TW201536316A - 使用抗ｃｇｒｐ抗體之葡萄糖代謝的調節 - Google Patents

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Abstract

本揭示提供預防或治療代謝性障礙的方法。於例示性具體例中，提供投藥抗CGRP抗體的方法，選擇性地組合以第二種製劑，其中使周邊及/或肝臟的葡萄糖利用增高，從而預防或治療與胰島素抗性有關的疾病及障礙。亦提供包含抗CGRP抗體的組成物，選擇性地組合以第二種製劑，其適合供用於投藥以使周邊及/或肝臟的葡萄糖利用增高，以及從而預防或治療與胰島素抗性有關的疾病及障礙。

Description

使用抗CGRP抗體之葡萄糖代謝的調節 相關申請案之揭示
本申請案主張於2014年4月22日提申的美國臨時專利申請案案號61/982,611，(代理人案號43257.3002)，以及於2013年7月3日提申的美國臨時專利申請案案號61/842,745(代理人案號43257.3001)的利益，其中各者皆在此以其之全體併入本文中以作為參考資料。
發明領域
本發明係有關於對抗人類抑鈣素基因系胜肽(Calcitonin Gene Related Peptide)(“CGRP”)之抗體及其片段(包括Fab片段)的用途，該等抗體專一地結合CGRP且促進周邊組織的葡萄糖攝取及利用及/或抑制肝葡萄糖的生成。該方法之例示性具體例可以保留功能性胰臟β細胞，從而使進展成明顯的糖尿病變慢。本發明亦有關於篩選與胰島素抗性有關的疾病及障礙(包括葡萄糖、碳水化合物及脂肪代謝的障礙)之方法，以及預防或治療與胰島素抗性有關的疾病及障礙之方法，其係藉由投藥該等抗體或其片段。
本申請案包括一生物序列表，其業已經由EFS-Web以ASCII格式提交及在此完整地併入本案以作為 參考資料。該ASCII副本係於2014年7月1日創建，檔案名稱為“43257o3074.txt”及檔案大小為203,678位元。
發明背景
抑鈣素基因系胜肽(CGRP)係以長度為37個胺基酸的多功能性神經胜肽形式產生。在人類中存在二種CGRP形式，即CGRP-α與CGRP-β形式，以及其等的活性相近。人類的CGRP-α與CGRP-β相差3個胺基酸，及衍生自不同的基因。CGRP胜肽家族包括澱粉素、腎上腺髓素及抑鈣素，然而其等各具有獨特的受體與生物活性。Doods,H.，Curr.Op.Invest.Drugs，2(9)：1261-68(2001)。CGRP蛋白家族之中，推定的受體結合位址之胺基酸殘基是守恆的，但整體的同源性是不同的。舉例來說，人類的CGRP與澱粉素整體共享46%胺基酸序列同一性，然而人類的抑鈣素與CGRP共享15%胺基酸序列同一性。Wimalawansa,S.J.,Endocrine Rev.17(5)：533-585(1996)。
CGRP的生物效應係經由CGRP受體(CGRP-R)媒介，CGRP受體係由七個跨膜組分聯同受體相關膜蛋白(RAMP)所組成。CGRP-R進一步需要受體組分蛋白(RCP)的活性，其係經由G蛋白與腺苷酸環化酶的高效偶合作用及cAMP生產作用所不可或缺者。Doods,H.，Curr.Op.Invest.Drugs，2(9)：1261-68(2001)。
在周邊神經及中樞神經系統處處均可發現CGRP，以及其會影響心血管、神經及內分泌系統。當CGRP從諸如 三叉神經的多種組織釋出時，其能導致連續的活化且在腦膜內釋出神經胜肽，而媒介神經源性發炎，神經源性發炎的特徵在於血管舒張、血管滲漏及肥大細胞的降解。Durham,P.L.，New Eng.J.Med.，350(11)：1073-75(2004)。據信CGRP在偏頭痛的發生扮演一顯著角色。在偏頭痛的頭痛期間已經發現頸靜脈血液的血漿中之CGRP位準升高，而其他神經胜肽並未升高。Arulmozhi,D.K.等人，Vas.Pharma.,43：176-187(2005)。此外，已經發現CGRP拮抗作用對治療偏頭痛是有效的(Olesen等人，N Engl J Med.2004 Mar 11；350(11)：1104-10)。
除了神經組織之外，已經於心血管組織、腎上腺、腦下腺、腎臟、胰臟，及骨骼內發現CGRP受體。Wimalawansa，S.J.，Endocrine Rev.17(5)：533-585(1996)。於活體外研究中，使用經單離的胰臟組織發現，CGRP與澱粉素二者均會抑制胰島素分泌，以劑量依賴性的方式抵消胰島素刺激的肝醣合成速率，以及妨礙胰島素對經單離的肝細胞的作用(Gomez-Foix等人，Biochem.J.276：607-610,1991)。此外，Leighton及Cooper(Nature,335(6191)：632-5,1988)報導大鼠CGRP-1於活體外會抑制剝離的大鼠(stripped rat)比目魚肌內之基礎及胰島素刺激的肝醣合成速率。
葡萄糖體內恆定(homeostasis)係藉由使激素升糖素之肝醣合成與肝醣分解，以及激素胰島素之組織葡萄糖利用和攝取，達到平衡來維持。葡萄糖存在通常會刺激胰島素產生，胰島素作用為增加葡萄糖進入骨骼肌、肌細 胞、大腦及脂肪細胞的運輸率。胰島素通常也會抑制脂肪細胞內的脂質降解。於糖尿病前期(pre-diabetes)或第2型糖尿病最早的階段，組織發展出胰島素抗性，但是胰臟β細胞會透過分泌增加位準的胰島素來補償。最後隨著肌肉及肝胰島素抗性的增高，耗盡了胰臟β細胞補償的能力而需要外源性胰島素。
由於胰島素合成及葡萄糖利用不良，而無法嚴格調控葡萄糖體內恆定會有很深的代謝性及有害健康的效應。最常見的就是發展出持續的高血糖(高血糖症(hyperglycemia))，導致胰島素抗性及第II型糖尿病的診斷結果。於2011年，在美國25,600,000位年紀為20歲或更大的人們被診斷為具有糖尿病，其中95%的人為第II型糖尿病。(Centers for Disease Control and Prevention.National Diabetes Fact Sheet,2011.Atlanta,GA：Centers for Disease Control and Prevention,US Department of Health and Human Services；2011。)糖尿病病人的醫療成本高達非糖尿病病人平均的二倍，因為增高的心臟病發作、中風、腎臟併發症及神經病變的風險。Imperatore等人，Am J Epidemiol.160(6)：531-539(2004)。在沒有變化的情況下，CDC預測在2050年之前，在美國3個成年人中有1個會患糖尿病。Boyle等人Popul.Health Metr.8：29(2010)。在世界各地，於2011年診斷為具有糖尿病的人口總數估計為3億6千6百萬人，在2030年之前會增加到5億5千2百萬人。(International Diabetes Foundation,IDF Diabetes Atlas,Fifth Ed.)
文獻中還沒有清楚界定CGRP在葡萄糖代謝的角色。經單離的肝細胞之研究中已經顯示出CGRP與澱粉素會抑制胰島素刺激的肝醣合成速率(Gomez-Foix等人，Biochem.J.276：607-610,1991)。Beaumont等人，Br J Pharmacol.Jul；115(5)：713-5(1995)發現CGRP受體不會媒介肌肉葡萄糖代謝的作用。Tanaka等人，Exp.Clin Endocrinol Diabetes 121：280-285(2013)說明於大鼠模式中抗CGRP抗體會引起第一相胰島素分泌稍微延長且使胰島素分泌有小小的改變，然而，該研究未報導該抗體是否會與可能混淆結果的其他抑鈣素家族的胜肽進行交叉反應。最後，先前的U.S.專利業已聲稱顯示CGRP為一種澱粉素促效劑，以及投藥CGRP多肽(和CGRP拮抗劑相反)可以治療糖尿病(參見諸如，U.S.專利第5,641,744號以及第5,175,145號)。
發明概要
於一態樣中，本揭示提供一種於需要其之主體體內增加周邊及/或肝臟的葡萄糖利用之方法，其包含投藥有效量的組成物至該主體，該組成物包含抗人類CGRP抗體或抗體片段。
於一態樣中，本揭示提供一種於需要其之主體體內減少胰島素抗性之方法，其包含投藥有效量的組成物至該主體，該組成物包含抗人類CGRP抗體或抗體片段。
於一態樣中，本揭示提供一種於需要其之主體體 內治療、預防或是控制肥胖症之方法，其包含投藥有效量的組成物至該主體，該組成物包含抗人類CGRP抗體或抗體片段。
於一態樣中，本揭示提供一種於需要其之主體體內達成持續的血糖濃度正常(normoglycemia)之方法，其包含投藥有效量的組成物至該主體，該組成物包含抗人類CGRP抗體或抗體片段。
於一態樣中，本揭示提供一種於需要其之主體體內增高瘦肉組織對體脂肪比率之方法，其包含投藥有效量的組成物至該主體，該組成物包含抗人類CGRP抗體或抗體片段。
本方法可有效治療或延遲第二型糖尿病及/或肥胖症的發病。舉例而言，可以延遲投藥外源性胰島素的需求。本方法可有效預防胰臟β細胞的喪失或使胰臟β細胞的喪失減慢。舉例來說，無意受限於理論，認為該方法可以讓胰島素抗性人類或非人類的動物之胰臟β細胞休息，從而預防功能性胰臟β細胞的喪失。
該主體可能已經診斷為具有糖尿病前期或可能展現出一個或多個發展第II型糖尿病的危險因子。
該主體可以為停經期前期(pre-menopausal)、近停經期(perimenopausal)、停經期或停經期後期。
該主體可能展現出一個或多個糖尿病前期的症狀，例如空腹血糖位準介於100mg/dL和125mg/dl之間；攝食75克葡萄糖溶液或是攝食每公斤體重1.75克葡萄糖的葡 萄糖溶液最大劑量75克，二小時之後血糖位準介於140mg/dL和199mg/dl之間；及/或糖化血紅素介於5.7百分比和6.4百分比之間。
該主體可能展現出一個或多個糖尿病的症狀，例如空腹血糖位準大於125mg/dl；攝食75克葡萄糖溶液或是攝食每公斤體重1.75克葡萄糖的葡萄糖溶液最大劑量75克，二小時之後血糖位準為至少200mg/dL；及/或糖化血紅素為至少6.5百分比。
該主體可能展現出一個或多個發展第II型糖尿病的危險因子，例如第II型糖尿病的家族史；先前診斷為具有第II型糖尿病的一個或多個雙親或兄弟姊妹；血脂異常；總血液三酸甘油酯位準為至少200mg/dL；血液高密度脂蛋白位準小於35mg/dL；肥胖症；身體質量指數大於25kg/m2；妊娠糖尿病之病史；先前生產的嬰兒出生重量大於9lbs(磅)；高血壓；收縮壓為至少140mmHg；舒張壓為至少90mmHg；先前測量空腹血糖位準為至少99mg/dl；血管疾病；多囊性卵巢症候群(Polycystic Ovarian Syndrome)；或是黑色棘皮症(acanthosis nigrican)。
該主體可已經診斷為具有第II型糖尿病。
該主體可能對選自於以下所構成的群組之至少一化合物之治療無反應：類升糖素胜肽1(GLP-1)、艾塞那肽(exenatide-1)、促胰島素分泌素(exendin)、促胰島素分泌素類似物、促胰島素分泌素促效劑、利拉魯肽(Liraglutide)、艾塞那肽LAR(exenatide LAR)、DPP-4拮抗劑、GLP-1受體 促效劑及另一種GLP-1促效劑；或者此化合物對該主體可能是禁忌。
該方法可進一步包含投藥抗人類CGRP抗體或抗體片段之外的一種抗糖尿病劑或抗肥胖劑至該主體。該抗糖尿病劑或抗肥胖劑可以包含下列之一者或多者：澱粉素、澱粉素促效劑、磺醯基脲類、抑鈣素、升糖素、PPAR-γ促效劑類、GPL-1受體促效劑類、二肽基肽酶IV(Dipeptidyl peptidase IV)抑制劑、澱粉素類似物、雙胍類、多巴胺D2受體促效劑類、美格列奈類(meglitinides)、脉葡萄糖苷酶抑制劑、抗異常血脂症膽酸螯隔劑(antidyslipidemic bile acid sequestrant)、促胰島素分泌素(exendin)、促胰島素分泌素類似物、促胰島素分泌素促效劑、胃抑肽(GIP)、腸促胰液素胜肽(incretin peptide)、胰島素、SGLT2抑制劑、葡萄糖再吸收抑制劑、非諾貝特(fenofibrate)、貝特類(fibrate)、抗飢餓肽(ghrelin)抗體或抗體片段、纖維母細胞生長因子受體(FGFR)-1(IIIb)、FGFR-1(IIIc)、抗體或抗體片段，及/或FGFR-4(IIIc)、抗CD38抗體或抗體片段，抗MIC-1抗體，或是MIC-1結合片段，甲福明(metformin)，或是前述任一者之組合。
於一個例示性具體例中，該抗糖尿病劑為甲福明(metformin)。
該方法可以有效使重量減輕。
該經投藥的抗人類CGRP抗體或抗體片段不會使活體內胰島素分泌顯著地增加，例如不會使胰島素分泌顯 著地增加高於活體內正常的生理位準，或是相對於在投藥該抗人類CGRP抗體或抗體片段之前的胰島素分泌位準，其不會使胰島素分泌顯著地增加。
該經投藥的抗人類CGRP抗體或抗體片段不會導致胰臟炎發生率增高，或是與胰臟發炎有關的標記或細胞介素之表現增高。
該組成物可進一步包含一種藥學上可接受的載劑。
該抗人類CGRP抗體或抗體片段可以以介於大約0.1和100.0mg/kg接受者主體的體重之間的劑量，投藥至該主體。
該抗人類CGRP抗體或抗體片段可以為一種人類抗體。該抗人類CGRP抗體或抗體片段可以為非天然存在的。該抗人類CGRP抗體或抗體片段可以為一種為非天然存在的抗體片段。該抗人類CGRP抗體或抗體片段可以為一種人類化抗體或其片段。該抗人類CGRP抗體或抗體片段可以為一種嵌合抗體。
該抗人類CGRP抗體或抗體片段可以專一地結合至一個完整的CGRP多肽或其之片段上相同的線形或構形抗原決定位，及/或競爭結合至相同或重疊的線形或構形抗原決定位，如同選自於以下所構成的群組之抗人類CGRP抗體：(a)Ab1，其包含序列辨識編號：2的VL與序列辨識編號：4的VH；(b)Ab2，其包含序列辨識編號：12的VL與序列辨識編號：14的VH；(c)Ab3，其包含序列辨識編號：22的 VL與序列辨識編號：24的VH；(d)Ab4，其包含序列辨識編號：32的VL與序列辨識編號：34的VH；(e)Ab5，其包含序列辨識編號：42的VL與序列辨識編號：44的VH；(f)Ab6，其包含序列辨識編號：52的VL與序列辨識編號：54的VH；(g)Ab7，其包含序列辨識編號：62的VL與序列辨識編號：64的VH；(h)Ab8，其包含序列辨識編號：52的VL與序列辨識編號：54的VH；(i)Ab9，其包含序列辨識編號：62的VL與序列辨識編號：64的VH；(j)Ab10，其包含序列辨識編號：72的VL與序列辨識編號：74的VH；(k)Ab11，其包含序列辨識編號：82的VL與序列辨識編號：84的VH；(1)Ab12，其包含序列辨識編號：92的VL與序列辨識編號：94的VH；(m)Ab13，其包含序列辨識編號：102的VL與序列辨識編號：104的VH；以及(n)Ab14，其包含序列辨識編號：112的VL與序列辨識編號：114的VH。
該抗人類CGRP抗體或抗體片段可以包含選自於以下所構成的群組之抗體中，所包含的至少一個、至少二個、至少三個、至少四個、至少五個，或全部六個CDRs：(a)Ab1，其包含序列辨識編號：2的VL與序列辨識編號：4的VH；(b)Ab2，其包含序列辨識編號：12的VL與序列辨識編號：14的VH；(c)Ab3，其包含序列辨識編號：22的VL與序列辨識編號：24的VH；(d)Ab4，其包含序列辨識編號：32的VL與序列辨識編號：34的VH；(e)Ab5，其包含序列辨識編號：42的VL與序列辨識編號：44的VH；(f)Ab6，其包含序列辨識編號：52的VL與序列辨識編號：54的VH；(g)Ab7， 其包含序列辨識編號：62的VL與序列辨識編號：64的VH；(h)Ab8，其包含序列辨識編號：52的VL與序列辨識編號：54的VH；(i)Ab9，其包含序列辨識編號：62的VL與序列辨識編號：64的VH；(j)Ab10，其包含序列辨識編號：72的VL與序列辨識編號：74的VH；(k)Ab11，其包含序列辨識編號：82的VL與序列辨識編號：84的VH；(1)Ab12，其包含序列辨識編號：92的VL與序列辨識編號：94的VH；(m)Ab13，其包含序列辨識編號：102的VL與序列辨識編號：104的VH；以及(n)Ab14，其包含序列辨識編號：112的VL與序列辨識編號：114的VH。
該抗人類CGRP抗體或抗體片段可以包含一種多肽序列，其與選自於以下所構成的群組之抗體有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或至少99%的同一性：(a)Ab1，其包含序列辨識編號：2的VL與序列辨識編號：4的VH；(b)Ab2，其包含序列辨識編號：12的VL與序列辨識編號：14的VH；(c)Ab3，其包含序列辨識編號：22的VL與序列辨識編號：24的VH；(d)Ab4，其包含序列辨識編號：32的VL與序列辨識編號：34的VH；(e)Ab5，其包含序列辨識編號：42的VL與序列辨識編號：44的VH；(f)Ab6，其包含序列辨識編號：52的VL與序列辨識編號：54的VH；(g)Ab7，其包含序列辨識編號：62的VL與序列辨識編號：64的VH；(h)Ab8，其包含序列辨識編號：52的VL與序列辨識編號：54的VH；(i)Ab9，其包含序列辨識編號：62的VL與序列辨識編號：64的VH；(j)Ab10， 其包含序列辨識編號：72的VL與序列辨識編號：74的VH；(k)Ab11，其包含序列辨識編號：82的VL與序列辨識編號：84的VH；(1)Ab12，其包含序列辨識編號：92的VL與序列辨識編號：94的VH；(m)Ab13，其包含序列辨識編號：102的VL與序列辨識編號：104的VH；以及(n)Ab14，其包含序列辨識編號：112的VL與序列辨識編號：114的VH。
該抗人類CGRP抗體或抗體片段包含一種選自於以下所構成的群組之抗體：(a)Ab1，其包含序列辨識編號：2的VL與序列辨識編號：4的VH；(b)Ab2，其包含序列辨識編號：12的VL與序列辨識編號：14的VH；(c)Ab3，其包含序列辨識編號：22的VL與序列辨識編號：24的VH；(d)Ab4，其包含序列辨識編號：32的VL與序列辨識編號：34的VH；(e)Ab5，其包含序列辨識編號：42的VL與序列辨識編號：44的VH；(f)Ab6，其包含序列辨識編號：52的VL與序列辨識編號：54的VH；(g)Ab7，其包含序列辨識編號：62的VL與序列辨識編號：64的VH；(h)Ab8，其包含序列辨識編號：52的VL與序列辨識編號：54的VH；(i)Ab9，其包含序列辨識編號：62的VL與序列辨識編號：64的VH；(j)Ab10，其包含序列辨識編號：72的VL與序列辨識編號：74的VH；(k)Ab11，其包含序列辨識編號：82的VL與序列辨識編號：84的VH；(1)Ab12，其包含序列辨識編號：92的VL與序列辨識編號：94的VH；(m)Ab13，其包含序列辨識編號：102的VL與序列辨識編號：104的VH；以及(n)Ab14，其包含序列辨識編號：112的VL與序列辨識編號：114的VH。
該抗人類CGRP抗體或抗體片段可以包含一種人類、嵌合或是人類化(humanized)抗體。該抗人類CGRP抗體或抗體片段可以包含Fab、F(ab’)2、scFv、IgNar，或MetMab或是另一種單價抗體片段。
在另一個態樣中，本揭示提供一種組成物，其適合供本文中所述之方法中使用，例如前面的段落中所引述的方法中使用，該組成物可以包含有效量的抗人類CGRP抗體或抗體片段，以及抗人類CGRP抗體或抗體片段之外的一種抗糖尿病劑或抗肥胖劑。該抗人類CGRP抗體或抗體片段可以為本文中說明的一者，例如其可以專一地結合至一個完整的CGRP多肽或其之片段上相同的線形或構形抗原決定位，可以競爭結合至一個完整的CGRP多肽或其之片段上相同或重疊的線形或構形抗原決定位，如同選自於以下所構成的群組之抗人類CGRP抗體一般，可以具有一多肽序列，其與選自於以下所構成的群組之抗人類CGRP抗體有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或至少99%的同一性，或者可以包含選自於以下所構成的群組之抗人類CGRP抗體：(a)Ab1，其包含序列辨識編號：2的VL與序列辨識編號：4的VH；(b)Ab2，其包含序列辨識編號：12的VL與序列辨識編號：14的VH；(c)Ab3，其包含序列辨識編號：22的VL與序列辨識編號：24的VH；(d)Ab4，其包含序列辨識編號：32的VL與序列辨識編號：34的VH；(e)Ab5，其包含序列辨識編號：42的VL與序列辨識編號：44的VH；(f)Ab6，其包含序列辨識編號： 52的VL與序列辨識編號：54的VH；(g)Ab7，其包含序列辨識編號：62的VL與序列辨識編號：64的VH；(h)Ab8，其包含序列辨識編號：52的VL與序列辨識編號：54的VH；(i)Ab9，其包含序列辨識編號：62的VL與序列辨識編號：64的VH；(j)Ab10，其包含序列辨識編號：72的VL與序列辨識編號：74的VH；(k)Ab11，其包含序列辨識編號：82的VL與序列辨識編號：84的VH；(1)Ab12，其包含序列辨識編號：92的VL與序列辨識編號：94的VH；(m)Ab13，其包含序列辨識編號：102的VL與序列辨識編號：104的VH；以及(n)Ab14，其包含序列辨識編號：112的VL與序列辨識編號：114的VH。
該抗糖尿病劑或抗肥胖劑包含下列之一者或多者：澱粉素、澱粉素促效劑、磺醯基脲類、抑鈣素、升糖素、PPAR-γ促效劑類、GPL-1受體促效劑類、二肽基肽酶IV(Dipeptidyl peptidase IV)抑制劑、澱粉素類似物、雙胍類、多巴胺D2受體促效劑類、美格列奈類(meglitinides)、α葡萄糖苷酶抑制劑、抗異常血脂症膽酸螯隔劑(antidyslipidemic bile acid sequestrant)、促胰島素分泌素(exendin)、促胰島素分泌素類似物、促胰島素分泌素促效劑、胃抑肽(GIP)、腸促胰液素胜肽(incretin peptide)、胰島素、SGLT2抑制劑、葡萄糖再吸收抑制劑、非諾貝特(fenofibrate)、貝特類(fibrate)、甲福明(metformin)、抗飢餓肽(ghrelin)抗體或抗體片段、纖維母細胞生長因子受體(FGFR)-1(IIIb)、FGFR-1(IIIc)、抗體或抗體片段，及/或FGFR-4(IIIc)、抗CD38抗體或抗體片段，抗MIC-1抗體或MIC-1結合片段，或是前 述任一者之組合。舉例來說，該抗糖尿病劑或抗肥胖劑可包含甲福明(metformin)。
圖1A-D.治療前及治療後之血糖及血漿胰島素位準。結果以平均值±SEM來表示。ANOVA單因子+鄧奈特事後檢定(ANOVA one way+Dunnett’s post test)之## p<0.01 vs載體。A：治療前餵食條件下，用載體、Ab14及甲福明治療後18h，以及用載體及Ab14治療後42h所測量的血糖。B：治療前餵食條件下、用甲福明治療後18h，以及用載體及Ab14治療後42h所測量的血漿胰島素。C：計算治療前、用甲福明治療後18h，以及用載體及Ab14治療後42h之HOMA-IR(胰島素抗性指數=葡萄糖(mM)X胰島素(μU/mL)/22.5)D：正好在鉗制術前、於禁食條件下所測量的血糖(甲福明治療後24h以及用載體及Ab14治療後48h)。圖例：各組中最左側槓，載體；各組中間的槓，Ab14治療；各組中最右側槓，甲福明治療。
圖2A-C.在鉗制術程序期間之葡萄糖輸注率發展(A)，穩態期間的血糖平均值(B)以及在鉗制術結束時的血漿胰島素位準(C)。結果以平均值±SEM來表示。A：以ANOVA二因子加上龐費洛尼事後檢定(Bonferroni’s post test)之*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001 vs載體。圖2A之圖例：上面的線，甲福明治療；中間的線，Ab14治療；下面的線，載體治療(於時間點180min)。圖2B-2C之圖例：各組中最左側槓，載體；各組中間的槓，Ab14治療；各組中最右側槓， 甲福明治療。
圖3.測得的葡萄糖通量(Measured glucose flux)。結果以平均值±SEM來表示。以ANOVA單因子加上鄧奈特事後檢定之# p<0.05 vs載體。於6小時禁食條件下執行鉗制術程序。0.3U/Kg/h胰島素及3H-葡萄糖灌流歷時180分鐘。計算對應於穩態，140分鐘和180分鐘之間的葡萄糖輸注率、全身轉換、肝葡萄糖的生成(HGP)、醣解作用，及肝醣合成之平均值。圖例：各組中最左側槓，載體；各組中間的槓，Ab14治療；各組中最右側槓，甲福明治療。
圖4A-C.活體內組織特異性葡萄糖的利用。結果以平均值±SEM來表示。以ANOVA單因子加上鄧奈特事後檢定之# p<0.05，## p<0.01vs載體。A：附睾白色脂肪組織(EWAT)、鼠蹊的白色脂肪組織(IWAT)，以及皮膚(作為負對照)之葡萄糖的利用。B：混合外股肌(mixed vastus lateralis muscle)(VL)及醣解伸趾長肌(glycolytic extensor digitorum longus muscle)(EDL)之葡萄糖的利用。C：氧化的比目魚肌及心尖內之葡萄糖的利用。圖例：各組中最左側槓，載體；各組中間的槓，Ab14治療；各組中最右側槓，甲福明治療。
圖5.餵食高脂高果糖飲食的動物或餵食對照食物的對照動物在時間期間之平均體重。圖例：上面的線，高脂高果糖飲食；下面的線，對照食物。
圖6.圖5所示之動物組別在時間期間之體重增重。上面的線：高脂高果糖飲食；下面的線：對照食物。圖例：上面的線，高脂高果糖飲食；下面的線，對照食物。
圖7.在用Ab14(10，30，或100mg/kg)或甲福明治療後餵食高脂肪飲食的動物，及載體治療的動物以及對照動物餵食對照食物，在時間期間之體重增重。在第0天投藥治療。圖上的線於第7天從最低至最高按順序為：正常食物(NC)加上載體；高脂肪飲食(HFD)加上甲福明；HFD加上Ab14 30mg/kg；HFD加上Ab14 10mg/kg；HFD加上載體；HFD加上Ab14 100mg/kg。
圖8A.圖7所示之動物組別之食物攝取。圖上的線於第7天從最低至最高按順序為：高脂肪飲食(HFD)加上甲福明；HFD加上Ab14 30mg/kg；HFD加上Ab14 10mg/kg；HFD加上Ab14 100mg/kg；HFD加上載體；正常食物(NC)加上載體。
圖8B.圖7所示之動物組別之累積的食物攝取。圖例：由左至右之槓為：正常食物(NC)加上載體；高脂肪飲食(HFD)加上載體；HFD加上Ab14 10mg/kg；HFD加上Ab14 30mg/kg；HFD加上Ab14 100mg/kg；HFD加上甲福明。
圖9.在用Ab14(10，30，或100mg/kg)或甲福明治療後餵食高脂肪飲食的動物，及載體治療的動物以及對照動物餵食對照食物，之空腹血糖。在第0天投藥治療。圖例：由左至右之槓的順序係如同圖8B中的一樣。
圖10.在用Ab14(10，30，或100mg/kg)或甲福明治療後餵食高脂肪飲食的動物，及載體治療的動物以及對照動物餵食對照食物，之空腹血漿胰島素。在第0天投藥治療。圖例：各組中由左至右之槓的順序係如同圖8B中的一 樣。
圖11.在用Ab14或甲福明治療15天之後，執行鉗制術之前及鉗制術期間的血漿胰島素(上部小組)及C胜肽位準(下部左小組及右小組)。在治療之前餵食動物6週的高脂肪飲食。圖例：由左至右之槓的順序係如同圖8B中的一樣。
圖12.在用Ab14(10，30，或100mg/kg)或甲福明治療後餵食高脂肪飲食的動物，及載體治療的動物以及對照動物餵食對照食物，之HOMA-IR。在第0天投藥治療。圖例：由左至右之槓的順序係如同圖8B中的一樣。
圖13.在用Ab14或甲福明治療15天之後，及載體治療的動物以及對照動物餵食對照食物，執行的葡萄糖鉗制術之葡萄糖輸注率。在治療之前餵食動物6週的高脂肪飲食。以二個不同的胰島素輸注率來執行葡萄糖鉗制術(5mU/kg/min，在大概70-100min達到穩態，以及15mU/kg/min，在大概170-210min.達到穩態)圖例：圓形的標誌，正常食物；中等的正方形標誌，高脂肪飲食(HFD)加上載體；指向上方的三角形，HFD加上Ab14 10mg/kg；指向下方的三角形，HFD加上Ab14 30mg/kg；菱形，HFD加上Ab14 100mg/kg；大的正方形，HFD加上甲福明。誤差槓係表示平均值加上或是減去SEM。
圖14.圖13所示之葡萄糖鉗制術實驗的穩態期間的平均葡萄糖輸注率。葡萄糖輸注率顯示低和高胰島素輸注率(5mU/kg/min，在大概70-100min達到穩態，以及 15mU/kg/min，在大概170-210min.達到穩態)。各組中槓的順序係如同圖8B中的一樣。
圖15.圖13所示之葡萄糖鉗制術實驗期間的平均葡萄糖通量。顯示低的(5mU/kg/min)胰島素輸注率結果，在大概70-100min達到穩態。圖例：各組中由左至右之槓的順序為：高脂肪飲食(HFD)加上載體；HFD加上Ab14 10mg/kg；HFD加上Ab14 30mg/kg；HFD加上Ab14 100mg/kg；HFD加上甲福明。
圖16.圖13所示之葡萄糖鉗制術實驗期間的平均葡萄糖通量。顯示高的(15mU/kg/min)胰島素輸注率結果，在大概170-210min達到穩態。圖例：各組中槓的順序係如同圖15一樣。
圖17. i.v.推注注射(bolus injection)至雄性史-道二氏(Sprague-Dawley)大鼠內之後，抗CGRP抗體(明確地，Ab6)之平均毒物動力學廓型。顯示168小時(7天)的時間期間之血漿濃度，支持以下的實驗執行的每週給藥。圖例：正方形標誌，Ab14 10mg/kg/週；指向上方的三角形標誌，Ab14 30mg/kg/週；菱形標誌，Ab14 100mg/kg/週。
圖18A-D.8週大的ZDF大鼠之6小時空腹HOMA-IR(A)，血糖(B)，血漿胰島素(C)以及體重(D)。結果以平均值±SEM來表示。
# p<0.05；### p<0.001 vs載體ZDF(曼-懷特尼(Mann Whitney))。圖18A-D中(由左至右)槓的順序為：(1)載體1和載體2治療的ZDF瘦大鼠(lean rats)；(2)載體1和載體 2治療的ZDF大鼠；(3)Ab14 20mg/kg/週和載體2治療的ZDF大鼠；(4)Ab14 60mg/kg/週和載體2治療的ZDF大鼠；(5)載體1和甲福明(“met”)200mg/kg/天治療的ZDF大鼠；(6)載體1和吡格列酮(pioglitazone)10mg/kg/天治療的ZDF大鼠；(7)Ab14 20mg/kg/週和甲福明200mg/kg/天治療的ZDF大鼠；以及(8)Ab14 60mg/kg/週和甲福明200mg/kg/天治療的ZDF大鼠。
圖19A-B.體重(A)和體重增重(B)的追蹤。結果以平均值±SEM來表示。
$ p<0.05(圖19A：於第8天吡格列酮(pioglitazone)治療的大鼠；於第28天Ab14 60mg/kg/wk+甲福明治療的大鼠；圖19B：於第22天及第25天Ab14 60mg/kg/wk+甲福明治療的大鼠)；$$ p<0.01(圖19B：於第28天Ab14 60mg/kg/wk+甲福明治療的大鼠)；$$$ p<0.001 vs載體ZDF(圖19A：在第11-28天之間的所有時間點，吡格列酮(pioglitazone)治療的大鼠；在所有時間點之載體治療的ZDF瘦大鼠)(二因子ANOVA+龐費洛尼事後檢定(2-way ANOVA+Bonferroni’s post test))。
圖20A-B.食物攝取的追踪(A)及累積的食物攝取(B)。結果以平均值±SEM來表示。圖20B中槓的順序係如同圖18A-D一樣。
$ p<0.05(圖20A：於第20天及第22天吡格列酮(pioglitazone)治療的大鼠；$$ p<0.01(圖20A：於第15天吡格列酮(pioglitazone)治療的大鼠)；$$$ p<0.001 vs載體 ZDF(圖20a：在所有時間點之載體治療的ZDF瘦大鼠)(二因子ANOVA+龐費洛尼事後檢定)
## p<0.01 vs載體ZDF(曼-懷特尼)
圖21A-D.6小時(第0天)或隔夜(第12天、第19天、第26天)禁食條件之血糖(A)，血漿胰島素(B)，HOMA-IR(C)以及C胜肽(D)。結果以平均值±SEM來表示。圖21A-D內各組中槓的順序係如同圖18A-D一樣。
# p<0.05；### p<0.001 vs載體ZDF(曼-懷特尼)
* p<0.05；** p<0.01；*** p<0.001 vs載體ZDF(克拉斯卡-瓦立斯檢定(Kruskal-Wallis)+鄧恩事後檢定(Dunn’s post test))
++ p<0.01；vs甲福明組以及AB14 20mg/kg+甲福明組(單因子ANOVA+紐柯事後檢定(Newman-Keuls post test))
$ p<0.05；$$ p<0.01 vs載體ZDF(二因子ANOVA+龐費洛尼事後檢定)
圖22.果胺糖位準。結果以平均值±SEM來表示。圖22內各組中槓的順序係如同圖18A-D一樣。
### p<0.001 vs載體ZDF(曼-懷特尼)
** p<0.01 vs載體ZDF(克拉斯卡-瓦立斯檢定(Kruskal-Wallis)+鄧恩事後檢定(Dunn’s post test))
$$$ p<0.001 vs載體ZDF(二因子ANOVA+龐費洛尼事後檢定)
圖23. HbA1c位準。結果以平均值±SEM來表示。 圖23內各組中槓的順序係如同圖18A-D一樣。
### p<0.001 vs載體ZDF(曼-懷特尼)
*** p<0.001 vs載體ZDF(克拉斯卡-瓦立斯檢定(Kruskal-Wallis)+鄧恩事後檢定(Dunn’s post test))
+ p<0.05；vs AB14 60mg/kg組(單因子ANOVA+紐柯事後檢定)
$ p<0.05；$$ p<0.01；$$$ p<0.001 vs載體ZDF(二因子ANOVA+龐費洛尼事後檢定)
圖24A-B.於6小時(第0天)或隔夜(第12天、第19天及第26天)禁食條件下之血漿三酸甘油酯(A)及游離脂肪酸(B)位準。結果以平均值±SEM來表示。圖24A-D內各組中槓的順序係如同圖18A-D一樣。
### p<0.001 vs載體ZDF(曼-懷特尼)
* p<0.05；** p<0.01；*** p<0.001 vs載體ZDF(克拉斯卡-瓦立斯檢定(Kruskal-Wallis)+鄧恩事後檢定(Dunn’s post test))
+ p<0.05；++ p<0.01；+++ p<0.001 vs甲福明組或是Ab14 60mg/kg+甲福明組(單因子ANOVA+紐柯事後檢定)
$ p<0.05；$$ p<0.01；$$$ p<0.001 vs載體ZDF(二因子ANOVA+龐費洛尼事後檢定)
圖25A-C.血漿總膽固醇(A)，HDL-膽固醇(B)與非HDL-膽固醇(C)位準。結果以平均值±SEM來表示。圖25A-C內各組中槓的順序係如同圖18A-D一樣。
# p<0.05；## p<0.01；### p<0.001 vs載體ZDF(曼-懷特尼)
* p<0.05；** p<0.01；*** p<0.001 vs載體ZDF(單因子ANOVA+鄧奈特事後檢定)
+ p<0.05；++ p<0.01 vs甲福明組或是Ab14+甲福明組(單因子ANOVA+紐柯事後檢定)
$$ p<0.01 vs載體ZDF(二因子ANOVA+龐費洛尼事後檢定)
圖26A-C.相對於第0天之血漿總膽固醇(A)，HDL-膽固醇(B)與非HDL-膽固醇(C)位準。結果以平均值±SEM來表示。圖26A-C內各組中槓的順序係如同圖18A-D一樣。
# p<0.05；## p<0.01；### p<0.001 vs載體ZDF(非配對t檢定(unpaired t-test))
* p<0.05；** p<0.01 vs載體ZDF(單因子ANOVA+鄧奈特事後檢定)
+ p<0.05；vs甲福明組(單因子ANOVA+紐柯事後檢定)
$ p<0.05；$$$ p<0.001 vs載體ZDF(二因子ANOVA+龐費洛尼事後檢定)
圖27A-C.於第26天、隔夜禁食條件(A)下，進行的口服耐糖試驗，於T0(B)測得的血糖所計算出曲線下的面積(AUC)，以及從相對值vs T0(C)所計算出之曲線下的面積。結果以平均值±SEM來表示。圖27B-C內各組中槓的順序係 如同圖18A-D一樣。
$$$ p<0.001 vs載體ZDF(二因子ANOVA+龐費洛尼事後檢定)(圖27A：在所有時間點之載體治療的ZDF瘦大鼠及吡格列酮(pioglitazone)治療的大鼠)。
