TW201518316A

TW201518316A - 毒素，組合物及相關方法

Info

Publication number: TW201518316A
Application number: TW103110045A
Authority: TW
Inventors: Mark Shieh; Mike Soika
Original assignee: Sanofi Pasteur Inc
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-17
Publication date: 2015-05-16
Also published as: KR20150133771A; JP2016519671A; CN105308066A; AU2014228983B2; AR095668A1; BR112015023469A8; EP2970400A1; SG11201507578PA; AU2014228983A1; BR112015023469A2; CA2907156A1; HK1213917A1; AU2018204879A1; WO2014144594A8; WO2014144594A1; US20160030542A1

Abstract

本發明揭示產生經純化之梭菌毒素的方法，該等方法包含切向流過濾、疏水性相互作用層析及陰離子交換層析。此等方法提供純度為約90%或90%以上之困難梭菌毒素的良好產率。亦揭示經高度純化之梭菌毒素、類毒素(例如藉由使如本文所揭示之毒素失活來製備)及包含此等毒素及/或類毒素之組合物。亦揭示使用經純化之毒素及/或類毒素例如誘發針對梭菌屬(例如困難梭菌)之免疫反應的方法。

Description

毒素，組合物及相關方法

相關申請案

本申請案主張2013年3月15日申請之美國第61/793,376號之優先權，其藉此以全文併入本申請案中。

本發明大體上係關於蛋白質純化之領域。更特定言之，其係關於經純化之梭菌毒素、類毒素、包含經純化之毒素或類毒素的組合物、及製備經純化之毒素及類毒素的方法。

自培養物濾液製備之梭菌毒素需要深入純化來分離存在於濾液中之各種細胞組分(例如細胞DNA、細胞蛋白質、培養基組分)，以適用於活體內使用。實際上，已為此目的而開發出多個種純化技術。然而，根據此等技術製備之毒素可仍含有可觀量之過程中雜質。已進行各種嘗試以自培養物濾液純化困難梭菌(C.difficile)毒素A及毒素B。

在一個過程中，藉由超過濾、離子交換層析及乙酸沈澱來純化培養物濾液。藉由此過程，毒素B僅可部分經純化，如由在藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)分析時不可能區分毒素與若干污染性蛋白質所證明。[Rothman,S.W.等人Curr.Microbiol.1981,6：221-224；Sullivan,N.M.等人Infect.Immun.,1982,35：1032-1040]。此過程之稍後修改涉及自困難梭菌之透析濾液藉由疏水性相互作用層析及離子交換層析來純化毒素(Rothman S.W.,Infect.Immun.,1984，第324-331 頁)。然而，此過程亦不能提供經高度純化形式之毒素A及毒素B兩者。

一種自困難梭菌培養物濾液使用透濾、硫酸銨沈澱及凝膠層析(S-300丙烯葡聚糖凝膠尺寸排外管柱)來共純化毒素A及B之方法描述於美國專利第6,969,520號中。藉由此方法製備之毒素純度為50%至60%(或以下，例如44%)，且包括多種雜質(例如約35kDa雜質(困難梭菌3-羥基丁基CoA脫氫酶)、45-47kDa雜質(困難梭菌麩胺酸脫氫酶)及60-70kDa蛋白質(groEL之同系物或細菌hsp60蛋白質家族))。

目前可獲得之方法不適用於大規模生產。相應地，在此項技術中需要製備經純化之毒素的替代性方法。本發明提供以大規模提供經純化之困難梭菌毒素的方法。

本發明提供用於製備經高度純化之毒素及類毒素的方法。藉由使用本文所描述之方法以經純化之形式且以足夠產率獲得困難梭菌毒素及類毒素。在一些實施例中，本發明提供用於產生困難梭菌毒素之方法，該方法藉由自不純水溶液藉由疏水性相互作用層析與陰離子交換層析之組合(視情況在某些賦形劑存在下)純化毒素來進行。在某些實施例中，該等方法可包括使用基於非多醣載體之陰離子交換層析。在一些實施例中，該等方法亦可包括使用附接有苯基、丁基或丙基之疏水性相互作用載體的疏水性相互作用層析。在一些實施例中，可使不純水溶液接受超過濾及/或透濾步驟(例如藉由切向流過濾)。本文所描述之方法以約90%(例如約90%、約94%、約95%-97%、約98%、約99%或99%以上)之純度水準提供毒素(例如「實質上不含雜質」)。經純化之毒素可使用一般技術者可獲得之化學藥劑或其他方法(諸如(但不限於)甲醛、戊二醛或β-丙內酯)來失活(例如產生「類毒素」)。亦提供經高度純化之毒素及類毒素、及包含該等毒素或類毒素之組合物。該等經高度純化之組分(及相關組合物)可用於保護個體不受症狀性困難梭菌感染影響及/或治療具有症狀性困難梭菌感染之個體(例如作為免疫組合物及/或疫苗)。例示性方法、毒素、類毒素、其組合物、及用途因此可包括(但不限於)陳述於實例中之彼等。自本發明，其他實施例對一般技術者而言將為清楚的。

圖1. 例示性毒素純化過程。

圖2. 類毒素免疫原性。

本發明提供用於製備經高度純化之毒素及類毒素的方法。本文中尤其受關注者為困難梭菌毒素A及/或B及/或其衍生物(例如基因脫毒版本、截斷形式、片段、及其類似物)。出於本發明之目的，毒素A及/或毒素B可包括任何困難梭菌毒素，該困難梭菌毒素可使用此項技術中之標準技術來識別為毒素A及/或毒素B。例示性技術可包括例如免疫分析(諸如ELISA)、點漬墨法或活體內分析。適用於進行該等識別之試劑可包括例如抗毒素A家兔多株抗血清(例如Abcam^®產品第ab35021號或Abcam^®產品第ab93318號)或抗毒素A小鼠單株抗體(例如Abcam^®產品第ab19953號(mAb PCG4)或第ab82285號(mAb B618M)中之任一者)、抗毒素B家兔多株抗血清(例如Abcam^®產品第ab83066號)或抗毒素B小鼠單株抗體(例如Abcam^®產品第ab77583號(mAb B428M)、第ab130855號(mAb B423M)或第ab130858號(mAb B424M)中之任一者)(所有均可購自Abcam^®(Cambridge,MA))。

本文提供可在分析與生產規模之間縮放的方法。在一些實施例中，該等方法提供純度水準為約90%或90%以上(例如約90%、約95%-97%、約98%、約99%或99%以上)之毒素。在一些實施例中，包含該等純度水準之毒素及/或類毒素的組合物可視為「實質上不含雜質」。亦提供用於使經純化之毒素失活為類毒素的方法。亦提供使用該等毒素及類毒素之方法。本文提供此等方法、毒素、類毒素、組合物、及其使用方法。

本文所描述之方法通常涉及自困難梭菌毒素之不純水溶液純化困難梭菌毒素。該方法可適用於來自困難梭菌之幾乎任何菌株的毒素。困難梭菌之較佳菌株為產生毒素A及/或B之菌株，且可為例如0毒素型菌株(例如VPI10463/ATCC43255、630)、III毒素型菌株(例如027/NAP/B1)、V毒素型菌株(例如078)及VIII毒素型菌株(例如017)。

