TW201538728A - 具優異細胞保護及免疫調節之ｑｕａｄｒｉ－正之基質細胞 - Google Patents

具優異細胞保護及免疫調節之ｑｕａｄｒｉ－正之基質細胞 Download PDF

Info

Publication number
TW201538728A
TW201538728A TW104104181A TW104104181A TW201538728A TW 201538728 A TW201538728 A TW 201538728A TW 104104181 A TW104104181 A TW 104104181A TW 104104181 A TW104104181 A TW 104104181A TW 201538728 A TW201538728 A TW 201538728A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
qpsc
cells
population
cell
isolated
Prior art date
Application number
TW104104181A
Other languages
English (en)
Other versions
TWI642781B (zh
Inventor
Oscar Kuang-Sheng Lee
Jennifer Hui-Chun Ho
Wei-Kee Ong
Yu-Hsuan Chu
Original Assignee
Steminent Biotherapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Steminent Biotherapeutics Inc filed Critical Steminent Biotherapeutics Inc
Publication of TW201538728A publication Critical patent/TW201538728A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI642781B publication Critical patent/TWI642781B/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/35—Fat tissue; Adipocytes; Stromal cells; Connective tissues
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • A61K38/13—Cyclosporins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本發明出乎意料地發現經分離及修飾之QPSC群體具有多潛能性，包括：骨胚細胞(骨細胞)、軟骨細胞(chondrocytes/cartilage cells)及脂肪細胞(adipocytes/fat cells)。本發明之QPSC群體之特徵在於合乎需要之免疫調節能力，包括誘導、增強或抑制免疫反應，且因此在預防及/或治療各種免疫疾病/病症/病況中具有潛在價值。本發明在補體依賴性細胞毒性方面具有有效歸巢能力及調節能力，包括阻斷宿主補體活化及直接遷移至標靶區域之能力及增強細胞活力之能力，且因此在預防及/或治療各種急性組織損傷、缺血或退化疾病/病症/病況中，於活體內提供較佳之細胞保護及治療功效。

