゾイルオキシメチル)-5-(6-((E)-(ヒドロキシイミノ)メチル)-5-メチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイルベンゾエートを得た。
ESI-MS(m/z): 614(M+1)
工程4
トリフェニルホスフィンオキシド(11.0 mg、0.039mmol)を酢酸エチル(5.00 mL)に溶解し、塩化オキサリル(0.104mL、1.183 mmol)を加え、室温で5分間撹拌し反応液を調製した。工程3で得られた(2R,3R,4R,5R)-2-(ベンゾイルオキシメチル)-5-(6-((E)-(ヒドロキシイミノ)メチル)-5-メチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイルベンゾエート(242 mg、0.394 mmol)を酢酸エチル(5.00 mL)に溶解し、上記反応液をゆっくり加え、室温で2時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去して得られた残渣を、ヘプタン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製することにより、(2R,3R,4R,5R)-2-(ベンゾイルオキシメチル)-5-(6-シアノ-5-メチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイル ベンゾエート(207 mg、収率88 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 596(M+1)
工程5
工程4で得られた(2R,3R,4R,5R)-2-(ベンゾイルオキシメチル)-5-(6-シアノ-5-メチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイル ベンゾエートを用い、参考例1.0の工程2と同様にして、3-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-5-メチル-2,6-ジオキソ-1,2,3,6-テトラヒドロピリミジン-4-カルボニトリルを得た。
ESI-MS(m/z): 284(M+1)
工程6〜10
工程5で得られた3-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-5-メチル-2,6-ジオキソ-1,2,3,6-テトラヒドロピリミジン-4-カルボニトリルを用い、参考例1.1の工程1〜5と同様にして、(2R,3R,4S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-5-(6-シアノ-5-メチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチル ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-20)を得る。
実施例26
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-24を有するsiRNAを、参考例20.1で得られる化合物am-20を用いて、実施例1と同様に合成する。
参考例21.0; 化合物I-25
工程1
参考例6.0の工程1で得られる((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(100 mg、0.306mmol)及びナフタレン-1-イルボロン酸(105 mg、0.612mmol)を用い、参考例6.0の工程2と同様にして、((3aR,4R,6R,6aR)−2,2−ジメチル-6-(6-(ナフタレン-1-イル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(150 mg、117 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 419(M+1)
工程2
工程1で得られた((3aR,4R,6R,6aR)−2,2−ジメチル-6-(6-(ナフチレン-1-イル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(128 mg、0.306mmol)を用い、参考例6.0の工程3と同様にして、リン酸ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)−2,2−ジメチル-6-(6-(ナフタレン-1-イル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(70.0 mg、37.5 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 611(M+1)
工程3
工程2で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)−2,2−ジメチル-6-(6-(ナフタレン-1-イル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(77.0 mg、0.126 mmol)を用い、参考例16.0の工程3と同様にして、リン酸((2R,3S,4R,5R)- 3,4-ジヒドロキシ-5-(6-(ナフタレン-1-イル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-25) トリエチルアンモニウム塩(10.8 mg、15.3 %)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 8.87 (1H, s), 8.60 (1H,s),8.07-7.84 (2H, m), 7.73-7.60 (2H, m), 7.58-7.40 (2H, m), 7.38-7.28 (1H,m),6.21 (1H, d, J = 5.5 Hz), 4.75-4.66 (1H, m), 4.45-4.38 (1H, m), 4.35-4.28(1H,m), 4.10-3.98 (2H, m), 3.05 (6H, q, J= 7.3 Hz), 1.13 (9H, t, J = 7.3 Hz).
ESI-MS(m/z): 459(M+1)
参考例21.1:化合物am-21
工程1
参考例17.1の工程2で得られた6-クロロ-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリンを用い、参考例21.0の工程1と同様にして、9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(ナフタレン-1-イル)-9H-プリンを得た。
ESI-MS(m/z): 633(M+1)
工程2〜4
工程1で得られた9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(ナフタレン-1-イル)-9H-プリンを用い、参考例1.1の工程3〜5と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)−4−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)−5−(6-(ナフタレン-1-イル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチル ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-21)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 500MHz) δ: 9.04(m, 1H), 8.34(m, 1H),8.20(m,1H), 8.04-7.91(m, 2H), 7.93(m, 1H), 7.64(m, 1H), 7.54-7.45(m, 4H),7.39-6.79(m,11H), 6.21(6.15)(m, 1H), 5.16(m, 1H), 4.51-4.39(m, 2H),4.04-3.32(m, 12H),2.68(2.32)(m, 2H), 1.25-1.06(m, 12H), 0.76(0.77)(s, 9H),-0.01(0.01)(s, 3H),-0.16(-0.15)(s, 3H).
実施例27
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-25を有するsiRNA(6-napht-1-yl-dPu)を、参考例21.1で得られる化合物am-21を用いて、実施例1と同様に合成した。
MALDI-TOF/MS(アンチセンス鎖)： 理論値6801.03(M-H)実測値 6800.94
参考例22.0; 化合物I-26
工程1
参考例6.0の工程1で得られる((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(100 mg、0.306mmol)及び(1,1’-ビフェニル)-3-イルボロン酸(121 mg、0.612 mmol)を用い、参考例6.0の工程2と同様にして、((3aR,4R,6R,6aR)−6-(6-(ビフェニル-3-イル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(130 mg、95 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 445(M+1)
工程2
工程1で得られた((3aR,4R,6R,6aR)−6-(6-(ビフェニル-3-イル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(125 mg、0.281mmol)を用い、参考例6.0の工程3と同様にして、リン酸ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)−6-(6-(ビフェニル-3-イル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(107 mg、59.8 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 637(M+1)
工程3
工程2で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)−6-(6-(ビフェニル-3-イル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(100 mg、0.157 mmol)を用い、参考例1.0の工程5と同様にして、リン酸((2R,3S,4R,5R)−5-(6-(ビフェニル-3-イル)-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-26)(47.0 mg、61.8 %)を得た。
1H-NMR(DMSO-d6, 300MHz) δ: 9.14 (1H, s), 9.06 (1H,s),8.89 (1H, s), 8.82 (1H, d, J = 7.7 Hz), 7.89 (1H, d, J = 7.7 Hz),7.79-7.68(3H, m), 7.58-7.50 (2H, m), 7.47-7.40 (1H, m), 6.15 (1H, d, J = 5.5Hz),4.72-4.65 (1H, m), 4.27-4.22 (1H, m), 4.20-3.98 (3H, m).
ESI-MS(m/z): 485(M+1)
参考例22.1:化合物am-22
工程1
参考例17.1の工程2で得られた6-クロロ-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリン(300 mg、0.554 mmol)を用い、参考例22.0の工程1と同様にして、6-(ビフェニル-3-イル)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリン(239 mg、65.4 %)を得た。
工程2〜4
工程1で得られた6-(ビフェニル-3-イル)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリンを用い、参考例1.1の工程3〜5と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-5-(6-(ビフェニル-3-イル)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-22)を得た。
1H-NMR (CDCl3, 400MHz) δ: 9.05-9.05 (m, 1H), 8.94-8.92(m,1H), 8.82-8.80 (m, 1H), 8.36-8.35 (m, 1H), 7.77-7.74 (m, 3H), 7.65-7.63 (m,1H),7.49-7.47 (m, 4H), 7.38-7.36 (m, 3H), 7.30-7.21 (m, 5H), 6.83-6.81 (m,4H),6.17-6.12 (m, 1H), 5.14-5.13 (m, 1H), 4.45-4.41 (m, 2H), 3.99-3.97 (m,1H),3.77-3.77 (m, 6H), 3.66-3.57 (m, 4H), 3.37-3.35 (m, 1H), 2.66-2.65 (m,1H),2.32-2.31 (m, 1H), 1.27-1.06 (m, 12H), 0.86-0.76 (m, 9H), -0.04(-0.01) (s,3H),-0.21(-0.19) (s, 3H).
実施例28
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-26を有するsiRNAを、参考例22.1で得られる化合物am-22を用いて、実施例1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6827.06 実測値6826.60
参考例23.0; 化合物I-27
工程1
参考例6.0の工程1で得られる((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(100 mg、0.306mmol)及び(3-アミノフェニル)ボロン酸(84 mg、0.612 mmol)を用い、参考例6.0の工程2と同様にして、((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-アミノフェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(77.2 mg、65.8%)を得た。
ESI-MS(m/z): 384(M+1)
工程2
工程1で得られた((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-アミノフェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(77.0 mg、0.201mmol)を用い、参考例6.0の工程3と同様にして、リン酸ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-アミノフェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(38.4 mg、33.2 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 576(M+1)
工程3
工程2で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-アミノフェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(38.0 mg、0.0660mmol)を用い、参考例1.0の工程5と同様にして、リン酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-(3-アミノフェニル)-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-27)(13.0 mg、43.3 %)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 8.82 (1H, s), 8.73 (1H,s),8.22-8.15 (2H, m), 7.66-7.58 (1H, m), 7.55-7.48 (1H, m), 6.16 (1H, d, J =5.5Hz), 4.72-4.65 (1H, m), 4.45-4.38 (1H, m), 4.35-4.26 (1H, m), 4.14-3.98(2H,m).
ESI-MS(m/z): 424(M+1)
参考例23.1:化合物am-23
工程1
参考例17.1の工程2で得られた6-クロロ-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリンを用い、参考例23.0の工程1と同様にして、6-(3-アミノフェニル)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリンを得る。
工程2〜4
工程1で得られた9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(3-アミノフェニル)-9H-プリンを用い、参考例1.1の工程3〜5と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-5-(6-(3-アミノフェニル)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチル ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-23)を得る。
参考例23.1:化合物am-23
工程1
参考例17.1の工程2で得られた6-クロロ-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリン(1.00 g、1.85 mmol)および3-アミノフェニルボロン酸を用い、参考例6.0の工程2と同様にして、6-(3-アミノフェニル)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリン(622 mg、56.3 %)を得た。
工程2
工程1で得られた6-(3-アミノフェニル)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリン(590 mg、0.987 mmol)をDMF(10 mL)に溶解し、N,N-ジメチルホルムアミドジメチルアセタール (1.32 mL、9.87 mmol)を加え、60℃で21時間撹拌した。反応混合物に飽和重曹水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣を酢酸エチル/ヘプタン系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(3-(((ジメチルアミノ)メチレン)アミノ)フェニル)-9H-プリン(514 mg、80.0%)を得た。
工程3〜5
工程2で得られた9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(3-(((ジメチルアミノ)メチレン)アミノ)フェニル)-9H-プリンを用い、参考例1.1の工程3〜5と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-5-(6-(3-(((ジメチルアミノ)メチレン)アミノ)フェニル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチル ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-23)を得た。
1H-NMR (CDCl3, 400MHz) δ: 8.90, 8.88 (1H, 2 s),8.52-8.46(1H, m), 8.36-8.29 (2H, m), 7.68 (1H, s), 7.52-7.42 (3H, m), 7.41-7.33(4H, m),7.32-7.14 (4H, m), 6.85-6.78 (4H, m), 6.17-6.08 (1H, m), 5.16-5.09 (1H,m),4.49-4.35 (2H, m), 4.03-3.85 (1H, m), 3.76 (6H, s), 3.70-3.53 (4H,m),3.38-3.27 (1H, m), 3.06 (6H, s), 2.70-2.62 (1H, m), 2.33-2.27 (1H,m),1.24-1.02 (12H, m), 0.74, 0.72 (9H, 2 s), -0.02, -0.06, -0.21, -0.23 (6H, 4s).
実施例29-0
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-27を有するsiRNAを、参考例23.1で得られる化合物am-23を用いて、実施例1と同様に合成する。
実施例29
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-27を有するsiRNAを、参考例23.1で得られる化合物am-23を用いて、実施例1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6765.98 実測値6766.80
参考例24.0; 化合物I-28
工程1
参考例6.0の工程1で得られる((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(100 mg、0.306mmol)及び(3-モルフォリノフェニル)ボロン酸(127 mg、0.612 mmol)を用い、参考例6.0の工程2と同様にして、((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-ジメチル-6-(6-(3-モルフォリノフェニル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(127 mg、92 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 454(M+1)
工程2
工程1で得られた((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-ジメチル-6-(6-(3-モルフォリノフェニル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(120 mg、0.265 mmol)を用い、参考例6.0の工程3と同様にして、リン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-ジメチル-6-(6-(3-モルフォリノフェニル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)mメチル(65.0 mg、38.0%)を得た。
ESI-MS(m/z): 646(M+1)
工程3
工程2で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-ジメチル-6-(6-(3-モルフォリノフェニル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(63.0 mg、0.0980mmol)を用い、参考例16.0の工程3と同様にして、リン酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(6-(3-モルフォリノフェニル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-28) トリエチルアンモニウム塩(9.00 mg、15.5 %)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 8.83 (1H, s), 8.72 (1H,s),7.85-7.75 (2H, m), 7.52-7.44 (1H, m), 7.28-7.20 (1H, m), 6.21-6.19 (1H,m),4.76-4.68 (1H, m), 4.45-4.40 (1H, m), 4.34-4.28 (1H, m), 4.06 (2H,s),3.88-3.80 (4H, m), 3.23-3.15 (4H, m), 3.08 (6H, q, J = 7.3 Hz), 1.16 (9H, t,J= 7.3 Hz).
ESI-MS(m/z): 494(M+1)
参考例24.1:化合物am-24
工程1
参考例17.1の工程2で得られた6-クロロ-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリンを用い、参考例24.0の工程1と同様にして、9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(3-モルフォリノフェニル)-9H-プリンを得る。
工程2〜4
工程1で得られた9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(3-モルフォリノフェニル)-9H-プリンを用い、参考例1.1の工程3〜5と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-5-(6-(3-モルフォリノフェニル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチル ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-24)を得る。
実施例30
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-28を有するsiRNAを、参考例24.1で得られる化合物am-24を用いて、実施例1と同様に合成する。
参考例25.0; 化合物I-29
工程1
参考例6.0の工程1で得られる((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(100 mg、0.306mmol)及び(3-(ベンジルオキシ)フェニル)ボロン酸(140 mg、0.612mmol)を用い、参考例6.0の工程2と同様にして、((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-(ベンジルオキシ)フェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(180 mg、130 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 475(M+1)
工程2
工程1で得られた((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-(ベンジルオキシ)フェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール (140 mg、0.295 mmol)を用い、参考例6.0の工程3と同様にして、リン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-(ベンジルオキシ)フェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(95.0 mg、48.3 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 667(M+1)
工程3
工程2で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-(ベンジルオキシ)フェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(95.0 mg、0.142mmol)を用い、参考例16.0の工程3と同様にして、リン酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-(3-(ベンジルオキシ)フェニル)-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-29) トリエチルアンモニウム塩(32.0 mg、36.5 %)を得た。
1H-NMR(D2O, 400MHz) δ: 8.63 (1H, s), 8.59 (1H,s),7.67-7.55 (2H, m), 7.30-7.16 (6H, m), 6.94-6.88 (1H, m), 6.06 (1H, d, J =5.9Hz), 4.88 (2H, s), 4.71-4.62 (1H, m), 4.39-4.34 (1H, m), 4.28-4.22 (1H,m),4.06-3.95 (2H, m), 3.14-2.95 (6H, q, J = 7.3 Hz), 1.12 (9H, t, J = 7.3 Hz).
ESI-MS(m/z): 515(M+1)
参考例25.1-A:化合物am-25
工程1
参考例17.1の工程2で得られた6-クロロ-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリンを用い、参考例25.0の工程1と同様にして、6-(3-(ベンジルオキシ)フェニル)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリンを得る。
工程2〜4
工程1で得られた6-(3-(ベンジルオキシ)フェニル)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリンを用い、参考例1.1の工程3〜5と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-5-(6-(3-(ベンジルオキシ)フェニル-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-25)を得る。
参考例25.1:化合物am-25
工程1
参考例17.1の工程2で得られた6-クロロ-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリン(300 mg、0.554 mmol)および3-ベンジルオキシフェニルボロン酸を用い、参考例6.0の工程2と同様にして、6-(3-(ベンジルオキシ)フェニル)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリン(284 mg、74.4 %)を得た。
工程2〜4
工程1で得られた6-(3-(ベンジルオキシ)フェニル)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリンを用い、参考例1.1の工程3〜5と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-5-(6-(3-(ベンジルオキシ)フェニル-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト(0.35 g, 98%)を得た。
1H-NMR (CDCl3, 400MHz) δ: 8.91-8.90 (1H, m),8.49-8.45(2H, m), 8.35-8.34 (1H, m), 7.50-7.47 (5H, m), 7.40-7.20 (10H, m),7.16-7.14(1H, m), 6.83-6.81 (4H, m), 6.16-6.11 (1H, m), 5.21 (2H, s), 5.13-5.11(1H, m),4.44-4.41 (2H, m), 3.99-3.31 (12H, m), 2.69-2.29 (2H, m), 1.22-1.05(12H, m),0.82-0.77 (9H, m), -0.04- -0.04 (3H, m), -0.12- -0.21 (3H, m).
実施例31-0
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-29を有するsiRNAを、参考例25.1で得られる化合物am-25を用いて、実施例1と同様に合成する。
実施例31
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-29を有するsiRNA(6-(3-benzyloxy)phenyl-Puという)を、参考例25.1で得られる化合物am-25を用いて、実施例1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6857.09 実測値6857.18
参考例26.0; 化合物I-30
工程1
参考例6.0の工程1で得られる((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(100 mg、0.306mmol)及び(3-(メトキシカルボニル)フェニル)ボロン酸(110 mg、0.612mmol)を用い、参考例6.0の工程2と同様にして、((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-(メトキシカルボニル)フェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(160 mg、123 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 427(M+1)
工程2
工程1で得られた((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-(メトキシカルボニル)フェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール (130 mg、0.305 mmol)を用い、参考例6.0の工程3と同様にして、リン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-(メトキシカルボニル)フェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(100 mg、53.0 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 619(M+1)
工程3
工程2で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-(メトキシカルボニル)フェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(68.7 mg、0.111mmol)を用い、参考例1.0の工程5と同様にして、リン酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-(3-(メトキシカルボニル)フェニル)-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(45.0 mg、87.0 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 467(M+1)
工程4
工程3で得られたリン酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-(3-(メトキシカルボニル)フェニル)-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(20.0 mg、0.0430mmol)を1規定水酸化ナトリウム水溶液 (2 mL)に溶解し、室温で2時間撹拌した。酢酸-トリエチルアミン緩衝液(pH 6.5)を加え、減圧下、溶媒を留去して得られた残渣を分取HPLC(溶離液 0.01mmol/L 酢酸アンモニウム水溶液/メタノール系)にて精製することにより、リン酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-(3-(カルボキシ)フェニル)-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-30) トリエチルアンモニウム塩(10.0 mg、42.1%)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 8.88-8.53 (3H, m), 8.34-8.22(1H,m), 8.03-7.92 (1H, m), 7.60-7.48 (1H, m), 6.22-6.15 (1H, m), 4.76-4.65 (1H,m),4.47-4.42 (1H, m), 4.35-4.30 (1H, m), 4.15-4.00 (2H, m), 3.09 (6H, q, J =7.2Hz), 1.16 (9H, t, J = 7.3 Hz).
ESI-MS(m/z): 453(M+1)
参考例26.1:化合物am-26
工程1
参考例17.1の工程2で得られた6-クロロ-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリンを用い、参考例26.0の工程1と同様にして、9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(3-メトキシカルボニル)-9H-プリンを得る。
工程2
工程1で得られた9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(3-メトキシカルボニル)-9H-プリンを用い、参考例26.0の工程4と同様にして、9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(3-カルボキシル)-9H-プリンを得る。
工程3〜5
工程2で得られた9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(3-カルボキシル)-9H-プリンを用い、参考例1.1の工程3〜5と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-5-(6-(3-カルボキシルフェニル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチル ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-26)を得る。
参考例26.1:化合物am-26
工程1
参考例17.1の工程2で得られた6-クロロ-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリン(0.600g, 1.11 mmol)を用い、参考例26.0の工程1と同様にして、9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(3-メトキシカルボニル)-9H-プリン (0.578 g, 81%)を得た。
工程2
工程1で得られた9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(3-メトキシカルボニル)-9H-プリン (0.578 g, 0.902 mmol)を用い、参考例26.0の工程4と同様にして、3-(9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリン-6-イル)安息香酸 (0.505 g, 89%)を得た。
工程3
工程2で得られた3-(9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリン-6-イル)安息香酸 (0.897 g, 1.43 mmol)をDMF (10 mL)に溶解し、3-ヒドロキシプロパンニトリル (0.291 mL, 4.29 mmol)および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (0.411 g, 2.15 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物 (0.329 g, 2.15 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン(0.750mL, 4.29 mmol)を加え、室温で終夜撹拌した。反応液に飽和重層水を加え、酢酸エチルで2回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をヘキサン/酢酸エチル系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、3-(9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリン-6-イル)安息香酸2-シアノエチル (0.373 g, 38%)を得た。
工程4〜6
工程3で得られた3-(9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリン-6-イル)安息香酸2-シアノエチルを用い、参考例1.1の工程3〜5と同様にして、3-(9-((2R,3R,4R,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-3-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル安息香酸2-シアノエチル(化合物am-26)を得た。
実施例32-0
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-30を有するsiRNAを、参考例26.1で得られる化合物am-26を用いて、実施例1と同様に合成する。
実施例32
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-30を有するsiRNA(6-(3-carboxy)phenyl-Puという)を、参考例26.1で得られる化合物am-26を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6794.98 実測値 6792.84
参考例27.0; 化合物I-31
工程1
参考例10.0の工程1で得られる5-ブロモ-1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオン(100 mg、0.275 mmol)を用いて、参考例6.0の工程2と同様にして、1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(ヒドロキシメチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)-5-スチリルピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオン(43.8 mg、41 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 385(M-1)
工程2
工程1で得られた1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(ヒドロキシメチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)-5-スチリルピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオン(16.3 mg、0.042 mmol)をジクロロメタン(2 mL)に溶解し、1H-テトラゾール(7.39mg、0.105 mmol)、ジ-tert-ブチルジイソプロピルホスホールアミド(0.028 mL、0.084 mmol)を加え、室温で2時間攪拌した。反応液を0℃に冷却し、(2R,8aS)-(+)-(カンファリルスルホニル)オキサジリジン(19.4 mg、0.084mmol)を加え、0℃でさらに30分間攪拌した。反応液を室温に冷却後、飽和重曹水を加え、Presep(登録商標; けいそう土、顆粒状タイプM, 4.5g/25mL)を通してろ過し、溶媒を減圧下留去した。残渣をヘプタン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製することにより、リン酸ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(2,4-ジオキソ-5-スチリル-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(10.0 mg、41 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 577(M-1)
工程3
工程2で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(2,4-ジオキソ-5-スチリル-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(10.0 mg、0.017 mmol)を用いて、参考例1.0の工程5と同様にして、リン酸 ((2R,3S,4R,5R)-5-(2,4-ジオキソ-5-スチリル-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-31)トリエチルアンモニウム塩(9.30 mg、102%)を得た。
1H-NMR (D2O, 300MHz) δ: 7.96 (s, 1H), 7.49 (d, J = 7.3Hz,2H), 7.37-7.19 (m, 3H), 6.88 (d, J = 16.5 Hz, 1H), 5.91 (d, J = 5.1 Hz,1H),4.32 (t, J = 5.1 Hz, 1H), 4.26 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 4.21-4.20 (m, 1H),4.11-3.99(m, 2H), 3.09 (q, J = 7.3 Hz, 6H), 1.16 (t, J = 7.3 Hz, 9H).
ESI-MS(m/z): 425(M-1)
参考例27.1:化合物am-27
工程1
参考例13.1の工程2で得られた5-ブロモ-1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用いて、参考例27.0の工程1と同様にして、1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル) -5-スチリルピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを得る。
工程2
工程1で得られる1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル) -5-スチリルピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用いて、参考例1.1の工程3〜5と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(2,4-ジオキソ-5-スチリル-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイトを得る。
実施例33
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-31を有するsiRNAを、参考例27.1で得られる化合物am-27を用いて、実施例1と同様に合成する。
参考例28.1; 化合物am-28
工程1
市販の(2R,3R,4S,5R)-2-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-3,4-ジオール (5.00 g, 17.4 mmol)をピリジン (42 mL)に溶解させ、1,3-ジクロロ-1,1,3,3-テトライソプロピルジシロキサン (6.70 ml, 20.9mmol)を加え、室温で2時間攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下で溶媒を留去して得られた残渣をヘキサン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製することにより、(6aR,8R,9R,9aS)-8-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)-2,2,4,4-テトライソプロピルテトラヒドロ-6H-フロ[3,2-f][1,3,5,2,4]トリオキサジシロシン-9-オール (8.64 g、収率94%)を得た。
ESI-MS(m/z): 530(M+1)
工程2
工程1で得られた(6aR,8R,9R,9aS)-8-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)-2,2,4,4-テトライソプロピルテトラヒドロ-6H-フロ[3,2-f][1,3,5,2,4]トリオキサジシロシン-9-オール (6.50 g, 12.3 mmol)を参考例6.0の工程2と同様にして、(6aR,8R,9R,9aS)-2,2,4,4-テトライソプロピル-8-(6-((E)-スチリル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロ-6H-フロ[3,2-f][1,3,5,2,4]トリオキサジシロシン-9-オール (4.77 g, 収率65 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 598(M+1)
工程3
工程2で得られた(6aR,8R,9R,9aS)-2,2,4,4-テトライソプロピル-8-(6-((E)-スチリル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロ-6H-フロ[3,2-f][1,3,5,2,4]トリオキサジシロシン-9-オール (4.50 g, 7.54 mmol)をN,N-ジメチルホルムアミド (50 mL)に溶解させ、0℃にて60%水素化ナトリウム (302 mg, 7.54 mmol)、ヨウ化メチル (0.471 mL,7.54mmol)を加え、室温で2時間攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下で溶媒を留去して得られた残渣をヘキサン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製することにより、6-((E)-スチリル)-9-((6aR,8R,9R,9aR)-2,2,4,4-テトライソプロピル-9-メトキシテトラヒドロ-6H-フロ[3,2-f][1,3,5,2,4]トリオキサジシロシン-8-イル)-9H-プリン(2.09g, 収率45 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 612(M+1)
工程4
工程3で得られた6-((E)-スチリル)-9-((6aR,8R,9R,9aR)-2,2,4,4-テトライソプロピル-9-メトキシテトラヒドロ-6H-フロ[3,2-f][1,3,5,2,4]トリオキサジシロシン-8-イル)-9H-プリン(569mg, 0.931 mmol)をテトラヒドロフラン(10 mL)に溶解させ、酢酸 (0.117 mL, 2.049 mmol)とテトラブチルアンモニウムフルオリドのテトラヒドロフラン溶液 (1 mol/L, 2.05 ml, 2.05 mmol)を加え、室温で30分間攪拌した。反応液を減圧下濃縮し、クロロホルム/メタノール系のカラムクロマトグラフィーで精製することにより、(2R,3S,4R,5R)-2-(ヒドロキシメチル)-4-メトキシ-5-(6-((E)スチリル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール (341 mf, 収率99%)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 500MHz) δ: 8.90 (s, 1H), 8.43 (d, J=16.7Hz, 1H), 8.13 (s, 1H), 7.68 - 7.75 (m, 3H), 7.37 - 7.47 (m, 3H), 6.17 (dd,J=2.2, 11.9 Hz, 1H), 5.95 (d, J= 7.0 Hz, 1H), 4.77 (dd, J= 4.7, 7.4 Hz 1H),4.61(d, J= 4.4 Hz, 1H)), 4.39 - 4.41 (m, 1H), 3.99 - 4.02 (m, 1H), 3.78 - 3.83(m,1H), 3.37 (s, 3H), 2.67 (s, 1H).
ESI-MS(m/z): 369(M+1)
工程5
工程4で得られる((2R,3S,4R,5R)-2-(ヒドロキシメチル)-4-メトキシ-5-(6-((E)スチリル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オールを用い、参考例1.1と同様にして(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-メトキシ-5-(6-((E)スチリル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-28)を得た。この化合物は精製せず、次工程に使用した。
実施例34
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-32を有するsiRNA(2'-OMe-6-styryl-dAという)を、参考例28.1で得られる化合物am-28を用いて、実施例1と同様に合成した。
ESI-MS(m/z)：理論値 6792.04 実測値6792.18
参考例29.0; 化合物I-33
市販の5-メチルピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1.0と同様にしてリン酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-ジヒドロキ-5-(5-メチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル) テトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-33)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 7.67 (s, 1H), 5.86 (d, J = 5.5Hz,1H), 4.23 (dt, J = 12.8, 4.9 Hz, 2H), 4.13 (dt, J = 6.0, 2.6 Hz, 1H),4.02-3.89(m, 2H), 1.80 (s, 3H).
ESI-MS(m/z): 337(M-1)
参考例29.1:化合物am-29
工程1
市販の5-メチルピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1.1と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(5-メチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイトを得る。
実施例35
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-33を有するsiRNAを、参考例29.1で得られる化合物am-29を用いて、実施例1と同様に合成する。
参考例30.0; 化合物I-34
市販の6-メチルピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1.0と同様にしてリン酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-ジヒドロキ-5-(6-メチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-34)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 5.63 (s, 1H), 5.56 (d, J = 2.9Hz,1H), 4.31 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 4.05-3.90 (m, 4H), 2.27 (s, 3H), 1.95 (s,1H).
ESI-MS(m/z): 337(M-1)参考例30.1:化合物am-30
市販の6-メチルピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1.1と同様にして(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(6-メチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-30)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 500MHz) δ: 7.80(m, 1H), 7.48-6.78(m,13H),5.55(s, 1H), 5.50(m, 1H), 5.10(m, 1H), 4.31-4.18(m, 2H), 3.93-3.22(m,12H),2.66-2.28(m, 5H), 1.18-1.05(m, 12H), 0.87(0.86)(s, 9H), 0.07(0.06)(s,3H),0.00(-0.01)(s, 3H).
実施例36
後述の表38に示す454-Xuのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-34を有するsiRNA(6-Me-dUという)を、参考例30.1で得られる化合物am-30を用いて、実施例1と同様に合成した。
MALDI-TOF/MS(アンチセンス鎖)： 理論値6680.87(M-H)実測値 6681.08
参考例31.0; 化合物I-35
工程1
公知の方法[Organic Process Research & Development、2001年,5巻,426-433頁]に記載された方法で合成した7-クロロ-6-ニトロキナゾリン2,4(1H,3H)-ジオン(0.626 g、1.24 mmol)を用い、参考例1.0の工程1と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-(ベンゾイルオキシメチル)-5-(7-クロロ-6-ニトロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイル ジベンゾエート(0.292 g、34%)を得た。
ESI-MS(m/z): 684(M-1)
工程2
工程1で得られた(2R,3R,4R,5R)-2-(ベンゾイルオキシメチル)-5-(7-クロロ-6-ニトロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイル ジベンゾエート(3.00 g、4.37 mmol)を用いて、参考例7.0の工程2と同様にして、7-クロロ-1-(2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-6-ニトロキナゾリン2,4(1H,3H)-ジオン(1.26g、77%)を得た。
ESI-MS(m/z): 372(M-1)
工程3
工程2で得られた7-クロロ-1-(2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-6-ニトロキナゾリン2,4(1H,3H)-ジオンを用いて、参考例7.0の工程3〜4と同様にして、リン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(7-クロロ-6-ニトロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチルを得た。
ESI-MS(m/z): 604(M-1)
工程4
工程3で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(7-クロロ-6-ニトロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(32.5 mg、0.054mmol)を用いて、参考例1.0の工程5と同様にして、リン酸((2R,3S,4R,5R)-5-(7-クロロ-6-ニトロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-35) トリエチルアンモニウム塩(20.0 mg、67%)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 8.67 (s, 1H), 7.87 (s, 1H),6.08(d, J = 4.8 Hz, 1H), 4.77 (dd, J= 6.6, 4.8 Hz, 1H), 4.42 (t, J = 6.4 Hz,1H),4.08-3.99 (m, 4H), 3.09 (q, J = 7.3 Hz, 6H), 1.17 (t, J = 7.3 Hz, 9H).
ESI-MS(m/z): 452(M-1)
参考例31.1:化合物am-31
工程1
参考例31.0の工程2で得られる7-クロロ-1-(2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-6-ニトロキナゾリン2,4(1H,3H)-ジオンを用いて、参考例1.1の工程1〜2と同様にして、7-クロロ-1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-ニトロキナゾリン)-2,4(1H,3H)-ジオンを得る。
工程2
参考例31.1の工程1で得られる7-クロロ-1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-ニトロキナゾリン)-2,4(1H,3H)-ジオンを用いて、参考例1.1の工程3〜5と同様にして((2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(7-クロロ-6-ニトロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-31)を得る。
実施例37
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-35を有するsiRNAを、参考例31.1で得られる化合物am-31を用いて、実施例1と同様に合成する。
参考例32.0; 化合物I-36
工程1
参考例10.0の工程3で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(7-クロロ-6-ニトロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(20.0 mg、0.033mmol)をTHF(１mL)に溶解し、ジメチルアミン/THF溶液(1mL, 2.00mmol)を加え、室温で30分攪拌した。減圧下、溶媒を留去した後、残渣をプレパラティブ薄層クロマトグラフィー(ヘプタン/酢酸エチル=25/75)で精製することにより、ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(7-(ジメチルアミノ)-6-ニトロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(14.4 mg、71％)を得た。
ESI-MS(m/z): 613(M-1)
工程2
工程1で得られたジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(7-(ジメチルアミノ)-6-ニトロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(22.0 mg、0.036mmol)を用いて、参考例1.0の工程5と同様にして、リン酸((2R,3S,4R,5R)-5-(7-(ジメチルアミノ)-6-ニトロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-36)トリエチルアンモニウム塩(12.5 mg、62%)を得た。
ESI-MS(m/z): 461(M-1)
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 8.46 (s, 1H), 6.75 (s, 1H), 6.05(d,J = 4.4 Hz, 1H), 4.79 (dd, J= 6.6, 4.0 Hz, 1H), 4.38 (t, J = 7.0 Hz,1H),4.11-3.98 (m, 4H), 3.09 (q, J = 7.3 Hz, 6H), 2.92 (s, 6H), 1.17 (t, J = 7.3Hz,9H).
参考例32.1:化合物am-32
工程1
参考例31.1の工程1で得られる7-クロロ-1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-ニトロキナゾリン) -2,4(1H,3H)-ジオンを用いて、参考例32.0の工程1と同様にして1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-7-(ジメチルアミノ)-6-ニトロキナゾリン)-2,4(1H,3H)-ジオンを得る。
工程2
工程1で得られる1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-7-(ジメチルアミノ)-6-ニトロキナゾリン)-2,4(1H,3H)-ジオンを用いて、参考例1.1の工程3〜5と同様にして((2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(7-(ジメチルアミノ)-6-ニトロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-32)を得る。
実施例38
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-36を有するsiRNAを、参考例32.1で得られる化合物am-32を用いて、実施例1と同様に合成する。
参考例33.0; 化合物I-37
工程1
参考例31.0の工程1で得られる(2R,3R,4R,5R)-2-(ベンゾイルオキシメチル)-5-(7-クロロ-6-ニトロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイルジベンゾエート(292 mg、0.426 mmol)を用いて、参考例1.0の工程2と同様にして、1-(2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-7-(メチルアミノ)-6-ニトロキナゾリン2,4(1H,3H)-ジオン(110 mg、71%)を得た。
ESI-MS(m/z): 367(M-1)
工程2
工程1で得られる1-(2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-7-(メチルアミノ)-6-ニトロキナゾリン2,4(1H,3H)-ジオンを用いて、参考例1.0の工程3〜5と同様にして、リン酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(7-(メチルアミノ)-6-ニトロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-37)トリエチルアンモニウム塩を得た。
ESI-MS(m/z): 447(M-1)
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 8.67 (s, 1H), 6.48 (s, 1H),6.02(d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.78 (dd, J = 6.6, 4.0 Hz, 1H), 4.37 (t, J = 7.0 Hz,1H),4.12 (dt, J = 13.9, 5.6 Hz, 1H), 4.03-3.97 (m, 2H), 2.97 (s, 3H).（アミン、アミドのプロトン見えない）
参考例33.1:化合物am-33
参考例33.0の工程1で得られる1-(2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル-7-(メチルアミノ)-6-ニトロキナゾリン2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1.1と同様にして(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(7-(メチルアミノ)-6-ニトロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-33)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 500MHz) δ: 9.03(s, 1H), 8.40(m, 1H),7.88(m,1H), 7.48-6.73(m, 13H), 6.64(s, 1H), 5.88(m, 1H), 5.13(5.16)(m,1H),4.50-4.29(m, 2H), 3.93-3.25(m, 12H), 3.00(2.96)(d, J= 5.1 Hz,3H),2.60(2.32)(m, 2H), 1.20-1.05(m, 12H), 0.85(0.82)(s, 9H), 0.07(0.05)(s, 3H),-0.05(-0.06)(s,3H).
実施例39
後述の表38に示す454-Xuのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-37を有するsiRNA(6-NO2,7-Me-dQuという)を、参考例33.1で得られる化合物am-33を用いて、実施例1と同様に合成した。
MALDI-TOF/MS(アンチセンス鎖)： 理論値6790.94(M-H)実測値 6794.76
参考例34.0; 化合物I-38
工程1
参考例6.0の工程1で得られる((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(100 mg、0.306mmol)及び(E)-2-(3-クロロスチリル)-4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン(81.0 mg、0.306 mmol)を用い、参考例6.0の工程2と同様にして、((3aR,4R,6R,6aR)−6-(6-(3-クロロスチリル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(118 mg、90 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 429(M+1)
工程2
工程1で得られた((3aR,4R,6R,6aR)−6-(6-(3-クロロスチリル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(115 mg、0.268mmol)を用い、参考例6.0の工程3と同様にして、リン酸ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)−6-(6-(3-クロロスチリル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(107 mg、59.8 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 621(M+1)
工程3
工程2で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)−6-(6-(3-クロロスチリル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(120 mg、0.193mmol)を用い、参考例1.0の工程5と同様にして、リン酸((2R,3S,4R,5R)−5-(6-(3-クロロスチリル)-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-38)トリエチルアンモニウム塩(28.0 mg、25.4 %)を得た。
1H-NMR(D2O, 400MHz) δ: 8.45 (1H, s), 8.34 (1H,s),7.32-7.20 (1H, m), 6.86-6.70 (3H, m), 6.64-6.50 (2H, m), 5.92-5.85 (1H,m),4.60-4.54 (1H, m), 4.38-4.32 (1H, m), 4.28-4.20 (1H, m), 4.10-3.92 (2H,m),3.04 (6H, q, J = 7.5 Hz), 1.11 (9H, t, J = 127.8 Hz).
ESI-MS(m/z): 469(M+1)
参考例34.1:化合物am-34
工程1
参考例17.1の工程2で得られた6-クロロ-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリンを用い、参考例22.0の工程1と同様にして、6-(3-クロロスチリル)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリンを得る。
工程2〜4
工程1で得られた6-(3-クロロスチリル)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリンを用い、参考例1.1の工程3〜5と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-5-(6-(3-クロロスチリル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチル ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-34)を得る。
実施例40
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-38を有するsiRNAを、参考例34.1で得られる化合物am-34を用いて、実施例1と同様に合成する。
参考例35.1; 化合物am-35
工程1
参考例17.1の工程2で得られた6-クロロ-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリン(300 mg、0.554 mmol)及びベンゾ[b]チオフェン-2-ボロン酸を用い、参考例6.0の工程2と同様にして、6-(ベンゾ[b]チオフェン-2-イル)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリン(315 mg、89.0 %)を得た。
工程2〜4