困難梭菌通常在醱酵器中於受控條件下生長。直至達到如由OD量測所測定之所需細胞濃度。收集醱酵器培養液，且藉由用過濾(例如使用膜過濾器)移除大部分細胞及細胞碎片雜質來澄清。過濾可使用過濾器來進行，諸如深度過濾器(例如高效深度過濾器，諸如Pall Stax)。經過濾之培養液可隨後藉由微過濾來滅菌，較佳使用約0.2μm微孔尺寸之膜過濾器。所得培養液濾液通常包括困難梭菌毒素(例如毒素A及/或毒素B)及其他雜質，代表困難梭菌毒素之不純水溶液。為純化(或實質上純化)困難梭菌毒素，提供包含多個階段(例如步驟)之方法。

在一些實施例中，第一階段可包括含有困難梭菌毒素之培養液的濃縮、超過濾及/或透濾。濃縮、超過濾及透濾可藉由切向流過濾(TFF)(例如交叉流過濾)來進行。濃縮一般可在具有適合之截止臨界值(例如在約100kDa與約400kDa之間)的膜上藉由超過濾來進行。TFF為熟習此項技術者所熟知的，且用於其實施例之設備及方案可購自多個製造商，包括(但不限於)Pall Corporation(Port Washington,New York；www.pall.com)及EMD Millipore(Billerica,MA；www.millipore.com)。此等方法可使用若干可廣泛獲得之系統中的任一者來執行，諸如包含平坦薄膜或空心纖維膜之彼等系統。例示性膜可包括例如Millipore之Spectrum膜及Biomax膜。在大規模生產中，可使用能夠預防對毒素之剪切力過度的平坦薄片系統(例如具有開放流動通道)。切向超過濾可使用呈平坦薄片形式且具有適當截止臨界值(例如大致為50-100kDa中之任何值)的膜來進行。

可將濾液(例如如上文所述而產生)透濾至適合之緩衝劑中，諸如Tris緩衝劑(例如大致為25mM至50mM中之任何濃度)，視情況包括鹽(例如25mM-50mM NaCl)、EDTA(例如0.2mM)，pH值為約7.0至約8.0(例如pH 7.5)。緩衝劑亦可包括二硫蘇糖醇(DTT)，但此未必總可為必需及/或建議的。而在一些較佳實施例中，特定言之排除DTT，因其可對過程結果具有負面效果。透濾產物可隨後使用適當之系統(例如包含0.8μm膜及0.2μm膜之過濾囊(例如Sartorius,Pall EKV或Millipore過濾器))過濾一或多次。

可隨後使透濾液接受疏水性相互作用層析(HIC)以移除親水性及微疏水性雜質。HIC之原理在此項技術中為人熟知。簡言之且在不受任何特定作用機制束縛之情況下，HIC係基於在蛋白質上之疏水性基團與可適用固體載體上之疏水性配體之間的相互作用。可藉由添加易溶鹽(諸如(但不限於)硫酸銨、硫酸鈉)來促進將蛋白質上之疏水性基團吸附至載體上之疏水性配體上。已結合之溶質的解吸附可藉由用較低鹽濃度之緩衝劑逐步或梯度溶離來達成。蛋白質結合至疏水性載體上可受多種因素影響，包括：(i)配體類型，尤其其疏水性(例如醚、苯基、丁基或丙基)；(ii)固體載體之配體密度；(iii)基質之主鏈材料；(iv)蛋白質之疏水性；及(v)所用鹽之類型。疏水性較小之管柱的結合通常將需要較高鹽濃度。為促進疏水性相互作用，可向透濾液溶液中添加硫酸銨(例如至適當最終濃度(例如大致為0.4-1.2M或約0.4至約0.9M中之任何濃度，諸如大致為0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1或1.2M中之任一者))。溶液可在疏水性相互作用載體(例如樹脂或膜)上層析，諸如瓊脂糖(附接有例如苯基、丁基、醚或丙基配體，較佳為丁基、醚或丙基)。在某些最佳實施例中，載體可包括丁基配體(例如丁基S瓊脂糖)。使用該等層析載體可在不使用溶劑(例如異丙醇(IPA))且不添加DTT之情況下自載體溶離毒素(參見例如實例)。如實例中所示，使用丁基瓊脂糖之HIC(例如丁基S HIC瓊脂糖)可使毒素回收率增加且在不使用溶劑(例如IPA)之情況下溶離毒素A及B。

在使管柱平衡之後，可將溶液直接負載在管柱上。負載緩衝劑可用於使毒素結合至所用管柱載體材料上。適合之負載緩衝劑可包含例如適合之緩衝組分，諸如適合之濃度(例如為約15mM至50mM中之任何濃度，例如大致為15、20、25、30、35、40、45或50mM中之任一者，較佳約25mM)下，典型pH值為約7.0至約8.0(較佳pH 8.0)，具有適量鹽(例如0.8M-1.0M(NH₄)₂SO₄，諸如0.8、0.9或1.0M中之任一者，較佳約0.9M)的Tris。如一般技術者應理解的，許多其他鹽亦可為適當的，諸如通常用於HIC中之彼等鹽，諸如硫酸鈉及/或NaCl(例如25mM至50mM NaCl，諸如大致為25、30、35、40、45或50mM中之任一者的NaCl)。亦可包括其他組分，諸如EDTA(例如約0.2mM)。亦可或可不包括DTT(例如因其可影響毒素自我蛋白酶解活性)。如上文所提及，較佳排除DTT(因此，該過程較佳在不包括DTT及/或不存在DTT之情況下進行)。

管柱負載之後通常可為使用包含適合緩衝組分之適當緩衝劑洗掉雜質的洗滌步驟，該緩衝組分為諸如適合濃度之Tris(例如約15mM至約50mM Tris(例如大致為15、20、25、30、35、40、45或50mM中之任一者，較佳約25mM Tris；0.8M-1.0M硫酸銨(較佳0.9M))，pH值約7.5-8.0(例如大致為pH 7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0中之任一者))。已結合之毒素隨後可使用適合之緩衝劑(例如10-40mM Tris(例如大致為10、15、20、25、30、35或40mM中之任一者的Tris，較佳約25mM Tris)，pH 7.5-8.0(例如大致為pH 7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0中之任一者))來溶離在一或多個溶離份中。經溶離之毒素溶離份的導電性(離子強度)可隨後使用適當稀釋劑(諸如注射用水(WFI))降低至適當水準(例如6-8mS/cm(導電性單位)或更低，諸如約6、6.5、7.0、7.5或8.0mS/cm中之任一者)。