Description

具優異細胞保護及免疫調節之QUADRI-正之基質細胞 相關申請案之交叉參考
本申請案主張2014年2月6日申請之美國臨時專利第61/936,407號之優先權，其以全文引用之方式併入本文中。
本發明係關於經分離及修飾之人類多潛能基質細胞之群體(下文稱為Quadri-正之基質細胞(QPSC)群體)，製備及/或應用其之方法及包含其之組合物。特定言之，本發明提供在QPSC群體上與CD55、CD46及/或CXCR4標記共表現之CD273。
已知幹細胞移植擁有再生損壞或受損組織及器官之潛能。因此，已進行深入研究以鑑別且分離來自人類及動物來源之新穎多潛能幹細胞，以及研究幹細胞在臨床應用，尤其再生醫學中之效用。多潛能基質細胞或MSC擁有至少三譜系分化能力，亦即成骨(骨胚細胞)、軟骨形成(軟骨細胞)及脂肪生成(脂肪細胞)分化。存在MSC在治療肌肉骨胳損傷、改良心血管疾病中之心臟功能及改善GVHD之嚴重程度方面之治療功效的記載證據。在充分誘導下，其具有不僅分化成間葉細胞，而且分化成外胚層及內胚層細胞類型而不形成畸胎瘤之潛能。MSC缺乏免疫原性但具有免疫調節能力，因此移植MSC之宿主免疫排斥反應常規地經由自體或同種異體移植避免。MSC可自數種成人組 織，包括骨髓(BM)、脂肪組織(AD)及臍血分離，且可離體擴增。舉例而言，間葉幹細胞/祖細胞已成功地自臍帶組織，即自華通氏膠(Wharton's jelly)，臍帶之基質分離(美國專利第5,919,702號及美國專利申請案2004/0136967)。已顯示此等細胞具有例如分別分化成神經元表型及軟骨組織之能力。此外，間葉幹細胞/祖細胞亦已自臍帶內發現之三個血管(兩個動脈，一個靜脈)之一，臍帶靜脈之內皮及內皮下層分離。國際細胞治療協會(ISCT)已提出一組定義MSC之標準。若細胞在普通培養條件下顯示塑膠黏附特性且具有類似纖維母細胞之形態，則其可分類為MSC。此外，MSC可經歷離體成骨、脂肪生成及軟骨形成分化。經培養之MSC亦於其表面上表現CD73、CD90及CD105，同時缺乏CD11b、CD14、CD19、CD34、CD45、CD79a及HLA-DR表面標記之表現(Dominici,M等人，「Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells.The International Society for Cellular Therapy position statement.」2006,Cytotherapy第8卷,第4期,第315-317頁)。
US 20100184033 A1係關於分化多潛能原始幹細胞(諸如人類胚胎幹(「hES」)細胞、人類胚胎生殖(「hEG」)細胞、人類胚胎來源(「hED」)細胞及人類胚胎癌(「hEC」)細胞)，自細胞之非均質混合物獲得細胞亞群之方法，其中一些幹細胞表現CD273抗原。然而，該等幹細胞不為MSC。
US 20120171171 A1提供胚胎軟骨細胞祖細胞或細胞株，其能夠產生軟骨而不表現COL10A1或IHH基因且對於表現以下基因中之任一種、兩種、三種、四種或所有呈陰性：CD74、CD90、CD166、ITGA2及KCNK2。儘管該申請案提及其細胞包括40.48% CD273-正之細胞，但其不為MSC。
然而，需要發現具有優異細胞保護及免疫調節能力(尤其活體內) 之新穎多潛能幹細胞以增加在組織修復及再生方面之治療功效。
本發明提供經分離及修飾之QPSC群體，其具有至少70%細胞均質性且表現至少CD273之細胞標記。在一個實施例中，除CD273以外，QPSC群體進一步表現CD55、CD46及CXCR4中之一或多者。特定言之，本發明之QPSC群體可強烈表現CD273、CD73、CD105及CD90及CD55、CD46及CXCR4而不表現CD11b、CD19、CD34、Cd45及HLA-DR中之一或多者。
本發明之QPSC群體在培養至至少第4、第5、第6、第7、第8或第9代之後具有至少70%細胞均質性及似乎表現至少CD273之細胞標記且在至少第4、第5、第6、第7、第8或第9代之後維持細胞標記表現，較佳自第4代至第15代或自第5代至第15代，自第6代至第15代或自第6代至第14代，自第6代至第13代，自第6代至第12代，自第8代至第15代，或自第8代至第12代表現及維持細胞標記。本發明之QPSC群體較佳在第6代至第12、第13、第14、第15、第16、第17或第18代之後維持至少CD273之表現。
在一些實施例中，本發明之QPSC群體在培養至至少第4、第5、第6、第7、第8或第9代之後似乎表現CD273及視情況存在之CD46、CD55及CXCR4中之一或多者，且在至少第4、第5、第6、第7、第8或第9代之後維持CD273表現及CD46、CD55及CXCR4中之一或多者；較佳自第4代至第15代或自第5代至第15代，自第6代至第15代或自第6代至第14代，自第6代至第13代，自第6代至第12代，自第8代至第15代或自第8代至第12代表現及維持細胞標記。本發明之QPSC群體更佳在培養至至少第5、第6、第7、第8或第9代之後似乎表現CD273、CD46、CD55及CXCR4且在至少第5、第6、第7、第8或第9代之後，較佳自第4代至至少第15代，自第4代至第15代或自第5代至第15代， 自第6代至第15代或自第6代至第14代，自第6代至第13代，自第6代至第12代，自第8代至第15代或自第8代至第12代維持CD273、CD46、CD55及CXCR4之表現。本發明之QPSC群體較佳在第6代至第12、第13、第14、第15、第16、第17或第18代之後維持CD273及CD46、CD55及CXCR4中之一或多者之表現。
在另一態樣中，本發明提供一種包含本發明之QPSC群體之組合物。
在一個態樣中，本發明提供一種產生具有至少70%細胞均質性之本發明之經分離及修飾之QPSC群體之方法，其包含自個體分離人類多潛能基質細胞；在幹細胞培養基中培養所得細胞；在細胞達至70-80%匯合之後分離細胞；以在3,000個細胞/平方公分至10,000個細胞/平方公分，較佳5,000個細胞/平方公分至10,000個細胞/平方公分，6,000個細胞/平方公分至10,000個細胞/平方公分或7,000個細胞/平方公分至10,000個細胞/平方公分範圍內之密度接種細胞；在含有至少一種生長因子(較佳EGF(較佳0.1-1.0ng/ml)、FGF-2(較佳1-10ng/ml))之培養基補充物(較佳ITS(胰島素、轉鐵蛋白、亞硒酸、BSA及亞麻油酸之混合物；較佳0.1-1%)中培養細胞；且在培養至至少第6代之後，至少70%細胞似乎表現CD273及視情況存在之CD46、CD55及CXCR4中之一或多者且自至少第6代至至少第12代維持CD273及視情況存在之CD46、CD55及CXCR4中之一或多者之表現，藉此可獲得經分離及修飾之QPSC群體。培養基較佳進一步包含培養基補充物(較佳ITS(胰島素、轉鐵蛋白、亞硒酸、BSA及亞麻油酸之混合物)。培養基補充物較佳呈0.1-1%之量。
在另一態樣中，本發明提供一種調節T細胞且增強細胞活力之方法，其包含向個體投與有效量之本發明之經分離及修飾之QPSC群體。在另一態樣中，本發明提供一種預防及/或治療免疫/缺血疾病、 病症或病況之方法，其包含向個體投與有效量之本發明之經分離及修飾之QPSC群體。
圖1(A)顯示QPSC群體之細胞之形態；且圖1(B)顯示呈80%匯合之QPSC群體之細胞之形態。
圖2(A)顯示QPSC P10群體(首先QP標記)之細胞之表面表型；且圖2(B)顯示QPSC P12群體之細胞之表面表型。
圖3(A)顯示在成骨(鹼性磷酸鹽)中QPSC群體之細胞之三譜系分化；圖3(B)顯示在成骨(鈣)中QPSC群體之細胞之三譜系分化；圖3(C)顯示在軟骨形成中QPSC群體之細胞之三譜系分化；且圖3(D)顯示在脂肪生成中QPSC群體之細胞之三譜系分化。
