TW201536330A - 具雙影像追蹤探針之高分子奈米載體及其製備方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種奈米粒子載體及其製備方法，該奈米粒子載體包含鍵結有金奈米團簇(AuNCs)的疏水性分子及鍵結有親水性分子的疏水性分子，其中該親水性分子係位於該奈米粒子外層且該金奈米團簇係被包覆於該奈米粒子內。

Description

具雙影像追蹤探針之高分子奈米載體及其製備方法
本發明係關於一種具高生物相容性，能有效包覆攜帶活性物質且能有效追蹤的標靶奈米載體。
現今醫藥的研究領域中，不少的高分子材料可以做為藥物及藥物載體等使用，由於多數的高分子材料在應用於生物體內時易被當作異物處理進而產生免疫反應，所以可以有效應用的高分子材料可以說是少之又少。再之部分藥物無法以直接注射或服用來輸送進入生物體內，而此類藥物一般都是和化合物一起製備而成。在這當中，高分子材料也相對佔有較大的比例。生物高分子材料在藥物輸送方面的評估一般會看兩個基本要件：生物相容性以及生物可降解性。就「生物相容性」而言，指的就是生醫材料與生物體相容而不產生排斥病變的現象，其應用時不能引起或產生血栓塞、無毒性、無過敏反應、無發炎反應、無免疫反應、無致癌性及無組織的破壞性等。而「生物可降解性」指的是生醫高分子材料在生物體內環境中， 如酵素、體液、水解以及氧化作用等作用之下，高分子的完整性遭受破壞進而產生碎片或是分解成其他產物的現象，而且可經由體內的基本代謝作用而分解排出體外。
醫藥用高分子材料，大致上可分為兩大類。一類為天然高分子材料及合成高分子材料。而常見作用於藥物載體的人工合成材料有聚酯類(polyester,PE)，如常見的聚乳酸(polylactide,PLA)、聚甘醇酸(polyglycolide,PGA)或是其共聚物聚乳酸-甘醇酸(poly(lactide-co-glycolide),PLGA)，以及其他不同類的人工合成高分子材料，如多數應用於紡織領域中的聚酸酐類(polyanhydrides)，聚醚類中最常見的聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)、聚環氧乙烷(poly ethylene oxide,PEO)等共聚物。天然高分子材料最常見者為殼聚醣(chitosan)、幾丁質(chitin)、膠原蛋白(Collagen)等材料。而常見的藥物載體多數由不同的共聚物一起使用，截短補長，來達到更好的效果。
運用高分子作為藥物載體的材料，已開發應用多年。而藥物載體設計上可以經由上述的高分子生物應用的材料作修飾或結合形成多官能基形態的高分子結構。多官能基再經由不同性質應用進一步去修飾或攜帶包覆，如蛋白質、標的抗體、油溶性或易分解之藥物…等，使之藥物載體不僅可以達到攜帶輸送藥物外，也具有保護保存藥物以及抗體對人體特定患部所產生的患部或胺基酸標的功能與能力，來達到降低劑量、降低毒性進而達到有效治療目的。
天然生物性材料有絕對的生物相容性等優點，脂肪族聚酯聚合物是常見的生物可降解性高分子材料之一，其中包括有聚乳酸(PLA)、聚甘醇酸(PGA)與聚乳酸-聚甘醇酸的共聚合物聚乳酸-甘醇酸(PLGA)等。而脂肪族聚酯聚合物擁有以下的優點：(1)以聚酯聚合物為材料的臨床應用廣泛。在1970年代，美國食品暨藥物管理局(FDA)核准PLGA使用於外科手術用縫合材料。近幾年更被廣泛運用於細胞支架或模板的製備上。(2)無毒性。此類高分子經水解後產生的乳酸(lactic acid)和甘醇酸(glycolic acid)能夠經由正常的生理代謝過程(三羧酸循環(tricarboxylic acid cycle))，轉變成二氧化碳和水分子，排出體外，而不會殘餘人體內部。(3)分解速率可調控。除上二者，PLGA可藉由調整共聚物的單體莫耳比、分子量、結晶度、pH值及酵素(酯酶)，得到不同降解速率的聚合物，容易設計、控制與新生組織的再生速率匹配。
聚乙二醇(PEG)是經環氧乙烷聚合而成的，由重複的氧乙烯基組成，不僅具有良好的水溶性，也能溶於二氯甲烷、N`N`-二甲基甲醯胺、苯、乙腈和乙醇等有機溶劑，具有線性(相對分子量5000~30000Da)或支化(相對分子量40000~60000 Da)的鏈狀結構，線性PEG分子式為H-(O-CH2-CH2)n-OH。普通的聚乙二醇兩端各有一個羥基，若一端以甲基封閉則得到甲氧基聚乙二醇(mPEG)，線性mPEG的分子式為CH3-(O-CH2-CH2)n-OH，在多肽和蛋白質的聚乙二醇化修飾研究中應用最多的是mPEG的衍生物。在生理特性上，聚乙二醇是中性、無毒且具有獨特理化性質和良好的生物相溶性的高分子聚合物，也是經FDA批准的極少數能作 為體內注射藥用的合成聚合物之一。聚乙二醇類修飾劑的藥物動力學性質因它們的相對分子量和注射給藥方式而異，分子量越大，半衰期越長。經過細胞色素P450系統的氧化作用，PEG分解成小分子的PEG，經膽汁排泄。
分子影像學(molecular imaging)主要是運用影像學的方式表現出組織、細胞和次細胞的特定分子水平，顯現出活體狀態下生物分子的變化，再將其觀察生物學上的行為在影像方面進行探討(如定性和定量的科學及醫療相關研究)。一般常用觀察的相關設備如：超音波、電腦斷層掃描(CT)、核磁共振照影(MRI)、正子造影(PET)等。
(一)超音波：
是利用聲波中頻率超過20000HZ以上的波動，轉換成像做追蹤，一般常用於婦產科或內科檢查之用。
(二)電腦斷層掃描(CT)：
電腦斷層掃描(computed tomography，簡稱CT)屬於切面照影裝置，其最初應用於透視人體的腦部結構，原理是利用X光從多角度穿透受檢體，觀察穿越時衰減能量，再轉換為電流訊號，經處理產生可辨識的影像。其讓醫護人員可以用非侵入的方式，透視人體各部分器官的形態變化，對於病變的診斷有很大助益。一般電腦斷層掃描系統是使用X光源做為能量源，使用不同能量源可以透視人體組織的不同特性，所以有不同的電腦斷層掃描系統成像類別。在檢查上，有時為了更精準結果，檢查時會搭配CT顯影劑 注射。顯影劑主要是由碘與某些大分子的結合，能阻斷X光的穿透能力，有時我們也將顯影劑稱作「對比劑」，藉由異常部位與正常組織對吸收顯影劑的能力差異，產生對比效果，達到提升判讀的結果。
(三)核磁共振照影(MRI)：
