TW201527317A - 以拓印螺旋胜肽方式組成白蛋白之人工抗體的方法 - Google Patents

Abstract

分子印刷高分子是藉由模板分子與功能性單體所構成具有專一性辨識的人工抗體。由人類血清白蛋白中挑選出構形為螺旋的胜肽序列做為模板分子，然後在經化學法修飾後的磁性粒子基質上，使用丙烯酸、丙烯醯胺、N-苄基丙烯醯胺及乙基雙丙烯醯胺做為官能性單體與交聯單體，經共聚合反應形成對應之胜肽構形拓印於基質載體上。並經實驗證實所製備印刷出的人工抗體，其對白蛋白之親和力與吸附量優於使用無規則線團胜肽為模板分子者，所製備印刷出的人工抗體，更遠優於傳統利用整個人類血清白蛋白分子為模板所製做出之人工抗體。

Description

以拓印螺旋胜肽方式組成白蛋白之人工抗體的方法

本發明係有關以拓印螺旋胜肽方式組成白蛋白之人工抗體的方法，使用一種分子印刷膜的技術，將人工抗體固定於磁性奈米粒子基質上，應用於捕捉人體血清白蛋白。

由於現今的疾病越來越複雜，如何在檢體中快速發展並準確的偵測出疾病的技術，更顯出其重要性。目前在醫學上迫切的期望能藉由生物標記(biomarker)的方式予以進行疾病早期的準確診斷。

簡單而言，生物標記即係對檢體中的若干特定分子，期待能以生物標記予以偵測出。例如：醣類、蛋白、核酸、酯類等各種分子都能夠成為生物標記之目標，以使此等分子之特性能代表或顯示生物體之生理狀態。

由於任何一種慢性疾病都會使獨特的生物標記產生變化，即便是微小的生理與病理的變化，都會導致在生物標記上有所變化。因此，測量此等 與生物體之生理狀態息息相關的生物標記，再藉由所得的測量數據予以評估身體之狀況，就有機會在早期發現受檢者罹患的疾病。

然而大多數研究血漿蛋白質之文獻中，於針對探索新的生物標記之時，並不會將目標設定於該等高豐度(high-abundant)蛋白之測定上，例如：白蛋白，而是將重心放在能夠提供早期診斷資訊的該等分子上，但因為此種特定分子或蛋白通常並非經由某些器官所正常分泌出來的，而是由某些細胞、組織受到特別作用影響而剝落或分泌出的蛋白。

此種特定蛋白在進入人體血液後，其相對濃度可想而知是相當低的。因為人體血液中的高豐度蛋白(如白蛋白)將會遮蔽(mask)低豐度蛋白之偵測，而使得檢體在分析時無法正確的判斷。如果可以選擇性的將高豐度蛋白予以移除，將可以增加鑑定與偵測低豐度蛋白之靈敏度。

人類血清白蛋白(human serum albumin)係血漿中含量最多的蛋白，占總值量之57%~71%。因而常會造成偵測低豐度蛋白之困難度。為了移除此種高豐度蛋白質，許多種可吸附白蛋白之商品乃經予逐一的被發展出，而化學家也不斷致力於開發更有效吸附白蛋白的工具。

分子印刷術之歷史可以從1940年，Pauling及Campbell以鑰匙與鎖之作用機制，發表理論說明分子間辨識性的抗體(Pauling,L.；Campbell,D.J.Exper Med. 1942,76,211.)開始算起。

1972年Wulff以及Sarhan運用共價鍵聚合的方式，並以與酵素受質有類似 結構的分子為模板進行聚合，聚合物完成後接著破壞共價鍵結以除去模板分子，而得到具有特異性的辨識區並與酵素結構十分類似的聚合物(Wulff,G.；Sarhan,A.Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 1972,11,341.)。

直至1984年，Mosbach參考Pauling的理論概念提出以單體(monomer)與模板分子(template)間利用非共價作用力先形成一錯合物(complex)，再藉由交聯單體(cross-liner)與單體分子產生聚合反應，而得到一具有專一性辨識能力之分子印刷高分子(Norrlöw,O.；Glad,M.；Mosbach,K.J.Chromatography 1984,29,299.)，此即為現在較為廣為使用的非共價性分子印刷高分子之基礎模型。