工程1で得られた6-(ベンゾ[b]チオフェン-2-イル)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリンを用い、参考例1.1の工程3〜5と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-5-(6-(ベンゾ[b]チオフェン-2-イル)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチル ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-35)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 8.99, 8.98 (1H, 2 s), 8.85,8.83(1H, 2 s), 8.41, 8.38 (1H, 2 s), 7.96-7.91 (2H, m), 7.53-7.34 (8H,m),7.32-7.19 (3H, m), 6.85-6.79 (4H, m), 6.17-6.08 (1H, m), 5.17-5.10 (1H,m),4.50-4.36 (2H, m), 4.02-3.84 (1H, m), 3.78 (6H, s), 3.68-3.55 (4H,m),3.38-3.30 (1H, m), 2.69-2.62 (1H, m), 2.33-2.28 (1H, m), 1.23-1.03 (12H,m),0.76, 0.75 (9H, 2 s), -0.01, -0.04, -0.19, -0.19 (6H, 4 s).
実施例41
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-39を有するsiRNA(6-benzothiophenyl purineという)を、参考例35.1で得られる化合物am-35を用いて、実施例1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6807.05 実測値6807.89
参考例36.1; 化合物am-36
工程1
参考例17.1の工程2で得られた6-クロロ-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリン(300 mg、0.554 mmol)及び6-ベンジルオキシナフタレン-2-ボロン酸を用い、参考例6.0の工程2と同様にして、6-(6-(ベンジルオキシ)ナフタレン-2-イル)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリン(307 mg、74.9 %)を得た。
工程2〜4
工程1で得られた6-(6-(ベンジルオキシ)ナフタレン-2-イル)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリンを用い、参考例1.1の工程3〜5と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-5-(6-(6-(ベンジルオキシ)ナフタレン-2-イル)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチル ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-36)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 9.36 (1H, s), 8.93, 8.91 (1H,2s), 8.88-8.83 (1H, m), 8.40, 8.37 (1H, 2 s), 8.02-7.86 (2H, m), 7.53-7.34(11H,m), 7.33-7.18 (5H, m), 6.86-6.79 (4H, m), 6.20-6.10 (1H, m), 5.23 (2H,s),5.17-5.12 (1H, m), 4.50-4.37 (2H, m), 4.03-3.85 (1H, m), 3.76 (6H,s),3.69-3.55 (4H, m), 3.40-3.30 (1H, m), 2.72-2.61 (1H, m), 2.37-2.25 (1H,m),1.24-1.03 (12H, m), 0.77, 0.76 (9H, 2 s), -0.01, -0.05, -0.18, -0.20 (6H, 4s).
実施例42
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-40を有するsiRNA6-benzyloxynaphtyl purineという)を、参考例36.1で得られる化合物am-36を用いて、実施例1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6907.15 実測値6909.04
参考例37.1; 化合物am-37
工程1
参考例17.1の工程2で得られた6-クロロ-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリン(300 mg、0.554 mmol)及び1-ピレンボロン酸を用い、参考例6.0の工程2と同様にして、9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(ピレン-1-イル)-9H-プリン(202 mg、51.5%)を得た。
工程2〜4
工程1で得られた9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(ピレン-1-イル)-9H-プリンを用い、参考例1.1の工程3〜5と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-5-(6-ピレン-1-イル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチル ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-37)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 9.13, 9.11 (1H, 2 s),8.57-8.47(2H, m), 8.41-8.31 (2H, m), 8.27-8.00 (7H, m), 7.52-7.45 (2H, m),7.42-7.32(4H, m), 7.31-7.16 (2H, m), 6.86-6.78 (4H, m), 6.27-6.16 (1H, m),5.22-5.16(1H, m), 4.53-4.40 (2H, m), 4.06-3.88 (1H, m), 3.76, 3.75 (6H, 2 s),3.72-3.56(4H, m), 3.43-3.32 (1H, m), 2.76-2.61 (1H, m), 2.38-2.25 (1H, m),1.25-1.06 (12H,m), 0.79, 0.78 (9H, 2 s), 0.04, 0.02, -0.12, -0.13 (6H, 4 s).
実施例43
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-41を有するsiRNA(6-pyrenyl purineという)を、参考例37.1で得られる化合物am-37を用いて、実施例1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6875.11 実測値6875.62
参考例38.1; 化合物am-38
工程1
参考例17.1の工程2で得られた6-クロロ-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリン(310 mg、0.573 mmol)及び2-アントラセンボロン酸を用い、参考例6.0の工程2と同様にして、6-(アントラセン-2-イル)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリン(215 mg、55.0 %)を得た。
工程2〜4
工程1で得られた6-(アントラセン-2-イル)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリンを用い、参考例1.1の工程3〜5と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-5-(6-(アントラセン-2-イル)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-38)を得た。
1H-NMR (CDCl3, 500MHz) δ: 9.69-9.69 (1H, m),8.98-8.96(1H, m), 8.83-8.82 (1H, m), 8.71-8.69 (1H, m), 8.46-8.43 (2H, m),8.18-8.16(1H, m), 8.05-8.04 (2H, m), 7.50-7.48 (4H, m), 7.41-7.37 (4H, m), 7.31-7.29(2H,m), 7.24-7.22 (1H, m), 6.84-6.83 (4H, m), 6.20-6.15 (1H, m), 5.17-5.15(1H, m),4.47-4.43 (2H, m), 3.99-3.92 (1H, m), 3.80-3.79 (6H, m), 3.68-3.60(4H, m),3.40-3.34 (1H, m), 2.67-2.32 (2H, m), 1.19-1.09 (12H, m), 0.77-0.77(9H, m),0.01(-0.02) (3H, s), -0.18(-0.16) (3H, s).
実施例44
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-42を有するsiRNA(6-anthracenyl purineという)を、参考例38.1で得られる化合物am-38を用いて、実施例1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6851.09 実測値6850.63
参考例39.1; 化合物am-39
工程1
公知の方法[ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー(J.Am.Chem.Soc)、1991年,113巻,4329-4331頁]に記載された方法で合成した(2R,3S,5R)−2−((ビス(4−メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)−5−(6−クロロ―9H―プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール(0.287g, 0.500 mmol)をTHF (2.50 mL)に溶解し、トリエチルアミン (0.279 mL、2.00 mmol)、ベンジルアミン (0.164 mL、1.50 mmol)を加え、50℃で一晩攪拌した。反応混合物に飽和重曹水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣を酢酸エチル/ヘキサン系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、(2R,3S,5R)-5-(6-(ベンジルアミノ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-オール (0.241 g, 75%)を得た。
工程2
工程1で得られた(2R,3S,5R)-5-(6-(ベンジルアミノ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-オール (0.241 g, 0.374 mmol)をTHF (3.74 mL)に溶解し、DIEA (0.196 mL, 1.12 mmol)、3-(クロロ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノオキシ)プロパンニトリル (0.100 mL, 0.449 mmol)を0℃で加え、室温でアルゴン雰囲気下、2時間攪拌した。反応混合物に飽和重曹水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣を1%トリエチルアミン含有酢酸エチル/ヘキサン系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、(2R,3S,5R)-5-(6-(ベンジルアミノ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト (am-39, 0.152 g, 48%)を得た。
1H-NMR (CDCl3, 500MHz) δ: 8.35 (1H, s), 7.94-7.92 (1H,m),7.41-7.16 (14H, m), 6.80-6.77 (4H, m), 6.45-6.42 (1H, m), 6.00 (1H, br s),4.88(2H, br s), 4.77-4.75 (1H, m), 4.29-4.27 (1H, m), 3.87-3.57 (4H, m),3.78-3.76(6H, m), 3.44-3.31 (2H, m), 2.89-2.86 (1H, m), 2.64-2.59 (2H, m),2.46-2.45 (1H,m), 1.20-1.11 (12H, m).
実施例45
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-43を有するsiRNA(N-Bn dAという)を、参考例39.1で得られる化合物am-39を用いて、実施例1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6864.01 実測値6765.02
参考例40.1; 化合物am-40
工程1
公知の方法[ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー(J.Am.Chem.Soc)、1991年,113巻,4329-4331頁]に記載された方法で合成した(2R,3S,5R)−2−((ビス(4−メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)−5−(6−クロロ―9H―プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール(0.287g, 0.500 mmol)をTHF (2.50 mL)に溶解し、トリエチルアミン (0.279 mL、2.00 mmol)、N-メチルベンジルアミン (0.193 mL、1.50 mmol)を加え、50℃で一晩攪拌した。反応混合物に飽和重曹水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣を酢酸エチル/ヘキサン系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、(2R,3S,5R)-5-(6-(ベンジル(メチル)アミノ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-オール(0.187 g, 57%)を得た。
工程2
工程1で得られた(2R,3S,5R)-5-(6-(ベンジル(メチル)アミノ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-オール(0.187g, 0.284 mmol)を用いて、参考例39.1の工程2と同様にして、(2R,3S,5R)-5-(6-(ベンジル(メチル)アミノ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト (am-40, 0.169 g, 69%)を得た。
1H-NMR (CDCl3, 500MHz) δ: 8.33 (1H, s), 7.91-7.89 (1H,m),7.40-7.38 (2H, m), 7.30-7.16 (12H, m), 6.79-6.76 (4H, m), 6.48-6.46 (1H,m),5.34 (2H, br s), 4.73-4.72 (1H, m), 4.29-4.27 (2H, m), 3.87-3.56 (4H,m),3.76-3.76 (6H, m), 3.44-3.29 (5H, m), 2.84-2.78 (1H, m), 2.65-2.60 (2H,m),2.46-2.44 (1H, m), 1.20-1.10 (12H, m).
実施例46
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-44を有するsiRNA(N-Bn-N-Me dAという)を、参考例40.1で得られる化合物am-40を用いて、実施例1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6778.04 実測値6778.19
参考例41.1; 化合物am-41
工程1
参考例6.1の工程3で得られた9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-((E)-スチリル)-9H-プリン(4.90 g、8.05 mmol)を用いて、参考例14.0の工程2と同様にして、8-ブロモ-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-((E)-スチリル)-9H-プリン(4.20 g、76%)を得た。
ESI-MS(m/z): 688(M+1)
工程2
工程1で得られた8-ブロモ-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-((E)-スチリル)-9H-プリン(300 mg、0.436 mmol)をエタノール(4.4 mL)に溶解し、ベンジルアミン(0.304 mL、2.181 mmol)、トリエチルアミン(0.143 mL、1.308 mmol)を加え、加熱還流下で3時間攪拌した。反応液を室温に冷却後、溶媒を減圧下留去した。残渣をヘプタン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製することにより、N-ベンジル-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-((E)-スチリル)-9H-プリン-8-アミン(304 mg、98%)を得た。
工程3
工程2で得られたN-ベンジル-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-((E)-スチリル)-9H-プリン-8-アミンを用いて、参考例1.1の工程3〜5と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-5-(8-(ベンジルアミノ)-6-((E)-スチリル)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチル ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-41)を得た。
1H-NMR (CDCl3, 500MHz) δ: 8.59-8.56(m, 1H), 8.21-8.17(m,1H), 7.63-7.61 (m, 2H), 7.55-7.50 (m, 1H), 7.37-7.34 (m, 4H), 7.30-7.18(m,11H), 7.15-7.13 (m, 2H), 6.74-6.67 (m, 4H), 6.33 -6.19 (m, 2H), 5.09 (m,1H),4.86-4.75 (m, 1H), 4.40-4.27 (m, 2H), 4.13-3.69 (m, 2H), 3.65-3.50 (m,4H),3.39 (m, 1H), 2.77-2.24 (m, 2H), 1.25-1.01 (m, 12H), 0.73 (m,9H),-0.03(-0.01)(s, 3H), -0.23(-0.24)(s, 3H).
実施例47
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-45を有するsiRNA(8-BnNH-6-styryl purineという)を、参考例41.1で得られる化合物am-41を用いて、実施例12と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6882.14 実測値6882.50
参考例42.1; 化合物am-42
工程1
参考例41.1の工程1で得られた8-ブロモ-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-((E)-スチリル)-9H-プリン(300 mg、0.436 mmol)及びフラン-3-イルメタンアミン(0.121 mL、1.308 mmol)を用い、参考例41.1の工程2と同様にして、9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-N-(フラン-3-イルメチル)-6-((E)-スチリル)-9H-プリン-8-アミンを(279mg、91%)を得た。
工程2
工程1で得られた9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-N-(フラン-3-イルメチル)-6-((E)-スチリル)-9H-プリン-8-アミンを用いて、参考例1.1の工程3〜5と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-5-(8-(フラン-3-イルメチルアミノ)-6-((E)-スチリル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-42)を得た。
1H-NMR (CDCl3, 400MHz) δ: 8.58 (m, 1H), 8.28-8.24 (m,1H),7.67-7.65 (m, 2H), 7.60-7.56 (m, 1H), 7.41-7.36 (m, 4H), 7.32-7.23 (m,7H), 7.00(m, 1H), 6.81-6.76 (m, 4H), 6.35 (m, 1H), 6.29-6.16 (m, 1H),6.16-6.08 (m, 1H),5.05-5.01 (m, 1H), 4.51 (m, 1H), 4.34 (m, 1H), 4.24 (m, 1H),4.11-4.05 (m, 1H),3.95 (m, 1H), 3.79 (s, 6H), 3.66-3.52 (m, 4H), 3.46 (m, 1H),3.39-3.35 (m, 1H),2.74 (m, 1H), 2.24 (m, 1H), 1.32-0.97 (m, 14H), 0.72 (m,9H), -0.04(-0.02)(s,3H), -0.25(-0.27)(s, 3H).
実施例48
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-46を有するsiRNA(8-furanylmethylamino-6-styryl purineという)を、参考例42.1で得られる化合物am-42を用いて、実施例12と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6872.11 実測値6872.95
参考例43.1; 化合物am-43
工程1
参考例41.1の工程1で得られた8-ブロモ-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-((E)-スチリル)-9H-プリン(300 mg、0.436 mmol)及び(2H-テトラゾール-5-イル)メタンアミン(0.130 mL、1.308 mmol)を用い、参考例41.1の工程2と同様にして、N-((2H-テトラゾール-5-イル)メチル)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-((E)-スチリル)-9H-プリン-8-アミンを(367 mg、119%)を得た。
ESI-MS(m/z): 706(M+1)
工程2
工程1で得られたN-((2H-テトラゾール-5-イル)メチル)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-((E)-スチリル)-9H-プリン-8-アミン(366 mg、0.518mmol)をDMF(5.2 mL)に溶解し、DBU(0.234mL、1.555 mmol)、ピバル酸クロロメチル(0.150 mL、1.037 mmol)を加え、80℃で3時間攪拌した。反応混合物に飽和重曹水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣を酢酸エチル/ヘプタン系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、(5-((9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-((E)-スチリル)-9H-プリン-8-イルアミノ)メチル)-2H-テトラゾール-2-イル)メチル ピバレートと(5-((9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-((E)-スチリル)-9H-プリン-8-イルアミノ)メチル)-1H-テトラゾール-1-イル)メチル ピバレートの混合物(172mg、41 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 821(M+1)
工程3
工程2で得られた(5-((9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-((E)-スチリル)-9H-プリン-8-イルアミノ)メチル)-2H-テトラゾール-2-イル)メチル ピバレートと(5-((9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-((E)-スチリル)-9H-プリン-8-イルアミノ)メチル)-1H-テトラゾール-1-イル)メチル ピバレートの混合物を用いて、参考例1.1の工程3〜5と同様にして、(5-((9-(2R,3R,4R,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-3-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-4-((2-シアノエトキシ)(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-6-((E)-スチリル)-9H-プリン-8-イルアミノ)メチル)-1H-テトラゾール-1-イル)メチル ピバレートと(5-((9-(2R,3R,4R,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-3-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-4-((2-シアノエトキシ)(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-6-((E)-スチリル)-9H-プリン-8-イルアミノ)メチル)-2H-テトラゾール-2-イル)メチル ピバレートの混合物(化合物am-43)を得た。
1H-NMR (CDCl3, 400MHz) δ: 8.63-8.58 (m, 1H), 8.15-8.07(m,1H), 7.64-7.62 (m, 2H), 7.50-7.16 (m, 11H), 6.88-6.86 (m, 1H), 6.80-6.78(m,4H), 6.67-6.63 (m, 1H), 6.38-6.19 (m, 1H), 5.10-5.03 (m, 1H), 4.68-4.51 (m,1H),4.51-4.30 (m, 3H), 4.20-3.94 (m, 2H), 3.80-3.77 (m, 6H), 3.75-3.52 (m,4H),3.45-3.43 (m, 1H), 2.82-2.17 (m, 2H), 1.32-1.14 (m, 12H), 1.09-0.96 (m,9H),0.88-0.82 (m, 2H), 0.74-0.71 (m, 9H), -0.02(0.01) (s, 3H), -0.24(-0.29)(m,3H).
実施例49
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-47を有するsiRNA(6-styryl-8-tetrazolylmethylamino purineという)を、参考例43.1で得られる化合物am-43を用いて、実施例12と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6874.08 実測値6873.91
参考例44.1; 化合物am-44
工程1
参考例17.1の工程2で得られた6-クロロ-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリン(900 mg、1.66 mmol)及び3-(2-メトキシカルボニルエチル)フェニルボロン酸を用い、参考例6.0の工程2と同様にして、9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(3-(3-メトキシ-3-オキソプロピル)フェニル)-9H-プリン(905 mg、81 %)を得た。
工程2〜6
工程1で得られた9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(3-(3-メトキシ-3-オキソプロピル)フェニル)-9H-プリンを用い、参考例26.1の工程2〜6と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-5-(6-(3-(3-(2-シアノエトキシ)-3-オキソプロピル)フェニル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-44)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 8.91, 8.89 (1H, 2 s),8.72-8.57(2H, m), 8.38, 8.34 (1H, 2 s), 7.53-7.45 (3H, m), 7.41-7.33 (5H, m),7.32-7.19(3H, m), 6.85-6.79 (4H, m), 6.19-6.09 (1H, m), 5.15-5.09 (1H, m),4.49-4.35(2H, m), 4.31-4.24 (2H, m), 4.03-3.84 (1H, m), 3.76 (6H, s), 3.68-3.55(4H, m),3.38-3.28 (1H, m), 3.15-3.08 (2H, m), 2.83-2.77 (2H, m), 2.69-2.62 (3H,m),2.34-2.27 (1H, m), 1.24-1.02 (12H, m), 0.76, 0.75 (9H, 2 s), -0.01,-0.05,-0.20, -0.20 (6H, 4 s).
実施例50
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-48を有するsiRNA(6-(m-carboxyethylphenyl) purineという)を、参考例44.1で得られる化合物am-44を用いて、実施例1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6823.03 実測値6824.53
実施例51
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-49を有するsiRNA(5-furyl dUという)を、市販の5-(2-フリル)-dU CEP (ベリー＆アソシエイツ社)用いて、実施例1と同様に合成した。
MALDI-TOF/MS(アンチセンス鎖) 理論値6717.94実測値 6717.65
実施例52
後述の表38に示す454−XYのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-51、センス鎖の3’末端から3塩基目のYにゼブラリン-5’-モノホスフェートを有するsiRNA(2-amino rAという)を、市販の2,6-ジアミノプリン-TOM-CE ホスホロアミダイト(グレン リサーチ社)、及びゼブラリン‐CEホスホロアミダイト(グレン リサーチ社)を用いて、実施例12と同様に合成した。
MALDI-TOF/MS(アンチセンス鎖) 理論値6704.62実測値 6704.90
MALDI-TOF/MS(センス鎖) 理論値 6725.85 実測値 6725.08
参考例47.1 化合物am-47
工程1
J.Am.Chem.Soc、1991年,第113巻,4329-4331頁に記載の方法で合成した(2R,3S,5R)-2-((ビス(4−メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール(0.573g, 1.00 mmol)および(3-(アミノメチル)フェニル)メタノール (0.412 g、3.00mmol)を用い、参考例39.1の工程1と同様にして、(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-((3-(ヒドロキシメチル)ベンジル)アミノ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール(678 mg、100%)を得た。
ESI-MS(m/z): 675(M+1)
工程2
工程1で得られた(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-((3-(ヒドロキシメチル)ベンジル)アミノ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール (0.337 g、0.500 mmol)を用いて、参考例1.1の工程2と同様にして、(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-((3-(tert-ブチルジメチルシロキシ)メチル)ベンジルアミノ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール (0.192 g、39%)を得た。
ESI-MS(m/z): 789(M+1)
工程3
工程2で得られた(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-((3-(tert-ブチルジメチルシロキシ)メチル)ベンジルアミノ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オールを用いて、参考例39.1の工程2と同様にして、(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-((3-(tert-ブチルジメチルシロキシ)メチル)ベンジルアミノ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル (2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイトを得た後、実施例53へと用いた。
実施例53
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-51を有するsiRNA(N6-(3-hydroxymethyl)Bn dAという)を、参考例47.1で得られる化合物am-47を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6794.04 実測値 6794.45
参考例48.1 化合物am-48
工程1
参考例48.1の工程１で得られた(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-((3-(ヒドロキシメチル)ベンジル)アミノ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール (0.337 g、0.500 mmol)を用いて、参考例1.1の工程4と同様にして、(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-((3-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)ベンジル)アミノ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール (0.195 g、40%)を得た。
ESI-MS(m/z): 977(M+1)
工程2
工程1で得られた(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-((3-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)ベンジル)アミノ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オールを用いて、参考例39.1の工程2と同様にして、(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-((3-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)ベンジル)アミノ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル (2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイトを得た後、実施例54へと用いた。
実施例54
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-52を有するsiRNA(N6-(3-phosphonooxymethyl)Bn dAという)を、参考例48.1で得られる化合物am-48を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
MALDI-TOF/MS(アンチセンス鎖) 理論値6873.01実測値 6876.34
参考例49.1 化合物am-49
工程1
市販の(2R,3S,5R)-5-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)-2-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-3-オール(2.00 g、7.39mmol)を用いて参考例1.1の工程1と同様にして、6-クロロ-9- ((4aR,6R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチルテトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリン (2.77g、91%)を得た。
工程2
工程1で得られた6-クロロ-9- ((4aR,6R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチルテトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリン(2.00 g、4.87 mmol)を用いて、参考例6.0の工程2と同様にして、9-((4aR,6R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチルテトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-((E)-スチリル)-9H-プリン(1.74 g、75%)を得た。
工程3〜5
工程2で得られた9-((4aR,6R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチルテトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキシリン-6-イル)-6-((E)-スチリル)-9H-プリンを用い、参考例1.1の工程3〜5と同様にして、(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-((E)-スチリル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチル ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-49)を得た。
ESI-MS(m/z): 841(M+1)
1H-NMR (CDCl3, 400MHz) δ: 8.84-8.84 (m, 1H), 8.41-8.37(m,1H), 8.28-8.26 (m, 1H), 7.73-7.71 (m, 3H), 7.42-7.39 (m, 6H), 7.31-7.22(m,37H), 6.79-6.77 (m, 4H), 6.53-6.52 (m, 1H), 4.82-4.75 (m, 1H), 4.34-4.32(m,1H), 3.89-3.56 (m, 14H), 3.49-3.33 (m, 4H), 2.98-2.93 (m, 1H), 2.75-2.62(m,2H), 2.48-2.47 (m, 1H), 1.27-1.24 (m, 2H), 1.20-1.19 (m, 9H), 1.14-1.12(m,3H).
実施例55
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-53を有するsiRNA(6-styrl-dPuという)を、参考例49.1で得られる化合物am-49を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6761.01 実測値 6762.51
参考例50.1 化合物am-50
工程1
J.Am.Chem.Soc、1991年,第113巻,4329-4331頁に記載の方法で合成した(2R,3S,5R)-2-((ビス(4−メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6−クロロ-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール(5.73g, 10.0 mmol)を用い、参考例1.1の工程2と同様にして、9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-6-クロロ-9H-プリン (6.87g, 100%)を得た。
工程2
Bioorg. Med. Chem., 2009年, 第17巻, 1974-1981頁に記載の方法で合成した(3-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)フェニル)メタノール (0.529 g, 1.20 mmol)をTHF (6.00 mL)に溶解し、0 ℃で水素化ナトリウム (0.053 g, 1.32 mmol)を加え、10分間室温で撹拌した。続いて、工程1で得られた9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-6-クロロ-9H-プリン(0.412g, 0.600 mmol)を0 ℃で加え、室温で1.5時間撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で溶媒を留去して9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-6-((3-ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)ベンジル)オキシ)-9H-プリンの粗精製物を得た。
工程3
工程2で得られた9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-6-((3-ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)ベンジル)オキシ)-9H-プリンをTHF (6.00 mL)に溶解させ、テトラブチルアンモニウムフルオリドのTHF溶液 (1 mol/L, 1.20 ml, 1.20 mmol)を加え、室温で30分間撹拌した。反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で溶媒を留去し、ヘキサン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製し、(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-((3-ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)ベンジル)オキシ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール (0.525 g, 90%)を得た。
ESI-MS(m/z): 978(M+1)
工程4
工程3で得られた(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-((3-ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)ベンジル)オキシ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール (0.525 g, 0.537 mmol)を用いて、参考例39.1の工程2と同様にして、(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-((3-ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)ベンジル)オキシ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル (2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-50) (0.475 g, 75%)を得た。
1H-NMR (CDCl3, 400MHz) δ: 8.47 (1H, d, J = 1.3 Hz),8.09(1H, d, J = 9.1 Hz), 7.52-7.00 (22H, m), 6.85-6.75 (8H, m), 6.49-6.45 (1H,m),5.66 (2H, s), 4.76 (1H, s), 4.31-4.30 (1H, m), 4.17 (2H, s), 3.88-3.56(16H,m), 3.41-3.33 (2H, m), 2.89-2.85 (1H, m), 2.62-2.61 (2H, m), 2.47 (1H, t,J =6.2 Hz), 1.20-1.11 (12H, m).
実施例56
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-54を有するsiRNA(O6-(3-phosphonooxymethyl)Bn dIという)を、参考例50.1で得られる化合物am-50を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6875.00 実測値 6874.56
参考例51.1:化合物am-51
工程1
参考例17.1の工程2で得られた6-クロロ-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリン(1.00 g、1.848 mmol)および(3-(2-メトキシ-2-オキソエチル)フェニル)ボロン酸 (538 mg、2.77 mmol)を用い、参考例6.0の工程2と同様にして、9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(3-(2-メトキシ-2-オキソエチル)フェニル)-9H-プリン(860 mg、71.1 %)を得た。
工程2〜6
工程1で得られた9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(3-(2-メトキシ-2-オキソエチル)フェニル)-9H-プリンを用い、参考例26.1の工程2〜6と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-5-(6-(3-(2-(2-シアノエトキシ)-2-オキソエチル)フェニル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-51)を得た。
1H-NMR (CDCl3, 400MHz) δ: 8.90, 8.88 (1H, 2 s),8.78-8.66(1H, m), 8.37, 8.34 (1H, 2 s), 7.58-7.42 (4H, m), 7.40-7.31 (4H, m),7.30-7.16(3H, m), 6.84-6.77 (4H, m), 6.18-6.07 (1H, m), 5.14-5.08 (1H, m),4.48-4.35(2H, m), 4.34-4.28 (2H, m), 4.00-3.86 (1H, m), 3.83 (2H, s), 3.76 (6H,s),3.68-3.53 (4H, m), 3.37-3.27 (1H, m), 2.72-2.62 (3H, m), 2.32-2.26 (1H,m),1.23-1.01 (12H, m), 0.75, 0.74 (9H, 2 s), -0.03, -0.06, -0.21, -0.23 (6H, 4s).
実施例57
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-55を有するsiRNA(6-(3-(N-methylcarbamoyl)phenyl)-Puという)を、参考例51.1で得られる化合物am-51を用いて、固相樹脂からの切り出しおよび保護基の脱保護の際にアンモニア水の代わりにAMA (40%メチルアミン水溶液 : 28%アンモニア水 = 1:1の混合溶液)を用いたのを除き、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6823.09 実測値 6821.94
参考例52.1 化合物am-52
工程1
参考例41.1の工程1で得られる8-ブロモ-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-((E)-スチリル)-9H-プリン(500 mg、0.727 mmol)を用い、参考例6.0の工程2と同様にして、9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-8-(4-ニトロフェニル)-6-((E)-スチリル)-9H-プリン(490 mg、92%)を得た。
工程2〜4
工程1で得られる9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-8-(4-ニトロフェニル)-6-((E)-スチリル)-9H-プリンを用い、参考例1.1の工程3〜5と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-5-(8-(4-ニトロフェニル)-6-((E)-スチリル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチル ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-52)を得た。
1H-NMR (CDCl3, 400MHz) δ: 8.68, 8.63 (1H, 2s),8.44-8.38(m, 3H), 8.15-8.12 (m, 2H), 7.82-7.72 (m, 3H), 7.51-7.43 (m, 10H),7.20-7.16(m, 1H), 6.82-6.79 (m, 5H), 5.92-5.83 (m, 2H), 4.54-4.44 (m, 1H),4.41-4.38 (m,1H), 3.86-3.78 (m, 7H), 3.65-3.59 (m, 4H), 3.42-3.30 (m, 1H),2.54-2.52 (m,1H), 2.29-2.28 (m, 1H), 1.17-1.11 (m, 12H), 0.68, 0.67 (9H, 2s),-0.06, 0.07,-0.32, -0.35 (6H, 4s)
実施例58
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-56を有するsiRNA(8-(4-nitro)phenyl-6-styryl-Puという)を、参考例52.1で得られる化合物am-52を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6898.10 実測値 6897.83
参考例53.1 化合物am-53
工程1
参考例51.1の工程1で得られた9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-6-クロロ-9H-プリン (0.500 g, 0.727 mmol)および2-アミノ-N-メチルアセトアミド(0.192g, 2.18 mmol)を用い、参考例39.1の工程1と同様にして、2-((9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)アミノ)-N-メチルアセトアミドの粗精製物を得た。
工程2
工程1で得られた2-((9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)アミノ)-N-メチルアセトアミドを用い、参考例50.1の工程3と同様にして、2-((9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)アミノ)-N-メチルアセトアミド(0.290g,57%)を得た。
ESI-MS(m/z): 625(M+1)
工程3
工程2で得られた2-((9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)アミノ)-N-メチルアセトアミド(0.370g,0.592 mmol)を用い、参考例39.1の工程2と同様にして、 (2R,3R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-((2-メチルアミノ)-2-オキソエチル)アミノ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル (2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-53) (0.121 g, 25%)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 8.35-8.34(1H, m),8.01-7.97(1H,m), 7.42-7.36(2H, m), 7.31-7.18(7H, m), 6.81-6.74(4H, m),6.47-6.36(2H, m),6.27-6.19(1H, m), 4.82-4.73(1H, m), 4.35-4.26(3H, m),3.90-3.54(9H, m),3.46-3.30(2H, m), 2.95-2.85(1H, m), 2.84-2.78(3H, m),2.71-2.54(2H, m),2.46(1H, t, J= 6.4 Hz), 1.21-1.10(12H, m).
実施例59
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-57を有するsiRNA(N6-(2-methylamino-2-oxo)ethyl dAという)を、参考例53.1で得られる化合物am-53を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6744.97 実測値 6745.41
参考例54.1 化合物am-54
工程1
参考例51.1の工程1で得られた9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-6-クロロ-9H-プリン (0.500 g, 0.727 mmol)および3-(アミノメチル)ピリジン-2(1H)-オン (0.256 g, 2.18 mmol)を用い、参考例39.1の工程1と同様にして、3-(((9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)アミノ)メチル)ピリジン-2(1H)-オンの粗精製物を得た。
工程2
工程1で得られた3-(((9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)アミノ)メチル)ピリジン-2(1H)-オンを用い、参考例50.1の工程3と同様にして、3-(((9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)アミノ)メチル)ピリジン-2(1H)-オン (0.370 g, 69%)を得た。
ESI-MS(m/z): 661(M+1)
工程3
工程2で得られた3-(((9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)アミノ)メチル)ピリジン-2(1H)-オン (0.360 g, 0.486 mmol)を用い、参考例39.1の工程2と同様にして、(2R,3R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-(((2-オキソ-1,2-ジヒドロピリジン-3-イル)メチル)アミノ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル (2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト (化合物am-54) (0.265 g, 63%)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 8.32(1H, brs), 7.97, 7.95 (1H,2s), 7.55(1H, d, J= 6.9 Hz), 7.41-7.37(2H, m), 7.31-7.15(9H, m),6.80-6.75(4H,m), 6.45-6.41(1H, m), 6.19-6.13(1H, m), 4.86-4.70(3H, m),4.30-4.23(1H, m),3.93-3.51(10H, m), 3.46-3.27(2H, m), 2.90-2.80(1H, m),2.68-2.54(2H, m),2.45(1H, t, J= 6.4 Hz), 1.19-1.09(12H, m).
31P-NMR (CDCl3, 162MHz) δ: 149.5, 149.4.
実施例60
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-58を有するsiRNA(N6-(2-oxo-1,2-dihydropyridin-3-yl)methyl dAという)を、参考例54.1で得られる化合物am-54を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6781.00 実測値 6781.94
参考例55.1 化合物am-55
工程1
参考例51.1の工程1で得られた9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-6-クロロ-9H-プリン (0.500 g, 0.727 mmol) およびJ.Org.Chem, 2005年, 70巻, 9198-9206頁に記載の方法で合成した2-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)エタン-1-オール (0.220g,0.602 mmol)を用い、参考例50.1の工程1-2と同様にして、(2R,4S,5R)-5-(6-(2-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)エトキシ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-オール (0.305 g, 54%)を得た。
工程2
工程1で得られた(2R,4S,5R)-5-(6-(2-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)エトキシ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-オール (0.300 g, 0.318 mmol)を用い、参考例39.1の工程2と同様にして、(2R,4S,5R)-5-(6-(2-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)エトキシ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル (2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト (化合物am-55) (0.240 g, 68%)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 8.44, 8.43 (1H, 2 s), 8.13,8.10(1H, 2 s), 7.46-7.14(18H, m), 6.80-6.76(8H, m), 6.51-6.47(1H, m),4.85-4.72(3H,m), 4.34-4.28(1H, m), 3.93-3.48(18H, m), 3.44-3.32(2H, m),2.92-2.84(1H, m),2.71-2.58(2H, m), 2.47(1H, t, J= 6.6 Hz), 1.21-1.11(12H, m).
31P-NMR (CDCl3, 162MHz) δ: 149.6, 149.4.
実施例61
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-59を有するsiRNA(O6-(2-phosphonooxyethyl) dIという)を、参考例55.1で得られる化合物am-55を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6798.91 実測値 6798.98
参考例56.1 化合物am-56
工程1
8-ブロモ-2’-デオキシ-アデノシン (1 g, 3.03 mmol)をエタノール (15.2 mL)に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン (2.65 mL,15.2mmol)およびベンジルアミン (1.32 mL, 12.1 mmol)を加え、還流下で5時間撹拌した。減圧下で溶媒を留去し、8-ベンジルアミノ-2’-デオキシ-アデノシンの粗精製物を得た。
工程2
工程1で得られた8-ベンジルアミノ-2’-デオキシ-アデノシンをDMF(15.2mL)に溶解し、1,1-ジメトキシ-N,N-ジメチルメタンアミン (6.04 mL, 45.5 mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。減圧下で溶媒を留去し、残渣をクロロホルム/メタノール系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、(E)-N’-(8-(ベンジルアミノ)-9-((2R,4S,5R)-4-ヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)-N,N-ジメチルホルムイミダミド (0.743 g, 60%)を得た。
工程3
工程2で得られた(E)-N’-(8-(ベンジルアミノ)-9-((2R,4S,5R)-4-ヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)-N,N-ジメチルホルムイミダミド (0.743 g, 1.81 mmol)を用い、参考例1.1の工程4と同様にして、N-(8-(ベンジルアミノ)-9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)ホルムアミド (0.216 g, 17%)を得た。
ESI-MS(m/z): 688(M+1)
工程4
工程3で得られたN-(8-(ベンジルアミノ)-9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)ホルムアミド (0.210 g, 0.306 mmol)を用い、参考例39.1の工程2と同様にして、(2R,4S,5R)-5-(8-(ベンジルアミノ)-6-ホルムアミド-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル (2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-56) (0.169 g, 62%)を得た。
1H-NMR (CDCl3, 400MHz) δ: 9.79 (1H, d, J = 10.6 Hz),8.30(1H, d, J = 2.5 Hz), 8.13 (1H, d, J = 10.6 Hz), 7.33-7.31 (2H, m),7.24-7.17(10H, m), 7.08-7.04 (2H, m), 6.73-6.68 (4H, m), 6.50-6.48 (1H, m),6.34-6.31(1H, m), 4.86-4.85 (1H, m), 4.35-4.31 (1H, m), 4.21-4.16 (1H, m),4.04-3.94(1H, m), 3.88-3.73 (7H, m), 3.65-3.50 (4H, m), 3.39-3.34 (1H, m),3.04-3.00(1H, m), 2.64-2.62 (1H, m), 2.56-2.40 (2H, m), 1.21-1.05 (12H, m).
実施例62
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-60を有するsiRNA(8-benzylamino dAという)を、参考例56.1で得られる化合物am-56を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6779.03 実測値 6779.44
参考例57.1 化合物am-57
工程1
(5-((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)-1,3-フェニレン)ジメタノール(1.00g, 2.55 mmol)を用い、参考例1.1の工程4と同様にして、(3-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)フェニル)メタノール (0.977g, 55%)を得た。
工程2
工程1で得られた(3-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)フェニル)メタノール (0.977 g, 1.41 mmol)および参考例51.1の工程1で得られた9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-6-クロロ-9H-プリン(0.483g, 0.703 mmol)を用い、参考例50.1の工程2と同様にして、9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-6-((3-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)ベンジル)オキシ)-9H-プリンの粗精製物を得た。
工程3
工程2で得られた9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-6-((3-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)ベンジル)オキシ)-9H-プリンを用い、参考例50.1の工程3と同様にして、(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-((3-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-ヒドロキシベンジル)オキシ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール (0.514 g, 74%)を得た。
工程4
工程3で得られた(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-((3-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-ヒドロキシベンジル)オキシ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール (0.186 g, 0.187 mmol)をTHF (0.935 mL)に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液 (1 mol/L, 0.206 mL, 0.206 mmol)および1-(1H-[1,2,3]トリアゾロ[4,5-b]ピリジン-1-イル)エタノン (0.036 g, 0.224 mmol)を加え、室温で4時間撹拌した。反応液に飽和塩化ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで逆抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥して、減圧下溶媒を留去した。残渣をヘキサン/酢酸エチル系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、3-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(((9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)オキシ)メチル)フェニルアセテート (0.082 g, 42%)を得た。
ESI-MS(m/z): 1035(M+1)
工程5
工程4で得られた3-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(((9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)オキシ)メチル)フェニルアセテート (0.080 g, 0.077 mmol)を用い、参考例39.1の工程2と同様にして、3-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(((9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(((2-シアノエトキシ)(ジイソプロピルアミノ)ホスファニ)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)オキシ)メチル)フェニルアセテート(化合物am-57) (0.039 g, 41%)を得た。
1H-NMR (CDCl3 400MHz) δ: 8.46 (1H, d, J = 1.0 Hz),8.10(1H, d, J= 8.9 Hz), 7.49-7.47 (2H, m), 7.40-7.17 (18H, m), 7.12-7.10 (1H,m),6.85-6.75 (8H, m), 6.48-6.46 (1H, m), 5.65 (2H, s), 4.76-4.74 (1H,m),4.31-4.29 (1H, m), 4.17 (2H, s), 3.78-3.34 (18H, m), 2.61-2.47 (4H, m),2.29(3H, s), 1.20-1.11 (12H, m).
実施例63
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-61を有するsiRNA(O6-(3-hydroxy-5-phosphonooxymethyl)Bn dIという)を、参考例57.1で得られる化合物am-57を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6890.02 実測値 6889.9
参考例58.1 化合物am-58
工程1
参考例51.1で得られた9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-6-クロロ-9H-プリン(0.781g, 1.136 mmol)およびび (3-(ヒドロキシメチル)フェニル)ボロン酸 (0.259 g,1.70 mmol)を用い、参考例6.0の工程2と同様にして、(3-(9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)フェニル)メタノール (0.721 g, 84%)を得た。
工程2
工程1で得られた(3-(9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)フェニル)メタノール (0.721 g, 0.950 mmol)を用い、参考例1.1の工程4と同様にして、9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-6-(3-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)フェニル)-9H-プリンの粗精製物を得た。
工程3
工程2で得られた9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-6-(3-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)フェニル)-9H-プリンを用い、参考例50.1の工程3と同様にして、 (2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-(3-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)フェニル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール(0.809g, 90%)を得た。
ESI-MS(m/z): 948(M+1)
工程4
工程3で得られた(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-(3-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)フェニル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール(0.189g, 0.200 mmol)を用い、参考例39.1の工程2と同様にして、(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-(3-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)フェニル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル (2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-58) (0.154 g, 67%)を得た。
