TW201525138A - 經培養肝細胞以及其製備方法 - Google Patents

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Abstract

本發明揭露具有肝索結構之經培養肝細胞以及應用。本發明亦揭露自多能幹細胞及前驅細胞獲得具有肝索結構之經培養肝細胞的方法。

Description

經培養肝細胞以及其製備方法
本發明是有關於一種細胞以及其製備方法，且特別是有關於一種肝細胞以及其製備方法。
製藥工業亟需用於在臨床前評估新藥肝臟毒性(hepatotoxicity)之人類肝細胞。然而，由於與原位肝臟移植(orthotopic liver transplantation)之間存在對肝臟的競爭性需求，因此原代人類肝細胞(primary human hepatocytes)供應不足。原代人類肝細胞之品質不同且與供體有關，且其在活體外應用時，其功能特性會迅速喪失。雖然亦使用動物模型及經轉型之人類細胞株來評估藥物代謝及毒性，但其不是正常人類反應之完全可靠的預測因子，且通常無法避免無效的主要候選藥物進入臨床期。在臨床試驗期間被發現導致肝損傷的許多藥物在動物實驗中未引起任何肝損傷。因此，目前製藥工業最關注的課題為人類肝細胞之替代源自。人類肝細胞為當前FDA評估藥物肝臟毒性之重要標準。
因此，亟需用於評估藥物之人類肝細胞。
由鑑於生技產業或製藥工業亟需用於在臨床前評估新藥肝臟毒性之人類肝細胞，因此本發明提供可用於體外評估藥物之人類肝細胞及其製備方法。
本發明之一個實施例提供一種多能幹細胞衍生之肝細胞，其在活體外具有肝索樣結構形態。
本發明之一個實施例提供一種製備肝細胞的方法，其包括下列步驟：提供多能幹細胞，使多能幹細胞分化為前驅細胞，使前驅細胞增殖，及誘導前驅細胞變成具有肝索樣結構形態的肝細胞。
本發明之一個實施例提供一種製備肝細胞的方法，其包括下列步驟：提供前驅細胞，使前驅細胞增殖，及誘導前驅細胞變成具有肝索樣結構形態的肝細胞。
本發明之一個實施例提供一種篩選藥劑的方法，其包括下列步驟：提供多能幹細胞衍生之肝細胞，用測試物處理經培養肝細胞，及確定測試物是否為所述藥劑。
下文參照附圖，詳細描述若干例示性實施例，以進一步詳細描述本發明。
圖1A與圖1B分別顯示根據一個實例，經誘導方式獲得的來源於TW6人類胚胎幹細胞(human embryonic stem cell，hESC)(圖1A)與ITRI-01人誘導多能幹細胞(human induced pluripotent stem cell，iPSC(圖1B)之經培養肝細胞的肝索結構形態，右下角之標度條對應於100微米。
圖2A與圖2B分別顯示根據一個實例，TW6 hESC(圖2A)與ITRI-01 iPSC(圖2B)來源之經培養肝細胞中多藥抗性相關蛋白2(resistance-associated proteins 2，MRP2)運輸蛋白的功能性，其中圖2A與圖2B中的下圖為利用5(6)-羧基-2',7'-二氯螢光素雙乙酸酯(羧基-DCFDA)(5(6)-Carboxy-2',7'-dichlorofluorescein diacetate(carboxy-DCFDA))進行偵測，MRP2於肝細胞頂端部分中具有運輸此螢光代謝物到膽小管空間(bile canalicular)的能力。
圖3顯示根據一個實例，標記物在TW6 hESC來源之經培養肝細胞中的表現，此圖顯示白蛋白(albumin，ALB)、肝細胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor 4 alpha，HNF4A)、α-1-抗胰蛋白酶(alpha-1-antitrypsin，AAT)、葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase，G6Pase)、脫唾液酸醣蛋白受體2(asialoglycoprotein receptor 2，ASGR2)、細胞角質蛋白-18(cytokeratin-18，CK18)、多藥抗性相關蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2，MRP2)及細胞色素P450 3A4(Cytochrome P450 3A4，CYP3A4)之表現。
圖4顯示根據一個實例，標記物在ITRI-01 iPSC來源之經培養肝細胞中的表現，此圖顯示白蛋白(ALB)、肝細胞核因子4α(HNF4A)、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)、脫唾液酸醣蛋白受體(ASGR2)、細胞角質蛋白-18(CK18)、多藥抗性相關蛋白2(MRP2)及CYP3A4之表現。