近來，由於分子印刷技術越趨成熟，已經可以在水溶液中聚合形成分子印刷高分子(C.Y.Lin,D.F.Tai,T.Z.Wu,Chem.Euro.J. 2003 ,9,5107.)，更可以使用胜肽片段為模板，以拓印出能吸附蛋白之人工抗體(D.F.Tai,C.Y.Lin,T.Z.Wu,L.K.Chen,Anal.Chem. 2005 ,77,5140；D.F.Tai,Ming-Hong Jhang,Guan-Yu Chen,Sue-Chen Wang,Kuo-Hao Lu,Yu-Der Lee,and Hsin-Tzu Liu,Anal.Chem. 2010,82,2290.)，使得分子印刷高分子更方便使用於胜肽或蛋白之吸附，也因此增加其應用性以及普及性。

傳統上，已有利用分子印刷方法去除血液中的白蛋白之研究，惟此等印刷高分子均直接使用白蛋白為模板分子。如披覆印刷高分子於矽晶片上再以石英晶體微天平進行檢測(Lin,T.Y.；Hu,C.H.；Chou,T.C.Biosensors and Bioelectronics 2004,20,75.and Zhang,Z.H.；Long,Y.M.；Nie,L.H.；Yao,S. Z.Biosensors and Bioelectronics 2006,21,1244.)、分子印刷高分子薄片(Chou,P.C.；Rick,J.；Chou,T.C.Anal.Chim.Acta. 2005 ,542,20.)、分子印刷高分子膜(Bossi,A.；Andreoli,M.；Bonini,F.；Piletsky,S.Anal.Bioanal.Chem.2007,389,447.)、分子印刷高分子珠(Bonini,F.；Piletsky,S.；Turner,A.P.F.；Speghini,A.；Bossi,A.Biosensors and Bioelectronics 2007,22,2322.)與披覆上分子印刷高分子之磁性奈米粒子(Lee,M.W.；Thomas,J.L.；Ho,M.H.；Yuan,C.；Lin,H.Y.ACS Appl.Mater.Interfaces,2010,2,1729.)等，雖然載體與聚合方法及單體不盡相同，但是均以白蛋白做為模板分子。

在此，發明人等提出以人類血清白蛋白上之二級結構的胜肽為模板分子予以製作白蛋白吸附劑之新方法，與其他用以去除白蛋白之印刷高分子的方法相比，此方法不僅具有高度的穩定性，價格也較為低廉，且具有高度專一性之辨識能力，可以減少血清樣品之用量，藉此開發出成本較為低廉且能大量生產的去除人類血清白蛋白之關鍵技術。

本發明利用分子印刷技術發展出新穎的白蛋白之吸附劑材料。人類血清白蛋白上共有IA,IB,IIA,IIB,IIIA,IIIB六個功能部位(domain)，每個功能部位各含有三個二級結構之螺旋胜肽，總共有十八個螺旋胜肽。此六個功能部位及十八個螺旋胜肽可參閱圖2所示。

因此選擇白蛋白上二級結構之螺旋胜肽，利用合成的螺旋胜肽作為模 板分子，於有機溶劑之存在下使形成分子印刷膜，將模板予以清洗後，進行生物分子辨識的功能。此作用機制如圖3所示，其係以二級結構胜肽為模板，使所產生的人工抗體於基質上與人類血清白蛋白吸附的過程。

本發明已可成功的將印刷高分子應用在移除白蛋白上。藉由下述實施例之數據，本發明已分別顯示建構嫁接在磁性奈米顆粒上的分子印刷膜，能形成所謂的人工抗體，具有吸附與辨識白蛋白之能力。其白蛋白之親和力(參見實施例表1、表2、表3)均不亞於現有市售商品，其再使用之效能亦十分優異。

上述本發明所採的磁性奈米顆粒，係以習用的氧化鐵奈米磁鐵粒子作為基質，以一聯結劑的有機化合物分子在磁鐵粒子的表面上，經一化學修飾方法予以固定之後使形成一自組裝單層，接著加入欲吸附之生物分子、或是欲吸附之生物分子的表面胜肽、或是其具有特定構造之部位分子為模板，與具有雙鍵的數種單體化合物混合，於有機溶劑的存在下，使用聚合的方式來製造出能夠辨識吸附欲吸附之生物分子的人工抗體於此特定基質上，再利用此高分子人工抗體將欲吸附之生物分子分離。

上述本發明所採的氧化鐵奈米磁鐵粒子，其係來源充裕的氧化鐵(Fe₂O₃，當然亦可採用以如：玻璃、晶圓、或其他不同形態之SiO₂所構成的基質，或是以Al₂O₃、TiO₂奈米粒子構成基質。