1H-NMR (CDCl3, 400MHz) δ: 8.92 (1H, d, J = 1.8 Hz),8.70(1H, d, J = 7.6 Hz), 8.66 (1H, d, J = 1.3 Hz), 8.29 (1H, d, J = 9.9 Hz),7.68(1H, d, J= 7.6 Hz), 7.58-7.52 (3H, m), 7.46-7.38 (6H, m), 7.31-7.15 (10H,m),6.85-6.83 (4H, m), 6.78-6.75 (4H, m), 6.56-6.53 (1H, m), 4.79-4.77 (1H,m),4.34-4.32 (3H, m), 3.79-3.68 (16H, m), 3.47-3.32 (2H, m), 2.97-2.94 (1H,m),2.64-2.62 (2H, m), 2.48-2.47 (1H, m), 1.19-1.14 (12H, m).
実施例64
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-62を有するsiRNA(O6-(3-hydroxy-5-phosphorylmethyl)Bn dIという)を、参考例58.1で得られる化合物am-58を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6844.98 実測値 6844.96
参考例59.1 化合物am-59
工程1
参考例51.1で得られた9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-6-クロロ-9H-プリン(0.825g, 1.20 mmol)および(3-(3-エトキシ-3-オキソプロピル)フェニル)ボロン酸 (0.400 g,1.80 mmol)を用い、参考例6.0の工程2と同様にして、エチル 3-(3-(9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)フェニル)プロパノエート (0.899 g, 90%)を得た。
工程2〜3
工程1で得られたエチル3-(3-(9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)フェニル)プロパノエートを用い、参考例26.1の工程2〜3と同様にして、2-シアノエチル 3-(3-(9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)フェニル)プロパノエートを得た。
ESI-MS(m/z): 741(M+1)
工程4
工程3で得られた2-シアノエチル3-(3-(9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)フェニル)プロパノエート (0.148 g, 0.200 mmol)を用い、参考例39.1の工程2と同様にして、2-シアノエチル 3-(3-(9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(((2-シアノエトキシ)(ジイソプロピルアミノ)ホスファニル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)フェニル)プロパノエート (化合物am-59) (0.115 g, 61%)を得た。
1H-NMR (CDCl3, 400MHz) δ: 8.92 (1H, d, J = 1.3 Hz),8.70(1H, s), 8.68 (1H, s), 8.30 (1H, d, J = 10.4 Hz), 7.41-7.40 (4H, m),7.31-7.18(7H, m), 6.79-6.76 (4H, m), 6.56-6.54 (1H, m), 4.80-4.79 (1H, m),4.35-4.27(3H, m), 3.89-3.58 (10H, m), 3.48-3.33 (2H, m), 3.07-3.05 (2H, m),2.98-2.93(1H, m), 2.78-2.61 (6H, m), 2.48-2.47 (1H, m), 1.19-1.14 (12H, m).
実施例65
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-63を有するsiRNA(6-(3-carboxyethylphenyl)-Puという)を、参考例59.1で得られる化合物am-59を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6807.03 実測値 6807.48
参考例60.1:化合物am-60
工程1
参考例17.1の工程2で得られた6-クロロ-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリン(1.10 g、2.032 mmol)および(3-(3-メトキシ-3-オキソプロピル)フェニル)ボロン酸(634 mg、3.05 mmol)を用い、参考例6.0の工程2と同様にして、9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(3-(3-メトキシ-3-オキソプロピル)フェニル)-9H-プリン(620 mg、45.6 %)を得た。
工程2
工程1で得られた9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(3-(3-メトキシ-3-オキソプロピル)フェニル)-9H-プリン(620 mg、0.927 mmol)をテトラヒドロフラン(10 mL)に溶解し、氷冷下で水素化ほう素リチウムのTHF溶液(3 mol/L) (1.545 mL、4.63 mmol)を加え、室温で3時間撹拌した。さらに、水素化ほう素リチウムのTHF溶液(3 mol/L)(1.545 mL、4.63 mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。氷冷下で反応混合物に飽和重曹水を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で溶媒を留去し、残渣を酢酸エチル/ヘプタン系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(3-(3-ヒドロキシプロピル)フェニル)-9H-プリン(207 mg、34.8 %)を得た。
工程3〜5
工程2で得られた9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(3-(3-ヒドロキシプロピル)フェニル)-9H-プリンを用い、参考例1.1の工程3〜5と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-(3-(3-(bis(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)プロピル)フェニル)-9H-プリン-9-イル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチル ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-60)を得た。
1H-NMR (CDCl3, 400MHz) δ: 8.90, 8.88 (1H, 2 s),8.68-8.50(2H, m), 8.35, 8.31 (1H, 2 s), 7.53-7.15 (20H, m), 6.85-6.77 (8H, m),6.18-6.07(1H, m), 5.16-5.10 (1H, m), 4.46-4.38 (2H, m), 4.02-3.85 (1H, m),3.80-3.74(12H, m), 3.70-3.54 (4H, m), 3.38-3.28 (1H, m), 3.17-3.11 (2H, m),2.91-2.84(2H, m), 2.69-2.62 (1H, m), 2.34-2.25 (1H, m), 2.07-1.96 (2H, m),1.23-1.03(12H, m), 0.75, 0.74 (9H, 2 s), -0.02, -0.06, -0.21, -0.23 (6H, 4 s).
実施例66
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-64を有するsiRNA(6-(m-phosphonooxypropylphenyl)-Puという)を、参考例60.1で得られる化合物am-60を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6889.03 実測値 6890.19
参考例61.1:化合物am-61
工程1
市販の(2R,3S,5R)-5-(6-クロ-9H-プリン-9-イル)-2-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-3-オール (3.00 g, 11.1 mmol)をピリジン (55 mL)に懸濁させ、4,4'-ジメトキシトリチルクロリド (4.51 g, 13.3 mmol)を加え、室温で3時間撹拌した。反応液にメタノールを加え15分間撹拌した。トルエンを加えて、減圧下で溶媒を留去した。残渣をヘキサン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製し、 (2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール(4.89g, 82 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 573(M+1)
工程2
工程1で得られた(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール(250 mg, 0.436 mmol)をジメチルホルミアミド(2.5 mL)に溶解し、水(0.5 mL)、リン酸三カリウム (185 mg, 0.872 mmol)、インドール-2-ボロン酸ピナコールエステル (0.037 mL, 0.523 mmol)および[1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]パラジウム(II)ジクロリド ジクロロメタン付加物(35.6 mg, 0.044 mmol)を加え、80 ℃で1時間撹拌した。反応液をろ過し、ろ液を酢酸エチルで抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。反応液を減圧下で溶媒を留去し、残渣をヘキサン/酢酸エチル系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、(2R,3S,5R)-5-(6-(1H-インドール-2-イル)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-オール (151 mg, 53 %)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 10.38 (s, 1H), 8.84 (s, 1H),8.28(s, 1H), 7.83 - 7.83 (m, 1H), 7.74 - 7.76 (m, 1H) 7.50 - 7.52 (m, 1H),7.39 -7.42 (m, 2H), 7.13 - 7.34 (m, 9H), 6.79 - 6.83 (m, 4H), 6.53 (t, J = 6.4Hz,1H), 4.71 - 4.75 (m, 1H), 4.15 - 4.19 (m, 1H), 3.76 (d, J= 1.3 Hz, 6H),3.44 -3.45 (m, 2H), 2.91 - 2.97 (m, 1H), 2.57 - 2.64 (m, 1H).
ESI-MS(m/z): 654(M+1)
工程3
工程2で得られた(2R,3S,5R)-5-(6-(1H-インドール-2-イル)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-オールを用い、参考例1.1と同様にして(2R,3S,5R)-5-(6-(1H-インドール-2-イル)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチル ジイソプロピルホスホロアミダイト (化合物am-61)を得た。この化合物は精製せず、次工程に使用した。
実施例67
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-65を有するsiRNA(6-(1H-indol-2-yl-dPuという)を、参考例61.1で得られる化合物am-61を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖)：理論値 6775.01 実測値 6774.64
参考例62.1:化合物am-62
工程1
市販の9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)-1H-プリン-6(9H)-オン(5.02g,9.05 mmol)をTHF(250 mL)に懸濁し、ジイソプロピルエチルアミン (4.74 mL, 27.2 mmol)および1H-ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスファート(4.83 g,10.9 mmol)を加え、室温で2日間撹拌し、さらに1H-ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスファート(8.00 g, 18.1 mmol)を加え一晩撹拌した。反応液に飽和重曹水を加えて、溶媒量が約半分になるまで減圧下で溶媒を留去し、酢酸エチルで抽出して、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒を留去し、残渣をヘキサン/酢酸エチル系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、(2R,3S,5R)-5-(6-(1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール-1-イルオキシ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-オール (5.77 g, 95 %)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 8.34 (s, 1H), 8.28 (s, 1H),8.14(d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.20 - 7.56 (m, 12H), 6.79 - 6.85 (m, 4H), 6.52 (t, J=6.5 Hz, 1H), 4.70 - 4.73 (m, 1H), 4.16 - 4.19 (m, 1H), 3.78 (s, 6H), 3.39-3.48 (m, 2H), 2.84 - 2.91 (m, 1H), 2.58 - 2.64 (m, 1H).
ESI-MS(m/z): 672(M+1)
工程2
工程1で得られた(2R,3S,5R)-5-(6-(1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール-1-イルオキシ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-オール (250 mg,0.436 mmol)をエタノール(5 mL)に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン(0.152 mL, 0.872 mmol)および2-メルカプトエタノール(0.037 mL, 0.523 mmol)を加え、60 ℃で1時間撹拌した。さらに2-メルカプトエタノール(0.061 mL, 0.872 mmol)を加え、60 ℃で4日間撹拌した。反応液を酢酸エチルで抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。反応液を減圧下で溶媒を留去し、残渣をヘキサン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製し、 (2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-(2-ヒドロキシエチルチオ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール (207 mg, 77 %)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 8.57 (s, 1H), 8.08 (s, 1H),7.13- 7.47 (m, 18H), 6.77 - 6.81 (m, 8H), 6.45 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 4.65 - 4.70(m,1H), 4.09 - 4.14 (m, 1H), 3.77 (d, J = 2.8 Hz, 12H), 3.60 - 3.64 (m, 2H),3.35- 3.45 (m, 4H), 2.80 - 2.87 (m, 1H), 2.51 - 2.57 (m, 1H).
工程3
工程2で得られた (2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-(2-ヒドロキシエチルチオ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オールを用い、参考例1.1と同様にして(2R,3S,5R)-5-(6-(2-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)エチルチオ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル2-シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト (化合物am-62)を得た。この化合物は精製せず、次工程に使用した。
実施例68
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-66を有するsiRNA(6-(phosphonooxyethyl)thio-dPuという)を、参考例62.1で得られる化合物am-62を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖)：理論値 6815.98 実測値 6815.44
参考例63.1:化合物am-63
工程1
参考例63の工程1で得られた(2R,3S,5R)-5-(6-(1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール-1-イルオキシ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-オール(400 mg, 0.689 mmol)をエタノール(8 mL)に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン(0.247 mL, 1.40mmol)および4-メルカプト-1-ブタノール(0.086mL, 0.838 mmol)を加え、60 ℃で3時間撹拌した。さらに4-メルカプト-1-ブタノール(0.144mL, 1.40 mmol)を加え、60 ℃で4日間撹拌した。さらにジイソプロピルエチルアミン(0.247 mL, 1.40mmol)および4-メルカプト-1-ブタノール(0.144 mL, 1.40 mmol)を加え、60 ℃で1晩撹拌した。反応液を酢酸エチルで抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。反応液を減圧下で溶媒を留去し、残渣をヘキサン/酢酸エチル系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-(4-ヒドロキシブチルチオ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール (341 mg, 76 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 643(M+1)
工程2
工程1で得られた(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-(4-ヒドロキシブチルチオ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール (304 mg, 0.530 mmol)をジクロロメタン (7 mL)に溶解し、トリエチルアミン (0.369 mL, 2.65 mmol)および4,4'-ジメトキシトリチルクロリド (269 mg, 0.795 mmol)を加え、室温で一晩撹拌した。反応液にメタノールを加え30分間撹拌した。反応液をクロロホルムで抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒を留去し、残渣をヘキサン/酢酸エチル系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、(2R,3S,5R)-5-(6-(4-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)ブチルチオ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-オール (437 mg, 87 %)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 8.59 (s, 1H), 8.08 (s, 1H),7.13- 7.44 (m, 18H), 6.78 - 6.82 (m, 8H), 6.45 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 4.65 - 4.70(m,1H), 4.11 - 4.14 (m, 1H), 3.77 (s, 12H), 3.41 - 3.45 (m, 1H), 3.35 - 3.39(m,3H), 3.10 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 2.81 - 2.87 (m, 1H) , 1.98 - 2.01 (m, 1H),2.51- 2.57 (m, 1H), 1.86 - 1.93 (m, 2H), 1.76 - 1.83 (m, 2H).
工程3
工程2で得られた(2R,3S,5R)-5-(6-(4-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)ブチルチオ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-オールを用い、参考例1.1と同様にして(2R,3S,5R)-5-(6-(2-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)ブチルチオ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル2-シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト (化合物am-63)を得た。この化合物は精製せず、次工程に使用した。
実施例69
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-67を有するsiRNA(6-(phosphonooxybutyl)thio-dPuという)を、参考例63.1で得られる化合物am-63を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖)：理論値 6844.03 実測値 6843.73
参考例64.1:化合物am-64
工程1
参考例63の工程1で得られた(2R,3S,5R)-5-(6-(1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール-1-イルオキシ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-オール (90.0 mg, 0.134 mmol)をエタノール(1 mL)に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン(0.047 mL,0.268mmol)およびチオフェノール(0.012 mL, 0.121 mmol)を加え、60 ℃で1時間撹拌した。減圧下で溶媒を留去し、残渣をヘキサン/酢酸エチル系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-(フェニルチオ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール (70.1 mg, 71%)を得た。
1H-NMR(CDCl3,400MHz) δ: 8.54 (s, 1H), 8.14 (s, 1H), 7.63- 7.69 (m, 2H), 7.45 - 7.49 (m, 3H)7.13 - 7.40 (m, 9H), 6.78 - 6.82 (m, 4H),6.46 (t, J= 6.4 Hz, 1H), 4.67 - 4.71(m, 1H), 4.11 - 4.15 (m, 1H), 3.78 (s,6H), 3.34 - 3.45 (m, 2H), 2.84 - 2.90 (m,1H), 2.51 - 2.58 (m, 1H).
工程2
工程1で得られた(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-(フェニルチオ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オールを用い、参考例1.1と同様にして(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-(フェニルチオ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル2-シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト (化合物am-64)を得た。この化合物は精製せず、次工程に使用した。
実施例70
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-68を有するsiRNA(6-phenylthio-dPuという)を、参考例64.1で得られる化合物am-64を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖)：理論値 6768.04 実測値 6767.68
参考例65.1:化合物am-65
工程1
参考例62の工程1で得られた(2R,3S,5R)-5-(6-クロ-9H-プリン-9-イル)-2-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-3-オール(250 mg, 0.436 mmol)をジメチルホルムアミド(2.5 mL)に溶解し、水(0.5 mL)、リン酸三カリウム (185 mg, 0.872 mmol)、4-(ヒドロキシメチル)フェニルボロン酸(99.4 mg, 0.648 mmol)および[1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]パラジウム(II)ジクロリド ジクロロメタン付加物(35.6 mg, 0.044 mmol)を加え、80 ℃で1時間撹拌した。反応液をろ過し、ろ液を酢酸エチルで抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。反応液を減圧下で溶媒を留去し、残渣をヘキサン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製し、 (2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-(4-(ヒドロキシメチル)フェニル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール(166mg, 61 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 654 (M+1)
工程2
工程1で得られた(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-(4-(ヒドロキシメチル)フェニル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール(165mg,0.256 mmol)をジクロロメタン (3 mL)に溶解し、トリエチルアミン (0.178 mL, 1.28 mmol)および4,4'-ジメトキシトリチルクロリド (130 mg, 0.384 mmol)を加え、室温で一晩撹拌した。反応液にメタノールを加え30分撹拌した。反応液をクロロホルムで抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒を留去し、残渣をヘキサン/酢酸エチル系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-(4-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)フェニル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール (収量180 mg, 74 %)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 8.93 (s, 1H) , 8.73 - 8.75 (d,J= 8.4 Hz, 2H), 8.26 (s, 1H), 7.59 (d, J = 8.6 Hz, 2H) , 7.52 - 7.54 (m, 2H),7.39 - 7.44 (m, 6H), 7.14 - 7.33 (m, 11H), 6.83 - 6.87 (m, 4H), 6.78 - 6.82(m,4H), 6.55 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 4.70 - 4.74 (m, 1H), 4.15 - 4.18 (dd, J =3.8Hz, 1H), 3.76 - 3.80 (m, 12H), 3.40 - 3.48 (m, 2H), 2.90 - 2.96 (m, 1H),2.57 -2.63 (m, 1H).
ESI-MS(m/z): 947(M+1)
工程3
工程2で得られた(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-(4-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)フェニル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オールを用い、参考例1.1と同様にして(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-(4-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)フェニル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル2-シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト (化合物am-65)を得た。この化合物は精製せず、次工程に使用した。
実施例71
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-69を有するsiRNA(6-(4-phosphonooxymethyl)phenyl-dPuという)を、参考例65.1で得られる化合物am-65を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖)：理論値 6845.98 実測値 6845.62
実施例72
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-70を有するsiRNA(6-(3-carboxymethylphenyl)-Puという)を、参考例51.1で得られる化合物am-51を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6809.00 実測値 6804.3
参考例66.1 化合物am-66
工程1
参考例51.1の工程1で得られた9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-6-クロロ-9H-プリン (0.500 g, 0.727 mmol)および4-アミノブタ-2-イン-1-オール塩酸塩 (0.265 g, 2.18 mmol)を用い、参考例53.1の工程1と同様にして、4-((9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)アミノ)ブタ-2-イン-1-オール (0.280 g, 52%)を得た。
工程2〜3
工程1で得られた4-((9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)アミノ)ブタ-2-イン-1-オール (0.280 g, 0.380 mmol)を用い、参考例1.1の工程4および参考例50.1の工程3と同様にして、(2R,3S,5R)-5-(6-((4-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)ブタ-2-イン-1-イル)アミノ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-オール (0.240 g, 68%)を得た。
ESI-MS(m/z): 924 (M+1)
工程4
工程3で得られた(2R,3S,5R)-5-(6-((4-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)ブタ-2-イン-1-イル)アミノ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-オール (0.240 g, 0.260 mmol)を用い、参考例39.1の工程2と同様にして、(2R,3S,5R)-5-(6-((4-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)ブタ-2-イン-1-イル)アミノ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル (2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-66) (0.168 g, 57%)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 8.35(1H, s), 7.97, 7.95(1H, 2s),7.46-7.17(18H, m), 6.84-6.76(8H, m), 6.45-6.41(1H, m), 5.82(1H,brs),4.78-4.71(1H, m), 4.47(2H, brs), 4.30-4.26(1H, m), 3.95-3.54(18H,m),3.44-3.30(2H, m), 2.91-2.83(1H, m), 2.68-2.55(2H, m), 2.46(1H, t, J= 6.4Hz),1.20-1.11(12H, m).
実施例73
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-71を有するsiRNA(N6-(4-phosphonooxy-2-butynyl) dAという)を、参考例66.1で得られる化合物am-66を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6821.66 実測値6823.08
参考例67.1 化合物am-67
工程1
(2-ヨードフェニル)メタノール (3.00 g, 12.8 mmol)を用い、参考例1.1の工程4と同様にして、4,4’-(((2-ヨードベンジル)オキシ)(フェニル)メチレン)ビス(メトキシベンゼン)の粗精製物 (7.67 g)を得た。
工程2
工程1で得られた4,4’-(((2-ヨードベンジル)オキシ)(フェニル)メチレン)ビス(メトキシベンゼン)(2.00g)をTHF (19.0 mL)に溶解し、トリエチルアミン(19 mL)、プロパルギルアミン (1.43 mL, 22.4 mmol)およびヨウ化銅 (71.8 mg, 0.337 mmol)を加えて10分間アルゴンガスを吹き込み脱気した。混合物に、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム (0.216 g, 0.187 mmol)を加え、室温で23時間撹拌した。反応液をセライトでろ過し、ろ液を減圧下濃縮した。残渣をジクロロメタンに溶解し、水で洗浄し、水層をさらにジクロロメタンで抽出した後、有機層を合わせて無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (展開溶媒：1%トリエチルアミン含有 クロロホルムのみ) で精製し、3-(2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)フェニル)プロパ-2-イン-1-アミン (0.650 g, 35%)を得た。
工程3〜4
参考例51.1の工程1で得られた9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-6-クロロ-9H-プリン (0.400 g, 0.582 mmol)および工程2で得られた3-(2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)フェニル)プロパ-2-イン-1-アミン (0.650 g, 1.40 mmol)を用い、参考例53.1の工程1および参考例50.1の工程3と同様にして、(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-((3-(2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)フェニル)プロパ-2-イン-1-イル)アミノ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール (0.240 g, 36%)を得た。
ESI-MS(m/z): 1000 (M+1)
工程5
工程4で得られた(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-((3-(2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)フェニル)プロパ-2-イン-1-イル)アミノ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール (0.240 g, 0.211 mmol)を用い、参考例39.1の工程2と同様にして、(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-((3-(2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)フェニル)プロパ-2-イン-1-イル)アミノ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル (2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-67) (0.106 g, 42%)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 8.33(1H, s), 7.97, 7.95 (1H,2s), 7.73, 7.71 (1H, 2 brs), 7.52-7.48(2H, m), 7.42-7.35(8H, m),7.31-7.16(11H,m), 6.85-6.75(8H, m), 6.48-6.42(1H, m), 5.76(1H, brs),4.80-4.71(1H, m),4.54(2H, brs), 4.29(3H, brs), 3.94-3.31(18H, m), 3.04-2.56(3H,m), 2.46(1H, t,J= 6.4 Hz), 1.29-1.11(12H, m).
実施例74
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-72を有するsiRNA(N6-(2-phosphonooxymethyl)phenylpropargyl dAという)を、参考例67.1で得られる化合物am-67を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6897.76 実測値6898.86
参考例68.1 化合物am-68
工程1〜5
(3-ヨードフェニル)メタノールを用い、参考例67.1の工程1〜5と同様にして、(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-((3-(3-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)フェニル)プロパ-2-イン-1-イル)アミノ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル (2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-68)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 8.38(1H, s), 7.98, 7.96(1H, 2s),7.51-7.16(22H, m), 6.85-6.76 (8H, m), 6.46-6.42(1H, m), 5.96(1H, brs),4.79-4.65(3H,m), 4.32-4.26(1H, m), 4.15-4.10(2H, m), 3.96-3.32(18H, m),2.92-2.84(1H, m),2.69-2.56(2H, m), 2.46(1H, t, J= 6.6 Hz), 1.20-1.10(12H, m).
実施例75
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-73を有するsiRNA(N6-(3-phosphonooxymethyl)phenylpropargyl dAという)を、参考例68.1で得られる化合物am-68を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6897.76 実測値6898.90
参考例69.1 化合物am-69
工程1〜5
(4-ヨードフェニル)メタノールを用い、参考例67.1の工程1〜5と同様にして、(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-((3-(4-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)フェニル)プロパ-2-イン-1-イル)アミノ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル (2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-69)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 8.38(1H, s), 7.99, 7.96(1H, 2s),7.51-7.47(2H, m), 7.40-7.18(20H, m), 6.85-6.76(8H, m), 6.46-6.42(1H,m),5.96(1H, brs), 4.80-4.64(3H, m), 4.31-4.26(1H, m), 4.15(2H, s),3.96-3.31(18H,m), 2.93-2.56(3H, m), 2.46(1H, t, J= 6.4 Hz), 1.20-1.11(12H, m).
実施例76
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-74を有するsiRNA(N6-(4-phosphonooxymethyl)phenylpropargyl dAという)を、参考例69.1で得られる化合物am-69を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6897.76 実測値6899.02
参考例70.1:化合物am-70
工程1
参考例63の工程1で得られた(2R,3S,5R)-5-(6-(1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール-1-イルオキシ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-オール (350 mg, 0.521 mmol)をエタノール(5.2 mL)に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン(0.273 mL,1.56mmol)および4-ヒドロキシベンゼンチオール(78.9mg,0.625 mmol)を加え、60 ℃で1時間撹拌した。さらに4-ヒドロキシベンゼンチオール (32.9 mg, 0.261 mmol)を加え1時間撹拌撹拌した。反応液を減圧下で溶媒を留去し、析出物をろ過した。ろ液を減圧下で溶媒留去し、残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール)で精製して、(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-(4-ヒドロキシフェニルチオ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール (282 mg, 82 %)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 8.55 (s, 1H), 8.15 (s, 1H),7.45- 7.49 (m, 2H), 7.36 - 7.39 (m, 2H) , 7.18 - 7.30 (m, 7H) , 6.83 - 6.87(m,2H), 6.78 - 6.82 (m, 4H), 6.46 (t, J = 6.5 Hz, 1H) , 6.40 (s, 1H), 4.66 -4.71(m, 1H), 4.12 - 4.15 (m, 1H), 3.78 (s, 6H), 3.35 - 3.45 (m, 2H), 2.82 -2.89(m, 1H), 2.52 - 2.58 (m, 1H).
ESI-MS(m/z): 663(M+1)
工程2
工程1で得られた(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-(4-ヒドロキシフェニルチオ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール (280 mg, 0.422 mmol)をジクロロメタン(4.2 mL)に溶解し、トリエチルアミン(0.178 mL, 1.27 mmol)およびピバロイルクロリド (0.078 mL, 0.643 mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。反応液に飽和重曹水(4 mL)を加え30分間撹拌した。反応液をクロロホルムで抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒を留去し、残渣をヘキサン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製し、4-(9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イルチオ)フェニルピバラート (304 mg, 78 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 747(M+1)
工程3
工程2で得られた4-(9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イルチオ)フェニルピバラートを用い、参考例1.1と同様にして4-(9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((2-シアノエトキシ)(ジイイソプロピルアミノ)ホスフィノオキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イルチオ)フェニルピバラート (化合物am-70)を得た。この化合物は精製せず、次工程に使用した。
実施例77
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-75を有するsiRNA(6-(4-hydroxy)phenylthio-dPuという)を、参考例70.1で得られる化合物am-70を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖)：理論値 6784.04 実測値 6784.15
参考例71.1:化合物am-71
工程1
参考例63の工程1で得られた(2R,3S,5R)-5-(6-(1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール-1-イルオキシ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-オール (350 mg, 0.521 mmol)をエタノール(5.2 mL)に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン(0.273 mL,1.56mmol)および3-ヒドロキシベンゼンチオール(0.063mL,0.625 mmol)を加え、60 ℃で1時間撹拌した。さらに3-ヒドロキシベンゼンチオール (0.026 mL, 0.261 mmol)を加え1時間撹拌した。反応液を減圧下で溶媒を留去し、得られた残渣をろ過した。ろ液を減圧下で溶媒留去し、残渣をクロロホルム/メタノール系のNHカラムクロマトグラフィーで精製し、 (2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-(3-ヒドロキシフェニルチオ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール (267 mg, 77 %)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 8.55 (s, 1H), 8.15 (s, 1H),7.16- 7.39 (m, 11H) , 7.07 - 7.08 (m, 1H) , 6.88 - 6.91 (m, 1H), 6.77 - 6.82(m,4H), 6.64 (bs, 1H), 6.45 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 4.69 - 4.72 (m, 1H), 4.11 -4.15(m, 1H), 3.78 (s, 6H), 3.35 - 3.44 (m, 2H), 2.85 - 2.91 (m, 1H), 2.53 -2.59(m, 1H).
ESI-MS(m/z): 663(M+1)
工程2
工程1で得られた(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-(3-ヒドロキシフェニルチオ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール(265 mg, 0.400 mmol)をジクロロメタン(4 mL)に溶解し、トリエチルアミン(0.167 mL, 1.20 mmol)およびピバロイルクロリド (0.073 mL, 0.600 mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。反応液に飽和重曹水(4 mL)を加え30分間撹拌した。反応液をクロロホルムで抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒を留去し、残渣をヘキサン/酢酸エチル系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、3-(9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イルチオ)フェニルピバラート (263 mg, 88 %)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 8.55 (s, 1H), 8.14 (s, 1H),7.20- 7.56 (m, 13H), 6.78 - 6.82 (m, 4H), 6.46 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 4.66 - 4.71(m,1H), 4.11 - 4.15 (m, 1H), 3.78 (s, 6H), 3.35 - 3.45 (m, 2H), 2.84 - 2.90(m,1H), 2.52 - 2.58 (m, 1H), 1.35 (s, 9H).
ESI-MS(m/z): 747(M+1)
工程3
工程2で得られた3-(9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イルチオ)フェニルピバラートを用い、参考例1.1と同様にして3-(9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((2-シアノエトキシ)(ジイイソプロピルアミノ)ホスフィノオキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イルチオ)フェニルピバラート (化合物am-71)を得た。この化合物は精製せず、次工程に使用した。
実施例78
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-76を有するsiRNA(6-(3-hydroxyphenyl)thio-dPuという)を、参考例71.1で得られる化合物am-71を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖)：理論値 6784.04 実測値 6783.69
参考例72.1:化合物am-72
工程1
参考例63の工程1で得られた(2R,3S,5R)-5-(6-(1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール-1-イルオキシ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-オール (350 mg, 0.521 mmol)をエタノール(5.2 mL)に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン(0.273 mL,1.56mmol)および2-メルカプトベンジルアルコール(124mg,0.886 mmol)を加え、60 ℃で1時間撹拌した。反応液を減圧下で溶媒留去し、得られた残渣をろ過した。ろ液を減圧下で溶媒を留去し、残渣をクロロホルム/メタノール系のNHカラムクロマトグラフィーで精製し、(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-(3-(ヒドロキシメチル)フェニルチオ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール (310 mg, 98 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 677(M+1)
工程2
工程1で得られた(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-(3-(ヒドロキシメチル)フェニルチオ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール(304mg, 0.449 mmol)をジクロロメタン(4.5 mL)に溶解し、トリエチルアミン(0.313 mL, 2.46 mmol)および4,4'-ジメトキシトリチルクロリド (305 mg, 0.898 mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。反応液にメタノールを加え30分間撹拌した。反応液をクロロホルムで抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒を留去し、残渣をヘキサン/酢酸エチル系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-(3-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)フェニルチオ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール(301 mg, 59 %)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 8.55 (s, 1H), 8.14 (s, 1H),7.14- 7.66 (m, 22H), 6.78 - 6.84 (m, 8H), 6.46 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 4.66 - 4.70(m,1H), 4.22 (s, 2H), 4.12 - 4.15 (m, 1H), 3.78 (d, J= 2.5 Hz, 12H), 3.34 -3.45(m, 2H), 2.83 - 2.89 (m, 1H), 2.52 - 2.58 (m, 1H).
ESI-MS(m/z): 979(M+1)
工程3
工程2で得られた(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-(3-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)フェニルチオ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オールを用い、参考例1.1と同様にして(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-(3-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)フェニルチオ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト (化合物am-72)を得た。この化合物は精製せず、次工程に使用した。
実施例79
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-77を有するsiRNA(6-(3-phosphonooxymethyl)phenylthio-dPuという)を、参考例72.1で得られる化合物am-72を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖)：理論値 6878.05 実測値 6877.67参考例73.1 化合物am-73
工程1
J.Am.Chem.Soc、1991年,第113巻,4329-4331頁に記載の方法で合成した(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール(0.400g, 0.698 mmol)および3-(メトキシカルボニル)ベンゼンボロン酸 (0.380 g、2.09mmol)を用い、参考例6.0の工程2と同様にして、メチル3-(9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)ベンゾエート (0.275 g、57%)を得た。
ESI-MS(m/z): 673(M+1)
工程2
工程1で得られたメチル3-(9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)ベンゾエート (0.275 g、0.401mmol)を用い、参考例39.1の工程2と同様にして、メチル3-(9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(((2-シアノエトキシ)(ジイソプロピルアミノ)ホスファニル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)ベンゾエート(化合物am-73)(97.0mg、28%)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 9.41(1H, brs), 9.03, 9.01(1H,2brs), 8.97, 8.97(1H, 2 s), 8.34, 8.31 (1H, 2 s), 8.23-8.19(1H, m), 7.65(1H,t,J= 8.0 Hz), 7.42-7.38(2H, m), 7.32-7.16(7H, m), 6.82-6.75(4H, m),6.58-6.54(1H,m), 4.84-4.76(1H, m), 4.38-4.31(1H, m), 3.98(3H, s),3.93-3.56(10H, m), 3.49-3.34(2H,m), 3.01-2.93(1H, m), 2.78-2.61(2H, m),2.48(1H, t, J= 6.4 Hz), 1.22-1.13(12H,m).
実施例80
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-78を有するsiRNA(6-(3-carbamoyl)phenyl-Puという)を、参考例73.1で得られる化合物am-73を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6777.71 実測値6778.90
実施例81
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-79を有するsiRNA(6-(3-(N-methylcarbamoyl))phenyl-Puという)を、参考例73.1で得られる化合物am-73を用いて、実施例57と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6791.74 実測値6793.01
参考例74 化合物am-74
工程1〜2
3-(メチルスルホニル)フェニルボロン酸を用い、参考例73.1の工程1〜2と同様にして、(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-(3-(メチルスルホニル)フェニル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル (2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-74)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 9.43(1H, brs), 9.20-9.17(1H,m),8.98, 8.98 (1H, 2 s), 8.37, 8.34 (1H, 2 s), 8.12, 8.10 (1H, 2 brs),7.78(1H,dd, J= 8.0, 8.0 Hz), 7.45-7.15(9H, m), 6.83-6.75(4H, m), 6.60-6.55(1H,m),4.89-4.76(1H, m), 4.39-4.32(1H, m), 3.95-3.56(10H, m), 3.52-3.33(2H,m),3.17(3H, s), 3.02-2.94(1H, m), 2.80-2.62(2H, m), 2.49(1H, t, J= 6.4Hz),1.25-1.14(12H, m).
実施例82
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-80を有するsiRNA(6-(3-methylsulfonyl)phenyl-Puという)を、参考例74.1で得られる化合物am-74を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6812.78 実測値6814.23
参考例75 化合物am-75
工程1〜2
3-シアノメチルフェニルボロン酸を用い、参考例73.1の工程1〜2と同様にして、(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-(3-(シアノメチル)フェニル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル (2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-75)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 8.95, 8.94 (1H, 2 s), 8.80,8.78(1H, 2 brs), 8.72(1H, brs), 8.34, 8.32 (1H, 2 s), 7.61-7.52(2H,m),7.41-7.38(2H, m), 7.31-7.16(7H, m), 6.80-6.77(4H, m), 6.58-6.54(1H,m),4.85-4.76(1H, m), 4.38-4.31(1H, m), 3.90(2H, s), 3.90-3.58(10H, m),3.49-3.34(2H,m), 3.00-2.93(1H, m), 2.78-2.61(2H, m), 2.48(1H, t, J= 6.4 Hz),1.22-1.13(12H,m).
実施例83
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-81を有するsiRNA(6-(3-cyanomethyl)phenyl-Puという)を、参考例75.1で得られる化合物am-75を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6773.72 実測値6775.60
参考例76.1 化合物am-76
工程1
アルゴン雰囲気下、1,2,4-ベンゼントリメタノール(4.55g, 27.1 mmol) を2,2-ジメトキシプロパン(14.0 mL) に懸濁させ、p-トルエンスルホン酸一水和物(0.256 g, 1.35 mmol) を加えて、室温で35分間撹拌した。トリエチルアミン (0.250 mL, 1.79 mmol) を加えて反応を停止させて、反応液を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (1%トリエチルアミン含有 クロロホルム/メタノール = 1/0 → 10/1)で精製し、(3,3-ジメチル-1,5-ジヒドロベンゾ[e][1,3]ジオキセピン-7-イル)メタノール (2.73g,48%) を得た。
工程2
工程1で得られた(3,3-ジメチル-1,5-ジヒドロベンゾ[e][1,3]ジオキセピン-7-イル)メタノール (1.18g,5.65 mmol)およびOrg. Lett.、2005年,7巻,999-1002頁に記載の方法で合成した6-クロロ-9-(2'-デオキシ-3',5'-ビス-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-s-D-エリスロペントフラノシル)プリン (1.50 g, 3.01 mmol)を用い、参考例50.1の工程2と同様にして、9-((2R,4S,5R)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)メチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-6-((3,3-ジメチル-1,5-ジヒドロベンゾ[e][1,3]ジオキセピン-7-イル)メトキシ)-9H-プリン (1.37 g、68%)を得た。
工程3
工程2で得られた9-((2R,4S,5R)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)メチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-6-((3,3-ジメチル-1,5-ジヒドロベンゾ[e][1,3]ジオキセピン-7-イル)メトキシ)-9H-プリン (1.30 g、1.94mmol)を氷冷し、80%(v/v)酢酸水溶液 (26.0mL)を加えて、室温で20分間撹拌した。反応液を氷冷した飽和重曹水に20分間かけて少しずつ加えて反応を停止させて酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮して(4-(((9-((2R,4S,5R)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)メチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)オキシ)メチル)-1,2-フェニレン)ジメタノールの粗生成物を得た。
工程4
工程3で得た(4-(((9-((2R,4S,5R)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)メチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)オキシ)メチル)-1,2-フェニレン)ジメタノールの粗生成物を用い、参考例1.1の工程4と同様にして、6-((3,4-ビス((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)ベンジル)オキシ)-9-((2R,4S,5R)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)メチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリンの粗生成物を得た。
工程5
工程4で得られた6-((3,4-ビス((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)ベンジル)オキシ)-9-((2R,4S,5R)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)メチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリンの粗生成物を用い、参考例50.1の工程3と同様にして、(2R,3S,5R)-5-(6-((3,4-ビス((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)ベンジル)オキシ)-9H-プリン-9-イル)-2-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-3-オール (1.22 g, 56%)を得た。
工程6
工程5で得られた(2R,3S,5R)-5-(6-((3,4-ビス((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)ベンジル)オキシ)-9H-プリン-9-イル)-2-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-3-オール (1.22 g, 1.10 mmol)を用い、参考例1.1の工程4と同様にして、(2R,3S,5R)-5-(6-((3,4-ビス((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)ベンジル)オキシ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-オール(0.732 g, 48%)を得た。
1H-NMR (CDCl3, 400MHz) δ: 8.50 (1H, s), 8.06(1H,s),7.71(1H, d, J= 1.6 Hz), 7.61(1H, d, J= 7.8 Hz), 7.53(1H, dd, J= 7.8, 1.6Hz),7.41-7.16(27H, m), 6.81-6.79(4H, m), 6.74-6.69(8H, m), 6.48(1H, t, J= 6.4Hz),5.74(2H, s), 4.70-4.66(1H, m), 4.16-4.12(1H, m), 4.03(4H, s), 3.77(6H,s),3.76(6H, s), 3.76(6H, s), 3.45(1H, dd, J=10.3, 4.8 Hz), 3.38(1H, dd,J=10.3,5.3 Hz), 2.84(1H, ddd, J= 13.7, 6.4, 6.4 Hz), 2.57-2.52(1H, m).
工程7
工程6で得られた(2R,3S,5R)-5-(6-((3,4-ビス((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)ベンジル)オキシ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-オール (0.732 g, 0.525 mmol)を用い、参考例39.1の工程2と同様にして、(2R,3S,5R)-5-(6-((3,4-ビス((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)ベンジル)オキシ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル (2-シアノエトキシ) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-76) (0.566 g, 71%) を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 8.45(1H, s), 8.11, 8.09(1H, 2s),7.70(1H, brs), 7.60(1H, d, J= 7.8 Hz), 7.53(1H, dd, J= 7.8, 1.8Hz),7.40-7.15(27H, m), 6.79-6.75(4H, m), 6.73-6.68(8H, m), 6.50-6.46(1H,m),5.73(2H, s), 4.80-4.72(1H, m), 4.33-4.29(1H, m), 4.02(4H, s),3.93-3.55(22H,m), 3.43-3.32(2H, m), 2.92-2.84(1H, m), 2.70-2.57(2H, m),2.47(1H, t, J= 6.4Hz), 1.21-1.11(12H, m).
実施例84
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-82を有するsiRNA(O6-(3,4-diphosphonooxymethyl)Bn dIという)を、参考例76.1で得られる化合物am-76を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6984.72 実測値6986.66