圖5顯示根據一個實例，使用誘導方式獲得的源自於TW6 hESC之經培養肝細胞、hepaRG細胞及原代人類肝細胞產生白蛋白的結果。
圖6顯示根據一個實例，在TW6 hESC來源之經培養肝細胞中藉由利福平(rifampicin)誘導CYP3A4酶。
圖7A與圖7B分別顯示TW6 hESC(圖7A)與ITRI-01 iPSC(圖7B)來源之經培養肝細胞對低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)的吸收情況，其中LDL為使用DiI標記之乙醯化LDL。
圖8A與圖8B分別顯示使用油紅O(Oil red O)染色觀察TW6 hESC(圖8A)與ITRI-01 iPSC(圖8B)來源之經培養肝細胞中的脂質小滴，右下角中之標度條對應於100微米。
圖9A與圖9B分別顯示使用過碘酸-希夫氏染色(periodic acid-schiff stain，PAS)觀察TW6 hESC(圖9A)與ITRI-01 iPSC(圖9B)來源之經培養肝細胞中的肝糖積聚，圖9C為用0.5% α-澱粉酶(西格瑪-奧德里奇)處理的陰性對照細胞，右下角中之標度條對應於100微米。
圖10顯示根據一個實例，在TW6 hESC來源之經培養肝細胞中曲格列酮(troglitazone)誘導之細胞毒性。
下文將參考附圖詳細描述例示性實施例，以便容易讓於所屬領域具有通常知識者實現。本發明的概念可以不同形式實施，而不限於本文闡述之例示性實施例。
本發明之一個實施例提供一種多能幹細胞衍生之肝細 胞，其在活體外具有肝索樣結構形態。
如本文所用之術語「肝細胞(hepatocyte)」是指具有獲自肝臟之上皮細胞特徵的細胞，例如表現脫唾液酸醣蛋白受體(ASGR)、α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)、白蛋白、肝細胞核因子1與4(HNF1及HNF4)及CYP基因(1A1、1A2、2B6、2C8、2C9、2D6、3A4)的細胞。肝細胞之其他標記物包含葡萄糖-6-磷酸酶、轉鐵蛋白、CK18、γ-麩胺醯基轉移酶、HNF-1.β.、HNF-3.α.、HNF-4.α.、轉甲狀腺素蛋白、囊性纖維化跨膜調節基子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)、apoE、葡萄糖激酶、胰島素生長因子(IGF)1及2、IGF-1受體、胰島素受體、瘦體素、apoAII、apoB、apoCIII、apoCII、醛縮酶B、苯丙胺酸羥化酶、L型脂肪酸結合蛋白、轉鐵蛋白、維生素A結合蛋白、紅血球生成素(EPO)、運輸蛋白(諸如多藥抗性相關蛋白2(Mrp2)及膽鹽出口泵(bile salt export pump，BSEP))及凝血因子(諸如因子V、VII、VIII、IX及X)。
肝細胞亦可具有下列生物活性，其可藉由功能分析證明。細胞可對二苯甲基螢光素(dibenzylfluorescein，DBF)具有陽性反應；能夠代謝某些藥物(例如右美沙芬(dextromethorphan)及香豆素(coumarin))；具有藥物流出泵(drug efflux pump)活性(例如P醣蛋白、Mrp2活性)；苯巴比妥(phenobarbital)對CYP活性之上調作用，例如利用戊氧基試鹵靈(pentoxyresorufin，PROD)分析所量測，此針對肝細胞而非其他細胞(參見例如施瓦茲(Schwartz)等人(2002)，臨床研究雜誌(J.Clin.Invest.)109：1291)；CYP酶之誘導作用，例如利福平對CYP3A4之誘導作 用，例如藉由CYP3A4/螢光素-IPA分析所測定(參見例如多希(Doshi U)及李(Li AP.)2011，針對CYP3A4抑制及誘導進行的基於螢光素IPA之較高處理量之人類肝細胞篩選分析(Luciferin IPA-based higher throughput human hepatocyte screening assays for CYP3A4 inhibition and induction)，生物分子篩選雜誌(Journal of Biomolecular Screening)16(8)：903-909)；吸收LDL，例如Dil-acil-LDL(參見例如施瓦茲等人，同上)；儲存脂質，例如藉由使用油紅O染色所測定(參見例如大澤(Osawa Y)等人，2011，酸性鞘磷脂酶經由AKT活化及AMP活化之蛋白激酶抑制來調節肝細胞中之葡萄糖及脂質代謝(Acid sphingomyelinase regulates glucose and lipid metabolism in hepatocytes through AKT activation and AMP-activated protein kinase suppression)25(4)：1133-1144)；儲存肝糖，例如藉由使用過碘酸-希夫氏(periodic acid-Schiff，PAS)染色細胞所測定(參見例如施瓦茲等人，同上)；產生尿素及白蛋白(參見例如施瓦茲等人，同上)；且呈現葡萄糖-6-磷酸酶活性之證據。在一個實例中，經培養肝細胞具有Mrp2運輸功能。在另一個實例中，經培養肝細胞吸收LDL且使肝糖及脂質積聚。在又一個實例中，經培養肝細胞表現至少一個由白蛋白、HNF4α、AAT、G6P、ASGR2、Mrp2、CK18及CYP3A4所構成之族群中選出的標記物。
