TW201442740A - 具有螢光放射性與近紅外光光感性的複合奈米粒子及其製備方法 - Google Patents

具有螢光放射性與近紅外光光感性的複合奈米粒子及其製備方法 Download PDF

Info

Publication number
TW201442740A
TW201442740A TW102116346A TW102116346A TW201442740A TW 201442740 A TW201442740 A TW 201442740A TW 102116346 A TW102116346 A TW 102116346A TW 102116346 A TW102116346 A TW 102116346A TW 201442740 A TW201442740 A TW 201442740A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
fluorescence
infrared light
radioactivity
composite nanoparticle
light sensitivity
Prior art date
Application number
TW102116346A
Other languages
English (en)
Other versions
TWI476015B (zh
Inventor
Dong-Hwang Chen
Bo-Hung Lai
Original Assignee
Univ Nat Cheng Kung
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Nat Cheng Kung filed Critical Univ Nat Cheng Kung
Priority to TW102116346A priority Critical patent/TWI476015B/zh
Publication of TW201442740A publication Critical patent/TW201442740A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI476015B publication Critical patent/TWI476015B/zh

Links

Landscapes

  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Luminescent Compositions (AREA)

Abstract

一種具有螢光放射性與近紅外光光感性的複合奈米粒子，其包含一經摻雜的二氧化矽殼層，以及一批覆該經摻雜的二氧化矽殼層的六硼化鑭核心粒子。所述的具有螢光放射性與近紅外光光感性的複合奈米粒子易於製造且具有優良的近紅外光轉換屬性以及螢光標記，且沒有明顯的細胞毒性，當被攝入細胞後，經近紅外光照射會發生光熱轉換，而導致顯著的細胞死亡發生，因此可以應用於螢光顯影以及近紅外光促發的光熱治療。

Description

具有螢光放射性與近紅外光光感性的複合奈米粒子及其製 備方法
本發明有關於一種複合奈米粒子，尤指包含六硼化鑭的複合奈米粒子，其兼具螢光放射性與近紅外光光感性，可應用於螢光顯影以及光熱治療。
光熱治療(photothermal therapy)係利用光敏劑吸收光轉換為熱能後殺死癌細胞的技術，在過去十年電漿子奈米材料(plasmonic nanomaterial)在近紅外光(near-infrared,NIR)光熱治療的應用受到越來越多的關注。目前研究中用於近紅外光光熱治療之具有高近紅外光吸收(NIR absorption)特性之電漿子奈米材料主要包括金奈米棒、金奈米球殼、金奈米籠、單壁或多壁奈米碳管、石墨烯或部分還原的氧化石墨烯等，其中以金的奈米材料最受矚目。值得注意的是，六硼化鑭也是類似的金屬的電漿子奈米材料。經過研磨後尺度達到納米級，使得表面電漿子具有高強度的近紅外光吸收。申請人先前的研究發現六硼化鑭(LaB6)奈米粒子透過表面電漿共振(surface plasmon resonance)呈現優於奈米金的近紅光線光吸收能力，且具有光熱轉換特性，因而可應用各種相關領域，其中包括醫學 領域的光熱治療，且基於六硼化鑭的低廉價格，使其確實具有產業競爭力。