困難梭菌毒素(在溶離液中)可隨後藉由陰離子交換層析(AEX)來進一步純化。AEX之原理為此項技術中熟知。在不受任何特定作用機制束縛之情況下，此方法通常依賴於待分離之溶質/分子與所用陰離子交換載體材料(例如樹脂、膜)上之電荷之間的電荷-電荷相互作用。因為毒素在生理pH值範圍下帶負電，所以載體可含有經固定之帶正電離子交換基團/部分。帶正電部分一般為四級胺基或二乙基胺基乙烷(DEAE)基團。因此，可使經溶離之水溶液與具有帶正電離子交換基團之陰離子交換載體(例如樹脂、膜)在使毒素結合至載體上之條件下接觸。儘管AEX可使用基於多醣之載體(諸如DEAE-瓊脂糖樹脂、GE(Q、DEAE、DEAP)瓊脂糖樹脂、及/或Sartobind膜)來進行，但此處發現基於非多醣之載體(例如合成聚合物及無機材料)改良毒素純度及產率。可使用之適合例示性膜包括由例如以下製成之彼等膜：經聚合物化學改質，交聯以產生具有帶正電離子交換基團之四級胺表面的微孔聚醚碸(PES)(諸如Pall或Natrix之膜)。舉例而言，適用之例示性樹脂包括四級胺官能基附接至其上的基於甲基丙烯酸酯之樹脂(諸如Tosoh Super Q樹脂(Toso Biosciences)、Bio-Rad Q樹脂(Bio-Rad))。如實例中所示，該等層析載體(樹脂、膜)與習知技術相比，可提供醇脫氫酶(ADH)雜質自毒素之有效及/或改良分離。

AEX層析載體可用適當緩衝劑(例如25mM Tris，0mM MgCl₂)加以平衡。在使管柱平衡之後，可將包含毒素之溶液直接負載在管柱上。通常使用導電性及/或pH值使得毒素結合至管柱載體上的負載緩衝劑。毒素A及毒素B可使用具有適當鹽濃度之適當緩衝劑(例如離子強度增加之緩衝劑)個別地溶離。舉例而言，與毒素B相比，毒素A可用鹽濃度較低之緩衝劑溶離。在一些實施例中，毒素A可用包含一或多種鈉及/或鎂鹽(諸如約2至約32mM MgCl₂，較佳約27mM MgCl₂，或約125至約160mM，或約140mM(例如141mM)NaCl)之低鹽緩衝劑溶離。毒素B可用包含一或多種鈉及/或鎂鹽(諸如約120至約150mM，或約122至約148mM MgCl₂，較佳約135mM MgCl₂，或約450至約550mM，或約500mM(例如488mM)NaCl)之高鹽緩衝劑溶離。雜質通常可在介於高鹽與低鹽緩衝劑之鹽濃度之間的鹽濃度(例如65-79mM MgCl₂，通常約72mM MgCl₂)下溶離。許多不同組分可適用於緩衝(例如穩定pH值)，諸如適合之量(例如約25至約50mM)的Tris。如由一般技術者應理解的，亦可使用其他緩衝劑及鹽。在一些實施例中，在其中毒素濃度較高及/或其中毒素之水溶液包括某些雜質(例如ADH、hsp60)的情況下，使用MgCl₂自AEX載體溶離較佳。如以下實例中所示，該情況可在使用補充有山梨糖醇之培養基來培養困難梭菌時遇到。

層析通常在水溶液緩衝劑系統存在下進行以避免蛋白質變性。舉例而言，任何習知緩衝劑(諸如Tris、麥黃酮(Tricine)、磷酸鹽(PBS)、甘胺醯甘胺酸、MES、MOPS、HEPES、雙-參-丙烷-HCl)或其他可適合於AEX。在陰離子交換劑上應使用帶正電緩衝離子以避免與官能基之相互作用或結合。在一些實施例中，舉例而言，Tris(pKa 8.2)可與作為相對離子之Cl^-一起使用。

較佳地，經純化(或實質上經純化)之毒素A及/或經純化(或實質上經純化)之毒素B可經濃縮且透濾至適當儲存緩衝劑(例如檸檬酸鹽、磷酸鹽、甘胺酸、碳酸鹽、碳酸氫鹽緩衝劑)中。使用檸檬酸鹽緩衝劑已觀測到毒素降解減少，其因此可為較佳的(參見例如實例)。

如使用標準技術(例如毛細管凝膠電泳及/或SDS/PAGE分析)所量測的，最終經純化之毒素一般純化至至少大致為80%、85%、90%、95%、97.5%、98%、99%或100%中之任一者。如實例中所示，此處所描述之方法可用於產生純化至約99%之毒素A及純化至約98%之毒素B。

本文所描述之方法亦提供增強之可縮放性、過程控制、產物純度及產物穩定性。舉例而言，為增加規模，可使用尺寸增加之管柱，且可相應調節流動速率。

該等方法以良好產率獲得雜質有限且效能/細胞毒性足夠之困難梭菌毒素。舉例而言，已發現藉由本文所描述之方法(例如使用具有基於非多醣載體之疏水性相互作用層析及/或陰離子交換層析)的純化自培養物濾液移除大量污染物(例如生物分子，包括DNA、脂質及蛋白質)。應注意AEX可在疏水性相互作用層析(HIC)之前或之後進行。舉例而言，HIC可在AEX之前進行，或AEX可在HIC之前進行。AEX亦可按使用者之需要而重複，以進一步改良純度水準。

可使用一般技術者已知技術，諸如藉由使用化學藥劑(例如(但不限於)甲醛、戊二醛或β-丙內酯)來使經純化之毒素失活(例如產生類毒素)，舉例而言，可使用甲醛來使毒素失活。經純化之毒素可以可適用之目標毒素A：毒素B比率(例如3：1、3：2)混合且隨後失活，或可單獨地失活。舉例而言，為使毒素失活，可向約0.5mg/ml毒素中添加約4mg/ml甲醛。失活可在適當溫度(例如約2℃-8℃，約25℃或25℃以下)下且在適當pH值(例如約pH 7.0)下進行適量時間(例如約18-21天)。失活之較佳方法(例如「類毒素化」)包括描述於2013年3月15日申請之同在申請中美國第61/790,423號中的彼等方法，其以全文引用之方式併入本申請案中。

所得類毒素製劑可在pH 8.0或8.0以下(例如6.5-7.5)下儲存於可預防類毒素反轉為毒素之儲存緩衝劑(諸如(但不限於)檸檬酸鹽、磷酸鹽、甘胺酸、碳酸鹽或碳酸氫鹽)中。緩衝劑較佳包括至少一或多種醫藥學上可接受之賦形劑，該等賦形劑增加類毒素之穩定性及/或延遲或減少類毒素之聚集。所用賦形劑包括例如(但不限於)糖(例如海藻糖、蔗糖)或糖醇(例如山梨糖醇)、鹽(氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、乙酸鎂)、甲醛(0.001%-0.02%)或其組合。適用之其他賦形劑描述於此項技術中，諸如WO2009/035707(US 2011/045025(A1))，其全文併入本文中。