如本文所用之術語「膜極性(membrane polarity)」是指具有分明之頂域(apical domain)及底側域(basolateral domain)之肝細胞的特性。特定運輸機制及受體位於面向小管管腔(canalicular lumen)的頂膜(例如P醣蛋白、BSEP、BCRP、MRP2)及面向肝 細胞與充血竇狀小管之間的細胞外周空間的底側膜(例如NTCP、OATP1B1、OATP1B3、OATP2B1、OAT2、OAT7、OCT1、MRP3、MRP4、MRP6)。肝細胞具有膜極性，例如藉由使用5(6)-羧基-2',7'-二氯螢光素雙乙酸酯(羧基-DCFDA)監測頂端流出運輸因子(apical efflux transporter)(諸如Mrp2)之表現及功能所測定(參見例如果納(Goral VN)等人，2010.在缺乏生物或合成基質或凝血劑下三維動態原代人類肝細胞細胞培養物的灌注型微流裝置(Perfusion-based microfluidic device for three-dimensional dynamic primary human hepatocyte cell culture in the absence of biological or synthetic matrices or coagulants)，晶片實驗室(Lab Chip)10：3380-3386)。羧基-DCFDA被肝細胞被動地吸收與代謝，且螢光素雙乙酸酯經由Mrp2運輸蛋白主動地流出至膽小管中。這個功能藉由細胞膜極性之恢復(restoration)而驅動。如本文所用之術語「肝索(hepatic cord)結構形態」是指由細胞團組成的活體內肝細胞結構形態，這些細胞以不規則的輻射柱及盤排列，自肝小葉之中央靜脈向外伸展。這些細胞具有多個側壁且含有一個或有時多個不同核。許多這些索接合形成肝小葉之組織(parenchyma)。各細胞通常含有顆粒及一些原生質以及由肝糖、脂肪或鐵化合物組成之其他部分。
如本文所用之術語「肝索樣結構形態(hepatic cord-like structure morphology)」是指結構形態類似於肝索之經培養肝細胞。
在一個實例中，經培養肝細胞在活體外具有肝索樣結構形態。
本發明之一個實施例提供一種製備肝細胞的方法，其包 括下列步驟：提供多能幹細胞，使多能幹細胞分化為前驅細胞，使前驅細胞增殖，及誘導前驅細胞變成具有肝索樣結構形態的肝細胞。
如本文所用之術語「多能幹細胞(pluripotent stem cell)」是指自我複製，來源於人類胚胎、人類胎兒組織或再程式化細胞且已知可發育成三個原胚層之細胞及組織的細胞之一。雖然多能幹細胞可來源於胚胎、胎兒組織或再程式化細胞，但這些幹細胞本身不是胚胎。「自我複製」意謂細胞可分離且形成彼此間不可區分的細胞。「三個原胚層(three primary germ layers)」(稱為外胚層、中胚層及內胚層)為胚胎中細胞之初始層，所有組織及器官由其發育而成。多能幹細胞亦稱為胚胎幹細胞或誘導型多能幹細胞。
根據一個實施例，多能幹細胞可為人類胚胎幹細胞(human embryonic stem cell)。在另一實例中，多能幹細胞為人類誘導型多能幹細胞(human induced pluripotent stem cell)。
如本文所用，術語「分化(differentiate)」是指產生比所來源的細胞類型更難分化的細胞類型。所述術語因此涵蓋部分分化及末期分化的細胞類型。舉例而言，來源於TW6 hESC細胞的分化細胞通常稱為TW6 hESC來源細胞或TW6 hESC來源細胞團塊培養物，或TW6 hESC來源單細胞懸浮液，或TW6 hESC來源細胞黏附培養物及其類似物。