### p<0.001 vs載體ZDF(曼-懷特尼)
*** p<0.001 vs載體ZDF(克拉斯卡-瓦立斯檢定(Kruskal-Wallis)+鄧恩事後檢定(Dunn’s post test))
圖28A-B.於第26天、口服耐糖試驗期間之血漿胰島素(A)以及C胜肽(B)位準。結果以平均值±SEM來表示。圖28A-B內各組中槓的順序係如同圖18A-D一樣。
### p<0.001 vs載體ZDF(曼-懷特尼)
* p<0.05 vs載體ZDF(克拉斯卡-瓦立斯檢定(Kruskal-Wallis)+鄧恩事後檢定(Dunn’s post test))
$$ p<0.01；$$$ p<0.001 vs載體ZDF(二因子ANOVA+龐費洛尼事後檢定)
圖29A-B.於第26天、口服耐糖試驗期間之T-60血漿胰島素(A)以及C胜肽(B)位準之相對表現。結果以平均值±SEM來表示。圖29A-B內各組中槓的順序係如同圖18A-D一樣。
# p<0.05；### p<0.001 vs載體ZDF(曼-懷特尼)
* p<0.05 vs載體ZDF(單因子ANOVA+鄧奈特事後檢定)
+ p<0.05；vs甲福明組(單因子ANOVA+紐柯事後檢定)
$ p<0.05；$$ p<0.01 vs載體ZDF(二因子ANOVA+龐費洛尼事後檢定)
圖30A-C.胰臟含量(Pancreas content)：前胰島素(proinsulin)(A)，胰島素(B)及前胰島素/胰島素比率(C)。結果以平均值±SEM來表示。圖30A-C中(由左至右)槓的順序為：載體1和載體2治療的ZDF瘦大鼠；載體1和載體2治療的ZDF大鼠；Ab14 60mg/kg/週和載體2治療的ZDF大鼠；載體1和甲福明200mg/kg/天治療的ZDF大鼠；以及Ab14 60mg/kg/週和甲福明200mg/kg/天治療的ZDF大鼠。
# p<0.05；### p<0.001 vs載體ZDF(曼-懷特尼)
* p<0.05 vs載體ZDF(單因子ANOVA+紐柯事後檢定)
圖31.胰臟免疫組織化學分析：胰島素標示定量。圖31中(由左至右)槓的順序為：載體1和載體2治療的ZDF瘦大鼠；載體1和載體2治療的ZDF大鼠；Ab14 60mg/kg/週和載體2治療的ZDF大鼠；載體1和甲福明200mg/kg/天治療的ZDF大鼠；以及Ab14 60mg/kg/週和甲福明200mg/kg/天治療的ZDF大鼠。
詳細說明
本發明人發現抗CGRP抗體當與甲福明相比，顯著地使周邊肌肉的葡萄糖利用增加，而不會明顯增加白色脂肪組織內之葡萄糖的利用率。並且，本文中說明的抗人類CGRP抗體可以使心臟之葡萄糖的利用增加，而甲福明使 心臟之葡萄糖的利用降低。此外，本文中說明的抗人類CGRP抗體會抑制肝葡萄糖的生成，與甲福明投藥獲得的效應相似。
抗人類CGRP抗體，其為一種有效力的功能性拮抗劑Ab14，進行以下評估：在正常和改變的葡萄糖代謝的臨床前動物模式中，決定其對正常大鼠之胰島素敏感性和升糖(glycemic)對照之效應(實施例1)，於已經餵食高脂/高果糖飲食六週，來誘發代謝症候群之高胰島素血性但血糖量正常的飲食誘發的肥胖(DIO)大鼠(實施例2)，以及於從糖尿病前(prediabetic)(高胰島素血性，血糖量正常)狀態進展至明顯糖尿病(低胰島素血性(hypoinsulinemic)，高血糖)狀態的祖克(Zucker)糖尿病肥胖大鼠(實施例3)。
於實施例1中，用Ab14來執行高胰島素血性-正常血糖鉗制術(hyperinsulinemic-euglycemic clamp)研究，以決定其對血糖量正常、正常胰島素血性(normoinsulinemic)，及有正常的全身及組織特異性胰島素敏感性之正常大鼠，之全身胰島素敏感性之效應以及其對特定組織的胰島素敏感性之效應。在高胰島素血性-正常血糖鉗制術程序之前48hrs，對正常大鼠通過靜脈給予單一的100mg/kg投藥Ab14。評估正好在鉗制術程序之前所測得的血漿葡萄糖和胰島素位準得到的結果顯示，相對於載體治療的對照，Ab14使血漿胰島素位準降低，而不會改變血漿葡萄糖的位準。產生的HOMA-IR降低顯示出全身胰島素敏感性的改善。
高胰島素血性-正常血糖鉗制術程序確認了此由 CGRP拮抗作用所致之全身胰島素敏感性的改善，穩態狀況下，相對於載體治療的對照，葡萄糖輸注率和全身葡萄糖轉換(利用)率二者都是提高的。增高的葡萄糖輸注率及全身葡萄糖轉換加上不變的胰島素輸注，表示增高的全身胰島素敏感性。
與葡萄糖輸注率及全身葡萄糖轉換的增高一致，相對於載體治療的對照，Ab14使醣解作用及肝醣合成之肝臟的葡萄糖利用增加，以及使肝葡萄糖的生成減少。此等觀察表示CGRP拮抗作用造成的肝臟胰島素敏感性增高，會導致增高的肝臟的利用，供應更多供能量生成及儲存二者的內化葡萄糖，然而會抑制重新(de novo)肝葡萄糖的生成。
CGRP拮抗作用也會增高醣解作用以及氧化的骨骼肌(外股肌，表示混合的醣解加上氧化；伸趾長肌，表示醣解作用，以及比目魚肌，表示氧化)之葡萄糖利用。葡萄糖利用最大的增加發生在混合新陳代謝的外股肌(vastus lateralis)。此等觀察資料表示增高的骨骼肌胰島素敏感性是由CGRP拮抗作用所造成的。CGRP拮抗作用亦增高心臟的葡萄糖利用。相比之下，內臟或皮下蓄積脂肪(fat depot)的葡萄糖利用率不受影響，暗示CGRP拮抗作用不會實質增高白色脂肪組織內之胰島素敏感性。
如上所提及的，研究中使用的動物為血糖量正常大鼠且具有正常的全身及肝臟組織特異性胰島素敏感性，使得改善此等動物之胰島素敏感性更不容易證明。因而， 雖然此研究中所評估的一些個別的終點的改善沒有達到統計顯著性，但是觀察到其等傾向相同方向，如同該等確實暗示增加的研究動力(study power)會使額外測得的參數得以達到統計顯著性。再者，因為通常實驗動物中執行的高胰島素血性-正常血糖鉗制術研究的結果，會高度轉變成臨床背景中執行的高胰島素血性-正常血糖鉗制術研究，此等觀察資料暗示著CGRP拮抗作用改善人類全身及組織特異性胰島素敏感性的潛力。
於實施例2中，透過慢性投藥Ab14所致之CGRP拮抗作用對於胰島素抗性動物之肝臟及周邊的胰島素敏感性之效應，係於長期餵食高脂/高果糖飲食所致之高胰島素血性及胰島素抗性，但非高血糖性的大鼠內進行評估。在化合物投藥起始之前，餵食大鼠含69%脂肪及14%果糖的飲食七週來誘發代謝症候群。在七週飲食治療期間結束時，大鼠繼續得到高脂/高果糖飲食，並且通過靜脈給予劑量為0mg/kg(載體)、10mg/kg、30mg/kg，或100mg/kg之Ab14每週一次歷時2週。
當與餵食高脂肪飲食的載體治療對照組相比時，CGRP拮抗作用對於食物攝取或體重沒有效應，表示CGRP拮抗作用對於以下所評估額外的參數之效應不是由於卡路里的限制或者使重量減輕。
在治療期間結束時，相對於載體治療的對照，Ab14的所有劑量均使HOMA-IR降低，表示全身胰島素敏感性之改善。HOMA-IR之此種下降主要是由於Ab14的所有劑 量均出現的血漿胰島素位準的降低所致。血漿胰島素的降低是胰島素產生減少的結果，而不是增高的胰島素降解所致，因為胰臟胰島素合成之副產物血漿C胜肽和血漿胰島素同樣為減少的。二個劑量的Ab14只有稍微降低減少血漿葡萄糖位準，但是相對於載體治療的對照，100mg/kg劑量的Ab14卻會使血漿葡萄糖位準實質減少。
於治療的最後一天之後，立即執行二步驟的高胰島素血性-正常血糖鉗制術程序，其係使用第一步驟、生理量的葡萄糖輸注以及第二步驟、超生理(supraphysiological)的胰島素濃度。相對於載體治療的對照，在生理及超生理胰島素輸注濃度之後，Ab14的所有三個劑量均使穩態之葡萄糖輸注率增高。此與全身胰島素敏感性之改善為一致的。相對於載體治療的對照，在生理胰島素輸注濃度之後，Ab14的所有三個劑量也都會增高全身葡萄糖轉換(利用)率，增高醣解作用及肝醣合成之肝臟的葡萄糖利用，以及抑制肝葡萄糖的生成，此與全身及肝臟胰島素敏感性二者之改善為一致的。在超生理胰島素輸注濃度之後亦完全預防肝葡萄糖的生成。
CGRP拮抗作用於正常大鼠體內之急性效應(實施例1)以及於血糖量正常、高胰島素血性、胰島素抗性大鼠體內之慢性效應(實施例2)之相似性，表示CGRP拮抗作用長期作用來治療已確立的胰島素抗性的能力。此外，如上所提及的，因為通常實驗動物中執行的高胰島素血性-正常血糖鉗制術研究的結果，會高度轉變成臨床背景中執行的 高胰島素血性-正常血糖鉗制術研究，此等觀察資料暗示著CGRP拮抗作用改善糖尿病前期或代謝症候群的胰島素抗性人類，全身及組織特異性胰島素敏感性的潛力。最後，CGRP拮抗作用使此等血糖量正常動物體內之血漿葡萄糖位準減少的能力，儘管只有在所評估的最高劑量出現，但是暗示CGRP拮抗作用亦能使高血糖性的病患之血漿葡萄糖位準減少之潛力。
於實施例3中，評估慢性投藥Ab14於從糖尿病前(高胰島素血性，血糖量正常)狀態進展至明顯糖尿病(低胰島素血性，高血糖)狀態的ZDF大鼠內，對於葡萄糖對照的效應。此等動物在幾週大之前發展出糖尿病前期(prediabetes)，其特徵在於有顯著的高胰島素血症來補償其等發展的胰島素抗性，但是具有輕微的高血糖症或是沒有高血糖症。此在10-12週大之前會由於胰臟β細胞衰竭，而快速地進展至明顯糖尿病，其特徵在於低胰島素血症，以及顯著的高血糖症。
ZDF大鼠在8週大時依據其等之HOMA-IR進行篩選，以及用20或60mg/kg之Ab14予以治療每週一次歷時28天。除了評估CGRP拮抗劑Ab14對於此動物模式內升糖(glycemic)對照的作用之外，還評估CGRP拮抗作用與市售藥物甲福明(200mg/kg/天)組合之效應。甲福明單獨會部分預防空腹血糖的上升，部分預防血漿胰島素及C胜肽位準的減少，完全預防胰臟的前胰島素位準的下降，部分預防胰臟胰島素位準的下降，以及減少胰島空泡形成、增生，及 纖維化，此等為與以上所說明的高劑量Ab14之程度相似。然而，Ab14與甲福明之組合於預防空腹血糖的上升，血漿胰島素及C胜肽位準的減少，胰臟的前胰島素及胰島素位準的下降，以及胰島纖維化的減少方面，會產生比任一化合物單獨，實質更大程度的作用。此情況暗示CGRP拮抗劑，例如Ab14可以提高甲福明的效應。
此外，於治療28天之後，相對於載體治療的對照，Ab14與甲福明之組合會導致HbA1c(血紅素糖化之標記)位準實質的下降，以及果胺糖位準較小程度的降低。此情況與Ab14加上甲福明之組合會比起任一製劑單獨，會產生更大量的血漿葡萄糖位準降低，是一致的。此等結果暗示CGRP拮抗劑與甲福明之組合將有利地影響高血糖症媒介的糖尿病併發症。
同樣地，於研究的第26天、執行口服耐糖試驗(oGTT)期間，在葡萄糖推注投藥之後，相對於載體治療的動物，高劑量的Ab14與甲福明之組合顯示出葡萄糖波動及葡萄糖AUC方面之改善。並且，因為在研究的第26天之前此等動物之β細胞毀壞已經進展至超過其等應付葡萄糖挑戰，來使胰島素分泌增加的能力，所以預期假如早二週執行oGTT或是在β細胞完全的破壞之前的另一時間點執行oGTT，Ab14加上甲福明之組合於葡萄糖波動及葡萄糖AUC方面會觀察到有更實質的改善。
實施例3中使用的ZDF大鼠是非常嚴重的糖尿病進展模式，此模式從胰島素抗性的糖尿病前狀態，快速地 進展至β細胞完全破壞的明顯糖尿病，於僅僅幾週的時間過程發生。此限制了調變所評估的疾病進展之機會，使得於此等動物中證明疾病進展和β細胞保護方面化合物相關的改善是不容易的。因而，如上概述之CGRP拮抗劑Ab14適度的延遲疾病進展之任何證明，暗示著臨床上之潛力且影響(potential to also affec)疾病進展。此外，經由組合CGRP拮抗作用與甲福明以改善整體治療功效的能力也支持在臨床上組合療法的功效。
本申請案中實施例的結果指出CGRP拮抗作用有改善全身胰島素敏感性、肝臟胰島素敏感性，以及骨骼肌胰島素敏感性的能力。於正常胰島素血性及血糖量正常且具有胰島素敏感性之正常的動物體內，以及於高胰島素血性但還沒高血糖性的胰島素抗性動物體內，可以敏銳或長期地觀察到此等改善。此等結果指出CGRP拮抗作用應該會使具有代謝症候群、糖尿病前期，或是其他的糖尿病前病況之病人存在的胰島素抗性降低，以及CGRP拮抗作用可以進一步使此等疾病進展至明顯糖尿病變緩慢。
此外，CGRP拮抗劑Ab14藉著使胰島素分泌減少，而使胰島素抗性動物體內高胰島素血症降低的能力，暗示Ab14可能透過讓胰島素抗性動物之胰臟休息，而有胰臟β細胞的防護效應。此於臨床上可進一步延遲代謝症候群、糖尿病前期，以及其他的糖尿病前病況進展至明顯糖尿病。
再者，Ab14使胰島素抗性、高胰島素血性但是 血糖量正常之大鼠體內血漿葡萄糖位準降低的能力，及使ZDF大鼠體內糖尿病前期進展至明顯糖尿病變緩慢的能力，以及在幾乎沒有或是沒有任何增加胰島素生產的殘餘能力之明顯糖尿病動物內，維持降低的血漿葡萄糖位準之能力，指出CGRP的拮抗作用可能不僅有能力影響如上概述之糖尿病前狀態之疾病進展，而且還有能力影響明顯糖尿病疾病進展。
因而，此等研究的結果合起來清楚地指出，CGRP拮抗劑，例如Ab14可以有利地影響具有糖尿病前病況的病人及具有發展中或明顯糖尿病的病人二者之臨床背景中，胰島素抗性及異常的葡萄糖對照。
最後，CGRP拮抗劑Ab14提高甲福明於ZDF大鼠體內效應之能力暗示，相對於Ab14或甲福明單獨，Ab14-甲福明之組合療法有成為優秀的臨床功效之潛力，用於治療具有糖尿病前病況的病人、具有發展中顯糖尿病的病人，以及有明顯糖尿病的病人。
定義
要瞭解到本發明不限於所說明之特定的方法學、操作程序、細胞株、動物物種或屬，以及試劑，因這些可以變化。也要瞭解到本文中所使用的術語僅僅為了說明特定的實施例之目的，以及不欲限制本發明的範疇，其僅由附隨的申請專利範圍所限定。當使用於本文中，單數形式"一"、"和"，以及"該"係包括複數的所指對象，除非上下文顯然另有規定。因此，舉例而言凡提及"一細胞"時，係包 括數個此等細胞，以及提及"該蛋白質"時，係包括提及一個或多個蛋白質和本技藝中具有技術的那些人所知道其之均等物，及依此類推。本文中所使用的所有的技術和科學術語，係與具有本發明所屬之技藝中具有通常技術的一般技能者所通常瞭解的意義相同，除非顯然另有規定。
抑鈣素基因系胜肽(CGRP)：當使用於本文中，CGRP不僅包含可從American Peptides(Sunnyvale CA)與Bachem(Torrance，CA)取得之下列智人(Homo sapiens)CGRP-α與智人CGRP-β胺基酸序列：CGRP-α：ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF-NH2(序列辨識編號：281)，其中N端苯丙胺酸係經醯胺化。除非另有指明，一般而言提及“CGRP”典型係指CGRP-α。CGRP-α係以可互換方式稱為αCGRP或是α-CGRP。
CGRP-β：ACNTATCVTHRLAGLLSRSGGMVKSNFVPTNVGSKAF-NH2(序列辨識編號：282)，其中N端苯丙胺酸係經醯胺化；而且還包含此等CGRP胺基酸序列的任何膜結合形式，以及突變型(mutant)(突變體(mutien))、剪接變異體、異構體、異種同源物(ortholog)、同源物及此序列的變異體。CGRP-β係以可互換方式稱為βCGRP或是β-CGRP。
血糖濃度正常(Normoglycemia)：在本揭示中，術語血糖濃度正常或血糖正常(euglycemia)係指具有正常血糖濃度的狀態。人類體內例示性的正常血糖濃度在禁食成 年人係介於70mg/dl和99mg/dl之間，以及在餐後的成年人係介於70mg/dl和140mg/dl之間。持續的血糖濃度正常係指血糖濃度正常維持延長期限，例如至少一天，至少二天，至少一週，至少二週，至少一個月，或更長。
配對的勝任酵母菌物種：於本發明中，此係意欲廣泛地包含任何能於培養物內生長的二倍體或四倍體酵母菌。此等酵母菌的物種可以以一個單倍體、二倍體，或是其他多倍體形式存在。於適當的條件之下，特定的多倍體之細胞可以以該形式增殖無限數目的世代。二倍體細胞也能形成孢子以形成單倍體細胞。相繼的配對能經由進一步二倍體菌株的配對或融合而產生四倍體菌株。本發明設想單倍體酵母菌之用途，以及例如藉由配對或球形質體融合所產生的二倍體或其他多倍體酵母菌細胞之用途。
於本發明的一個具體例中，配對的勝任酵母菌是酵母菌科(Saccharomycetaceae)家族的一成員，其包括：阿席歐酵母菌(Arxiozyma)屬；糞盤菌(Ascobotryozyma)屬；固囊酵母菌(Citeromyces)屬；得巴利酵母菌(Debaryomyces)屬；德克酵母菌(Dekkera)屬；假囊酵母菌(Eremothecium)屬；伊薩酵母菌(Issatchenkia)屬；哈薩克酵母菌(Kazachstania)屬；克魯維酵母菌(Kluyveromyces)屬；柯達菌(Kodamaea)屬；路德酵母菌(Lodderomyces)屬；管囊酵母菌(Pachysolen)屬；畢赤酵母菌(Pichia)屬；酵母菌(Saccharomyces)屬；木黴菌屬(Saturnispora)；四重孢酵母菌屬(Tetrapisispora)；有孢圓酵母菌(Torulaspora)屬；擬威爾酵母菌(Williopsis)屬；以及 結合酵母菌(Zygosaccharomyces)屬。本發明中可能有用的其他類的酵母菌包括：耶羅威亞(Yarrowia)；紅冬孢酵母菌(Rhodosporidium)；念珠菌(Candida)；漢遜酵母菌(Hansenula)；線黑粉菌(Filobasidium)；鎖擲酵母菌(Sporidiobolus)；布勒擲孢酵母菌(Bullera)；白冬孢酵母菌(Leucosporidium)以及線黑粉菌(Filobasidiella)。
在本發明的一個具體例中，配對的勝任酵母菌是畢赤酵母菌(Pichia)屬的一成員。在本發明的另一個具體例中，畢赤酵母菌(Pichia)屬之配對的勝任酵母菌係下列物種之一：巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris)、甲醇畢赤酵母菌(Pichia methanolica)，以及多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)(安格斯畢赤酵母菌(Pichia angusta))。在本發明的一個例示性具體例中，畢赤酵母菌屬之配對的勝任酵母菌係巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris)物種。
單倍體酵母菌細胞：一細胞，其之正常的基因體(染色體)組的各基因具有一單一副本。
多倍體酵母菌細胞：一細胞，其之正常的基因體(染色體)組具有多於一個副本。
二倍體酵母菌細胞：一細胞，其之正常的基因體組之實質上每個基因具有2個副本(對偶基因)，典型地係藉由2個單倍體細胞的融合的過程(配對)而形成。
四倍體酵母菌細胞：一細胞，其之正常的基因體組之實質上每個基因具有4個副本(對偶基因)，典型地係藉由2個單倍體細胞的融合的過程(配對)而形成。四倍體可以 帶有2、3、4個或是更多個不同的表現卡匣。此等四倍體可以藉由以下方式獲得：於啤酒酵母菌內選擇性配對同型接合的異宗配合的(heterothallic)a/a和α/α二倍體，以及於畢赤酵母菌內藉由相繼的單倍體配對以獲得營養缺陷型的二倍體。舉例而言：一個[met his]單倍體可以配對以[ade his]單倍體以獲得二倍體[his]；以及一個[met arg]單倍體可以配對以[ade arg]單倍體以獲得二倍體[arg]；接而該二倍體[his]x二倍體[arg]以獲得一個四倍體原質營養生物。本技藝中具有技術的那些人會瞭解到提及二倍體細胞的優勢與用途也可以應用至四倍體細胞。
酵母菌配對：二個單倍體酵母菌細胞天然融合以形成一個二倍體酵母菌細胞之過程。
減數分裂：一個二倍體酵母菌細胞經歷減少性分裂以形成四個單倍體孢子產物之過程。各孢子接而可以生長且形成一個單倍體有生長力的成長細胞株。
可篩選標記：一可篩選標記是一基因或基因片段，其舉例而言經由一轉形事件，會賦予接受那個基因的細胞一種生長表現型(生理生長特徵)。可篩選標記允許那個細胞在未接受那個可篩選標記基因之細胞無法生長的條件下，可於一選擇性生長培養基中存活和生長。可篩選標記基因通常屬於數個類型，包括：正向可篩選標記基因，如：賦予一細胞對一抗生素或其他藥物之抗性的基因，或是當雜交2個溫度敏感(“ts”)突變型或是轉形1個ts突變型時，賦予一細胞對於溫度抗性之一基因；負向可篩選標記基因，如 生合成的基因，其賦予一細胞在缺乏一特定的營養素之培養基內生長的能力，該營養素係不具有那個生合成的基因之所有細胞所需者，或是致突變的生合成的基因，其賦予細胞因沒有該野生型基因的細胞而無法生長；和類似物。合適的標記包括但不限於：ZEO；G418；LYS3；MET1；MET3a；ADE1；ADE3；URA3；和類似物。
表現載體：此等DNA載體含有幫助操作一外來蛋白質於標的宿主細胞內表現之元素。方便地，首先於一細菌宿主，例如大腸桿菌內執行序列的操作和供轉形之DNA的生產，以及載體通常會包括促進此等操作的序列，包括複製之細菌來源及適當的細菌篩選標記。篩選標記係編碼經轉形的宿主細胞於一選擇性培養基中存活或是生長必須的蛋白質。宿主細胞若未經含有篩選基因的載體轉形，則無法在該培養基中存活。典型的篩選基因所編碼的蛋白質係(a)賦予對於抗生素或其他毒素之抗性，(b)補充營養缺陷型的缺陷(complement auxotrophic deficiencies)，或(c)供應無法從複合培養基取得的關鍵性營養素。例示性載體以及用於轉形酵母菌的方法係說明，舉例而言：於Burke,D.,Dawson,D.,& Stearns,T.(2000)。“Methods in Yeast Genetics：A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual.”Plainview,N.Y.：Cold Spring Harbor Laboratory Press之內。
供用於本發明的方法之表現載體會進一步包括酵母菌的特異性序列，包括一種用於辨識經轉形的酵母菌菌株之可選擇的營養缺陷型或藥物標記。一種藥物標記可 以進一步用來選擇擴增一酵母菌宿主細胞內的載體副本的數目。
編碼有興趣的序列之多肽係操作地連結至轉錄和轉譯調控序列，該轉錄和轉譯調控序列提供用於酵母菌細胞內之多肽的表現。此等載體組份可以包括，但不限於下列的一者或多者：一增強子元素、一啟動子，以及一轉錄終止序列。也可以包括關於該多肽的分泌之序列，例如一訊息序列，和類似物。一酵母菌的複製的原點是選擇性的，因表現載體往往被併入至酵母菌的基因體之內。於本發明的一個具體例中，有興趣的多肽係被操作地連結，或是被融合至來自酵母二倍體細胞之序列以提供最佳化的多肽分泌。
當核酸與另一個核酸序列置於一功能關係時，則該核酸係"操作地連結"。舉例而言，設若一訊息序列的DNA係表現為參與一多肽的分泌之前蛋白，則該訊息序列的DNA係操作地連結至該多肽的DNA；設若一啟動子或增強子影響一序列的轉錄，則該啟動子或增強子係操作地連結至該編碼序列。一般而言，“操作地連結”係指連接的DNA序列係相鄰的，及在分泌前導(secretory leader)的情況係相鄰及位於同一讀框中。然而，增強子不一定要相鄰。連結作用係在合宜的限制位址藉由連接作用而完成，或是任擇地透過本技藝中具有技術的那些人所熟悉的PCR/重組方法(Gateway® Technology；Invitrogen,Carlsbad California)予以完成。設若此等位址不存在，合成的寡核苷酸接合體或 連結子係依照慣用的慣例使用。
啟動子是座落於一結構基因的起始密碼子之上游(5')(通常在大約100至1000bp的範圍內)的未轉譯的序列，其控制其等操作地連結的特定核酸序列之轉錄和轉譯。此等啟動子屬於數個種類：可誘導性、構成性的(constitutive)，以及可抑制的啟動子(其等對缺乏抑制子反應而增加轉錄的位準)。可誘導性啟動子可以對培養條件的一些變化作出反應，例如，存在或是缺少一營養素或溫度的變化，而在其等的控制之下起始來自DNA之增加位準的轉錄。
酵母菌的啟動子片段也可以作用為同源重組的位址，以及表現載體併入至酵母菌的基因體之內的相同位址；任擇地，使用一可選擇的標記作為同源重組的位址。畢赤酵母菌的轉形係於Cregg等人，Mol.Cell.Biol.5：3376-3385，1985乙文中說明。
來自畢赤酵母菌的適宜啟動子之實例包括AOX1及啟動子(Cregg等人Mol.Cell.Biol. 9：1316-1323，(1989))；ICL1啟動子(Menendez等人Yeast 20(13)：1097-108，(2003))；甘油醛-3-磷酸去氫酶啟動子(GAP)(Waterham等人Gene 186(1)：37-44，(1997))；以及FLD1啟動子(Shen等人Gene 216(1)：93-102，(1998))。GAP啟動子係一強力的構成性啟動子，而AOX及FLD1啟動子係可誘導性啟動子。
其他的酵母菌啟動子包括：ADH1、乙醇去氫酶II、GAL4、PHO3、PHO5、Pyk，以及自其衍生的嵌合啟動子。此外，本發明中可以使用非酵母菌的啟動子，如：哺 乳動物、昆蟲、植物、爬蟲類、兩棲動物、病毒，以及鳥類的啟動子。最典型地，啟動子會包含一種哺乳動物的啟動子(可能對表現的基因是內源的)，或是會包含一種於酵母菌系統提供有效的轉錄之酵母菌的啟動子或是病毒的啟動子。
有興趣的多肽不僅可以直接重組生產，而且也可以為帶有一種異源多肽的融合多肽，異源多肽例如為訊息序列或在成熟蛋白或多肽的N端具有特定的分裂的位址之其他多肽。一般而言，訊息序列可以是載體的一個組份，或者其可以是插入至載體內的多肽編碼序列的一部分。選擇的異源訊息序列較佳係經由宿主細胞內的標準途徑之一者所辨識且處理者。啤酒酵母菌α因子原前訊息(pre-pro signal)已經被證實可有效分泌來自巴斯德畢赤酵母菌之各種重組型蛋白。其他的酵母菌訊息序列包括α配對因子訊息序列、轉化酶訊息序列，以及衍生自其他分泌的酵母菌多肽之訊息序列。此外，此等訊息胜肽序列可以是經工程化的，來用於提高於二倍體酵母菌表現系統內的分泌。其他有興趣的分泌訊息也包括哺乳動物的訊息序列，其等對於待分泌的蛋白可以是異源的，或是可以是待分泌的蛋白之天然序列。訊息序列包括：前胜肽序列(pre-peptide sequences)，以及於一些實例中，可以包括原胜肽序列。許多此等訊息序列係本技藝中所知道的，包括免疫球蛋白鏈上發現的訊息序列，例如K28原前毒素序列、PHA-E、FACE、人類MCP-1、人類血清白蛋白訊息序列、人類Ig重鏈、人類 Ig輕鏈，和類似物。舉例而言：參見Hashimoto等人，Protein Eng 11(2)75(1998)；以及Kobayashi等人，Therapeutic Apheresis 2(4)257(1998)。
轉錄作用可以藉由插入一種轉錄活化子序列至載體之內而增加。此等活化子係DNA的順式作用元素，通常大約自10至300bp，其等作用於一啟動子上以增加其之轉錄。轉錄增強子係相對地定位且位置獨立的，已經發現轉錄增強子位於轉錄單元的5'和3'，在一插入子之內，以及在編碼序列本身之內。增強子可以予以剪接至表現載體中位於編碼序列的5'或3'的一位置，但是較佳地係座落於啟動子的5'的位址。
真核宿主細胞中使用的表現載體也可以含有轉錄終止以及穩定mRNA必須的序列。此等序列通常可得自於真核或病毒DNA或cDNA之未轉譯區之轉譯終止密碼的3'。此等區域含有的核苷酸區段係轉錄為mRNA的未轉譯部分內聚腺苷酸化的片段。
使用標準的連接技術或PCR/重組方法來建構含有一個或多個以上列出的組份之合適的載體。將經單離的質體或DNA片段按產生所需質體所欲之形式切開、修改，以及再連接，或透過重組方法來產生。為了分析以確認建構的質體內之正確的序列，連接的混合物係使用來轉形宿主細胞，以及成功的轉形體係酌情藉由適當的抗生素抗性(例如氨比西林(ampicillin)或吉歐黴素(Zeocin))予以選擇。製備來自該等轉形體的質體，藉由限制核酸內切酶消化及/ 或定序予以分析。
以att位址為基礎的重組方法和重組酵素可以用來插入DNA序列至一載體之內，以作為片段的限制和連接的另一選擇。此等方法係說明於，舉例而言Landy Ann.Rev.Biochem.58：913-949(1989)乙文；以及是熟悉此藝者所知曉的。此等方法利用分子內DNA重組，係藉由λ(lambda)和大腸桿菌-編碼的重組型蛋白的混合物所媒介。重組作用發生於交互作用的DNA分子之特定的連接(att)位址之間。關於att位址的說明，參見Weisberg和Landy(1983)“Site-Specific Recombination in Phage Lambda,in Lambda II”，Weisberg,ed.(Cold Spring Harbor,N.Y.：Cold Spring Harbor Press)，pp.211-250。將位於重組位址的側邊之DNA區段交換，以致於在重組之後，att位址係由各親代載體所捐贈的序列所組成之雜種序列。重組作用能發生於任何拓撲的DNA之間。
Att位址可以藉由以下方式予以引導至有興趣的一序列之內：連接有興趣的序列至一適當的載體之內；經由使用專一的引子而產生含有att B位址之PCR產物；產生經選殖至含有att位址的適當的載體之內的cDNA存庫；以及類似物。
當使用於本文中，折疊係提及多肽與蛋白之三維結構，其中介於胺基酸殘基之間的交互作用係發揮功用而穩定該結構。雖然非共價的交互作用在決定結構上是重要的，但是通常有興趣的蛋白會具有由2個半胱胺酸殘基形成的分子內的及/或分子間的共價雙硫鍵。關於天然存在的蛋 白與多肽或衍生物以及其等之變異體，適當的折疊典型地導致最理想的生物活性之配置，以及能方便地藉由活性的分析予以監測，例如配體的結合、酵素活性，等等。
於一些實例中，舉例而言，所欲的產物係合成的來源製成時，以生物活性為基礎的分析法會是較無意義的。此等分子之適當的折疊可以基於生理性質、積極的考量、模式研究，和類似物來決定。
可以藉由引進編碼提高折疊和雙硫鍵的形成的一個或多個酶，也就是折疊酶、伴護蛋白(chaperonin)等等，的序列而進一步修飾表現宿主。此等序列可以利用本技藝中所知道的載體、標記等等，而構成地或可誘導地表現於酵母菌宿主細胞內。該序列所包括的轉錄調控元素係足以促成所欲的表現模式，及該序列較佳經由一種標定方法而穩定地併入至酵母菌的基因體之內。
舉例而言，真核的PDI不僅是蛋白半胱胺酸氧化和雙硫鍵同分異構作用之有效的催化劑，而且也顯現出伴護蛋白(chaperone)的活性。PDI的共表現能幫助具有多重的雙硫鍵之活性蛋白的生產。BIP(免疫球蛋白重鏈結合蛋白)；環胞菌素(cyclophilin)；和類似物的表現也是有興趣的。於本發明的一個具體例中，單倍體的親代菌株中之各者表現不同的折疊酶，例如，一菌株可以表現BIP，以及另一個菌株可以表現PDI或是其等之組合。
術語"所欲的蛋白"或是"所欲的抗體"係可交換地使用，以及一般係指對於一標的具有專一性之一親代抗 體，亦即本文中說明的一種CGRP或一嵌合或人類化抗體或自其所衍生的一結合部分。術語“抗體”係意欲包括任何含有多肽鏈的分子結構，其具有適合且辨識一抗原決定位之特定的形狀，其中一個或多個非共價的結合交互作用係穩定分子結構和抗原決定位之間的複合體。原始型抗體分子係免疫球蛋白，以及來自所有的來源之所有種類的免疫球蛋白、IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等等均被認為是“抗體”，例如來自人類、齧齒動物、兔、乳牛、綿羊、豬、狗、其他的哺乳動物、雞、其他的鳥類等等。依據本發明，適用作為生產抗體之起始材料之較佳的來源是兔子。許多的抗體編碼序列已經被描述過；以及其他者可以藉由本技藝中所熟知的方法予以培育出。其等之實例包括嵌合抗體、人類抗體與其他非人類的哺乳動物抗體、人類化抗體、單鏈抗體(如scFvs)、駱駝抗體(camelbodies)、奈米抗體(nanobodies)、IgNAR(衍生自鯊魚的單鏈抗體)、小分子免疫藥物(small-modular immunopharmaceuticals)(SMIPs)，以及抗體片段，如Fab、F(ab')2和類似物。參見Streltsov VA等人，Structure of a shark IgNAR antibody variable domain and modeling of an early-developmental isotype,Protein Sci.Nov；14(11)：2901-9(2005),Epub 2005 Sep 30；Greenberg AS等人，A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks,Nature,Mar 9；374(6518)：168-73(1995)；Nuttall SD等人，Isolation of the new antigen receptor from wobbegong sharks, and use as a scaffold for the display of protein loop libraries,Mol Immunol.Aug；38(4)：313-26(2001)；Hamers-Casterman C等人，Naturally occurring antibodies devoid of light chains,Nature.1993 Jun 3；363(6428)：446-8；Gill DS等人，Biopharmaceutical drug discovery using novel protein scaffolds,Curr Opin Biotechnol.Dec；17(6)：653-8(2006),Epub 2006 Oct 19。
舉例而言，抗體或抗原結合片段可以藉由基因工程予以生產。於此種技術中，如同用其他的方法，生產抗體的細胞係對所欲的抗原或免疫原敏化的(sensitized)。自抗體生產細胞單離的信使RNA使用作為一模板以利用PCR擴增來製造cDNA。藉由在表現載體中插入經擴增的免疫球蛋白cDNA之適當的區段而產生一個載體存庫，其中各載體含有保留起始的抗原專一性之一個重鏈基因和一個輕鏈基因。藉由將重鏈基因庫與輕鏈基因庫組合而建構一個組合存庫。此導致共表現一個重鏈與輕鏈(類似一抗體分子的Fab片段或是抗原結合片段)的純株存庫。將攜帶此等基因之載體共轉染至一種宿主細胞內。當誘導抗體基因於經轉染的宿主內合成時，重鏈與輕鏈蛋白會自行組裝以產生活性抗體，其等能藉由抗原或是免疫原篩選予以偵測。
有興趣的抗體編碼序列包括由天然序列所編碼的該等，以及由於遺傳密碼的簡併而與揭示的核酸在序列上不相同的核酸，以及其等之變異體。變異體多肽能包括胺基酸(“aa”)取代、加入或是刪除。胺基酸取代可以是守恆 性胺基酸取代或是消除非必須胺基酸之取代，例如改變一醣化作用的位址，或是藉由取代或刪除非功能所必需的一個或多個半胱胺酸殘基以使不當折疊最小化。可設計變異體以便保留或是提高蛋白的一特定區域(例如，一功能領域、催化作用的胺基酸殘基等等)之生物活性。變異體也包括本文中所揭示的多肽之片段，尤其生物活性片段及/或對應於功能領域的片段。選殖的基因之活體外的致突變的技術為已知的。本發明也包括已經使用普通的分子生物技術予以修飾的多肽，從而改善其等對蛋白水解性降解之抗性，或是使溶解度性質最佳化或是使其等成為更合適作為一治療劑。
可以藉由將獲得自一物種的抗體生產細胞之變異輕鏈區與重鏈區(VL和VH)，以及帶有來自另一者的恆定輕鏈區與重鏈區組合之重組方法，來製造嵌合抗體。嵌合抗體典型係使用齧齒動物或兔的變異區以及人類的恆定區，俾以生產主要是人類領域之抗體。此等嵌合抗體的生產係本技藝中所熟知的，以及可以藉由標準的方法予以達成(如同例如於美國專利案號5,624,659中說明的，其係以其之全體併入本文中以作為參考資料)。進一步預期到的是本發明的嵌合抗體之人類恆定區可以選自於IgG1、IgG2、IgG3或是IgG4恆定區。
人類化抗體係予以工程化以包含甚至更多的類人類的免疫球蛋白領域，以及僅併入動物衍生的抗體之互補決定區。此係透過檢查單株抗體的變異區之高度變異環 的序列，以使其等適合於人類抗體鏈的結構而完成。縱然表面錯綜複雜，在實施上方法是直接明確的。參見，例如美國專利案號6,187,287，其係完全併入本文中以作為參考資料。