圖4顯示QPSC之CD3+ T細胞增殖能力。為了檢驗QPSC對T淋巴細胞增殖之免疫調節效應，以各種比率將QPSC與藉由板結合抗CD3抗體加抗CD28抗體刺激之新鮮分離之T淋巴細胞共同培養。隨後使用BrdU併入法量測T細胞增殖。BrdU(5-溴-2'-脫氧尿苷)為可併入增殖細胞中之新合成DNA中且藉由免疫分析偵測之合成胸苷類似物。結果顯示T細胞增殖由QPSC顯著抑制，但不以細胞數目依賴性方式。
圖5(A)顯示用於T細胞調節之QPSC上之CD273(QPSC群體之細胞，第10代)；圖5(B)(QPSC群體之細胞，第12代)顯示抑制CD273-QPSC群體之T細胞增殖之能力顯著降低。此外，CD273-QPSC藉由負選擇使用抗人類CD273抗體結合磁性粒子純化。圖5(C)顯示CD273-QPSC群體未能抑制T細胞增殖。此等結果表明CD273表現對於QPSC群體之細胞之免疫調節功能為重要的。
圖6(A)顯示在4週低溫保存且隨後解凍之後QPSC群體p10之細胞之細胞標記概況；且圖6(B)顯示在4週低溫保存且隨後解凍之後QPSC群體p12之細胞之細胞標記概況。
圖7(A)顯示用於歸巢之QPSC群體之細胞上之CXCR4，其中CXCR4高 MSC(QPSC，n=2)及CXCR4低 MSC(n=3)朝向SDF-1遷移；且圖7(B)顯示歸巢之條形圖。
圖8(A)顯示用於抵抗補體依賴性細胞毒性之能力之QPSC群體上之CD46及CD55且圖8(B)顯示MTS分析之細胞活力。
本發明出乎意料地發現經分離及修飾之QPSC群體具有多潛能，包括：骨胚細胞(骨細胞)、軟骨細胞(chondrocytes/cartilage cells)及脂肪細胞(adipocytes/fat cells)。本發明之QPSC群體具有調節T細胞及/或補體系統之免疫調節能力且具有增強細胞活力之能力，表明其誘導、增強或抑制免疫反應以及增強歸巢效率，且因此在預防及/或治療各種免疫及缺血疾病、病症或病況方面具有潛在價值。
定義
如本文所用，「幹細胞」為當暴露於特定環境條件時擁有自我更新能力及多分化能力之細胞。自我更新意謂在細胞分裂期間，兩個子細胞中之至少一者將為幹細胞。
如本文所用，「多潛能」意謂具有分化成至少三種細胞類型之潛能之細胞。
如本文所用，「分化」意謂形成表現功能標記之細胞，該等功能標記已知與較特定且較接近於變成不能進一步分裂或分化之終末分化細胞的細胞相關聯。
如本文所用，「自體移植」意謂移植物質來源於且移植至同一個體。
如本文所用，「增殖」或「擴增」意謂細胞數目增加。
如本文所用，「細胞表面標記」意謂可經由特異性抗體偵測之在細胞表面上表現之蛋白質。
如本文所用，「對於表現呈陽性」意謂無論細胞內或細胞外，相關標記可使用任何方法，包括(但不限於)流動式細胞測量術在細胞中或於細胞上偵測。本文中術語「對於表現呈陽性」、「陽性表現」、「表現」及以上標形式使用之「+」可互換使用。
如本文所用，「對於表現呈陰性」意謂無論細胞內或細胞外，相關標記不可使用任何方法，包括(但不限於)流動式細胞測量術在細胞中或於細胞上偵測。本文中術語「對於表現呈陰性」、「陰性表現」、「不表現」及以上標形式使用之「-」可互換使用。
如本文所用，參考單個細胞或細胞群體使用之「經分離」意謂細胞或細胞群體實質上不含與其一起天然出現在其來源中之其他細胞類型或細胞物質。
如本文所用，「經修飾」意謂天然分離細胞經修飾以具有顯著不同特徵，諸如不同結構、不同生物或藥理學功能及/或其他特性。
如本文所用，術語「細胞群體」意謂實質上均質之細胞群體。至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之細胞群體在細胞標記表現中為均質的。
如本文所用，術語「強烈表現」或「強烈之表現」係指超過70%之細胞標記之表現強度；術語「中度表現」或「中度之表現」係指超過40%之細胞標記之表現強度。
如本文所用，「免疫調節」及「免疫調節的」意謂引起免疫反應之可偵測變化或具有引起免疫反應之可偵測變化之能力。
如本文所用，「免疫抑制」及「免疫抑制的」意謂引起免疫反應之可偵測降低或具有引起免疫反應之可偵測降低之能力，及引起免疫反應之可偵測抑制之能力。
如本文所用，「補體系統」為免疫系統之幫助或補助抗體及吞噬細胞自有機體清除病原體之能力的部分。
如本文所用，「補體C3」為量測作為補體系統之部分之某種蛋白質之活性的血液測試。補體系統為自由移動通過血流之蛋白質之群組。該等蛋白質與免疫系統一同起作用且在產生發炎中起作用。
如本文所用，「歸巢」為藉此細胞遷移至其來源之器官或特定生態區位，亦即損傷區域之現象。
經分離及修飾之QPSC細胞群體及包含其之組合物
在一個態樣中，本發明提供一種經分離及修飾之QPSC群體，其具有至少70%細胞均質性且表現至少CD273之細胞標記，較佳進一步表現CD55、CD46及CXCR4中之一或多者。在一個實施例中，除CD273以外，QPSC群體強烈表現CD73、CD105及CD90，而不表現CD11b、CD19、CD34、Cd45及HLA-DR中之一或多者。
抗體可用於識別在靶細胞上不同表現之表面分子。細胞表面標記意謂可經由特異性抗體偵測之在細胞表面上表現之蛋白質。適用於本發明之細胞標記以及表面標記包括(但不限於)CD(分化叢集)抗原CD73、CD105、CD90、CD273、CD46、CD55、CXCR4、CD11b、CD19、CD34、CD45及HLA-DR。以上標記如下說明。
CD73(NT5E，胞外5'-核苷酸酶，E5NT，NTE)為在人類T及B淋巴細胞表面上表現之糖基磷脂醯肌醇(GPI)錨定嘌呤補救酶。CD73在活化T細胞中起作用。
CD90為發現於胸腺細胞前體細胞上之GPI細胞錨定分子。
CD105為發現於內皮細胞上但不存在於大部分T及B細胞之二硫化物連接之均二聚體。
CD273為對於調節T細胞活化具有重要性之PD1(共受體)之第二配位體(共配位體)且已知表現在DC及巨噬細胞中。
CD55為補體衰變加速因子，其在細胞表面上調節補體系統且防止C3bBb複合物(替代路徑之C3轉化酶)組裝或加快預先形成之轉化酶 之分解，因此阻斷攻膜複合物形成；CD46為抑制性補體受體。
CXCR4在免疫及中樞神經系統之細胞中廣泛表現，回應於其配位體SDF-1(CXCL12)介導靜息白血球及造血祖細胞之遷移，且此SDF-1/CXCR4軸之主要功能之一為在胚胎發育、細胞趨化性及產後歸巢至損傷部位期間調節祖細胞運輸。
CD11b為整合素α M鏈；CD11c為整合素α X鏈且對於嗜中性白血球及單核細胞黏附至經刺激內皮為重要的，且亦在吞噬補體包覆粒子中起作用且作為區分最近活化效應CD8(+)T細胞及記憶細胞之標記。
CD19發現於B細胞(一類白血球)表面上且於濾泡樹突狀細胞及B細胞上表現。
CD34為存在於人體內之某些細胞及細胞表面醣蛋白上之分化分子叢集且充當細胞-細胞黏附因子；其亦可介導幹細胞至骨髓細胞外基質或直接至基質細胞之附著。
CD45為發現於造血來源之所有細胞上之白血球常見抗原。
HLA-DR為MHC II類分子。
在一個實施例中，本發明之QPSC群體具有至少70%細胞均質性且可強烈表現至少CD273、CD73、CD105及CD90。除CD273、CD73、CD105及CD90以外，本發明之QPSC群體可強烈表現CD55、CD46及CXCR4中之一或多者。在另一實施例中，本發明之QPSC群體可強烈表現CD90、CD105、CD73、CD273、CD46、CD55及CXCR4。
在一些實施例中，細胞表面標記之表現缺乏限定本發明之QPSC群體。根據本發明，QPSC群體具有至少70%細胞均質性且對於CD11b、CD19、CD34、CD45及HLA-DR中之一或多者呈陰性。基於上文所提及之獨特細胞表面標記標籤，已鑑別具有獨特功能特徵之個別幹細胞群體。
在一些實施例中，本發明之細胞群體內之至少約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99% QPSC表現相關細胞標記；在其他實施例中，幹細胞群體內之至少約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99% QPSC群體表現相關細胞標記；在其他實施例中，幹細胞群體內之至少約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或甚至約100% QPSC群體表現相關細胞標記。「實質上不含」意謂群體中之少於約30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或甚至0%細胞表現相關標記。