雖然六硼化鑭具有應用於光熱治療應用之潛力，然而其對於細胞的毒性尚未有足夠之試驗確認。此外，若能將具有螢光放射性與近紅外光光感性材料結合，可於誘發奈米材料發生光熱轉換前，先確認所述的奈米材料是否已經有效為細胞所攝取，並得知其進入生體後組織內部分布之情況，可先評估照射位置與劑量，並藉以適當調整
近年來，由於量子點具有高螢光亮子產率，因此已廣泛被用於生物醫學顯影和診斷。然而目前用於生物醫學顯影的高螢光量子點大部分是由有毒元素(鎘，硒，碲等)組成。二氧化矽已被廣泛用於改善的穩定性和生物相容性的奈米粒子的表面塗層。此外，可藉由簡單的修飾使表面具有胺類、硫醇類、或羧基基團等與生物分子產生共價鍵結。常見的STÖBER法合成二氧化矽是由四乙氧基矽烷(TEOS)的水解與縮合而成此方法製得的二氧化矽是不具有螢光。因此，在近幾年發展具螢光的二氧化矽已有相當大的成效，利用摻雜螢光基團或披覆螢光層的方式，使二氧化矽具有螢光。此外，也可在二氧化矽進行水解-縮合過程中添加烷氧基矽烷或羧酸，並經由熱處理使二氧化矽網狀結構中產生缺陷如碳缺陷或氧相關的缺陷。然而，使二氧化矽具有螢光仍需考量摻雜物與二氧化矽之含量比例關係，以及其最終螢光放射波長之影響。
基於上述可知，現有技術尚未有應用二氧化矽之產生螢光之性質且同時又可達到光熱轉換特性的技術， 且如何調整螢光與光熱轉換之性質不至於相互干擾而影響螢光顯影與光熱治療之應用效果，因此兼具有螢光放射性與近紅外光光感性的材料以供進行治療前的分析以及光熱轉換效應之發生的技術具有實用價值且仍亟待發展。
有鑒於現有技術的前述缺點，本發明之目的在於提供一種兼具有螢光放射性與近紅外光光感性的複合奈米粒子，其於特定的吸收波長的激發下，可放射螢光，以用於螢光顯影偵測奈米粒子位置與數量；且其具有高度的光熱轉換能力，能夠令細胞死亡，藉以有效的應用光熱治療。
基於上述，本發明提供一種具有螢光放射性與近紅外光光感性的複合奈米粒子，其包含一經摻雜的二氧化矽殼層，以及一批覆該經摻雜的二氧化矽殼層的六硼化鑭核心粒子。
依據本發明，所述的經摻雜的二氧化矽殼層係主要由二氧化矽所構成，其係摻雜有任一能令整體經摻雜的二氧化矽殼層具有螢光放射性之物質。所述的經摻雜的二氧化矽殼層係例如，但不限於：含有碳摻雜與氧缺陷的二氧化矽。較佳的，所述的經摻雜的二氧化矽殼層係由碳摻雜與氧缺陷的二氧化矽所構成。
經摻雜的二氧化矽殼層係可藉由鹼性環境下利用溶膠凝膠法製得二氧化矽奈米粒子具有較均一粒子大小與較平滑表面。進一步，在溶膠凝膠過程加入摻雜成分，諸如碳源，具體而言，為氨基丙基三乙氧基矽烷 (3-aminopropyl triethoxy silane,APTES)，並經由熱處理方式可產生碳摻雜與氧缺陷之二氧化矽，而具有藉由適當激發光刺激而產生螢光之特性。
為了達到較佳的量子產率，較佳的，所述的該經摻雜的二氧化矽殼層的摻雜成分與二氧化矽的莫耳百分比介於9%至27%之間。更佳的，所述的該經摻雜的二氧化矽殼層係由碳摻雜的二氧化矽所構成，該經摻雜的二氧化矽殼層的碳矽莫耳百分比係為12%至21%之間。特定的，該經摻雜的二氧化矽殼層的碳矽莫耳百分比係約為18%。
依據本發明，所述的六硼化鑭核心粒子係包含六硼化鑭的顆粒，較佳的，為顆粒狀的六硼化鑭，其具有近紅外光光感性，所述的近紅外光光感性係指向具有高度紅外光吸收能力，進一步能將所吸收的光能轉換成熱能。
較佳的，所述的六硼化鑭核心粒子的平均粒徑約為40 nm至300 nm；較佳的，為60 nm至200 nm；更佳的為80 nm至150 nm；又更佳的，為90 nm至120 nm。較佳的，所述的經摻雜的二氧化矽殼層之厚度大約為10 nm至50 nm；更佳的，為20 nm至45 nm；又更佳的，為30 nm至40 nm。