上述本發明所採的化學修飾方法，係以氯化亞碸與基質上之醇基進行氯化反應，並加入含胺基之化合物來取代氯基為胺基，隨後再以甲基丙烯醯氯、丙烯醯氯進行醯化反應。

上述的含胺基之化合物，係選自由甲基苄胺、乙基苄胺、苄胺、甲基苯胺、乙基苯胺、苯胺、乙二胺、及丙二胺而成的群體中之至少一種。

上述本發明所採的欲吸附生物分子，係選自由人類血清白蛋白、或是其他蛋白質、醣蛋白、脂肪蛋白、多醣体、脂肪酸、去氧核糖核酸、及核糖核酸而成的群體中之至少一種。。

上述的聯結劑的有機化合物分子，可為以下通式表示者，其中X為氫、甲基丙烯醯基、丙烯醯基、乙烯基或是丙烯基等官能基，Y為OCH₃、OCH₂CH₃、F、Cl、Br、I、OH等官能基，n為2或3或4。

上述的聯結劑的有機化合物較宜為γ-氨丙基三甲氧基矽烷[NH₂(CH₂)₃Si(OCH₃)₃]。

上述本發明所採的化學修飾方法係以戊二醛與磁鐵粒子上之胺基進行架橋，並加入氰基硼氫化鈉予以氫化亞胺基為胺基，隨後再以甲基丙烯醯氯、丙烯醯氯進行醯化反應。

使用戊二醛進行修飾，將磁鐵粒子末端之胺基以戊二醛成雙的予以架橋連接在一起以降低磁鐵粒子末端之胺基的擾動性，避免對之後的操作有不利的影響。磁鐵粒子末端之胺基的擾動性可能不利於其後在氧化鐵奈米粒子上所披覆分子印刷薄膜。

上述本發明所採的單體化合物，係選自由甲基丙烯醯酪胺酸、甲基丙烯醯酪胺酸甲酯、甲基丙烯醯酪胺酸乙酯、甲基丙烯醯酪胺醯胺、丙烯醯酪胺酸、丙烯醯酪胺酸甲酯、丙烯醯酪胺酸乙酯、丙烯醯酪胺醯胺、甲基丙烯醯酪胺、丙烯醯胺、甲基丙烯醯胺、丙烯酸、甲基丙烯酸、乙基雙丙烯醯胺、乙基雙甲基丙烯醯胺、N-苄基-丙烯醯胺、及N-苄基-甲基丙烯醯胺而成的群體中之至少一種。

上述本發明所採的欲吸附之生物分子的表面胜肽為人類血漿白蛋白之含有螺旋結構之序列的表面胜肽。其含有螺旋結構之序列如：Lys-Glu-Phe-Asn-Ala-Glu-Thr-Phe-Thr-Phe-His-Ala(SEQ ID NO.1)、Leu-Pro-Arg-Leu-Val-Arg-Pro-Glu-Asp-Val-Asp(SEQ ID NO.2)、Phe-Ala-Glu-Glu-Gly-Lys-Lys-Leu-Val-Ala-Ala-Ser-Gln-Ala-Ala(SEQ ID NO.3)、Leu-Pro-Ser-Leu-Ala-Ala-Asp-Phe-Val-Glu-Ser-Lys(SEQ ID NO.4)；或是含有其醯胺Lys-Glu-Phe-Asn-Ala-Glu-Thr-Phe-Thr-Phe-His-Ala-NH₂、Leu-Pro-Arg-Leu-Val-Arg-Pro-Glu-Asp-Val-Asp-NH₂、Phe-Ala-Glu-Glu-Gly-Lys-Lys-Leu-Val-Ala-Ala-Ser-Gln-Ala-Ala-NH₂、Leu-Pro-Ser-Leu-Ala-Ala-Asp-Phe-Val-Glu-Ser-Lys-NH₂之化合物。

上述本發明所採的聚合方式，為於極性有機溶劑的存在下，使用波長350nm的光化學儀中照光6小時或是加熱到50~100℃間，使單體聚合成高分子。

上述的極性有機溶劑，係選自由甲醇、乙醇、三氟乙醇、二氟乙醇、 一氟乙醇、二乙醇、乙氰、及水而成的群體中之至少一種以不同比例混合。

上述本發明所述利用此高分子人工抗體將欲吸附之生物分子分離，乃是將此高分子人工抗體填充到管柱進行層析、或是以薄層吸附、薄膜過濾的方式，將特定生物分子分離。

本發明係對所使用的基質進行數步驟之修飾使其可以作為單體與吸附劑間之連接者，然後在由模版分子的存在下，與其他的單體分子、交聯分子利用加熱的方式，形成能快速、大量移除人類血清白蛋白之高分子人工抗體。