在一個實施例中，本發明之QPSC群體在培養至至少第4、第5、第6、第7、第8或第9代之後具有至少70%細胞均質性及似乎表現至少CD273之細胞標記且在至少第4、第5、第6、第7、第8或第9代之後維持細胞標記表現，較佳自第4代至第15代或自第5代至第15代，自第6代至第15代或自第6代至第14代，自第6代至第13代，自第6代至第12代，自第8代至第15代或自第8代至第12代表現及維持至少CD273。本發明之QPSC群體較佳在第6代至第12、第13、第14、第15、第16、第17或第18代之後維持至少CD273之表現。
在一些實施例中，本發明之QPSC群體在培養至至少第4、第5、第6、第7、第8或第9代之後似乎表現CD273及視情況存在之CD46、CD55及CXCR4中之一或多者，且在至少第4、第5、第6、第7、第8或第9代之後維持CD273表現及CD46、CD55及CXCR4中之一或多者；較佳自第4代至第15代或自第5代至第15代，自第6代至第15代或自第6代至第14代，自第6代至第13代，自第6代至第12代，自第8代至第15代或自第8代至第12代表現及維持細胞標記。本發明之QPSC群體更佳在培養至至少第5、第6、第7、第8或第9代之後似乎表現CD273、 CD46、CD55及CXCR4且在至少第5、第6、第7、第8或第9代之後，較佳自第4代至至少第15代，自第4代至第15代或自第5代至第15代，自第6代至第15代或自第6代至第14代，自第6代至第13代，自第6代至第12代，自第8代至第15代或自第8代至第12代維持CD273、CD46、CD55及CXCR4之表現。本發明之QPSC群體較佳在第6代至第12、第13、第14、第15、第16、第17或第18代之後維持CD273及CD46、CD55及CXCR4中之一或多者之表現。
在一個實施例中，本發明之QPSC群體在低溫保存及解凍之後在表現圖譜中保持實質上相同。
可使用此項技術中已知且本文描述之選擇性方法使QPSC群體表徵。通常，QPSC群體之來源與單株/多株抗體反應。表現細胞表面抗原之細胞亞群可藉由螢光材料(諸如量子點)標記或藉由二級抗體標記或藉由免疫磁珠鑑定、補體介導溶解、凝集方法、市售抗體陣列套組或螢光活化細胞分類(FACS)正或負選擇。隨後使用群落形成分析測定具有限定細胞表面表型之所得亞群之功能屬性。
在一個實施例中，相對於人類角膜上皮細胞，本發明之QPSC群體具有至少3倍優異的抗氧化能力。
在一個實施例中，本發明之QPSC群體表現生長因子(較佳EGF、VEGF)、免疫調節因子(較佳IDO、IL10、TGF-β 1)及神經營養因子(較佳GDNF、CNTF、NGF、NTF3、NTF4)之基因。
在一個實施例中，本發明之QPSC群體合成且分泌細胞激素，包括血管生成素-2、BDNF、BTC、FGF-4、FGF-9、IGF-II、IL3、IL12-p40、GRO、MCP-1、MIF、MIP-1α、Fas/TNFRSF6、IGF-BP-3、TRAIL-R4、TIMP-1、TIMP-2及uPAR。
在另一態樣中，本發明提供一種包含本發明之QPSC群體之組合物。根據本發明，除QPSC群體以外，以上組合物可含有一或多種醫 藥學上准許之不活化載劑。不活化載劑之實例包括防腐劑、增溶劑、穩定劑等。組合物可用於非經口投與，例如靜脈內、皮下、腹膜內投與或局部施用。細胞群體之劑量可根據疾病之類別，疾病之嚴重程度，投與途徑，或患者之體重、年齡及性別而變化。
本發明之QPSC群體之產生方法
本發明之QPSC群體藉由將其維持在適當培養基中，在其達至適當匯合之後自培養基將其分離，收集分離細胞且隨後於細胞培養容器中接種該等細胞來培養。
在一個態樣中，本發明提供一種產生具有至少70%細胞均質性之本發明之經分離及修飾之QPSC群體之方法，其包含自個體分離人類多潛能基質細胞；在幹細胞培養基中培養所得細胞；在細胞達至70-80%匯合之後分離細胞；以在3,000個細胞/平方公分至10,000個細胞/平方公分，較佳5,000個細胞/平方公分至10,000個細胞/平方公分，6,000個細胞/平方公分至10,000個細胞/平方公分或7,000個細胞/平方公分至10,000個細胞/平方公分範圍內之密度接種細胞；在含有至少一種生長因子(較佳EGF(較佳0.1-1.0ng/ml)、FGF-2(較佳1-10ng/ml))之培養基補充物(較佳ITS(胰島素、轉鐵蛋白、亞硒酸、BSA及亞麻油酸之混合物；較佳0.1-1%)中培養細胞；且在培養至至少第6代之後，至少70%細胞似乎表現CD273及視情況存在之CD46、CD55及CXCR4中之一或多者且自至少第6代至至少第12代維持CD273及視情況存在之CD46、CD55及CXCR4中之一或多者之表現，藉此可獲得經分離及修飾之QPSC群體。培養基較佳進一步包含培養基補充物(較佳ITS(胰島素、轉鐵蛋白、亞硒酸、BSA及亞麻油酸之混合物)。培養基補充物較佳呈0.1-1%之量。
在一個實施例中，本發明之QPSC群體可使用多種方法(包括本文描述及以下例示之彼等方法)自脂肪組織分離及純化，其隨後經修飾 以藉由增強且維持其關於CD273及視情況存在之CD46、CD55及CXCR4中之一或多者之表現而具有至少70%細胞均質性。關於鑑別及表徵，經分離及修飾之QPSC群體藉由針對細胞表面標記之表現分類且針對細胞表面標記之表現缺乏負分類來正選擇。
在一個實施例中，本發明之經分離及修飾之QPSC群體在低溫保存及解凍之後可維持CD273及視情況存在之CD46、CD55及CXCR4中之一或多者之表現。在另一態樣中，本發明提供一種在大規模細胞低溫保存及解凍之後維持本發明之QPSC群體之細胞標記的方法，其包含在凍結過程期間以恆定冷卻速率緩慢降低QPSC群體之大規模細胞之溫度且隨後解凍之步驟，其中QPSC群體之大規模細胞之周圍與中心之間的溫度差(ΔT)在1.6℃至2.6℃範圍內。
當凍結細胞時，需要緩慢降低溫度以避免快速或不穩定冷卻過程，快速或不穩定冷卻過程可導致細胞因細胞內之水晶體凝結而死亡。低溫保存活細胞之習知方法包含將細胞置放於低溫保護劑中；將低溫保護劑中之活細胞逐漸冷卻至第一預定溫度；及將低溫保護劑中之活細胞自第一預定溫度快速冷卻至第二預定溫度。逐漸冷卻細胞之步驟可包括以在約1℃/min與約3℃/min之間的速率冷卻。第一預定溫度通常為約-30℃。第二預定溫度可在約-80℃與約-196℃之間。然而，控制細胞之周圍與中心之間的溫度差為重要的。
本發明出乎意料地發現在低溫保存中，當降低溫度時將大規模細胞之周圍與中心之間的溫度差(ΔT)控制在1.6℃至2.6℃範圍內可在解凍之後維持細胞之細胞標記表現。亦即，在凍結細胞解凍之後細胞標記之表現強度將不降低。
在一個實施例中，在低溫保存本發明之QPSC群體細胞中使用在減慢冷卻下之低溫袋之低溫保存裝置。該裝置包含主體外殼、一或多個用於低溫袋插入之空隙層及兩個或兩個以上填充有異丙醇之鐵氟龍 (Teflon)低溫保存袋。術語「低溫袋」或「細胞收集袋」定義為含有活細胞之低溫保存袋。如本文所用，活細胞可為在活體外培養擴增之後的細胞，包括(但不限於)幹細胞或自活體收集之臍血。為了避免污染且提供用於輸送及堆疊之有利組態，於低溫保存裝置之主體外殼上提供罩蓋以便藉由按壓配合或搭扣配合控制開及關。主體外殼可由抗凍結塑膠、紙、金屬或其他材料製成，且在本發明中材料不受特別限制。在一個實施例中，主體外殼及罩蓋由PP塑膠材料製成。低溫保存裝置含有單層或多層低溫袋之置放空隙。低溫袋可置放於可單獨移除之金屬外殼中或固定於藉由自主外殼之內壁突出之物件來固持之牆板上。置放空隙之高度應與低溫袋相同以確保低溫袋在上表面及下表面直接接觸鐵氟龍低溫保存袋。低溫袋較佳中間堆疊於鐵氟龍低溫保存袋之間。在本發明之一較佳實施例中，低溫袋之上表面及下表面均直接接觸鐵氟龍低溫保存袋。