依據本發明，所述的經摻雜的二氧化矽殼層的厚度與該六硼化鑭核心粒子的平均半徑之比例為1：3至1：5，藉以產生所欲之螢光放射能力以及光熱轉換效率。
依據本發明，所述之具有螢光放射性與近紅外光光感性的複合奈米粒子具有一特性吸收峰介於1000 nm至1100 nm之間，並且具有特性放射波長介於400 nm至500 nm之間。
依據本發明，所述的具有螢光放射性與近紅外光光感性的複合奈米粒子之XRD光圖譜，具有十個明顯的特性峰(2θ=21.3、30.4、37.4、43.5、49.0、54.0、63.2、67.6、71.8、75.9°)分別是六硼化鑭的(100)、(110)、(111)、(200)、(210)、(211)、(220)、(300)、(310)與(311)晶面；在2θ約23°處的寬廣特性峰，則屬於非晶態的二氧化矽所有。
依據本發明，所述之具有螢光放射性與近紅外光光感性的複合奈米粒子於FTIR光譜具有1537 cm-1的特性峰，顯示其表面仍保留少許的NH2基，有利於後續的表面修飾或生物分子鍵結。舉例而言，所述之具有螢光放射性與近紅外光光感性的複合奈米粒子藉由表面的NH2基而與抗體共價性結合。
另一方面，本發明提供一種如前所述之具有螢光放射性與近紅外光光感性的複合奈米粒子之製造方法，其包含：提供一六硼化鑭核心粒子，以及於該六硼化鑭核心粒子之表面形成一經摻雜的二氧化矽殼層，藉以取得所述之兼具螢光放射與近紅外光光感性複合奈米粒子。
所述之具有螢光放射性與近紅外光光感性的複合奈米粒子之製造方法，其中令含矽前趨物與摻雜成分進行溶凝膠法反應係包含於鹼性或酸性環境下令含矽前趨物與摻雜成分進行溶凝膠法反應。
依據本發明，所述的鹼性環境係以鹼劑作為觸 媒，所述的鹼劑係例如，但不限於：氨水。
較佳的，依據本發明之具有螢光放射性與近紅外光光感性的複合奈米粒子之製造方法，其中該於該六硼化鑭核心粒子之表面形成一經摻雜的二氧化矽殼層之步驟係包括：提供一含矽前趨物與一摻雜成分，其中摻雜成分與含矽前趨物的莫耳比為0.01%至20%；以及，令含矽前趨物與摻雜成分於特定催化條件下進行溶凝膠法(sol-gel process)反應以及熱處理，藉以於該六硼化鑭核心粒子之表面形成該經摻雜的二氧化矽殼層。
所述的摻雜成分與含矽前趨物的莫耳比為0%~12%；較佳的，為5%~7%；特定的為3%、6%與9%，其中以摻雜成分與含矽前趨物的莫耳比為6%者為佳。
依據本發明，所述的含矽前趨物，如此領域中所知者，係為提供矽來源而可藉由溶凝膠法反應形成矽聚合物之物質，例如，但不限於：四甲氧矽烷(tetramethoxysilane,TMOS)、矽酸四乙酯(tetraethyl orthosilicate,TEOS)、四丁氧矽烷(tetrabutoxylsilane,TBOS)或氨基丙基三乙氧基矽烷(3-aminopropyl triethoxy silane,APTES)。
如此領域所知者，所述的摻雜成分係任何可令含矽前趨物經適當反應後所形成之聚合物具有螢光放射能力之物質。以溶凝膠法與熱處理反應所形成矽聚合物而言，有機酸可以是形成碳摻雜與氧缺陷之較佳的摻雜成分。較佳的，所述的摻雜成分為氨基丙基三乙氧基矽烷 (3-aminopropyl triethoxy silane,APTES)或其它含碳之矽烷如3-(三乙氧矽烷基)丙基琥珀酸酐[3-(Triethoxysilyl)propylsuccinic anhydride,TESPSA]等。
較佳的，摻雜成分與含矽前趨物的莫耳比為3%至9%。更佳的，摻雜成分與含矽前趨物的莫耳比為5%至7%，藉以產生所欲之螢光放射能力以及光熱轉換效率。
如此領域中所知者，所述的熱處理，以一提高的溫度令經如溶凝膠法反應形成矽聚合物反應，以形成所欲的經摻雜的二氧化矽殼層；較佳的，熱處理是以200至500℃溫度下進行；更佳的，熱處理是以250至400℃溫度下進行。特定的，熱處理是350℃溫度下進行。
所述的具有螢光放射性與近紅外光光感性的複合奈米粒子易於製造且具有優良的近紅外光轉換屬性，且經適當激發可發射螢光，且沒有明顯的細胞毒性，當被攝入細胞後，經近紅外光照射，導致顯著的細胞死亡，因此可以應用於螢光顯影以及近紅外光促發的光熱治療。