除了完整的免疫球蛋白(或其等之重組對應體)之外，還可以合成包含抗原決定位結合位址的免疫球蛋白片段(例如，Fab、F(ab’)2，或是其他的片段)。“片段”，或是最小的免疫球蛋白可以使用重組免疫球蛋白的技術予以設計。例如，可以藉由合成一個融合的變異輕鏈區與一變異重鏈區而生產供用於本發明中的“Fv”免疫球蛋白。抗體的組合也是感興趣的，例如，二聚抗體(diabodies)，其等包含二個不同的Fv的專一性。於本發明的另一個具體例中，免疫球蛋白片段包含SMIPs(小分子免疫藥物)、駱駝抗體(camelbodies)、奈米抗體(nanobodies)，以及IgNAR。
免疫球蛋白以及其等之片段可以是，例如經轉譯後修飾的，以添加可以使用於本發明的方法和組成物內之效應部分，如化學連接子，可偵測的部分，如螢光染料、酶、毒素、受質、生物發光材料、放射材料、化學發光部分和類似物，或是專一的結合部分，如鏈黴抗生物素蛋白(streptavidin)、抗生物素蛋白(avidin)，或是生物素和類似物。以下提供額外的效應分子之實例。
設若依照遺傳密碼，轉譯多核苷酸序列會產出多肽序列(也就是，該多核苷酸序列"編碼"該多肽序列)，那麼一多核苷酸序列便"對應"於一多肽序列，設若二序列編碼 相同的多肽序列，那麼一多核苷酸序列便"對應"於另一個多核苷酸序列。
一種DNA建構物之"異源性"區域或領域是於一個更大的DNA分子內的DNA之可辨識的區段，該區段未發現與自然存在之該更大的分子有所關連。因此，當該異源性區域編碼一哺乳動物的基因時，該基因兩側的DNA在來源生物體的基因體中，通常並非側臨該哺乳類動物基因體DNA。另一個異源性區域的實例是一建構物，該編碼序列本身在自然界中不存在(例如，一個cDNA，其基因體編碼序列含有插入子，或是具有不同於天然的基因之密碼子的合成序列)。對偶基因的變異體或是天然發生的突變事件並不會產生如本文中所界定的DNA之異源性區域。
一個"編碼序列"是一種在架構上(in-frame)的密碼子序列，其(考慮到遺傳密碼)係對應於或是編碼一蛋白或胜肽序列。設若該等序列或是其等之互補序列編碼相同的胺基酸序列，那麼2個編碼序列係互相對應的。一個編碼序列連同適當的調控序列可以予以轉錄和轉譯成一種多肽。一聚腺苷酸化的訊息和轉錄終止序列通常會座落於該編碼序列的3'。一個"啟動子序列"是一DNA調控區域，其能夠結合細胞內的RNA聚合酶以及起始下游(3'方向)的編碼序列之轉錄。啟動子序列典型地含有供結合影響編碼序列的轉錄之調控分子(例如，轉錄因子)的額外位址。當RNA聚合酶結合細胞內的啟動子序列且轉錄該編碼序列成為mRNA時，一編碼序列係在該啟動子序列的"的控制之下"或是"操作地 連結"至該啟動子，該mRNA接而依序轉譯成該編碼序列所編碼的蛋白。
載體係用來引導一種外來物質，如DNA、RNA或蛋白質，進入一有機體或宿主細胞內。典型的載體包括重組型病毒(用於多核苷酸)和脂質體(用於多肽)。一種"DNA載體"是一個複製子，如質體、噬菌體或是黏接質體，另一個多核苷酸區段可以連接至其上，而導致連接的區段之複製作用。"表現載體"是含有調節序列之一種DNA載體，該調節序列引導一適當的宿主細胞之多肽合成作用。此通常意指一啟動子與RNA聚合酶結合並且起始mRNA的轉錄，以及核酸體結合位址和起始訊息以指示mRNA轉譯成多肽。在恰當的位址和於正確的閱讀架構上併入一種多核苷酸序列至一表現載體內，接著由載體轉形一適當的宿主細胞，使得能夠生產由該多核苷酸序列所編碼的一種多肽。
多核苷酸序列的"擴增"是活體外生產多副本的特定的核酸序列。經擴增的序列通常有DNA的形式。進行此擴增的各種技術係於Van Brunt的一回顧文章中說明(Bio/Technol.,8(4)：291-294(1990))。聚合酶連鎖反應或是PCR是核酸擴增的原型，以及本文中的PCR之使用應視為其他合適的擴增技術之例示。
脊椎動物(包括哺乳類動物)體內的抗體之一般結構現在是相當地瞭解的(Edelman,G.M.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,190：5(1971))。抗體係由分子量大概23,000道爾頓之2個相同的輕多肽鏈(“輕鏈”)，以及分子量53,000-70,000的2 個相同的重鏈(“重鏈”)所構成。4條鏈係藉由雙硫鍵予以結合成“Y”構型，其中重鏈係從“Y”構型的口部開始托住輕鏈。“Y”構型的“分支”部分係稱為Fab區域；“Y”構型的柄部分係稱為FC區域。胺基酸序列定位係自“Y”構型頂部的N端末端進行至各鏈底部的C端末端。N端末端擁有變異區，變異區對於引出(elicited)其之抗原具有專一性，及在長度上大概是100個胺基酸，於輕鏈與重鏈之間以及抗體至抗體之間有輕微的變異。
各鏈內的變異區係連結至一恆定區，其係延伸該鏈剩下的長度，以及在一特定種類的抗體中其不隨著抗體的專一性(也就是，引出其之抗原)而變化。有五種已知的主要種類的恆定區，其等決定免疫球蛋白分子的種類(IgG、IgM、IgA、IgD，以及IgE，對應於γ、μ、α、δ，和ε(加馬(gamma)、幕(mu)、阿伐(alpha)、德爾塔(delta)，或是艾普士龍(epsilon))重鏈恆定區)。恆定區或種類會決定抗體隨後的效應功能，包括補體的活化(Kabat,E.A.,Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry,2nd Ed.,p.413-436,Holt,Rinehart,Winston(1976))，以及其他的細胞反應(Andrews,D.W.，等人，Clinical Immunobiology,pp 1-18,W.B.Sanders(1980)；Kohl,S.，等人，Immunology,48：187(1983))；同時變異區決定其所反應的抗原。輕鏈分類為κ(卡巴(kappa))或是λ(lambda)。各重鏈種類能與κ或是λ輕鏈製備(prepared)。當由融合瘤或是由B細胞產生免疫球蛋白時，輕鏈與重鏈係互相共價鍵結，以及2個重鏈的“尾”部係 藉由共價的雙硫連結而互相鍵結。
措辭“變異區”或“VR”係提及一抗體內各對的輕鏈與重鏈內之領域，其等直接涉及抗體與抗原的結合。各重鏈在一端有一變異領域(VH)接著一些恆定領域。各輕鏈在一端有一變異領域(VL)以及在其之另一端有一恆定領域；輕鏈的恆定領域係與重鏈的第一恆定領域一起排列，以及輕鏈變異領域係與重鏈變異領域一起排列。
措辭“互補決定區”、“高度變異區”，或是“CDR”係提及一抗體的輕鏈或重鏈之變異區內存在的一個或多個高度變異或互補決定區(CDRs)(參見Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,(1987))。此等措辭包括像是由Kabat等人所定義的高度變異區(“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”Kabat E.，等人，US Dept.of Health and Human Services,1983)或是抗體的3維結構中的高度變異環(Chothia和Lesk,J Mol.Biol.196 901-917(1987))。各鏈內的CDRs係藉由架構區而保持很靠近以及，與另一個鏈的CDRs一起促成抗原結合位址的形成。在CDRs之內，有已經被說明為選擇性決定區(SDRs)之選出的胺基酸，其等代表抗體-抗原交互作用中CDR所使用的關鍵接觸殘基(Kashmiri,S.,Methods,36：25-34(2005))。
措辭“架構區”或“FR”係提及在一抗體的輕鏈與重鏈之變異區內的一個或多個架構區(參見Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health,Bethesda,Md.,(1987))。此等措辭包括插入於一抗體的輕與重鏈之變異區內的CDRs之間的胺基酸序列區域。
具有CGRP的結合活性之抗CGRP抗體與其等之結合片段
本發明方法之例示性具體例包含投藥抗CGRP抗體與其等之片段至主體。例示性抗CGRP抗體與片段係描述於美國專利公開案第2012/0294797號中，其係以其之全體併入本文中以作為參考資料，以及額外的例示性抗CGRP抗體係描述接下來的段落中。
抗體Ab1
於一個具體例中，本發明包括嵌合抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一可變異輕鏈序列：QVLTQTASPVSAAVGSTVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDLECADAATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTEVVVKR(序列辨識編號：1)。
本發明亦包括嵌合抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一輕鏈序列：QVLTQTASPVSAAVGSTVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDLECADAATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(序列辨識編號：2)。
本發明進一步包括嵌合抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一可變異重鏈序列： (序列辨識編號：3)。
本發明亦包括嵌合抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一重鏈序列： (序列辨識編號：4)。
本發明進一步預期包含以下的抗體：序列辨識編號：5；序列辨識編號：6；和序列辨識編號：7的多肽序列之一者或多者，其等係對應至序列辨識編號：1的可變異輕鏈序列或序列辨識編號：2的輕鏈序列之互補決定區(CDRs， 或高度變異區)，及/或序列辨識編號：8；序列辨識編號：9；和序列辨識編號：10的多肽序列之一者或多者，其等係對應至序列辨識編號：3的可變異重鏈序列或序列辨識編號：4的重鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)，或是此等多肽序列的組合。於本發明的另一個具體例中，本發明的抗體與其等之片段包含以上提出的CDRs、可變異重鏈與可變異輕鏈序列，及重鏈與輕鏈序列之一者或多者的組合，或任擇地由其等所組成，包括其等之全體。
本發明亦預期具有CGRP的結合專一性之抗體的片段。於本發明的一個具體例中，本發明的抗體片段包含序列辨識編號：1或序列辨識編號：2的多肽序列，或任擇地由序列辨識編號：1或序列辨識編號：2的多肽序列所組成。於本發明的另一個具體例中，本發明的抗體片段包含序列辨識編號：3或序列辨識編號：4的多肽序列，或是任擇地由序列辨識編號：3或序列辨識編號：4的多肽序列所組成。
於本發明的一個另外的具體例中，具有CGRP結合專一性之抗體片段包含序列辨識編號：5；序列辨識編號：6；和序列辨識編號：7的多肽序列之一者或多者，或是任擇地由序列辨識編號：5；序列辨識編號：6；和序列辨識編號：7的多肽序列之一者或多者所組成，其等係對應至序列辨識編號：1的可變異輕鏈序列或序列辨識編號：2的輕鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)。
於本發明的一個另外的具體例中，具有CGRP結 合專一性之抗體片段包含序列辨識編號：8；序列辨識編號：9；和序列辨識編號：10的多肽序列之一者或多者，或是任擇地由序列辨識編號：8；序列辨識編號：9；和序列辨識編號：10的多肽序列之一者或多者所組成，其等係對應至序列辨識編號：3的可變異重鏈序列或序列辨識編號：4的重鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)。
本發明亦預期包括本文中說明的抗體片段之一者或多者的抗體片段。於本發明的一個具體例中，具有CGRP結合專一性的抗體片段係包含，或任擇地由下列的抗體片段的一、二、三或更多者，包括全部，所組成：序列辨識編號：1的可變異輕鏈區；序列辨識編號：3的可變異重鏈區；序列辨識編號：1的可變異輕鏈區之互補決定區(序列辨識編號：5；序列辨識編號：6；和序列辨識編號：7)；以及序列辨識編號：3的可變異重鏈區之互補決定區(序列辨識編號：8；序列辨識編號：9；和序列辨識編號：10)。
於本發明的一個特別佳的具體例中，嵌合抗CGRP抗體係Ab1，其包含序列辨識編號：2與序列辨識編號：4，或是任擇地由序列辨識編號：2與序列辨識編號：4所組成，以及具有至少一種本文提出的生物活性。
於本發明之另外的較佳具體例中，抗體片段包含，或任擇地由具有CGRP結合專一性的Fab(片段抗原結合(fragment antigen binding))片段所組成。關於抗體Ab1，Fab片段包括序列辨識編號：1的可變異輕鏈序列和序列辨識編號：3的可變異重鏈序列。本發明的此具體例進一步預期在 該Fab中的序列辨識編號：1及/或序列辨識編號：3之加入作用、刪除作用及變異體，同時保留CGRP結合專一性。
在此(下文)所述之本發明的一具體例中，可藉由Ab1的酶消化作用(如木瓜酶)，產生Fab片段。在本發明的另一具體例中，可經由在諸如CHO、NSO或HEK 293細胞的哺乳類動物細胞、真菌、昆蟲或微生物系統諸如酵母菌細胞(例如諸如二倍體畢赤酵母菌屬(Pichia)之二倍體酵母菌)與其他酵母菌株中的表現作用，產生抗CGRP抗體，諸如Ab1或其Fab片段。適宜的畢赤酵母菌屬(Pichia)物種包括，但不限於巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris)。
抗體Ab2
於一個具體例中，本發明包括人類化抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一可變 異輕鏈序列： 序列辨識編號：11)。
本發明亦包括人類化抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一輕鏈序列： (序列辨識編號：12)。
本發明進一步包括人類化抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一可變異重鏈序列： ( 序列辨識編號：13)。
本發明亦包括人類化抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一重鏈序列： (序列辨識編號：14)。
本發明進一步預期包含以下的抗體：序列辨識編號：15；序列辨識編號：16；和序列辨識編號：17的多肽序列之一者或多者，其等係對應至序列辨識編號：11的可 變異輕鏈序列或序列辨識編號：12的輕鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)，及/或序列辨識編號：18；序列辨識編號：19；和序列辨識編號：20的多肽序列之一者或多者，其等係對應至序列辨識編號：13的可變異重鏈序列或序列辨識編號：14的重鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)，或是此等多肽序列的組合。於本發明的另一個具體例中，本發明的抗體與其等之片段包含以上提出的CDRs、可變異重鏈與可變異輕鏈序列，以及重鏈與輕鏈序列之一者或多者的組合，或任擇地由其等所組成，包括其等之全體。
本發明亦預期具有CGRP的結合專一性之抗體的片段。於本發明的一個具體例中，本發明的抗體片段包含序列辨識編號：11或序列辨識編號：12的多肽序列，或任擇地由序列辨識編號：11或序列辨識編號：12的多肽序列所組成。於本發明的另一個具體例中，本發明的抗體片段包含序列辨識編號：13或序列辨識編號：14的多肽序列，或任擇地由序列辨識編號：13或序列辨識編號：14的多肽序列所組成。
於本發明的一個另外的具體例中，具有CGRP結合專一性之抗體片段包含序列辨識編號：15；序列辨識編號：16；和序列辨識編號：17的多肽序列之一者或多者，或是任擇地由序列辨識編號：15；序列辨識編號：16；和序列辨識編號：17的多肽序列之一者或多者所組成，其等係對應至序列辨識編號：11的可變異輕鏈序列或序列辨識 編號：12的輕鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)。
於本發明的一個另外的具體例中，具有CGRP結合專一性之抗體片段包含序列辨識編號：18；序列辨識編號：19；和序列辨識編號：20的多肽序列之一者或多者，或是任擇地由序列辨識編號：18；序列辨識編號：19；和序列辨識編號：20的多肽序列之一者或多者所組成，其等係對應至序列辨識編號：13的可變異重鏈序列或序列辨識編號：14的重鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)。
本發明亦預期包括本文中說明的抗體片段之一者或多者的抗體片段。於本發明的一個具體例中，具有CGRP結合專一性的抗體片段係包含，或任擇地由下列的抗體片段的一、二、三或更多者，包括全部，所組成：序列辨識編號：11的可變異輕鏈區；序列辨識編號：13的可變異重鏈區；序列辨識編號：11的可變異輕鏈區之互補決定區(序列辨識編號：15；序列辨識編號：16；和序列辨識編號：17)；以及序列辨識編號：13的可變異重鏈區之互補決定區(序列辨識編號：18；序列辨識編號：19；和序列辨識編號：20)。
於本發明的一個具體例中，人類化抗CGRP抗體係Ab2，其包含序列辨識編號：12與序列辨識編號：14，或是任擇地由序列辨識編號：12與序列辨識編號：14所組成，以及具有至少一種本文提出的生物活性。
於本發明之另外的具體例中，抗體片段包含，或任擇地由具有CGRP結合專一性的Fab(片段抗原結合)片段 所組成。關於抗體Ab2，Fab片段包括序列辨識編號：11的可變異輕鏈序列和序列辨識編號：13的可變異重鏈序列。本發明的此具體例進一步預期在該Fab中的序列辨識編號：11及/或序列辨識編號：13之加入作用、刪除作用及變異體，同時保留CGRP結合專一性。
在此(下文)所述之本發明的一具體例中，可藉由Ab2的酶消化作用(如木瓜酶)，產生Fab片段。在本發明的另一具體例中，可經由在諸如CHO、NSO或HEK 293細胞的哺乳類動物細胞、真菌、昆蟲或微生物系統諸如酵母菌細胞(例如諸如二倍體畢赤酵母菌屬(Pichia)之二倍體酵母菌)與其他酵母菌株中的表現作用，產生抗CGRP抗體，諸如Ab2或其Fab片段。適宜的畢赤酵母菌屬(Pichia)物種包括，但不限於巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris)。
抗體Ab3
於一個具體例中，本發明包括人類化抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一可變 異輕鏈序列： (序列辨識編號：21)。
本發明亦包括人類化抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一輕鏈序列： (序列辨識編號：22)。
本發明進一步包括人類化抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一可變異重鏈序列： (序列辨識編號：23)。
本發明亦包括人類化抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一重鏈序列： (序列辨識編號：24)。
本發明進一步預期包含以下的抗體：序列辨識編號：25；序列辨識編號：26；和序列辨識編號：27的多肽序列之一者或多者，其等係對應至序列辨識編號：21的可變異輕鏈序列或序列辨識編號：22的輕鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)，及/或序列辨識編號：28；序列辨識編號：29；和序列辨識編號：30的多肽序列之一者或多者，其等係對應至序列辨識編號：23的可變異重鏈序列或序列辨識編號：24的重鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)，或是此等多肽序列的組合。於本發明的另一個具體例中，本發明的抗體與其等之片段包含以上提出的CDRs、可變異重鏈與可變異輕鏈序列，及重鏈與輕鏈序列之一者或多者的組合，或任擇地由其等所組成，包括其等之全體。
本發明亦預期具有CGRP的結合專一性之抗體的片段。於本發明的一個具體例中，本發明的抗體片段包含序列辨識編號：21或序列辨識編號：22的多肽序列，或任擇地由序列辨識編號：21或序列辨識編號：22的多肽序列所組成。於本發明的另一個具體例中，本發明的抗體片段包含序列辨識編號：23或序列辨識編號：24的多肽序列，或任擇地由序列辨識編號：23或序列辨識編號：24的多肽序列所組成。
於本發明的一個另外的具體例中，具有CGRP結合專一性之抗體片段包含序列辨識編號：25；序列辨識編號：26；和序列辨識編號：27的多肽序列之一者或多者， 或是任擇地由序列辨識編號：25；序列辨識編號：26；和序列辨識編號：27的多肽序列之一者或多者所組成，其等係對應至序列辨識編號：21的可變異輕鏈序列或序列辨識編號：22的輕鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)。
於本發明的一個另外的具體例中，具有CGRP結合專一性之抗體片段包含序列辨識編號：28；序列辨識編號：29；和序列辨識編號：30的多肽序列之一者或多者，或是任擇地由序列辨識編號：28；序列辨識編號：29；和序列辨識編號：30的多肽序列之一者或多者所組成，其等係對應至序列辨識編號：23的可變異重鏈序列或序列辨識編號：24的重鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)。
本發明亦預期包括本文中說明的抗體片段之一者或多者的抗體片段。於本發明的一個具體例中，具有CGRP結合專一性的抗體片段係包含，或任擇地由下列的抗體片段的一、二、三或更多者，包括全部，所組成：序列辨識編號：21的可變異輕鏈區；序列辨識編號：23的可變異重鏈區；序列辨識編號：21的可變異輕鏈區之互補決定區(序列辨識編號：25；序列辨識編號：26；和序列辨識編號：27)；以及序列辨識編號：23的可變異重鏈區之互補決定區(序列辨識編號：28；序列辨識編號：29；和序列辨識編號：30)。
於本發明的一個具體例中，嵌合抗CGRP抗體係Ab3，其包含序列辨識編號：22與序列辨識編號：24，或是任擇地由序列辨識編號：22與序列辨識編號：24所組成， 以及具有至少一種本文提出的生物活性。
於本發明之另外的具體例中，抗體片段包含，或任擇地由具有CGRP結合專一性的Fab(片段抗原結合)片段所組成。關於抗體Ab3，Fab片段包括序列辨識編號：21的可變異輕鏈序列和序列辨識編號：23的可變異重鏈序列。本發明的此具體例進一步預期在該Fab中的序列辨識編號：21及/或序列辨識編號：23之加入作用、刪除作用及變異體，同時保留CGRP結合專一性。
在此(下文)所述之本發明的一具體例中，可藉由Ab3的酶消化作用(如木瓜酶)，產生Fab片段。在本發明的另一具體例中，可經由在諸如CHO、NSO或HEK 293細胞的哺乳類動物細胞、真菌、昆蟲或微生物系統諸如酵母菌細胞(例如諸如二倍體畢赤酵母菌屬(Pichia)之二倍體酵母菌)與其他酵母菌株中的表現作用，產生抗CGRP抗體，諸如Ab3或其Fab片段。適宜的畢赤酵母菌屬(Pichia)物種包括，但不限於巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris)。
抗體Ab4
於一個具體例中，本發明包括嵌合抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一可變異 輕鏈序列： (序列辨識編號：31)。
本發明亦包括嵌合抗體，其具有CGRP結合專一 性及擁有包含以下提出的序列之一輕鏈序列：
(序列辨識編號：32)。
本發明進一步包括嵌合抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一可變異重鏈序列： (序列辨識編號： 33)。
本發明亦包括嵌合抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一重鏈序列： (序列辨識編號：34)。
本發明進一步預期包含以下的抗體：序列辨識編號：35；序列辨識編號：36；和序列辨識編號：37的多肽序列之一者或多者，其等係對應至序列辨識編號：31的可變異輕鏈序列或序列辨識編號：32的輕鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)，及/或序列辨識編號：38；序列辨識編號：39；和序列辨識編號：40的多肽序列之一者或多者，其等係對應至序列辨識編號：33的可變異重鏈序列或序列辨識編號：34的重鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)，或是此等多肽序列的組合。於本發明的另一個具體例中，本發明的抗體與其等之片段包含以上提出的CDRs、可變異重鏈與可變異輕鏈序列，及重鏈與輕鏈序列之一者或多者的組合，或任擇地由其等所組成，包括其等之全體。
本發明亦預期具有CGRP的結合專一性之抗體的片段。於本發明的一個具體例中，本發明的抗體片段包含序列辨識編號：31或序列辨識編號：32的多肽序列，或任擇地由序列辨識編號：31或序列辨識編號：32的多肽序列所組成。於本發明的另一個具體例中，本發明的抗體片段包含序列辨識編號：33或序列辨識編號：34的多肽序列，或任擇地由序列辨識編號：33或序列辨識編號：34的多肽序列所組成。
於本發明的一個另外的具體例中，具有CGRP結合專一性之抗體片段包含序列辨識編號：35；序列辨識編號：36；和序列辨識編號：37的多肽序列之一者或多者，或是任擇地由序列辨識編號：35；序列辨識編號：36；和序列辨識編號：37的多肽序列之一者或多者所組成，其等係對應至序列辨識編號：31的可變異輕鏈序列或序列辨識編號：32的輕鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)。
於本發明的一個另外的具體例中，具有CGRP結合專一性之抗體片段包含序列辨識編號：38；序列辨識編號：39；和序列辨識編號：40的多肽序列之一者或多者，或是任擇地由序列辨識編號：38；序列辨識編號：39；和序列辨識編號：40的多肽序列之一者或多者所組成，其等係對應至序列辨識編號：33的可變異重鏈序列或序列辨識編號：34的重鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)。
本發明亦預期包括本文中說明的抗體片段之一者或多者的抗體片段。於本發明的一個具體例中，具有CGRP結合專一性的抗體片段係包含，或任擇地由下列的抗體片段的一、二、三或更多者，包括全部，所組成：序列辨識編號：31的可變異輕鏈區；序列辨識編號：33的可變異重鏈區；序列辨識編號：31的可變異輕鏈區之互補決定區(序列辨識編號：35；序列辨識編號：36；和序列辨識編號：37)；以及序列辨識編號：33的可變異重鏈區之互補決定區(序列辨識編號：38；序列辨識編號：39；和序列辨識編號：40)。
於本發明的一個具體例中，人類化抗CGRP抗體係Ab4，其包含序列辨識編號：32與序列辨識編號：34，或是任擇地由序列辨識編號：32與序列辨識編號：34所組成，以及具有至少一種本文提出的生物活性。
於本發明之另外的具體例中，抗體片段包含，或任擇地由具有CGRP結合專一性的Fab(片段抗原結合)片段所組成。關於抗體Ab4，Fab片段包括序列辨識編號：31的可變異輕鏈序列和序列辨識編號：33的可變異重鏈序列。本發明的此具體例進一步預期在該Fab中的序列辨識編號：31及/或序列辨識編號：33之加入作用、刪除作用及變異體，同時保留CGRP結合專一性。
在此(下文)所述之本發明的一具體例中，可藉由Ab4的酶消化作用(如木瓜酶)，產生Fab片段。在本發明的另一具體例中，可經由在諸如CHO、NSO或HEK 293細胞的哺乳類動物細胞、真菌、昆蟲或微生物系統諸如酵母菌細胞(例如諸如二倍體畢赤酵母菌屬(Pichia)之二倍體酵母菌)與其他酵母菌株中的表現作用，產生抗CGRP抗體，諸如Ab4或其Fab片段。適宜的畢赤酵母菌屬(Pichia)物種包括，但不限於巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris)。
抗體Ab5
於一個具體例中，本發明包括人類化抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一可變 異輕鏈序列： (序列辨識編號：41)。
本發明亦包括人類化抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一輕鏈序列： (序列辨識編號：42)。
本發明進一步包括人類化抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一可變異重鏈序列： ( 序列辨識編號：43)。
本發明亦包括人類化抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一重鏈序列： (序列辨識編號：44)。
本發明進一步預期包含以下的抗體：序列辨識編號：45；序列辨識編號：46；和序列辨識編號：47的多肽序列之一者或多者，其等係對應至序列辨識編號：41的可變異輕鏈序列或序列辨識編號：42的輕鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)，及/或序列辨識編號：48；序列辨識編號：49；和序列辨識編號：50的多肽序列之一者或多者，其等係對應至序列辨識編號：43的可變異重鏈序列或序列辨識編號：44的重鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)，或是此等多肽序列的組合。於本發明的另一個具體例中，本發明的抗體與其等之片段包含以上提出的CDRs、可變異重鏈與可變異輕鏈序列，及重鏈與輕鏈序列之一者或多者的組合，或任擇地由其等所組成，包括其等之全體。
本發明亦預期具有CGRP的結合專一性之抗體的片段。於本發明的一個具體例中，本發明的抗體片段包含序列辨識編號：41或序列辨識編號：42的多肽序列，或任擇地由序列辨識編號：41或序列辨識編號：42的多肽序列所組成。於本發明的另一個具體例中，本發明的抗體片段 包含序列辨識編號：43或序列辨識編號：44的多肽序列，或任擇地由序列辨識編號：43或序列辨識編號：44的多肽序列所組成。
於本發明的一個另外的具體例中，具有CGRP結合專一性之抗體片段包含序列辨識編號：45；序列辨識編號：46；和序列辨識編號：47的多肽序列之一者或多者，或是任擇地由序列辨識編號：45；序列辨識編號：46；和序列辨識編號：47的多肽序列之一者或多者所組成，其等係對應至序列辨識編號：41的可變異輕鏈序列或序列辨識編號：42的輕鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)。
於本發明的一個另外的具體例中，具有CGRP結合專一性之抗體片段包含序列辨識編號：48；序列辨識編號：49；和序列辨識編號：50的多肽序列之一者或多者，或是任擇地由序列辨識編號：48；序列辨識編號：49；和序列辨識編號：50的多肽序列之一者或多者所組成，其等係對應至序列辨識編號：43的可變異重鏈序列或序列辨識編號：44的重鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)。
本發明亦預期包括本文中說明的抗體片段之一者或多者的抗體片段。於本發明的一個具體例中，具有CGRP結合專一性的抗體片段係包含，或任擇地由下列的抗體片段的一、二、三或更多者，包括全部，所組成：序列辨識編號：41的可變異輕鏈區；序列辨識編號：43的可變異重鏈區；序列辨識編號：41的可變異輕鏈區之互補決定區(序列辨識編號：45；序列辨識編號：46；和序列辨識編 號：47)；以及序列辨識編號：43的可變異重鏈區之互補決定區(序列辨識編號：48；序列辨識編號：49；和序列辨識編號：50)。
於本發明的一個具體例中，嵌合抗CGRP抗體係Ab5，其包含序列辨識編號：42與序列辨識編號：44，或是任擇地由序列辨識編號：42與序列辨識編號：44所組成，以及具有至少一種本文提出的生物活性。
於本發明之另外的具體例中，抗體片段包含，或任擇地由具有CGRP結合專一性的Fab(片段抗原結合)片段所組成。關於抗體Ab5，Fab片段包括序列辨識編號：41的可變異輕鏈序列和序列辨識編號：43的可變異重鏈序列。本發明的此具體例進一步預期在該Fab中的序列辨識編號：41及/或序列辨識編號：43之加入作用、刪除作用及變異體，同時保留CGRP結合專一性。
在此(下文)所述之本發明的一具體例中，可藉由Ab5的酶消化作用(如木瓜酶)，產生Fab片段。在本發明的另一具體例中，可經由在諸如CHO、NSO或HEK 293細胞的哺乳類動物細胞、真菌、昆蟲或微生物系統諸如酵母菌細胞(例如諸如二倍體畢赤酵母菌屬(Pichia)之二倍體酵母菌)與其他酵母菌株中的表現作用，產生抗CGRP抗體，諸如Ab5或其Fab片段。適宜的畢赤酵母菌屬(Pichia)物種包括，但不限於巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris)。
抗體Ab6
於一個具體例中，本發明包括人類化抗體，其具 有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一可變 異輕鏈序列：
(序列辨識編號：51)。
本發明亦包括人類化抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一輕鏈序列： (序列辨識編號：52)。
本發明進一步包括人類化抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一可變異重鏈序列： ( 序列辨識編號：53)。
本發明亦包括人類化抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一重鏈序列： (序列辨識編號：54)。
本發明進一步預期包含以下的抗體：序列辨識編號：55；序列辨識編號：56；和序列辨識編號：57的多肽序列之一者或多者，其等係對應至序列辨識編號：51的可變異輕鏈序列或序列辨識編號：52的輕鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)，及/或序列辨識編號：58；序列辨識編號：59；和序列辨識編號：60的多肽序列之一者或多者，其等係對應至序列辨識編號：53的可變異重鏈序列或序列辨識編號：54的重鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)，或是此等多肽序列的組合。於本發明的另一個具體例中，本發明的抗體與其等之片段包含以上提出的CDRs、可變異重鏈與可變異輕鏈序列，及重鏈與輕鏈序列之一者或多者的組合，或任擇地由其等所組成，包括其等之全體。
本發明亦預期具有CGRP的結合專一性之抗體的片段。於本發明的一個具體例中，本發明的抗體片段包含 序列辨識編號：51或序列辨識編號：52的多肽序列，或任擇地由序列辨識編號：51或序列辨識編號：52的多肽序列所組成。於本發明的另一個具體例中，本發明的抗體片段包含序列辨識編號：53或序列辨識編號：54的多肽序列，或任擇地由序列辨識編號：53或序列辨識編號：54的多肽序列所組成。
於本發明的一個另外的具體例中，具有CGRP結合專一性之抗體片段包含序列辨識編號：55；序列辨識編號：56；和序列辨識編號：57的多肽序列之一者或多者，或是任擇地由序列辨識編號：55；序列辨識編號：56；和序列辨識編號：57的多肽序列之一者或多者所組成，其等係對應至序列辨識編號：51的可變異輕鏈序列或序列辨識編號：52的輕鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)。
於本發明的一個另外的具體例中，具有CGRP結合專一性之抗體片段包含序列辨識編號：58；序列辨識編號：59；和序列辨識編號：60的多肽序列之一者或多者，或是任擇地由序列辨識編號：58；序列辨識編號：59；和序列辨識編號：60的多肽序列之一者或多者所組成，其等係對應至序列辨識編號：53的可變異重鏈序列或序列辨識編號：54的重鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)。