儘管類毒素製劑可與儲存緩衝劑直接混合，但該等製劑亦可經濃縮且透濾至適當緩衝溶液中。濃縮及透濾較佳使用切向流過濾來進行，以在確保移除甲醛且交換至儲存緩衝劑中的同時使蛋白質剪切最小化。例示性儲存緩衝劑包含適量檸檬酸鹽(例如20mM)、適當pH值(例如pH 7.5)、適量之至少一種糖(例如4%至8%蔗糖，諸如5%)、及約0.016%±0.004%甲醛(w/v)。必要時可調節甲醛之濃度以維持預防反轉之甲醛目標濃度(例如0.016%±0.004%甲醛(w/v))。在一些實施例中，甲醛可以較低量(諸如0.008%(w/v)或0.004%(w/v))存在於該等組合物中。儲存之較佳方法包括描述於2013年3月15日申請之同在申請中美國第61/790,423號中的彼等方法，其以全文引用之方式併入本申請案中。

類毒素製劑亦可經過濾(例如使用0.2μm膜過濾器)以移除可影響藉由280nm處吸光度得到之蛋白質濃度的小蛋白質聚集體，以允許以預定類毒素A：類毒素B比率調配醫藥組合物。類毒素A及類毒素B在儲存之前可以預定類毒素A：類毒素B比率組合。組合或個別類毒素之組合物可以液體或凍乾形式儲存在例如2℃-8下(例如在該形式中甲醛可以例如約0.016%(w/v)存在)。若呈液體形式，則類毒素較佳儲存在 <-60℃下。

類毒素可經調配以用作醫藥組合物(例如免疫原性及/或疫苗組合物)。舉例而言，包含困難梭菌類毒素之組合物可藉由使類毒素懸浮在醫藥學上可接受之稀釋劑(例如生理鹽水)中及/或藉由使類毒素與醫藥學上可接受之載劑締合來製備以供投藥。該等醫藥調配物可包括一或多種賦形劑(例如稀釋劑、增稠劑、緩衝劑、防腐劑、佐劑、清潔劑及/或免疫刺激劑)，諸如已知及/或可獲得之彼等賦形劑。適合之賦形劑通常與類毒素及佐劑(例如在有佐劑之組合物中)相容，其中其實例為一般技術者已知且可獲得的。組合物可呈液體形式，或經凍乾(按照標準方法)或泡沫乾燥(如由例如美國專利公開案2009/110699中所描述，其全文併入本發明中)。如上文所提及，組合物亦可經凍乾。在一些實施例中，經凍乾之組合物可儲存在約2℃至約8℃之間。

為製備用於投藥之疫苗，可用水溶液(諸如注射用水)或適合之稀釋劑或緩衝溶液來使乾燥組合物復原。在某些實例中，如本文所描述，稀釋劑可包括甲醛。稀釋劑可包括具有或不具有甲醛之佐劑(例如氫氧化鋁)。例示性稀釋劑可為NaCl及氫氧化鋁之水溶液。該稀釋劑可用於使乾燥組合物復原。醫藥組合物可包含劑量為約10至150μg/mL(例如約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150μg/mL中之任一者)的類毒素。注射劑量體積通常為約0.5mL或1.0mL。可視需要加或減少劑量以調節個體中之免疫反應(及/或是否觀測到副作用)。類毒素可在存在或不存在佐劑之情況下，以可由熟習此項技術者確定之量投與。例示性佐劑可包括例如鋁化合物，諸如氫氧化鋁、磷酸鋁及羥基磷酸鋁。

免疫及/或疫苗組合物可藉由經皮(percutaneous)(例如肌肉內、靜脈內、腹膜內或皮下)、透皮(transdermal)、及/或經黏膜途徑以由熟習此項技術者確定為適當之量及方案向具有症狀性困難梭菌感染或具有出現該感染之風險的個體投與。此等群體包括例如已接受廣譜抗生素之個體，諸如住院老年患者、老人安養院居住者、長期生病患者、癌症患者、AIDS患者、特護病房中之患者及接受透析治療之患者。疫苗可投與一次、兩次、三次、四次或四次以上。當投與多個劑量時，劑量可彼此間隔例如一至六天、一週、兩週、三週、或一或多個月(例如若干月)中之任一者。因此，本發明亦提供誘發針對毒素、類毒素及/或傳染性生物之免疫反應的方法，其包含藉由向個體投與醫藥組合物來誘發。此可藉由向個體投與本文所描述之醫藥組合物(例如免疫原性組合物及/或疫苗)以實現使該個體之免疫系統暴露於類毒素中來達成。因此，免疫原性組合物及/或疫苗可用於預防及/或治療症狀性困難梭菌感染。

因此，本發明提供用於產生經純化之困難梭菌毒素的方法，其藉由以下各者來進行：將包含困難梭菌毒素之不純水溶液施加於疏水性相互作用載體(例如HIC)上，以使困難梭菌毒素結合至其上；自該疏水性相互作用載體溶離該已結合之困難梭菌毒素；將該經溶離之困難梭菌毒素施加於選自由以下各者組成之群的陰離子交換載體(例如AEX)上：(i)具有四級胺官能基之聚甲基丙烯酸酯；及(ii)具有四級胺官能基之聚醚碸膜，以使困難梭菌毒素結合至其上；及自該陰離子交換載體溶離該已結合之困難梭菌毒素。在一些實施例中，該等方法進一步包含在HIC之前使包含困難梭菌毒素之不純水溶液接受切向流過濾及/或自AEX溶離液回收經純化之困難梭菌毒素。該毒素通常為困難梭菌毒素A或困難梭菌毒素B。在一些實施例中，該包含困難梭菌毒素之水溶液包含可自該陰離子交換載體單獨溶離之困難梭菌毒素A及困難梭菌毒素B。在一些實施例中，用於HIC之該疏水性相互作用載體為附接有苯基之基質、附接有丁基S基團之基質(例如瓊脂糖基質)、或附接有丙基之基質。在一些實施例中，該陰離子交換載體可為結合有四級胺官能基之聚甲基丙烯酸酯樹脂，該載體包含其中R為聚合物之部分-O-R-N⁺-(CH₃)₃；及/或該陰離子交換載體為Tosoh Super Q 650M。在一些實施例中，該困難梭菌毒素之不純水溶液藉由以下各者來獲得：在生長培養基中生長困難梭菌細胞以提供含有困難梭菌毒素及生長細胞之培養液，及自該等生長細胞分離該培養液以提供該困難梭菌毒素之不純水溶液。在一些實施例中，該困難梭菌毒素之不純水溶液包含山梨糖醇。亦提供根據此等方法中之任一者而獲得的經純化之困難梭菌毒素(例如純度為約90%或90%以上(例如大致為91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%中之任一者))。在一些實施例中，該等方法可提供純化至約92.8%之困難梭菌毒素A。在一些實施例中，該等方法可提供純化至約91%之困難梭菌毒素B。在一些實施例中，該經純化之困難梭菌毒素實質上可不含溶劑及/或可偵測之醇脫氫酶。該等方法亦可包含用化學劑(例如甲醛)使經回收的經純化之困難梭菌毒素失活以提供困難梭菌類毒素。本發明亦提供根據此等方法中之任一者而獲得的困難梭菌類毒素。類毒素(例如類毒素A及/或類毒素B)亦可與醫藥學上可接受之賦形劑組合以提供醫藥組合物(例如免疫原性組合物及/或疫苗)。在一些實施例中，該等組合物可以3：2之重量比包含困難梭菌類毒素A及困難梭菌B。本發明亦提供用於在個體中誘發免疫反應(例如針對困難梭菌)之方法，其藉由向個體投與本文提供之組合物中的任何一或多者來進行。在一些實施例中，該等方法包含預防或治療個體中之症狀性及/或非症狀性困難梭菌感染。該等方法亦可用於治療不具有症狀性困難梭菌感染但可具有該感染之風險的個體。