核磁共振照影(magnetic resonance imaging,MRI)是現今較新的醫學影像技術，其原理由核磁共振(NMR)衍生而來，一般在掃瞄過程中，會將人體置於強大且均勻的磁場中，以特定的射頻無線電波脈衝(RF)，激發人體組織內的氫原子產生共振現象，來產生及接收磁矩變化的訊號，收集轉換成像出立體影像。
(四)正子造影(PET)：
正子造影(Positron Emission Tomography,PET)主要是用來偵測正電子的電腦斷層掃描，正子是電子的反粒子，與電子不同的是帶正電荷。在實際進行造影檢查時，須先將正子放射性同位素標籤化合物以靜脈注射，口服或吸入的方式注入受測體內。此藥物注入體內後會不停地衰變即產生正子，在人體中的正子會快速的與體內的電子產生撞擊，產生互毀作用並產生一對能量且方向相反的加馬射線。此r射線的能量很高，足以穿透人體，因此可以利用體外的偵測器，偵測此對光子，追蹤核醫藥物在體內的位置。正子放射的區域，就是體內信號的出處，也就是造影的位置。
以往研究中，為細胞或動物體內觀察所需要，常會以一些具螢光表現 的有機化合物如螢光異硫氰酸鹽(Fluorescein isothiocyanate,FITC)等作為觀察用試劑，但有機化合物並不皆可適用於所有試驗，主要因為有機化合本身的化學性質對於活細胞與活體動物依舊具有部分毒性，應此多數實驗過程中會盡量選用毒性較為弱的試劑，而另一項缺點在於有機化合物本身的不易保存且在實驗過程中必須避光，以減少螢光的消失。為了改善有機化合物的限制，近年來尋求一種具生物相容、低毒性且具螢光性質的材料來取代現有螢光試驗中有機化合物的使用。螢光金奈米材料的開發應用，成為改善策略之一。利用金本身具有高生物相容性、無毒性性質，研究開發，使其具尺寸小且比表面積大的特性，其在光學、磁學、電學以及催化性質上和現有的金屬材料都有相當大的差異。金奈米團簇(gold nanoclusters,AuNCs)產生螢光的主要原理是因為當金奈米團簇的平均尺寸趨近電子平均自由路徑時(約50nm)，導致其電子集體激發(collective excitation of electrons)現象明顯化，進而產生表面電漿共振效應(Tang,L.；Azzi,J.；Kwon,M.；Mounayar,M.；Tong,R.；Yin,Q.；Moore,R.；Skartsis,N.；Fan,T.M.；Abdi,R.；Cheng,J.,Immunosuppressive activity of size-controlled PEG-PLGA nanoparticles containing encapsulated cyclosporine A.J.Transplant.2012,896141,9 pp)。為合成表面修飾單層硫醇分子(thiolate)的金奈米團簇通常會在鹼性環境下複合金離子前驅物(如HAuCL4或AuBr)配合還原劑NaBH4跟硫醇分子，上述步驟依一定比例，使金離子還原成具硫醇分子表面修飾的金奈米團簇。而選用不同的硫醇分子，所得到的光學性質以及放光波段也有所不同。大多金奈米團簇的放光波段落於600nm前後，加上生物基質在600nm後的放光波段背景干擾較小，因此金奈米團簇有利於用於生物體檢測應用中作為追蹤一大 利器(Brust,M.；Walker,M.；Bethell,D.；Schiffrin,D.J.；Whyman,R.,Synthesis of thiol-derivatized gold nanoparticles in a two-phase liquid-liquid system.J.Chem.Soc.,Chem.Commun.1994,(7),801-2)。
近年癌症或細胞病變等的相關疾病越來越多，相關治療方式也衍生出許許多多的藥物，而常見的治療藥物對於人體影響就像兩面刀，不僅對患部的毒殺，也會影響正常器官與細胞。因此有需要針對此問題開發新穎性的藥物載體，來解決藥物對人體不必要傷害與增加精準的藥物傳遞，達到有效的藥物投遞與治療。近年來藥物載體的多元開發，以改善傳統化療藥物對人體正常細胞的毒殺與減少用藥量為出發點，結合標靶治療的模式，設計出具標的型藥物載體。此構想加強了藥物控制釋放的作用，也提供癌症治療中更安全的選項(Yu,M.K.；Park,J.；Jon,S.,Targeting strategies for multifunctional nanoparticles in cancer imaging and therapy.Theranostics 2012, 2(1),3-44)。
奈米藥物載體的研究過程中發現大多數奈米粒子會聚積於腫瘤組織中。此病理生理特徵主要是因為癌症腫瘤組織在增長的過程中，體積大於2mm時會因營養變的有限，繼續生長的需求下，釋放出促進血管新生因子(proangiogenic factors)使血管新生以提供所需養分與氧氣。催生的新生血管其細胞間隙約100nm~2μm左右，較正常細胞間隙來得大，因此容易導致大部分的養分流失。而將奈米粒子設計其小於癌症腫瘤細胞間隙之粒徑大小，藉由血液的循環，能有效的使奈米粒子停留累積在腫瘤組織中。上述的功能稱為增強滲透和保留效應(EPR效應，enhanced permeability and retention effect)，從而構成被動標靶和選擇性的累積(Acharya,S.；Sahoo,S.K.,PLGA nanoparticles containing various anticancer agents and tumour delivery by EPR effect.Adv.Drug Delivery Rev.2011, 63(3),170-183)。因此研究奈米粒子在腫瘤間隙成了近年來重要機制之一。
被動標靶雖然有著特定效果。然而，被動標靶的方式存在著一些限制性，針對利用EPR效應並不是都適用所有癌細胞，因為細胞間隙的大小會隨著腫瘤的類型和狀態而有所不同，這缺乏準確控制性可能造成藥物損失與誘使癌細胞產生抗藥性，在治療效果上導致不可以避免的降低。為改善被動標靶系統限制上的缺失，在奈米粒子表面上附加靶向能力，而此系統通稱「主動標靶」，其通過配體受體的相互作用可以結合到靶細胞上，誘導受體引導的內吞作用和細胞內藥物釋放。這種傳遞藥物的策略實現了專一性特定結合與提高藥物傳遞的效率，同時也可以避免掉非特異性結合和抗藥性的產生。根據臨床試驗，目前已有一些針對性的輸送系統，如CALAA-01、MBP426等。配體引導的標靶技術結合奈米藥物載體的能力其潛力已成為各方研究的重點。