本發明亦預期包括本文中說明的抗體片段之一者或多者的抗體片段。於本發明的一個具體例中，具有CGRP結合專一性的抗體片段係包含，或任擇地由下列的抗體片段的一、二、三或更多者，包括全部，所組成：序列 辨識編號：51的可變異輕鏈區；序列辨識編號：53的可變異重鏈區；序列辨識編號：51的可變異輕鏈區之互補決定區(序列辨識編號：55；序列辨識編號：56；和序列辨識編號：57)；以及序列辨識編號：53的可變異重鏈區之互補決定區(序列辨識編號：58；序列辨識編號：59；和序列辨識編號：60)。
於本發明的一個具體例中，人類化抗CGRP抗體係Ab6，其包含序列辨識編號：52與序列辨識編號：54，或是任擇地由序列辨識編號：52與序列辨識編號：54所組成，以及具有至少一種本文提出的生物活性。
於本發明之另外的具體例中，抗體片段包含，或任擇地由具有CGRP結合專一性的Fab(片段抗原結合)片段所組成。關於抗體Ab6，Fab片段包括序列辨識編號：51的可變異輕鏈序列和序列辨識編號：53的可變異重鏈序列。本發明的此具體例進一步預期在該Fab中的序列辨識編號：51及/或序列辨識編號：53之加入作用、刪除作用及變異體，同時保留CGRP結合專一性。
在此(下文)所述之本發明的一具體例中，可藉由Ab6的酶消化作用(如木瓜酶)，產生Fab片段。在本發明的另一具體例中，可經由在諸如CHO、NSO或HEK 293細胞的哺乳類動物細胞、真菌、昆蟲或微生物系統諸如酵母菌細胞(例如諸如二倍體畢赤酵母菌屬(Pichia)之二倍體酵母菌)與其他酵母菌株中的表現作用，產生抗CGRP抗體，諸如Ab6或其Fab片段。適宜的畢赤酵母菌屬(Pichia)物種包括， 但不限於巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris)。
抗體Ab7
於一個具體例中，本發明包括嵌合抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一可變異 輕鏈序列： (序列辨識編號：61)。
本發明亦包括嵌合抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一輕鏈序列： (序列辨識編號：62)。
本發明進一步包括嵌合抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一可變異重鏈序列： (序列辨識編 號：63)。
本發明亦包括嵌合抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一重鏈序列： (序列辨識編號：64)。
本發明進一步預期包含以下的抗體：序列辨識編號：65；序列辨識編號：66；和序列辨識編號：67的多肽序列之一者或多者，其等係對應至序列辨識編號：61的可變異輕鏈序列或序列辨識編號：62的輕鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)，及/或序列辨識編號：68；序列辨識編號：69；和序列辨識編號：70的多肽序列之一者或多者，其等係對應至序列辨識編號：63的可變異重鏈序列或序列辨識編號：64的重鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)，或是此等多肽序列的組合。於本發明的另一個具體例中，本發明的抗體與其等之片段包含以上提出的CDRs、可變異重鏈與可變異輕鏈序列，及重鏈與輕鏈序列之一者或多者的組合，或任擇地由其等所組成，包括其等 之全體。
本發明亦預期具有CGRP的結合專一性之抗體的片段。於本發明的一個具體例中，本發明的抗體片段包含序列辨識編號：61或序列辨識編號：62的多肽序列，或任擇地由序列辨識編號：61或序列辨識編號：62的多肽序列所組成。於本發明的另一個具體例中，本發明的抗體片段包含序列辨識編號：63或序列辨識編號：64的多肽序列，或任擇地由序列辨識編號：63或序列辨識編號：64的多肽序列所組成。
於本發明的一個另外的具體例中，具有CGRP結合專一性之抗體片段包含序列辨識編號：65；序列辨識編號：66；和序列辨識編號：67的多肽序列之一者或多者，或是任擇地由序列辨識編號：65；序列辨識編號：66；和序列辨識編號：67的多肽序列之一者或多者所組成，其等係對應至序列辨識編號：61的可變異輕鏈序列或序列辨識編號：62的輕鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)。
於本發明的一個另外的具體例中，具有CGRP結合專一性之抗體片段包含序列辨識編號：68；序列辨識編號：69；和序列辨識編號：70的多肽序列之一者或多者，或是任擇地由序列辨識編號：68；序列辨識編號：69；和序列辨識編號：70的多肽序列之一者或多者所組成，其等係對應至序列辨識編號：63的可變異重鏈序列或序列辨識編號：64的重鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)。
本發明亦預期包括本文中說明的抗體片段之一 者或多者的抗體片段。於本發明的一個具體例中，具有CGRP結合專一性的抗體片段係包含，或任擇地由下列的抗體片段的一、二、三或更多者，包括全部，所組成：序列辨識編號：61的可變異輕鏈區；序列辨識編號：63的可變異重鏈區；序列辨識編號：61的可變異輕鏈區之互補決定區(序列辨識編號：65；序列辨識編號：66；和序列辨識編號：67)；以及序列辨識編號：63的可變異重鏈區之互補決定區(序列辨識編號：68；序列辨識編號：69；和序列辨識編號：70)。
於本發明的一個特別佳的具體例中，嵌合抗CGRP抗體係Ab7，其包含序列辨識編號：62與序列辨識編號：64，或是任擇地由序列辨識編號：62與序列辨識編號：64所組成，以及具有至少一種本文提出的生物活性。
於本發明之另外的具體例中，抗體片段包含，或任擇地由具有CGRP結合專一性的Fab(片段抗原結合)片段所組成。關於抗體Ab7，Fab片段包括序列辨識編號：61的可變異輕鏈序列和序列辨識編號：63的可變異重鏈序列。本發明的此具體例進一步預期在該Fab中的序列辨識編號：61及/或序列辨識編號：63之加入作用、刪除作用及變異體，同時保留CGRP結合專一性。
在此(下文)所述之本發明的一具體例中，可藉由Ab7的酶消化作用(如木瓜酶)，產生Fab片段。在本發明的另一具體例中，可經由在諸如CHO、NSO或HEK 293細胞的哺乳類動物細胞、真菌、昆蟲或微生物系統諸如酵母菌 細胞(例如諸如二倍體畢赤酵母菌屬(Pichia)之二倍體酵母菌)與其他酵母菌株中的表現作用，產生抗CGRP抗體，諸如Ab7或其Fab片段。適宜的畢赤酵母菌屬(Pichia)物種包括，但不限於巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris)。
抗體Ab8
於一個具體例中，本發明包括人類化抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一可變 異輕鏈序列： (序列辨識編號：71)。
本發明亦包括人類化抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一輕鏈序列： (序列辨識編號：72)。
本發明進一步包括人類化抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一可變異重鏈序列： ( 序列辨識編號：73)。
本發明亦包括人類化抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一重鏈序列： (序列辨識編號：74)。
本發明進一步預期包含以下的抗體：序列辨識編號：75；序列辨識編號：76；和序列辨識編號：77的多肽序列之一者或多者，其等係對應至序列辨識編號：71的可變異輕鏈序列或序列辨識編號：72的輕鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)，及/或序列辨識編號：78；序列辨識編號：79；和序列辨識編號：80的多肽序列之一者或多者，其等係對應至序列辨識編號：73的可變異重鏈序列或序列辨識編號：74的重鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)，或是此等多肽序列的組合。於本發明的另一個 具體例中，本發明的抗體與其等之片段包含以上提出的CDRs、可變異重鏈與可變異輕鏈序列，及重鏈與輕鏈序列之一者或多者的組合，或任擇地由其等所組成，包括其等之全體。
本發明亦預期具有CGRP的結合專一性之抗體的片段。於本發明的一個具體例中，本發明的抗體片段包含序列辨識編號：71或序列辨識編號：72的多肽序列，或任擇地由序列辨識編號：71或序列辨識編號：72的多肽序列所組成。於本發明的另一個具體例中，本發明的抗體片段包含序列辨識編號：73或序列辨識編號：74的多肽序列，或任擇地由序列辨識編號：73或序列辨識編號：74的多肽序列所組成。
於本發明的一個另外的具體例中，具有CGRP結合專一性之抗體片段包含序列辨識編號：75；序列辨識編號：76；和序列辨識編號：77的多肽序列之一者或多者，或是任擇地由序列辨識編號：75；序列辨識編號：76；和序列辨識編號：77的多肽序列之一者或多者所組成，其等係對應至序列辨識編號：71的可變異輕鏈序列或序列辨識編號：72的輕鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)。
於本發明的一個另外的具體例中，具有CGRP結合專一性之抗體片段包含序列辨識編號：78；序列辨識編號：79；和序列辨識編號：80的多肽序列之一者或多者，或是任擇地由序列辨識編號：78；序列辨識編號：79；和序列辨識編號：80的多肽序列之一者或多者所組成，其等 係對應至序列辨識編號：73的可變異重鏈序列或序列辨識編號：74的重鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)。
本發明亦預期包括本文中說明的抗體片段之一者或多者的抗體片段。於本發明的一個具體例中，具有CGRP結合專一性的抗體片段係包含，或任擇地由下列的抗體片段的一、二、三或更多者，包括全部，所組成：序列辨識編號：71的可變異輕鏈區；序列辨識編號：73的可變異重鏈區；序列辨識編號：71的可變異輕鏈區之互補決定區(序列辨識編號：75；序列辨識編號：76；和序列辨識編號：77)；以及序列辨識編號：73的可變異重鏈區之互補決定區(序列辨識編號：78；序列辨識編號：79；和序列辨識編號：80)。
於本發明的一個具體例中，人類化抗CGRP抗體係Ab8，其包含序列辨識編號：72與序列辨識編號：74，或是任擇地由序列辨識編號：72與序列辨識編號：74所組成，以及具有至少一種本文提出的生物活性。
於本發明之另外的具體例中，抗體片段包含，或任擇地由具有CGRP結合專一性的Fab(片段抗原結合)片段所組成。關於抗體Ab8，Fab片段包括序列辨識編號：71的可變異輕鏈序列和序列辨識編號：73的可變異重鏈序列。本發明的此具體例進一步預期在該Fab中的序列辨識編號：71及/或序列辨識編號：73之加入作用、刪除作用及變異體，同時保留CGRP結合專一性。
在此(下文)所述之本發明的一具體例中，可藉由 Ab8的酶消化作用(如木瓜酶)，產生Fab片段。在本發明的另一具體例中，可經由在諸如CHO、NSO或HEK 293細胞的哺乳類動物細胞、真菌、昆蟲或微生物系統諸如酵母菌細胞(例如諸如二倍體畢赤酵母菌屬(Pichia)之二倍體酵母菌)與其他酵母菌株中的表現作用，產生抗CGRP抗體，諸如Ab8或其Fab片段。適宜的畢赤酵母菌屬(Pichia)物種包括，但不限於巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris)。
抗體Ab9
於一個具體例中，本發明包括嵌合抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一可變異 輕鏈序列： (序列辨識編號：81)。
本發明亦包括嵌合抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一輕鏈序列： (序列辨識編號：82)。
本發明進一步包括嵌合抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一可變異重鏈序列： (序列辨識編號：
83)。
本發明亦包括嵌合抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一重鏈序列： (序列辨識編號：84)。
本發明進一步預期包含以下的抗體：序列辨識編號：85；序列辨識編號：86；和序列辨識編號：87的多肽序列之一者或多者，其等係對應至序列辨識編號：81的可變異輕鏈序列或序列辨識編號：82的輕鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)，及/或序列辨識編號：88；序列辨識編號：89；和序列辨識編號：90的多肽序列之一者或 多者，其等係對應至序列辨識編號：83的可變異重鏈序列或序列辨識編號：84的重鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)，或是此等多肽序列的組合。於本發明的另一個具體例中，本發明的抗體與其等之片段包含以上提出的CDRs、可變異重鏈與可變異輕鏈序列，及重鏈與輕鏈序列之一者或多者的組合，或任擇地由其等所組成，包括其等之全體。
本發明亦預期具有CGRP的結合專一性之抗體的片段。於本發明的一個具體例中，本發明的抗體片段包含序列辨識編號：81或序列辨識編號：82的多肽序列，或任擇地由序列辨識編號：81或序列辨識編號：82的多肽序列所組成。於本發明的另一個具體例中，本發明的抗體片段包含序列辨識編號：83或序列辨識編號：84的多肽序列，或任擇地由序列辨識編號：83或序列辨識編號：84的多肽序列所組成。
於本發明的一個另外的具體例中，具有CGRP結合專一性之抗體片段包含序列辨識編號：85；序列辨識編號：86；和序列辨識編號：87的多肽序列之一者或多者，或是任擇地由序列辨識編號：85；序列辨識編號：86；和序列辨識編號：87的多肽序列之一者或多者所組成，其等係對應至序列辨識編號：81的可變異輕鏈序列或序列辨識編號：82的輕鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)。
於本發明的一個另外的具體例中，具有CGRP結合專一性之抗體片段包含序列辨識編號：88；序列辨識編 號：89；和序列辨識編號：90的多肽序列之一者或多者，或是任擇地由序列辨識編號：88；序列辨識編號：89；和序列辨識編號：90的多肽序列之一者或多者所組成，其等係對應至序列辨識編號：83的可變異重鏈序列或序列辨識編號：84的重鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)。
本發明亦預期包括本文中說明的抗體片段之一者或多者的抗體片段。於本發明的一個具體例中，具有CGRP結合專一性的抗體片段係包含，或任擇地由下列的抗體片段的一、二、三或更多者，包括全部，所組成：序列辨識編號：81的可變異輕鏈區；序列辨識編號：83的可變異重鏈區；序列辨識編號：81的可變異輕鏈區之互補決定區(序列辨識編號：85；序列辨識編號：86；和序列辨識編號：87)；以及序列辨識編號：83的可變異重鏈區之互補決定區(序列辨識編號：88；序列辨識編號：89；和序列辨識編號：90)。
於本發明的一個具體例中，嵌合抗CGRP抗體係Ab9，其包含序列辨識編號：82與序列辨識編號：84，或是任擇地由序列辨識編號：82與序列辨識編號：84所組成，以及具有至少一種本文提出的生物活性。
於本發明之另外的具體例中，抗體片段包含，或任擇地由具有CGRP結合專一性的Fab(片段抗原結合)片段所組成。關於抗體Ab9，Fab片段包括序列辨識編號：81的可變異輕鏈序列和序列辨識編號：83的可變異重鏈序列。本發明的此具體例進一步預期在該Fab中的序列辨識編號： 81及/或序列辨識編號：83之加入作用、刪除作用及變異體，同時保留CGRP結合專一性。
在此(下文)所述之本發明的一具體例中，可藉由Ab9的酶消化作用(如木瓜酶)，產生Fab片段。在本發明的另一具體例中，可經由在諸如CHO、NSO或HEK 293細胞的哺乳類動物細胞、真菌、昆蟲或微生物系統諸如酵母菌細胞(例如諸如二倍體畢赤酵母菌屬(Pichia)之二倍體酵母菌)與其他酵母菌株中的表現作用，產生抗CGRP抗體，諸如Ab9或其Fab片段。適宜的畢赤酵母菌屬(Pichia)物種包括，但不限於巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris)。
抗體Ab10
於一個具體例中，本發明包括人類化抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一可變 異輕鏈序列： (序列辨識編號：91)。
本發明亦包括人類化抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一輕鏈序列： (序列辨識編號：92)。
本發明進一步包括人類化抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一可變異重鏈序列： ( 序列辨識編號：93)。
本發明亦包括人類化抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一重鏈序列： (序列辨識編號：94)。
本發明進一步預期包含以下的抗體：序列辨識編號：95；序列辨識編號：96；和序列辨識編號：97的多肽序列之一者或多者，其等係對應至序列辨識編號：91的可 變異輕鏈序列或序列辨識編號：92的輕鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)，及/或序列辨識編號：98；序列辨識編號：99；和序列辨識編號：100的多肽序列之一者或多者，其等係對應至序列辨識編號：93的可變異重鏈序列或序列辨識編號：94的重鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)，或是此等多肽序列的組合。於本發明的另一個具體例中，本發明的抗體與其等之片段包含以上提出的CDRs、可變異重鏈與可變異輕鏈序列，及重鏈與輕鏈序列之一者或多者的組合，或任擇地由其等所組成，包括其等之全體。
本發明亦預期具有CGRP的結合專一性之抗體的片段。於本發明的一個具體例中，本發明的抗體片段包含序列辨識編號：91或序列辨識編號：92的多肽序列，或任擇地由序列辨識編號：91或序列辨識編號：92的多肽序列所組成。於本發明的另一個具體例中，本發明的抗體片段包含序列辨識編號：93或序列辨識編號：94的多肽序列，或任擇地由序列辨識編號：93或序列辨識編號：94的多肽序列所組成。
於本發明的一個另外的具體例中，具有CGRP結合專一性之抗體片段包含序列辨識編號：95；序列辨識編號：96；和序列辨識編號：97的多肽序列之一者或多者，或是任擇地由序列辨識編號：95；序列辨識編號：96；和序列辨識編號：97的多肽序列之一者或多者所組成，其等係對應至序列辨識編號：91的可變異輕鏈序列或序列辨識 編號：92的輕鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)。
於本發明的一個另外的具體例中，具有CGRP結合專一性之抗體片段包含序列辨識編號：98；序列辨識編號：99；和序列辨識編號：100的多肽序列之一者或多者，或是任擇地由序列辨識編號：98；序列辨識編號：99；和序列辨識編號：100的多肽序列之一者或多者所組成，其等係對應至序列辨識編號：93的可變異重鏈序列或序列辨識編號：94的重鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)。
本發明亦預期包括本文中說明的抗體片段之一者或多者的抗體片段。於本發明的一個具體例中，具有CGRP結合專一性的抗體片段係包含，或任擇地由下列的抗體片段的一、二、三或更多者，包括全部，所組成：序列辨識編號：91的可變異輕鏈區；序列辨識編號：93的可變異重鏈區；序列辨識編號：91的可變異輕鏈區之互補決定區(序列辨識編號：95；序列辨識編號：96；和序列辨識編號：97)；以及序列辨識編號：93的可變異重鏈區之互補決定區(序列辨識編號：98；序列辨識編號：99；和序列辨識編號：100)。
於本發明的一個具體例中，人類化抗CGRP抗體係Ab10，其包含序列辨識編號：92與序列辨識編號：94，或是任擇地由序列辨識編號：92與序列辨識編號：94所組成，以及具有至少一種本文提出的生物活性。
於本發明之另外的具體例中，抗體片段包含，或任擇地由具有CGRP結合專一性的Fab(片段抗原結合)片段 所組成。關於抗體Ab10，Fab片段包括序列辨識編號：91的可變異輕鏈序列和序列辨識編號：93的可變異重鏈序列。本發明的此具體例進一步預期在該Fab中的序列辨識編號：91及/或序列辨識編號：93之加入作用、刪除作用及變異體，同時保留CGRP結合專一性。
在此(下文)所述之本發明的一具體例中，可藉由Ab10的酶消化作用(如木瓜酶)，產生Fab片段。在本發明的另一具體例中，可經由在諸如CHO、NSO或HEK 293細胞的哺乳類動物細胞、真菌、昆蟲或微生物系統諸如酵母菌細胞(例如諸如二倍體畢赤酵母菌屬(Pichia)之二倍體酵母菌)與其他酵母菌株中的表現作用，產生抗CGRP抗體，諸如Ab10或其Fab片段。適宜的畢赤酵母菌屬(Pichia)物種包括，但不限於巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris)。
抗體Ab11
於一個具體例中，本發明包括嵌合抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一可變異 輕鏈序列： (序列辨識編號：101)。
本發明亦包括嵌合抗體，其具有CGRP結合專-性及擁有包含以下提出的序列之一輕鏈序列： (序列辨識編號：102)。
本發明進一步包括嵌合抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一可變異重鏈序列： (序列辨識編 號：103)。
本發明亦包括嵌合抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一重鏈序列： (序列辨識編號：104)。
本發明進一步預期包含以下的抗體：序列辨識編號：105；序列辨識編號：106；和序列辨識編號：107的多肽序列之一者或多者，其等係對應至序列辨識編號：101的可變異輕鏈序列或序列辨識編號：102的輕鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)，及/或序列辨識編號：108；序列辨識編號：109；和序列辨識編號：110的多肽序列之一者或多者，其等係對應至序列辨識編號：103的可變異重鏈序列或序列辨識編號：104的重鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)，或是此等多肽序列的組合。於本發明的另一個具體例中，本發明的抗體與其等之片段包含以上提出的CDRs、可變異重鏈與可變異輕鏈序列，及重鏈與輕鏈序列之一者或多者的組合，或任擇地由其等所組成，包括其等之全體。
本發明亦預期具有CGRP的結合專一性之抗體的片段。於本發明的一個具體例中，本發明的抗體片段包含序列辨識編號：101或序列辨識編號：102的多肽序列，或任擇地由序列辨識編號：101或序列辨識編號：102的多肽序列所組成。於本發明的另一個具體例中，本發明的抗體片段包含序列辨識編號：103或序列辨識編號：104的多肽序列，或任擇地由序列辨識編號：103或序列辨識編號：104的多肽序列所組成。
於本發明的一個另外的具體例中，具有CGRP結合專一性之抗體片段包含序列辨識編號：105；序列辨識編號：106；和序列辨識編號：107的多肽序列之一者或多者， 或是任擇地由序列辨識編號：105；序列辨識編號：106；和序列辨識編號：107的多肽序列之一者或多者所組成，其等係對應至序列辨識編號：101的可變異輕鏈序列或序列辨識編號：102的輕鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)。
於本發明的一個另外的具體例中，具有CGRP結合專一性之抗體片段包含序列辨識編號：108；序列辨識編號：109；和序列辨識編號：110的多肽序列之一者或多者，或是任擇地由序列辨識編號：108；序列辨識編號：109；和序列辨識編號：110的多肽序列之一者或多者所組成，其等係對應至序列辨識編號：103的可變異重鏈序列或序列辨識編號：104的重鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)。
本發明亦預期包括本文中說明的抗體片段之一者或多者的抗體片段。於本發明的一個具體例中，具有CGRP結合專一性的抗體片段係包含，或任擇地由下列的抗體片段的一、二、三或更多者，包括全部，所組成：序列辨識編號：101的可變異輕鏈區；序列辨識編號：103的可變異重鏈區；序列辨識編號：101的可變異輕鏈區之互補決定區(序列辨識編號：105；序列辨識編號：106；和序列辨識編號：107)；以及序列辨識編號：103的可變異重鏈區之互補決定區(序列辨識編號：108；序列辨識編號：109；和序列辨識編號：110)。
於本發明的一個具體例中，嵌合抗CGRP抗體係 Ab11，其包含序列辨識編號：102與序列辨識編號：104，或是任擇地由序列辨識編號：102與序列辨識編號：104所組成，以及具有至少一種本文提出的生物活性。
於本發明之另外的具體例中，抗體片段包含，或任擇地由具有CGRP結合專一性的Fab(片段抗原結合)片段所組成。關於抗體Ab11，Fab片段包括序列辨識編號：101的可變異輕鏈序列和序列辨識編號：103的可變異重鏈序列。本發明的此具體例進一步預期在該Fab中的序列辨識編號：101及/或序列辨識編號：103之加入作用、刪除作用及變異體，同時保留CGRP結合專一性。
在此(下文)所述之本發明的一具體例中，可藉由Ab11的酶消化作用(如木瓜酶)，產生Fab片段。在本發明的另一具體例中，可經由在諸如CHO、NSO或HEK 293細胞的哺乳類動物細胞、真菌、昆蟲或微生物系統諸如酵母菌細胞(例如諸如二倍體畢赤酵母菌屬(Pichia)之二倍體酵母菌)與其他酵母菌株中的表現作用，產生抗CGRP抗體，諸如Ab11或其Fab片段。適宜的畢赤酵母菌屬(Pichia)物種包括，但不限於巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris)。
抗體Ab12
於一個具體例中，本發明包括人類化抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一可變 異輕鏈序列： EIKR(序列辨識編號：111)。
本發明亦包括人類化抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一輕鏈序列： (序列辨識編號：112)。
本發明進一步包括人類化抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一可變異重鏈序列： ( 序列辨識編號：113)。
本發明亦包括人類化抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一重鏈序列： (序列辨識編號：114)。
本發明進一步預期包含以下的抗體：序列辨識編號：115；序列辨識編號：116；和序列辨識編號：117的多肽序列之一者或多者，其等係對應至序列辨識編號：111的可變異輕鏈序列或序列辨識編號：112的輕鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)，及/或序列辨識編號：118；序列辨識編號：119；和序列辨識編號：120的多肽序列之一者或多者，其等係對應至序列辨識編號：113的可變異重鏈序列或序列辨識編號：114的重鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)，或是此等多肽序列的組合。於本發明的另一個具體例中，本發明的抗體與其等之片段包含以上提出的CDRs、可變異重鏈與可變異輕鏈序列，及重鏈與輕鏈序列之一者或多者的組合，或任擇地由其等所組成，包括其等之全體。
本發明亦預期具有CGRP的結合專一性之抗體的片段。於本發明的一個具體例中，本發明的抗體片段包含序列辨識編號：111或序列辨識編號：112的多肽序列，或任擇地由序列辨識編號：111或序列辨識編號：112的多肽序列所組成。於本發明的另一個具體例中，本發明的抗體片段包含序列辨識編號：113或序列辨識編號：114的多肽 序列，或任擇地由序列辨識編號：113或序列辨識編號：114的多肽序列所組成。
於本發明的一個另外的具體例中，具有CGRP結合專一性之抗體片段包含序列辨識編號：115；序列辨識編號：116；和序列辨識編號：117的多肽序列之一者或多者，或是任擇地由序列辨識編號：115；序列辨識編號：116；和序列辨識編號：117的多肽序列之一者或多者所組成，其等係對應至序列辨識編號：111的可變異輕鏈序列或序列辨識編號：112的輕鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)。
於本發明的一個另外的具體例中，具有CGRP結合專一性之抗體片段包含序列辨識編號：118；序列辨識編號：119；和序列辨識編號：120的多肽序列之一者或多者，或是任擇地由序列辨識編號：118；序列辨識編號：119；和序列辨識編號：120的多肽序列之一者或多者所組成，其等係對應至序列辨識編號：113的可變異重鏈序列或序列辨識編號：114的重鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)。
本發明亦預期包括本文中說明的抗體片段之一者或多者的抗體片段。於本發明的一個具體例中，具有CGRP結合專一性的抗體片段係包含，或任擇地由下列的抗體片段的一、二、三或更多者，包括全部，所組成：序列辨識編號：111的可變異輕鏈區；序列辨識編號：113的可變異重鏈區；序列辨識編號：111的可變異輕鏈區之互補決 定區(序列辨識編號：115；序列辨識編號：116；和序列辨識編號：117)；以及序列辨識編號：113的可變異重鏈區之互補決定區(序列辨識編號：118；序列辨識編號：119；和序列辨識編號：120)。
於本發明的一個具體例中，人類化抗CGRP抗體係Ab12，其包含序列辨識編號：112與序列辨識編號：114，或是任擇地由序列辨識編號：112與序列辨識編號：114所組成，以及具有至少一種本文提出的生物活性。
於本發明之另外的具體例中，抗體片段包含，或任擇地由具有CGRP結合專一性的Fab(片段抗原結合)片段所組成。關於抗體Ab12，Fab片段包括序列辨識編號：111的可變異輕鏈序列和序列辨識編號：113的可變異重鏈序列。本發明的此具體例進一步預期在該Fab中的序列辨識編號：111及/或序列辨識編號：113之加入作用、刪除作用及變異體，同時保留CGRP結合專一性。
在此(下文)所述之本發明的一具體例中，可藉由Ab12的酶消化作用(如木瓜酶)，產生Fab片段。在本發明的另一具體例中，可經由在諸如CHO、NSO或HEK 293細胞的哺乳類動物細胞、真菌、昆蟲或微生物系統諸如酵母菌細胞(例如諸如二倍體畢赤酵母菌屬(Pichia)之二倍體酵母菌)與其他酵母菌株中的表現作用，產生抗CGRP抗體，諸如Ab12或其Fab片段。適宜的畢赤酵母菌屬(Pichia)物種包括，但不限於巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris)。
抗體Ab13
於一個具體例中，本發明包括嵌合抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一可變異 輕鏈序列： (序列辨識編號：121)。
本發明亦包括嵌合抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一輕鏈序列： (序列辨識編號：122)。
本發明進一步包括嵌合抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一可變異重鏈序列： (序列辨識編號：123)。
本發明亦包括嵌合抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一重鏈序列： (序列辨識編號：124)。
本發明進一步預期包含以下的抗體：序列辨識編號：125；序列辨識編號：126；和序列辨識編號：127的多肽序列之一者或多者，其等係對應至序列辨識編號：121的可變異輕鏈序列或序列辨識編號：122的輕鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)，及/或序列辨識編號：128；序列辨識編號：129；和序列辨識編號：130的多肽序列之一者或多者，其等係對應至序列辨識編號：123的可變異重鏈序列或序列辨識編號：124的重鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)，或是此等多肽序列的組合。於本發明的另一個具體例中，本發明的抗體與其等之片段包含以上提出的CDRs、可變異重鏈與可變異輕鏈序列，及重鏈與輕鏈序列之一者或多者的組合，或任擇地由其等所組成，包括其等之全體。
本發明亦預期具有CGRP的結合專一性之抗體的 片段。於本發明的一個具體例中，本發明的抗體片段包含序列辨識編號：121或序列辨識編號：122的多肽序列，或任擇地由序列辨識編號：121或序列辨識編號：122的多肽序列所組成。於本發明的另一個具體例中，本發明的抗體片段包含序列辨識編號：123或序列辨識編號：124的多肽序列，或任擇地由序列辨識編號：123或序列辨識編號：124的多肽序列所組成。
於本發明的一個另外的具體例中，具有CGRP結合專一性之抗體片段包含序列辨識編號：125；序列辨識編號：126；和序列辨識編號：127的多肽序列之一者或多者，或是任擇地由序列辨識編號：125；序列辨識編號：126；和序列辨識編號：127的多肽序列之一者或多者所組成，其等係對應至序列辨識編號：121的可變異輕鏈序列或序列辨識編號：122的輕鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)。
於本發明的一個另外的具體例中，具有CGRP結合專一性之抗體片段包含序列辨識編號：128；序列辨識編號：129；和序列辨識編號：130的多肽序列之一者或多者，或是任擇地由序列辨識編號：128；序列辨識編號：129；和序列辨識編號：130的多肽序列之一者或多者所組成，其等係對應至序列辨識編號：123的可變異重鏈序列或序列辨識編號：124的重鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)。
本發明亦預期包括本文中說明的抗體片段之一 者或多者的抗體片段。於本發明的一個具體例中，具有CGRP結合專一性的抗體片段係包含，或任擇地由下列的抗體片段的一、二、三或更多者，包括全部，所組成：序列辨識編號：121的可變異輕鏈區；序列辨識編號：123的可變異重鏈區；序列辨識編號：121的可變異輕鏈區之互補決定區(序列辨識編號：125；序列辨識編號：126；和序列辨識編號：127)；以及序列辨識編號：123的可變異重鏈區之互補決定區(序列辨識編號：128；序列辨識編號：129；和序列辨識編號：130)。
於本發明的一個具體例中，嵌合抗CGRP抗體係Ab13，其包含序列辨識編號：122與序列辨識編號：124，或是任擇地由序列辨識編號：122與序列辨識編號：124所組成，以及具有至少一種本文提出的生物活性。
於本發明之另外的具體例中，抗體片段包含，或任擇地由具有CGRP結合專一性的Fab(片段抗原結合)片段所組成。關於抗體Ab13，Fab片段包括序列辨識編號：121的可變異輕鏈序列和序列辨識編號：123的可變異重鏈序列。本發明的此具體例進一步預期在該Fab中的序列辨識編號：121及/或序列辨識編號：123之加入作用、刪除作用及變異體，同時保留CGRP結合專一性。