根據一個實施例，人類多能幹細胞(hPSC)是在合適的培養基中加以培養。適用於人類多能幹細胞的培養基可以是湯姆遜(Thomson JA)等人，1998，來源於人類囊胚之胚胎幹細胞株(Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts)，科學 (Science)282(5391)：1145-1147，但不限於此。在一個實例中，培養基包括小鼠胚胎纖維母細胞(MEF)、補充有15%諾考血清置換物(knockout serum replacement)(英傑公司(Invitrogen Corp))的DMEM/F12培養基(英傑公司)、1毫莫耳L-麩醯胺酸(英傑公司)、0.1毫莫耳β-巰基乙醇、0.1毫莫耳NEAA及4奈克/毫升纖維母細胞生長因子2(fibroblast growth factor 2，FGF2)。
如本文所用，術語「前驅細胞(progenitor cell)」是指一種生物細胞，其如同幹細胞，容易分化成特定類型細胞，但已比幹細胞更具特異性且被迫分化成其「靶(target)」細胞。幹細胞與前驅細胞之間的最重要差異在於幹細胞可無限地複製，而前驅細胞僅可分裂有限次數。關於確切定義仍存在爭議且概念仍在進展。
根據一個實施例，人類胚胎幹細胞所分化成的人肝臟前驅細胞例如為HP-01細胞株，HP-01細胞株已於103年4月8日寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存號碼為BCRC960477。在另一實例中，人類誘導型多能幹細胞所分化成的人肝臟前驅細胞例如為HP-02細胞株，HP-02細胞株已於103年4月8日寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存號碼為BCRC960478。使多能幹細胞分化成肝臟前驅細胞的方法可指(1)撻耶伯(Tayeb K)等人，2010，由誘導型多能幹細胞高效產生類似人類肝細胞之細胞(Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells)，肝臟病學(Hepatology)51：297-305；(2)妥博(Touboul T)等人，2010，在再現肝臟發育的化學限定條件下由人類胚胎幹細胞產生功能性肝細胞(Generation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells under chemically defined conditions that recapitulate liver development)，肝臟病學(Hepatology)51：1754-1765；(3)宋(Song Z)等人，2009，由人類誘導型多能幹細胞有效產生類似於肝細胞之細胞(Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells)，細胞研究(Cell Research)19：1233-1242；(4)漢南(Hannan N)等人，2013，由人類多能幹細胞產生類似於肝細胞之細胞(Production of hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells)，自然-實驗手冊(Nature Protocol)8(2)：430-437，但不限於此。在一個實例中，將經培養TW6 hESC轉移至2%第1型膠原蛋白塗佈之盤中且在小鼠胚胎纖維母細胞(MEF)的條件培養基中維持24小時至48小時。當細胞生長至覆蓋培養基表面40-50%時，用內胚層誘導培養基置換原培養基，並維持3天，所述內胚層誘導培養基是由補充有2%血清置換物及活化素A(Activin A)(100奈克/毫升)的RPMI培養基組成。對於肝臟前驅細胞分化而言，將細胞在補充有1% B27、FGF4(10奈克/毫升；派普泰克(Peprotech))及肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)(10奈克/毫升)的RPMI培養基中培養5天。細胞接著用胰蛋白酶分離且於補充有HGF(20奈克/毫升；派普泰克)之DMEM培養基中以1-5×104個細胞/平方公分之密度再接種於塗佈有第1型膠原蛋白之盤中，維持5天。
如本文所用之術語「增殖(proliferate)」是指細胞生長，其是在細胞發育及細胞分裂(再生)之相關說明中使用。當在細胞分裂之相關說明中使用時，其是指細胞群體之生長。
根據一個實施例，前驅細胞在特定條件下增殖一段時 間。在一個實例中，肝臟前驅細胞培養且維持5天至28天。在另一實例中，前驅細胞的增殖期亦可為7天至14天。在此期間，肝臟前驅細胞可自1×104個細胞/平方公分生長至1×105個細胞/平方公分。在一個實例中，肝臟前驅細胞在培養基中培養且維持，所述培養基包括補充有1-10微莫耳濃度菸鹼醯胺、1x胰島素-轉鐵蛋白-硒(ITS)、0.1-10微莫耳濃度地塞米松(dexamethasone)、1-10%人類血清白蛋白、1-40奈克/毫升HGF、1-40奈克/毫升FGF1及1-50奈克/毫升表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)的DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)/F12培養基。