参考例77.1 化合物am-77
工程1
5-フルオロ-1,3-ベンゼントリメタノール (0.638 g, 4.09 mmol) を用い、参考例1.1の工程4と同様にして、(3-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-フルオロフェニル)メタノール(0.898g, 48%)を得た。
工程2
工程1で得られた(3-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-フルオロフェニル)メタノール (0.400 g, 0.872 mmol)およびJ.Am.Chem.Soc、1991年,113巻,4329-4331頁に記載の方法で合成した(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール(0.333g, 0.582 mmol)を用い、参考例50.1の工程2と同様にして、(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-((3-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-フルオロベンジル)オキシ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール (0.180 g, 31%)を得た。
ESI-MS(m/z): 995(M+1)
工程3
工程2で得られた(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-((3-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-フルオロベンジル)オキシ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール (0.180 g, 0.181 mmol)を用い、参考例39.1の工程2と同様にして、(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-((3-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-フルオロベンジル)オキシ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル (2-シアノエトキシ) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-77) (0.135 g, 62%) を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 8.46, 8.45(1H, 2 s),8.12,8.09(1H, 2 s), 7.50-7.12(21H, m), 6.85-6.76(8H, m), 6.49-6.45(1H, m),5.63(2H,s), 4.80-4.72(1H, m), 4.33-4.28(1H, m), 4.16(2H, s), 3.96-3.55(16H,m),3.42-3.32(2H, m), 2.92-2.84(1H, m), 2.70-2.57(2H, m), 2.47(1H, t, J= 6.4Hz),1.20-1.11(12H, m).
実施例85
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-83を有するsiRNA(O6-(3-fluoro-5-phosphonooxymethyl)Bn dIという)を、参考例77.1で得られる化合物am-77を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6892.71 実測値6894.36
参考例78.1 化合物am-78
工程1〜3
参考例58.1の工程1で得られた(3-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)フェニル)メタノール (2.60 g, 3.74 mmol)をジクロロメタン (37.0 mL)に溶解した。トリエチルアミン(1.04 mL, 7.48 mmol)を加えた後に氷冷して、メタンスルホニルクロリド(0.347mL,4.49 mmol)をゆっくり滴下し、氷冷下で50 分間撹拌した。氷冷下で反応液に水を加えて反応を停止させ、ジクロロメタンで抽出した。有機層を飽和食塩水 (50 mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮し、3-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)ベンジル メタンスルホネートの粗生成物を得た。得られた粗生成物をDMF (37.0 mL)に溶解し、アジ化ナトリウム (0.291 g,4.49mmol)を加えて60 ℃で4時間撹拌した。反応液に酢酸エチルを加え、飽和食塩水で2回洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮し、得られた粗生成物にメタノール (37.0 mL)を加えて懸濁させ、トリフェニルホスフィン (0.980 g,3.74mmol)を加えて55分間還流した。反応液を放冷後、減圧下で濃縮し残渣にヘプタン (50.0 mL)およびトリエチルアミン (0.100 mL)を加えて40 ℃で懸洗後ろ過して、ろ液を減圧下で濃縮した。ヘプタンおよびトリエチルアミンを加えて懸洗して、減縮濃縮するところまでの操作をさらに3 回繰り返した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (展開溶媒：1%トリエチルアミン含有 n-ヘプタン/クロロホルム =1/0 → 0/1 → クロロホルム/メタノール = 1/0 → 10/1)で精製し、(3-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)フェニル)メタンアミン (1.62 g, トリフェニルホスフィンオキシドを含む)を得た。
工程4
工程3で得られた(3-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)フェニル)メタンアミン (0.784 g, トリフェニルホスフィンオキシドを含む)を用い、参考例39.1の工程1と同様にして、(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-((3-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)ベンジル)アミノ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール (0.285 g, 58%)を得た。
ESI-MS(m/z): 1230 (M+1)
工程5
工程4で得られた(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-((3-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)ベンジル)アミノ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール (0.285 g, 0.232 mmol)を用い、参考例39.1の工程2と同様にして、(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-((3-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)ベンジル)アミノ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル (2-シアノエトキシ) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-78) (0.240 g, 72%) を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 8.28(1H, s), 7.93, 7.90(1H, 2s),7.69(4H, d, J= 6.4 Hz), 7.42-7.15(24H, m), 6.82-6.72(11H, m), 6.46-6.42(1H,m),5.84(1H, brs), 4.79-4.57(3H, m), 4.31-4.26(1H, m), 3.94(2H, s),3.89-3.31(16H,m), 3.45-3.31(2H, m), 2.90-2.81(1H, m), 2.68-2.54(2H, m),2.46(1H, t, J= 6.6Hz), 1.20-1.11(12H, m), 1.09(9H, s).
実施例86
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-84を有するsiRNA(N6-(3-hydroxy-5-phosphonooxymethyl)Bn dAという)を、参考例78.1で得られる化合物am-78を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6889.73 実測値6891.42
参考例79.1 化合物am-79
工程1
参考例48.1の工程１で得られた(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-((3-(ヒドロキシメチル)ベンジル)アミノ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール (0.337 g、0.500 mmol)をDMF (11.7 mL)に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン (1.02mL,5.86 mmol)およびレブリン酸 (0.144 mL, 1.41 mmol)、および1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム 3-オキシド ヘキサフルオロホスフェート(HATU)(0.892 g,2.35mmol)を加え、室温で終夜撹拌した。反応液に飽和重層水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣を、クロロホルム/メタノール系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、3-(((9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)アミノ)メチル)ベンジル 4-オキソペンタノエート (0.350 g、39%)を得た。
ESI-MS(m/z): 772(M+1)
工程2
工程1で得られた3-(((9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)アミノ)メチル)ベンジル 4-オキソペンタノエート (0.350 g、0.453 mmol)を用い、参考例39.1の工程2と同様にして、3-(((9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(((2-シアノエトキシ)(ジイソプロピルアミノ)ホスファニル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)アミノ)メチル)ベンジル 4-オキソペンタノエート(化合物am-79)(0.110g, 25%) を得た。
1H-NMR (CDCl3, 400MHz) δ: 8.35 (1H, s), 7.94 (1H, d, J=9.4 Hz), 7.41-7.16 (13H, m), 6.79-6.77 (4H, m), 6.46-6.42 (1H, m), 6.02 (1H,brs), 5.09 (2H, s), 4.88 (2H, br s), 4.78-4.71 (1H, m), 4.29-4.27 (1H,m),4.23-3.30 (13H, m), 2.91-2.44 (7H, m), 2.17 (3H, s), 1.17-1.12 (12H, m).
実施例87
実施例1と同様に化合物am-79を用いてアンチセンス鎖を固相合成した後、ヒドラジン溶液 (0.5 mol/L in 酢酸/ピリジン=3:2, 500 μL)に浸し、室温で20分間静置した。樹脂をアセトニトリルで洗浄後、核酸合成機で市販の2-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)エチル (2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイトおよびリン酸化試薬を順次カップリングさせた。得られた固相樹脂を参考例1と同様の後処理を行い、後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-85を有するsiRNAを合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6998.05 実測値6998.23
参考例80.1:化合物am-80
工程1
市販の3-アミノベンジルアルコール (500 mg,4.06mmol)をDMF(40 mL)に溶解し、イミダゾール(415mg, 6.09 mmol)およびtert-ブチルジメチルシリルクロリド (734 mg, 4.87 mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。反応液に水を加え15分間撹拌した。反応液を酢酸エチルで抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で溶媒を留去し、残渣をヘキサン/酢酸エチル系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、3-((tert-ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)アニリン (893 mg,93%)を得た。
ESI-MS(m/z): 238(M+1)
工程2
市販の9-((2R,4S,5R)-4-ヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-1H-プリン-6(9H)-オン (500 mg, 1.98 mmol)をDMF (13 mL)に懸濁し、イミダゾール(944.7 mg, 13.9 mmol)およびtert-ブチルジメチルシリルクロリド (1.20 g, 7.93 mmol)を加え、室温で一晩撹拌した。反応液に水を加え30分間撹拌した。反応液を酢酸エチルで抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒を留去し、残渣をtert-ブチルメチルエーテルに溶解し、ヘキサンを加え、析出物を濾取して、9-((2R,4S,5R)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-5-((tert-ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-1H-プリン-6(9H)-オン (886 mg, 93 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 481(M+1)
工程3
工程2で得られた9-((2R,4S,5R)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-5-((tert-ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-1H-プリン-6(9H)-オン (878 mg, 1.83 mmol)をTHF (44 mL)に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン(956 mL,5.48mmol)および1H-ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスファート(2.42 g, 5.48 mmol)を加え、室温で2日間撹拌した。反応液に飽和重曹水を加えて、反応液をろ過した。ろ液を酢酸エチルで抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒を留去し、ろ過した。減圧下で溶媒を留去し、残渣をヘキサン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製し、6-(1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール-1-イルオキシ)-9-((2R,4S,5R)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-5-((tert-ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン (535 mg, 49 %)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 8.54 (s, 1H), 8.41 (s, 1H),8.13- 8.16 (m, 1H), 7.44 - 7.56 (m, 3H), 6.55 (t, J = 6.3 Hz, 1H), 4.63 - 4.66(m,1H), 4.05 - 4.08 (m, 1H), 3.90 - 3.94 (m, 1H), 3.78 - 3.82 (m, 1H), 2.62 -2.68(m, 1H), 2.45 - 2.55 (m, 1H), 0.91 - 0.94 (m, 18H), 0.10 - 0.12 (m, 18H).
工程4
工程3で得られた6-(1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール-1-イルオキシ)-9-((2R,4S,5R)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-5-((tert-ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン(179 mg, 0.300 mmol)および工程1で得られた3-((tert-ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)アニリン (142mg,0.600 mmol)をエタノール(3 mL)に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン(0.104 mL, 0.600 mmol)を加え、60 ℃で1晩撹拌し、さらに80 ℃で5時間撹拌した。反応液を減圧下で溶媒留去し、残渣をヘキサン/酢酸エチル系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、9-((2R,4S,5R)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-5-((tert-ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-N-(3-((tert-ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)フェニル)-9H-プリン-6-アミン (164 mg, 78 %)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 8.52 (s, 1H), 8.18 (s, 1H),7.83(bs, 1H), 7.66 - 7.69 (m, 2H), 7.34 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.04 - 4.07 (m,1H),6.49 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 4.79 (s, 2H), 4.61 - 4.64 (m, 1H), 4.01 - 4.05(m,1H), 3.88 - 3.91 (m, 1H), 3.77 - 3.81 (m, 1H), 2.63 - 2.70 (m, 1H), 2.43 -2.49(m, 1H), 0.91 - 0.97 (m, 27H), 0.14 - 0.09 (m, 18H).
工程5
工程4で得られた9-((2R,4S,5R)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-5-((tert-ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-N-(3-((tert-ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)フェニル)-9H-プリン-6-アミン (162 m, 0.231 mmol)をTHF (2.3 mL)に溶解し、テトラブチルアンモニウムフルオリド(1.00mol/L THF溶液、0.810 mL)を加え、室温で2時間撹拌した。反応液を減圧下で溶媒留去し、残渣をクロロホルム/メタノール系のカラムクロマトグラフィーで精製し、(2R,3S,5R)-2-(ヒドロキシメチル)-5-(6-(3-(ヒドロキシメチル)フェニルアミノ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール(88.9 mg, 107 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 358(M+1)
工程6
工程5で得られた(2R,3S,5R)-2-(ヒドロキシメチル)-5-(6-(3-(ヒドロキシメチル)フェニルアミノ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール (88.9 mg, 0.231 mmol)をピリジン(2.3 mL)に溶解し、4,4'-ジメトキシトリチルクロリド (196 mg, 0.577 mmol)を加え、室温で一晩撹拌した。さらに4,4'-ジメトキシトリチルクロリド (78.3 mg, 0.231 mmol)を加え、室温で数時間撹拌した。反応液にメタノールを加え15分間撹拌した。トルエンを加えて、減圧下で溶媒を留去し、残渣に水を適量加えた後に、酢酸エチルで抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で溶媒留去し、残渣をヘキサン/酢酸エチル系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-(3-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)フェニルアミノ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール(95.4 mg, 43 %)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 8.47 (s, 1H), 8.00 (s, 1H),7.90(bs, 1H) , 7.71 - 7.75 (m, 2H) , 7.52 - 7.56 (m, 2H), 7.10 - 7.45 (m,18H),6.79 - 6.87 (m, 8H), 6.46 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 4.68 - 4.74 (m, 1H), 4.21(s,2H), 4.11 - 4.16 (m, 1H), 3.78 (d, J = 11.3 Hz, 12H), 3.38 - 3.47 (m, 2H),2.86- 2.92 (m, 1H), 2.53 - 2.59 (m, 1H).
工程7
工程6で得られた(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-(3-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)フェニルアミノ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オールを用い、参考例1.1と同様にして(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-(3-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)フェニルアミノ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト (化合物am-80)を得た。この化合物は精製せず、次工程に使用した。
実施例88
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-86を有するsiRNA(N6-(3-phosphonooxymethyl)phenyl dAという)を、参考例80.1で得られる化合物am-80を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖)：理論値 6861.00 実測値 6862.08
参考例81.1:化合物am-81
工程1
参考例63の工程1で得られた(2R,3S,5R)-5-(6-(1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール-1-イルオキシ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-オール(250 mg, 0.372 mmol)をエタノール(3.7 mL)に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン(0.194 mL,1.12mmol)および8-メルカプト-1-オクタノール(0.077 mL, 0.447 mmol)を加え、80 ℃で1時間撹拌した。さらに8-メルカプト-1-オクタノール(0.032 mL, 0.186 mmol)を加え1時間撹拌し、室温でさらに一晩撹拌した。反応液を減圧下で溶媒留去し、残渣をヘキサン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製し、 (2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-(8-ヒドロキシオクチルチオ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール (186 mg, 71 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 699(M+1)
工程2
工程1で得られた(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-(6-ヒドロキシオクチルチオ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール (183 mg, 0.262 mmol)をジクロロメタン(3.7 mL)に溶解し、トリエチルアミン(0.182 mL, 1.31 mmol)および4,4'-ジメトキシトリチルクロリド (133 mg, 0.393 mmol)を加え、室温で一晩撹拌した。さらに4,4'-ジメトキシトリチルクロリド (17.8 mg, 0.052 mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。反応液にメタノールを加え、30分間撹拌した。反応液をクロロホルムで抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で溶媒留去し、残渣をヘキサン/酢酸エチル系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、(2R,3S,5R)-5-(6-(6-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)オクチルチオ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-オール (208 mg 79 %)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 8.61 (s, 1H), 8.07 (s, 1H),7.14- 7.44 (m, 18H), 6.78 - 6.84 (m, 8H), 6.45 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 4.66 - 4.70(m,1H), 4.11 - 4.14 (m, 1H), 3.78 (s, 12H), 3.34 - 3.45 (m, 4H), 3.02 (t, J =6.6Hz, 2H), 2.81 - 2.88 (m, 1H), 2.51 - 2.57 (m, 1H) , 1.73 - 1.80 (m, 2H) ,1.56- 1.63 (m, 2H) , 1.42 - 1.45 (m, 2H) , 1.22 - 1.39 (m, 6H).
工程3
工程2で得られた(2R,3S,5R)-5-(6-(6-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)オクチルチオ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-オールを用い、参考例1.1と同様にして(2R,3S,5R)-5-(6-(6-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)オクチルチオ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル2-シアノエチル ジイソプロピルホスホロアミダイト (化合物am-81)を得た。この化合物は精製せず、次工程に使用した。
実施例89
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-87を有するsiRNA(6-(8-phosphonooxyoctyl)thio-dPuという)を、参考例81.1で得られる化合物am-81を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖)：理論値 6900.14 実測値 6899.92
参考例82.1：化合物am-82
工程1
2-(3-アミノフェノキシ)エタノール(300 mg, 1.96 mmol)をDMF (20 mL)に溶解し、イミダゾール(200 mg, 1.94 mmol)およびtert-ブチルジメチルシリルクロリド (354 mg, 2.35 mmol)を加え、室温で90分間撹拌した。反応液に水を加え30分間撹拌した。反応液を酢酸エチルで抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で溶媒を留去し、残渣をヘキサン/酢酸エチル系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、 3-(2-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)エトキシ)アニリン (522mg,99 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 268(M+1)
工程2
工程1で得られた3-(2-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)エトキシ)アニリン (382mg,1.43 mmol)および参考例83の工程3で得られた6-(1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール-1-イルオキシ)-9-((2R,4S,5R)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-5-((tert-ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン(427 mg, 0.714 mmol)をエタノール(7.1 mL)に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン(0.249 mL, 1.43 mmol)を加え、80 ℃で一晩間撹拌した。さらに6-(1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール-1-イルオキシ)-9-((2R,4S,5R)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-5-((tert-ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン(139 mg, 0.520 mmol)およびエタノール(0.9 mL)を加え、2.5時間撹拌した。反応液を減圧下で溶媒留去し、残渣をヘキサン/酢酸エチル系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、9-((2R,4S,5R)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-5-((tert-ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-N-(3-(2-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)エトキシ)フェニル)-9H-プリン-6-アミン (326 mg, 63 %)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 8.53 (s, 1H), 8.19 (s, 1H),7.66(bs, 1H), 7.56 (t, J = 2.2 Hz, 1H), 7.30 - 7.33 (m, 2H), 6.66 - 6.68 (m,1H),6.49 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 4.61 - 4.64 (m, 1H), 3.98 - 4.10 (m, 5H), 3.88 -3.92(m, 1H), 3.77 - 3.82 (m, 1H), 2.63 - 2.71 (m, 1H), 2.43 - 2.49 (m, 1H),0.91 -0.93 (m, 27H), 0.09 - 0.12 (m, 18H).
ESI-MS(m/z): 730(M+1)
工程3
工程2で得られた9-((2R,4S,5R)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-5-((tert-ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-N-(3-(2-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)エトキシ)フェニル)-9H-プリン-6-アミン (324 mg, 0.446 mmol)をTHF (4.5 mL)に溶解し、テトラブチルアンモニウムフルオリド(1.00mol/L THF溶液、1.56 mL)を加え、室温で2時間撹拌した。反応液を減圧下で溶媒留去し、残渣をクロロホルム/メタノール系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、(2R,3S,5R)-5-(6-(3-(2-ヒドロキシエトキシ)フェニルアミノ)-9H-プリン-9-イル)-2-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-3-オール(194mg, 113 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 388(M+1).
工程4
工程3で得られた(2R,3S,5R)-5-(6-(3-(2-ヒドロキシエトキシ)フェニルアミノ)-9H-プリン-9-イル)-2-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-3-オール (0.446 mmol)をピリジン(4.5 mL)に溶解し、4,4'-ジメトキシトリチルクロリド (378 mg, 1.12 mmol)を加え、室温で一晩撹拌した。反応液にメタノールを加え15分間撹拌した。トルエンを加えて、減圧下で溶媒を留去し、残渣に水を適量加えて、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒を留去し、残渣をヘキサン/酢酸エチル系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、(2R,3S,5R)-5-(6-(3-(2-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)エトキシ)フェニルアミノ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-オール(167 mg, 38 %)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 8.47 (s, 1H), 8.00 (s, 1H),7.62- 7.68 (m, 2H), 7.14 - 7.41 (m, 20H), 6.78 - 6.85 (m, 8H), 6.68 - 6.71 (m,1H),6.46 (t, J= 6.5 Hz, 1H), 4.68 - 4.73 (m, 1H) , 4.19 (t, J = 5.1 Hz, 2H),4.12 -4.15 (m, 1H), 3.77 (d, J = 5.5 Hz, 12H), 3.37 - 3.50 (m, 4H), 2.86 - 2.92(m,1H), 2.51 - 2.59 (m, 1H).
ESI-MS(m/z): 992(M+1)
工程5
工程4で得られた(2R,3S,5R)-5-(6-(3-(2-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)エトキシ)フェニルアミノ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-オールを用い、参考例1.1と同様にして(2R,3S,5R)-5-(6-(3-(2-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)エトキシ)フェニルアミノ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト (化合物am-82)を得た。この化合物は精製せず、次工程に使用した。
実施例90
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-88を有するsiRNA(N6-(3-phosphonooxyethoxy)phenyl dAという)を、参考例82.1で得られる化合物am-82を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖)：理論値 6891.02 実測値 6892.22
参考例83.1:化合物am-83
工程1
参考例63の工程1で得られた(2R,3S,5R)-5-(6-(1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール-1-イルオキシ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-オール (250 mg, 0.372 mmol)をエタノール(3.7 mL)に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン(0.194 mL,1.12mmol)および6-メルカプト-1-ヘキサノール(0.061 mL, 0.447 mmol)を加え、80℃で1時間撹拌した。さらに6-メルカプト-1-ヘキサノール(0.025 mL, 0.186 mmol)を加え1時間撹拌した。さらに6-メルカプト-1-ヘキサノール(0.025mL, 0.186 mmol)を加え2時間撹拌した。反応液を減圧下で溶媒留去し、残渣をヘキサン/酢酸エチル系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-(6-ヒドロキシヘキシルチオ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール (198 mg)を得た。
工程2
工程1で得られた(2R,3S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-(6-ヒドロキシヘキシルチオ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール (0.372 mmol)をジクロロメタン(3.7 mL)に溶解し、トリエチルアミン(0.259 mL, 1.861 mmol)および4,4'-ジメトキシトリチルクロリド (252 mg, 0.744 mmol)を加え、室温で2時間撹拌し、反応液にメタノールを加え30分間撹拌した。反応液をクロロホルムで抽出し、有機層は無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で溶媒を留去し、残渣をヘキサン/酢酸エチル系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、(2R,3S,5R)-5-(6-(6-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)ヘキシルチオ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-オール (231 mg, 59 %)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 8.61 (s, 1H), 8.08 (s, 1H),7.14- 7.44 (m, 18H), 6.78 - 6.83 (m, 8H), 6.45 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 4.66 - 4.70(m,1H), 4.11 - 4.14 (m, 1H), 3.78 (s, 12H), 3.32 - 3.45 (m, 4H), 3.04 (t, J =6.6Hz, 2H), 2.81 - 2.88 (m, 1H), 2.51 - 2.57 (m, 1H) , 1.73 - 1.80 (m, 2H) ,1.57- 1.66 (m, 2H) , 1.50 - 1.37 (m, 4H).
工程3
工程2で得られた(2R,3S,5R)-5-(6-(6-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)ヘキシルチオ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-オールを用い、参考例1.1と同様にして(2R,3S,5R)-5-(6-(6-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)ヘキシルチオ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル2-シアノエチル ジイソプロピルホスホロアミダイト (化合物am-83)を得た。この化合物は精製せず、次工程に使用した。
実施例91
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-89を有するsiRNA(6-(6-phosphonooxy)hexylthio-dPuという)を、参考例83.1で得られる化合物am-83を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖)：理論値 6872.08 実測値 6871.82
参考例84.1:化合物am-84
工程1
参考例50.1の工程2で得られる9-((4aR,6R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチルテトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-((E)-スチリル)-9H-プリン(1.38 g、 2.87 mmol)を用いて参考例14.0の工程2と同様にして、8-ブロモ-9-((4aR,6R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチルテトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-((E)-スチリル)-9H-プリン(922 mg、56%)を得た。
工程2
工程1で得られる8-ブロモ-9-((4aR,6R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチルテトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-((E)-スチリル)-9H-プリン(300 mg、 0.538 mmol)を用いて参考例41.1の工程2と同様にして、N-ベンジル-9-((4aR,6R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチルテトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-((E)-スチリル)-9H-プリン-8-アミン(342 mg、109%)を得た。
ESI-MS(m/z): 584(M+1)
工程3〜5
工程2で得られるN-ベンジル-9-((4aR,6R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチルテトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-((E)-スチリル)-9H-プリン-8-アミンを用いて参考例1.1の工程3〜5と同様にして、(2R,3S,5R)-5-(8-(ベンジルアミノ)-6-((E)-スチリル)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-84)を得た。
1H-NMR (CDCl3, 400MHz) δ: 8.58, 8.58 (1H, 2s), 8.22,8.18(1H, 2s), 7.63-7.61 (m, 2H), 7.53-7.49 (m, 1H), 7.37-7.21 (m, 14H),6.72-6.70(m, 5H), 6.54-6.48 (m, 1H), 6.36-6.32 (m, 1H), 4.87-4.78 (m, 1H),4.57-4.51 (m,1H), 4.20-4.06 (m, 3H), 3.92-3.74 (m, 7H), 3.64-3.49 (m, 4H),3.36-3.34 (m,2H), 3.10-2.99 (m, 1H), 2.58, 2.46 (m, 3H), 1.21-1.04 (m, 12H).
実施例92
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-90を有するsiRNA(8-BnNH-6-styryl-dPuという)を、参考例84.1で得られる化合物am-84を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖)：理論値 6866.14 実測値 6866.99
参考例85.1:化合物am-85
工程1〜4
参考例50.1の工程1〜4と同様にして、ベンゼントリメタノールを用いて、(2R,3S,5R)-5-(6-((3,5-ビス((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)ベンジル)オキシ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル (2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-85)を得た。
1H-NMR (CDCl3, 400MHz) δ: 8.48-8.45 (1H, m),8.09-8.07(1H, m), 7.52-7.50 (5H, m), 7.42-7.37 (12H, m), 7.29-7.14 (13H, m),6.83-6.75(12H, m), 6.49-6.45 (1H, m), 5.65 (2H, s), 4.76-4.73 (1H, m),4.31-4.30 (1H,m), 4.18 (4H, s), 3.87-3.56 (22H, m), 3.41-3.33 (2H, m), 2.87-2.84(1H, m),2.62-2.45 (3H, m), 1.18-1.13 (12H, m).
実施例93
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-91を有するsiRNA(O6-(3,5-diphosphonooxymethyl)Bn dIという)を、参考例85.1で得られる化合物am-85を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6985.01 実測値6985.44
参考例86.1:化合物am-86
工程1〜4
参考例50.1の工程1〜4と同様にして、(5-ニトロ-1,3-フェニレン)ジメタノールを用いて、(2R,3S,5R) -2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-((3-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-ニトロベンジル)オキシ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル (2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト (am-86)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 8.47-8.45(1H, m), 8.27(1H,brs),8.18(1H, brs), 8.13, 8.11 (1H, 2 brs), 7.80(1H, brs), 7.50-7.45(2H,m),7.42-7.34(6H, m), 7.32-7.15(10H, m), 6.87-6.75(8H, m), 6.50-6.46(1H,m),5.72(2H, s), 4.81-4.72(1H, m), 4.34-4.27(3H, m), 3.96-3.55(16H,m),3.43-3.32(2H, m), 2.92-2.84(1H, m), 2.72-2.57(2H, m), 2.88(1H, t, J= 6.6Hz),1.20-1.11(12H, m).
実施例94
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-92を有するsiRNA(O6-(3-nitro-5-phosphonooxymethyl)Bn dIという)を、参考例86.1で得られる化合物am-86を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6920.00 実測値6920.75
参考例87.1:化合物am-87
工程1
J.Am.Chem.Soc、2007年,第129巻,782-789頁に記載の方法で合成した(2R,3S,5R)-5-(6-((1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾル-1-イル)オキシ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メエトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-オール(0.403g, 0.600 mmol)および3-(アミノメチル)安息香酸 (0.181 g、1.20mmol)を用い、参考例39.1の工程1と同様にして、3-(((9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)アミノ)メチル)安息香酸 (153 mg、37%)を得た。
ESI-MS(m/z): 689(M+1)
工程2
工程1で合成した3-(((9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)アミノ)メチル)安息香酸 (153 mg、0.222 mmol)を用い、参考例26.1の工程2と同様にして、2-シアノエチル3-(((9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)アミノ)メチル)ベンゾエート (97.0mg,61%)を得た。
ESI-MS(m/z): 742(M+1)
工程3
工程2で合成した2-シアノエチル 3-(((9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)アミノ)メチル)ベンゾエート (97.0mg,0.131 mmol)を用い、参考例39.1の工程2と同様にして、2-シアノエチル 3-(((9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(((2-シアノエトキシ)(ジイソプロピルアミノ)ホスファニル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)アミノ)メチル)ベンゾエート (化合物am-87) (60.0 mg, 49%)を得た。
1H-NMR (CDCl3, 400MHz) δ: 8.35 (1H, s), 8.07 (1H,s),7.99-7.95 (2H, m), 7.64-7.62 (1H, m), 7.42-7.40 (3H, m), 7.31-7.17 (7H,m),6.80-6.77 (4H, m), 6.45-6.43 (1H, m), 6.05 (1H, s), 4.93 (2H, s),4.78-4.75(1H, m), 4.52-4.50 (2H, m), 4.29-4.28 (1H, m), 3.78-3.69 (10H, m),3.45-3.31(2H, m), 2.90-2.59 (5H, m), 2.47-2.45 (1H, m), 1.20-1.10 (12H, m).
実施例95
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-93を有するsiRNA(N6-(3-carboxy)Bn dAという)を、参考例87.1で得られる化合物am-87を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6808.02 実測値
参考例88.1:化合物am-88
工程1
参考例63の工程1で得られた(2R,3S,5R)-5-(6-(1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール-1-イルオキシ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-オールを用いて、参考例1.1と同様にして(2R,3S,5R)-5-(6-(1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール-1-イルオキシ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル2-シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト (化合物am-88)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 8.34 (d, J = 2.2 Hz, 1H),8.32(d, J = 10.2 Hz, 1H), 8.13 - 8.15 (m, 1H), 7.56 - 7.13 (m, 12H), 6.77 -6.82(m, 4H), 6.51 - 6.55 (m, 1H), 4.76 - 4.84 (m, 1H), 4.32 - 4.38 (m, 1H),3.78 -3.79 (m, 6H), 3.34 - 3.47 (m, 2H), 2.89 - 2.96 (m, 1H), 2.66 - 2.78 (m,1H) ,2.47 - 2.63 (m, 2H), 2.36 (s, 2H) 1.13 - 1.32 (m, 14H).
ESI-MS(m/z): 872(M+1)
実施例96
工程1
参考例88で得られた化合物am-88を用いて、アンチセンス鎖の5’末端のXにジエチル2-(((((2R,3S,5R)-5-(6-(1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール-1-イルオキシ)-9H-プリン-9-イル)-3-ヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリルオキシ)メチル)-2-(ヒドロキシメチル)マロナートを有する1本鎖オリゴヌクレオチドを実施例1と同様に合成した。
工程2
工程1で得られた1本鎖オリゴヌクレオチドに、10 mmol/L 2-(3-メルカプトフェニル)酢酸のDMSO溶液および50 mmol/L トリエチルアミンのDMSO溶液を65℃で5時間反応させ、後述の表39に示す454-Xa-dTのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-94を有するsiRNAを合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖)：理論値 6824.10 実測値6824.00
実施例97
工程1
参考例88で得られた化合物am-88および3-アミノ-1-プロパンスルホン酸を用いて、実施例96と同様にして、後述の表39に示す454-Xa-dTのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-95を有するsiRNAを合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖)：理論値 6795.07 実測値6794.00
参考例89.1:化合物am-89
工程1〜4
(3-(4-メトキシ-4-オキソブチル)フェニル)ボロン酸を用い、参考例59.1の工程1〜4と同様にして、2-シアノエチル 4-(3-(9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(((2-シアノエトキシ)(ジイソプロピルアミノ)ホスファニル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)フェニル)ブタノエート (am-89)を得た。
1H-NMR (CDCl3, 400MHz) δ: 8.94-8.94 (1H, m), 8.66-8.64(1H,m), 8.54 (1H, s), 8.32-8.30 (1H, m), 7.51-7.48 (1H, m), 7.41-7.39 (2H,m),7.36-7.34 (1H, m), 7.31-7.16 (7H, m), 6.78-6.77 (4H, m), 6.58-6.54 (1H,m),4.83-4.76 (1H, m), 4.36-4.32 (1H, m), 4.26-4.24 (2H, m), 3.91-3.56 (10H,m),3.47-3.42 (1H, m), 3.36-3.34 (1H, m), 2.98-2.93 (1H, m), 2.82-2.80 (2H,m),2.76-2.61 (4H, m), 2.47-2.43 (3H, m), 2.09-2.05 (2H, m), 1.17 (12H, dt, J=21.9, 7.9 Hz).
実施例98
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-96を有するsiRNA(6-(3-carboxypropylphenyl)-dPuという)を、参考例89.1で得られる化合物am-89を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6822.10 実測値 6816.08
参考例90.1:化合物am-90
工程1〜2
N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)エチレンジアミンを用い、参考例62.1の工程2〜3と同様にして、(2R,3S,5R)-5-(6-((2-(ビス(2-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)エチル)アミノ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-オールを得た。
ESI-MS(m/z): 1290.04(M+1)
工程3
工程2で得られた(2R,3S,5R)-5-(6-((2-(ビス(2-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)エチル)アミノ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-オールを用い、参考例39.1の工程2と同様にして、(2R,3S,5R)-5-(6-((2-(ビス(2-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)エチル)アミノ)エチル)アミノ-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル (2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト (am-90)を得た。
1H-NMR (CDCl3, 400MHz) δ: 8.38 (1H, s), 7.98-7.95 (1H,m),7.70-7.16 (30H, m), 6.84-6.76 (12H, m), 6.45-6.43 (1H, m), 5.91 (1H,s),4.76-4.73 (3H, m), 4.30-4.28 (1H, m), 4.13-4.12 (4H, m), 3.89-3.54 (24H,m),3.41-3.34 (2H, m), 2.90-2.87 (1H, m), 2.69-2.55 (2H, m), 2.47-2.45 (1H,m),1.20-1.10 (12H, m).
実施例99
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-97を有するsiRNA(N6-(N,N-diphosphonooxyethyl)aminoethyl dAという)を、参考例90.1で得られる化合物am-90を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6966.06 実測値 6965.21
参考例91.1:化合物am-91
工程1〜4
(5-ヨード-1,3-フェニレン)ジメタノールを用い、参考例67.1の工程1〜4と同様にして、(2R,3S,5R)-5-(6-((3-(3,5-ビス((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)フェニル)プロプ-2-イン-1-イル)アミノ)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル (2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト (am-91)を得た。
1H-NMR (CDCl3, 400MHz) δ: 8.26 (1H, s), 7.84-7.82 (1H,m),7.52-7.00 (27H, m), 6.80-6.72 (12H, m), 6.42-6.40 (1H, m), 6.03 (1H, brs),4.75-4.69 (1H, m), 4.28-4.27 (1H, m), 3.90-3.54 (24H, m), 3.44-3.29 (2H,m),3.16-3.15 (4H, m), 2.84-2.78 (7H, m), 2.65-2.54 (2H, m), 2.46-2.44 (1H,m),1.20-1.10 (12H, m).
実施例100
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-98を有するsiRNA(N6-(3,5-diphosphonooxymethyl)phenylpropargyl dAという)を、参考例91.1で得られる化合物am-91を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 7009.08 実測値 7009.53
参考例92.1:化合物am-92
工程1〜3
N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-1,3-プロピレンジアミンを用い、参考例90.1の工程1〜3と同様にして、(2R,3S,5R)-5-(6-((3-(ビス(2-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)エチル)アミノ)プロピル)アミノ-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル (2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト (am-92)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 8.27 (1H, s), 7.79, 7.77 (1H,2s), 7.42-7.36 (6H, m), 7.31-7.11 (21H, m), 6.79-6.73 (12H, m), 6.42-6.38(1H,m), 6.32 (1H, brs), 4.78-4.70 (1H, m), 4.30-4.25 (1H, m), 3.91-3.30 (26H,m),3.18 (4H, t, J= 6.2 Hz), 2.90-2.81(1H, m), 2.71 (4H, t, J= 6.0 Hz),2.66-2.52(4H, m), 2.45 (1H, t, J= 6.4 Hz), 1.76-1.69 (2H, m), 1.20-1.11 (12H,m).
実施例101
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-99を有するsiRNA(N6-(N,N-diphosphonooxyethyl)aminopropyl dAという)を、参考例92.1で得られる化合物am-92を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6980.08 実測値 6979.20
参考例93.1:化合物am-93
工程1〜3
2-(1-(メルカプトメチル)シクロプロピル)酢酸を用い、参考例87.1の工程1〜3と同様にして、2-シアノエチル2-(1-(((9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(((2-シアノエトキシ)(ジイソプロピルアミノ)ホスファニル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)チオ)メチル)シクロプロピルアセテート (am-93)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 8.57(1H, s), 8.16, 8.14(1H, 2s),7.40-7.38(2H, m), 7.31-7.17(7H, m), 6.80-6.77(4H, m), 6.48-6.44(1H,m),4.80-4.72(1H, m), 4.33-4.27(1H, m), 4.30 (2H, t, J= 6.4 Hz), 3.90-3.30(14H,m),2.93-2.86(1H, m), 2.70-2.58 (4H, m), 2.49(2H, s), 2.47(1H, t, J= 6.4Hz),1.20-1.11(12H, m), 0.80(2H, t, J= 5.5 Hz), 0.63(2H, t, J= 5.5 Hz).
実施例102
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-100を有するsiRNA(6-(1-carboxymethyl)cyclopropylmethyl-dPuという)を、参考例93.1で得られる化合物am-93を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6804.10 実測値 6798.26
参考例94.1:化合物am-94
工程1〜3
3-メルカプト安息香酸を用い、参考例87.1の工程1〜3と同様にして、3-((9-((2R,4S,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(((2-シアノエトキシ)(ジイソプロピルアミノ)ホスファニル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)チオ)安息香酸 (am-94)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ: 8.53 (1H, s), 8.34 (1H, s),8.22,8.20 (1H, 2 s), 8.16 (1H, d, J= 7.8 Hz), 7.88 (1H, d, J= 7.8 Hz), 7.57(1H, t,J= 7.8 Hz), 7.41-7.36(2H, m), 7.29-7.17 (7H, m), 6.80-6.77 (4H, m),6.50-6.45(1H, m), 4.80-4.72 (1H, m), 4.54 (2H, t, J= 6.4 Hz), 4.34-4.28 (1H,m),3.89-3.31 (12H, m), 2.95-2.88 (1H, m), 2.84 (2H, t, J= 6.4 Hz), 2.73-2.67(1H,m), 2.62 (1H, t, J= 6.4 Hz), 2.47 (1H, t, J= 6.4 Hz), 1.20-1.11 (12H, m).
実施例103
後述の表38に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-101を有するsiRNA(6-(3-carboxy)phenylthio-dPuという)を、参考例94.1で得られる化合物am-94を用いて、実施例1-1と同様に合成した。
ESI-MS(アンチセンス鎖) 理論値 6812.07 実測値6811.50
実施例104
後述の表40に示すアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-1を有するsiRNAを、実施例1-1と同様に合成した。
試験例6:
実施例1〜4で得られたアンチセンス鎖の5’末端に非天然型ヌクレオチド残基が導入された、ルシフェラーゼ標的siRNAのAGO2との親和性を、以下に示したように、ビアコア（Biacore） T100及びT200システム(ジーイーヘルスケアサイエンス(GE)社)を用い、siRNAとAGO2-MIDドメインの親和性を基盤表面に固定したオリゴDNAの5’末端との競合を測定することで評価した。
(1)試料の調製
ランニングバッファー原液(HBS-EP+ 10X、GE社、BR-1006-69)を純水で10倍希釈し、フィルターろ過することでHPS-EP+(10 mM HEPES (4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸), 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05%(v/v) SurfactantP20, pH7.4)とし、ランニングバッファーとして使用した。
HBS-EP+に終濃度2 mMとなるようにジチオトレイトール(dithiothreitol(DTT))を加え、本溶液でsiRNA溶液を200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nMへ希釈し、同様に希釈した5μg/mLAGO2-MIDドメインと等量混合することで、siRNAをそれぞれ100 nM, 50 nM, 25 nM, 12.5 nM含む2.5μg/mLAGO2-MIDドメイン溶液を調製した。
(2)測定方法
(2-1)ビオチン化オリゴの固定化
チップ(Series S Sensor Chip SA、GE社 BR-1005-31)にビオチン化一本鎖DNA(dT(16)-Biotin)の固定化を行った。流速(Flow rate)は10 μL/分で一定、HBS-EP+で100 nM に希釈したビオチン化一本鎖DNA溶液を以下のプログラムでFc2もしくはFc4に固定化した。同時にFc1, Fc3はブランクの固定化操作を行った。
1. 1M NaCl/50 mM NaOH, 60秒(インジェクト(INJECT)コマンド), 3回
2. ランニングバッファー (ウォシュ(WASH)コマンド)
3. ランニングバッファー 120秒(インジェクト(INJECT)コマンド)
4. エイム・フォー・イモビライズド・レベル(Aim for Immobilized Level)を750 RUに設定し固定化(リガンド・インジェクト(LIGAND INJECT)コマンド)
5. 1M NaCl/50 mM NaOH/50% イソプロピルアルコール (WASHコマンド)
固定化したセルでは約700RUの固定量が確認された。
(2-2) オリゴヌクレオチド(siRNA)の競合実験
ビオチン化一本鎖DNAを固定化したチップを用いてsiRNAによる競合実験を行った。流速は全て30 μL/分で行い、1サイクルは結合60秒、乖離5 秒、再生 1M NaCl, 5 秒で行う。
機械安定化のため、初めの10サイクルはHBS-EP+のみ添加し、その後は各siRNAごとにHBS-EP+(ブランク(BLANK))、2.5 μg/mL AGO2-MIDドメイン溶液(コントロール(CONTROL))、siRNAをそれぞれ100 nM, 50 nM, 25 nM, 12.5 nM含む2.5μg/mLAGO2-MIDドメイン溶液(サンプル(Sample))の順に測定する。解析では、固定化したセルのグラフからブランク固定をしたグラフを差し引いたグラフのbinding levelを使用し、残存結合率(%)を([Sample]-[BLANK])/([CONTROL]-[BLANK])×100で算出し、阻害率(%)を100-(残存結合率)で算出する。
また、比較のために、各siRNAのアンチセンス鎖の5’末端に対応する天然型のヌクレオチドを有するsiRNAについても同様に試験を行った。
表35に、それぞれの阻害率(%)を示す。