在此(下文)所述之本發明的一具體例中，可藉由Ab13的酶消化作用(如木瓜酶)，產生Fab片段。在本發明的另一具體例中，可經由在諸如CHO、NSO或HEK 293細胞的哺乳類動物細胞、真菌、昆蟲或微生物系統諸如酵母菌 細胞(例如諸如二倍體畢赤酵母菌屬(Pichia)之二倍體酵母菌)與其他酵母菌株中的表現作用，產生抗CGRP抗體，諸如Ab13或其Fab片段。適宜的畢赤酵母菌屬(Pichia)物種包括，但不限於巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris)。
抗體Ab14
於一個具體例中，本發明包括人類化抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一可變 異輕鏈序列： (序列辨識編號：131)。
本發明亦包括人類化抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一輕鏈序列： (序列辨識編號：132)。
本發明進一步包括人類化抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一可變異重鏈序列： ( 序列辨識編號：133)。
本發明亦包括人類化抗體，其具有CGRP結合專一性及擁有包含以下提出的序列之一重鏈序列： (序列辨識編號：134)。
本發明進一步預期包含以下的抗體：序列辨識編號：135；序列辨識編號：136；和序列辨識編號：137的多肽序列之一者或多者，其等係對應至序列辨識編號：131的可變異輕鏈序列或序列辨識編號：132的輕鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)，及/或序列辨識編號：138；序列辨識編號：139；和序列辨識編號：140的多肽序列之一者或多者，其等係對應至序列辨識編號：133的可變異重鏈序列或序列辨識編號：134的重鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)，或是此等多肽序列的組合。於本 發明的另一個具體例中，本發明的抗體與其等之片段包含以上提出的CDRs、可變異重鏈與可變異輕鏈序列，及重鏈與輕鏈序列之一者或多者的組合，或任擇地由其等所組成，包括其等之全體。
本發明亦預期具有CGRP的結合專一性之抗體的片段。於本發明的一個具體例中，本發明的抗體片段包含序列辨識編號：131或序列辨識編號：132的多肽序列，或任擇地由序列辨識編號：131或序列辨識編號：132的多肽序列所組成。於本發明的另一個具體例中，本發明的抗體片段包含序列辨識編號：133或序列辨識編號：134的多肽序列，或任擇地由序列辨識編號：133或序列辨識編號：134的多肽序列所組成。
於本發明的一個另外的具體例中，具有CGRP結合專一性之抗體片段包含序列辨識編號：135；序列辨識編號：136；和序列辨識編號：137的多肽序列之一者或多者，或是任擇地由序列辨識編號：135；序列辨識編號：136；和序列辨識編號：137的多肽序列之一者或多者所組成，其等係對應至序列辨識編號：131的可變異輕鏈序列或序列辨識編號：132的輕鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)。
於本發明的一個另外的具體例中，具有CGRP結合專一性之抗體片段包含序列辨識編號：138；序列辨識編號：139；和序列辨識編號：140的多肽序列之一者或多者，或是任擇地由序列辨識編號：138；序列辨識編號：139； 和序列辨識編號：140的多肽序列之一者或多者所組成，其等係對應至序列辨識編號：133的可變異重鏈序列或序列辨識編號：134的重鏈序列之互補決定區(CDRs，或高度變異區)。
本發明亦預期包括本文中說明的抗體片段之一者或多者的抗體片段。於本發明的一個具體例中，具有CGRP結合專一性的抗體片段係包含，或任擇地由下列的抗體片段的一、二、三或更多者，包括全部，所組成：序列辨識編號：131的可變異輕鏈區；序列辨識編號：133的可變異重鏈區；序列辨識編號：131的可變異輕鏈區之互補決定區(序列辨識編號：135；序列辨識編號：136；和序列辨識編號：137)；以及序列辨識編號：133的可變異重鏈區之互補決定區(序列辨識編號：138；序列辨識編號：139；和序列辨識編號：140)。
於本發明的一個具體例中，人類化抗CGRP抗體係Ab14，其包含序列辨識編號：132與序列辨識編號：134，或是任擇地由序列辨識編號：132與序列辨識編號：134所組成，以及具有至少一種本文提出的生物活性。
於本發明之另外的具體例中，抗體片段包含，或任擇地由具有CGRP結合專一性的Fab(片段抗原結合)片段所組成。關於抗體Ab14，Fab片段包括序列辨識編號：131的可變異輕鏈序列和序列辨識編號：133的可變異重鏈序列。本發明的此具體例進一步預期在該Fab中的序列辨識編號：131及/或序列辨識編號：133之加入作用、刪除作用及變異 體，同時保留CGRP結合專一性。
在此(下文)所述之本發明的一具體例中，可藉由Ab14的酶消化作用(如木瓜酶)，產生Fab片段。在本發明的另一具體例中，可經由在諸如CHO、NSO或HEK 293細胞的哺乳類動物細胞、真菌、昆蟲或微生物系統諸如酵母菌細胞(例如諸如二倍體畢赤酵母菌屬(Pichia)之二倍體酵母菌)與其他酵母菌株中的表現作用，產生抗CGRP抗體，諸如Ab14或其Fab片段。適宜的畢赤酵母菌屬(Pichia)物種包括，但不限於巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris)。
在另一具體例中，抗體片段可能以下列非限制性形式中之一者或多者呈現：Fab、Fab'、F(ab')2，Fv及單鏈Fv抗體形式。在一個較佳具體例中，本文中所述之抗CGRP抗體進一步包含κ恆定輕鏈序列，其包含如下所列序列： (序列辨 識編號：283)。
在另一較佳具體例中，本文中所述之抗CGRP抗體進一步包含γ-1恆定重鏈多肽序列，其包含如下所列序列： (序列辨識編號：284)。
在另一個具體例中，本發明預期一種經單離的抗CGRP抗體，其包含選自下列之一個VH多肽序列：序列辨識編號：3、13、23、33、43、53、63、73、83、93、103、113、123或133或是其變異體；以及進一步包含選自下列之一個VL多肽序列：序列辨識編號：1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121或131或是其變異體，其中該VH或VL多肽中的一或多個架構殘基(FR殘基)已被另一個胺基酸殘基取代，而產生以專一性方式與CGRP結合之一種抗CGRP抗體。本發明預期此等抗體之人類化與嵌合形式。該嵌合抗體可包括衍生自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5、IgG6、IgG7、IgG8、IgG9、IgG10、IgG11、IgG12、IgG13、IgG14、IgG15、IgG16、IgG17、IgG18或是IgG19恆定區之Fc。
在本發明的一個具體例中，在起始本文中所提及的人類化過程之前，該抗體或VH或VL多肽係源自或選自一種或多種兔B細胞族群。
於本發明的另一個具體例中，該等抗CGRP抗體與其等之片段不具有CGRP-R的結合專一性。於本發明的一個另外的具體例中，該等抗CGRP抗體與其等之片段抑制 CGRP與CGRP-R的結合。於本發明的另一個具體例中，抗CGRP抗體及其片段抑制CGRP與CGRP-R及/或與附加的蛋白及/或與其多聚體之結合作用，及/或拮抗其生物效應。
如以上所說明的，抗體與其等之片段可以予以轉譯後修飾以加入效應部分(moieties)，例如化學連接子，可偵測的部分，例如舉例而言：螢光染料，酶，受質，生物發光材料，放射性材料，以及化學發光部分，或是功能性部分，例如舉例而言：鏈黴抗生物素蛋白(streptoavidin)、抗生物素蛋白(avidin)、生物素、一細胞毒素、一細胞毒性劑，以及放射性材料。
抗體或其片段亦可進行化學修飾而提供附加的優點，諸如增加多肽的溶解性、安定性及循環時間(活體內半衰期)，或是降低免疫原性(參見美國專利第4,179,337號)。用於衍生化作用之化學部分可選自水溶性聚合物，諸如聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、聚葡萄糖、聚乙烯醇之類。抗體及其片段可在分子內的隨機位置或在分子內的預定位置進行修飾，以及可包括一個、二個、三個或更多個連接的化學部分。
聚合物可具有任何分子量，及可為分支或未分支者。就聚乙二醇而言，為便於處理與製造，分子量較佳介於大約1kDa與大約100kDa之間(“大約”一詞表明在製備聚乙二醇時，有些分子比所述分子量來得重，有些分子則較輕)。依所欲的治療廓型(profile)(例如所欲的持續釋出期間、若有任何生物活性時之效應、處理之方便性、抗原性程度 或缺乏抗原性，以及聚乙二醇對於一治療性蛋白或類似物的其他已知效應)而定，可採用其他分子量。舉例而言，聚乙二醇的平均分子量可為大約200、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10,000、10,500、11,000、11,500、12,000、12,500、13,000、13,500、14,000、14,500、15,000、15,500、16,000、16,500、17,000、17,500、18,000、18,500、19,000、19,500、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、85,000、90,000、95,000或100,000kDa。分支型聚乙二醇係述於例如美國專利第5,643,575號；Morpurgo等人，Appl.Biochem.Biotechnol.56：59-72(1996)；Vorobjev等人，Nucleosides Nucleotides 18：2745-2750(1999)；以及Caliceti等人，Bioconjug.Chem.10：638-646(1999)，各者的揭露內容在此併入本案以作為參考資料。
有數種連接方法可供嫻熟技藝者使用，參見例如EP 0 401 384，其在此併入本案以作為參考資料(將PEG與G-CSF偶合)，亦參見Malik等人，Exp.Hematol.20：1028-1035(1992)(報導使用三氟代乙烷磺醯氯之GM-CSF的聚乙二醇化作用)。舉例而言，經由一反應基團，諸如游離胺基或羧基，聚乙二醇可經由胺基酸殘基而共價結合。反應基團係可與一活化的聚乙二醇分子結合者。具有一游離胺基的胺基酸殘基可包括離胺酸殘基及胺基端胺基酸殘基；具有一游離羧基之該等可包括天冬胺酸殘基麩胺酸殘基及羧基端 胺基酸殘基。巰基亦可作為用於連接聚乙二醇分子的反應基團。就治療目的而言，較佳連接在一胺基上，諸如連接在胺基端或離胺酸基上。
如上文之暗示，聚乙二醇可經由與任何數目的胺基酸殘基之鍵結而與蛋白連接。舉例而言，聚乙二醇可經由與離胺酸、組胺酸、天冬胺酸、麩胺酸或半胱胺酸殘基的共價鍵而與多肽連接。可採用一種或多種反應化學來連接聚乙二醇與特定的胺基酸殘基(諸如離胺酸、組胺酸、天冬胺酸、麩胺酸或半胱胺酸)或是連接一種類型以上的胺基酸殘基(諸如離胺酸、組胺酸、天冬胺酸、麩胺酸或半胱胺酸及其之組合)。
任擇地，抗體或其片段可經由與白蛋白(包括但不限於重組型人類血清白蛋白或片段或其變異體(參見例如於1999年3月2日頒證之美國專利第5,876,969號、EP專利0 413 622，及於1998年6月16日頒證之美國專利第5,766,883號，其等在此完整地併入本案以為參考資料))或其他循環型血液蛋白，諸如轉鐵蛋白或鐵蛋白融合，而增加活體內半衰期。在一個較佳具體例中，本發明的多肽及/或抗體(包括其片段或變異體)係與成熟形式的人類血清白蛋白融合(亦即如EP專利0 322 094之圖1與圖2中所示之人類血清白蛋白的第1至585個胺基酸)，該專利在此完整地併入本案以為參考資料。本發明亦涵蓋編碼本發明之融合蛋白的聚核苷酸。
關於可偵測的部分，另外的例示性酶包括，但不 限於：山葵過氧化酶、乙醯膽鹼酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶(beta-galactosidase)以及螢光素酶。另外的例示性螢光材料包括，但不限於：玫瑰紅(rhodamine)、螢光黃、螢光異硫氰酸鹽、繖形酮(umbelliferone)、二氯三胺(dichlorotriazinylamine)、藻紅素(phycoerythrin)以及丹磺醯氯(dansyl chloride)。進一步的例示性化學發光部分包括但不限於流明諾(luminal)。進一步的例示性生物發光物質包括但不限於螢光素與水母發光蛋白(aequorin)。進一步的例示性放射性物質包括但不限於碘125(125I)、碳14(14C)、硫35(35S)、氚(3H)及磷32(32P)。
就功能性部分而言，例示性細胞毒性劑包括但不限於：甲氨蝶呤(methotrexate)、胺喋呤(aminopterin)、6-巰嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶達卡巴仁(5-fluorouracil dacarbazine)；烷化劑諸如氮芥(mechlorethamine)、噻替哌(thiotepa)苯丁酸氮芥(chlorambucil)、黴法蘭(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BSNU)、絲裂黴素C、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、1-甲基亞硝脲、塞克羅邁得(cyclophosphamide)、氮芥(mechlorethamine)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇、鏈佐黴素、絲裂黴素C、順二氯二胺鉑(II)(DDP)、順鉑(cisplatin)與卡鉑(carboplatin)(伯爾定(paraplatin))；蒽環素包括唐黴素(daunorubicin)(先前稱為道諾黴素(daunomycin))、多柔比星(doxorubicin)(阿德力黴素(Adriamycin))、地托比星(detorubicin)、洋紅黴素 (carminomycin)、伊達比星(idarubicin)、表柔比星(epirubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)與比生群(bisantrene)；抗生素包括更生黴素(dactinomycin)(放線菌素D)、博萊黴素(bleomycin)、卡奇黴素(calicheamicin)、光輝黴素(mithramycin)，及安曲黴素(mithramycin)(AMC)；以及抗有絲分裂劑諸如長春花生物鹼(vinca alkaloid)、(vincristine)及長春鹼(vinblastine)。其他細胞毒性劑包括太平洋紫杉醇(紫杉醇(Taxol))、蓖麻毒蛋白、綠膿桿菌外毒素(pseudomonas exotoxin)、吉西他濱(gemcitabine)、細胞遲緩素B(cytochalasin B)、短桿菌肽(gramicidin)D、溴化乙啶、吐根鹼、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、秋水仙素、二羥基炭疽菌素二酮、1-去氫睪固酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮質素、普魯卡因(procaine)、四卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)、嘌呤黴素、丙卡巴肼(procarbazine)、羥基脲(hydroxyurea)、天冬醯胺酸酶(asparaginase)、皮質類固醇、米托坦(mitotane)(O,P'-(DDD))、干擾素及此等細胞毒性劑的混合物。
進一步的細胞毒性劑包括但不限於化療藥物，諸如卡鉑(carboplatin)、順鉑、太平洋紫杉醇、吉西他濱(gemcitabine)、卡奇黴素(calicheamicin)、多柔比星(doxorubicin)、5-氟尿嘧啶、絲裂黴素C、放線菌素D、環磷醯胺、長春新鹼及萊黴素(bleomycin)。來自植物與細菌的毒性酵素，諸如蓖麻毒蛋白、白喉毒素及假單胞菌毒素，可與人類化或嵌合抗體或其結合片段接合，而產生細胞類 型專一性殺滅試劑(cell-type-specific-killing reagents)(Youle等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 77：5483(1980)；Gilliland等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 77：4539(1980)；Krolick等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 77：5419(1980))。
其他的細胞毒性劑包括，如同於美國專利案第6,653,104號中Goldenberg所說明的細胞毒性核糖核酸酶。本發明的具體例亦有關放射免疫結合劑，其中發射脉或β粒子的放射性核種係在使用或不使用複合物形成劑之下，安定地耦合至抗體或其等之結合片段。此等放射性核種包括：β發射體，如：磷-32(32P)、鈧-47(47Sc)、銅-67(67Cu)、鎵-67(67Ga)、釔-88(88Y)、釔-90(90Y)、碘-125(125I)、碘-131(131I)、釤-153(153Sm)、鎦-177(177Lu)、錸-186(186Re)或錸-188(188Re)，以及脉發射體，如：砹(Astatine)-211(211At)、鉛-212(212Pb)、鉍-212(212Bi)或-213(213Bi)或是錒-225(225Ac)。
用於結合一抗體或其之結合片段至一可偵測的部分與類似物的方法係本技藝中所知道的，如舉例而言以下說明的那些方法：Hunter等人，Nature 144：945(1962)；David等人，Biochemistry 13：1014(1974)；Pain等人，J.Immunol.Meth.40：219(1981)；以及Nygren,J.,Histochem.and Cytochem.30：407(1982)。
本文中說明的具體例進一步包括與本文中提出的抗體、抗體片段、二聚抗體、SMIPs、駱駝抗體(camelbodies)、奈米抗體(nanobodies)、IgNAR、多肽、變 異區以及CDRs實質同源的變異體和均等物。此等可以含有，例如，守恆性取代突變(也就是，由相似的胺基酸之取代一或多個胺基酸)。舉例而言，守恆性取代係提及用具有相同的一般種類之另一者取代一個胺基酸，例如，用另一個酸性胺基酸取代一個酸性胺基酸、用另一個鹼性胺基酸取代一個鹼性胺基酸，或是由另一個中性胺基酸取代一個中性胺基酸。一守恆性胺基酸取代之目的係本技藝中所熟知的。
於另一個具體例中，本發明係預期多肽序列，其等與本文中提出的抗體片段、變異區與CDRs之多肽序列的任何一個或多個具有至少90%或更大的序列同源性。更佳地，本發明預期多肽序列，其等與本文中提出的抗體片段、變異區與CDRs之多肽序列的任何一個或多個具有至少95%或更大的序列同源性，甚至還更佳地至少98%或更大的序列同源性，以及還更佳地至少99%或更大的序列同源性。決定核酸與胺基酸序列之間的同源性之方法係本技藝中具有通常技術的那些人所熟知的。
於另一個具體例中，本發明係進一步預期如本文中提出之進一步具有抗CGRP活性之抗體片段、變異區與CDRs的以上詳述的多肽同系物。非限制性的抗CGRP活性之實例係於本文中提出。
於另一個具體例中，本發明係進一步預期與前述的序列之任何一者結合之抗遺傳性型抗體的生產和用途。於一個例示的具體例中，此一抗遺傳性型抗體能投藥至已 經接受一抗CGRP抗體的一主體，以調整、降低，或是中和抗CGRP抗體的作用。此等抗遺傳性型抗體也可以用於治療自體免疫疾病，該自體免疫疾病特徵在於抗CGRP抗體的存在。此等抗遺傳性型抗體之另外的例示性用途是用於偵測本發明的抗CGRP抗體，舉例而言監測主體的血液或是其他的體液存在的抗CGRP抗體位準。
本發明亦預期抗CGRP抗體，其等包含用本文中說明的多肽或是多核苷酸序列之任何一個代替本文中說明的其他的多核苷酸序列之任何一個。舉例而言但不限於該等，本發明預期包含本文中說明的變異輕鏈與變異重鏈序列之任何一個的組合之抗體，以及進一步預期到本文中說明的CDR序列之任何一個取代本文中說明的其他的CDR序列之任何一個所產生的抗體。
本發明額外的例示性具體例
於另一個具體例中，本發明係預期一個或多個抗人類CGRP抗體或其抗體片段，其等如同選自於以下之抗人類CGRP抗體一般，專一地結合至一完整的人類CGRP多肽或其之片段上之相同的線形或構形抗原決定位，及/或競爭結合至相同的線形或構形抗原決定位：Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13，或Ab14。該一個或多個抗人類CGRP抗體或其抗體片段可以為非天然存在的，例如人類化或嵌合抗體、非天然存在的抗體片段、併入標誌或標記的抗體等等。在一較佳具體例中，該抗人類CGRP抗體或其抗體片段如同Ab3、 Ab6、Ab13，或Ab14一般，專一地結合至一完整的人類CGRP多肽或其之片段上之相同的線形或構形抗原決定位，及/或競爭結合至相同的線形或構形抗原決定位。
本發明的一個較佳具體例係有關嵌合或人類化抗體及其片段(包括Fab片段)，其具有CGRP結合專一性及抑制由CGRP與CGRP受體的結合作用所媒介之生物活性。在本發明的一個具體例中，該嵌合或人類化抗CGRP抗體係選自Ab3、Ab6、Ab13，或Ab14。
於本發明的另一個具體例中，該抗人類CGRP抗體為一個抗體，當藉由利用跨越天然人類CGRP多肽全長之重疊的線形胜肽片段之抗原決定位繪圖予以確定時，其專一地結合至一完整的CGRP多肽或其之片段上，專一地結合Ab3、Ab6、Ab13，或Ab14之相同的線形或構形抗原決定位。
本發明亦針對一種如同本文中揭示的抗體或抗體片段之抗CGRP抗體，其結合至相同的CGRP抗原決定位及/或與抗CGRP抗體競爭結合至CGRP，其包括但不限於選自於以下的抗CGRP抗體：Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13，或Ab14。
於另一個具體例中，本發明亦針對一種經單離之抗CGRP抗體或抗體片段，其包含選自以下之VH多肽序列所含有的一或更多個CDRs：3、13、23、33、43、53、63、73、83、93、103、113、123或133，或其變異體，及/或選 自以下之VL多肽序列所含有的一或更多個CDRs：序列辨識編號1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121或131，或其變異體。
本發明進一步預期以上討論的一個或多個抗人類CGRP抗體是無醣化的或是假如有醣化僅包含甘露糖殘基；其等含有已經予以修飾以改變效應功能、半衰期、蛋白水解、及/或醣化作用之Fc區域；係人類的、人類化的、單鏈或嵌合的；以及係一種衍生自一兔的(親代)抗人類CGRP抗體之人類化抗體。
本發明進一步預期一個或多個抗人類CGRP抗體，其中於該抗體的可變異輕區域和可變異重區域之架構區(FRs)各別地是人類FRs，其等係未經修飾的或是其等已經藉由用親代兔抗體之對應的FR殘基，來取代該可變異輕或重鏈區內的一個或多個人類FR殘基而予以修飾，以及其中該等人類FRs已衍生自人類可變異重鏈與輕鏈抗體序列，該等係以其等相對於資料庫之內包含的其他的人類生殖抗體序列與對應的兔可變異重或輕鏈區域之高位準的同源性為基礎，而自人類生殖抗體序列的一存庫予以選擇出。
於本發明的一個具體例中，抗人類CGRP抗體或片段可專一地結合至活體內CGRP的表現人類細胞及/或循環的可溶解的CGRP分子，包括表現在患有與CGRP表現細胞相關聯的疾病之一病人的人類細胞上或藉由該等細胞所表現之CGRP。
本發明進一步預期直接地或間接地附著至一可 偵測的標記或治療劑之抗人類CGRP抗體或片段。
本發明亦預期一個或多個核酸序列，其導致如以上提出的一種抗人類CGRP抗體或抗體片段的表現，該核酸序列包括含有酵母菌或人類偏好密碼子之該等，或任擇地由酵母菌或人類偏好密碼子所構成之該等。本發明亦預期包含該(等)核酸序列之載體(包括質體或重組病毒載體)。本發明亦預期表現以上提出的至少一個抗體之宿主細胞或是重組型宿主細胞，包括：哺乳動物細胞、酵母菌細胞、細菌細胞，以及昆蟲細胞。於一較佳的具體例中，宿主細胞是一種酵母菌細胞。於又一較佳的具體例中，酵母菌細胞是係一種二倍體酵母菌細胞。於一例示性具體例中，酵母菌細胞是一種畢赤酵母菌(Pichia yeast)。
本發明亦預期一種治療的方法，其包含投藥一治療有效量的本文中揭示之至少一種抗人類CGRP抗體或片段至具有與CGRP表現細胞有關的疾病或病況的一病人。本發明亦預期該治療方法可涉及投藥本文中揭示的二種或多種抗CGRP抗體或其片段。若對於病人投藥一種以上的抗體，該多種抗體可同時或並行投藥，或者其等可交錯投藥。
本發明之具有CGRP結合專一性的抗CGRP抗體及其片段之抗CGRP活性，也可以藉由其等對CGRP的結合力或其等對CGRP之親和性予以說明。於本發明的一個具體例中，本發明之具有CGRP結合專一性的抗CGRP抗體及其片段係以低於或等於如下的一解離常數(KD)結合至CGRP：5x10-7M、10-7M、5x10-8M、10-8M、5x10-9M、10-9M、 5x10-10M、10-10M、5x10-11M、10-11M、5x10-12M、10-12M、5x10-13M，或10-13M。較佳地，抗CGRP抗體與其之片段係以低於或等於10-11、5x10-12M，或10-12M的解離常數來與CGRP結合。在本發明的另一具體例中，本發明之具有CGRP結合專一性的抗CGRP抗體及其片段係與一線形或構形CGRP抗原決定位結合。
於本發明的另一個具體例中，本發明之具有CGRP結合專一性的抗CGRP抗體及其片段之抗CGRP活性，係以低於或等於以下的脫離速率結合至CGRP：10-4S-1、5x10-5S-1、10-5S-1、5x10-6S-1、10-6S-1、5x10-7S-1，或是10-7S-1。
於本發明的一個另外的具體例中，本發明之具有CGRP結合專一性的抗CGRP抗體及其片段之抗CGRP活性，係藉由預防、改善或減少與CGRP相關的疾病或障礙之症狀，或是任擇地治療與CGRP相關的疾病或障礙而顯現出抗CGRP活性。與CGRP相關的疾病或障礙之非限制性之實例係載列於本文中。
編碼抗CGRP抗體多肽之多核苷酸
於例示的具體例中，該抗CGRP抗體可以由本文所含之生物序列表列舉的多核苷酸序列所編碼，或者熟悉此藝者容易辨識之其他的編碼多核苷酸所編碼。其等之實例包括：序列辨識編號141之多核苷酸(編碼序列辨識編號：1之多肽)、序列辨識編號：142之多核苷酸(編碼序列辨識編號：2之多肽)、序列辨識編號：143之多核苷酸(編碼序列辨 識編號：3之多肽)、序列辨識編號：144之多核苷酸(編碼序列辨識編號：4之多肽)、序列辨識編號：151之多核苷酸(編碼序列辨識編號：11之多肽)、序列辨識編號：152之多核苷酸(編碼序列辨識編號：12之多肽)、序列辨識編號：153之多核苷酸(編碼序列辨識編號：13之多肽)、序列辨識編號：154之多核苷酸(編碼序列辨識編號：14之多肽)、序列辨識編號：161之多核苷酸(編碼序列辨識編號：21之多肽)、序列辨識編號：162之多核苷酸(編碼序列辨識編號：22之多肽)、序列辨識編號：163之多核苷酸(編碼序列辨識編號：23之多肽)、序列辨識編號：164之多核苷酸(編碼序列辨識編號：24之多肽)、序列辨識編號：171之多核苷酸(編碼序列辨識編號：31之多肽)、序列辨識編號：172之多核苷酸(編碼序列辨識編號：32之多肽)、序列辨識編號：173之多核苷酸(編碼序列辨識編號：33之多肽)、序列辨識編號：174之多核苷酸(編碼序列辨識編號：34之多肽)、序列辨識編號：181之多核苷酸(編碼序列辨識編號：41之多肽)、序列辨識編號：182之多核苷酸(編碼序列辨識編號：42之多肽)、序列辨識編號：183之多核苷酸(編碼序列辨識編號：43之多肽)、序列辨識編號：184之多核苷酸(編碼序列辨識編號：44之多肽)、序列辨識編號：191之多核苷酸(編碼序列辨識編號：51之多肽)、序列辨識編號：192之多核苷酸(編碼序列辨識編號：52之多肽)、序列辨識編號：193之多核苷酸(編碼序列辨識編號：53之多肽)、序列辨識編號：194之多核苷酸(編碼序列辨識編號：54之多肽)、序列辨識編號：201 之多核苷酸(編碼序列辨識編號：61之多肽)、序列辨識編號：202之多核苷酸(編碼序列辨識編號：62之多肽)、序列辨識編號：203之多核苷酸(編碼序列辨識編號：63之多肽)、序列辨識編號：204之多核苷酸(編碼序列辨識編號：64之多肽)、序列辨識編號：211之多核苷酸(編碼序列辨識編號：71之多肽)、序列辨識編號：212之多核苷酸(編碼序列辨識編號：72之多肽)、序列辨識編號：213之多核苷酸(編碼序列辨識編號：73之多肽)、序列辨識編號：214之多核苷酸(編碼序列辨識編號：74之多肽)、序列辨識編號：221之多核苷酸(編碼序列辨識編號：81之多肽)、序列辨識編號：222之多核苷酸(編碼序列辨識編號：82之多肽)、序列辨識編號：223之多核苷酸(編碼序列辨識編號：83之多肽)、序列辨識編號：224之多核苷酸(編碼序列辨識編號：84之多肽)、序列辨識編號：231之多核苷酸(編碼序列辨識編號：91之多肽)、序列辨識編號：232之多核苷酸(編碼序列辨識編號：92之多肽)、序列辨識編號：233之多核苷酸(編碼序列辨識編號：93之多肽)、序列辨識編號：234之多核苷酸(編碼序列辨識編號：94之多肽)、序列辨識編號：241之多核苷酸(編碼序列辨識編號：101之多肽)、序列辨識編號：242之多核苷酸(編碼序列辨識編號：102之多肽)、序列辨識編號：243之多核苷酸(編碼序列辨識編號：103之多肽)、序列辨識編號：244之多核苷酸(編碼序列辨識編號：104之多肽)、序列辨識編號：251之多核苷酸(編碼序列辨識編號：111之多肽)、序列辨識編號：252之多核苷酸(編碼序列辨識編號：112之 多肽)、序列辨識編號：253之多核苷酸(編碼序列辨識編號：113之多肽)、序列辨識編號：254之多核苷酸(編碼序列辨識編號：114之多肽)、序列辨識編號：261之多核苷酸(編碼序列辨識編號：121之多肽)、序列辨識編號：262之多核苷酸(編碼序列辨識編號：122之多肽)、序列辨識編號：263之多核苷酸(編碼序列辨識編號：123之多肽)、序列辨識編號：264之多核苷酸(編碼序列辨識編號：124之多肽)、序列辨識編號：271之多核苷酸(編碼序列辨識編號：131之多肽)、序列辨識編號：272之多核苷酸(編碼序列辨識編號：132之多肽)、序列辨識編號：273之多核苷酸(編碼序列辨識編號：133之多肽)，或是序列辨識編號：274之多核苷酸(編碼序列辨識編號：134之多肽)。
B細胞篩選以及單離
於一具體例中，本發明預期可用於分離至少一種CGRP抗原專一性細胞之抗原專一性B細胞株系族群(clonal population)之製備與分離作用，該CGRP抗原專一性細胞可用於生產對抗CGRP的單株抗體，其對於所欲的一CGRP抗原或對於對應於此一抗體的核酸序列具專一性。例如在授予Carvalho-Jensen等人之美國專利公開案第US 2007/0269868號中，教導該抗原專一性B細胞株系族群之製備與分離方法，該專利公開案的揭露內容在此完整地併入本案以為參考資料。在本文之實例中亦教導該抗原專一性B細胞株系族群之製備與分離方法。技藝中已知按尺寸或密度來“富集(enriching)”一細胞族群之方法。參見例如美國 專利第5,627,052號。在藉由抗原專一性富集該細胞種群之外，可使用該等步驟。
人類化抗體的方法
於另一個具體例中，本發明預期用於人類化抗體重鏈與輕鏈之方法。例如在Olson等人之美國專利申請公開案第US2009/0022659號與在授予Garcia-Martinez等人之美國專利第7,935,340號中，教導可應用於抗CGRP抗體之用於人類化抗體重鏈與輕鏈之方法，其中各者的揭露內容在此完整併入本案以為參考資料。
篩選分析
本發明亦包括篩選分析法，其設計在顯現出CGRP相關的疾病或障礙症狀的病人體內，用於協助辨識與CGRP相關的疾病或障礙。舉例來說，本發明包括分析法，其偵測一主體體內之胰島素不敏化(抗性)或葡萄糖利用。該主體選擇性地可以處於空腹狀態或進食後的狀態。
於本發明的一個具體例中，本發明的抗CGRP抗體或其等之CGRP結合片段，係用來偵測從顯現出與CGRP有關的一疾病或障礙的症狀的一病人，所獲得的一生物樣本中的CGRP的存在。CGRP的存在，或是其之提高的位準，當與於一可比較的生物樣本中的CGRP之疾病前的位準相比時，可以有益於診斷與CGRP有關的疾病或障礙。
本發明的另一個具體例係提供一種診斷或篩選分析，以於顯現出本文中辨識的CGRP相關的疾病或障礙的症狀的病人體內協助診斷與CGRP相關的疾病或障礙，其包 含利用一轉譯後修飾的抗CGRP抗體或其之結合片段，予以分析來自該病人的一生物樣本中的CGRP表現位準。抗CGRP抗體或其之結合片段可以予以轉譯後修飾成包括如本揭示中先前提出的可偵測的部分。
生物樣本中的CGRP位準可以使用如本文中提出的一經修飾的抗CGRP抗體或其之結合片段予以決定，以及比較該生物樣本中的CGRP位準對於CGRP的標準位準(例如，於正常的生物樣本中的位準)。具有技藝的臨床醫生會瞭解到正常的生物樣本之間可以存在一些可變性，以及當評估結果時會考慮到這些。在本發明的一具體例中，可使用本發明的抗CGRP抗體來取得CGRP表現位準與葡萄糖代謝不良(impaired glucose metabolism)的一特定階段之關聯性。舉例來說，將循環CGRP位準與葡萄糖及/或胰島素位準建立關聯性將可允許建立胰島素不敏化或高血糖症之位準。可以額外地使用本技藝所知的方法來測量主體內之胰島素敏感性，舉例來說像Muniyappa等人所述(Am J Physiol Endocrinol Metab 294：E15-E26,2008)，其在此完整地併入本案以作為參考資料。簡言之，可以使用各種方法來測量胰島素敏感性，包括高胰島素血性-正常血糖葡萄糖鉗制術、胰島素抑制試驗、QUICKI、HOMA、1/胰島素，或松田指數(Matusda index)。熟悉此藝者將能夠測量許多主體的CGRP，俾以建立與臨床上界定的糖尿病發展或糖尿病前期(pre-diabetes)之階段對應之CGRP表現範圍。
以上列舉的分析法也可以用於監測一疾病或障 礙，其中將來自一據信具有CGRP相關的疾病或障礙之病人的一生物樣本中，所獲得的CGRP的位準與來自相同的病人先前的生物樣本中的CGRP的位準作比較，俾以確定是否於該病人體內的CGRP的位準已經隨著舉例而言，治療攝生法而改變。熟悉此藝者會瞭解到藉由測量病人不同間隔的CGRP，可以決定一個體代謝葡萄糖能力的損傷之進展。
本發明亦針對一種活體內成像的方法，其係偵測表現CGRP的細胞之存在，該方法包含投藥一診斷有效量的診斷組成物。該偵測可使用作為用於設計有效的糖尿病或處於發展糖尿病的風險之病人，治療程序之規劃療法的一部分。