根據一個實施例，肝臟前驅細胞增殖之後的下一步驟為誘導肝臟前驅細胞變成肝細胞。
在一個實例中，肝臟前驅細胞在康寧(Corning)肝細胞培養基中培養，所述培養基補充有0.5-2% DMSO、0.1-10微莫耳濃度地塞米松、10-100奈克/毫升制癌蛋白M(oncostatin M，OSM)及10-100奈克/毫升HGF。前驅細胞亦用1-10%基質膠(Matrigel)覆蓋。在分化過程(由肝臟前驅細胞分化成肝細胞)中，培養基一週更換三次。
根據一個實施例，經培養肝細胞具有肝索樣結構形態且展現MRP2運輸活性。因此，經培養肝細胞在活體外展現膜極性。相反地，無肝索樣結構形態的多能幹細胞來源肝細胞在活體外不顯示膜極性或顯示有限的膜極性。本發明之經培養肝細胞非常類似於活體內肝細胞，且其生物特性更類似於活體內肝細胞之生物特性。
本發明之一個實施例提供一種製備肝細胞的方法，其包 括下列步驟：提供前驅細胞，使前驅細胞增殖，及誘導前驅細胞變成具有肝索樣結構形態的肝細胞。
根據一個實施例，具有肝索樣結構形態的經培養肝細胞可來源於前驅細胞。前驅細胞之增殖及誘導步驟已描述於上文中。
本發明之一個實施例提供一種篩選藥劑的方法，其包括下列步驟：提供具有肝索樣結構形態的經培養肝細胞，用測試物處理經培養肝細胞，及確定測試物是否為所述藥劑。
根據一個實施例，上述經培養肝細胞用於評估毒性效應及代謝產物。細胞具有肝索樣結構形態，且其適用於在活體外評估藥物肝臟毒性及代謝產物。
如本文所用，術語「藥劑(agent)」是指具有藥理學或生物學活性的物質，亦即醫用藥物。
根據一個實施例，欲作為藥劑之測試物可為化合物、溶劑、蛋白質、核酸、抗體、疫苗及其類似物，但不限於此。在一個實施例中，藥劑為例如曲格列酮。
根據一個實施例，用測試物處理經培養肝細胞之步驟意謂在添加測試物的情況下培養細胞。處理方式可為添加不同量之測試物。
根據一個實施例，用於測定所關注之肝臟毒性的方法可指佛塔克斯(Fotakis G)及廷博萊(Timbrell JA.),2006，活體外細胞毒性分析：在暴露於氯化鎘之後的肝癌細胞株中LDH、中性紅、MTT及蛋白質分析之比較(In vitro cytotoxicity assays：comparison of LDH,neutral red,MTT and protein assay in hepatoma cell lines following exposure to cadmium chloride)，毒理學通訊 (Toxicology Letters)160(2)：171-7，但不限於此。在一個實例中，利用CellToxTM綠色細胞毒性分析測定毒性效應。
實例
實例1：培養TW6 hESC及ITRI-01 iPSC
TW6 hESC來源於活體外授精之人類囊胚之內細胞團。ITRI-01 iPSC是根據製造商說明書(斯格道司(Stemgent Dox)誘導性再程式化套組)，利用慢病毒介導遞送人類因子Oct4、Sox2、Nanog及c-Myc，來源於人類包皮纖維母細胞。TW6 hESC細胞株與ITRI-01 iPSC細胞株均使用DMEM/F12培養基(英傑公司)在小鼠胚胎纖維母細胞(MEF)上培養且擴增，所述培養基補充有15%諾考血清置換物(英傑公司)、1毫莫耳L-麩醯胺酸(英傑公司)、0.1毫莫耳β-巰基乙醇、0.1毫莫耳非必要胺基酸(non-essential amino acid，NEAA)及4奈克/毫升FGF2。
實例2：使TW6 hESC或ITRI-01 iPSC分化成肝臟前驅細胞。將實例1之TW6 hESC或ITRI-01 iPSC轉移至2%第1型膠原蛋白塗佈之盤中且在MEF改良性培養基中維持24小時至48小時。當細胞生長至覆蓋培養基表面40-50%時，用內胚層誘導培養基置換原培養基，維持3天，所述內胚層誘導培養基是由補充有2%血清置換物及活化素A(Activin A)(100奈克/毫升)的RPMI培養基組成。對於肝臟前驅細胞分化而言，將細胞在補充有FGF4(10奈克/毫升；派普泰克)及HGF(10奈克/毫升)的RPMI/B27培養基中培養5天。細胞接著用胰蛋白酶(1：3至1：5)分離且於補充有HGF(20奈克/毫升；派普泰克)之DMEM培養基中再接種於第1型膠原蛋白塗佈之盤中，維持5天。來源於TW6 hESC 的HP-01肝臟前驅細胞株已於103年4月8日寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存號碼為BCRC960477。來源於ITRI-01 iPSC的HP-02肝臟前驅細胞株已於103年4月8日寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存號碼為BCRC960478。