試験例6の結果から、実施例1〜4で得られたアンチセンス鎖の5’末端に非天然型ヌクレオチド残基が導入された、ルシフェラーゼ標的siRNA(874-8-Br-dA、874-8-oxo-dA、874-5-Br-dU、454-5-F-dUおよび1556-5-F-dU)は、それぞれの5’末端に対応する天然型のヌクレオチドであるアデノシン一リン酸またはウリジン一リン酸を有するsiRNA(874-A及び874-U)と比較して、いずれも阻害率(%)が高く、AGO2との親和性が高いことが明らかとなった。
試験例7: ヌクレオチド(モノマー)のビアコア
実施例1および4で得られたsiRNAの5’末端の非天然型ヌクレオチドである、8-Br-dA(化合物I-1)および5-フルオロ-2’-デオキシウリジン一リン酸(化合物I-4)のAGO2との親和性を、以下に示したように、ビアコア（Biacore） T100及びT200システム(GE社)を用い、siRNAとAGO2-MIDドメインの親和性を基盤表面に固定したオリゴDNAの5’末端との競合を測定することで評価した。
(1)試料の調製
HBS-EP+ 10Xを純水で10倍希釈し、終濃度2 mMとなるようにDTTを加え、フィルターろ過することでHBS-EP+, 2 mM DTT水溶液とした。この溶液に終濃度1%となるようにジメチルスルホキシド(Dimethyl sulfoxide(DMSO))を加え、ランニングバッファーとした。
DMSOもしくは蒸留水に溶解したモノマー溶液を、200μM,40 μM, 8 μM, 1.6 μM/(2% DMSO, HBS-EP+, 2 mM DTT)となるように希釈し、HBS-EP+, 2 mM DTT溶液で希釈した5 μg/mL AGO2-MIDドメインと等量混合することで、HBS-EP+, 2 mM DTT, 1%DMSO溶液でモノマーをそれぞれ100μM,20 μM, 4 μM, 0.8 μM含む2.5 μg/mL AGO2-MIDドメイン溶液を調製した。
(2) ヌクレオチド(モノマー)の競合実験
試験例6と同様にdT(16)-Biotinオリゴを固定化したチップを用いてsiRNAによる競合実験を行った。流速は全て30 μL/分で行い、1サイクルは結合60秒、乖離5秒、再生 1M NaCl, 5秒で行う。
機械安定化のため、初めの10サイクルはHBS-EP+のみ添加し、その後は各モノマーについて、HBS-EP+(BLANK)、 2.5 μg/mL AGO2-MIDドメイン溶液(CONTROL)、モノマーをそれぞれ100 μM, 20 μM, 4 μM,0.8μM含む2.5 μg/mL AGO2-MIDドメイン溶液(Sample)、2.5 μg/mL AGO2-MIDドメイン溶液(CONTROL) の順に測定する。
解析では、固定化したセルのグラフからブランク固定をしたグラフを差し引いたグラフのbinding levelを使用し、残存結合率(%)を([Sample]-[BLANK])/([CONTROL]-[BLANK])×100で算出し、阻害率(%)を100-(残存結合率)で算出する。
表36に、8-Br-dA(化合物I-1)および5-フルオロ-2’-デオキシウリジン一リン酸(化合物I-4)と、それぞれの比較として、アデノシン一リン酸(AMP)およびウリジン一リン酸(UMP)の阻害率(%)を示す。