圖1A是LaB6@C-SiO2奈米粒子之穿透式電子顯微鏡圖(transmission electron microscopy,TEM)；圖1B為LaB6@C-SiO2奈米粒子高解析TEM的X射線能量散佈分析圖(energy-dispersive X-ray spectroscopy,EDX)；圖2是LaB6@C-SiO2奈米粒子之X射線繞射(X-Ray diffraction,XRD)光譜圖；圖3是LaB6@SiO2與LaB6@C-SiO2奈米粒子熱 處理前後之界面電位圖；圖4是LaB6@SiO2與LaB6@C-SiO2奈米粒子熱處理前後之傅立葉轉換紅外線光譜分析儀(Fourier-transform infrared spectrometer,FTIR)光譜圖；圖5A是LaB6與LaB6@C-SiO2奈子粒子之吸收光譜圖；圖5B是LaB6與LaB6@C-SiO2奈子粒子螢光光譜圖；圖6例示說明近紅外光照射對磷酸鹽緩衝液(PBS)及其含LaB6@C-SiO2奈米粒子(250 μg/mL)時之溶液溫度的影響；圖7A例示說明不同LaB6@C-SiO2奈米粒子濃度對HeLa細胞培養72小時後之細胞存活率的影響；圖7B例示說明含LaB6@C-SiO2奈米粒子之PBS(250μg/mL)培養液照射波長808 nm雷射(740mW)不同時間對HeLa細胞存活率的影響；圖8例示說明培養液不含LaB6@C-SiO2奈米粒子(圖8A)及含LaB6@C-SiO2奈米粒子(250μg/mL)(圖8B)時，HeLa細胞在波長808nm雷射(740mW)照射不同時間後細胞存活的現象圖9例示說明HeLa細胞在不含LaB6@C-SiO2奈米粒子(a區至d區)、含LaB6@SiO2奈米粒子(250μg/mL)(e區~h區)以及含LaB6@C-SiO2奈米粒子(250μg/mL)(i區~l區)的培養液中培養24後以共軛焦顯微鏡觀察之影像，a區、e區、i區是於DAPI濾鏡下所呈現的細胞核狀況；b 區、f區、j區顯示於480 nm激發光下產生螢光以若丹明綠濾鏡(Rhodamine green filter)觀察細胞狀況；c區、g區、k區是以Alexa Fluor 647濾鏡紀錄細胞質之結果；d區、h區、l區分別是a-c區、e-g區以及i至k區重疊影像。
本發明將進一步藉由下面的實施例來作說明，但應明瞭的是，該等實施例僅為說明之用，而不應被視為本發明的實施上的限制。
製備例1 摻碳二氧化矽奈米粒子之製備
為決定二氧化矽奈米殼層適當之碳源含量與熱處理條件，首先以矽酸四乙酯(tetraethyloxysilane,TEOS)為前驅物，3-氨基丙基三乙氧基矽烷(3-aminopropyltriethoxysilane,APTES)為碳源，利用溶凝膠法製備摻碳之二氧化矽(C-SiO2)奈米粒子。在20 mL異丙醇溶劑中加入0.5 mL氨水和0.09M APTES/TEOS(莫耳比為0%、3%、6%與9%)，在30℃反應攪拌24小時，再以酒精清洗數次；然後，將所得粉體進行熱處理，以2℃/min的加熱速率加熱至250、300、350和400℃，得到淡黃色的碳摻雜二氧化矽粉體，比較不同APTES添加量與不同熱處理溫度所得產品的量子產率(QY)。量子產率係以Coumarin 1(QY：73%)為標準染料，根據式(1-1)計算而得。結果如表1所示，當摻混6% APTES及熱處理溫度350℃時所得產品具有最佳的量子產率。
其中Φ為量子產率，I是測量的整體發射強度(measure integrated emission intensity)，n是折射係數(refractive index)，酒精為1.36，而A是光學強度(optical density)，而下標r是指已知量子產率的參考螢光團(reference fluorophore of known quantum yield)。
所述的該碳摻雜的二氧化矽殼層的碳與二氧化矽的莫耳百分比大約介於9%至27%之間，其中以約18%為佳。
製備例2 具有螢光放射性與近紅外光光感性的複合奈米粒子的製備