實例3：使肝臟前驅細胞增殖
實例2之肝臟前驅細胞在培養基中培養且維持10天，所述培養基含有補充有1x ITS、10微莫耳濃度菸鹼醯胺(西格瑪-奧德里奇(Sigma-Aldrich))、0.1微莫耳濃度地塞米松(西格瑪-奧德里奇)、10奈克/毫升HGF(派普泰克)、10奈克/毫升FGF1(派普泰克)及10奈克/毫升EGF(派普泰克)的DMEM/F12培養基。初始培養物中之細胞密度為3×104個細胞/平方公分。
實例4：誘導肝臟前驅細胞變成肝細胞
實例3之肝臟前驅細胞接著在另一培養基中誘導7天，所述培養基含有補充有0.5% DMSO、0.1微莫耳濃度地塞米松、抑瘤素M(oncostatin-M，OSM)(100奈克/毫升)及20奈克/毫升HGF的康寧肝細胞培養基。細胞用2%基質膠覆蓋。在誘導過程中，培養基一週更換三次。
圖1A與圖1B分別顯示實例4之經培養肝細胞的形態。如圖1A與圖1B分別所示，來源於TW6 hESC與ITRI-01 iPSC之肝臟前驅細胞的經培養肝細胞排列成索狀或盤狀，且這個肝索樣結構形態類似於活體內肝組織。
實例5：Mrp2運輸功能分析
實例4之肝細胞用含有5微莫耳濃度5(6)-羧基-2',7'-二氯螢光素雙乙酸酯(羧基-DCFDA；英傑公司)的培養基培育。羧 基-DCFDA被細胞吸收且代謝。螢光代謝物藉由Mrp2運輸蛋白而主動分泌至膽小管中。在37℃下培育1小時之後，細胞用磷酸緩衝溶液(PBS)洗滌以移除細胞外羧基-DCFDA。螢光代謝物之流出表現藉由倒置螢光顯微鏡(卡爾蔡司顯微成像公司(Carl Zeiss MicroImaging)，耶拿(Jena)，德國(Germany))監測。
圖2A與圖2B分別為實例5之來源於TW6 hESC與ITRI-01 iPSC之肝臟前驅細胞的經培養肝細胞之Mrp2運輸功能的結果。如圖所示，來源於HP-01肝臟前驅細胞(圖2A)與HP-02肝臟前驅細胞(圖2B)之經培養肝細胞能夠沿著索樣結構分泌螢光素雙乙酸酯至相鄰肝細胞之間的膽小管樣區域，顯示經培養肝細胞中具有Mrp2運輸功能及存在膜極性。
實例6：肝細胞標記物表現之分析
實例4之肝細胞在4℃用4%三聚甲醛固定10分鐘且接著在含有0.1%曲拉通-X100(Triton-X100)(西格瑪-奧德里奇)的PBS中滲透10分鐘。固定之細胞用PBS洗滌且在4℃下用含有5%山羊血清(維克特(Vector))的PBS阻斷1小時，隨後與初級抗體或同型對照物一起在含有1%山羊血清的PBS中在4℃下培育隔夜。所用初級抗體為：兔抗人類白蛋白(ALB)與FITC結合物(1：50；DAKO)、小鼠抗人類肝細胞核因子4α(HNF4a；1：50；安迪生物科技(R & D Systems))、小鼠抗人類α1抗胰蛋白酶(AAT；1：100；艾碧康(abcam))、小鼠抗人類細胞角質蛋白18(Ck18；1：100；DAKO)、兔抗葡萄糖-6-磷酸酶(G6P；1：100；艾碧康)、兔抗脫唾液酸醣蛋白受體2(ASGR2；1：50；西格瑪-奧德里奇)、小鼠抗人類MRP2(1：100；艾碧康)及兔抗人類CYP3A4(1：100； 艾碧康)。使用稀釋度為1：500的埃里克斯福(Alexa Fluor)594抗小鼠IgG、埃里克斯福488抗兔IgG及埃里克斯福488抗小鼠IgG二級抗體(英傑公司)進行間接標記。用DAPI(1：10000；羅氏分子診斷公司(Roche Molecular Diagnostics))對細胞進行對比染色。螢光標記之細胞使用倒置螢光顯微鏡(卡爾蔡司顯微成像公司)成像。結果說明於圖3及圖4中。如圖3及圖4中所示，來源於HP-01肝臟前驅細胞或HP-02肝臟前驅細胞的經培養肝細胞表現成熟肝細胞標記物，包含ALB、HNF4a、AAT、Ck18、G6Pase、ASGR2、Mrp2及CYP3A4。
實例7：白蛋白分泌分析
分析實例4之經培養肝細胞、hepaRG細胞(英傑)及原代人類肝細胞(龍沙(Lonza))分泌白蛋白的情況。根據製造商說明書培養HepaRG細胞及原代人類肝細胞。培育48小時之後收穫培養基，且使用酶聯結免疫吸附劑分析(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)套組(貝瑟(Bethyl))分析其中白蛋白分泌情況。計算每105個細胞的白蛋白分泌量且相對於時間進行正規化(normalize)。