癌症或相關的病變越來越來常見，發病原因的找尋一直是人們最佳的方向，而對於癌症治療上，早期著重於手術切除患部，而手術的方式往往有許多問題存在，如術後的癌細胞轉移以及對於癌症後期患者體力無法支持手術的消耗等問題。近幾年來學者們尋找與研究，得到一些對於治療上具有毒殺效果的化合物。雖然化合物能部分有效的毒殺癌細胞卻也相對的傷害了正常細胞與器官的運作，而為有效達到毒殺效果往往需要大量投 藥，進而導致患者的不適與噁心等症狀，對於癌症的治療一直讓人覺得是一大挑戰。為了能減低藥物對人體的傷害，首先減低藥量且又能有效的使藥物達到毒殺治療的效果，使病患能減輕治療過程中的不適與內心的恐慌。為此方向開發了許多藥物載體來包覆攜帶藥物進入人體，以達到效果。經由藥物的治療來達到癌細胞的毒殺，而為了確認藥物是否能使癌腫瘤的變小，需要利用顯影的方式來觀察確認。在觀察的過程中有時因觀察方式的需要，另外注射了顯影劑來達到其效果，往往對於患者也是另一種傷害。因此需要一種具高生物相容性，能有效包覆攜帶藥物且能有效追蹤的標靶藥物載體。
Mieszawska等人雖然已合成出修飾有金奈米團簇的PLGA奈米球(Mieszawska,A.J.；Gianella,A.；Cormode,D.P.；Zhao,Y.；Meijerink,A.；Langer,R.；Farokhzad,O.C.；Fayad,Z.A.；Mulder,W.J.M.,Engineering of lipid-coated PLGA nanoparticles with a tunable payload of diagnostically active nanocrystals for medical imaging.Chem.Commun.(Cambridge,U.K.) 2012,48(47),5835-5837)，但其設計上的缺點在於PEG係以塗佈方式(coating)分佈在奈米球表面而未與PLGA有化學上的鍵結，因此結構不夠穩定，容易與奈米球脫離，因此若接上標靶分子效果不佳，無法作為標靶載體來應用。且其設計上需要另外使用量子點(quantum dots,QDs)作為螢光來源。
本發明之目的係製備一種具高生物相容性，能有效包覆攜帶藥物且能 有效追蹤的標靶藥物載體，方法是利用聚乳酸-甘醇酸(PLGA)為主體鍵結上由(±)-α-心肌黄酶((±)-α-Lipoamide)為主要結構製備而成的金奈米團簇(AuNCs)，合成PLGA-AuNCs，再與同樣以PLGA為主要的結構鍵結上親水性質的聚乙二醇(PEG)合成的PEG-PLGA複合成奈米粒子，利用PEG的親水性質來增加奈米載體在體內循環的時間以提升藥物釋放時間。兩種不同修飾的PLGA奈米粒子，依所需要的目的做不同比例的複合，進而達到有效包覆攜帶藥物且又能利用奈米金團簇高生物相容性、發光性來有效追蹤藥物及治療過程的觀察。
本發明係關於多功能性之腫瘤標靶奈米載體，即奈米載體(nanocarrier)同時具有攜帶抗癌藥物、腫瘤標定與奈米載體的影像追蹤等功能。此腫瘤標靶奈米載體組成包含一近紅外螢光(near-IR)與電腦斷層掃描(CT)影像追蹤系統的金奈米團簇(AuNCs)接枝在聚乳酸-甘醇酸(poly(lactic-co-glycolic acid)；PLGA)之共聚高分子末端成PLGA-AuNC與PLGA接枝上聚乙二醇(PEG)合成出PLGA-mPEG兩段式共聚高分子，依兩者不同比例混合析出複合型奈米粒子。故發明目標有(1)合成與分析近紅外光之金奈米團簇。(2)合成與鑑定PLGA接枝金奈米團簇。(3)合成與鑑定PLGA接枝PEG。(4)依PLGA-AuNC與PLGA-mPEG兩者不同比例混合析出複合型奈米粒子，並評估其奈米粒子特性與包覆攜帶藥物的能力。(5)評估此多功能性之腫瘤標靶奈米載體之影像追蹤能力，並結合抗PEG抗體對PEG之專一性標靶能力評估。其中近紅外螢光金奈米團簇是以(±)-α-心肌黄酶模板來合成，並利用(±)-α-心肌黄酶尾端的胺與PLGA尾端的羧基進行醯 胺鍵的鍵結合成接枝反應。而PLGA-AuNC與PLGA-mPEG兩種合成之化學結構是以核磁共振(NMR)及紅外線光譜儀(FTIR)來檢定，而奈米粒子大小分布是利用ζ電位-粒徑測定儀分析，複合奈米粒子的型態則利用穿透式電子顯微鏡(TEM)觀察。體外細胞評估則以MTT活性討論其HeLa細胞株及3T3細胞株之毒性，腫瘤細胞吞噬試驗是以HeLa3細胞株進行，吞噬試驗設計以包覆一螢光劑(FITC)為模擬藥物，經由雷射共軛焦顯微鏡(Laser Scanning Confocal Microscopy，簡稱LSCM)觀察AuNC與FITC螢光劑之螢光訊號與細胞吞噬特性，確認複合型奈米粒子具親油性藥物之包覆能力與近紅外光的螢光追蹤評估。動物體內實驗是利用活體分子影像系統(Caliper IVIS system)，將此複合型奈米粒子注射進入小鼠體內，觀察其中金奈米團簇的螢光與CT顯影的能力評估。初步結果顯示，由NMR光譜鑑定此PLGA-AuNC與PLGA-mPEG兩種合成之化學結構正確。粒徑分析此複合型奈米粒子尺寸在100~120nm範圍。TEM觀察複合型奈米粒子中確實有金奈米團簇分布在其中。細胞活性評估顯示此複合型奈米粒子均無細胞毒性，且在共軛焦顯微鏡觀察下，確認此複合型奈米粒子能有效攜帶親油性藥物螢光劑進入HeLa細胞內部與金奈米團簇在近紅外光追蹤的能力，此結果已可對未來腫瘤細胞治療目的的具有很好的可行性。目前在IVIS的活體螢光影像的觀察下，也確認此複合型奈米粒子在體內螢光具有生物體腫瘤PEG抗體標靶能力與近紅外光追蹤成像之能力。對於CT影像的對比性，已在體外高濃度下顯示具有對比性。本發明成功合成出高生物相容性與多功能性之腫瘤標靶奈米載體，即其同時具有攜帶油溶性藥物、PEG抗體腫瘤標定與奈米載體的近紅外光、CT影像追蹤等功能。
除非本文另外界定，否則本發明所用之科學及技術術語應具有一般熟習此項技術者通常所理解之含義。該等術語之含義及範疇應為清晰的；然而，在任何潛在歧義之情況下，本文所提供之定義優於任何辭典或外在定義。
本文中所提及之任何參考文獻，其全文皆併入本文中作為參考。
除非本文另外需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。