在下述實施例中表面被覆摻碳二氧化矽之六硼化鑭奈米粒子被使用作為具有螢光放射性與近紅外光光感性的複合奈米粒子，其詳細的製備步驟如下：首先以濕式研磨分散技術(研磨轉速2500rpm、研磨6小時)製備出平均粒徑約100 nm之六硼化鑭奈米粒子，在下述實施例中作 為對照組。其次，依據上述表1所得最佳條件，以溶凝膠法製備LaB6@C-SiO2奈米粒子。在20 mL含六硼化鑭奈米粒子(1 mg/mL)的異丙醇分散液中加入0.09 M APTES/TEOS(6 mol%)與0.5 mL氨水，在30℃反應攪拌24小時，再以酒精清洗數次，然後進行熱處理，以2℃/min的加熱速率加熱至350℃，形成表面被覆摻碳二氧化矽之六硼化鑭奈米粒子(註記為LaB6@C-SiO2奈米粒子)被使用於下述的實施例中。
實施例1 表面被覆摻碳二氧化矽之六硼化鑭奈米粒子的物性鑑定
以高解析穿透式電子顯微鏡(transmission electron microscopy,TEM)分析LaB6@C-SiO2奈米粒子粒徑與形態，以X射線能量散佈分析(energy-dispersive X-ray spectroscopy,EDX)儀分析其組成，以動態光散射儀(dynamic light scattering,DLS)分析其水力直徑，以X射線繞射(X-Ray diffraction,XRD)儀分析其晶格結構，以傅立葉轉換紅外線光譜分析儀(Fourier-transform infrared spectrometer,FTIR)分析其表面組成，以界面電位儀(zeta potential meter)鑑定LaB6@C-SiO2奈米粒子表面修飾後的電位變化，以紫外光/可見光/紅外光光譜儀分析其吸收光譜，以螢光光譜儀分析其經由紫外光激發所產生的螢光光譜。
圖1A為典型之LaB6@C-SiO2奈米粒子TEM圖，顯示所得粒子大致上具有良好的分散性，且二氧化矽確實被覆在表面上，至於不規則的形態，則是因核心六硼化鑭奈米粒子係研磨而得所致。
圖1B為LaB6@C-SiO2奈米粒子的高解析TEM的EDX線掃描分析圖，可顯示二氧化矽與六硼化鑭的構成元素Si與B的分佈，得知核心與殼層分別由六硼化鑭與二氧化矽所組成，確認其殼核結構，且二氧化矽殼層厚度約30~40 nm。此外，由DLS分析得知，LaB6@C-SiO2奈米粒子的平均水力直徑約為134.6±21nm，扣除LaB6奈米粒子的平均直徑100 nm，二氧化矽殼層平均厚度約35 nm，與TEM分析結果相當吻合。
圖2所示為LaB6@C-SiO2奈米粒子之XRD光圖譜，十個明顯的特性峰(2θ=21.3、30.4、37.4、43.5、49.0、54.0、63.2、67.6、71.8、75.9°)分別是六硼化鑭的(100)、(110)、(111)、(200)、(210)、(211)、(220)、(300)、(310)與(311)晶面。在2θ約23°處的寬廣特性峰，則屬於非晶態的二氧化矽所有，佐證二氧化矽已被覆於六硼化鑭奈米粒子表面。
由於被覆摻碳二氧化矽的溶凝膠反應過程中係添加APTES為碳源，因此由界面電位與FTIR的分析鑑定APTES是否被成功摻入二氧化矽中，結果如圖3所示，其中未摻APTES之LaB6@SiO2與摻APTES之LaB6@C-SiO2奈米粒子在熱處理前後之界面電位圖，由其可知，在熱處理前，摻入APTES所得粒子表面等電點位約為pH 8.0，而未摻入APTES者則為pH 2.5。熱處理後，前者的等電點由pH 8.0降低至pH 3.6，而後者則仍維持在pH 2.5。由界面電位的變化可看出，摻入APTES可使二氧化矽殼層表面具有NH2官能基，故表面電位提高至pH 8.0。熱處理後，雖然大部分的NH2官能基消失，但與未摻入APTES之二氧化 矽殼層比較下，其表面仍保留少許的NH2基，有利於後續的表面修飾或生物分子鍵結。
如圖4所示，未摻APTES之LaB6@SiO2與摻APTES之LaB6@C-SiO2奈米粒子在熱處理前後之FTIR光譜圖，所有情況都顯示在1060、952、796 cm-1處有二氧化矽的Si-O-Si與Si-OH官能基特性峰，但摻入APTES所得粒子在熱處理前後於1537 cm-1處皆出現屬於NH2官能基的新特性峰，而未摻入APTES者則無此特性峰出現。此結果也佐證了APTES可成功摻入二氧化矽殼層中。