試験例7の結果から、本発明のsiRNAのアンチセンス鎖の5’末端に導入した非天然型ヌクレオチドである、8-Br-dAおよび5-フルオロ-2’-デオキシウリジン一リン酸は、天然ヌクレオチドであるアデノシン一リン酸またはウリジン一リン酸と比較して、いずれも阻害率(%)が高く、AGO2との親和性が高いことが明らかとなった。
試験例8: モノマーのビアコア
実施例7〜33、及び35〜40で得られるsiRNAの5’末端の非天然型ヌクレオチドである、化合物I-5〜I-31、及びI-33〜I-38のAGO2との親和性を、試験例7と同様に評価した。
表37にそれぞれ測定した阻害率(%)を示す。

試験例8の結果から、実施例7〜33、及び35〜40で得られるsiRNAの5’末端の非天然型ヌクレオチドである、化合物I-5〜I-31、及びI-33〜I-38は、いずれも阻害率(%)が高く、AGO2との親和性が高いことが明らかとなった。よって、実施例7〜33、及び35〜40で得られるsiRNAは、AGO2との親和性が向上したオリゴヌクレオチドになり、標的mRNAに対する高いノックダウン活性を有するオリゴヌクレオチドになることが期待される。
試験例9：ルシフェラーゼ標的siRNAのノックダウン活性
1ウェルあたりの細胞数を7500細胞数とし、siRNAの最終濃度を10000 pmol/L、1000 pmol/L、100 pmol/L、10 pmol/L、1 pmol/Lの5点としてN=5で設定した以外は試験例１と同様にして、実施例39、23、36、または27で得られたアンチセンス鎖の5’末端に各化合物を有するsiRNAの活性を測定して評価した。アンチセンス鎖の5’末端に、I-37(6-NO2,7-Me-dQu)、I-21(6-napht-2-yl-dPu)、I-34(6-Me-dU)、またはI-25(6-napht-1-yl-dPu)を有するsiRNAのノックダウン活性を図4に示した。
なお、表38中の454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに8-Br-dAを有するsiRNA(454-BrdAという)を、8-Br-dAを用いて実施例１と同様に合成し、siRNAの活性を測定して評価した。さらに、アンチセンス鎖の5’末端がアデノシン一リン酸、またはウリジン一リン酸を有する天然型のヌクレオチドを有するsiRNA(454-A、または454-Uという)についても、同様にsiRNAの活性を測定して評価した。
試験例9の結果から、アンチセンス鎖の5’末端にAgo2高親和性塩基アナログを有するsiRNAは、アンチセンス5’末端に天然型のヌクレオチドを有するsiRNAと比較して、高いノックダウン活性を示すことが分かる。
試験例10：ルシフェラーゼ標的siRNAのノックダウン活性
1ウェルあたりの細胞数を7500細胞数とし、siRNAの最終濃度を10000 pmol/L、1000 pmol/L、100 pmol/L、10 pmol/L、1 pmol/Lの5点としてN=5で設定した以外は試験例１と同様にして、実施例34、及び21で得られたアンチセンス鎖の5’末端に各化合物を有するsiRNAの活性を測定して評価した。アンチセンス鎖の5’末端に、I-32(2'-OMe-6-styryl-dA)、またはI-19(di-Me-thienyl-dU)を有するsiRNAのノックダウン活性を図5に示した。
試験例10の結果から、アンチセンス鎖の5’末端にAgo2高親和性塩基アナログを有するsiRNAは、アンチセンス5’末端に対応する天然型のヌクレオチドを有するsiRNAと比較して、高いノックダウン活性を示すことが分かる。