應用
在另一態樣中，本發明提供一種調節T細胞及/或補體系統且增強細胞活力之方法，其包含向個體投與有效量之本發明之經分離及修飾之QPSC群體。因此，本發明之QPSC群體可誘導、增強或抑制免疫反應。
在另一態樣中，本發明提供一種增強細胞之歸巢效率之方法，其包含向個體投與有效量之本發明之經分離及修飾之QPSC群體。
在另一態樣中，本發明提供一種預防及/或治療免疫疾病、病症或病況之方法，其包含向個體投與有效量之本發明之經分離及修飾之QPSC群體。本發明之經分離及修飾之QPSC群體具有免疫調節能力，包括誘導、增強或抑制免疫反應且因此在預防及/或治療各種免疫疾病、病症或病況方面具有潛在價值。
在一特定實施例中，該疾病、病症或病況為發炎性腸病。在一 更特定實施例中，該發炎性腸病為克羅恩氏病(Crohn's disease)。
在另一特定實施例中，該疾病、病症或病況為移植物抗宿主疾病。在一更特定實施例中，該移植物抗宿主疾病在同種異體骨髓移植之後產生。在另一更特定實施例中，該移植物抗宿主疾病在實體器官移植之後產生。在另一更特定實施例中，該移植物抗宿主疾病在複合組織同種異體移植之後產生。在另一更特定實施例中，該移植物抗宿主疾病藉由該投與藉由至少一個步驟在等級上減輕。
在另一特定實施例中，該疾病、病症或病況為類風濕性關節炎(RA)。在一更特定實施例中，投與在患有RA之個體之至少一個關節中足以引起RA之一或多種症狀之可偵測改良或足以可偵測地減少RA之一或多種症狀之發作。在另一特定實施例中，投與在患有RA之個體之至少一種非關節組織中足以引起RA之一或多種症狀之可偵測改良或足以可偵測地減少RA之一或多種症狀之發作。在一更特定實施例中，該非關節組織為皮膚(真皮)、肺、自體免疫系統或血液、腎組織、心血管組織、眼部組織或神經組織。在一更特定實施例中，該RA症狀為附屬於RA的病況。在一更特定實施例中，該附屬於RA的病況為壞疽性膿皮病、嗜中性皮膚病、斯威特氏症候群(Sweet's syndrome)、病毒感染、結節性紅斑、小葉脂層炎、指端皮膚萎縮、手掌紅斑、彌漫性薄化(米紙皮膚)、皮膚脆弱性、外表面上(例如肘部上)之皮下節結、肺纖維化(例如由於甲胺喋呤療法)、卡普蘭氏節結(Caplan's nodules)、血管病症、甲皺梗塞、神經病變、腎病變、澱粉樣變性、肌肉脂肪性假肥大、心內膜炎、左心室衰竭、血管炎、鞏膜軟化、多發性單神經炎、寰樞椎半脫位。
在另一特定實施例中，該疾病、病症或病況為多發性硬化。在一更特定實施例中，該多發性硬化為復發/緩解型多發性硬化、繼發性進行性多發性硬化、原發性進行性多發性硬化或進行性/復發性多 發性硬化。
在另一特定實施例中，該疾病、病症或病況為紅斑狼瘡。在一更特定實施例中，該紅斑狼瘡症狀為以下中之一或多者：頰部疹，蝶形疹，盤狀狼瘡，禿頭症，口、鼻及陰道潰瘍，皮膚病變，關節疼痛貧血及/或缺鐵，低於正常血小板及白血球計數，抗磷脂抗體症候群，血液中存在抗心磷脂抗體，心包炎，心肌炎，心內膜炎，肺及/或胸膜發炎，胸膜炎，肋膜積液，狼瘡肺炎，慢性彌漫性間質肺病，肺高血壓，肺栓塞，肺出血，無痛血尿或蛋白尿，狼瘡腎炎，腎衰竭，及/或具有「線環」異常之膜性絲球體腎炎之產生，神經表現(例如癲癇發作、精神病、腦脊髓液異常)，T細胞異常(例如CD45磷酸酶缺乏及/或CD40配位體表現增加)，及/或非特異性表現(例如狼瘡胃腸炎、狼瘡胰臟炎、狼瘡膀胱炎、自體免疫內耳疾病、副交感功能障礙、視網膜血管炎、全身性血管炎、Fc.ε.RI.γ表現增加、T細胞中鈣含量增加並且維持、血液中三磷酸肌醇增加、蛋白激酶C磷酸化減少、Ras-MAP激酶信號傳導減少及/或蛋白激酶AI活性缺乏)。
在另一特定實施例中，該疾病、病症或病況為硬皮病。在一更特定實施例中，硬皮病為彌漫性硬皮病。在另一特定實施例中，該疾病、病症或病況為蕈樣真菌病(阿-巴二氏症候群(Alibert-Bazin syndrome))。在另一實施例中，該疾病、病症或病況為糖尿病。在另一實施例中，該疾病、病症或病況為牛皮癬。在一更特定實施例中，牛皮癬為斑塊型牛皮癬(尋常型牛皮癬)。
在以上方法中之任一者之另一特定實施例中，方法包含向患有疾病、病症或病況之個體投與第二治療劑。在一更特定實施例中，該第二治療劑為消炎劑、免疫調節劑及免疫抑制劑、止痛藥或抗生素。在一更特定實施例中，該第二治療劑為免疫調節劑。在一更特定實施例中，該免疫調節劑為免疫抑制劑。在一甚至更特定實施例中，該免 疫抑制劑為抗CD3抗體(例如OKT3，莫羅單抗(muronomab))、抗IL-2受體抗體(例如巴利昔單抗(basiliximab)(SIMULECT®)及達利珠單抗(daclizumab)(ZENAPAX®))、抗T細胞受體抗體(例如莫羅莫那(Muromonab)-CD3)、硫唑嘌呤、鈣調神經磷酸酶抑制劑、皮質類固醇、環孢靈、甲胺喋呤、巰基嘌呤、黴酚酸嗎啉乙酯、他克莫司(tacrolimus)或西羅莫司(sirolimus)。在另一更特定實施例中，該第二治療劑包含另一類型之幹細胞，例如來源於骨髓之間葉幹細胞、骨髓或造血幹細胞。
在另一態樣中，本發明提供一種預防及/或治療缺血疾病/病症/病況、急性組織損傷或退化疾病/病症/病況之方法，其包含向個體投與QPSC群體。本發明之QPSC群體之細胞具有有效歸巢能力，包括阻斷宿主補體之活化之能力及定向遷移至損傷區域，其均提供較好活體內細胞保護及治療功效。
在另一特定實施例中，該缺血疾病/病症/病況為心血管系統、呼吸系統、神經系統、肌肉骨胳系統、消化系統、免疫系統、淋巴系統、內分泌系統、外分泌系統或外皮系統之缺血或缺血/再灌注損傷。
在另一特定實施例中，該急性組織損傷為與心血管系統、呼吸系統、神經系統、肌肉骨胳系統、消化系統、免疫系統、淋巴系統、內分泌系統、外分泌系統或外皮系統有關之組織之創傷性、醫原性、感染性、機械或化學損傷。
在另一特定實施例中，該退化疾病/病症/病況為與心血管系統、呼吸系統、神經系統、肌肉骨胳系統、消化系統、免疫系統、淋巴系統、內分泌系統、外分泌系統或外皮系統有關之組織之基因相關、蛋白質相關、單核苷酸多形性、細胞膜相關或特發性功能惡化。
實例 實例1 本發明之QPSC群體之分離及培養
自健康成人供體之皮下脂肪組織分離且純化QPSC。所收集之組織首先在100 RCF下離心3-10分鐘以移除非所需水狀血液，且在37℃下用膠原蛋白酶消化0.5-6小時。前述培育時間長度及附加震盪視組織狀態及尺寸而定。經分離之QPSC隨後用PBS洗滌且在400 RCF下離心3-10分鐘兩次。在集結粒分散之後，將QPSC計數且以小於5×106個細胞/平方公分之密度塗於細胞培養燒瓶上。
QPSC維持在ADMSC培養基中且每2-3天更換培養基。在QPSC達至70-80%匯合後，其在37℃下用胰蛋白酶/EDTA溶液分離1-10分鐘，隨後用PBS洗滌且在330 RCF下離心3-10分鐘兩次。在細胞計數之後，QPSC以小於5,000個細胞/平方公分至10,000個細胞/平方公分之密度接種於細胞培養燒瓶中。QPSC之接種密度可視繼代培養物之間的時間間隔長度而調整。細胞培養於含有0.1-1.0ng/ml EGF、1-10ng/ml FGF-2及0.1-1% ITS之培養基中。在培養六、七、八、九、十、十一及十二代之後，分別獲得且收集QPSC群體。在10代之後QPSC群體之形態顯示於圖1中。
實例2 本發明之QPSC群體之表徵
關於本發明之QPSC群體之表徵，使用C6 Flow Cytometer®系統進行流動式細胞測量術分析且用Accuri CFlow®軟體分析資料。APC小鼠抗人類CD273、FITC小鼠抗人類CD46、FITC小鼠抗人類CD55、兔抗人類CXCR4及FITC山羊抗兔IgG、含有MSC陽性混合液(FITC CD90、PerCP-CyTM5.5 CD105及APC CD73)之人類MSC分析套組及QPSC陰性混合液(PE CD45、PE CD34、PE CD11b、PE CD19及PE HLA-DR)購自BD Bioscience。