於一個具體例中，本發明的方法包括組合本文中揭示的抗CGRP抗體之一個或多個組成物，使用於治療葡萄糖代謝不良，諸如胰島素抗性、胰島素分泌不良或是高血糖症。特別有興趣的是，舉例而言下列之一者或多者：磺醯基脲類、PPAR-γ促效劑類、GPL-1受體促效劑類、二肽基肽酶IV(dipeptidyl peptidase IV)抑制劑、澱粉素類似物、雙胍類、多巴胺D2受體促效劑類、美格列奈類(meglitinides)、脉葡萄糖苷酶抑制劑、抗異常血脂症膽酸螯隔劑(antidyslipidemic bile acid sequestrant)、胰島素、細胞介素療法、基因療法，及抗體療法，以及抗CGRP抗體或其片段。雙胍類之實例包括：甲福明(Metformin)，例如Glucophage及Glucophage XR(Bristol Myers Squibb/Merck Serono)，Fortamet(Watson)，Glumetza(Biovail/Depomed/Santarus)， 以及學名藥(generics)。磺醯基脲類之實例包括：格列美脲(Glimepiride)，例如亞莫利(Amaryl)(Sanofi)以及學名藥；格列吡嗪(Glipizide)，例如瑞易寧(Glucotrol)及瑞易寧(Glucotrol)XL(Pfizer)以及學名藥；格列本脲(Glyburide)/格列本脲(glibenclamide)，例如達安療(Diabeta)(Sanofi)，優降糖(Micronase)/格列納斯(Glynase)(Pfizer)以及學名藥；甲福明(Metformin)+格列本脲(glyburide)，例如Glucovance(Bristol Myers Squibb)，Suguan M(Sanofi-Aventis)，GlicoRest，GlucoNorm(Abiogen)，Bi-Euglucon(Roche)以及學名藥；甲福明(Metformin)+格列吡嗪(glipizide)，例如Metaglip(Bristol Myers Squibb)，以及學名藥。PPAR-γ促效劑類之實例包括：羅格列酮(Rosiglitazone)，例如梵帝雅(Avandia)(GlaxoSmithKline)；吡格列酮(Pioglitazone)，例如愛妥糖(Actos)(Takeda)以及學名藥；羅格列酮(Rosiglitazone)+甲福明(Metformin)，例如Avandamet(GlaxoSmithKline)；吡格列酮(Pioglitazone)+甲福明(Metformin)，例如Actoplus Met XR(Takeda)；吡格列酮(Pioglitazone)+格列美脲(glimepiride)，例如Avandaryl/Avaglim(GlaxoSmithKline)；吡格列酮(Pioglitazone)+格列美脲(glimepiride)，例如Duetact/Tandemact/Sonias(Takeda)。GPL-1受體促效劑類之實例包括：艾塞那肽(Exenatide)，例如百泌達(Byetta)(Bristol Myers Squibb/AstraZeneca)；利拉魯肽(Liraglutide)，例如Victoza(Novo Nordisk)；艾塞那肽LAR(Exenatide LAR)，例如Bydureon(Bristol Myers Squibb/ AstraZeneca)。二肽基肽酶IV(Dipeptidyl peptidase IV)(DPP-IV或DPP4)抑制劑之實例包括：西他列汀(Sitagliptin)，諸如Januvia，Merck；維格列汀(Vildagliptin)，諸如Galvus(Novartis)；賽格列汀(Saxagliptin)，諸如Onglyza(Bristol Myers Squibb/AstraZeneca)；阿格列汀(Alogliptin)，諸如Nesina(Takeda/Furiex)；林格列汀(Linagliptin)，例如Trazenta(Boehringer Ingelheim/Eli Lilly)；特格列汀(Teneligliptin)，例如Tenelia(Mitsubishi Tanabe/Daiichi Sankyo)；西他列汀(Sitagliptin)+甲福明(metformin)，例如Janumet(Merck)及Janumet XR(Merck)；西他列汀(Sitagliptin)+辛伐他汀(simvastatin)，例如JuviSync(Merck)；維格列汀(Vildagliptin)+甲福明，例如Eurcreas(Novartis)；賽格列汀(Saxagliptin)+甲福明，例如Kombiglyze/Kombiglyze XR(AstraZeneca/Bristol Myers Squibb)；阿格列汀(Alogliptin)+吡格列酮(Pioglitazone)，例如Liovel(Takeda/Furiex)；林格列汀(Linagliptin)+甲福明，例如Jentadueto(Boehringer Ingelheim/Eli Lilly)。美格列奈類(Meglitinides)之實例包括：瑞格列奈(Repaglinide)，例如GlucoNorm/Prandin/NovoNorm(Daiichi Sankyo/Fournier Pharma/Novo Nordisk)；那格列奈(Nateglinide)，例如Starlix(Novartis)，Fastic(Daiichi Sankyo)，Starsis(Astellas)以及學名藥；米格列奈(Mitiglinide)，例如Glufast(Kissei/Takeda)。脉葡萄糖苷酶抑制劑之實例包括：阿卡波糖(Acarbose)，例如Precose/Glucobay(Bayer)以及學名藥； 米格列醇(Miglitol)，例如Glyset(Pfizer)，Diastabol(Sanofi)，Seibule(Sanwa Kagaku)以及學名藥；伏格列波糖(voglibose)，例如Basen(Takeda)以及學名藥。膽酸螯隔劑之實例包括：考來維崙(Colesevelam)，例如Cholestagel(Sanofi)，Welchol(Daiichi Sankyo)。多巴胺D2受體促效劑之實例包括：溴隱亭(Bromocriptine)，例如Cycloset(Santarus)。澱粉素類似物之實例包括：普蘭林肽(Pramlintide)，例如Symlin(Bristol Myers Squibb/AstraZeneca)。快速作用胰島素之實例包括：賴脯胰島素(insulin lispro)，例如Humalog(Eli Lilly)；門冬胰島素(Insulin aspart)，例如NovoLog(Novo Nordisk)，NovoRapid(Novo Nordisk)，賴古胰島素(Insulin glulisine)，例如Apidra(Sanofi)。常規型人體胰島素(regular human insulins)之實例包括：Humulin/Umuline Rapide(Eli Lilly)，Novolin R(Novo Nordisk)，Actrapid(Sanofi)。中間作用型胰島素之實例包括：Humulin N(Eli Lilly)，Novolin N(Novo Nordisk)。長效型胰島素之實例包括：甘精胰島素(Insulin glargine)，例如Lantus(Sanofi)及地特胰島素(insulin detemir)，例如Levemir(Novo Nordisk)。
本發明進一步提供一種用於偵測本發明的抗CGRP抗體與CGRP的結合作用之套組。尤其該套組可用於偵測是否存在與本發明的抗CGRP抗體或其免疫反應性片段進行專一性反應之CGRP。該套組亦可包括與一受質結合之一抗體、具有抗原反應性之一種二級抗體及用於偵測二級抗體與抗原的反應之一試劑。此套組可為一種ELISA套 組及可酌情包括受質、初級與二級抗體，及任何其他所需的試劑，諸如可偵測的部分、酵素受質及呈色試劑，例如本文中所述者。該診斷套組亦可為免疫墨點套組之形式。該診斷套組亦可為化學發光套組之形式(Meso Scale Discovery，Gaithersburg，MD)。該診斷套組亦可為一種鑭系元素式偵測套組(PerkinElmer，San Jose，CA)。
具有技藝的臨床醫生會瞭解到一生物樣本包括，但不限於：血清、血漿、尿液、唾液、黏液、胸膜液、關節液以及脊髓液。
改善或減少與CGRP有關的疾病或障礙的症狀，或治療，或預防與CGRP有關的疾病或障礙之方法
於本發明的另一個具體例中，本文中說明的抗CGRP抗體或其等之片段對於改善或減少與CGRP有關的疾病或障礙的症狀，或是治療，或預防與CGRP有關的疾病或障礙是有用的。本文中說明的抗CGRP抗體或其等之片段，以及組合，也能以如下更加詳盡地說明的一藥學組成物的形式予以投藥至需要治療與CGRP有關的疾病或是障礙之病人。
在本發明的另一個具體例中，本文中說明的抗CGRP抗體或其片段係適用於改善或減少下列的症狀，或治療或預防下列的症狀：葡萄糖耐受不良(impaired glucose tolerance)、胰島素抗性(不敏化)、胰島素分泌不良、脂毒性作用(lipotoxicity)、高血糖症、由於糖尿病、糖尿病前期(pre-diabetes)、第1型糖尿病、第2型糖尿病，或是妊娠糖尿 病之胰臟刍細胞衰竭。
於例示性具體例中，本文中所述之抗CGRP抗體或其片段可以予以投藥至有發展糖尿病的風險之個體，諸如診斷為糖尿病前期(pre-diabetes)之個體。無意受限於理論，據信透過恢復胰島素敏感性，本抗CGRP抗體可能可以延遲或預防進展成糖尿病。
於額外的例示性具體例中，本文中所述之抗CGRP抗體或其片段可以投藥至另一種治療的投藥沒有達到血糖濃度正常的病人，諸如以下的治療：甲福明(metformin)，吡格列酮(pioglitazone)，磺醯基脲類，格列奈類(glinide)，口服噻唑烷二酮類(oral thiazolidinedione)(TZD)，如吡格列酮(pioglitazone)，類升糖素胜肽1(GLP-1)促效劑，如艾塞那肽(exenatide)，DPP4抑制劑，如西他列汀(sitagliptin)、維格列汀(vildagliptin)、賽格列汀(saxagliptin)、阿格列汀(alogliptin)、林格列汀(linagliptin)，或特格列汀(teneligliptin)之治療，或是組合療法，諸如甲福明(metformin)及吡格列酮(pioglitazone)、甲福明及磺醯基脲、甲福明及格列奈類(glinide)、甲福明及TZD、甲福明及吡格列酮(pioglitazone)、甲福明及GLP-1促效劑、甲福明及艾塞那肽(exenatide)、西他列汀(sitagliptin)及甲福明、西他列汀及辛伐他汀(simvastatin)、維格列汀(vildagliptin)及甲福明、賽格列汀(saxagliptin)及甲福明、阿格列汀(alogliptin)及甲福明，或是林格列汀(linagliptin)及甲福明。
於額外的例示性具體例中，本文中所述之抗CGRP抗體或其片段，可以投藥至例如具有身體質量指數至少25的個體內，用於預防或治療肥胖症。無意受限於理論，據信本抗CGRP抗體可以增加周邊及/或肝臟的葡萄糖利用，藉此增加代謝率及使重量減輕。該抗CGRP抗體可以組合另一種抗肥胖劑來投藥，例如奧利司他(orlistat)、利莫納班(rimonabant)、西布曲明(sibutramine)、胜肽YY(PYY，降低食慾的36個胺基酸胜肽)、PYY類似物、CB-1拮抗劑、利莫納班(rimonabant)、瘦素(leptin)、瘦素類似物，或是芬特明(phentermine)。
投藥
於本發明的一個具體例中，本文中說明的抗CGRP抗體，或其等之CGRP結合片段，以及該等抗體或抗體片段的組合，係以介於約0.1和100.0mg/kg接受者主體的體重之間的一濃度予以投藥至一主體。於本發明的一個具體例中，本文中說明的抗CGRP抗體，或其等之CGRP結合片段，以及該等抗體或抗體片段的組合，係以大約0.4mg/kg接受者主體的體重的濃度予以投藥至一主體。於本發明的另一個具體例中，本文中說明的抗CGRP抗體或其等之CGRP結合片段，以及該等抗體或抗體片段的組合，係以每二十六週一次或更少的頻率投藥至一接受者主體，例如每十六週一次或更少、每八週一次或更少、每四週一次或更少、每二週一次或更少、每週一次或更少，或是每天一次或更少。
Fab片段可以每二週或更少、每週或更少，或是每天一次或更少、每日多次及/或每數小時投藥。在本發明的一具體例中，病人係每日領受有效獲得所欲結果之0.1mg/kg至40mg/kg的Fab片段，其係以每日分成1至6次的分次劑量給藥，或以一持續釋出形式給藥。
需瞭解對於一特定病人所投藥的抗體或Fab濃度，可能高於或低於在上文二個前面的段落中所列的例示性投藥濃度。
本技藝中具有技術者能夠經由例行的實驗來決定投藥的有效劑量和頻率，舉例而言藉由本文中的揭示以及以下的教示的指引：Goodman,L.S.,Gilman,A.,Brunton,L.L.,Lazo,J.S.,& Parker,K.L.(2006).Goodman & Gilman's the pharmacological basis of therapeutics.New York：McGraw-Hill；Howland,R.D.,Mycek,M.J.,Harvey,R.A.,Champe,P.C.,& Mycek,M.J.(2006).Pharmacology.Lippincott's illustrated reviews.PhiladelphiA：Lippincott Williams & Wilkins；以及Golan,D.E.(2008).Principles of pharmacology：the pathophysiologic basis of drug therapy.Philadelphia,Pa.，[等等]：Lippincott Williams & Wilkins。
於本發明的另一個具體例中，本文中說明的抗CGRP抗體或其等之CGRP結合片段，以及該等抗體或抗體片段的組合，係以一藥學調配物的形式投藥至一主體。
一“藥學組成物”係提及合適於投藥至一哺乳動物的一化學或生物的組成物。此等組成物可以特別地配方 供用於透過一些途徑中的一或多者投藥，該等途徑包括但不限於：頰的、表皮的(epicutaneous)、硬腦膜上的、吸入、動脈內的、心內的、側腦室內的、真皮內的、肌內的、鼻內的、眼內的、腹膜內的、脊椎內的、椎管內的、靜脈內的、口腔、非經腸的、透過一灌腸或栓劑之直腸方式、皮下的、真皮下的、舌下的、經皮的，以及經黏膜的途徑。此外，可藉由注射、粉末、液體、凝膠、滴劑，或是其他的方法，進行投藥。
於本發明的一個具體例中，本文中說明的抗CGRP抗體或其等之CGRP結合片段，以及該等抗體或抗體片段的組合，可以選擇性地組合以一個或多個活性劑予以投藥。此等活性劑包括：止痛劑、抗組織胺劑、退熱劑、抗發炎劑、抗生素、抗病毒劑，以及抗細胞介素劑。活性劑包括：TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-18、IFN-α、IFN-γ、BAFF、CXCL13、IP-10、VEGF、EPO、EGF、HRG、肝細胞生長因子(HGF)、鐵調節激素(Hepcidin)的促效劑、拮抗劑，以及調節劑，其包括對前述的任何一者有反應的抗體，以及對其等之受體的任何一者有反應的抗體。活性劑亦包括但不限於：2-芳基丙酸(2-Arylpropionic acids)、醋氯芬酸(Aceclofenac)、阿西美辛(Acemetacin)、乙酰水楊酸(Acetylsalicylic acid)(阿斯匹靈(Aspirin))、阿氯芬酸(Alclofenac)、阿明洛芬(Alminoprofen)、阿莫西匹靈(Amoxiprin)、安替比林(Ampyrone)、芳香基烷酸(Arylalkanoic acids)、阿扎丙酮(Azapropazone)、貝諾酯/ 苯樂來(Benorylate/Benorilate)、苯噁洛芬(Benoxaprofen)、溴芬酸(Bromfenac)、卡洛芬(Carprofen)、塞來昔布(Celecoxib)、膽鹼水楊酸鎂(Choline magnesium salicylate)、氯非宗(Clofezone)、COX-2抑制劑、右布洛芬(Dexibuprofen)、右旋酮洛芬(Dexketoprofen)、雙氯酚酸(Diclofenac)、二氟尼柳(Diflunisal)、屈噁昔康(Droxicam)、乙柳醯胺(Ethenzamide)、依托度酸(Etodolac)、依托考昔(Etoricoxib)、費索胺(Faislamine)、芬那酸(fenamic acid)、芬布芬(Fenbufen)、非諾洛芬(Fenoprofen)、氟芬那酸(Flufenamic acid)、氟諾洛芬(Flunoxaprofen)、氟吡洛芬(Flurbiprofen)、布洛芬(Ibuprofen)、異丁普生(Ibuproxam)、吲哚美辛(Indometacin)、吲哚洛芬(Indoprofen)、凱布宗(Kebuzone)、克特普芬(Ketoprofen)、酮咯酸(Ketorolac)、氯諾昔康(Lornoxicam)、洛索洛芬(Loxoprofen)、羅美昔布(Lumiracoxib)、水楊酸鎂(Magnesium salicylate)、甲氯芬那酸(Meclofenamic acid)、甲芬那酸(Mefenamic acid)、美洛昔康(Meloxicam)、安乃近(Metamizole)、甲基水揚酸(Methyl salicylate)、莫非布宗(Mofebutazone)、萘丁美酮(Nabumetone)、萘普生(Naproxen)、N-芳基鄰氨基苯甲酸(N-Arylanthranilic acid)、神經生長因子(NGF)、奧沙美辛(Oxametacin)、奧沙普嗪(Oxaprozin)、昔康(Oxicams)、羥布宗(Oxyphenbutazone)、帕瑞考昔(Parecoxib)、非那宗(Phenazone)、保泰松(Phenylbutazone)、保泰松(Phenylbutazone)、吡羅西康(Piroxicam)、吡洛芬(Pirprofen)、 洛芬(profens)、丙谷美辛(Proglumetacin)、吡唑烷(Pyrazolidine)衍生物、羅非昔布(Rofecoxib)、雙水楊酯(Salicyl salicylate)、水楊醯胺(Salicylamide)、水楊酸(Salicylates)、物質P、磺砒酮(Sulfinpyrazone)、舒林酸(Sulindac)、舒洛芬(Suprofen)、替諾昔康(Tenoxicam)、噻洛芬酸(Tiaprofenic acid)、托芬那酸(Tolfenamic acid)、托美汀(Tolmetin)以及戊地昔布(Valdecoxib)。
抗組織胺劑可為預防組織胺的作用或預防組織胺自細胞(如肥大細胞)釋出之任一化合物。抗組織胺劑包括但不限於：阿伐斯汀(acrivastine)、阿司咪唑(astemizole)、阿扎他定(azatadine)、阿扎他定(azelastine)、貝他塔斯汀(betatastine)、溴苯那敏(brompheniramine)、布克力嗪(buclizine)、西替利嗪(cetirizine)、西替利嗪類似物、氯苯那敏(chlorpheniramine)、氯馬斯汀(clemastine)、CS 560、賽庚啶(cyproheptadine)、地氯雷他定(desloratadine)、右旋氯苯那敏(dexchlorpheniramine)、依巴斯汀(ebastine)、依匹斯汀(epinastine)、非索非那定(fexofenadine)、HSR 609、羥(hydroxyzine)、左卡巴斯汀(levocabastine)、樂雷塔定(loratidine)、甲基莫菪鹼(methscopolamine)、咪唑斯汀(mizolastine)、諾阿斯咪唑(norastemizole)、苯茚達明(phenindamine)、普洛敏太定(promethazine)、吡拉明(pyrilamine)、特非那定(terfenadine)及曲尼司特(tranilast)。
抗生素包括但不限於：艾米康絲菌素(Amikacin)、氨基糖苷(Aminoglycosides)、阿莫西林(Amoxicillin)、氨比 西林(Ampicillin)、安莎黴素(Ansamycins)、砷酚胺(Arsphenamine)、阿齊黴素(Azithromycin)、阿洛西林(Azlocillin)、氨曲南(Aztreonam)、枯草菌素(Bacitracin)、碳頭孢烯(Carbacephem)、碳青黴烯(Carbapenems)、卡苯尼西林(Carbenicillin)、頭孢克洛(Cefaclor)、頭孢羥氨芐(Cefadroxil)、頭孢氨芐(Cefalexin)、頭孢噻吩(Cefalothin)、頭孢噻啶(Cefalotin)、頭孢孟多(Cefamandole)、頭孢唑啉(Cefazolin)、頭孢地尼(Cefdinir)、頭孢托崙(Cefditoren)、頭孢吡肟(Cefepime)、頭孢克肟(Cefixime)、頭孢哌酮(Cefoperazone)、頭孢噻肟(Cefotaxime)、頭孢西丁(Cefoxitin)、頭孢泊肟(Cefpodoxime)、頭孢丙烯(Cefprozil)、頭孢他啶(Ceftazidime)、頭孢布烯(Ceftibuten)、頭孢唑肟(Ceftizoxime)、頭孢必普洛(Ceftobiprole)、頭孢曲松(Ceftriaxone)、頭孢呋肟(Cefuroxime)、頭孢菌素(Cephalosporins)、氯黴素(Chloramphenicol)、西司他丁(Cilastatin)、環丙沙星(Ciprofloxacin)、克拉黴素(Clarithromycin)、克林達黴素(Clindamycin)、氯唑西林(Cloxacillin)、黏菌素(Colistin)、磺胺甲基異惡唑(Co-trimoxazole)、達福普汀(Dalfopristin)、地美環素(Demeclocycline)、雙氯西林(Dicloxacillin)、地紅黴素(Dirithromycin)、多利培南(Doripenem)、多西環素(Doxycycline)、依諾沙星(Enoxacin)、爾他培南(Ertapenem)、紅黴素(Erythromycin)、乙胺丁醇(Ethambutol)、氟氯西林(Flucloxacillin)、磷黴素(Fosfomycin)、呋喃唑酮 (Furazolidone)、夫西地酸(Fusidic acid)、加替沙星(Gatifloxacin)、格爾德黴素(Geldanamycin)、見大黴素(Gentamicin)、(Glycopeptides)、除莠黴素(Herbimycin)、亞胺培南(Imipenem)、異煙肼(Isoniazid)、卡那黴素(Kanamycin)、左氧氟沙星(Levofloxacin)、林可黴素(Lincomycin)、雷奈佐利(Linezolid)、洛美沙星(Lomefloxacin)、氯碳頭孢(Loracarbef)、大環內酯(Macrolides)、磺胺米隆(Mafenide)、美洛培南(Meropenem)、耐甲氧西林(Meticillin)、甲硝唑(Metronidazole)、美洛西林(Mezlocillin)、米諾環素(Minocycline)、單環內醯胺(Monobactams)、莫西沙星(Moxifloxacin)、莫匹羅星(Mupirocin)、萘夫西林(Nafcillin)、新黴素(Neomycin)、奈替米星(Netilmicin)、呋喃妥因(Nitrofurantoin)、諾氟沙星(Norfloxacin)、氧氟沙星(Ofloxacin)、苯唑西林(Oxacillin)、羥四環黴素(Oxytetracycline)、巴龍黴素(Paromomycin)、青黴素(Penicillin)、青黴素(Penicillins)、哌拉西林(Piperacillin)、平板黴素(Platensimycin)、多粘菌素B(Polymyxin B)、多肽(Polypeptides)、百浪多息(Prontosil)、吡嗪醯胺(Pyrazinamide)、喹諾酮(Quinolones)、奎奴普丁(Quinupristin)、利福平(Rifampicin)、利福平(Rifampin)、羅紅黴素(Roxithromycin)、大觀黴素(Spectinomycin)、鏈黴素(Streptomycin)、磺胺乙醯(Sulfacetamide)、磺胺甲噻唑(Sulfamethizole)、氨苯磺胺(Sulfanilimide)、柳氮磺吡啶(Sulfasalazine)、磺胺異噁唑(Sulfisoxazole)、磺胺 (Sulfonamides)、替考拉寧(Teicoplanin)、泰利黴素(Telithromycin)、四環黴素(Tetracycline)、四環黴素(Tetracyclines)、替卡西林(Ticarcillin)、梯尼達諾(Tinidazole)、泰百黴素(Tobramycin)、甲氧芐啶(Trimethoprim)、甲氧芐啶磺胺甲異噁唑(Trimethoprim-Sulfamethoxazole)、醋竹桃黴素(Troleandomycin)、曲氟沙星(Trovafloxacin)，以及萬古黴素(Vancomycin)。
活性劑也包括：醛固酮(Aldosterone)、倍氯米松(Beclometasone)、倍他米松(Betamethasone)、皮質類固醇(corticosteroids)、可體松(Cortisol)、乙酸可體松(Cortisone acetate)、乙酸去氧皮質酮(Deoxycorticosterone acetate)、醋酸地塞米松(Dexamethasone)、醋酸氟氫可體松(Fludrocortisone acetate)、糖皮質激素、氫化可體松(Hydrocortisone)、甲潑尼松龍(Methylprednisolone)、潑尼松龍(Prednisolone)、潑尼松(Prednisone)、類固醇，以及曲安西龍(Triamcinolone)。也預期到此等活性劑之任何合適的組合。
一種“藥學賦形劑”或是一種“藥學上可接受的賦形劑”是在其中配製一活性治療劑之載劑，通常是液體。於本發明的一個具體例中，活性治療劑為本文中說明的一種人類化抗體，或其之一個或更多個片段。賦形劑通常不提供任何的藥學活性給該調配物，雖然其可以提供化學及/或生物的安定性，以及釋放特性。例示性調配物可以舉例而言：於Remington’s Pharmaceutical Sciences,19th Ed., Grennaro,A.,Ed.,1995中找到，其係併入以作為參考資料。
當於本文中使用，“藥學上可接受的載劑”或是“賦形劑”包括任何以及全部的生理上相容的溶劑、分散媒介、塗層、抗細菌劑和抗真菌劑、等張劑和吸收延遲劑。於一具體例中，載劑係合適用於非腸胃的投藥。任擇地，載劑可以合適於靜脈內的、腹膜內的、肌肉內的，或是舌下的投藥。藥學上可接受的載劑包括無菌的水溶液或分散液，以及用於即席製備無菌的可注射溶液或是分散液之無菌的粉末。此等媒介和製劑用於藥學上活性的物質之用途係本技藝中所熟知的。除了與活性化合物不相容的任何慣用的媒介和製劑之外，其等於本發明的藥學組成物之用途係預期到的。亦可在組成物中併入補充性活性化合物。
藥學組成物典型地必須於製造和儲存的條件之下是無菌且安定的。本發明係預期以凍乾的形式存在之藥學組成物。組成物可以予以調配為一溶液、微乳劑、脂質體，或是其他合適於高的藥物濃度之有序的結構。載劑可以是一溶劑或是分散媒介，其含有舉例而言：水、乙醇、多元醇(舉例而言，甘油、丙二醇，和液態聚乙二醇)，以及其等之合適的混合物。本發明進一步預期在藥學組成物中納入一安定劑。例如在分散液情況下，可藉由維持所需粒度及藉由使用表面活性劑，而維持適當的流動性。
於許多情況下，較佳在組成物中包括等張劑，舉例而言：糖、多元醇，如甘露糖醇、山梨糖醇，或是氯化 鈉。藉由含括例如單硬脂酸鹽類與明膠之製劑，可以延長可注射組成物的吸收作用。而且，鹼性多肽可以調配於一種定時釋放調配物內，舉例而言於包括一緩慢釋放聚合物的組成物中。活性化合物可以用防止化合物不被快速釋放的載劑來製備，如一種控制釋放調配物，包括植入物和微膠囊化遞送系統。可使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸(polyglycolic acid)、膠原蛋白、聚原酸酯、聚乳酸以及聚乳酸、聚乙醇酸共聚物(PLG)。製備此等調配物的眾多方法係本技藝中具有技術的那些人所知道的。
就各個列舉的具體例而言，能藉由種種的劑量形式予以投藥該等化合物。本技藝中具有通常技術的人所知道的任何生物上可接受的劑量形式，以及其等之組合係預期到的。此等劑量形式之實例包括但不限於：可重構的(reconstitutable)粉末、酏劑、液體、溶液、懸浮液、乳劑、粉末、顆粒、粒子、微粒子、可分散的顆粒、膠囊(cachet)、吸入劑、氣溶膠(aerosol)吸入劑、貼片、粒子吸入劑、植入物、補給植入物(depot implant)、可注射物(包括皮下的、肌肉內的、靜脈內的，以及皮內的)、注入物，以及其等之組合。
本發明種種作例證的實施例之上述的說明並非意欲窮舉或是要限制本發明至所揭露的確切形式。縱然在本文中為了闡釋的目的而說明本發明之特定的具體例和實例，但是如相關技藝中的那些熟悉技術者所認出之各種均 等修飾皆可以落在本發明的範疇之內。本文中所提供關於本發明之教示可以應用在以上所說明的實例之外的其他的目的。
按照以上的詳細說明，可在本發明進行此等和其他的變化。一般而言，於下列的申請專利範圍中，使用術語不應解釋成將本發明侷限於說明書和申請專利範圍中揭露的特定的具體例。於是，本發明並非受限於揭露內容，本發明的範疇係完全地由下列的申請專利範圍決定。
可以以前述的說明和具體例之中特別說明的方式以外之其他方式，實施本發明。鑑於上述教導可能進行本發明之許多的修飾和變化，以及其等因而落在附隨的申請專利範圍的範疇之內。
有關用於獲得抗原專一性的B細胞的一株系族群的方法之某些教示係揭露於2006年5月19日提申的美國臨時專利申請案第60/801,412號之中，其之揭示係以其之全體併入本文中以作為參考資料。
有關於兔衍生的單株抗體之人類化以及較佳的序列修飾以維持抗原結合親和性之某些教示，係揭示於2008年5月21日提申的國際申請案第PCT/US2008/064421號中，對應於國際早期公開案第WO/2008/144757號，名為「Novel Rabbit Antibody Humanization Methods and Humanized Rabbit Antibodies」，其之揭示係以其之全體併入本文以作為參考資料。
有關利用配對的勝任酵母菌生產抗體或其等之 片段與對應的方法之某些教示，係揭露於2006年5月8日提申的美國專利申請案第11/429,053號(美國專利申請案早期公開案第US2006/0270045號)之中，其之揭示係以其之全體併入本文中以作為參考資料。
有關於某些CGRP抗體多核苷酸與多肽係揭露於伴隨此專利申請案提申的序列表之中，以及該序列表之揭示係以其之全體併入本文中以作為參考資料。
於本發明的背景、詳細說明，以及實施例中所引述的各文件(包括專利、專利申請案、期刊文章、摘要、手冊、書籍，或是其他的揭示)之整個的揭示，係以其等之全體併入本文中以作為參考資料。
提出下列的實施例以便於提供本技藝中具有通常技術的那些人如何做以及如何使用本發明之完全的揭示和說明，而並非意欲限制視為本發明的範疇。已經努力確保有關於使用的數目(例如：數量、溫度、濃度等等)之正確性，但應允許一些的實驗錯誤和誤差。除非用別的方法指出，份係重量份，分子量是平均分子量，溫度是攝氏度數為單位；以及壓力是大氣壓力或是接近大氣壓力。
實施例
實施例1
用Ab14 100mg/kg來治療正常大鼠(經由靜脈內的途徑，在鉗制術程序之前48h單一的投藥)，以及與甲福明500mg/kg的效應作比較(經由口腔的途徑，在鉗制術程序之前24h和4h投藥二次)。此實施例使用的抗體係由序列辨 識編號132和134之輕多肽鏈和重多肽鏈所組成。
血糖測量的進行係於餵食條件下，治療前、用甲福明及Ab14治療後18h，以及用Ab14治療後42h。該2種化合物不影響此等條件下之血糖。於禁食條件下測量血糖，正好在鉗制術前，以及只用甲福明的條件下有顯著降低的效應(17%)。該2種化合物會使餵食條件下，治療前、用甲福明治療後18h，以及用Ab14治療後42h所測量的血漿胰島素稍微地減少，還有胰島素抗性指數HOMA-IR也是(不顯著)。
獲得正好在鉗制術程序之前、治療後48小時之Ab14治療的動物之血漿樣本，判定Ab14的濃度。此分析的結果確認進行鉗制術程序的大鼠全身性暴露在範圍從642到797μg/mL Ab14之下。
為了估定對於全身胰島素敏感性的效應，執行鉗制術程序，使用0.3U/Kg/h胰島素及3H-葡萄糖。大鼠在灌流180分鐘之前，先禁食6小時。在灌流140分鐘後到達穩態，以及計算140分鐘至180分鐘之葡萄糖輸注率(GIR)、全身葡萄糖轉換(GTO)、肝葡萄糖的生成(HGP)、醣解作用，及肝醣合成。在鉗制術結束之前1小時投藥14-C-2-去氧葡萄糖之推注，以測量組織特異性的葡萄糖利用。如同預期的，甲福明藉由增加醣解作用及肝醣合成，而使GIR(27%)及GTO(30%)顯著地增加。甲福明使混合外股肌(VL，49% p<0.05)，醣解伸趾長肌(EDL，19% NS)內之葡萄糖的利用增加，以及使心臟內之葡萄糖的利用減少(-39%，p<0.01)， 據推測可能是由於心肌脂肪酸氧化(oxidationl)的刺激。Ab14傾向使增加GIR及GTO(NS)，以及對VL(70%，p<0.01)，EDL(26%，NS)，及氧化的比目魚肌內(27%，NS)之葡萄糖的利用有比甲福明更強大的效應。Ab14亦傾向增加心臟(21%,NS)內之葡萄糖的利用。與甲福明相似，Ab14不影響白色脂肪組織內之葡萄糖的利用率(深部及皮下)。
總而言之，Ab14在急性的治療之後，良好的傾向於改善正常大鼠之全身葡萄糖的利用，且對於肌肉(VL)內之葡萄糖的利用率有顯著的效應。
方法
雄性史-道二氏(Sprague-Dawley)大鼠在整個實驗期係眷養於籠子(1500cm2 x 21cm)中。動物籠子的墊料每星期更換一次。動物在適應期係以3-4隻動物一組的方式眷養，然後在手術後個別眷養直到進行鉗制術程序。倒轉的12小時光週期(在上午8點關燈)，22±2℃及55±10%相對濕度。提供標準的飲食(RM1(E)801492，SDS)與自來水供隨意取用。
在2週的適應期之後，將大鼠麻醉(異氟醚)並於股靜脈提供導管。接著在鉗制術程序之前為5-6天的恢復期。
於上午07：30和08：00之間(正好在關燈之前)，用血糖計從尾巴尖端來測量血糖(BG)，以及正好在測量血漿胰島素之後執行血液採集(使用EDTA)。下表說明該等情況：
血漿樣本保持在-80℃直到胰島素測量(使用ELISA方法)。
從每隻第2組動物獲得正好在鉗制術程序之前的血液樣本(~200μL)，處理成血漿(~60μL)，以及維持在-80℃，供用於隨後利用Meso Scale Discovery(MSD)ELISA平台來判定Ab14的濃度。
在鉗制術程序T0之前48h(在鉗制術之前2天的下午02：00)，經由i.v.途徑來投藥載體及Ab14。
在鉗制術程序T0之前24h及4h(在鉗制術前一天的下午02：00及鉗制術當天的上午10：00)，經由p.o.途徑來投藥甲福明。
大鼠在鉗制術開始之前(~8h，正好在血液採集後)，先禁食6小時。
使用3H-葡萄糖作為示蹤劑以及0.3U/Kg/h胰島素輸注，從下午02：00(T0)執行高胰島素血性-正常血糖鉗制術至下午05：00(T+3h)。同時進行葡萄糖溶液輸注，並調整輸注率以達到穩態(~100+/-10mg/dL)。每10分鐘使用血糖計從尾巴尖端測量血糖。在最後一小時期間(穩態)，從尾巴尖端採集血液(10μL)，以及評估下列參數：葡萄糖輸注率；全身葡萄糖的利用率；肝葡萄糖的生成率；全身肝醣及醣 解率。
為了判定個別組織的葡萄糖的利用率，在D-[3-3H]-葡萄糖輸注結束之前60min，執行經由股靜脈推注注射每隻大鼠100μCi的去氧-D-葡萄糖2-14C(14C-2-DOG)。於注射之後0、5、10、15、20、25、30、45，及60分鐘時，從尾靜脈尖端採樣10μL微量血液，來判定血漿14C-2-DOG的消失及葡萄糖濃度。在實驗期間結束時，將外股肌(VL)、醣解伸趾長肌(EDL)及比目魚肌、附睾及鼠蹊的白色脂肪組織、心尖，以及皮膚(作為負對照)剝離，急速冷凍並保持在-80℃。將各組織的一片溶解於1M NaOH內，然後用1M HCl予以中和。D-2-14C去氧葡萄糖6-磷酸鹽。藉由使用氫氧化鋅(0.3M)溶液或過氯酸溶液(6%)而使D-2-14C去氧葡萄糖差別性沈澱(differentially precipitated)。測量二個放射性含量來評估表達為ng/mg/min之葡萄糖攝取。
在鉗制術結束時測量血漿胰島素位準。
使用GraphPad prism軟體來執行統計分析。使用單因子ANOVA加上鄧奈特事後檢定來分析直方圖，以及使用ANOVA二因子加上龐費洛尼事後檢定來分析曲線。當p值<0.05時，認為差異是顯著的。NS：不顯著。
結果及討論