儘管本文已描述較佳實施例，但應理解變化及修改涵蓋於此且對熟習此項技術者而言為顯而易見的。

術語「約」、「大約」及其類似物在數值或範圍之列表之前時獨立地提及列表或範圍中之各個別值，如同該術語緊靠在該列表或範圍中之各個別值之前。該術語意謂其所提及之值為確切、接近或類似該值。舉例而言，「約」或「大約」可指示在指定值百分之十內的值(例如「約30%」可包括27%至33%的任何值)。

如本文所用，個體或宿主意謂個別者。個體可包括馴養動物(諸如貓及狗)、家畜(例如牛、馬、豬、綿羊及山羊)、實驗室動物(例如小鼠、家兔、大鼠、天竺鼠)及鳥類。在一個態樣中，個體為哺乳動物，諸如靈長類或人類。

視情況選用(optional)或視情況(optionally)意謂隨後描述之事件或情形可能或不能發生，且該描述包括其中該事件或情形發生之情況及其中該事件或情形不發生之情況。舉例而言，片語組合物視情況可包含組合意謂組合物可包含不同分子之組合或可不包括組合，以使得描述包括組合及組合(亦即組合之個別成員)不存在兩者。

範圍在本文中可表示為自約一個特定值及/或至約另一個特定值。當表示該範圍時，另一個態樣包括自一個特定值及/或至另一個特定值。類似地，當藉由使用前置詞約或大約來將值表示為近似值時，應理解特定值形成另一個態樣。進一步應理解範圍中之每一者的端點在相關於其他端點及獨立於其他端點時均為重要的。範圍(例如90-100%)意欲包括範圍本身以及該範圍內之各獨立值，如同單獨列出各值。

當本文中與對給定病狀之給定治療結合使用術語預防(prevent/preventing/prevention)(例如預防感染)時，其意謂表達待治療之個體完全未出現臨床上可觀測之量的病狀，或病狀出現比未進行治療者更緩慢及/或程度更低。此等術語不僅限於其中個體不經歷任何病狀之態樣的情況。舉例而言，若在將個體暴露於已預期將產生給定病狀表現之刺激中期間提供治療，且導致個體比其它方式之預期經歷更少及/或更輕病狀症狀，則將該治療稱為預防該病狀。治療可藉由使個體僅呈現溫和之明顯感染症狀來「預防」症狀性感染；其不暗示此處必須已無感染性微生物穿透任何細胞。

類似地，如本文中與使用給定治療之症狀性感染風險結合使用的降低(reduce/reducing/reduction)(例如降低症狀性困難梭菌感染之風險)通常係指與在不存在治療(例如使用所揭示之毒素或類毒素的投藥或疫苗接種)之情況下出現症狀性感染之對照或基本水準相比，個體出現症狀性感染更緩慢或程度更低。症狀性感染之風險降低可使個體僅呈現溫和之明顯感染症狀或延遲感染症狀；其不暗示此處必須已無感染性微生物穿透任何細胞。

亦必須注意，如在本發明及所附申請專利範圍中所使用，除非上下文另外明確指示，否則單數形式「一個/一種(a/an)」及「該」包括複數性參照。

本發明內所引用之所有參考均以全文引用之方式併入本文中。在以下實例中進一步描述某些實施例。此等實施例僅作為實例提供，而並不意欲以任何方式限制申請專利範圍之範疇。

實例

僅出於說明之目的提供以下實例，而不意欲限制本發明之範疇。涵蓋形式變化及等效物取代以作為可表明或賦予有利條件之情況。儘管本文已採用特定術語，但該等術語意欲為描述含義而非出於限制之目的。所用但未明確描述於本發明及此等實例中之分子遺傳、蛋白質生物化學及免疫學方法在科學文獻中得以充分報告且充分處於熟習此項技術者之能力內。

實例1

此實例描述一種用於製造經純化之困難梭菌毒素及類毒素的方法。使用困難梭菌工作菌種(菌株VPI10463/ATCC43255)來接種包含大豆蛋白腖、酵母提取物、磷酸鹽緩衝劑及碳酸氫鈉(pH 6.35-7.45)的經預處理之培養基(SYS培養基)，且按比例自4mL工作細胞庫(WCB)小瓶擴增為160L培養物。在達到所需密度及10-12小時培育期時候，加工全部160L培養物以進行澄清及0.2μm過濾。收集來自另一個產生醱酵器之培養物且使之接受膜過濾(例如使用Meisner膜過濾器)以移除困難梭菌細胞及細胞碎片雜質。濃縮所得澄清培養物濾液，且藉由切向流過濾使之透濾至具有NaCl、EDTA及DTT之Tris緩衝劑中。使用膜過濾器來過濾所得溶液，增加硫酸銨之濃度(例如至約0.4M)，且隨後進行另一次過濾(例如使用膜過濾器)。此水溶液含有困難梭菌毒素A及毒素B。使水溶液接受疏水性相互作用層析。(以下稱為段落A)將困難梭菌毒素結合至苯基FF瓊脂糖凝膠管柱(GE苯基FF瓊脂糖)上。用硫酸銨於Tris緩衝劑中之0.2mM溶液洗滌管柱，且用Tris緩衝劑及IPA溶離兩個溶離份之困難梭菌毒素。合併自HIC溶離之兩個毒素溶離份，且使用WFI將導電性調節至9mS或9mS以下。藉由陰離子交換層析來進一步純化困難梭菌毒素(在經合併之溶離液中)。使經溶離之水溶液穿過陰離子交換管柱(例如DEAE FF瓊脂糖)，以使毒素結合至管柱上。用Tris緩衝劑(50mM Tris/50mM NaCl，pH 7.5)來使管柱平衡，且用低鹽Tris緩衝劑(141mM NaCl/50mM Tris，pH 7.5)溶離毒素A且用高鹽Tris緩衝劑(488mM NaCl/50mM Tris，pH 7.5)溶離毒素B。將經純化之毒素A及經純化之毒素B各自濃縮，且透濾至100mM PO₄(pH 7)中。步驟(例如澄清、TFF、HIC、AEX)各自在環境溫度(亦即約37℃-26℃)下進行。毒素A之平均產量為約0.0075公克純毒素/公升醱酵物，且如由SDS Page所評估之純度為平均約92.8%。毒素B之平均產量為約0.0035公克純毒素/公升醱酵物，且如由SDS Page所評估之純度為平均約91%。蛋白質之濃度藉由280nm處之UV吸光度使用吸光度單元來測定。

毒素之失活

藉由用甲醛處理來使毒素A及B失活。向毒素A透濾液及毒素B透濾液中之每一者中無菌添加37%甲醛溶液，以獲得0.42%之最終濃度。混合溶液，且隨後在2℃-8℃下儲存18-22天。在失活之後，將毒素透濾液透析至調配物緩衝劑中。