對於各反應，QPSC群體之2-5×105個細胞再懸浮於1% FBS/DPBS溶液中且於冰上用抗體培育30分鐘。然後，QPSC群體細胞在製備中 用1ml 1% FBS/DPBS溶液洗滌兩次以用於流動式細胞測量術分析。
藉由流動式細胞測量術表徵之表面免疫表型揭示本發明之QPSC群體細胞於其表面上表現CD273、CD55、CD46、CXCR4、CD73、CD90及CD105，同時缺乏CD11b、CD19、CD34、CD45及HLA-DR表面標記之表現(參見圖2及下表)。
提供比較實例以顯示本發明之QPSC群體之細胞標記表現不同於天然存在之QPSC。細胞自皮下脂肪組織分離及純化且根據實例1中指定之方法培養至第五代。所得細胞上CD273之表現水準僅為60%且其CD55及CXCR4之表現水準分別為40%及10%(參見下表)。
實例3 QPSC群體在三譜系分化方面之能力
本發明之QPSC群體細胞三譜系分化成脂肪細胞、骨胚細胞及軟骨細胞之能力用購自Gibco之特定細胞培養基(STEMPRO®脂肪生成分化套組、STEMPRO®成骨分化套組及STEMPRO®軟骨形成分化套組)誘導。
對於脂肪生成分化，QPSC群體之細胞以於ADMSC培養基中 1×105個細胞/毫升之密度接種於35mm培養皿上且於5% CO2中在37℃下培育。在2-4小時之後，用脂肪生成分化培養基替換培養基且QPSC群體之細胞再連續培育14天或21天。分化培養基每3-4天更新。為了確認QPSC群體之細胞之脂肪生成分化，細胞在室溫下於4%甲醛溶液(Merck)中固定20分鐘且在觀察之前用40%油紅(Oil Red)O溶液(Sigma)染色5分鐘。
對於成骨分化，QPSC群體之細胞以於ADMSC培養基中5×104個細胞/毫升之密度接種於35mm培養皿上且於5% CO2中在37℃下培育。在2-4小時之後，用成骨分化培養基替換培養基且每3-4天連續更新。在14天或21天培養之後，細胞於4%甲醛溶液中固定20分鐘且用NBT-BCIP®溶液(Sigma)染色45-60分鐘以觀測鹼性磷酸酶活性。另一新鮮樣本用茜素紅(Alizarin Red)S溶液(Sigma)染色60-90分鐘以驗證鈣沈澱。
對於軟骨形成分化，收集1×107個細胞/毫升之於ADMSC培養基中之QPSC群體之細胞且在12孔培養板之一個孔中心滴10μl培養基隨後於5% CO2中在37℃下培育。在OPSC群體之細胞於培養板上黏附2小時之後，添加軟骨形成分化培養基且細胞再連續培育3天或6天。分化培養基每2-3天小心更新。為了驗證QPSC群體之細胞之軟骨形成分化，細胞於4%甲醛溶液中固定20分鐘且在觀察之前用愛爾斯藍(Alcian Blue)溶液(Merck)在4℃下染色2-3小時。
本發明之QPSC群體之細胞之分化能力顯示於圖3中。
實例4 T細胞增殖分析
為了檢驗QPSC對T淋巴細胞增殖之免疫調節效應，以各種比率將QPSC與藉由板結合抗CD3抗體加抗CD28抗體刺激之新鮮分離之T淋巴細胞共同培養。隨後使用BrdU併入法量測T細胞增殖。BrdU(5-溴-2'-脫氧尿苷)為可併入增殖細胞中之新合成DNA中且藉由免疫分析 偵測之合成胸苷類似物。結果顯示T細胞增殖由QPSC顯著抑制，但不以細胞數目依賴性方式(參見圖4)。
為了研究CD273是否對QPSC之免疫調節功能至關重要，吾等使用抗CD273中和抗體比較QPSC與CD273阻斷之QPSC(CD273-QPSC)之T細胞調節能力。QPSC群體細胞用絲裂黴素C(50微克/1×107個細胞/毫升，Sigma-Aldrich)處理1小時。CD273缺乏之QPSC隨後藉由負選擇使用抗人類CD273抗體結合磁性粒子(BD Biosciences)純化或用抗CD273之阻斷抗體(MIH18，Biolegend)處理1小時。CD273對QPSC群體細胞之關於T細胞調節之效應顯示於圖5中。圖5(A)(QPSC，第10代)及(B)(QPSC，第12代)顯示CD273-QPSC之抑制T細胞增殖之能力顯著降低。此外，CD273-QPSC藉由負選擇使用抗人類CD273抗體結合磁性粒子純化。圖5(C)顯示CD273-QPSC未能抑制T細胞增殖。此等結果表明CD273表現對於QPSC之免疫調節功能為重要的。
經純化之人類CD3+ T細胞(1×105個細胞)與QPSC群體之細胞或QPSC群體之CD273缺乏細胞在含有10%胎牛血清(FBS)、2mM 1-麩醯胺酸、100U/ml青黴素、100U/ml鏈黴素及25mM HEPES之RPMI-1640培養基(Gibco)中共同培養。細胞用板結合抗CD3(2μg/ml)及抗CD28(2μg/ml)單株抗體(BD Biosciences)在96孔培養板中刺激48小時及72小時(37℃/5% CO2)。
在2-3天之後，將5-溴-2-脫氧尿苷(BrdU)添加至各孔且培養板再培育18小時以用於量測T細胞增殖。根據製造商之說明使用細胞增殖ELISA，BrdU套組(Roche)量測併入T細胞中之BrdU之量。
實例5 本發明之QPSC群體細胞在低溫保存之前及在低溫保存及解凍之後的細胞標記表現
QPSC群體之細胞在低溫保存之前的細胞標記表現圖譜顯示於下表中。在使用本文描述之低溫保存方法之後，本發明之QPSC群體之 細胞在低溫保存及解凍之後的細胞標記表現圖譜保持實質上相同(參見圖6)。QPSC群體之細胞在低溫保存之前及在低溫保存及隨後解凍之後的表現圖譜顯示於下表中。
陰性混合液：CD11b、CD19、CD34、CD45及HLA-DR
實例6 活體外趨化性分析
基質衍生因子-1(SDF-1)在細胞經由與在幹/祖細胞表面上表現之其同源受體CXC趨化因子受體4(CXCR4)之相互作用朝向缺血組織歸巢方面起關鍵作用。吾等在傳斯維爾(transwell)趨化性分析中檢查CXCR4之較高表現是否增加QPSC朝向SDF-1梯度移動。為了持續釋放化學引誘劑，100μl，2.4mg/ml水凝膠(Porcogen膠原蛋白，SunMax Biotechnology Co.,Ltd.)裝載有0ng/ml、500ng/ml及1000ng/ml SDF-1α(R&D System)且置放於24孔培養板之底孔中且在37℃下預培育1小時以膠凝。
將懸浮於Stemchymal培養基(100μl，1×105個細胞/毫升)中之QPSC群體之細胞裝載至24孔培養插件(8μm孔隙尺寸，PET，BD FalconTM)之上部腔室上，且將額外700μl之相同培養基添加至下部腔室中。在37℃及5% CO2下預培育隔夜之後，插件轉移至含有預培育水凝膠之24孔培養板上且裝載有700μl含有低含量血清之遷移培養基(含0.5% FBS之α-MEM)。在進一步培育16-24小時之後，細胞用4%甲 醛(Merck)固定30分鐘且用0.5%結晶紫溶液(Sigma)染色30分鐘。藉由用棉花棒輕輕擦拭來移除插件膜之頂面上之未遷移細胞。藉由在×40之顯微鏡下對每孔五個隨機視野計數來測定膜底面上之遷移細胞之數目。如圖7中所示，QPSC群體細胞具有有利歸巢能力。結果顯示具有CXCR4之較高表現(CXCR4高)之細胞以劑量依賴性方式增強QPSC對SDF-1濃度作出反應之能力。然而，具有CXCR4之較低表現(CXCR4低)之細胞並未顯示朝向SDF-1之遷移細胞數目增加。
實例7 補體依賴性細胞毒性分析
QPSC群體細胞以1×104細胞/孔之濃度接種於96孔組織培養板(BD Biosciences)中。當附著時，細胞在37℃下用自健康成人供體收集作為補體來源之正常人類血清培育1小時。對於陽性及陰性對照，細胞分別用1% Triton X-100(Sigma-Aldrich)及α-MEM(Gibco)培育。在培育之後，使用MTS分析評估細胞活力。根據製造商之說明進行MTS分析步驟。簡言之，以1：5稀釋度將MTS試劑(Promega)添加至96孔組織培養板之各孔，培養板於潮濕、5% CO2氛圍中在37℃下培育3小時，且藉由ELISA讀取器記錄在490nm下之吸光度。如圖8中所示，QPSC群體細胞在調節補體依賴性細胞毒性方面具有有利能力。