圖5A為LaB6與LaB6@C-SiO2奈子粒子之吸收光譜圖，六硼化鑭奈米粒子(註記為LaB6)在近紅外光波長區段1000~1100 nm處呈現特性吸收峰，在被覆摻碳之二氧化矽後，由於純二氧化矽在400~1200 nm之間並無顯著的特性吸收峰，故仍保留其吸收特性，僅略為紅位移而已。此意味著六硼化鑭奈米粒子的近紅外光光熱轉換特性，在被覆摻碳之二氧化矽後，應該也可以獲得保留。
圖5B為LaB6與LaB6@C-SiO2奈子粒子之螢光光譜圖，在被覆摻碳之二氧化矽前，六硼化鑭奈米粒子分散於水中，在波長360 nm紫外光照射下並無螢光產生；但在被覆摻碳之二氧化矽後，在波長360 nm紫外光照射下會產生波長400~500 nm的藍色螢光，在波長480nm藍光照射下會產生波長500~550 nm的螢光。此乃由於摻碳二氧化矽殼層經過熱處理後，會在-O-Si-O-網狀結構中產生碳的缺陷形成-O-C-O-或-Si-C-鍵結。LaB6奈米粒子與LaB6@C-SiO2奈米粒子在白光照射下溶液顏色皆呈現 綠色，但在紫外光照射下，LaB6奈米粒子並無螢光產生，而LaB6@C-SiO2奈米粒子則發出顯著的藍色螢光，證明所得LaB6@C-SiO2奈米粒子確實具有螢光特性。
光熱轉換效應係當奈米粒子經由一脈衝雷射照射下，其內部電子吸收脈衝雷射能量而產生表面電漿共振吸收，此時因電子集體振盪而產生熱能，並藉由聲子間散射機制將熱能傳遞給晶格，最後再由晶格將熱能傳遞給環境介質而達到熱釋放。為了解LaB6@C-SiO2奈子粒子的近紅外光光熱效果，取100 μL含LaB6@C-SiO2奈米粒子之PBS(250μg/mL)加入96孔盤中，於波長808 nm雷射(740 mW)光源下照射10分鐘，利用紅外線熱像儀偵測溶液溫度變化。
結果如圖6所示，含有LaB6@C-SiO2奈米粒子的PBS溶液溫度由29.7℃升至50.2℃，其△T為20.5℃，而不含LaB6@C-SiO2奈米粒子的純PBS溫度僅由29.3℃略升至30.7℃，△T為1.4℃。此乃因六硼化鑭奈米粒子會吸收近紅外光而產生光熱效應，因此在含有LaB6@C-SiO2奈米粒子溶液中，會因粒子核心之六硼化鑭產生光熱效應而使溶液溫度顯著升高，若無LaB6@C-SiO2奈米粒子，則溶液溫度並無顯著變化。此結果證明了LaB6@C-SiO2奈米粒子確實保留了六硼化鑭奈米粒子的近紅外光光熱轉換特性。
實施例2 表面被覆摻碳二氧化矽之六硼化鑭奈米粒子的細胞毒性測試
由於尚未有文獻報導六硼化鑭對細胞的毒性，因此在進行癌細胞光熱治療前，首先探討LaB6@C-SiO2奈米粒子對細胞的毒性。以含不同LaB6@C-SiO2奈米粒子濃度(0、5、25、50、125與250 μg/mL)之PBS，進行對HeLa細胞的毒性測試，詳細的測試步驟如下所述。
在LaB6@C-SiO2奈米粒子體外細胞毒性測試研究，以人類子宮頸癌細胞作為分析對象，以WST-8試劑分析活細胞粒線體去氫酶(dehydrogenase)活性。將人類子宮頸癌細胞(HeLa cells)與細胞培養液(90% MEM+10%FBS)混合於培養皿中，置於37℃、5% CO2的培養箱中培養。首先將HeLa細胞與細胞培養液混合後加入96孔培養盤中(每一孔癌細胞數目為2000顆，總體積為100 μL)，放置於37℃、5% CO2的培養箱中24小時。培養後再以磷酸鹽緩衝液(PBS)清洗一次，接著在每一孔中加入100μL含有不同濃度LaB6@C-SiO2奈米粒子(0~250 μ/L)的新鮮細胞培養液，然後置於培養箱中72小時。培養後吸除孔中的細胞培養液，加入100 μL PBS溶液清洗兩次，接著每孔中各加入含有10% WST-8的新鮮細胞培養液100 μL，再置入37℃、5% CO2的培養箱中2小時，之後使用酵素免疫分析儀測量波長450 nm處的吸光值。