實例2

進行本文所描述之實驗以改良純化方法之可縮放性、產率及純度。使用困難梭菌工作菌種(菌株VPI10463/ATCC43255)來接種無菌拋棄式袋中的經預處理之培養基(包含大豆蛋白腖、酵母提取物、磷酸鹽緩衝劑及D-山梨糖醇，pH 7.1-7.3)且在35℃-39℃下培育培養物直至達成目標OD。應注意，發現在經預處理之培養基中包括山梨糖醇明顯增加產率。使用30L菌種1培養物來接種250L無菌拋棄式培養袋中之培養基，且在35℃-39℃下培育培養物直至達成目標OD。使用菌種2培養物來接種1000L無菌拋棄式培養袋，且在35℃-39℃下培育培養物直至達成目標OD。收集來自另一個產生醱酵器之培養物，且使之接受深度過濾(例如使用Pall Stax深度過濾器)以移除困難梭菌細胞及細胞碎片雜質，且同時使之冷卻(例如約37℃-19℃)以限制蛋白酶活性。濃縮所得澄清培養物濾液，且使用扁材(flat stock)Millpore(其較佳用於規模擴大)及在約4℃至10℃之溫度(用於降低蛋白酶活性)下藉由切向流過濾使之透濾至25mM Tris/50mM NaCl/0.2mM EDTA(pH 7.5-8.0)(無DTT)中。使用膜過濾器來過濾所得溶液，增加硫酸銨之濃度(例如至約0.4M)，且隨後進行另一次過濾(例如使用膜過濾器)。此水溶液含有困難梭菌毒素A及毒素B。此醱酵過程(其利用具有山梨糖醇之培養基)的產率為自實質上如實例1中所描述醱酵過程獲得之毒素產率的2-3倍(亦即大約5-9μg/mL毒素A及10-15μg/mL毒素B之2-3倍)。使用實質上如實例1中(如在上文段落A中)所描述之過程來純化培養物濾液。多種雜質在毒素A及B中顯而易見，包括毒素A中之醇脫氫酶(ADH)。藉由SDS-PAGE分析，三種雜質在毒素B中顯而易見，包括在約210kDa、85kDa及60kDa處之亮帶，其可表示HSP60及降解產物。多次嘗試該過程。毒素純度藉由SDS-PAGE來評估，且介於約73.5%至88.7%之範圍內。如藉由量測SDS-PAGE凝膠之主要可見亮帶來計算的毒素A及毒素B之純度陳述於表1中，且介於約73.5%至88.7%之範圍內。毒素A之主要雜質為ADH(如藉由SDS-PAGE作為約100kDa處之亮帶可見)，且多種雜質在毒素B中顯而易見。在HIC步驟處所獲得之回收率<50%。

如下所述對純化過程進行變化，以部分地處理由於醱酵過程改良而產生之雜質負載增加：(i)在HIC步驟中，使用Tris/2mM EDTA及7% IPA影響溶離；及(ii)使用DEAP影響AEX。

毒素降解

已尤其在毒素B中觀測到毒素降解，且可為關於純度之問題。在毒素B中，在200kDa、85kDa及60kDa處觀測到典型雜質，其對應於對如由在DTT存在下之自我蛋白酶解產生的其他雜質而報告的亮帶。為評估蛋白酶之存在，將來自一個批次的過程中樣品在-80℃、4℃及25℃下培育若干天。在澄清培養液及HIC前樣品中注意到次要亮帶化模式變化，顯示在25℃及4℃樣品中但不在-80℃樣品中出現約200 kDa及85kDa處之亮帶。毒素B之TFF2後樣品在於室溫下培育四天之後完全降解，表明外生蛋白酶。使用TFF2後材料之研究表明使用PO₄作為透濾緩衝劑可影響降解。將來自一個批次的TFF2後材料透析至不同pH值水準(6.0、6.5、7.0、7.5及8.0)下的20mM PO₄緩衝劑中。將另外一個樣品透析至20mM檸檬酸鹽(pH 7.5)中。在透析之後，在PO₄緩衝劑中之不同pH值下觀測到在約200kDa及85kDa處之新亮帶。意外地，20mM檸檬酸鹽不顯示此結果，因此表明檸檬酸鹽緩衝劑可為適用之透濾緩衝劑。

改良之純化過程

如上文所提及，修改純化過程以改良產率及純度。篩選不同HIC樹脂。藉由深度過濾澄清後之培養物濾液經切向流過濾及膜過濾加工，且使用若干HIC載體(例如苯基低疏水性、苯基高疏水性(苯基瓊脂糖樹脂(快流速苯基瓊脂糖))、丁基瓊脂糖、丁基S瓊脂糖、Sartobind奈米苯基及Fractogel丙基(EMD Biosciences))中之一者藉由HIC來純化。ADH之分離無法使用此等研究中HIC樹脂或膜中之任一者來達成。基於SDS-PAGE資料，與苯基高底物(對照)相比，丁基S產生之能力為約2×，且毒素之回收率明顯較好(約90%相對於苯基之50%)。新過程之其他益處包括不必需異丙醇，且產物可在溶離之後以單一峰值來收集。

在一個研究中，HIC前材料在Fractogel丙基管柱(EMD Biosciences)上操作。與苯基瓊脂糖樹脂相比，Fractogel丙基為包括惰性載體(甲基丙烯酸酯)的疏水性較弱之樹脂，其可壓縮性比瓊脂糖更高(例如且可限制蛋白質之二級結合)。使用疏水性較弱之樹脂(如丙基及丁基)消除在水溶液溶離之後使用溶劑完全去除產物樹脂的需要。評估各種負載條件及線性梯度溶離。與使用苯基瓊脂糖之HIC相比，提供明顯較好之毒素回收率以及在自毒素分離雜質中之一些改良。結果指示(i)Fractogel丙基樹脂可替代苯基樹脂；(ii)1.2M硫酸銨濃度之負載條件足以使毒素結合至丙基樹脂上，(iii)完成溶離過程(如目前在苯基樹脂中所見)不必需溶劑，及(iv)相較於使毒素A及B共溶離之後藉由AEX層析來分離，使用丙基樹脂可能拆分毒素A及B兩者。

在另一個研究中，HIC使用丁基S瓊脂糖(GE Healthcare Hitrap丁基-S)來進行。用1×體積之2.5M硫酸銨、50mM Tris(pH 7.5)來稀釋HIC前材料，且按照製造商說明及使用線性梯度在管柱上操作以共溶離毒素。來自丁基-S瓊脂糖層析操作之HIC後產物藉由SDS-PAGE與來自苯基瓊脂糖層析操作之HIC後產物進行比較。使用丁基-S瓊脂糖HIC層析具有明顯更低量之分子量雜質。來自丁基-S HIC溶離之毒素所含有的雜質比率比使用苯基瓊脂糖純化之材料更低。與使用苯基瓊脂糖之HIC及使用Fractogel丙基之HIC相比，丁基-S HIC提供明顯更好的毒素自雜質之分離。在比較HIC/苯基瓊脂糖與HIC/丁基S之一個研究中，使用HIC/苯基瓊脂糖僅獲得毒素A之10%回收率，而HIC/丁基S使用相同澄清培養物濾液起始材料提供毒素A幾乎70%回收率及毒素B幾乎90%回收率。因此，與疏水性較大之苯基瓊脂糖樹脂相比，疏水性較小之樹脂(例如丁基瓊脂糖樹脂，諸如GE丁基S FF瓊脂糖)在HIC步驟處提供明顯改良之回收率，且亦允許在不使用溶劑(例如IPA)之情況下溶離毒素。