Claims (22)

  1. 一種經分離及修飾之QPSC群體，其具有至少70%細胞均質性且表現至少CD273之細胞標記。
  2. 如請求項1之QPSC群體，其強烈表現CD273。
  3. 如請求項1之QPSC群體，其進一步表現CD73、CD105及CD90。
  4. 如請求項1之QPSC群體，其進一步表現CD55、CD46及CXCR4中之一或多者，而不表現CD11b、CD19、CD34、CD45及HLA-DR中之一或多者。
  5. 如請求項1之QPSC群體，其具有至少90%細胞均質性且至少表現CD273之細胞標記。
  6. 如請求項5之QPSC群體，其強烈表現CD273。
  7. 如請求項5之QPSC群體，其進一步表現CD73、CD105及CD90。
  8. 如請求項5之QPSC群體，其進一步表現CD55、CD46及CXCR4中之一或多者，而不表現CD11b、CD19、CD34、CD45及HLA-DR中之一或多者。
  9. 一種組合物，其包含如請求項1之QPSC群體。
  10. 一種產生如請求項1之經分離及修飾之QPSC群體之方法，其包含自個體分離人類多潛能基質細胞；在幹細胞培養基中培養所得細胞；在該等細胞達至70-80%匯合之後將其分離；以在3,000-10,000個細胞/平方公分範圍內之密度接種該等細胞；在含有至少一種生長因子及培養基補充物之培養基中培養該等細胞；且在培養至至少第4代之後，該等細胞似乎表現CD273及視情況存在之CD46、CD55及CXCR4中之一或多者且自至少第4代維持CD273及視情況存在之CD46、CD55及CXCR4中之一或多者之表現，藉此可獲得經分離及修飾之QPSC群體。
  11. 如請求項10之方法，其中該接種密度為5,000個細胞/平方公分至10,000個細胞/平方公分。
  12. 如請求項10之方法，其中該生長因子為EGF、EGF-2或VEGF或其任何組合且該培養基補充物為ITS。
  13. 如請求項12之方法，其中EGF濃度為0.1-1.0ng/ml；FGF-2濃度為1-10ng/ml且ITS濃度為0.1-1%。
  14. 一種在大規模細胞低溫保存及解凍之後維持如請求項1之QPSC之細胞標記的方法，其包括在凍結過程期間以恆定冷卻速率緩慢降低大規模QPSC群體細胞之溫度且隨後解凍之步驟，其中該等大規模QPSC之周圍與中心之間的溫度差(ΔT)在1.6℃至2.6℃範圍內。
  15. 一種調節T細胞及/或補體系統且增強細胞活力之方法，其包括向個體投與有效量之如請求項1之經分離及修飾之QPSC群體。
  16. 一種增強細胞之歸巢效率之方法，其包括向個體投與有效量之如請求項1之經分離及修飾之QPSC群體。
  17. 一種預防及/或治療免疫、缺血、退化疾病/病症/病況及急性組織損傷之方法，其包括向個體投與如請求項1之QPSC群體。
  18. 如請求項17之方法，其中該免疫疾病/病症/病況為發炎性腸病、移植物抗宿主疾病、類風濕性關節炎、多發性硬化、全身性紅斑狼瘡、硬皮病、糖尿病或牛皮癬。
  19. 如請求項17之方法，其中該缺血疾病/病症/病況為心血管系統、呼吸系統、神經系統、肌肉骨胳系統、消化系統、免疫系統、淋巴系統、內分泌系統、外分泌系統或外皮系統之缺血或缺血/再灌注損傷。
  20. 如請求項17之方法，其中該急性組織損傷為與心血管系統、呼吸系統、神經系統、肌肉骨胳系統、消化系統、免疫系統、淋 巴系統、內分泌系統、外分泌系統或外皮系統有關之組織之創傷性、醫原性、感染性、機械或化學損傷。
  21. 如請求項17之方法，其中該退化疾病/病症/病況為與心血管系統、呼吸系統、神經系統、肌肉骨胳系統、消化系統、免疫系統、淋巴系統、內分泌系統、外分泌系統或外皮系統有關之組織之基因相關、蛋白質相關、單核苷酸多形性、細胞膜相關或特發性功能惡化。
  22. 如請求項17之方法，其包含進一步投與第二治療劑。
TW104104181A 2014-02-06 2015-02-06 具優異細胞保護及免疫調節之ｑｕａｄｒｉ－正之基質細胞 TWI642781B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461936407P 2014-02-06 2014-02-06
US61/936,407 2014-02-06