血糖及胰島素測量 。於餵食條件下，與載體組相比，用Ab14 100mg/kg治療後42h及用甲福明500mg/kg治療後18h，血糖的位準不受影響(圖1A)。然而，Ab14及甲福明分別使血漿胰島素位準減少達11%及18%(不顯著，圖1B)。 然後，與載體組相比，胰島素抗性指數HOMA-IR以相似的方式減少(圖1C)。另一方面，於6小時禁食條件下，甲福明顯著地使血糖於治療30h後減少達17%(圖1D)。
全身葡萄糖通量 。在Ab14 100mg/kg單一的投藥48h後，以及甲福明500mg/kg最後一次投藥4h之後，於6小時禁食條件下執行高胰島素血性-正常血糖鉗制術。
與載體組相比，甲福明顯著地使GIR發展由輸注開始之後60分鐘增高。Ab14傾向使GIR發展增高，主要在130分鐘輸注之後(圖2A)。
所有組別之葡萄糖輸注率均在140min達到平線區。於此穩態期間所有組別之血糖位準是相似的(圖2B)。在鉗制術結束時所有組別之血漿胰島素位準是相似的(圖2C)。在鉗制術結束時的血漿胰島素位準與餵食條件下所測得的血漿胰島素位準幾乎是相同的，亦即，使用來獲得高胰島素血症之胰島素劑量是生理的劑量。
接著計算140分鐘至180分鐘輸注之葡萄糖通量(圖3)。Ab14與甲福明分別使葡萄糖輸注率增加達18%(NS)及27%(p<0.05)，以及分別使葡萄糖轉換達18%(NS)及30%(p<0.05)。此超生理劑量之胰島素完全抑制3組中的肝葡萄糖的生成。Ab14不影響醣解作用率，反之甲福明卻使醣解作用率增加達43%(NS)。Ab14使肝醣合成的速率增高達23%，與甲福明相似(NS)。
亦判定個別組織的葡萄糖的利用率，其係在D-[3-3H]-葡萄糖輸注結束之前60min，使用經由股靜脈推 注注射每隻大鼠100μCi的去氧-D-葡萄糖2-14C(14C-2-DOG)。測量二個放射性含量來評估表達為ng/mg/min之葡萄糖攝取。如圖4A-C中所示，甲福明使混合外股肌(VL，49% p<0.05)，醣解伸趾長肌(EDL，19% NS)內之葡萄糖的利用增加，以及甲福明使心臟內之葡萄糖的利用減少(-39%，p<0.01)，據推測可能是由於心肌脂肪酸氧化的刺激，其為甲福明已知的效應。Ab14傾向使葡萄糖輸注率及全身葡萄糖轉換(NS)增加，以及對VL(70%，p<0.01)，EDL(26%，NS)，及氧化的比目魚肌內(27%，NS)之葡萄糖的利用有比甲福明更強大的效應。Ab14亦傾向增加心臟(21%,NS)內之葡萄糖的利用。與甲福明相似，Ab14不影響白色脂肪組織內之葡萄糖的利用率(深部及皮下)。
Ab14血漿濃度分析。進行鉗制術程序的第2組動物之Ab14血漿濃度範圍從642到797μg/mL，以及支撐高達48小時的全身性暴露。
結論.用Ab14之急性的治療會使血漿胰島素稍微降低，且藉由增加肝醣合成及肌肉的葡萄糖利用，而傾向使全身葡萄糖的利用增加。
實施例2
此實施例評估Ab14改善胰島素抗性大鼠模式之胰島素敏感性的能力。於此模式中，餵食大鼠高脂(69%)及高果糖(14%)的飲食(HFD)六週來誘發葡萄糖失耐(glucose intolerance)，加上與餵食正常食物的對照動物相比，血漿胰島素位準變成顯著地增加且糖血症(glycaemia)變成 稍微增加。此實施例使用的抗體係由序列辨識編號132和134之輕多肽鏈和重多肽鏈所組成。
用Ab14來治療餵食HFD六週的大鼠歷時二週，並且執行2步驟的高胰島素血性-正常血糖鉗制術以評估胰島素敏感性。在第一個步驟的期間使用生理劑量的胰島素，以及在第二個步驟的期間使用藥學劑量的胰島素，以分別評估在此等二種條件下周邊及肝臟的胰島素敏感性之效應。
摘要
在HFD六週後依據大鼠之葡萄糖失耐(於口服耐糖試驗(OGTT)期間之AUC計算結果)及其等之HOMA-IR(胰島素抗性指數)，而隨機分佈其等至治療組。HFD大鼠之15天治療係用10、30及100mg/kg/週之Ab14(i.v.，一週相間隔地投藥二次)，或每天用甲福明200mg/kg/天於飲水中。
體重及食物攝取每週測量3次直到治療10天。於第10天及第15天測量HOMA-IR。於第15天及第16天執行2步驟的鉗制術(5mU/kg/min然後15mU/kg/min胰島素)。使用3H-葡萄糖示蹤劑輸注來評估鉗制術程序期間的葡萄糖轉換(GTO)。
在研究結束時，當與餵食正常食物的對照大鼠相比時，觀察到HFD大鼠於體重、空腹血糖、血漿胰島素以及C胜肽展現出顯著的增加，以及在2步驟的高胰島素血性-正常血糖鉗制術的期間，葡萄糖輸注率(GIR)展現出顯著的 減少。
當與HFD加上載體對照組相比時，Ab14治療對於體重或食物攝取沒有效應，然而甲福明組顯著地使二個參數都減少。
100mg/kg之Ab14於治療15天之後顯著地使HOMA-IR減少38%(透過降低空腹血糖及血漿胰島素)。甲福明對HOMA-IR於第15天有不顯著的(ns)降低效應。Ab14治療亦使C胜肽顯著地降低(10mg/kg達30%及100mg/kg達29%)。
當與HFD載體對照組相比時，在鉗制術步驟第一個步驟的期間，於Ab14治療組內觀察到增高的GIR(ns)，而甲福明對GIR有程度稍微小的顯著增加效應。30或100mg/kg之Ab14以及甲福明治療在鉗制術第二個步驟的期間使GIR顯著地增加(分別達36、28，以及27%)。
當與HFD載體對照組相比時，30mg/kg之Ab14在鉗制術程序第一個步驟的期間傾向使增加GTO(達17%，ns)。30mg/kg之Ab14對二個鉗制術步驟期間之醣解作用及肝醣合成有稍微增加的效應(ns)。
在第一個步驟的期間，Ab14或甲福明治療只有稍微但卻是顯著地使肝葡萄糖的生成(HGP)減少(介於11-20%之間)。在第二個步驟的期間，當與HFD載體對照組相比時，10mg/kg之Ab14使HGP不顯著減少(達78%)，以及30或100mg/kg之Ab14及甲福明完全地抑制HGP。
總而言之，於HFD大鼠模式中觀察到Ab14靜脈 內投藥後會改善的胰島素抗性(主要為肝臟)。
方法
82隻史-道二氏(Sprague-Dawley)大鼠(研究開始實為8週大，平均重量為大約250克)在整個實驗期係眷養於籠子(904cm2 x 23cm)中。動物籠子的墊料每星期更換三次。動物在適應期、HFD及治療時期係以2-3隻動物一組的方式眷養。然後大鼠在手術後個別眷養直到進行鉗制術程序。在倒轉的12小時光週期(在上午8點關燈)，以及維持22±2℃及55±10%相對濕度下眷養大鼠。在開始HFD餵食之前，提供至少5天的適應期。在適應期期間，提供標準的飲食(RM1(E)801492，SDS)與自來水供隨意取用。
在適應期之後，10隻大鼠餵食正常食物(NC)，而72隻大鼠在整個實驗中均餵食HFD(RD1，SAFE)。
高脂肪飲食組成如下(千卡%)：蛋白質：17.3%；碳水化合物(果糖)：14%；脂肪(豬油))：68.7%；膽固醇1.65%，膽酸0.65%。
在HFD餵食六週之後，大鼠禁食6小時，以及執行口服耐糖試驗。接著將呈現最低的AUC(~17%)大鼠排除在研究之外。然後依據大鼠之AUC(耐糖指數)及HOMA-IR(胰島素抗性指數)，而將剩餘的大鼠隨機地分派至不同的組別。
於治療的第1天及第8天早晨經由i.v.途徑(經由尾靜脈，於異氟醚麻醉之下)，每週投藥Ab14(10，30。 100mg/kg)及載體。
甲福明(200mg/kg/天)投藥於飲水中~2週，直到鉗制術程序為止。用甲福明治療的大鼠於第1天及第8天係用載體予以治療(經由尾靜脈)。
測試組如下：第1組：NC+載體i.v.(n=10)
第2組：HFD+載體i.v.(n=10)
第3組：HFD+Ab14 10mg/kg i.v.(n=10)
第4組：HFD+Ab14 30mg/kg i.v.(n=10)
第5組：HFD+Ab14 100mg/kg i.v.(n=10)
第6組：HFD+甲福明200mg/kg於飲水中+載體i.v.(n=10)
在HFD餵食的最後一週期間，篩選之前，一週測量水攝取3次來評估自來水中的甲福明稀釋度。
在正常食物及HFD六週之後，82隻大鼠從上午08：00禁食至下午02：00(6小時)。於下午02：00(t0)進行葡萄糖推注投藥(2.5g/kg)。於t-30、0、15、30、60、90、120、150min.進行血糖的測量(使用血糖計，從尾巴尖端採集血滴)。於t-30從尖尾(tip tail)採集血液(40μL，使用EDTA)來測量血漿胰島素(ELISA法)。
計算曲線下的面積(AUC)。呈現最高的AUC之12隻餵食HFD的大鼠被認為是葡萄糖失耐比較少的，並且被排除在研究之外。剩餘的60隻大鼠係依據大鼠之均質(homogeneous)AUC、HOMA-IR，及體重，而隨機地分派至6組。
在HFD的第一個六週期間，每星期測量一次體重。在治療的第一個10天期間，每星期測量3次體重。測量48h或72h期間的食物攝取，正好是在治療之前，以及在治療的期間直到手術程序(第11天)為止，每星期測量3次食物攝取。
在開始治療之前(OGTT那天)以及在治療的第10天，全部的大鼠從上午08：00禁食。於下午01：30，從尾巴尖端採集血液(40μL，使用EDTA)。測量(使用血糖計)及血漿胰島素(ELISA法)。
於第11天，將大鼠麻醉(異氟醚)並於股靜脈植入導管。接著在鉗制術程序之前為4天的恢復期。
鉗制術的早晨，大鼠禁食6小時(從上午8：00至下午02：00)。正好在鉗制術程序之前(於~下午1：00)，從第3組、第4組、第5組，及第6組的每隻大鼠之尾巴尖端採集血液樣本(~160μL，使用EDTA)，處理成血漿(~60μL)，以及維持在-80℃直到要評估Ab14的濃度。雖然沒有分析對照和甲福明組之抗體濃度，但是從第1組、第2組及第7組的大鼠採集相似量的血液(並丟棄)。
於第15或16天，執行2步驟的高胰島素血性-正常血糖鉗制術，其係使用3H-葡萄糖作為示蹤劑(除了正常食物組之外)，以及從下午02：00(T0)至下午04：00(T+2h)為5mU/kg/min胰島素輸注，接著從下午04：00至下午05：30(t+3.5h)為15mU/kg/min胰島素輸注。同時進行葡萄糖溶液輸注，並調整輸注率以達到穩態(100+/-10mg/dL)。每 10分鐘使用血糖計從尾巴尖端測量血糖。於各步驟的穩態期間，從尾巴尖端規律地採集血液(10μL)。
評估下列參數：葡萄糖輸注率(所有組別)；全身葡萄糖的利用率(除了正常食物組之外)；肝葡萄糖的生成率(除了正常食物組之外)；全身肝醣及醣解率(除了正常食物組之外)。
並且，除了正常食物組之外，在鉗制術實驗結束之前1小時，來執行推注注射14C-2DOG，以及在鉗制術結束時採集下列組織的樣本並保留用於進一步評估：外股肌(VL)；伸趾長肌(EDL)；比目魚肌心尖；附睾白色脂肪組織鼠蹊的白色脂肪組織皮膚(負對照)。
測量正好在輸注開始之前(~T-30min.)，在步驟1(T2h)和步驟2(T3.5h)的穩態結束時的血漿胰島素及C胜肽位準。就此而言，從尾巴尖端執行血液採集(~100μL，使用EDTA)。
使用GraphPad prism軟體來執行統計分析。使用ANOVA二因子加上龐費洛尼事後檢定來分析曲線。使用t檢定來分析直方圖，以比較HFD加上載體對照組及正常食物加上載體對照組。使用單因子ANOVA加上鄧奈特事後檢定來分析直方圖，以比較Ab14及甲福明組對抗HFD加上載體對照組。當p值<0.05時，認為差異是顯著的。NS：不顯著。
結果
動物模式及篩選. 在開始治療之前，8週大的大 鼠餵食果糖富集的高脂肪飲食(HFD，69%脂肪及16%果糖)七週。HFD組的體重為522±5g vs餵食正常食物的對照組之體重448±13g。所以在第42天於HFD體重增加16%(t檢定之p<0.001(圖5)。在七週後，HFD族群體重增加達187±3g vs餵食正常食物的對照組之158±9g(於第42天t檢定之p<0.001，圖6)。
在HFD的第七週期間，執行口服耐糖試驗來評估HFD族群之葡萄糖失耐。HFD族群之血糖的位準直到葡萄糖投藥之後150min仍是較高的(未顯示)。與餵食對照食物的大鼠(未顯示)相比時，HFD大鼠計算出的AUC相對於T0為顯著較高的(9%)。
用t-30之OGTT來計算HOMA-IR(胰島素抗性指數)。將呈現較高的AUC及較高的HOMA-IR之大鼠，隨機地分派至6組。與餵食對照食物組相比時，HFD組之AUC為較高的(~9%，未顯示)，以及HOMA-IR(34%，未顯示)及體重為較高的(~17%，p<0.001，圖7)。
體重和食物攝取的追踪。於治療10天之後追踪體重。Ab14治療對於體重沒有效應。餵食對照食物大鼠的體重仍是顯著地低於HFD載體組(圖7)。Ab14(30mg/kg)只有使體重增重稍微減少(ns)，以及甲福明200mg/kg從治療的第二天向前使體重增重出現顯著地減少。
如同預期的，HFD載體組內之食物攝取比餵食對照食物組更少。Ab14治療對於追踪的食物攝取(圖8A)或是累積的食物攝取(圖8B未顯示)沒有效應。甲福明顯著地使 累積的食物攝取減少25%。在手術程序之前第9天和第10天之間的動物禁食中斷了累積的食物攝取之測量。
生化參數.當與餵食對照食物的對照組相比時，HFD載體組之空腹血糖於第0天、第10天及第15天分別增加達5%(ns)、11%(ns)，以及20%(p<0.001)。Ab14或甲福明治療於第10天沒有效應。當與HFD載體組相比時，Ab14 100mg/kg之治療於第15天對於空腹血糖有顯著減少的效應(圖9)。
當與餵食對照食物組相比時，HFD載體組之空腹血漿胰島素於第0天、第10天及第15天分別增加達33%(ns)、49%(ns)以及67%(p<0.01)。於第10天Ab14治療沒有效應，而甲福明使血漿胰島素減少達37%(ns)。於治療15天之後，10、30或100mg/kg之Ab14治療分別使血漿胰島素減少達26、16，或18%(ns)，以及甲福明使血漿胰島素減少達11%(ns，圖10)。
如同預期的，第15天之血漿C胜肽位準廓型與血漿胰島素位準相似，但是其之效應更明顯且變化較小。當與餵食對照食物組相比時，HFD載體組之C胜肽顯著地增加達67%。10、30或100mg/kg之Ab14治療分別使C胜肽位準減少達30%(p<0.05)、23%(ns)，及29%(p<0.05)，以及甲福明使C胜肽減少達13%(ns)(圖11，下部左小組)。
當與餵食對照食物組相比時，HFD載體組之胰島素抗性指數，HOMA-IR於第0天增加達36%(ns)，於第10天增加達42%(ns)，以及於第15天增加達98%(p<0.01)。與HFD 載體相比，Ab14於治療10天之後沒有效應，而甲福明有36%之減少的效應(ns)。於治療15天之後，10、30或100mg/kg之Ab14治療分別使HOMA-IR減少達33%(ns)、17%(ns)及38%(p<0.05)，以及甲福明傾向使HOMA-IR減少達18%(ns，圖12)。
高胰島素血性鉗制術.圖13顯示在2步驟的高胰島素血性期間，於時間期間之葡萄糖輸注率(GIR)。在第一個步驟期間(5mU/kg/min胰島素)，肝葡萄糖的生成(HGP)被不完全地抑制，以及葡萄糖輸注率(GIR)比第二個步驟(15mU/kg/min胰島素)的期間為更低，當肝葡萄糖的生成被抑制時。
在二個鉗制術步驟的期間，餵食對照食物組之GIR比HFD載體組更高，以及確認了HFD大鼠在8-9週飲食之後具有胰島素抗性表現型。在第一個鉗制術步驟的期間，甲福明對於GIR沒有效應，而Ab14治療組之GIR平線區為稍微高的(ns)。在第二個鉗制術步驟的期間，觀察到所有的治療組之GIR平線區比HFD載體組為更高，觀察到甲福明及30或100mg/kg的Ab14具有顯著差異(圖13)。使用ANOVA二因子加上龐費洛尼事後檢定來評估相對HFD之統計顯著性。在第一個鉗制術步驟的期間，只有於時間點50及60分鐘之正常食物的對照、載體治療的大鼠之GIR為顯著地不同(分別為p<0.01及p<0.05)。在第二個鉗制術步驟的期間，用30mg/kg Ab14治療之HFD大鼠於時間點160-210分鐘之GIR顯著地不同(於時間點160分鐘之p<0.05以及於時間點170-210 分鐘之p<0.01)，用100mg/kg Ab14予以治療之HFD大鼠於時間點170-210分鐘之GIR顯著地不同(於時間點190分鐘之p<0.01，以及於時間點170-180分鐘和200-210分鐘之p<0.05)，以及用甲福明治療之HFD大鼠於時間點170-210分鐘之GIR顯著地不同(於時間點180分鐘和190分鐘之p<0.01，以及於時間點170分鐘和200-210分鐘之p<0.05)。
計算各平線區之GIR平均值(圖14)。與餵食對照食物組相比，HFD載體組的GIR在第一個步驟和第二個步驟的期間分別顯著地減少達32%(p<0.05)及17%(p<0.01)。10、30或100mg/kg之Ab14使第一個步驟期間之GIR增加(ns)(分別達26、37及29%)，以及甲福明也有11%之增高效應(ns)。在第二個步驟的期間，當與HFD載體組相比時，所有的治療使GIR增加：Ab14 10、30或100mg/kg分別為19%(ns)、36%(p<0.01)及28%(p<0.05)，以及甲福明為27%(p<0.05)。
如同預期的，在二個鉗制術步驟的期間之血糖平均值對應於正常血糖狀態。雖然在第一個鉗制術步驟的期間，於餵食對照食物組和HFD載體組之間有顯著差異，但是糖血症(glycaemia)仍是在正常範圍內，以及二組的生物狀態是一樣的(圖14)。
測量鉗制術程序期間的血漿胰島素。如同預期的，在二個鉗制術步驟結束時所有組別之間的胰島素位準是相似的。在第一個鉗制術步驟的期間，胰島素濃度大概是140μU/mL，以及是餵食條件下預期的生理位準。在第二個鉗制術步驟之後，胰島素濃度大概是490μU/mL，此為藥學 位準(圖11，上部小組)。
亦測量在鉗制術程序的期間的C胜肽(圖11，下部右方小組)。在正常血糖條件期間，刍細胞會抑制胰島素分泌，以及因而血漿C胜肽位準很低且不可解釋。
在鉗制術程序的期間所有的HFD組別之3H-葡萄糖係與胰島素一起輸注(餵食對照食物組中沒有)。接著計算全身葡萄糖通量。在第一個鉗制術步驟的期間，所有的組別之葡萄糖轉換(GTO)是相似的，不包括30mg/kg的Ab14，當與HFD載體組相比時，其傾向使GTO增加(17%，ns)。用30mg/kg的Ab14予以治療之後，醣解作用及肝醣合成傾向分別增加15和16%(ns，圖15)。
在第二個鉗制術步驟的期間，所有的治療組之GTO，醣解作用，及肝醣合成是與相似的，且當與HFD載體組相比時，觀察到Ab14 30mg/kg治療組之肝醣合成少量的增加(達10%，ns)。30mg/kg(p<0.05)及100mg/kg(ns)之Ab14會完全抑制HGP，如同甲福明(ns)一般，以及10mg/kg之Ab14治療會使HGP減少達78%(ns，圖16)。
結論.HFD大鼠模式中用Ab14治療會藉由減少空腹血糖及血漿胰島素位準，而使HOMA-IR減少。再者，Ab14明顯改善肝臟胰島素敏感性，然而卻沒有清楚觀察到Ab14對於全身周邊的胰島素敏感性的效應。如同預期的，甲福明治療也會改善肝臟胰島素敏感性。
實施例3
此實施例評估Ab14對於祖克(Zucker)糖尿病肥 胖(ZDF)大鼠，大鼠糖尿病模式之模式內之葡萄糖代謝的效應及對於升糖(glycemic)對照的效應。評估慢性投藥Ab14於從糖尿病前(高胰島素血性，血糖量正常)狀態進展至明顯糖尿病(低胰島素血性，高血糖)狀態的ZDF大鼠內，對於葡萄糖對照的效應。此等動物在幾週大之前發展出糖尿病前期，其特徵在於有顯著的高胰島素血症來補償其等發展的胰島素抗性，但是具有輕微的高血糖症或是沒有高血糖症。此在10-12週大之前會由於胰臟刍細胞衰竭，而快速地進展至明顯糖尿病，其特徵在於低胰島素血症，以及顯著的高血糖症。此實施例使用的抗體係由序列辨識編號132和134之輕多肽鏈和重多肽鏈所組成。
方法
81隻ZDF fa/fa大鼠(Charles River Laboratories，法國)及10隻瘦ZDF ？/+大鼠(對照)以1-2隻動物一組的方式，眷養於通風且豐富的(飼養)(enriched)眷養籠中，處於正常12小時光週期(在下午8點關燈)，22±2℃及50±10%相對濕度。大鼠送來時為7週大，以及在研究開始前適應一週。用ZDF大鼠之標準的飲食(Purina 5008，Charles River)來餵食大鼠，以及提供自來水供隨意取用。監測所有的動物在整個研究中任何不健康、治療的不良反應，或是發病率的徵兆每天至少一次。
8週大的雄性ZDF fa/fa大鼠為高胰島素血性且緩和性糖尿病。由於此狀態下血糖及胰島素位準之變異性，所以依據其等之HOMA-IR來篩選且選擇ZDF大鼠。
於AB14治療組方面，以二種不同劑量20mg/kg/週(第3組和第7組)或是60mg/kg/週(第4組和第8組)、於第1、8、15及22天，經由尾靜脈(i.v.，5mL/kg)每週投藥一次。所有其他組別係每週用載體1(i.v.，5mL/kg)來治療一次。於第1、8、15及22天早上、同時於異氟醚麻醉下執行靜脈內治療。投藥的體積係依據最近的體重，而分別修改。
於上午8：00及10：00之間，經由口服途徑(p.o.，5mL/kg)每天投藥一次甲福明(Met)及吡格列酮(pioglitazone)(PIO)予以歷時28天，除了OGTT那天之外或是靜脈治療以後，有一些口服治療是在上午10：00後完成。第5組、第7組和第8組是用200mg/kg/天的甲福明來治療，以及第6組是用10mg/kg/天的吡格列酮來治療。所有其他組別係每天用載體2(p.o.，5mL/kg)來治療歷時28天。用最近的體重來計算各組之投藥的平均體積。
測試組概述於下表中。Met：甲福明。
在1週的適應期間之後，稱全部大鼠的重量且禁食6小時(從上午~8：00至下午~2：00)。於下午~2：00時，從尾巴尖端採集血液(~150μL，EDTA)。測量血糖(使用血糖計)血漿及胰島素(ELISA)，以及計算HOMA-IR(胰島素抗性指數)。呈現極端的HOMA-IR值之11隻ZDF fa/fa大鼠排除在研究之外，但是繼續眷養歷時28天用於在研究結束時採集血漿。然後依據其等之HOMA-IR及體重，而將剩餘的70隻大鼠隨機地分派至7組。瘦大鼠全部留在第1組且只用載體予以治療。
在治療的4週期間，每星期測量二次體重。
測量正好在篩選程序之前的食物攝取，以及接著在第一個三週治療期間測量24h之食物攝取每星期2次。在OGTT(第4週)週的期間，每星期測量食物攝取一次。
在每次血液採集之前，執行禁食(於第0天從上午8：00至下午02：00為6小時，以及於第12、19及26天從下午~6：00至上午~8：00隔夜)。於第0天下午~2：00時(篩選之前，150μL，EDTA鉀)，以及於第12天(110μL，EDTA鉀)、第19天(150μL，EDTA鉀)及第26天(110μL，EDTA鉀)在給藥之前上午~8：00時，從尾巴尖端採集血液。
於第0天、第12天、第19天及第26天測量空腹血糖(血糖計)。於第0天，以及於第12天、第19天及第26天在給藥之前，測量空腹血漿胰島素、C胜肽位準(ELISA法)、游離脂肪酸、三酸甘油酯、總膽固醇(比色法)，以及HDL-膽固醇(磷鎢酸沈澱，比色法)。總膽固醇-HDL-膽固醇計算為非HDL-膽固醇。於第0天、第19天及第28天測量果胺糖。於第0天及第28天測量HbA1c(DCA 2000)。
執行口服耐糖試驗(OGTT)如下。於第25天，大鼠在下午~6：00行禁食並於第二天(於第26天)執行口服耐糖試驗。在上午~8：00(T-60)執行血液採集(110μL，EDTA)用於測量生化參數。一小時以後(上午~09：00)，投藥口服葡萄糖推注(1.5g/kg)(T0)。於T-60、T0、T15、T30、T60、T90、T120及T180分鐘時，進行血糖的測量(血糖計或是於高糖血症(high glycaemia)的情況下用比色法)。根據T0時所測得的血糖值來計算曲線下的面積(AUC)。於T-60、T15(~40μL的血，EDTA)，及T30分鐘(~40μL的血，EDTA)時，測量血漿胰島素及C胜肽(ELISA法)。
於第28天2小時的限食(從上午8：00至上午10：00)之後，以異氟醚來麻醉研究的80隻大鼠。採集血液(從腹靜脈~3000μL，用K2-EDTA)用於決定AB14的血漿濃度。血漿(~200μL之3等分試樣)保持在-80℃直到測試。然後切除胰臟組織。藉由切除腹靜脈和主動脈而使大鼠安樂死。
將各個胰臟分成2部分(縱向切割)。一塊於10%福馬林溶液內固定用於組織病理加工。另一塊胰臟急速冷凍 並保持在-80℃用於決定胰島素及前胰島素位準。
於眷養28天之後，將排除在研究之外的11隻ZDF fa/fa大鼠予以犧牲。以異氟醚來麻醉該等大鼠。從腹靜脈採集血液(用EDTA鉀之最大體積)。冷凍血漿樣本(每個1mL之2等分試樣)用於進一步測試。藉由切除腹靜脈和主動脈而使大鼠安樂死。
使每個胰臟樣本於酸性緩衝液內均質化，以及使用ELISA套組來測量下列組別之胰島素及前胰島素含量：第1組：瘦大鼠+載體(n=10)
第2組：ZDF大鼠+載體(n=10)
第4組：ZDF大鼠+AB14 60mg/kg/週(n=10)
第5組：ZDF大鼠+甲福明200mg/kg/天(n=10)
第8組：ZDF大鼠+AB14 60mg/kg/週+甲福明200mg/kg/天(n=10)
在最多為24-48小時的期間內，將各個胰臟樣本於4%福馬林溶液內固定；福馬林的體積比樣本體積的5-10倍更高以確保恰當的固定作用。48h之後，將樣本放置於70%乙醇內。然後將樣本包含於石蠟裡面供用於下列組別之組織加工：第1組：瘦大鼠+載體(n=10)
第2組：ZDF大鼠+載體(n=10)
第4組：ZDF大鼠+AB14 60mg/kg/週(n=10)
第5組：ZDF大鼠+甲福明200mg/kg/天(n=10)
第8組：ZDF大鼠+AB14 60mg/kg/週+甲福明 200mg/kg/天(n=10)
在描繪出胰島(islets of Langerhans)之後，藉由影像分析經標示的(棕色)和未經標示的(藍色)區域，來定量胰島素標示的表面和強度。
當費雪檢定(Fisher test)沒有顯示出變異數之顯著差異時，使用司徒頓檢定(student test)來比較載體ZDF大鼠和瘦大鼠之平均值。如果沒有，則使用非參數曼-懷特尼檢定(non-parametric Mann Whitney test)。
治療的ZDF大鼠之平均值係使用單因子ANOVA+鄧奈特事後檢定來與載體ZDF大鼠比較。如果巴勒檢定(Bartlett’s test)顯示變異數之出顯著差異，則使用非參數克拉斯卡-瓦立斯檢定+鄧恩事後檢定(Kruskall Wallis +Dunn’s post-test)。
AB14 20mg/kg單獨之平均值係使用單因子ANOVA+紐柯事後檢定，來與甲福明單獨或是甲福明200mg/kg與AB14 20mg/kg之組合相比。
AB14 60mg/kg單獨之平均值係使用單因子ANOVA+紐柯事後檢定，來與甲福明200mg/kg單獨或是甲福明200mg/kg與AB14 60mg/kg之組合相比。
使用二因子ANOVA+龐費洛尼事後檢定來分析曲線。
設若大鼠於所有或幾乎所有的參數均是離群值，則其等會被排除在分析之外。此造成四隻大鼠被排除，各者來自不同的組別。
結果
如同預期的，當與瘦大鼠相比時，8週大的ZDF大鼠之HOMA-IR強大地增加(~111 vs 3.5，圖18A)。ZDF大鼠為緩和性高血糖性的(~180 vs 113mg/dL，圖18B)且高胰島素血性(~250 vs 12.6μU/mL，圖18C)。ZDF大鼠之體重稍微增加(圖18D)。
與瘦大鼠相比，在整個治療期間ZDF大鼠之體重仍是較高的(圖19A)，而瘦大鼠與ZDF大鼠之間的體重增重是相似的(圖19B)。
與ZDF載體大鼠相比，吡格列酮從治療8天使體重顯著地增加，以及在治療期間結束時，體重增重為更高3倍(圖19A及B)。與載體ZDF大鼠相比之下，所有其他的藥物治療對於體重沒有顯著的效應。AB14 60mg/kg+甲福明200mg/kg之組合從治療22天使體重增重顯著地增加(圖19B)。
與瘦大鼠相比，載體ZDF大鼠之食物攝取為增加2倍的(於第13天為顯著的)。當與ZDF載體大鼠相比時，用吡格列酮治療的大鼠顯示出傾向較高的食物攝取(於第15、20及22天為顯著的，圖20A)。當與瘦組(lean group)相比時，載體ZDF組之累積的食物攝取增加達94%(p<0.01)，以及當與載體ZDF組相比時，吡格列酮組增加14%(NS，圖20B)。當與載體治療的ZDF大鼠比較，其他的治療對於食物攝取沒有效應。
在26天的治療期間中，不論是禁食6小時或是一夜之後，瘦大鼠之空腹血糖仍是在正常範圍內(圖21A)。此 情況與正常的胰島素位準有關聯(圖21B)。於載體ZDF大鼠方面，隔夜空腹血糖於第12天達到362±32mg/dL(於大約10週大)，以及直到治療期間結束，仍是顯著地比瘦大鼠更高(圖21A)。此情況與第12天、第19天及第26天所測得的減少的血漿胰島素位準有關聯(49.2±6.7，41.2±4.8，及36.6±2.7μU/mL-p<0.001 vs.瘦大鼠，圖21B)，以及與減少的血漿C胜肽位準有關聯(2813±249，2472±195，2156±165pM-<p<0.001 vs瘦大鼠(圖21D)。瘦大鼠和載體ZDF大鼠之HOMA-IR發展反映出血糖以及血漿胰島素位準的變化(圖21C)。
吡格列酮從治療12天使隔夜血糖的位準顯著地減少至正常的位準(p<0.001，圖21A)。AB14的二種劑量於治療12、19或26天之後，均使血糖減少大約15%(n.s，圖21A)。與AB14相比，甲福明200mg/kg於第12天有相似的效應，但是於第19天及第26天沒有觀察到此效應。與載體治療的ZDF大鼠比較之下，AB14 20mg/kg+甲福明之組合於第12天使血糖稍微降低(12%,ns)，以及於第19及26天顯示為沒有效應(圖21A)。相比之下，AB14 60mg/kg組合以甲福明於第12天顯著地使血糖的位準降低(38%，p<0.01 vs載體治療的ZDF大鼠)。雖然統計上不顯著，但是仍然於第19及26天觀察到血降低(blood reduction)(分別為22%及27%，圖21A)。
吡格列酮似乎對於胰島素分泌沒有保護效應，因與載體ZDF大鼠相比時，吡格列酮於第12天、第19天及第 26天對於血漿胰島素及C胜肽位準沒有顯示效應(圖21B及D)。因此，血糖位準的降低與吡格列酮的胰島素敏化效應(sensitizing effect)有關，當與載體ZDF大鼠相比時，此效應於第12天、第19天及第26天使HOMA-IR分別降低67%、62%及54%(圖21C)。
與載體治療的ZDF大鼠比較，AB14 20mg/kg於第12天、第19天及第26天沒有改變血漿胰島素及C胜肽位準，以及HOMA-IR(圖21B-D)。同時，AB14 60mg/kg於第12天、第19天及第26天使血漿胰島素位準分別增加達74%、21%及19%(ns vs.載體ZDF大鼠，圖21B)。
AB14 60mg/kg於第12天使血漿C胜肽位準增加達10%(ns)，以及於第19及26天沒有效應(圖21D)。
與載體治療的ZDF大鼠比較，甲福明於第12天、第19天及第26天使血漿胰島素位準分別增加達79%、55%及48%(ns，圖21B)。甲福明於第12天、第19天及第26天使血漿C胜肽位準分別增加達23%、21%及9%，(NS vs載體治療的ZDF大鼠，圖21D)。
與載體治療的ZDF大鼠比較，AB14 20mg/kg+甲福明之組合於第12天、第19天及第26天使血漿胰島素位準分別增加2倍(NS，圖21B)。AB14 20mg/kg+甲福明之組合於第12天、第19天及第26天使血漿C胜肽位準分別增加達21%、23%及25%(NS，圖21D)。
與載體治療的ZDF大鼠比較，AB14 60mg/kg+甲福明之組合於第12天、第19天及第26天使血漿胰島素位準 分別顯著地增加達2.5、2.3及2.7因子(factor)。AB14 60mg/kg+甲福明之組合從第12天使血漿C胜肽位準顯著地增加達45%(第12天)、48%(第19天)及52%(第26天)(p<0.05 vs載體治療的ZDF大鼠，圖21D)。
於此種胰島素分泌隨時間而降低的模式內，HOMA-IR之增加反映出胰島素分泌的改善。因而，與載體ZDF組比較，甲福明單獨或與AB14治療組之組合觀察到HOMA-IR的增加，以及於第12天、第19天及第26天均保持此增加(圖21C)。
與瘦大鼠比較，8週大的載體治療的ZDF大鼠(208±6 vs 144±2μM，p<0.001)之果胺糖為顯著更高的(66%)。在治療的期間瘦大鼠之果胺糖位準仍在相似的範圍內，但是於治療19天(253±5μM，p<0.001)及28天(234±6μM，p<0.001)之後，載體ZDF大鼠的果胺糖位準增加(圖22)。如同預期的，吡格列酮從第19天使果胺糖位準顯著地降低(於第19天為30%以及於第28天為25%，p<0.001)。AB14 20及60mg/kg對於果胺糖位準沒有效應。與載體治療的大鼠比較，甲福明只有在第19天(6%，ns)顯示出傾向更低的果胺糖位準。與載體治療的ZDF大鼠比較，AB14 20mg/kg+甲福明之組合於第19天及第28天分別顯示出不顯著的傾向較低的果胺糖位準達10%及8%。AB14 60mg/kg+甲福明之組合同樣地於第28天顯示出不顯著的傾向較低的果胺糖位準(9%)(圖22)。
與瘦大鼠比較，8週大的ZDF大鼠之HbA1c為更 較高的(4.3±0.1% vs3.1±0.04%)，雖然此等值還落在正常範圍內。
於12週大的ZDF大鼠方面，HbA1c於第28天達到病理值8.8±0.2%，(p<0.001 ZDF vs瘦大鼠，圖23)。與載體治療的ZDF大鼠比較，AB14 20及60mg/kg於治療28天之後，對於HbA1c位準沒有效應。於治療28天之後，吡格列酮及甲福明使HbA1c分別顯著地減少達44及15%(圖23)。甲福明與AB14 20之組合以及甲福明與AB14 60mg/kg之組合使HbA1c分別顯著地減少達11及19%(圖23)。
與瘦大鼠相比，8週大的ZDF大鼠之血漿三酸甘油酯位準強大地增加(~8mM vs~0.7mM，圖24A)。
與載體相比，吡格列酮從治療的第12天使血漿三酸甘油酯位準強大地減少。AB14 20mg/kg於第12天及第19天使血漿三酸甘油酯位準稍微減少(分別達15%及7%，ns)，以及於第26天沒有效應。AB14 60mg/kg於第12天、第19天及第26天使血漿三酸甘油酯位準分別稍微減少達14%、9%及12%(ns)。甲福明於第12天、第19天及第26天使血漿三酸甘油酯位準分別增加達26%、40%以及49%(從第19天為顯著的)。當與載體ZDF組比較時，甲福明+AB14 20mg/kg之組合於第19天及第26天顯示出傾向朝更高的血漿三酸甘油酯(分別為13%及23%，ns)。甲福明+AB14 60mg/kg之組合於第12天、第19天及第26天顯示出傾向朝為較高的血漿三酸甘油酯(分別為9%、48%以及43%，從第19天為顯著的，圖24A)。
在禁食6小時之後，8週大的ZDF大鼠之血漿游離脂肪酸位準比瘦大鼠更高(~0.85mM vs.~0.59mM)。在隔夜禁食之後(最大的解脂狀態)，10和11週之游離脂肪酸位準是與相似的(~1.3mM)。12週治療之後，當與瘦大鼠比較，如同較低的游離脂肪酸位準所表明，ZDF大鼠之解脂能力減小(1.05±0.06 vs 1.38±0.03mM，圖24B)。與載體ZDF大鼠比較，用吡格列酮之治療大鼠顯示出較低的血漿游離脂肪酸位準，於第12天達35%(p<0.001)、於第19天達17%(ns)，以及於第26天達30%(p<0.05)。AB14 20及60mg/kg沒有效應。當與載體ZDF大鼠相比時，甲福明於第12天、第19天及第26天使游離脂肪酸位準增加達14%、25%以及8%，但是不顯著。甲福明單獨或與AB14 20mg/kg之組合有相似的效應。另一方面，當與載體ZDF組比較，甲福明與AB14 60mg/kg組合僅於第19天顯示出增加的效應(達20%，NS，圖24B)。