亦評估多種陰離子交換載體。培養物濾液在藉由HIC/苯基瓊脂糖或HIC/丁基S瓊脂糖純化後，使用若干AEX管柱中之一者來純化。使用10管柱體積之梯度溶離。篩檢結果陳述於表2中。當使用DEAP管柱在測試pH值中之每一者下且用具有0.5M精胺酸之溶離緩衝劑來進行AEX時，ADH雜質與毒素A一起共溶離。使用DEAP管柱與1M乙酸鹽溶離緩衝劑顯示ADH雜質自毒素A之分離極少或沒有。使用Tosoh DEAE管柱之AEX層析亦顯示ADH雜質自毒素A之分離極少或沒有。操作在Tosoh Q上純化的經丁基S瓊脂糖溶離之材料產生極純材料，其中毒素A之純度為94%或94%以上。使用來自2000L醱酵批次且使用用丁基S瓊脂糖之HIC及用Tosoh Q之AEX來純化之培養液濾液的多種操作提供平均純度為99%之毒素A及平均純度為98%之毒素B。關於毒素B，使用丁基S瓊脂糖(與苯基瓊脂糖相比)之HIC及使用Tosoh Q(與DEAP相比)之AEX改良純度及產率。毒素B降解及純度藉由移除DTT及在第二切向流過濾步驟中用檸檬酸鹽緩衝劑替代磷酸鹽緩衝劑(儘管磷酸鹽緩衝劑因其他原因而通常較佳)而得以進一步改良。因此，一種雜質(醇脫氫酶(ADH))自毒素A之良好分離見於基於非多醣之載體(諸如基於甲基丙烯酸酯之樹脂、基於聚醚碸之膜)。亦觀測到毒素B自其他雜質(諸如HSP-60及其他蛋白質)之良好分離。如表2中所示，相比於DEAE-瓊脂糖樹脂，此等基於非多醣之載體增加毒素純度及產率，

°使用苯基瓊脂糖進行之HIC

*使用丁基S瓊脂糖進行之HIC

ND²因樣品負載期間之問題而未計算產率

使用來自實質上如此實例中所描述而培養之困難梭菌的20L過濾培養液來比較兩種純化程序：(i)第一純化程序使用丁基HIC瓊脂糖以用於HIC步驟及Tosoh Q樹脂以用於AEX步驟；及(ii)第二純化程序使用苯基HIC瓊脂糖以用於HIC步驟及DEAP瓊脂糖以用於AEX步驟。藉由SDS-PAGE來評估純度。藉由第一過程來純化之毒素A及B的純度分別>97%及為95%。在於25℃下儲存一週之後，此等毒素顯示良好穩定性且純度無變化。毒素甚至在不含檸檬酸鹽之緩衝劑中仍穩定。使用第二過程之毒素純度較小(例如毒素A為76%，且毒素B為28%)。此等毒素在於4℃下儲存一週之後的穩定性不佳。

HIC及AEX之次序

交替HIC及AEX層析步驟之次序以評估對產率及純度之影響。首先藉由AEX層析(使用Tosoh Q樹脂)來純化澄清收集物，且藉由HIC層析(使用Fractogel丙基樹脂)來進一步純化所得毒素A及毒素B產物。使用線性梯度，自AEX管柱觀測到具有基線解析度之兩個溶離峰。藉由SDS-PAGE之分析確定第一溶離峰對應於毒素A且第二溶離峰對應於毒素B。各峰之污染物型態明顯不同。合併來自各峰之溶離份以產生用於藉由HIC來進一步純化的毒素A及毒素B起始材料。各HIC分離均觀測到一個主要溶離峰，且峰溶離份在藉由SDS-PAGE分析時顯示主要為毒素A或毒素B。此研究之結果顯示(i)來自澄清收集物之毒素A及B可分離至達到基線解析度，及(ii)個別毒素可在丙基樹脂上進一步經純化及精製。

使用丁基S瓊脂糖之HIC及使用Tosoh Q之AEX

確立使用丁基HIC瓊脂糖以用於HIC步驟及Tosoh Q樹脂以用於AEX步驟的純化過程(圖1)。進行多次大規模操作(160L或160L以上)。毒素A及B的如由SDS PAGE評估之純度分別為平均約98%及97%。毒素A及B的平均產量分別為0.024及0.12公克毒素/公升醱酵液(例如含有山梨糖醇)，其表示增加為使用描述於實例1中之過程而獲得之產量的3-5倍。在1000L及2000L操作中獲得類似產量及純度結果。因此，用丁基S取代苯基瓊脂糖以用於HIC及用Tosoh Q取代DEAP以用於AEX提供毒素A及毒素B之良好純度及回收率(部分地歸因於山梨糖醇在培養基中之摻雜)。後續研究使用丁基S以用於HIC及Tosoh Q以用於在未向樣品或緩衝劑中添加任何DTT且在AEX溶離緩衝劑中使用MgCl₂之情況下進行的AEX，該等研究進一步改良純度且減少毒素降解。

毒素之失活

藉由用甲醛處理來使如上文所述而純化之毒素A及B失活。向毒素A透濾液及毒素B透濾液中之每一者中無菌添加37%甲醛溶液，以獲得約0.2%-0.4%之最終濃度。混合溶液，且隨後在約25℃下儲存6至13天。在失活之後，將毒素透濾液透析至調配物緩衝劑中，且如實例3中所描述進行活體內分析。

實例3

實質上根據陳述於實例2中之方法來製備經純化之困難梭菌類毒素A及困難梭菌類毒素B，且調配為疫苗組合物。以3：2之重量比組合類毒素A及B，與包含蔗糖(4.0%至8.0% w/v)及甲醛(0.012%至0.020% w/v)之檸檬酸鹽緩衝劑一起調配，且凍乾。用稀釋劑復原各組合物，且與氫氧化鋁佐劑混合，隨後用作疫苗。敍利亞金倉鼠提供用於困難梭菌疫苗發育之嚴格模型。在用單一腹膜內(IP)劑量之克林達黴素抗生素預處理之後，且在接受胃內(IG)接種產毒困難梭菌生物體之後，倉鼠快速出現突發腹瀉及出血性盲腸炎，且在兩至四天內死亡(例如未進行疫苗接種)。復原疫苗含有100微克/劑量類毒素、0.008%甲醛及400微克/劑量鋁。藉由用不同劑量之困難梭菌疫苗(人類劑量(100微克/劑量)之4倍稀釋液(HD))的三次肌肉內免疫接種(在第0天、第14天及第27天)對倉鼠(9隻倉鼠/組)接種疫苗，或用安慰劑(AlOH)注射。在第41天，藉由IP途徑用化學形式之克林達黴素-2-磷酸鹽抗生素以10mg/kg預處理倉鼠。在第42天，在用抗生素預處理28小時之後，藉由IG途徑用致死性劑量的來源於困難梭菌ATCC43255菌株之孢子製劑攻擊倉鼠。藉由量測與困難梭菌感染相關之症狀的出現期動力學及致死率來評估保護性療效。結果展示，疫苗以劑量依賴性方式保護倉鼠不受困難梭菌產毒細菌之致死性攻擊的影響，其中藉由用劑量HD/20(在100μg/mL AlOH存在下之5μg類毒素A+B)之疫苗接種誘導100%保護(圖2)。保護經免疫之動物不受死亡及疾病(體重減輕及腹瀉)影響。此研究之結果為若干活體內研究之代表。相應地，藉由所揭示之方法製備的類毒素提供針對困難梭菌疾病之保護性免疫性。