以下就本發明所採用的磁性奈米粒子基質，予以說明。由於氧化鐵奈米粒子可大量生產且具磁性，容易分離並有極大的表面積，因此本發明將之選用作為被覆印刷高分子之基材。

本發明所採用的磁性奈米粒子，係先以三氯化鐵及二氯亞鐵藉由添加氨水製作出氧化鐵奈米粒子，接著將氧化鐵奈米粒子表面上的羥基與矽烷分子在表面上形成自身組裝單層膜(Self-Assembly Monolayer；SAM)，然後將已修飾的胺基與戊二醛進行二次修飾，最後再以丙烯醯氯進行氧化鐵粒子之表面修飾。以使用四種人類血清白蛋白抗原決定部位胜肽為模板，藉由自由基聚合法，分子印刷形成高分子膜於氧化鐵顆粒表面上，使予辨識人類血清白蛋白。

本發明所使用之經修飾處理的基材，在由模版分子的存在下經與其他的單體分子、交聯分子利用加熱的方式，形成能快速、大量移除人類血清白蛋白之高分子人工抗體。此人工抗體具有優異的吸附量、親和力及多次的重複使用性，且製造過程簡單且成本低廉、快速亦方便操作等優點。

本發明已顯示出建構嫁接在磁性奈米顆粒上的分子印刷膜，能形成所謂的人工抗體，具有吸附與辨識白蛋白之能力。其白蛋白之親和力(參見實施表1、表2、表3)均不亞於現有市售商品及其他實驗室之研究，其再使用之效能亦十分優異。

(1)‧‧‧氧化鐵奈米粒子

(2)‧‧‧APTMS修飾的氧化鐵奈米粒子

(3)‧‧‧戊二醛對含胺基之氧化鐵奈米粒子進行修飾

(4)‧‧‧以丙烯醯氯對含二級胺官能基之氧化鐵粒子表面進行修飾

圖1係與本發明有關的利用聯結劑對氧化鐵磁性粒子進行化學修飾之過程示意圖。

圖2係人類血清之白蛋白上二級結構之螺旋胜肽。

圖3係以二級結構胜肽為模板，使所產生的人工抗體於基質上與人類血清白蛋白吸附之過程。

本發明係對所使用的基材進行數步驟之修飾使其可以作為單體與吸附劑間之連接者，然後在由模版分子的存在下，與其他的單體分子、交聯分子利用加熱的方式，形成能快速、大量移除人類血清白蛋白之高分子人工抗體。

以下，針對與本發明技術特徵有關之利用聯結劑對氧化鐵磁性粒子進行化學修飾過程，予以說明。先以三氯化鐵及二氯亞鐵藉由添加氨水製作 出氧化鐵奈米粒子，接著將氧化鐵奈米粒子表面上的羥基與矽烷分子在表面上形成自身組裝單層膜(Self-Assembly Monolayer；SAM)，然後將已修飾的胺基與戊二醛進行二次修飾，最後再以丙烯醯氯進行氧化鐵粒子之表面修飾。依以氧化鐵奈米粒子基質製備分子印刷高分子載體之步驟順序，參照圖1予以說明如下所示。

[製備例] 1.磁性奈米粒子基質之製備

至於磁性奈米粒子基材，係先製備磁性氧化鐵奈米粒子。其係以去離子水為溶劑，配置30毫升之0.1莫耳濃度的二氯亞鐵水溶液以及60毫升之0.1莫耳濃度的三氯化鐵水溶液，接著將兩者混合並攪拌20分鐘。接著加熱使溫度升高至80℃之後逐滴加入氨水(6毫升，5莫耳濃度)持續攪拌30分鐘。反應結束後置於室溫下冷卻，待冷卻至室溫後，以強力磁鐵將氧化鐵奈米粒子吸於瓶底並將溶液移除，接著分別以水及丙酮清洗數次後置於真空下乾燥備用(如圖1之(1)所示)。