試験例 11：ルシフェラーゼ標的siRNAのノックダウン活性
1ウェルあたりの細胞数を7500細胞数とし、siRNAの最終濃度を1000 pmol/L、100 pmol/L、10 pmol/L、1 pmol/L、0.1 pmol/Lの5点としてN=5で設定した以外は試験例１と同様にして、実施例32及び41〜51で得られた各化合物をアンチセンス鎖の5’末端に有するsiRNAの活性を測定して評価した。アンチセンス鎖の5’末端に、I-45 (8-BnNH-6-styryl purine)、I-44 (N-Bn-N-Me dA)またはI-46(8-furanylmethylamino-6-styrylpurine)を有するsiRNAのノックダウン活性を図6に示した。そして、アンチセンス鎖の5’末端に、I-39 (6-benzothiophenyl purine)、I-41(6-pyrenylpurine)、I-43 (N-Bn dA)またはI-40(6-benzyloxynaphtyl purine) を有するsiRNAのノックダウン活性を図7；アンチセンス鎖の5’末端に、I-42(6-anthracenylpurine) を有するsiRNAのノックダウン活性を図8；アンチセンス鎖の5’末端に、I-47(6-styryl-8-tetrazolylmethylaminopurine) を有するsiRNAのノックダウン活性を図9；アンチセンス鎖の5’末端にI-30(6-(m-carboxyphenyl) purine を有するsiRNAのノックダウン活性を図10；アンチセンス鎖の5’末端にI-48(6-(m-carboxyethylphenyl) purine)を有するsiRNAのノックダウン活性を図11；及びアンチセンス鎖の5’末端にI-49 (5-furyl dU)を有するsiRNAのノックダウン活性を図12にそれぞれ示した。なお、表38中の454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端がアデノシン一リン酸である天然型siRNA (454-A)についても、同一の条件下においてsiRNAの活性を測定し、評価した。
試験例11の結果から、アンチセンス鎖の5’末端にAgo2高親和性塩基アナログを有するsiRNAは、アンチセンス5’末端に対応する天然型のヌクレオチドを有するsiRNAと比較して、高いノックダウン活性を示すことが分かる。
試験例 12：ルシフェラーゼ標的siRNAのノックダウン活性
1ウェルあたりの細胞数を7500細胞数とし、siRNAの最終濃度を500 pmol/L、100 pmol/L、20 pmol/L、4 pmol/L、0.8 pmol/Lの5点としてN=5で設定した以外は試験例１と同様にして、実施例52で得られた化合物をアンチセンス鎖の5’末端に有するsiRNAの活性を測定して評価した。アンチセンス鎖の5’末端にI-50 (2-amino rA)を有するsiRNAのノックダウン活性を図13に示した。なお、表38中の454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端がアデノシン一リン酸である天然型siRNA (454-A)についても、同一の条件下においてsiRNAの活性を測定し、評価した。
試験例12の結果から、アンチセンス鎖の5’末端にAgo2高親和性塩基アナログを有するsiRNAは、アンチセンス5’末端に対応する天然型のヌクレオチドを有するsiRNAと比較して、高いノックダウン活性を示すことが分かる。
上記試験例9〜12の結果から、本発明によって活性向上したsiRNAを医薬応用することにより、天然型のsiRNAを用いる場合と比較して、投与量の抑制が期待できる。
試験例13:ルシフェラーゼ標的siRNAのRNAi活性
実施例24および53で得られたアンチセンス鎖の5’末端にI-22またはI-51を有するルシフェラーゼ標的siRNAのRNAi活性を、以下に示したようにルシフェラーゼ発光抑制レベルを指標に評価した。
試験例1にて用いたルシフェラーゼ発現ベクターを導入したヒーラ(Hela)細胞を、10%ウシ胎仔血清を含むアールピーエムアイ1640培地(RPMI 1640 Medium (ATCC Modification) インビトロジェン (Invitrogen Life technologies、型番A10491-01)中に懸濁し、1ウェルあたり7500細胞数となるように50μLの細胞懸濁液を培養ディッシュ(CulturPlateTM 96 細胞培養用マイクロプレート、型番6005688)の各ウェルに播種した。
siRNAをオプティ-メム(OPTI-MEM)(インビトロジェン (InvitrogenLifetechnologies)、31985-070)で希釈した。リポフェクタミンRNAi マックス (lipofectamine RNAiMAX、インビトロジェン(Invitrogen Life technologies)、13778-150)をオプティ-メム(OPTI-MEM)で希釈した。調製したそれぞれの希釈液を混合し、siRNAとリポフェクタミンRNAi マックス複合体を形成させた。細胞懸濁液を含む各ウェルに、調製したsiRNA-ポフェクタミンRNAi マックス複合体溶液を10μL添加することでsiRNAをヒーラ(Hela)細胞に導入した。siRNAの最終濃度は1000pmol/L、100 pmol/L、10 pmol/L、1 pmol/Lおよび100 fmol/Lの5点とし、N=5で設定した。また陰性対照群としてリポフェクタミンRNAi マックスのみを添加した細胞を播種した。また、比較のために、各siRNAのI-22またはI-51に相当する位置にアデノシン一リン酸を有する454-Aについても同様に試験を行った。
siRNA導入後の細胞は、37 ℃、5%CO2条件下で24時間培養した。
培養後の細胞に対して市販ルシフェラーゼ定量試薬であるステディーグロルシフェラーゼアッセイシステム(Steady-GloLuciferase Assay System、プロメガ(Promega)、 E2520)を、添付のプロトコルに則り各ウェルに40μL添加し、ARVO (パーキンエルマー (PerkinElmer))でプロトコルに則り、各ウェルの0.5秒あたり発光量(cps)を測定した。
ルシフェラーゼ標的siRNA処理群の発光量と同時に、陰性対照群の発光量も測定することでsiRNA導入検体のRNAi効果を、siRNA未導入群(陰性対照群)における発光量を1としたときの相対的な割合として算出した。
本試験の結果を図14に示す。図14は、本発明のsiRNAであるI-22、I-51、およびその配列中のI-22またはI-51に相当する位置にアデノシン一リン酸を有する454-Aとのノックダウン活性を示す図である。縦軸は50%阻害濃度(IC50(pM))、横軸は用いたsiRNAを表す。統計解析には、統計解析ソフトサス (SAS、リリース 9.2、サスインスティチュート (SAS Institute Inc.))を用いた。
試験例13の結果から、アンチセンス鎖の5’末端にI-22またはI-51を有するsiRNAは、アンチセンス5’末端に対応する天然型のヌクレオチドを有するsiRNAと比較して、高いノックダウン活性を示すことが分かる。
試験例 14：ルシフェラーゼ標的siRNAのノックダウン活性
発光測定機器を2104 EnVisionTM マルチラベルカウンター(パーキンエルマー (PerkinElmer))で各ウェルの0.8秒あたり発光量を測定した以外は試験例13と同様にして、実施例54, 57および58で得られた化合物をアンチセンス鎖の5’末端に有するsiRNAの活性を測定して評価した。アンチセンス鎖の5’末端にI-52, I-55またはI-56を有するsiRNAと、その配列中のI-52, I-55またはI-56に相当する位置に天然型のアデノシン一リン酸を有する454-Aとのノックダウン活性を図15に示した。
試験例14の結果から、アンチセンス鎖の5’末端にI-52, I-55またはI-56を有するsiRNAは、アンチセンス5’末端に対応する天然型のヌクレオチドを有するsiRNAと比較して、高いノックダウン活性を示すことが分かる。
試験例 15：ルシフェラーゼ標的siRNAのノックダウン活性
試験例13と同様にして、実施例56, 59, 60および61で得られた化合物をアンチセンス鎖の5’末端に有するsiRNAの活性を測定して評価した。アンチセンス鎖の5’末端にI-54, I-57, I-58またはI-59を有するsiRNAと、その配列中のI-54, I-57, I-58またはI-59に相当する位置に天然型のアデノシン一リン酸を有する454-Aとのノックダウン活性を図16に示した。
試験例15の結果から、アンチセンス鎖の5’末端にI-54, I-57, I-58またはI-59を有するsiRNAは、アンチセンス5’末端に対応する天然型のヌクレオチドを有するsiRNAと比較して、高いノックダウン活性を示すことが分かる。
試験例 16：ルシフェラーゼ標的siRNAのノックダウン活性
試験例13と同様にして、実施例55, 62, 63,64,65, 66,および72で得られた化合物をアンチセンス鎖の5’末端に有するsiRNAの活性を測定して評価した。アンチセンス鎖の5’末端にI-53, I-60, I-61, I-62, I-63, I-64またはI-70を有するsiRNAと、その配列中のI-53, I-60, I-61, I-62, I-63,I-64またはI-70に相当する位置に天然型のアデノシン一リン酸を有する454-Aとのノックダウン活性を図17に示した。
試験例16の結果から、アンチセンス鎖の5’末端にI-53, I-60, I-61, I-62, I-63, I-64またはI-70を有するsiRNAは、アンチセンス5’末端に対応する天然型のヌクレオチドを有するsiRNAと比較して、高いノックダウン活性を示すことが分かる。
試験例 17：ルシフェラーゼ標的siRNAのノックダウン活性
試験例13と同様にして、実施例73, 74, 75および76で得られた化合物をアンチセンス鎖の5’末端に有するsiRNAの活性を測定して評価した。アンチセンス鎖の5’末端にI-71, I-72, I-73またはI-74を有するsiRNAと、その配列中のI-71, I-72, I-73またはI-74に相当する位置に天然型のアデノシン一リン酸を有する454-Aとのノックダウン活性を図18に示した。
試験例17の結果から、アンチセンス鎖の5’末端にI-71, I-72, I-73またはI-74を有するsiRNAは、アンチセンス5’末端に対応する天然型のヌクレオチドを有するsiRNAと比較して、高いノックダウン活性を示すことが分かる。
試験例 18：ルシフェラーゼ標的siRNAのノックダウン活性
試験例13と同様にして、実施例67, 68, 69, 70および71で得られた化合物をアンチセンス鎖の5’末端に有するsiRNAの活性を測定して評価した。アンチセンス鎖の5’末端にI-65, I-66, I-67, I-68またはI-69を有するsiRNAと、その配列中のI-65, I-66, I-67, I-68またはI-69に相当する位置に天然型のアデノシン一リン酸を有する454-Aとのノックダウン活性を図19に示した。
試験例18の結果から、アンチセンス鎖の5’末端にI-65, I-66, I-67, I-68またはI-69を有するsiRNAは、アンチセンス5’末端に対応する天然型のヌクレオチドを有するsiRNAと比較して、高いノックダウン活性を示すことが分かる。
試験例 19：ルシフェラーゼ標的siRNAのノックダウン活性
試験例13と同様にして、実施例80, 81, 82および83で得られた化合物をアンチセンス鎖の5’末端に有するsiRNAの活性を測定して評価した。アンチセンス鎖の5’末端にI-78, I-79, I-80またはI-81を有するsiRNAと、その配列中のI-78, I-79, I-80またはI-81に相当する位置に天然型のアデノシン一リン酸を有する454-Aとのノックダウン活性を図20に示した。
試験例19の結果から、アンチセンス鎖の5’末端にI-78, I-79, I-80またはI-81を有するsiRNAは、アンチセンス5’末端に対応する天然型のヌクレオチドを有するsiRNAと比較して、高いノックダウン活性を示すことが分かる。
試験例 20：ルシフェラーゼ標的siRNAのノックダウン活性
試験例13と同様にして、実施例77, 78および79で得られた化合物をアンチセンス鎖の5’末端に有するsiRNAの活性を測定して評価した。アンチセンス鎖の5’末端にI-75, I-76またはI-77を有するsiRNAと、その配列中のI-75, I-76またはI-77に相当する位置に天然型のアデノシン一リン酸を有する454-Aとのノックダウン活性を図21に示した。
試験例20の結果から、アンチセンス鎖の5’末端にI-75, I-76またはI-77を有するsiRNAは、アンチセンス5’末端に対応する天然型のヌクレオチドを有するsiRNAと比較して、高いノックダウン活性を示すことが分かる。
試験例 21：ルシフェラーゼ標的siRNAのノックダウン活性
試験例13と同様にして、実施例84および85で得られた化合物をアンチセンス鎖の5’末端に有するsiRNAの活性を測定して評価した。アンチセンス鎖の5’末端にI-82またはI-83を有するsiRNAと、その配列中のI-82またはI-83に相当する位置に天然型のアデノシン一リン酸を有する454-Aとのノックダウン活性を図22に示した。
試験例21の結果から、アンチセンス鎖の5’末端にI-82またはI-83を有するsiRNAは、アンチセンス5’末端に対応する天然型のヌクレオチドを有するsiRNAと比較して、高いノックダウン活性を示すことが分かる。
試験例 22：ルシフェラーゼ標的siRNAのノックダウン活性
試験例13と同様にして、実施例86および87で得られた化合物をアンチセンス鎖の5’末端に有するsiRNAの活性を測定して評価した。アンチセンス鎖の5’末端にI-84またはI-85を有するsiRNAと、その配列中のI-84またはI-85に相当する位置に天然型のアデノシン一リン酸を有する454-Aとのノックダウン活性を図23に示した。
試験例22の結果から、アンチセンス鎖の5’末端にI-84またはI-85を有するsiRNAは、アンチセンス5’末端に対応する天然型のヌクレオチドを有するsiRNAと比較して、高いノックダウン活性を示すことが分かる。
試験例 23：ルシフェラーゼ標的siRNAのノックダウン活性
試験例13と同様にして、実施例88, 89, 90および91で得られた化合物をアンチセンス鎖の5’末端に有するsiRNAの活性を測定して評価した。アンチセンス鎖の5’末端にI-86, I-87, I-88またはI-89を有するsiRNAと、その配列中のI-86, I-87, I-88またはI-89に相当する位置に天然型のアデノシン一リン酸を有する454-Aとのノックダウン活性を図24に示した。
試験例23の結果から、アンチセンス鎖の5’末端にI-86, I-87, I-88またはI-89を有するsiRNAは、アンチセンス5’末端に対応する天然型のヌクレオチドを有するsiRNAと比較して、高いノックダウン活性を示すことが分かる。
試験例 24：ルシフェラーゼ標的siRNAのノックダウン活性
試験例13と同様にして、実施例29, 31, 92,93,94および95で得られた化合物をアンチセンス鎖の5’末端に有するsiRNAの活性を測定して評価した。アンチセンス鎖の5’末端にI-27, I-29, I-90, I-91, I-92またはI-93を有するsiRNAと、その配列中のI-27, I-29, I-90, I-91, I-92またはI-93に相当する位置に天然型のアデノシン一リン酸を有する454-Aとのノックダウン活性を図25に示した。
試験例24の結果から、アンチセンス鎖の5’末端にI-27, I-29, I-90, I-91, I-92またはI-93を有するsiRNAは、アンチセンス5’末端に対応する天然型のヌクレオチドを有するsiRNAと比較して、高いノックダウン活性を示すことが分かる。
試験例 25：ルシフェラーゼ標的siRNAのノックダウン活性
試験例13と同様にして、実施例96および97で得られた化合物をアンチセンス鎖の5’末端に有するsiRNAの活性を測定して評価した。アンチセンス鎖の5’末端にI-94またはI-95を有するsiRNAと、その配列中のI-94またはI-95に相当する位置に天然型のアデノシン一リン酸を有し、3’末にDNA体のチミンを有する454-A-dTのノックダウン活性を図26に示した。
試験例25の結果から、アンチセンス鎖の5’末端にI-94またはI-95を有するsiRNAは、アンチセンス5’末端に対応する天然型のヌクレオチドを有するsiRNAと比較して、高いノックダウン活性を示すことが分かる。
試験例 26：ルシフェラーゼ標的siRNAのノックダウン活性
試験例13と同様にして、実施例98で得られた化合物をアンチセンス鎖の5’末端に有するsiRNAの活性を測定して評価した。アンチセンス鎖の5’末端にI-96を有するsiRNAと、その配列中のI-96に相当する位置に天然型のアデノシン一リン酸を有する454-Aとのノックダウン活性を図27に示した。
試験例26の結果から、アンチセンス鎖の5’末端にI-96を有するsiRNAは、アンチセンス5’末端に対応する天然型のヌクレオチドを有するsiRNAと比較して、高いノックダウン活性を示すことが分かる。
試験例 27：ルシフェラーゼ標的siRNAのノックダウン活性
試験例13と同様にして、実施例99, 100,101,102および103で得られた化合物をアンチセンス鎖の5’末端に有するsiRNAの活性を測定して評価した。アンチセンス鎖の5’末端にI-97, I-98, I-99, I-100またはI-101を有するsiRNAと、その配列中のI-97, I-98, I-99, I-100またはI-101に相当する位置に天然型のアデノシン一リン酸を有する454-Aとのノックダウン活性を図28に示した。
試験例27の結果から、アンチセンス鎖の5’末端にI-97, I-98, I-99, I-100またはI-101を有するsiRNAは、アンチセンス5’末端に対応する天然型のヌクレオチドを有するsiRNAと比較して、高いノックダウン活性を示すことが分かる。
本発明により、AGO2との親和性が向上したオリゴヌクレオチド等が提供される。