結果說明於圖5中。如圖5中所示，具有肝索結構之經培養肝細胞展現的白蛋白分泌量(35奈克/毫升/105個細胞/天)與經培養原代人類肝細胞及HepaRG細胞類似。
實例8：CYP3A4誘導分析
實例4之肝細胞在康寧肝細胞培養基中與利福平(10微莫耳濃度)一起培育以誘導CYP3A4蛋白質含量。媒劑(vehicle)對照孔是與含DMSO之康寧肝細胞培養基一起培育。培育72小時 之後，移除培養基且使用P450-Glo CYP3A4結合螢光素-IPA(普洛麥格(Promega))，根據製造商使用說明書測定代謝作用。與螢光素-IPA受質培育60分鐘之後，將培養基轉移至不透明的96孔微量滴定盤中，所述微量滴定盤含有等體積的P450-Glo反應緩衝液。培育20分鐘之後，用讀盤光度計(分子儀器公司(Molecular Devices))測定發光。每次量測時，分析不含受質之孔的值，且自具有受質之孔減去上述不含受質之孔的值。這些值接著相對於細胞數目正規化。計算每孔中每105個細胞之平均發光單位，且每孔計算兩次。
結果說明於圖6中。如圖6中所示，利福平誘導之後，細胞展現約5倍之CYP3A4活性誘導。
實例9：LDL吸收、肝糖及脂質積聚
對於LDL吸收分析而言，實例4之肝細胞與5微克/毫升之DiI-Ac-LDL(英傑)一起在37℃下培育隔夜。用PBS洗滌兩次之後，使用倒置螢光顯微鏡(卡爾蔡司顯微成像公司)對螢光標記細胞進行攝像，且結果說明於圖7A與圖7B中。圖7A與圖7B分別顯示來源於HP-01肝臟前驅細胞與HP-02肝臟前驅細胞之經培養肝細胞吸收低密度脂蛋白(LDL)。
為偵測脂質，實例4之肝細胞在4℃下用4%三聚甲醛固定10分鐘且用0.3%油紅O溶液(西格瑪-奧德里奇)染色30分鐘。結果說明於圖8A與圖8B中，其顯示在來源於HP-01肝臟前驅細胞或HP-02肝臟前驅細胞之經培養肝細胞的邊緣處出現脂質小滴。利用過碘酸-希夫氏(PAS)染色分析細胞內肝糖。細胞在4℃下用4%三聚甲醛固定10分鐘且在0.5%過碘酸中氧化5分鐘。 氧化之後，細胞用蒸餾水沖洗3次且接著用希夫氏試劑(西格瑪-奧德里奇)處理15分鐘。細胞用蒸餾水沖洗5分鐘之後，細胞用梅爾氏蘇木素(Mayer's hematoxylin)對比染色1分鐘。陰性對照細胞用0.5% α-澱粉酶(西格瑪-奧德里奇)處理以確認存在肝糖。結果說明於圖9A至圖9C中，其顯示來源於HP-01肝臟前驅細胞或HP-02肝臟前驅細胞之經培養肝細胞能夠使肝糖積聚。
實例10：曲格列酮誘導之肝臟毒性分析
實例4之經培養肝細胞用不同濃度(0、100、200、300、400及500微莫耳濃度)之人類肝毒性劑曲格列酮(西格瑪-奧德里奇)處理5天，其中0濃度的組別為對照組。使用CellToxTM綠色染料套組(普洛麥格)，根據製造商使用說明書分析細胞毒性並取得實驗資料。相對於非曲格列酮處理所得的對照資料，對上述實驗資料進行正規化。
圖10為曲格列酮誘導的實例4之經培養肝細胞的細胞毒性的結果。如圖10中所示，處理5天之後，大於100微莫耳濃度之曲格列酮導致經培養肝細胞之細胞毒性增大，顯示經培養肝細胞可用於評估藥物肝臟毒性。
與習知的活體外多能幹細胞來源肝細胞相比，本發明之實施例提供一種具有肝索樣結構之經培養肝細胞，其展現Mrp2運輸功能，並顯示頂端-底端細胞極性(apicobasal cell polarity)，其非常類似於肝組織。所提供之經培養肝細胞可用於實驗室及/或臨床藥物評估，如藥物肝臟毒性。
於所屬領域具有通常知識者顯而易見的是，可對所揭露之實施例進行各種修改及變更。希望說明書及實例被認為是僅具 例示性，本發明之真實範疇是由下列申請專利範圍及其等效物指示。
【生物材料寄存】
HP-01細胞株已於103年4月8日寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存號碼為BCRC960477。
HP-02細胞株已於103年4月8日寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存號碼為BCRC960478。

Claims (21)

  1. 一種多能幹細胞衍生之肝細胞，所述肝細胞具有肝索樣結構形態。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的多能幹細胞衍生之肝細胞，其中所述肝細胞具有多藥抗性相關蛋白2(MRP2)的運輸功能及膜極性(membrane polarity)。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的多能幹細胞衍生之肝細胞，其中所述肝細胞吸收低密度脂蛋白(LDL)且使肝糖及脂質積聚。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的多能幹細胞衍生之肝細胞，其中所述肝細胞表現至少一個由白蛋白、肝細胞核因子4α(HNF4α)、細胞角質蛋白-18(CK18)、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)、脫唾液酸醣蛋白受體(ASGR2)2、多藥抗性相關蛋白2(MRP2)及細胞色素P450 3A4(CYP3A4)所構成之族群選出的標記物。