2.利用聯結劑進行氧化鐵奈米粒子之表面修飾

為了使氧化鐵微米粒子基質能夠適用作分子印刷高分子載體，因此使用具有胺基之氨丙基三甲氧基矽烷(默克試藥級；[NH₂(CH₂)₃Si(OCH₃)₃]，3-(aminopropyl)trimethoxysilane以下簡稱APTMS)對氧化鐵奈米粒子進行修飾(如圖1之(2)所示)，以利後續之使用及操作。

接著利用γ-氨丙基三甲氧基矽烷(對磁性氧化鐵粒子進行修飾。

以甲苯為溶劑配置濃度為0.8%(v/v)之γ-氨丙基三甲氧基矽烷溶液，接著加入800毫克之氧化鐵奈米粒子以及16毫升之三乙胺攪拌反應24小時，接著以強力磁鐵將已修飾上胺基之氧化鐵奈米粒子吸附於瓶底，移除溶液後再分別以甲苯以及丙酮清洗數次並置於真空下乾燥備用。

由修飾過後的Fe₃O₄與KBr混合所測之FTIR圖譜，可以看到Si-O-Si之特徵峰(1132cm_-1，1030cm_-1)，NH₂之特徵峰(3424cm_-1，3362cm_-1與1647cm_-1)以及CH之特徵峰(2927cm_-1，2871cm_-1)。

3.利用戊二醛對含胺基之氧化鐵奈米粒子進行修飾

其次利用戊二醛對已修飾上胺基之氧化鐵粒子進行二次修飾。將已修飾胺基之氧化鐵奈米粒子，溶於400毫升之乙腈後超音波震盪5分鐘並置於攪拌器上攪拌。接著加入1.29毫升之戊二醛進行反應，並偶爾加入醋酸直到溶液之pH值變為弱酸性，接著持續反應2小時。接著加入400毫克的氰基硼氫化鈉(sodium cyanoborohydride)並監測溶液之pH直到變為弱鹼，接著持續攪拌反應2小時。反應結束後以洗液(水/乙腈=1/1)清洗數次後置於真空下抽乾(如圖1之(3)所示)。由經戊二醛修飾過的氧化鐵奈米粒子與KBr混合所測之FTIR圖譜，可看出氧化鐵並未有殘留的C=O特徵峰存在，表示戊二醛兩端均能對氧化鐵奈米粒子上之胺基進行反應。

4.以丙烯醯氯對含二級胺官能基之氧化鐵粒子表面進行修飾

再利用丙烯醯氯對氧化鐵粒子表面進行修飾。在100毫升平底瓶中加入300毫克已經完成戊二醛修飾之氧化鐵粒子並置於真空下抽乾，接著通入氮氣。加入50毫升二氯甲烷並置於攪拌器上攪拌均勻，接著加入0.96毫升三乙胺反應30分鐘。然後在冰浴條件下逐滴加入0.24mL之丙烯醯氯，反應1小時後將反應移至室溫下反應24小時。反應結束後用二氯甲烷清洗數次後置於真空下抽乾(如圖1之(4)所示)。

[實施例1]：利用Phe-Ala-Glu-Glu-Gly-Lys-Lys-Leu-Val-Ala-Ala-Ser-Gln-Ala-Ala(SEQ ID NO.3)作為模版，嫁接人工抗體到氧化鐵粒子的表面。

取55微莫耳的丙烯醯胺、55微莫耳的丙烯酸、110微莫耳的N-苄基丙烯醯胺以及220微莫耳的乙基雙丙烯醯胺與3微莫耳的人類血清白蛋白抗原決定部位胜肽一(如圖2)溶於1.2毫升之三氟乙醇與水7：3的混合溶液中，此為聚合溶液。接著再加入修飾過之氧化鐵奈米粒子(70毫克)，配製成聚合溶液後置入圓底瓶中。通入氮氣五分鐘以除去氧氣，接著將圓底瓶置於加熱攪拌器上隔水加熱並攪拌，聚合溫度為65℃聚合18小時，接著調整溫 度至85℃聚合6小時。反應結束後以洗液(水/乙腈=1/1)清洗數次後置於真空下乾燥。使用含有0.5%tween ^® 20的5%醋酸水溶液清洗抽乾之分子印刷高分子氧化鐵粒子，並置於恆溫震盪機中搖晃30分鐘後，取出溶液。重複此步驟四次，藉此去除分子印刷高分子氧化鐵粒子上的模板分子。反應結束後，利用洗液(水/乙腈=1/1)清洗分子印刷高分子氧化鐵奈米粒子數次以去除醋酸水溶液後，置於真空下乾燥備用。