Claims (72)

  1. オリゴヌクレオチドの5’末端に、式(I)


    ｛式中、X1は酸素原子、硫黄原子、セレン原子またはNR4(式中、R4は水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルスルホニル、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアロイルまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環カルボニルである)であり、
    R1は式(II)


    ｛式中、Y1は窒素原子またはCR8[式中、R8は水素原子、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、-NR9aR9b(式中、R9a及びR9bは同一または異なって、それぞれ水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキルまたは置換基を有していてもよいアラルキルである)、または-CONR9cR9d(式中、R9c及びR9dは同一または異なって、それぞれ水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)である]であり、
    R5は水素原子、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよいシクロアルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、置換基を有していてもよい脂肪族複素環基、-NR10aR10b(式中、R10a及びR10bはそれぞれ前記R9a及びR9bと同義である)、-CONR10cR10d(式中、R10c及びR10dはそれぞれ前記R9c及びR9dと同義である)、-N=C-R10e(式中、R10eは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)、-C=N-R10f(式中、R10fは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)または-N=N-R10g(式中、R10gは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)であり、
    R6は水素原子、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよいアリールオキシ、置換基を有していてもよいアラルキルオキシ、置換基を有していてもよいアリールチオ、置換基を有していてもよいアロイル、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環オキシ、置換基を有していてもよい芳香族複素環チオ、置換基を有していてもよい芳香族複素環カルボニル、-NR11aR11b(式中、R11a及びR11bは、同一または異なって、それぞれ水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルスルホニル、置換基を有していてもよいアロイル、置換基を有していてもよいアリールスルホニル、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、置換基を有していてもよい芳香族複素環カルボニルまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環スルホニルである)、-CONR11cR11d(式中、R11c及びR11dは同一または異なって、それぞれ水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基である)、-NHCONR11eR11f(式中、R11e及びR11fは同一または異なって、それぞれ水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基である)、-NHCO2R11g(式中、R11gは置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基である)、-N=C-R11h(式中、R11hは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)、-C=N-R11i(式中、R11iは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)または-N=N-R11j(式中、R11jは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)であり、
    R7は水素原子、核酸分野における水素原子の等価体、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよいアリールオキシ、置換基を有していてもよいアリールチオ、置換基を有していてもよいアロイル、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環オキシ、置換基を有していてもよい芳香族複素環チオ、置換基を有していてもよい芳香族複素環カルボニル、-NR11aR11b(式中、R11a及びR11bは、同一または異なって、それぞれ水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルスルホニル、置換基を有していてもよいアロイル、置換基を有していてもよいアリールスルホニル、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、置換基を有していてもよい芳香族複素環カルボニルまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環スルホニルである)、-CONR11cR11d(式中、R11c及びR11dは同一または異なって、それぞれ水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基である)、-NHCONR11eR11f(式中、R11e及びR11fは同一または異なって、それぞれ水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基である)または-NHCO2R11g(式中、R11gは置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基である)であるが、Y1が窒素原子であり、R5が水素原子であり、R6が-NR11aR11bであり、R7が水素原子である場合、R11a及びR11bは同時に水素原子になることはない｝、式(III)


    (式中、Y2、R6a及びR7aはそれぞれ前記Y1、R6及びR7と同義である)、式(IV)


    [式中、R12は水素原子、核酸分野における水素原子の等価体、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよい低級アルカノイルまたは置換基を有していてもよい低級アルキルスルホニルであり、
    ---は単結合または二重結合であり、
    ---が単結合である場合、
    Y3はNR13a(式中、R13aは水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよい低級アルカノイルまたは置換基を有していてもよい低級アルキルスルホニルである)またはCR14aR14b(式中、R14a及びR14bは同一または異なって、それぞれ水素原子、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよい低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよいジ低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよい低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいジ低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、または置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキルである)であり、
    Y4はNR13b(式中、R13bは前記R13aと同義である)またはCR14cR14d(式中、R14c及びR14dはそれぞれ前記R14a及びR14bと同義である)であり、
    ---が二重結合である場合、
    Y3は窒素原子またはCR14e(式中、R14eは水素原子、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよい低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよいジ低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよい低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいジ低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、または置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキルである)であり、
    Y4は窒素原子またはCR14f(式中、R14fは水素原子、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよい低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよいジ低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよい低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいジ低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、または置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキルである)であるが、R12が水素原子であり、Y3がCR14eであり、Y4がCR14fである場合、R14e及びR14fは同時に水素原子になること並びにR14eがメチルであってR14fが水素原子になることはない]、または式(V)


    (式中、R12aは前記R12と同義であり、環Aは芳香族環であり、n1は0〜4の整数であり、R16は、ハロゲン、ヒドロキシ、スルファニル、ニトロ、シアノ、カルボキシ、カルバモイル、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよい低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよいジ低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよい低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいジ低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキルまたは置換基を有していてもよい低級アルキルスルホニルであり、n1が2〜4の整数の場合、それぞれのR16は同一でも異なっていてもよいが、環Aがベンゼン環であり、n1が2である場合、R16は低級アルコキシではない)であり、
    R2は水素原子、ヒドロキシ、ハロゲンまたは置換基を有していてもよい低級アルコキシであり、
    R3は水素原子または


    (式中、n2は1、2または3である)である｝で表されるヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基を有し、該ヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基は3位の酸素原子を介して隣接するヌクレオチド残基と結合する、オリゴヌクレオチド。
  2. X1が酸素原子である、請求項1記載のオリゴヌクレオチド。
  3. R1が式(II)である、請求項1または2記載のオリゴヌクレオチド。
  4. Y1が窒素原子である、請求項3記載のオリゴヌクレオチド。
  5. R5が水素原子、ハロゲン、シアノ、置換基を有していてもよい低級アルキル置換基を有していてもよいシクロアルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、置換基を有していてもよい脂肪族複素環基、-NR10aR10b(式中、R10a及びR10bはそれぞれ前記と同義である)、-CONR10cR10d(式中、R10c及びR10dはそれぞれ前記と同義である)、-N=C-R10e(式中、R10eは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)、-C=N-R10f(式中、R10fは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)または-N=N-R10g(式中、R10gは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)である、請求項3または4記載のオリゴヌクレオチド。
  6. R5が水素原子、ハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、シアノまたは-NR10aR10b(式中、R10a及びR10bはそれぞれ前記と同義である)である、請求項3または4記載のオリゴヌクレオチド。
  7. R5が置換基を有していてもよい低級アルケニルまたはシアノである、請求項3または4記載のオリゴヌクレオチド。
  8. R6が置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、-NR11aR11b(式中、R11a及びR11bはそれぞれ前記と同義である)、-N=C-R11h(式中、R11hは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)、-C=N-R11i(式中、R11iは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)または-N=N-R11j(式中、R11jは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)である、請求項3〜7のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
  9. R6が置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよいアリールまたは-NR11aR11b(式中、R11a及びR11bはそれぞれ前記と同義である)である、請求項3〜7のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
  10. R6が-NR11aR11b(式中、R11a及びR11bは、同一または異なって、それぞれ水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)である、請求項3〜7のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
  11. R6が置換基を有していてもよいアリールであり、置換基がアリールのメタ位またはパラ位に存在する請求項3〜7のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
  12. R7が水素原子である、請求項3〜11のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
  13. R1が式(III)である、請求項1または2記載のオリゴヌクレオチド。
  14. Y2が窒素原子である、請求項13記載のオリゴヌクレオチド。
  15. R6aがアミノ、メチルアミノまたはジメチルアミノである、請求項13または14記載のオリゴヌクレオチド。
  16. R7が水素原子である、請求項13〜15のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
  17. R1が式(IV)である、請求項1または2記載のオリゴヌクレオチド。
  18. R12が水素原子または核酸分野における水素原子の等価体である、請求項17記載のオリゴヌクレオチド。
  19. ---が二重結合であり、Y3がCR14e(式中、R14eは前記と同義である)であり、Y4が窒素原子またはCR14f(式中、R14fは前記と同義であるが、シアノである場合を除く)である、請求項18記載のオリゴヌクレオチド。
  20. R14eが水素原子である、請求項19記載のオリゴヌクレオチド。
  21. R14eがハロゲン、シアノ、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基であり、R14fが水素原子である、請求項19記載のオリゴヌクレオチド。
  22. R14eが水素原子であり、R14fがハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基である、請求項19記載のオリゴヌクレオチド。
  23. R1が式(V)である、請求項1または2記載のオリゴヌクレオチド。
  24. 環Aが式(A1)


    (式中、R16及びn1はそれぞれ前記と同義であるが、式(A1’)


    で表される場合を除く)、式(A2)


    (式中、R16は前記と同義であり、n1は0〜2の整数であり、X2はNH、酸素原子または硫黄原子である)、または式(A3)


    (式中、R16及びX2は前記と同義であり、n1は0〜2の整数である)である、請求項23記載のオリゴヌクレオチド。
  25. R16が、ハロゲン、ニトロ、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルキルアミノまたは置換基を有していてもよいジ低級アルキルアミノである、請求項23または24記載のオリゴヌクレオチド。
  26. R12aが水素原子または核酸分野における水素原子の等価体である、請求項25記載のオリゴヌクレオチド。
  27. n1が1または2である、請求項23〜26のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
  28. R3が


    (式中、n2は前記と同義である)である、請求項1〜27のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
  29. n2が1である、請求項28記載のオリゴヌクレオチド。
  30. R2が水素原子、ヒドロキシ、フッ素原子またはメトキシである、請求項1〜29のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
  31. R2がヒドロキシである、請求項1〜29のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
  32. R2が水素原子またはフッ素原子である、請求項1〜29のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
  33. X1が酸素原子であり、R2が水素原子、ヒドロキシ、フッ素原子またはメトキシである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  34. R1が式(IIA)


    (式中、R5A及びR6Aはそれぞれ前記R5及びR6と同義である)
    である、請求項33記載のオリゴヌクレオチド。
  35. R5Aがハロゲン、カルバモイル、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよいシクロアルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよいジ低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよい低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいジ低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、置換基を有していてもよい脂肪族複素環基または-NR10aR10b(式中、R10a及びR10bはそれぞれ前記と同義である)である、請求項34記載のオリゴヌクレオチド。
  36. R5Aがハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、シアノまたは-NR10aR10b(式中、R10a及びR10bはそれぞれ前記と同義である)である、請求項34記載のオリゴヌクレオチド。
  37. R6Aが置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよい芳香族複素環基またはNR11aR11b(式中、R11a及びR11bはそれぞれ前記と同義である)である、請求項34〜36のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
  38. R6AがNR11aR11b(式中、R11a及びR11bはそれぞれ前記と同義である)である、請求項34〜36のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
  39. R6Aがアミノ、置換基を有していてもよい低級アルケニルまたは置換基を有していてもよいアリールである、請求項34〜36のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
  40. R1が式(IVA)


    (式中、Y3A及びY4Aはそれぞれ前記Y3及びY4と同義であるが、Y3A及びY4AがCR14e及びCR14fであり、R14eが水素原子である場合、R14fはシアノではない)である、請求項33記載のオリゴヌクレオチド。
  41. Y3AがCR14e(式中、R14eは前記と同義である)であり、Y4AがCR14f(式中、R14fは前記と同義である)である、請求項40記載のオリゴヌクレオチド。
  42. R14eが水素原子である、請求項41記載のオリゴヌクレオチド。
  43. R14eがハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基であり、R14fが水素原子である、請求項41記載のオリゴヌクレオチド。
  44. R14eが水素原子であり、R14fがハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基である、請求項41記載のオリゴヌクレオチド。
  45. R1が式(VA)


    (式中、環AA、n1A及びR16Aはそれぞれ前記環A、n1、及びR16と同義であり、n1Aが2〜4の整数の場合、それぞれのR16Aは同一でも異なっていてもよいが、環AAがベンゼン環であり、n1Aが2である場合、R16Aは低級アルコキシではなく、環AAがベンゼン環であり、n1Aが1であり、R16Aが塩素原子である場合、式(A1’)


    で表される場合を除く)である、請求項33記載のオリゴヌクレオチド。
  46. 環AAがベンゼン環またはチオフェン環である、請求項45記載のオリゴヌクレオチド。
  47. R16Aが、ハロゲン、ニトロ低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルキルアミノまたは置換基を有していてもよいジ低級アルキルアミノである、請求項45または46記載のオリゴヌクレオチド。
  48. n1Aが1または2である、請求項45〜47のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
  49. R3が


    (式中、n2Aは前記と同義である)である、請求33〜48のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
  50. n2Aが1である、請求項49記載のオリゴヌクレオチド。
  51. R2が水素原子またはフッ素原子である、請求項33〜50のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
  52. R2がヒドロキシである、請求項33〜50のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
  53. 10〜80の塩基長を有する請求項1〜52のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
  54. 20〜50の塩基長を有する請求項1〜52のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
  55. 20〜30の塩基長を有する請求項1〜52のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
  56. 21〜25の塩基長を有する請求項1〜52のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
  57. 2本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項1〜56のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
  58. 1本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項1〜56のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
  59. オリゴヌクレオチドが短鎖干渉性RNA(siRNA)である、請求項1〜56のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
  60. 疾患に関与する蛋白質をコードするメッセンジャーRNA(mRNA)に対するノックダウン活性を有するオリゴヌクレオチドにおいて、
    該オリゴヌクレオチドの5’末端における塩基残基を、
    式(II)


    (式中、Y1、R5、R6及びR7はそれぞれ前記と同義である)、式(III)


    (式中、Y2、R6a及びR7aはそれぞれ前記と同義である)、式(IV)


    (式中、R12、---、Y3及びY4はそれぞれ前記と同義である)、または式(V)


    (式中、R12a、環A、n1及びR16は、それぞれ前記と同義である)で表される塩基残基に置換することを特徴とする、該ノックダウン活性を向上させる方法。
  61. 疾患に関与する蛋白質をコードするメッセンジャーRNA(mRNA)に対するノックダウン活性を有し、5’末端における塩基がグアニンまたはシトシンであるオリゴヌクレオチドにおいて、
    該オリゴヌクレオチドの5’末端におけるグアニン残基またはシトシン残基を、アデニン残基(6-アミノプリン-9-イル)、チミン残基(5-メチル-1,2,3,4テトラヒドロピリミジン-2,4ジオン-1-イル)、ウリジン残基(ピリミジン-2,4(1H,3H)ジオン-1-イル)、
    式(II)


    (式中、Y1、R5、R6及びR7はそれぞれ前記と同義である)、式(III)


    (式中、Y2、R6a及びR7aはそれぞれ前記と同義である)、式(IV)


    (式中、R12、---、Y3及びY4はそれぞれ前記と同義である)、または式(V)


    (式中、R12a、環A、n1及びR16は、それぞれ前記と同義である)で表される塩基残基に置換することを特徴とする該ノックダウン活性を向上させる方法。
  62. オリゴヌクレオチドが短鎖干渉性RNA(siRNA)である、請求項60または61記載の方法。
  63. 請求項60〜62のいずれかに記載の方法によって、オリゴヌクレオチドの標的メッセンジャーRNA(mRNA)に対するノックダウン活性を向上させたオリゴヌクレオチドを含有する核酸医薬。
  64. 疾患に関与する蛋白質をコードするメッセンジャーRNA(mRNA)に対するノックダウン活性を有するオリゴヌクレオチドの5’末端のヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基を置換することに使用される、該オリゴヌクレオチドの標的mRNAに対するノックダウン活性の向上のための、式(Ia)


    (式中、X1、R1、R2及びR3はそれぞれ前記と同義である)で表されるヌクレオチドもしくはヌクレオシド、そのヒドロキシ、カルボキシルおよび/もしくはアミノを保護基で保護したもの、またはそのアミダイト、あるいはその塩。
  65. オリゴヌクレオチドが短鎖干渉性RNA(siRNA)である、請求項64記載のヌクレオチドもしくはヌクレオシド、そのヒドロキシ、カルボキシルおよび/もしくはアミノを保護基で保護した化合物、またはそのアミダイト、あるいはその塩。
  66. 疾患に関与する蛋白質をコードするメッセンジャーRNA(mRNA)に対するノックダウン活性を有するオリゴヌクレオチドの5’末端のヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基を置換することに使用される、該オリゴヌクレオチドの標的mRNAに対するノックダウン活性の向上のための、
    式(II)


    (式中、Y1、R5、R6及びR7はそれぞれ前記と同義である)、式(III)


    (式中、Y2、R6a及びR7aはそれぞれ前記と同義である)、式(IV)


    (式中、R12、---、Y3及びY4はそれぞれ前記と同義である)、または式(V)


    (式中、R12a、環A、n1及びR16は、それぞれ前記と同義である)で表される塩基残基を含有するヌクレオチドもしくはヌクレオシド、そのヒドロキシ、カルボキシルおよび/もしくはアミノを保護基で保護した化合物、またはそのアミダイト、あるいはその塩。
  67. オリゴヌクレオチドが短鎖干渉性RNA(siRNA)である、請求項66記載のヌクレオチドもしくはヌクレオシド、そのヒドロキシ、カルボキシルおよび/もしくはアミノを保護基で保護した化合物、またはそのアミダイト、あるいはその塩。
  68. 標的蛋白質の発現抑制剤の製造のための、式(I)


    (式中、X1、R1、R2及びR3はそれぞれ前記と同義である)で表されるヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基を5’末端に有する、疾患に関与する蛋白質をコードするメッセンジャーRNA(mRNA)に対するノックダウン活性を有するオリゴヌクレオチドの使用。
  69. 標的蛋白質の発現抑制剤の製造のための、
    式(II)


    (式中、Y1、R5、R6及びR7はそれぞれ前記と同義である)、式(III)


    (式中、Y2、R6a及びR7aはそれぞれ前記と同義である)、式(IV)


    (式中、R12、---、Y3及びY4はそれぞれ前記と同義である)、または式(V)


    (式中、R12a、環A、n1及びR16は、それぞれ前記と同義である)で表される塩基残基を、5’末端における塩基残基として導入した、疾患に関与する蛋白質をコードするメッセンジャーRNA(mRNA)に対するノックダウン活性を有するオリゴヌクレオチドの使用。
  70. オリゴヌクレオチドが短鎖干渉性RNA(siRNA)である、請求項68または69記載の使用。
  71. R2が水素原子であり、R6が置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよいアリールオキシ、置換基を有していてもよいアラルキルオキシ、置換基を有していてもよい芳香族複素環オキシ、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよいアリールチオ、置換基を有していてもよい芳香族複素環チオ、-NR30R31(R30およびR31は、同一または異なって、それぞれ水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよい芳香族複素環、置換基を有していてもよいアラルキル、または置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキルである、ただし、R30およびR31が同時に水素原子となる場合を除く)、置換基を有していてもよいアリール、または置換基を有していてもよい芳香族複素環である請求項1〜7のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
  72. R6が置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよいアラルキルオキシ、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよいアリールチオ、-NR30AR31A(R30AおよびR31Aは、同一または異なって、それぞれ置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよいアリール、または置換基を有していてもよいアラルキルである、ただし、R30AおよびR31Aが同時に水素原子となる場合を除く)である請求項1〜7のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
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