因此，本發明提供一種同時具備有近紅外光及CT影像追蹤能力的奈米粒子載體，其包含鍵結有金奈米團簇(AuNCs)的疏水性分子及鍵結有親水性分子的疏水性分子，其中該親水性分子係位於該奈米粒子外層且該金奈米團簇係被包覆於該奈米粒子內。該疏水性分子可為例如聚乳酸-甘醇酸(poly(lactide-co-glycolide),PLGA)、聚己內酯(polycaprolactone,PCL)、聚戊內酯(polyvalerolactone,PVL)、聚乳酸(polylactic acid,PLA)、聚丁內酯(polybutyrolactone,PBL)、聚甘醇酸(polyglycolide,PLG)或聚丙內酯(polypropiolactone,PPL)；該親水性分子可為例如聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)、玻尿酸、聚麩胺酸(PGA)、聚葡萄糖(dextran)、幾丁聚醣(chitosan)或明膠。在一實施例中，該鍵結有金奈米團簇的疏水性分子係鍵結有金奈米團簇的聚乳酸-甘醇酸(PLGA-AuNCs)且鍵結有親水性分子的疏水性分子係鍵結有聚乙二醇的聚乳酸-甘醇酸(PLGA-mPEG)。一般而言，該奈米粒子之粒徑會介於20~300nm；在一實施例中，該奈米粒子之粒徑係介於90~140nm。本發明之奈米粒子載體內部可進一步包覆一活性物 質。該活性物質可為例如藥物、蛋白質、多醣體、放射性物質、生長因子或基因，其中該藥物較佳係親脂性藥物。本發明之奈米粒子載體外層的親水性分子上可進一步連結一功能性分子，該功能性分子可為例如一具有靶向能力之靶向分子。
本發明亦提供一種製備如上所述之奈米粒子載體的方法，其包含(a)將鍵結有金奈米團簇的疏水性分子與鍵結有親水性分子的疏水性分子溶解於有機溶劑中得出一混合物；及(b)加入水至該混合物中。該疏水性分子可為例如聚乳酸-甘醇酸(poly(lactide-co-glycolide),PLGA)、聚己內酯(polycaprolactone,PCL)、聚戊內酯(polyvalerolactone,PVL)、聚乳酸(polylactic acid,PLA)、聚丁內酯(polybutyrolactone,PBL)、聚甘醇酸(polyglycolide,PLG)或聚丙內酯(polypropiolactone,PPL)；該親水性分子可為例如聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)、玻尿酸、聚麩胺酸(PGA)、聚葡萄糖(dextran)、幾丁聚醣(chitosan)或明膠。在一實施例中，該鍵結有金奈米團簇的疏水性分子係鍵結有金奈米團簇的聚乳酸-甘醇酸(PLGA-AuNCs)且鍵結有親水性分子的疏水性分子係鍵結有聚乙二醇的聚乳酸-甘醇酸(PLGA-mPEG)。該PLGA-AuNCs與PLGA-mPEG之混合比例範圍可為例如約1：10至10：1或約1：5至5：1；在一實施例中，該PLGA-AuNCs與PLGA-mPEG之混合比例範圍為約1：2至2：1。該方法中的有機溶劑可為例如二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基亞碸(DMSO)、四氫呋喃(THF)、丙酮、二氯甲烷或氯仿。該方法中水與有機溶劑的體積比可為例如約1：20至20：1；在一實施例中，該水與有機溶劑的體積比為約4：1。該方法中，步驟(a)可進一步 包含將一活性物質加入該混合物中。該活性物質可為例如藥物、蛋白質、多醣體、放射性物質、生長因子或基因，其中該藥物較佳係親脂性藥物。此外，該方法中的步驟(a)之親水性分子上還可進一步連結一功能性分子，該功能性分子可為例如一具有靶向能力之靶向分子。
圖1為金奈米團簇合成反應示意圖。
圖2為PLGA-mPEG合成反應示意圖。
圖3為PLGA-AuNCs合成反應示意圖。
圖4為奈米化示意圖。
圖5顯示螢光光譜儀檢測金奈米團簇的結果。
圖6為金奈米團簇的TEM顯影圖。
圖7為PLGA、PLGA-mPEG的奈米粒子螢光圖譜。
圖8為複合型奈米粒子螢光圖譜。
圖9為MTS試驗中金奈米團簇對HeLa細胞株活性影響之結果。
圖10為MTS試驗中金奈米團簇對3T3細胞株活性影響之結果。
圖11為MTS試驗中複合型奈米粒子對HeLa細胞株活性影響之結果。編 號1~5分別表示PLGA、PLGA-mPEG、PLGA-AuNCs：PLGA-mPEG(2：1)、PLGA-AuNCs：PLGA-mPEG(1：1)及PLGA-AuNCs：PLGA-mPEG(1：2)的組別。
圖12為MTS試驗中複合型奈米粒子對3T3細胞株活性影響之結果。編號1~5分別表示PLGA、PLGA-mPEG、PLGA-AuNCs：PLGA-mPEG(2：1)、PLGA-AuNCs：PLGA-mPEG(1：1)及PLGA-AuNCs：PLGA-mPEG(1：2)的組別。
圖13為PLGA-mPEG奈米粒子對抗PEG抗體的專一性結合測試結果。
圖14為PLGA-AuNCs：PLGA-mPEG(1：1)奈米粒子對抗PEG抗體的專一性結合測試結果。
圖15為PLGA奈米粒子包覆FITC對(A)無抗體及(B)帶有抗PEG抗體之HeLa細胞胞吞試驗的螢光影像。
圖16為PLGA-AuNCs：PLGA-mPEG(1：2)奈米粒子包覆FITC對(A)無抗體及(B)帶有抗PEG抗體之HeLa細胞胞吞試驗的螢光影像。
圖17為PLGA-AuNCs：PLGA-mPEG(1：1)奈米粒子包覆FITC對(A)無抗體及(B)帶有抗PEG抗體之HeLa細胞胞吞試驗的螢光影像。
圖18為活體動物螢光影像。
圖19為金奈米團簇與PLGA-AuNCs：PLGA-mPEG(1：1)奈米粒子的微 型CT顯影圖。
圖20為本發明之奈米粒子載體之示意圖。
本發明可能以不同的形式來實施，並不僅限於下列文中所提及的實例。下列實施例僅作為本發明不同面向及特點中的代表。
實施例1： 材料與方法： 金奈米團簇(AuNCs)的製備方法