表1顯示利用Phe-Ala-Glu-Glu-Gly-Lys-Lys-Leu-Val-Ala-Ala-Ser-Gln-Ala-Ala(SEQ ID NO.3)為模板所製造出來之抗人類血清白蛋白的人工抗體與以人類血清白蛋白為模板分子的研究成果之比較，顯示出本發明具有超越此研究成果數倍以上之親和力以及較優異之吸附量。

α：1克之EVALs所能吸附的量(Lee,M.W.；Thomas,J.L.；Ho,M.H.；Yuan,C.；Lin,H.Y.ACS Appl.Mater.Interfaces,2010,2(6),1729)

β：1克之嫁接在氧化鐵粒子的人工抗體所吸附量

[實施例2]：利用Leu-Pro-Ser-Leu-Ala-Ala-Asp-Phe-Val-Glu-Ser-Lys(SEQ ID NO.4)作為模版，嫁接人工抗體到氧化鐵粒子的表面。

取55微莫耳的丙烯醯胺、55微莫耳的丙烯酸、110微莫耳的N-苄基丙烯醯胺以及220微莫耳的乙基雙丙烯醯胺與3微莫耳的人類血清白蛋白抗原決定部位胜肽二(如圖2)溶於1.2毫升之乙腈與水1：1的混合溶液中，此為聚合溶液。接著再加入修飾過之氧化鐵奈米粒子(70毫克)，配製成聚合溶液後置入圓底瓶中。通入氮氣五分鐘以除去氧氣，接著將圓底瓶置於加熱攪拌器上隔水加熱並攪拌，聚合溫度為65℃聚合18小時，接著調整溫度至85℃聚合6小時。反應結束後以洗液(水/乙腈=1/1)清洗數次後置於真空下乾燥。使用含有0.5%tween ^® 20的5%醋酸水溶液清洗抽乾之分子印 刷高分子氧化鐵粒子，並置於恆溫震盪機中搖晃30分鐘後，取出溶液。重複此步驟四次，藉此去除分子印刷高分子氧化鐵粒子上的模板分子。反應結束後，利用洗液(水/乙腈=1/1)清洗分子印刷高分子氧化鐵奈米粒子數次以去除醋酸水溶液後，置於真空下乾燥備用。

[實施例3]：利用嫁接在磁性氧化鐵粒子的人工抗體吸附人類血清白蛋白。

將在實施例2到3製備的人工抗體，取1毫克分別加入體積均為500微升，而濃度不同之人類血清白蛋白再結合溶液(溶劑為磷酸緩衝溶液，pH=7)進行動力學的測試，最後再利用螢光光譜儀檢測(激發波長：280奈米，放射波長：360奈米)。

由實施例2至實施例3的結果顯示於表2，利用Phe-Ala-Glu-Glu-Gly-Lys-Lys-Leu-Val-Ala-Ala-Ser-Gln-Ala-Ala(SEQ ID NO.3)為模板(如圖2)所製造的人工抗體，在吸附人類血清白蛋白時，有最大的吸附量與最強的吸引力。

a：1克之嫁接在氧化鐵粒子的人工抗體所吸附量

[比較例]：以申請人讓與國立東華大學之第419900號專利方法嫁接非印刷高分子(Non-imprinted polymers；以下稱NIP)在纖維素濾紙上製備具雙面 NIP之濾紙。

取55微莫耳的丙烯醯胺、55微莫耳的丙烯酸、110微莫耳的N-苄基丙烯醯胺以及220微莫耳的乙基雙丙烯醯胺溶於300微升之乙二醇與水一比一的混合溶液中，此為聚合溶液。取20微升聚合液滴在一片已披覆上NIP薄膜的纖維素濾紙上，放入烘箱加熱至140℃，加熱時間2.5小時，反應結束後，用乙二醇與水一比一的混合溶液清洗濾紙，單面披覆NIP的濾紙。取一片已披覆NIP之濾紙並在其另一面均勻塗抹聚醋酸乙烯樹脂後再將另一片已披覆NIP之濾紙覆蓋；經12小時再放入真空乾燥即可得到具雙面披覆NIP的印刷濾紙。將此高分子取一片置於體積350微升，濃度為1毫克/毫升之人類血清白蛋白結合溶液(溶劑為pH=8之磷酸緩衝溶液)進行吸附，最後再取200微升吸附後的溶液，置入96孔微量分析盤經螢光光譜儀測得吸附後螢光強度變化(激發波長為280奈米，放射波長為357奈米)。表3可以證明生物分子的吸附，是經由利用分子印刷術所製造出來的鍵結部位所辨識。