如圖7A所示，加入含有不同濃度LaB6@C-SiO2奈米粒子的PBS溶液在72小時後，HeLa細胞並無明顯毒性產生。即使濃度高至250 μg/mL時，細胞存活率都在80%以上，說明LaB6@C-SiO2奈米粒子在此濃度範圍並不會對HeLa細胞造成傷害。
實施例3 表面被覆摻碳二氧化矽之六硼化鑭奈米粒子的癌細胞光熱治療測試
本實施粒探討光熱治療對細胞存活率的影響，其一般的測試步驟如下所述。在定量分析方面，首先將HeLa細胞與細胞培養液混合後加入96孔培養盤中(每一孔癌細胞數目為5000顆，總體積為100 μL)，放置於37℃、5% CO2的培養箱中24小時。培養後再以PBS清洗一次，接著在每一孔中置換100 μL含有250 μg/mLLaB6@C-SiO2奈米粒子新鮮細胞培養液，然後置於培養箱中24小時。之後，以波長808 nm、2.47 W/cm2紅外線雷射照射，並改變不同照射時間(0、4、6、8、10、12分鐘)，探討照射時間對細胞光熱治療的影響。照射後吸除孔中的細胞培養液，加入100 μL PBS溶液清洗兩次，接著每孔中各加入含有10% WST-8的新鮮細胞培養液100 μL，再置入37℃、5% CO2的培養箱中1.5小時，之後使用酵素免疫分析儀測量波長450 nm處的吸光值。
在定性分析方面，按照上述的程序將HeLa細胞與LaB6@C-SiO2奈米粒子(250 μg/mL)一起培養，不同的是使用的24孔微盤與細胞密度為每孔5×104個細胞。後用PBS清洗以去除奈米粒子，並利用鈣黃綠素AM(Calcein AM)與乙錠二聚體(Ethidium homodimer-1,EthD-1)測量細胞的存活，其中無螢光性之Calcein AM會被活細胞之酯酶(esterase)轉化為具螢光性之Calcein，因此在螢光顯微鏡下活細胞在藍光照射後會呈現綠色。而EthD-1為一種核酸染料會進入死細胞中並與死細胞的DNA結合後其螢光 會增強四十倍，故死細胞於綠光照射後在螢光顯微鏡下會呈現紅色。將0.1 mL的PBS含有2 μM Calcein AM和4 μM EthD-1加入到各孔，並置入於37℃，5% CO2的培養箱中0.5小時。於螢光顯微鏡下觀察癌細胞存活情形。
針對光熱治療對細胞存活率的影響，將100 μL含LaB6@C-SiO2奈米粒子之PBS(250 μg/mL)加入事先鋪好HeLa細胞的96孔盤中，再以波長808 nm雷射(740 mW)分別照射0、4、6、8、10與12分鐘，以WST-8偵測細胞存活率。結果如圖7B所示，細胞存活率隨著雷射照射時間的增加而降低。照射時間為4、6、8、10、12分鐘時，細胞存活率分別為56.7、49.7、25.8、16.5、7.64%。此乃因增加雷射照射時間將使LaB6@C-SiO2奈米粒子光熱轉換所產生的熱能也隨之增加，導致細胞存活率因溶液溫度持續上升而下降。
以實際觀察細胞影像來探討光熱治療對細胞的影響，先將1 mL含LaB6@C-SiO2奈米粒子之PBS(250 μg/mL)加入事先鋪好HeLa細胞的24孔盤中，再以波長808 nm雷射(740 mW)分別照射0、4、6、8、10與12分鐘，以LIVE/DEAD ® Kit細胞染色試劑對活細胞與死亡細胞染色，藉由螢光顏色區分細胞的存活。光熱治療後HeLa細胞經過鈣黃綠素AM(Calcein AM)及乙錠二聚體(Ethidium homodimer-1)染色成像，鈣黃綠素能滲透進活體細胞內被酯酶水解，經藍光激發後可發出綠色螢光，而乙錠只能滲透入死亡細胞中將核酸染色經綠光激發後可放出紅色螢光，結果如圖8A及圖8B所示。圖8A為不含LaB6@C-SiO2奈米 粒子的控制組，HeLa細胞單獨經過雷射照射0~12分鐘後，HeLa細胞都還存活，並無明顯死亡的情形，可知只以雷射照射並不會造成HeLa細胞死亡。圖8B為光熱治療組，當培養液含有LaB6@C-SiO2奈米粒子時，經過不同照射時間可明顯看到細胞的死亡，在照射4分鐘時已有細胞死亡，隨著照射時間增加，細胞死亡的現象更加明顯。由此可知，LaB6@C-SiO2奈米粒子確實具有近紅外光光熱治療的效果。
實施例4 表面被覆摻碳二氧化矽之六硼化鑭奈米粒子的癌細胞顯影測試