  5. 如申請專利範圍第1項所述的多能幹細胞衍生之肝細胞，其中所述肝細胞來源於人類胚胎幹細胞。
  6. 如申請專利範圍第5項所述的多能幹細胞衍生之肝細胞，其中所述肝細胞來源於由所述人類胚胎幹細胞衍生的前驅細胞，所述前驅細胞為HP-01細胞株，該HP-01細胞株已於103年4月8日寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存號碼為BCRC960477。
  7. 如申請專利範圍第1項所述的多能幹細胞衍生之肝細胞，其中所述肝細胞來源於人類誘導型多能幹細胞。
  8. 如申請專利範圍第7項所述的多能幹細胞衍生之肝細胞， 其中所述肝細胞來源於由所述人類誘導型多能幹細胞衍生的前驅細胞，所述前驅細胞為HP-02細胞株，該HP-02細胞株已於103年4月8日寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存號碼為BCRC960478。
  9. 一種製備肝細胞的方法，包括：提供多能幹細胞；使所述多能幹細胞分化成前驅細胞；使所述前驅細胞增殖；以及誘導所述前驅細胞變成具有肝索結構形態的所述肝細胞。
  10. 如申請專利範圍第9項所述的製備肝細胞的方法，其中所述方法包括使所述前驅細胞在培養基中增殖，所述培養基包括補充有1-10微莫耳濃度菸鹼醯胺(nicotinamide)、1x胰島素-轉鐵蛋白-硒(ITS)、0.1-10微莫耳濃度地塞米松(dexamethasone)、1-10%人類血清白蛋白、10-40奈克/毫升肝細胞生長因子(HGF)、10-40奈克/毫升纖維母細胞生長因子(FGF1)1及10-50奈克/毫升表皮生長因子(EGF)的DMEM/F12培養基。
  11. 如申請專利範圍第9項所述的製備肝細胞的方法，其中所述方法包括使所述前驅細胞增殖5至28天。
  12. 如申請專利範圍第9項所述的製備肝細胞的方法，其中所述方法包括使所述前驅細胞自1×104個細胞/平方公分之細胞密度增殖至1×105個細胞/平方公分之細胞密度。
  13. 如申請專利範圍第9項所述的製備肝細胞的方法，其中所述前驅細胞為HP-01細胞株，該HP-01細胞株已於103年4月8日寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存號碼為 BCRC960477。
  14. 如申請專利範圍第9項所述的製備肝細胞的方法，其中所述前驅細胞為HP-02細胞株，該HP-02細胞株已於103年4月8日寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存號碼為BCRC960478。
  15. 一種製備肝細胞的方法，包括：提供前驅細胞；使所述前驅細胞增殖；以及誘導所述前驅細胞變成具有肝索結構形態的所述肝細胞。
  16. 如申請專利範圍第15項所述的製備肝細胞的方法，其中所述方法包括使所述前驅細胞在培養基中增殖，所述培養基包括補充有1-10微莫耳濃度菸鹼醯胺(nicotinamide)、1x胰島素-轉鐵蛋白-硒(ITS)、0.1-10微莫耳濃度地塞米松(dexamethasone)、1-10%人類血清白蛋白、1-40奈克/毫升肝細胞生長因子(HGF)、1-40奈克/毫升纖維母細胞生長因子(FGF1)1及1-50奈克/毫升表皮生長因子(EGF)的DMEM/F12培養基。
  17. 如申請專利範圍第15項所述的製備肝細胞的方法，其中所述方法包括使所述前驅細胞增殖5至28天。
  18. 如申請專利範圍第15項所述的製備肝細胞的方法，其中所述方法包括使所述前驅細胞自1×104個細胞/平方公分之細胞濃度或密度增殖為1×105個細胞/平方公分之細胞濃度或密度。
  19. 一種篩選藥劑的方法，包括：提供如申請專利範圍第1項所述的多能幹細胞衍生之肝細胞； 用測試物處理所述肝細胞；以及確定所述測試物是否為所述藥劑。
  20. 如申請專利範圍第19項所述的篩選藥劑的方法，其中所述方法包括測定所述測試物對所述肝細胞的毒性作用。
  21. 如申請專利範圍第19項所述的篩選藥劑的方法，其中所述方法包括測定所述測試物在所述肝細胞中的代謝產物。
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