a：10片之嫁接在濾紙的人工抗體所吸附量

[實施例4]：嫁接非印刷高分子(NIP)在本發明所採的氧化鐵粒子上。

取55微莫耳的丙烯醯胺、55微莫耳的丙烯酸、110微莫耳的N-苄基丙烯醯胺以及220微莫耳的乙基雙丙烯醯胺溶於1.2毫升之乙腈與水1：1的混合溶液中，此為聚合溶液。接著再加入修飾過之氧化鐵奈米粒子(70毫克)，配製成聚合溶液後置入圓底瓶中。通入氮氣五分鐘以除去氧氣，接著將圓底瓶置於加熱攪拌器上隔水加熱並攪拌，聚合溫度為65℃聚合18小時，接 著調整溫度至85℃聚合6小時。反應結束後以洗液(水/乙腈=1/1)清洗數次後置於真空下乾燥。將此高分子取1毫克分別加入體積均為500微升，而濃度31.25毫克/毫升之人類血清白蛋白再結合溶液(溶劑為磷酸緩衝溶液，pH=7)進行動力學的測試，最後再利用螢光光譜儀檢測(激發波長：280奈米，放射波長：360奈米)。比較披覆印刷與非印刷高分子之氧化鐵粒子的吸附能力，其結果如表4所示。

a：70毫克之嫁接在氧化鐵粒子的人工抗體所吸附量

[實施例5]：嫁接在濾紙的人工抗體之重複使用測試。

當生物分子吸附到人工抗體上之後，25mM的尿素水溶液及含有0.5%Tween^® 20的5%醋酸水溶液清洗濾紙。重複此清洗步驟三次，且一次清洗1小時，清洗完之後再將此高分子取一片置於體積350微升，濃度為1毫克/毫升之人類血清白蛋白結合溶液(溶劑為pH=8之磷酸緩衝溶液)進行吸附，最後再取200微升吸附後的溶液，置入96孔微量分析盤經螢光光譜儀測得吸附後螢光強度變化(激發波長為280奈米，放射波長為357奈米)。結果如表5所示，此人工抗體具有很好的重覆使用性與穩定度。

a：10片之嫁接在濾紙的人工抗體所吸附量

[實施例6]：嫁接在氧化鐵粒子的人工抗體之重複使用測試。

以25mM之尿素水溶液清洗四次，每次三十分鐘，接著再用含有0.5%tween ^® 20的5%醋酸水溶液清洗，並置於shaker搖晃30分鐘後，取出溶液。重複此步驟四次。清洗後再將此高分子取1毫克分別加入體積均為500微升，而濃度為31.25微克/毫升之人類血清白蛋白再結合溶液(溶劑為磷酸緩衝溶液，pH=7)進行再結合的測試，最後再利用螢光光譜儀檢測(激發波長：280奈米，放射波長：360奈米)。結果如表6所示，此人工抗體具有很好的重覆使用性與穩定度。

a：70毫克之嫁接在氧化鐵粒子的人工抗體所吸附量

藉由上述的說明與實驗數據可發現本發明利用分子印刷技術，先對磁性氧化鐵粒子基質進行數步之修飾使其可以作為單體、吸附劑間連接者，然後在由模版分子的存在下，與其他的單體分子、交聯分子利用加熱的方式，形成能快速、大量移除人類血清白蛋白之高分子人工抗體。此人工抗體具有優異的吸附量、親和力及多次的重複使用性，且製造過程簡單且成本低廉、快速亦方便操作等優點。

本發明已分別顯示建構嫁接在濾紙與磁性奈米顆粒上的分子印刷膜，能形成所謂的人工抗體，具有吸附與辨識白蛋白之能力。其白蛋白之親和力(表1、表2、表3)均不亞於現有市售商品及其他實驗室之研究，其再使用之效能亦十分優異。

<110> 戴達夫

<120> 以拓印螺旋胜肽方式組成白蛋白之人工抗體的方法

<130> 20140115

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胜肽

<220>

<221> 螺旋

<222> (1)..(12)

<400> 1

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 胜肽

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<221> 螺旋

<222> (1)..(11)

<400> 2

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 胜肽

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<221> 螺旋

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<400> 3

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胜肽

<220>

<221> 螺旋

<222> (1)..(12)