為了合成表面修飾有單層硫胺分子的金奈米團簇，本方法係參考Shang,L.；Azadfar,N.；Stockmar,F.；Send,W.；Trouillet,V.；Bruns,M.；Gerthsen,D.；Nienhaus,G.U.,One-Pot Synthesis of Near-Infrared Fluorescent Gold Clusters for Cellular Fluorescence Lifetime Imaging.Small 2011,7(18),2614-2620中所述之方法。使用(±)-α-心肌黄酶為主要的分子，取適量(±)-α-心肌黄酶(購自Sigma-Aldrich)，溶於二甲基甲醯胺(DMF)溶劑中，移入反應瓶中。緩慢加入預先配製完成NaOH(購自J.T.Baker)水溶液，攪拌5-60分鐘，使(±)-α-心肌黄酶完成開環。以鹼性水溶液開環完成後，同樣緩慢滴加預先配製完成的氯化金(Ⅲ)三水合物(Gold(III)chloride trihydrate,HAuCl4)(購自Sigma-Aldrich)水溶液，攪拌5分鐘後，將反應瓶移至超音波震盪器4℃環境下進行震盪，震盪過程中，緩慢的滴加入硼氫化鈉(NaBH4)(購自 Sigma-Aldrich)水溶液。在此以震盪方式進行反應，主要是為了減緩NaBH4加入時快速產生的氧化還原反應，以避免金團簇快速聚集生成使顆粒過大而導致實驗失敗。完成此步驟後，將反應瓶移出超音波震盪器，以一般磁石攪拌器，攪拌反應10-60分鐘。反應完成後加入等體積甲醇，以減壓濃縮機進行濃縮，以DMP透析2-4天，得到以(±)-α-心肌黄酶為表面修飾的金奈米團簇。上述合成反應示意圖係如圖1所示。
PLGA-mPEG的製備方法
本方法使用的材料是一端為甲氧基而另一端為胺的雙異官能基的聚乙二醇，分子量大約為2015道爾頓(Dalton)，而另一材料採用L-乳酸：甘醇酸=50：50的PLGA(購自Sigma)，分子量介於7000~17000道爾頓。實驗取mPEG、PLGA與N,N'-二環己基碳二亞胺(DCC)於四氫呋喃/二甲基甲醯胺有機溶劑下進行醯胺化反應，得到PLGA-mPEG兩性二嵌段(di-block)共聚高分子產物。製備步驟係參考Saadati,R.；Dadashzadeh,S.；Abbasian,Z.；Soleimanjahi,H.,Accelerated Blood Clearance of PEGylated PLGA Nanoparticles Following Repeated Injections：Effects of Polymer Dose,PEG Coating,and Encapsulated Anticancer Drug.Pharm.Res.2013,30(4),985-995中所述之方法。以PLGA為主體材料，取PLGA與N,N'-二環己基碳二亞胺(DCC，分子量206.33)溶於二甲基甲醯胺(DMF)：四氫呋喃(THF)的有機溶劑中，攪拌反應6~12小時，再加入OMe-PEG-H2N(分子量2015，購自Laysan Bio Inc.)，攪拌進行醯胺化反應6~12小時。完成反應後進行純化，將溶液移入12,000分子量的透析袋中，以DMF透析1天，再使用二次水透析3~4天。透析完 成後再由冷凍乾燥得到白色粉末的PLGA-mPEG。上述合成反應示意圖係如圖2所示。
PLGA-AuNCs的製備方法
本方法採用L-乳酸：甘醇酸=50：50的PLGA(購自Sigma)，分子量介於7000~17000道爾頓。實驗取300~600mg PLGA加入金奈米團簇懸浮溶液，以DCC於THF/DMF有機溶劑下進行醯胺化反應得到PLGA-AuNCs共聚高分子產物。製備步驟係參考Mieszawska,A.J.；Gianella,A.；Cormode,D.P.；Zhao,Y.；Meijerink,A.；Langer,R.；Farokhzad,O.C.；Fayad,Z.A.；Mulder,W.J.M.,Engineering of lipid-coated PLGA nanoparticles with a tunable payload of diagnostically active nanocrystals for medical imaging.Chem.Commun.(Cambridge,U.K.) 2012,48(47),5835-5837中所述之方法。以PLGA為主體材料，取PLGA與DCC溶於DMF：THF中，攪拌反應6~12小時，再加入(±)-α-心肌黄酶為表面修飾的金奈米團簇約100μL後再進行攪拌進行醯胺化反應6~12小時。完成反應後進行純化，將溶液移入12,000分子量的透析袋中，以DMF透析1-3天，再使用二次水透析3~4天。透析完成後再由冷凍乾燥得到微褐的白色粉末的PLGA-AuNCs。
奈米粒子載體的製備方法
將合成出的PLGA-mPEG及PLGA-AuNCs依不同比例進行複合形成奈米粒子，以觀察其PEG對抗PEG抗體的標靶能力及奈米金團簇影像追蹤能力。複合比例如下表1所示。
依表1所呈現的比例，進行奈米化試驗，試驗中奈米粒子溶液濃度約為25mg/5mL。首先秤取總克數25mg的材料，以1mL DMF溶劑溶解攪拌均勻複合，再以1：4的比進行奈米化步驟，取4mL二次水(DD water)一次性快速加入反應瓶中，由於二次水體積比DMF溶劑來的大，產生了相轉變的效應，使得溶劑中的含PLGA結構的疏水端，物理性膠聯組裝形成奈米粒子，如圖4所示。
NMR核磁共振測定
取0.5mg乾燥的PLGA、mPEG、PLGA-mPEG、PLGA-AuNCs粉末，溶於0.6mL的氯仿-d(chloroform-d)中，置於NMR管中，以1H NMR核磁共振光譜儀(Varian Gemini-200)進行1H NMR核磁共振光譜分析，以高分子材料官能基訊號位置作比對確認合成之結構。
穿透式電子顯微鏡(TEM)觀察
以TEM觀察金奈米團簇的型態及粒徑大小以及觀察PLGA-AuNCs奈米粒子中金奈米團簇的分布情形。將上述金奈米團簇、PLGA-AuNCs奈米粒子滴在TEM觀察用銅網上，真空乾燥2天，最後放入穿透式電子顯微鏡中觀察。
螢光能力檢測
利用螢光光譜儀有效檢測金奈米團簇及複合型奈米粒子中放光效應。由此檢測可獲得其放光波長波帶和放光強度，以提供後續體外細胞胞吞試驗及活體分子影像的條件設計評估。
金奈米團簇及奈米粒子粒徑分析
利用ζ電位-粒徑測定儀(Zetasizer 3000HSA)檢測奈米化完成的奈米粒子溶液中的奈米粒子粒子大小。進行三重覆試驗，以確認粒子大小，並探討不同複合比例所造成的影響。
細胞毒性與細胞胞吞能力評估
金奈米團簇及不同比例複合的奈米粒子對細胞毒性與細胞胞吞能力的評估是使用取自ATCC(全球非營利性生物資源中心)的HeLa(ATCC®CCL-2 TM)及3T3(ATCC®CRL-2593)細胞株做為評估之對象，3T3細胞株是小鼠的纖維母細胞，在試驗中設計為正常細胞組來評估。HeLa細胞株是人類子宮頸癌的癌症細胞。本研究探討奈米粒子與抗PEG抗體的標的能力，將抗體基因轉殖在HeLa細胞上，在此細胞毒性試驗中增加對HeLa細胞的測試。