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201538728A true TW201538728A (zh) 2015-10-16
TWI642781B TWI642781B (zh) 2018-12-01

Family

ID=53753917

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW104104181A TWI642781B (zh) 2014-02-06 2015-02-06 具優異細胞保護及免疫調節之ｑｕａｄｒｉ－正之基質細胞

Country Status (2)

Country Link
US (2) US20150216908A1 (zh)
TW (1) TWI642781B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110799200A (zh) * 2017-05-26 2020-02-14 仲恩生医科技股份有限公司 用于多麸酰氨酸(polyq)疾病的治疗
TWI717521B (zh) * 2017-05-26 2021-02-01 仲恩生醫科技股份有限公司 用於多麩醯胺酸(polyq)疾病之治療

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL269893B2 (en) * 2017-05-15 2023-10-01 Stem Cell Medicine Ltd Treatment of multiple sclerosis using stem cells derived from adipose tissue
EP3624815A4 (en) 2017-05-15 2021-01-20 Stem Cell Medicine Ltd. TREATMENT OF MULTIPLE SCLEROSIS WITH LONG-ACTING GLATIRAMER AND ADAPTIVE STEM CELLS

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070172840A1 (en) * 2006-01-26 2007-07-26 Lin Liu Parallel microarray hybridization
WO2009023566A2 (en) * 2007-08-09 2009-02-19 Genzyme Corporation Method of treating autoimmune disease with mesenchymal stem cells
EP2689787A1 (en) * 2010-09-03 2014-01-29 Stem Centrx, Inc. Identification and enrichment of cell subpopulations

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110799200A (zh) * 2017-05-26 2020-02-14 仲恩生医科技股份有限公司 用于多麸酰氨酸(polyq)疾病的治疗
TWI717521B (zh) * 2017-05-26 2021-02-01 仲恩生醫科技股份有限公司 用於多麩醯胺酸(polyq)疾病之治療
US11547730B2 (en) 2017-05-26 2023-01-10 Steminent Biotherapeutics Inc. Therapy for polyglutamine (polyQ) diseases

Also Published As

Publication number Publication date
US20150216908A1 (en) 2015-08-06
TWI642781B (zh) 2018-12-01
US20220218758A1 (en) 2022-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9539288B2 (en) Immunomodulation using placental stem cells
US11142747B2 (en) Stromal stem cells
US20220218758A1 (en) Quadri-positive stromal cell (qpsc) population for superior cell protection and immunomodulation
US20200376038A1 (en) Mesenchymal stromal cells for treating sepsis
EP2773746A1 (en) Adult mesenchymal stem cell (msc) compositions and methods for preparing the same
ES2914692T3 (es) Células madre adhesivas derivadas de cordón umbilical mejoradas, método de preparación para las mismas, y uso de las mismas
RU2757818C2 (ru) Способы и композиции для трансплантации стволовых клеток
Kellner et al. Differential properties of human stromal cells from bone marrow, adipose, liver and cardiac tissues
US20150190431A1 (en) Method for isolating stem cells and their use in cell therapy
KR102011634B1 (ko) 향상된 산후 부착형 세포 및 그의 용도
Wuchter et al. Mesenchymal Stromal Cells (MSC)
Mohammadi et al. Effect of gestational age on migration ability of the human umbilical cord vein mesenchymal stem cells
AU2021240128A1 (en) Immunomodulation using placental stem cells
Antunes Developing an Advanced Therapy Medicinal Product (ATMP) for the treatment of GvHD