<400> 4

(1)‧‧‧氧化鐵奈米粒子

(2)‧‧‧APTMS修飾的氧化鐵奈米粒子

(3)‧‧‧戊二醛對含胺基之氧化鐵奈米粒子進行修飾

(4)‧‧‧以丙烯醯氯對含二級胺官能基之氧化鐵粒子表面進行修飾

Claims (7)

1. 一種以拓印螺旋胜肽組成白蛋白之人工抗體的方法，其係包括：(1)以一分子如下所示之X為氫、甲基丙烯醯基、丙烯醯基、乙烯基或是丙烯基等官能基，Y為OCH₃、OCH₂CH₃、F、Cl、Br、I、OH等官能基，n為2或3或4之聯結劑的有機化合物分子在磁鐵粒子基質的表面上，經一化學修飾方法予以固定之後形成一自組裝單層；(2)接著加入欲吸附之選自人類血清白蛋白或是其他蛋白質、醣蛋白、脂肪蛋白、多醣体、脂肪酸、去氧核糖核酸、核糖核酸，或是欲吸附之含有Lys-Glu-Phe-Asn-Ala-Glu-Thr-Phe-Thr-Phe-His-Ala(SEQ ID NO.1)、Leu-Pro-Arg-Leu-Val-Arg-Pro-Glu-Asp-Val-Asp(SEQ ID NO.2)、Phe-Ala-Glu-Glu-Gly-Lys-Lys-Leu-Val-Ala-Ala-Ser-Gln-Ala-Ala(SEQ ID NO.3)、Leu-Pro-Ser-Leu-Ala-Ala-Asp-Phe-Val-Glu-Ser-Lys(SEQ ID NO.4)；或是含有其醯胺Lys-Glu-Phe-Asn-Ala-Glu-Thr-Phe-Thr-Phe-His-Ala-NH₂、Leu-Pro-Arg-Leu-Val-Arg-Pro-Glu-Asp-Val-Asp-NH₂、Phe-Ala-Glu-Glu-Gly-Lys-Lys-Leu-Val-Ala-Ala-Ser-Gln-Ala-Ala-NH₂、Leu-Pro-Ser-Leu-Ala-Ala-Asp-Phe-Val-Glu-Ser-Lys-NH₂之化合物螺旋結構之序列人類血漿白蛋白的生物分子的表面胜肽、或是其具有特定構造之部位分子為模板；(3)與具有雙鍵的數種單體化合物混合，於有機溶劑的存在下，使用聚合的方式來製造出能夠辨識吸附欲吸附之生物分子的人工抗體於此特定基質上，再利用此高分子人工抗體將欲吸附之生物分子分離
2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中聯結劑有機化合物為γ-氨丙基三甲氧基矽烷[NH₂(CH₂)₃Si(OCH₃)₃]。
3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中化學修飾方法係以戊二醛與磁鐵粒子上之胺基進行架橋，並加入氰基硼氢化钠予以氫化亞胺基為胺基，隨後再以甲基丙烯醯氯、丙烯醯氯進行醯化反應。
4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中單體化合物係選自由甲基丙烯醯酪胺酸、甲基丙烯醯酪胺酸甲酯、甲基丙烯醯酪胺酸乙酯、甲基丙烯醯酪胺醯胺、丙烯醯酪胺酸、丙烯醯酪胺酸甲酯、丙烯醯酪胺酸乙酯、丙烯醯酪胺醯胺、甲基丙烯醯酪胺、丙烯醯胺、甲基丙烯醯胺、丙烯酸、甲基丙烯酸、乙基雙丙烯醯胺、乙基雙甲基丙烯醯胺、N-苄基-丙烯醯胺、及N-苄基-甲基丙烯醯胺而成的群體中之一種以上。
5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中聚合方式為於極性有機溶劑的存在下，使用波長350nm的光化學儀中照光6小時或是加熱到50~100℃間，使單體聚合成高分子。
6. 如申請專利範圍第5項所述之方法，，其中極性有機溶劑係選自由甲醇、乙醇、三氟乙醇、二氟乙醇、一氟乙醇、二乙醇、乙氰、及水而成的群體中之一種以上以不同比例混合。
7. 如申請專利範圍第1項所述，其中利用此高分子人工抗體將欲吸附之生物分子分離，乃是將此高分子人工抗體填充到管柱進行層析、或是以薄層吸附、薄膜過濾的方式，將特定生物分子分離。