將HeLa細胞株及3T3細胞株復甦培養於基礎培養基(低葡萄糖的DMEM(購自GIBCO)，添加有10%胎牛血清(FBS，購自Biological Industries)、1.5μl/ml碳酸氫鈉、5%青黴素/鏈黴素(P/S))，並培養於37℃、5% CO2的培養箱內，待細胞生長後進行繼代培養。
將HeLa細胞、3T3細胞(5*103顆/200μL)、奈米金團簇及不同比例複合的奈米粒子(20μg/1mL)培養於基礎培養基中3天及5天後，以MTS分析試驗(MTS assay)進行細胞生長活性測試。首先移除含金奈米團簇或奈米粒子的基礎培養基，以PBS溶液潤洗2次，加入100μl培養液，最後加入20μl的MTS試劑反應1小時，利用ELISA分析儀以490nm波長的光測定。
體外標靶能力試驗
本研究使用高雄醫學大學生命科學院生物系鄭添祿教授實驗室所開發的抗PEG抗體對具PEG修飾的奈米粒子進行標靶能力測試。先將抗PEG抗體轉譯到癌症細胞上，將奈米粒子等修飾上PEG抗體，使之具有與癌症細胞表面的抗體或是接受器具有專一性結合的標靶能力。
取出剛合成之複合型奈米粒子膠體溶液後，分別稀釋成1倍、0.5倍、0.25倍、0.125倍的待測膠體溶液，另外製備做為對照組的純PLGA奈米粒子，取20mg PLGA原料以相同奈米析出法製作出無PEG的PLGA奈米膠體溶液做為實驗對照組，PLGA奈米膠體溶液對照組同樣分別稀釋成10倍、30倍、90倍、270倍後，加入已塗佈(coating)上PEG抗體的96孔培養盤 中，將配好的奈米懸浮膠體材料以每孔50μl放入96孔培養盤中於室溫下培養1小時，接者以PBS清洗，然後加入二次抗體於室溫下培養1小時，繼續以PBS清洗，再以鏈霉抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶(streptavidin-HRP)於室溫下染1小時，以PBS清洗，最後在避光環境下加入ABTS，於室溫反應15分鐘後，開始測定吸光值OD 405nm。
細胞胞吞試驗
取20mg的高分子材料溶於DMF中攪拌，待完全溶解後，取2.5mg的螢光異硫氰酸鹽(FITC)(購自Sigma-Aldrich)加入，持續攪拌，同時應注意避光，最後瞬間加入二次水後持續攪拌約1小時，取出溶液放入分子量1000之透析膜中透析，先以二次水透析約2小時，後以DMF透析約4小時，最後再以水持續透析約兩天。將準備好的奈米膠體溶液材料加入無抗體及帶抗PEG抗體的HeLa細胞30分鐘後，以PBS緩衝液與二次水清洗，然後染DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)(購自Sigma-Aldrich)後進行螢光顯微鏡照影。
活體分子影像追蹤測定
本方法中探討金奈米團簇與複合型奈米粒子在活體動物中的螢光影像追蹤能力，利用IVIS系統(IVIS 200 Imaging System)進行測試。將除毛後的BALB/c品系小鼠，由背部注射0.5~1.0mL的金奈米團簇及(1：1)複合型的奈米粒子，進行比較。
微型CT成像
以動物實驗用微型CT檢測金奈米團簇與PLGA-AuNCs奈米粒子。以140keV及250mA條件，以每一片0.67厚度切256片，觀察與PBS之間的差異性。
結果： 金奈米團簇合成鑑定
首先以螢光光譜儀檢測以(±)-α-心肌黄酶合成的金奈米團簇，用310nm的激發波長對金奈米團簇進行激發，收500nm後放光訊號，得出圖5結果。由圖5可以得知，金奈米團簇的放光屬於一較寬的波段，其最高放光區間為700~720nm的位置，已落於600nm之後，此波段區間不僅能減少生物基質在放光波段背景的干擾，在細胞螢光追蹤範圍內也能在有效觀察到，符合本實驗所需求在細胞觀察或動物體內的影像追蹤用的波段。若將金奈米團簇放至可見光及UV燈管下，經由肉眼的觀察，可以發現明顯的差異性，日光燈下金奈米團簇呈現一較深褐色的膠體溶液，而將金奈米團簇移入UV燈觀察時，可由肉眼明顯觀察到紅光的產生，由簡單的螢光檢測可以確認本發明合成出一具螢光影像追蹤用的奈米金團簇。
再將金奈米團簇稀釋後，以TEM穿透式電子顯微鏡觀察金奈米團簇的形狀及粒子大小。由圖6中可看出金奈米團簇呈現圓形粒狀，其粒徑大小約為10nm以下。
複合型奈米粒子大小檢測
由下表2可得知，奈米粒子平均大小為118nm，最大達132nm，最小91.3nm。從表中可發現PLGA-mPEG所佔的比例越高，所形成的奈米粒子越小，相對於PLGA-AuNCs所佔的比例越高，所形成的奈米粒子越大。對此進一步探討PEG親水性的特性，可以有趨勢的使以PLGA為主體的奈米粒子降低粒徑大小。
複合型奈米粒子螢光檢測
將奈米粒子膠體溶液放至日光燈及UV燈下觀察，經由肉眼觀察下可以看出PLGA、PLGA-mPEG的奈米粒子膠體溶液，日光燈下顏色為純白較微透明，但放至UV燈下，並無有螢光的產生。進一步利用螢光光譜儀檢測探討，如圖7所示。圖7中可證實PLGA、PLGA-mPEG本身在700~720nm波段並無螢光放光的訊號，因此可以確認PLGA和mPEG對於金奈米團簇的螢光結果並不會造成影響。
同樣將PLGA-AuNCs：PLGA-mPEG(2：1)、PLGA-AuNCs：PLGA-mPEG(1：1)及PLGA-AuNCs：PLGA-mPEG(1：2)等3組放至日光燈下觀察，可以看出膠體溶液顏色與PLGA、PLGA-mPEG相比較為偏褐色，且PLGA-AuNCs比例佔的越高，越偏近褐色。移至UV燈下，可以觀察到螢光放光能力PLGA-AuNCs：PLGA-mPEG(2：1)>PLGA-AuNCs：PLGA-mPEG(1：1)>PLGA-AuNCs：PLGA-mPEG(1：2)，再經由螢光光譜儀的檢測可得到圖8。經由圖8可以看到700~720nm放光波段，具有一明顯波峰，與圖5所呈現的波峰位置相同，因此可以更加確認PLGA-AuNCs奈米粒子的成功合成。
金奈米團簇細胞活性試驗
將金奈米團簇分別稀釋1、10、100倍濃度分別對HeLa細胞株及3T3細胞株在96孔培養盤中(5*103顆/200μL)培養，對照組為只有細胞。觀察24小時及72小時並進行MTS分析試驗，所測得之吸光值代表粒線體的活性，亦間接代表活細胞的數目。圖9及圖10中可看出加入金奈米團簇後的72小時，相較24小時，細胞能持續成長且與對照組高度相當，由此結果可以確認金奈米團簇不論是對正常細胞或癌細胞都沒抑制或毒殺的產生。