雖然已以較佳實施例形式描述於中某些實施例，但應理解熟習此項技術者將意識到變化及修飾。因此，希望所附申請專利範圍覆蓋出現在以下申請專利範圍之範疇內的所有該等等效變化。

Claims

一種用於產生經純化之困難梭菌(C.difficile)毒素的方法，該方法包含：a)將包含困難梭菌毒素之不純水溶液施加於疏水性相互作用載體上，以使困難梭菌毒素結合至其上；b)自該疏水性相互作用載體溶離該已結合之困難梭菌毒素；c)將來自步驟(b)的該經溶離之困難梭菌毒素施加於選自由以下各者組成之群的陰離子交換載體上：(i)具有四級胺官能基之聚甲基丙烯酸酯；及(ii)具有四級胺官能基之聚醚碸膜，以使困難梭菌毒素結合至其上；及d)自該陰離子交換載體溶離該已結合之困難梭菌毒素。
如請求項1之方法，其進一步包含在步驟(a)之前使該包含困難梭菌毒素之不純水溶液接受切向流過濾。
如請求項1或2之方法，其進一步包含在步驟(d)之後回收經純化之困難梭菌毒素。
如請求項1至3中任一項之方法，其中該毒素為困難梭菌毒素A。
如請求項1至3中任一項之方法，其中該毒素為困難梭菌毒素B。
如請求項1至5中任一項之方法，其中該疏水性相互作用載體為附接有丁基S基團之基質或附接有丙基之基質。
如請求項6之方法，其中該疏水性相互作用載體為附接有丙基之基質，且在硫酸銨存在下將該不純水溶液施加於該疏水性相互作用載體上。
如請求項8之方法，其中在約0.8至約1.0M硫酸銨存在下將該不純水溶液施加於該疏水性相互作用載體上。
如請求項1至5、8或9中任一項之方法，其中步驟(b)在不存在有機溶劑之情況下進行。
如請求項6之方法，其中該疏水性相互作用載體為附接有丁基S基團之瓊脂糖樹脂。
如請求項6或11之方法，其中在步驟(a)及(b)之後，回收該不純水溶液中的約70%之該毒素A及/或約90%之該毒素B。
如請求項6、11或12中任一項之方法，其中步驟(b)在不存在有機溶劑之情況下進行。
如請求項1之方法，其中該包含困難梭菌毒素之水溶液包含困難梭菌毒素A及困難梭菌毒素B，且在步驟(c)中，困難梭菌毒素A及困難梭菌毒素B自該陰離子交換載體個別地溶離。
如請求項1至14中任一項之方法，其中該陰離子交換載體為基於非多醣之材料。
如請求項15中任一項之方法，其中該陰離子交換載體為結合有四級胺官能基之聚甲基丙烯酸酯樹脂。
如請求項16中任一項之方法，其中該陰離子交換載體包含強陰離子交換劑，其中R為聚合物之部分-O-R-N⁺-(CH₃)₃；及/或該陰離子交換載體為Tosoh Super Q 650M。
如請求項14至17中任一項之方法，其中使用低鹽緩衝劑來溶離毒素A。
如請求項19之方法，其中毒素A該低鹽緩衝劑包含2至約32mM MgCl₂或約125至約160mM NaCl。
如請求項14至17中任一項之方法，其中使用高鹽緩衝劑來溶離毒素B。
如請求項20之方法，其中該高鹽緩衝劑包含約120至約150mM MgCl₂或約450至約550mM NaCl。
如請求項1至21中任一項之方法，其中該困難梭菌毒素之不純水溶液藉由以下各者來獲得：使困難梭菌細胞在生長培養基中生長以提供含有困難梭菌毒素及生長細胞之培養液，及自該等生長細胞分離該培養液以提供該困難梭菌毒素之不純水溶液。
如請求項22之方法，其中該生長培養基包含山梨糖醇。
一種經純化之困難梭菌毒素，其根據如請求項1至12中任一項之方法來獲得，其中該經純化之困難梭菌毒素的純度為約90%或90%以上。
如請求項24之經純化之困難梭菌毒素，其中該毒素之純度為約94%或94%以上。
如請求項25之經純化之困難梭菌毒素，其中該毒素之純度為約98%或98%以上。
如請求項26之經純化之困難梭菌毒素A，其純度為約99%或99%以上。
如請求項24之經純化之困難梭菌毒素，其中該毒素為困難梭菌毒素A。
如請求項24之經純化之困難梭菌毒素，其中該毒素為困難梭菌毒素B。
一種經純化之困難梭菌毒素，其根據如請求項1至23中任一項之方法來獲得，其中該經純化之困難梭菌毒素實質上不含溶劑。
一種經純化之困難梭菌毒素，其根據請求項1至23中任一項來獲得，其中該經純化之困難梭菌毒素不具有可偵測之醇脫氫酶。
如請求項1至23中任一項之方法，其進一步包含用化學劑使經回收的經純化之困難梭菌毒素失活以提供困難梭菌類毒素。
如請求項32之方法，其中用甲醛使該經回收的經純化之困難梭菌毒素失活以提供困難梭菌類毒素。
一種困難梭菌類毒素，其根據如請求項32或33之方法來獲得。
如請求項34之困難梭菌類毒素，其中該類毒素為類毒素A或類毒素B。
一種組合物，其包含如請求項34或35之困難梭菌類毒素。
一種組合物，其包含如請求項34或35之困難梭菌類毒素及醫藥學上可接受之賦形劑。
如請求項36或37之組合物，其中該困難梭菌類毒素為類毒素A或類毒素B。
如請求項36或37之組合物，其以3：2之重量比包含困難梭菌類毒素A及困難梭菌B。
一種誘發個體中免疫反應之方法，該方法包含向該個體投與如請求項36至39中任一項之組合物。
一種預防或治療個體中症狀性困難梭菌感染之方法，該方法包含向該個體投與如請求項36至39中任一項之組合物。
如請求項41之方法，其中該個體不具有症狀性困難梭菌感染之症狀但具有出現該感染之風險。
如請求項41之方法，其中該個體具有症狀性困難梭菌感染。