與瘦大鼠比較，8週大的ZDF大鼠之血漿總膽固醇和HDL-膽固醇位準為更較高的，以及於之後的4週逐漸地增加(圖25A-B，圖26A-B)。8週大時瘦大鼠和ZDF大鼠的血漿非HDL-膽固醇位準是相似的，但是從10週ZDF大鼠和瘦大鼠在時間期間之血漿非HDL-膽固醇位準增加(圖25C和圖26C)。因為ZDF組之間第0天之總膽固醇和HDL-膽固醇有顯著差異(圖25)，所以以離第0天之相對值來表示結果(圖26)。如圖26A中所示，吡格列酮在時間期間(overtime)傾向預防血漿總膽固醇位準之增加。AB14 20mg/kg與甲福明沒有效應。與載體ZDF組比較，AB14 60mg/kg於第12天、第 19天及第26天使總膽固醇分別增加達8%、14%及15%。與載體ZDF組比較，當與甲福明組合，AB14 20mg/kg於第12及26天分別使總膽固醇增加達15%及10%，而AB14 60mg/kg於第12天、第19天及第26天分別使總膽固醇增加達24%、21%及13%。與載體比較，吡格列酮於第12天、第19天及第26天分別地為血漿HDL-膽固醇增加達38%、17%及19%。甲福明單獨沒有效應。單獨或與甲福明組合之AB14 20mg/kg及60mg/kg治療12天、19天及26天之後，會使血漿HDL-膽固醇位準增加達11至22%。於治療12天之後，所有的ZDF組之血漿非HDL-膽固醇位準(圖26C)是相似的。與載體比較，AB14 20mg/kg、AB14 60mg/kg、甲福明單獨，或甲福明與AB14組合對於非HDL-膽固醇位準沒有效應。只有吡格列酮於第19天及第26天分別使血漿非HDL-膽固醇位準顯著地減少達49%及47%。
於治療26天之後執行口服耐糖試驗。當與載體治療的ZDF瘦大鼠比較，預期葡萄糖負荷之前和葡萄糖負荷之後的載體治療ZDF大鼠之血糖位準為更高的(圖27A)。與載體治療的ZDF大鼠比較，只有吡格列酮治療的ZDF大鼠在所有時間點顯示出顯著降低的血糖位準。與載體比較，AB14 60mg/kg和甲福明之組合於t-60分鐘時，傾向使血糖的位準降低(圖27A)，而其他的藥物治療沒有顯示出顯著的效應。與瘦大鼠比較，載體治療的ZDF大鼠血糖之曲線下的面積(AUC)顯著地增加3.7倍。與載體治療的ZDF大鼠比較，用吡格列酮治療的大鼠於血糖AUC顯示出顯著的54% 降低。AB14 20mg/kg、AB14 60mg/kg以及甲福明單獨或是甲福明與AB14 20mg/kg或60mg/kg之組合，顯示出AUC不顯著的降低(分別為7%、11%、6%、7%和17%)。當與AB14或甲福明單獨作比較，AB14 60mg/kg+甲福明之組合於降低AUC是稍微有效的(圖27B)。
於葡萄糖負荷之後15及30分鐘時測量血漿胰島素及C胜肽位準。胰島素及C胜肽二者之濃度相對於時間廓型是相似的。載體、AB14 20mg/kg及AB14 60mg/kg治療組之胰島素及C胜肽位準是與相似的，甲福明及吡格列酮治療組使胰島素及C胜肽位準稍微增加，以及與甲福明組合之AB14 20mg/kg及AB14 60mg/kg所治療的組別係以劑量依賴性的方式使胰島素及C胜肽位準增加更多(圖28A-B)。評估胰島素或C胜肽對葡萄糖攻擊(glucose charge)反應而分泌的能力，此係藉由離T-60分鐘時計算之相對值來表示結果。如同預期的，當與瘦大鼠相比時，載體ZDF大鼠明顯地失去其等對葡萄糖攻擊反應而分泌胰島素及C胜肽的能力(圖29A-B)。當與載體治療的ZDF大鼠比較，用吡格列酮治療的大鼠於時間T15及T30使胰島素分泌分別增加達20%(p<0.05)及5%。所有其他的治療於時間T15對於胰島素分泌沒有效應。甲福明於時間T30使胰島素分泌減少達26%(p<0.01)。AB14 20mg/kg單獨於時間T30沒有效應，以及與甲福明組合顯示傾向使胰島素分泌減少(達14%，ns)。AB14 60mg/kg單獨或與甲福明組合顯示出傾向使胰島素分泌分別減少達19%及18%(圖29A)。當與瘦大鼠相比時，載體治 療的ZDF大鼠於時間T15及T30，對葡萄糖負荷反應之C胜肽分泌(圖29B)顯著地降低達~40%。當與載體治療的ZDF大鼠比較，只有吡格列酮於時間T15及T30分別顯著地增加C胜肽分泌達21%及22%。
如同預期的，當與瘦大鼠相比時，12週大的ZDF大鼠之胰臟前胰島素(圖30A)及胰島素(圖30B)位準顯著地減少。AB14 60mg/kg及甲福明完全地預防前胰島素之降低，以及AB14 60mg/kg組合甲福明顯著地增加前胰島素位準(p<0.05 vs.載體)(圖30A)。AB14 60mg/kg使胰臟胰島素位準稍微增加，以及甲福明或AB14 60mg/kg組合甲福明顯著地增加胰島素位準(p<0.05 vs.載體)(圖30B)。與瘦大鼠相比，ZDF大鼠之前胰島素/胰島素比率顯著地增加，然而藥物治療沒有觀察到變化(圖30C)。
此研究中報告沒有毒性的跡象，聚焦在載體、AB14、甲福明或AB14/甲福明之組合治療的瘦大鼠或ZDF大鼠胰臟之顯微鏡變化。
提供載體對照之ZDF大鼠內注意到有更高的局灶性(focal)至多局灶性大的/巨大的胰島(focal to multifocal large/giant islet)發生率和嚴重性-對應於胰島增生-及胰島纖維化(表1及表2)。
與瘦大鼠相比，載體治療的ZDF大鼠有輕微的胰島細胞空泡形成及增高的胰島纖維化發生率和嚴重性。全部的藥物治療，AB14 60mg/kg，甲福明，或甲福明及AB14之組合一致傾向使空泡形成和胰島纖維化嚴重性減少。此等效應在AB14與甲福明組合時是更加明顯的。
如同預期的，免疫組織化學分析所測得的胰臟胰島素顯示出ZDF大鼠之胰島素標示的減少。如同從胰島素含量(圖30B)測量觀察到的，藥物治療會稍微預防此胰島素標示的減少，且當AB14與甲福明組合的效應較佳(圖31)。
討論
8週大的ZDF大鼠有明顯的胰島素抗性及嚴重的高胰島素血性但只有緩和性高血糖性，通過靜脈給予劑量為0mg/kg(載體)、20mg/kg，或60mg/kg之Ab14每週一次歷時4週。在此時間期間，載體治療的對照進展至明顯糖尿病，以及在研究的第12天之前成為嚴重的低胰島素血性和明確的高血糖性，此與年齡10週之前完全胰臟刍細胞衰竭為一致的。此情況在研究結束時透過直接測量胰臟的胰島素及前胰島素位準來確認，胰島素及前胰島素二者都實質地降低，並且通過免疫組織化學評估胰臟的胰島素標示，其亦引人注目地減低。此外，在研究結束時進行的組織學分析亦證實使此等動物之胰島細胞空泡形成、胰島增生(大的/巨大的胰島)，以及胰島纖維化的發生率和嚴重性增加，與糖尿病胰島病變為一致的。
相比之下，二種劑量的AB14會部分預防研究的第12天載體治療的對照組之空腹血糖上升，以及於研究的第19天及第26天也觀察到此種部分預防作用。此外，高劑量的Ab14也會部分預防研究的第12天載體治療的對照組，觀察到的血漿胰島素及C胜肽位準的下降。於研究的第19天及第26天也觀察到此種部分預防作用，但是程度較小，此表示適度的延遲疾病進展(胰臟刍細胞衰竭)，以及暗示此化合物之胰臟刍細胞部分保護作用。更確切地，當在研究結束(第28天)得到胰臟組織時，於載體治療的對照組內觀察到，高劑量的Ab14也會完全預防胰臟前胰島素位準的下降，以及當直接測量或透過免疫組織化學分析測量，也會觀察 到胰臟胰島素位準的下降之部分預防作用。再者，在研究結束組織學評估時，於載體治療的動物注意到Ab14一貫地降低胰島空泡形成、胰島纖維化，及胰島增生，此進一步指出對於糖尿病胰島病變有利的影響。
如實施例2中展示的，當與載體治療的對照組相比時，Ab14對於食物攝取或體重沒有效應，表示Ab14對於以上所評估的參數的效應不是由於卡路里的限制或者使重量減輕所致。
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成的多肽
<400> 174
<210> 175
<211> 39
<212> DNA
<213> 穴兔屬穴兔
<400> 175
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<211> 21
<212> DNA
<213> 穴兔屬穴兔
<400> 176
<210> 177
<211> 39
<212> DNA
<213> 穴兔屬穴兔
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<213> 穴兔屬穴兔
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<213> 穴兔屬穴兔
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<213> 穴兔屬穴兔
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成的多肽
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列的說明：合成的多肽
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成的多肽
<400> 183
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列的說明：合成的多肽
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<213> 穴兔屬穴兔
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<223> 人工序列的說明：合成的多肽
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成的多肽
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<212> DNA
<213> 穴兔屬穴兔
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<212> DNA
<213> 穴兔屬穴兔
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<223> 人工序列的說明：合成的多肽
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<223> 人工序列的說明：合成的多肽
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<220>
<223> 人工序列的說明：合成的多肽
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<223> 人工序列的說明：合成的多肽
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<223> 人工序列的說明：合成的多肽
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<220>
<223> 人工序列的說明：合成的多肽
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列的說明：合成的多肽
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<223> 人工序列的說明：合成的多肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成的多肽
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列的說明：合成的多肽
<400> 222
<210> 223
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列的說明：合成的多肽
<400> 223
<210> 224
<211> 1320
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成的多肽
<400> 224
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<211> 39
<212> DNA
<213> 穴兔屬穴兔
<400> 225
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<211> 21
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<213> 穴兔屬穴兔
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成的多肽
<400> 231
<210> 232
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成的多肽
<400> 232
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成的多肽
<400> 233
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<211> 1326
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成的多肽
<400> 234
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<212> DNA
<213> 穴兔屬穴兔
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列的說明：合成的多肽
<400> 241
<210> 242
<211> 660
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成的多肽
<400> 242
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成的多肽
<400> 243
<210> 244
<211> 1320
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成的多肽
<400> 244
<210> 245
<211> 39
<212> DNA
<213> 穴兔屬穴兔
<400> 245
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<400> 246
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成的多肽
<400> 251
<210> 252
<211> 660
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成的多肽
<400> 252
<210> 253
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成的多肽
<400> 253
<210> 254
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成的多肽
<400> 254
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<211> 39
<212> DNA
<213> 穴兔屬穴兔
<400> 255
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<211> 21
<212> DNA
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<400> 256
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 穴兔屬穴兔
<400> 258
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<212> DNA
<213> 穴兔屬穴兔
<400> 259
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<212> DNA
<213> 穴兔屬穴兔
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<210> 261
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成的多肽
<400> 261
<210> 262
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成的多肽
<400> 262
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成的多肽
<400> 263
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成的多肽
<400> 264
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<211> 39
<212> DNA
<213> 穴兔屬穴兔
<400> 265
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<213> 穴兔屬穴兔
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<211> 36
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<212> DNA
<213> 穴兔屬穴兔
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<212> DNA
<213> 穴兔屬穴兔
<400> 269
<210> 270
<211> 12
<212> DNA
<213> 穴兔屬穴兔
<400> 270
<210> 271
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成的多肽
<400> 271
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成的多肽
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成的多肽
<400> 273
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<211> 1326
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的說明：合成的多肽
<400> 274
<210> 275
<211> 39
<212> DNA
<213> 穴兔屬穴兔
<400> 275
<210> 276
<211> 21
<212> DNA
<213> 穴兔屬穴兔
<400> 276
<210> 277
<211> 39
<212> DNA
<213> 穴兔屬穴兔
<400> 277
<210> 278
<211> 15
<212> DNA
<213> 穴兔屬穴兔
<400> 278
<210> 279
<211> 48
<212> DNA
<213> 穴兔屬穴兔
<400> 279
<210> 280
<211> 9
<212> DNA
<213> 穴兔屬穴兔
<400> 280
<210> 281
<211> 37
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> C端醯胺化(C-term amidated)
<400> 281
<210> 282
<211> 37
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> C端醯胺化
<400> 282
<210> 283
<211> 105
<212> PRT
<213> 智人
<400> 283
<210> 284
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 284

Claims (47)

  1. 一種於需要其之主體體內增加周邊及/或肝臟的葡萄糖利用之方法，其包含投藥有效量的組成物至該主體，該組成物包含抗人類CGRP抗體或抗體片段。
  2. 一種於需要其之主體體內減少胰島素抗性之方法，其包含投藥有效量的組成物至該主體，該組成物包含抗人類CGRP抗體或抗體片段。
  3. 一種於需要其之主體體內治療、預防或控制肥胖症之方法，其包含投藥有效量的組成物至該主體，該組成物包含抗人類CGRP抗體或抗體片段。
  4. 一種於需要其之主體體內達成持續的血糖濃度正常(normoglycemia)之方法，其包含投藥有效量的組成物至該主體，該組成物包含抗人類CGRP抗體或抗體片段。
  5. 一種於需要其之主體體內增高瘦肉組織(lean tissue)對體脂肪比率之方法，其包含投藥有效量的組成物至該主體，該組成物包含抗人類CGRP抗體或抗體片段。
  6. 如請求項1至5中任一項之方法，其有效用於治療或延遲第II型糖尿病及/或肥胖症的發病，及/或預防功能性胰臟β細胞的喪失。
  7. 如請求項6之方法，其中投藥外源性胰島素的需求被延遲。
  8. 如請求項1至7中任一項之方法，其中該主體已經診斷為具有糖尿病前期(pre-diabetes)或是展現出一個或多個發 展第II型糖尿病的危險因子。
  9. 如請求項1至7中任一項之方法，其中該主體為停經期前期(pre-menopausal)、近停經期(perimenopausal)、停經期或停經期後期。
  10. 如請求項1至7中任一項之方法，其中該主體展現出一個或多個糖尿病前期的症狀，其包含：空腹血糖位準介於100mg/dL(毫克/分升)和125mg/dl之間；攝食75克葡萄糖溶液或是攝食每公斤體重1.75克葡萄糖的葡萄糖溶液至75克之最大劑量，二小時之後血糖位準介於140mg/dL和199mg/dl之間；及/或糖化血紅素介於5.7百分比和6.4百分比之間。
  11. 如請求項1至7中任一項之方法，其中該主體展現出一個或多個糖尿病的症狀，其包含：空腹血糖位準大於125mg/dl；攝食75克葡萄糖溶液或是攝食每公斤體重1.75克葡萄糖的葡萄糖溶液至75克之最大劑量，二小時之後血糖位準為至少200mg/dL；及/或糖化血紅素為至少6.5百分比。
  12. 如請求項8之方法，其中該主體展現出一個或多個發展第II型糖尿病的危險因子，其包含：第II型糖尿病的家族史；先前診斷為具有第II型糖尿病的一個或多個雙親或兄弟姊妹；血脂異常；總血液三酸甘油酯位準為至少200mg/dL；血液高密度脂蛋白位準小於35mg/dL；肥胖症；身體質量指數大於25kg/m2(公斤/平方公尺)；妊娠糖尿病之病史；先前生產的嬰兒出生重量大於9lbs (磅)；高血壓；收縮壓為至少140mmHg(毫米汞柱)；舒張壓為至少90mmHg；先前測量空腹血糖位準為至少99mg/dl；血管疾病；多囊性卵巢症候群(Polycystic Ovarian Syndrome)；或是黑色棘皮症(acanthosis nigricans)。
  13. 如請求項1至7中任一項之方法，其中該主體已經診斷為具有第II型糖尿病。
  14. 如請求項13之方法，其中該主體對以下之治療無反應：類升糖素胜肽1(GLP-1)、艾塞那肽(exenatide-1)、促胰島素分泌素(exendin)、促胰島素分泌素類似物、促胰島素分泌素促效劑、利拉魯肽(liraglutide)、艾塞那肽LAR(exenatide LAR)、DPP-4拮抗劑、GLP-1受體促效劑，或另一個GLP-1促效劑。
  15. 如請求項1至14中任一項之方法，其進一步包含投藥抗人類CGRP抗體或抗體片段之外的抗糖尿病劑或抗肥胖劑至該主體。
  16. 如請求項15之方法，其中該抗糖尿病劑或抗肥胖劑包含下列之一者或多者：澱粉素、澱粉素促效劑、磺醯基脲類、抑鈣素(calcitonin)、升糖素、PPAR-γ促效劑類、GPL-1受體促效劑類、二肽基肽酶IV(Dipeptidyl peptidase IV)抑制劑、澱粉素類似物、雙胍類、多巴胺D2受體促效劑類、美格列奈類(meglitinides)、α葡萄糖苷酶抑制劑、抗異常血脂症膽酸螯隔劑(antidyslipidemic bile acid sequestrant)、促胰島素分泌素(exendin)、促胰島素分泌素類似物、促胰島素分泌素促效劑、胃抑肽(GIP)、腸 促胰液素胜肽(incretin peptide)、胰島素、SGLT2抑制劑、葡萄糖再吸收抑制劑、非諾貝特(fenofibrate)、貝特類(fibrate)、抗飢餓肽(ghrelin)抗體或抗體片段、纖維母細胞生長因子受體(FGFR)-1(IIIb)、FGFR-1(IIIc)、抗體或抗體片段，及/或FGFR-4(IIIc)、抗CD38抗體或抗體片段，抗MIC-1抗體，或MIC-1結合片段，甲福明(metformin)，或是前述任一者之組合。
  17. 如請求項15之方法，其中該抗糖尿病劑為甲福明。
  18. 如請求項1至17中任一項之方法，其有效使重量減輕。
  19. 如請求項1至18中任一項之方法，其中該經投藥的抗人類CGRP抗體或抗體片段不會使活體內胰島素分泌顯著地增加。
  20. 如請求項1至19中任一項之方法，其中該經投藥的抗人類CGRP抗體或抗體片段不會導致胰臟炎發生率增高，或是與胰臟發炎有關的標記或細胞介素之表現增高。
  21. 如請求項1至20中任一項之方法，其中該組成物進一步包含一藥學上可接受的載劑。
  22. 如請求項1至21中任一項之方法，其中該抗人類CGRP抗體或抗體片段係以介於大約0.1和100.0mg/kg(毫克/公斤)接受者主體的體重之間的劑量，投藥至該主體。
  23. 如請求項1至22中任一項之方法，其中該抗人類CGRP抗體或抗體片段為人類抗體。
  24. 如請求項1至22中任一項之方法，其中該抗人類CGRP抗體或抗體片段為非天然存在的。
  25. 如請求項1至22中任一項之方法，其中該抗人類CGRP抗體或抗體片段為為非天然存在的抗體片段。
  26. 如請求項1至22中任一項之方法，其中該抗人類CGRP抗體或抗體片段為人類化抗體。
  27. 如請求項1至22中任一項之方法，其中該抗人類CGRP抗體或抗體片段為嵌合抗體。
  28. 如請求項1至22中任一項之方法，其中該抗人類CGRP抗體或其抗體片段專一地結合至一完整的CGRP多肽或其之片段上之相同的線形或構形抗原決定位，及/或競爭結合至一完整的CGRP多肽或其之片段上之相同或重疊的線形或構形抗原決定位，如同選自於以下所構成的群組之抗人類CGRP抗體：a. Ab1，其包含序列辨識編號：2的VL與序列辨識編號：4的VH；b. Ab2，其包含序列辨識編號：12的VL與序列辨識編號：14的VH；c. Ab3，其包含序列辨識編號：22的VL與序列辨識編號：24的VH；d. Ab4，其包含序列辨識編號：32的VL與序列辨識編號：34的VH；e. Ab5，其包含序列辨識編號：42的VL與序列辨識編號：44的VH；f. Ab6，其包含序列辨識編號：52的VL與序列辨識編號：54的VH； g. Ab7，其包含序列辨識編號：62的VL與序列辨識編號：64的VH；h. Ab8，其包含序列辨識編號：52的VL與序列辨識編號：54的VH；i. Ab9，其包含序列辨識編號：62的VL與序列辨識編號：64的VH；j. Ab10，其包含序列辨識編號：72的VL與序列辨識編號：74的VH；k. Ab11，其包含序列辨識編號：82的VL與序列辨識編號：84的VH；l. Ab12，其包含序列辨識編號：92的VL與序列辨識編號：94的VH；m. Ab13，其包含序列辨識編號：102的VL與序列辨識編號：104的VH；以及n. Ab14，其包含序列辨識編號：112的VL與序列辨識編號：114的VH。
  29. 如請求項28之方法，其中該抗人類CGRP抗體或抗體片段包含選自於以下所構成的群組之抗體中，所包含的至少一個、至少二個、至少三個、至少四個、至少五個，或全部六個CDRs：a. Ab1，其包含序列辨識編號：2的VL與序列辨識編號：4的VH；b. Ab2，其包含序列辨識編號：12的VL與序列辨識編號：14的VH； c. Ab3，其包含序列辨識編號：22的VL與序列辨識編號：24的VH；d. Ab4，其包含序列辨識編號：32的VL與序列辨識編號：34的VH；e. Ab5，其包含序列辨識編號：42的VL與序列辨識編號：44的VH；f. Ab6，其包含序列辨識編號：52的VL與序列辨識編號：54的VH；g. Ab7，其包含序列辨識編號：62的VL與序列辨識編號：64的VH；h. Ab8，其包含序列辨識編號：52的VL與序列辨識編號：54的VH；i. Ab9，其包含序列辨識編號：62的VL與序列辨識編號：64的VH；j. Ab10，其包含序列辨識編號：72的VL與序列辨識編號：74的VH；k. Ab11，其包含序列辨識編號：82的VL與序列辨識編號：84的VH；l. Ab12，其包含序列辨識編號：92的VL與序列辨識編號：94的VH；m. Ab13，其包含序列辨識編號：102的VL與序列辨識編號：104的VH；以及n. Ab14，其包含序列辨識編號：112的VL與序列辨識編號：114的VH。
  30. 如請求項28之方法，其中該抗人類CGRP抗體或抗體片段具有一多肽序列，其與選自於以下所構成的群組之抗體有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或至少99%的同一性：a. Ab1，其包含序列辨識編號：2的VL與序列辨識編號：4的VH；b. Ab2，其包含序列辨識編號：12的VL與序列辨識編號：14的VH；c. Ab3，其包含序列辨識編號：22的VL與序列辨識編號：24的VH；d. Ab4，其包含序列辨識編號：32的VL與序列辨識編號：34的VH；e. Ab5，其包含序列辨識編號：42的VL與序列辨識編號：44的VH；f. Ab6，其包含序列辨識編號：52的VL與序列辨識編號：54的VH；g. Ab7，其包含序列辨識編號：62的VL與序列辨識編號：64的VH；h. Ab8，其包含序列辨識編號：52的VL與序列辨識編號：54的VH；i. Ab9，其包含序列辨識編號：62的VL與序列辨識編號：64的VH；j. Ab10，其包含序列辨識編號：72的VL與序列辨識編號：74的VH； k. Ab11，其包含序列辨識編號：82的VL與序列辨識編號：84的VH；l. Ab12，其包含序列辨識編號：92的VL與序列辨識編號：94的VH；m. Ab13，其包含序列辨識編號：102的VL與序列辨識編號：104的VH；以及n. Ab14，其包含序列辨識編號：112的VL與序列辨識編號：114的VH。
  31. 如請求項28之方法，其中該抗人類CGRP抗體或抗體片段包含選自於以下所構成的群組之一抗體：a. Ab1，其包含序列辨識編號：2的VL與序列辨識編號：4的VH；b. Ab2，其包含序列辨識編號：12的VL與序列辨識編號：14的VH；c. Ab3，其包含序列辨識編號：22的VL與序列辨識編號：24的VH；d. Ab4，其包含序列辨識編號：32的VL與序列辨識編號：34的VH；e. Ab5，其包含序列辨識編號：42的VL與序列辨識編號：44的VH；f. Ab6，其包含序列辨識編號：52的VL與序列辨識編號：54的VH；g. Ab7，其包含序列辨識編號：62的VL與序列辨識編號：64的VH； h. Ab8，其包含序列辨識編號：52的VL與序列辨識編號：54的VH；i. Ab9，其包含序列辨識編號：62的VL與序列辨識編號：64的VH；j. Ab10，其包含序列辨識編號：72的VL與序列辨識編號：74的VH；k. Ab11，其包含序列辨識編號：82的VL與序列辨識編號：84的VH；l. Ab12，其包含序列辨識編號：92的VL與序列辨識編號：94的VH；m. Ab13，其包含序列辨識編號：102的VL與序列辨識編號：104的VH；以及n. Ab14，其包含序列辨識編號：112的VL與序列辨識編號：114的VH。
  32. 如請求項1至22中任一項之方法，其中該抗人類CGRP抗體或其抗體片段如同該抗人類CGRP抗體Ab6一般，專一地結合至一完整的CGRP多肽或其之片段上之相同的線形或構形抗原決定位，及/或競爭結合至一完整的CGRP多肽或其之片段上之相同或重疊的線形或構形抗原決定位，該抗人類CGRP抗體Ab6包含序列辨識編號：52的VL與序列辨識編號：54的VH之抗人類CGRP抗體。
  33. 如請求項1至22中任一項之方法，其中該抗人類CGRP抗體或抗體片段包含該抗人類CGRP抗體Ab6中，包含的至少一個、至少二個、至少三個、至少四個、至少五個， 或較佳全部六個CDRs，該抗人類CGRP抗體Ab6包含序列辨識編號：52的VL與序列辨識編號：54的VH。
  34. 如請求項1至22中任一項之方法，其中該抗人類CGRP抗體或抗體片段具有一多肽序列，其與該抗人類CGRP抗體Ab6有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或至少99%的同一性，該抗人類CGRP抗體Ab6包含序列辨識編號：52的VL與序列辨識編號：54的VH，其中該抗體選擇性地包含，該抗人類CGRP抗體Ab6內所包含的全部六個CDRs，該抗人類CGRP抗體Ab6包含序列辨識編號：52的VL與序列辨識編號：54的VH。
  35. 如請求項1至22中任一項之方法，其中該抗人類CGRP抗體或抗體片段包含Ab6，其包含序列辨識編號：52的VL與序列辨識編號：54的VH。
  36. 如請求項1至35中任一項之方法，其中該抗人類CGRP抗體或抗體片段包含人類、嵌合或是人類化(humanized)抗體。
  37. 如請求項1至36中任一項之方法，其中該抗人類CGRP抗體或抗體片段包含Fab、F(ab’)2、scFv，或IgNar或是另一個單價抗體片段。
  38. 一種適合用於請求項1-37中任一項之方法的組成物，其包含有效量的組成物，該組成物包含抗人類CGRP抗體或抗體片段，以及抗人類CGRP抗體或抗體片段之外的抗糖尿病劑或抗肥胖劑。
  39. 如請求項38之組成物，其中該抗人類CGRP抗體或抗體片段為如請求項28-31或36-37中任一項之一者，或較佳為請求項32-36中任一項之之一者。
  40. 如請求項39之組成物，其中該抗糖尿病劑或抗肥胖劑包含下列之一者或多者：澱粉素、澱粉素促效劑、磺醯基脲類、抑鈣素、升糖素、PPAR-γ促效劑類、GPL-1受體促效劑類、二肽基肽酶IV(Dipeptidyl peptidase IV)抑制劑、澱粉素類似物、雙胍類、多巴胺D2受體促效劑類、美格列奈類(meglitinides)、α葡萄糖苷酶抑制劑、抗異常血脂症膽酸螯隔劑(antidyslipidemic bile acid sequestrant)、促胰島素分泌素(exendin)、促胰島素分泌素類似物、促胰島素分泌素促效劑、胃抑肽(GIP)、腸促胰液素胜肽(incretin peptide)、胰島素、SGLT2抑制劑、葡萄糖再吸收抑制劑、非諾貝特(fenofibrate)、貝特類(fibrate)、甲福明(metformin)、抗飢餓肽(ghrelin)抗體或抗體片段、纖維母細胞生長因子受體(FGFR)-1(IIIb)、FGFR-1(IIIc)、抗體或抗體片段，及/或FGFR-4(IIIc)、抗CD38抗體或抗體片段，抗MIC-1抗體或MIC-1結合片段，或是前述任一者之組合。
  41. 如請求項39之組成物，其中其他的(the other)抗糖尿病劑或抗肥胖劑包含甲福明。
  42. 一種辨識使周邊的葡萄糖的利用增加之抗人類CGRP抗體或抗體片段之方法，其包含：投藥抗人類CGRP抗體或抗體片段至一主體，測量該主體之周邊的葡萄糖的利 用，以及比較該主體之周邊的葡萄糖利用位準和至少一對照主體之周邊的葡萄糖利用位準。
  43. 一種辨識使肝臟的葡萄糖利用增加之抗人類CGRP抗體或抗體片段之方法，其包含：投藥抗人類CGRP抗體或抗體片段至一主體，測量該主體之肝臟的葡萄糖的利用，以及比較該主體之肝臟的葡萄糖利用位準和至少一對照主體之肝臟的葡萄糖利用位準。
  44. 如請求項42或請求項43之方法，其中該主體為人類、小鼠、大鼠、非人類靈長類動物、非人類動物之糖尿病模式。
  45. 如請求項44之方法，其中該非人類動物之糖尿病模式係選自於餵食高脂肪飲食的大鼠及祖克(Zucker)糖尿病肥胖(ZDF)大鼠。
  46. 如請求項42至45中任一項之方法，其中相對於該對照主體，該抗人類CGRP抗體或抗體片段使周邊的葡萄糖的利用增加達至少10%、達至少20%，或達至少50%。
  47. 如請求項42至46中任一項之方法，其中該至少一對照主體包含(includes)在投藥該抗人類CGRP抗體或抗體片段至的該主體。
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