複合型奈米粒子細胞活性試驗
將奈米粒子稀釋至約(20μg/1mL)濃度再分別對HeLa細胞株及3T3細胞株在96孔培養盤中(5*103顆/200μL)培養，對照組為只有細胞。觀察24小時及72小時並進行MTS分析試驗。圖11、圖12中可看出加入不同的奈米粒 子後的72小時，相較24小時，細胞能持續成長且與對照組高度相當，由此結果可以確認奈米粒子不論是對正常細胞或癌細胞都沒抑制或毒殺的產生。
ELISA測定奈米粒子對於抗PEG抗體專一性結合的能力
以ELISA測試PLGA-mPEG、PLGA-AuNCs：PLGA-mPEG(1：1)奈米粒子以及對照組PLGA奈米粒子對於抗PEG抗體專一性結合的能力。圖13及圖14實驗結果中，PLGA-mPEG奈米粒子與抗PEG抗體具有高度的專一性結合能力，相對的做為對照組的PLGA奈米粒子則與空白的對照組沒有差別，可以證明本發明之PLGA-mPEG奈米粒子具有與抗PEG抗體專一性結合的能力。由圖13及圖14相互比較得知PLGA-AuNCs：PLGA-mPEG(1：1)複合型奈米粒子中雖然PLGA-mPEG所佔比例只有一半濃度，但依舊具有與抗PEG抗體專一性結合的能力，進一步證實混合型奈米粒子具有標靶專一性功能。
體外螢光顯微鏡評估細胞吞噬
以PLGA、PLGA-AuNCs：PLGA-mPEG(1：2)、PLGA-AuNCs：PLGA-mPEG(1：1)三種奈米粒子對(A)無抗體及(B)帶有抗PEG抗體的HeLa細胞檢測奈米粒子包覆、標靶、影像追蹤能力試驗。以FITC為藥物模型包覆進入奈米粒子中，奈米化及純化後，加入進行細胞胞吞試驗，給與停留時間為30分鐘，再以PBS沖洗，進行固定。為分辨螢光位置，以DAPI染取細胞核。最後經由雷射共軛焦顯微鏡觀看螢光影像。圖中分別呈現FITC-綠光、DAPI-藍光、AuNCs-紅光。實驗結果中，圖15為PLGA奈米粒子包覆FITC，經由與DAPI之間的相對位置可以確認，30分鐘後奈米粒子能有效進入細胞質中。其與 圖16及圖17相比，FITC的累積量來的較少且並無紅光的影像，主要是因為單純PLGA所形成的奈米粒子對抗PEG抗體不會產生專一性結合，因此聚集相對PEG修飾的奈米粒子來的不明顯，也沒有金奈米團簇修飾，所以沒有紅光的螢光影像。將圖16及圖17作比較，可以明顯看到金奈米團簇在700~720nm所放出的紅色螢光影像，PLGA-AuNCs：PLGA-mPEG(1：1)的紅色螢光影像比PLGA-AuNCs：PLGA-mPEG(1：2)奈米粒子大且有明顯量聚積。圖17中以FITC所聚積的亮度可以看出，不具抗PEG抗體的HeLa細胞與具抗PEG抗體的HeLa細胞之間，同樣的試驗時間，卻有明顯差異的累積量，這是由於PEG對抗PEG抗體上的差異。而這聚積的差異在金奈米團簇的紅光波段能更加明顯的證實。實驗結果中可以證實，PLGA-AuNCs：PLGA-mPEG複合型奈米粒子經由抗PEG抗體對PEG結構專一性的標靶能力而具有較快且較高的奈米粒子的累積，具有包覆藥物攜帶進入細胞質和通過抗PEG抗體達到標靶作用的能力，並可利用奈米粒子上金奈米團簇作為影像追蹤的影像探針。
活體中的分子螢光影像追蹤
進一步利用IVIS系統來做活體螢光影像追蹤試驗，以確認PLGA-AuNCs：PLGA-mPEG複合型奈米粒子是否在活體模型下具有螢光成像的能力。先將PLGA-AuNCs：PLGA-mPEG(1：1)複合型奈米粒子及金奈米團簇分別抽取至針筒中放至IVIS下，以465nm激發，收600nm後的放光波段，可以發現金奈米團簇本身由於無PLGA的包覆，其產生的螢光強度比PLGA-AuNCs：PLGA-mPEG(1：1)複合型奈米粒子來得高。將除毛後的BALB/c品系小鼠， 由背部注射0.5~1.0mL的金奈米團簇及PLGA-AuNCs：PLGA-mPEG(1：1)複合型奈米粒子，進行比較。分別觀察注射後24小時及72小時。圖18中，可以明顯看到金奈米團簇的螢光強度較PLGA-AuNCs：PLGA-mPEG(1：1)複合型奈米粒子的螢光強度來得高，此結果與注射前所得結果一樣，但這也證實金奈米團簇經由修飾接枝上PLGA後仍然具有螢光顯影之能力，且由圖18也可以證明，金奈米團簇及PLGA-AuNCs：PLGA-mPEG(1：1)複合型奈米粒子，對動物模型注射後並不會產生任何不適與造成死亡，且螢光停留時間可達三日以上，是一適合做為影像追蹤與藥物治療使用之材料。
微型CT檢測
此次實驗是為檢測未來在醫學上在金奈米團簇應用於人體的可能性，以取代現有的顯影劑。將金奈米團簇與二次水(DDW)以0.6mL的微量試管裝取，放至動物實驗用微型CT中，由圖19中的上圖可以看出金奈米團簇與二次水(DDW)所產生出的灰階影像，明顯的金奈米團簇有一較高的灰階值。再將PLGA-AuNCs：PLGA-mPEG(1：1)複合型奈米粒子以同樣的條件與二次水(DDW)作成像比較。由圖19中的下圖可以看到，金奈米團簇所呈現的影像灰階同樣有一較高的灰階值，且與上圖相比，金奈米團簇與PLGA-AuNCs：PLGA-mPEG(1：1)複合型奈米粒子並無明顯差異，並不像螢光顯影中，金奈米團簇經由PLGA包覆所產生的螢光差異。由此可證實金奈米團簇或是PLGA-AuNCs：PLGA-mPEG(1：1)複合型奈米粒子皆有助於CT成像。
綜上所述，PLGA-AuNCs：PLGA-mPEG複合型奈米粒子在藥物包覆、專一性標靶及影像追蹤的三效能力，將有助於未來在癌症化療上，包覆化療用疏水性藥物，並通過專一性抗體標的能力，使攜藥的奈米粒子累積於患部，並經由金奈米團簇作為影像探針之能力，提供治療時影像追蹤之用。
一個熟知此領域技藝者能很快體會到本發明可很容易達成目標，並獲得所提到之結果及優點，以及那些存在於其中的東西。本發明中之萃取物、組合物、其製造程序與方法及其用途乃較佳實施例的代表，其為示範性且不僅侷限於本發明領域。熟知此技藝者將會想到其中可修改之處及其他用途。這些修改都蘊含在本發明的精神中，並在申請專利範圍中界定。
本發明的內容敘述與實施例均揭示詳細，得使任何熟習此技藝者能夠製造及使用本發明，即使其中有各種不同的改變、修飾、及進步之處，仍應視為不脫離本發明之精神及範圍。
說明書中提及之所有專利及出版品，都以和發明有關領域之一般技藝為準。所有專利和出版品都在此被納入相同的參考程度，就如同每一個個別出版品都被具體且個別地指出納入參考。
在此所適當地舉例說明之發明，可能得以在缺乏任何要件，或許多要件、限制條件或並非特定為本文中所揭示的限制情況下實施。所使用的名詞及表達是作為說明書之描述而非限制，同時並無意圖使用這類排除任何等同於所示及說明之特點或其部份之名詞及表達，但需認清的是，在本發明的專利申請範圍內有可能出現各種不同的改變。因此，應了解到雖然已 根據較佳實施例及任意的特點來具體揭示本發明，但是熟知此技藝者仍會修改和改變其中所揭示的內容，諸如此類的修改和變化仍在本發明之申請專利範圍內。

Claims (20)

  1. 一種奈米粒子載體，其包含鍵結有金奈米團簇(AuNCs)的疏水性分子及鍵結有親水性分子的疏水性分子，其中該親水性分子係位於該奈米粒子外層且該金奈米團簇係被包覆於該奈米粒子內。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之奈米粒子載體，其中該疏水性分子係聚乳酸-甘醇酸(poly(lactide-co-glycolide),PLGA)、聚己內酯(polycaprolactone,PCL)、聚戊內酯(polyvalerolactone,PVL)、聚乳酸(polylactic acid,PLA)、聚丁內酯(polybutyrolactone,PBL)、聚甘醇酸(polyglycolide,PLG)或聚丙內酯(polypropiolactone,PPL)。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之奈米粒子載體，其中該親水性分子係聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)、玻尿酸、聚麩胺酸(PGA)、聚葡萄糖(dextran)、幾丁聚醣(chitosan)或明膠。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之奈米粒子載體，其中該鍵結有金奈米團簇的疏水性分子係鍵結有金奈米團簇的聚乳酸-甘醇酸(PLGA-AuNCs)且鍵結有親水性分子的疏水性分子係鍵結有聚乙二醇的聚乳酸-甘醇酸(PLGA-mPEG)。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之奈米粒子載體，其中該奈米粒子之粒徑介於20~300nm。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之奈米粒子載體，其內部進一步包覆一活性物質。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之奈米粒子載體，其中該活性物質係藥物、蛋白質、多醣體、放射性物質、生長因子或基因。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之奈米粒子載體，其中該親水性分子上進一步連結一功能性分子。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之奈米粒子載體，其中該功能性分子係一具有靶向能力之靶向分子。
  10. 一種製備如申請專利範圍第1項所述之奈米粒子載體的方法，其包含(a)將鍵結有金奈米團簇的疏水性分子與鍵結有親水性分子的疏水性分子溶解於有機溶劑中得出一混合物；及(b)加入水至該混合物中。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中該疏水性分子係聚乳酸-甘醇酸(poly(lactide-co-glycolide),PLGA)、聚己內酯(polycaprolactone,PCL)、聚戊內酯(polyvalerolactone,PVL)、聚乳酸(polylactic acid,PLA)、聚丁內酯(polybutyrolactone,PBL)、聚甘醇酸(polyglycolide,PLG)或聚丙內酯(polypropiolactone,PPL)。
  12. 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中該親水性分子係聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)、玻尿酸、聚麩胺酸(PGA)、聚葡萄糖(dextran)、幾丁聚醣(chitosan)或明膠。
  13. 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中該鍵結有金奈米團簇的疏水性分子係修飾有金奈米團簇的聚乳酸-甘醇酸(PLGA-AuNCs)且鍵結有親水性分子的疏水性分子係修飾有聚乙二醇的聚乳酸-甘醇酸 (PLGA-mPEG)。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之方法，其中該PLGA-AuNCs與PLGA-mPEG之混合比例範圍為1：10至10：1。
  15. 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中該有機溶劑係二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基亞碸(DMSO)、四氫呋喃(THF)、丙酮、二氯甲烷或氯仿。
  16. 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中該水與有機溶劑的體積比為1：20至20：1。
  17. 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中步驟(a)進一步包含將一活性物質加入該混合物中。
  18. 如申請專利範圍第17項所述之方法，其中該活性物質係藥物、蛋白質、多醣體、放射性物質、生長因子或基因。
  19. 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中步驟(a)之親水性分子上進一步連結一功能性分子。
  20. 如申請專利範圍第19項所述之方法，其中該功能性分子係一具有靶向能力之靶向分子。
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