為進一步了解LaB6@C-SiO2奈米粒子是否真能在可見光照射下會發出螢光，以應用於細胞顯影，故配合以DAPI進行細胞核染色，分析細胞顯影狀況，利用觀察螢光顏色的差異可使LaB6@C-SiO2奈米粒子於細胞中顯影。實驗利用共軛焦螢光顯微鏡觀察HeLa細胞在不含LaB6@C-SiO2奈米粒子及含LaB6@C-SiO2奈米粒子(250 μg/mL)的培養液中培養24小時後的情形，其詳細測試步驟如下所述。
在24孔微盤中放置原型玻片，並取約10萬顆人類子宮頸癌細胞舖在含有10% FBS的MEM的24孔微量盤中，置入37℃、5% CO2的培養箱中24小時後。然後將細胞培養液置換0.5 mL含有250 μg/mL LaB6@C-SiO2奈米粒子的新鮮培養液，再置入37℃、5% CO2的培養箱中24小時。最後以PBS清洗，加入4%福馬林進行固定，在室溫下作用10分鐘後再以PBS清洗三次，每次5分鐘。以含有0.5% Triton X-100的PBS對細胞進行穿孔 作用，在室溫下作用30分鐘後以PBS清洗三次，每次5分鐘。接著用2%牛血清球蛋白(bovine serum albumin,BSA)配於PBST在室溫下作用60分鐘後進行阻隔(blocking)。最後將初級抗體(anti-α tubulin,mouse monoclonal IgG2a,Senta Cruz,2 μg mL-1 in PBST with 2% PBST)於室溫下作用60分鐘，再用PBST清洗三次，每次5分鐘，再以二級抗體(Alexa Flour 647 goat anti-mouse IgG,invitrogen)(4μg/mL)於室溫下作用45分鐘，再以PBST清洗三次，每次五分鐘，接著與4',6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(4’,6’-diamino-2-phenylindole.2HCl,DAPI)(0.1 μg/mL-1)作用10分鐘，用以染色細胞核，然後以共軛焦顯微鏡(Olympus,FV1000)觀察細胞並拍照。
結果如圖9所示，其中a~d區為不含LaB6@C-SiO2奈米粒子以及e~h區為含LaB6@SiO2奈米粒子(250μg/mL)的對照組，i~l區為含LaB6@C-SiO2奈米粒子(250μg/mL)為實驗組。a區、e區、i區因DAPI對細胞核染色而形成藍色螢光。j區通過480 nm藍光激發材料產生螢光，顯示LaB6@C-SiO2奈米粒子會經由細胞吞噬效應而進入細胞質中，而對照組b區、f區則無任何螢光產生。由此證明，LaB6@C-SiO2奈米粒子確實具有螢光顯影之功能。
在本發明中，因為六硼化鑭核心粒子其相對較低的價格，且易於製備，再加上其優良的近紅外光熱轉換屬性，使得本發明可作為近紅外光熱治療奈米材料。此外，六硼化鑭核心粒子的表面被覆碳摻雜氧化矽(C-SiO2)的外殼同時提供的螢光性能和提高材料的穩定性和生物相容 性。依據本發明的具有螢光放射性與近紅外光光感性的複合奈米粒子具有優異的近紅外光熱轉換性能，在可見光照射下，呈現出藍色發光。在人類子宮頸癌細胞系統中，證實六硼化鑭被覆碳摻雜二氧化矽奈米粒子沒有明顯的細胞毒性，而於近紅外光照射後，可導致顯著的細胞死亡發生。另外，從細胞攝取試驗中，亦證實本發明的具有螢光放射性與近紅外光光感性的複合奈米粒子的螢光標記的功能。這些結果表明，依據本發明的具有螢光放射性與近紅外光光感性的複合奈米粒子可以作為一個有效的平台，應用作為螢光顯影和近紅外光誘發腫瘤細胞的光熱治療的多功能奈米材料。

Claims (15)

  1. 一種具有螢光放射性與近紅外光光感性的複合奈米粒子，其包含一經摻雜的二氧化矽殼層，以及一批覆該經摻雜的二氧化矽殼層的六硼化鑭核心粒子。
  2. 如請求項1所述之具有螢光放射性與近紅外光光感性的複合奈米粒子，其中經摻雜的二氧化矽殼層係含有碳摻雜與氧缺陷之二氧化矽。
  3. 如請求項1所述之所述具有螢光放射性與近紅外光光感性的複合奈米粒子，其中該經摻雜的二氧化矽殼層係由碳摻雜的二氧化矽所構成，該經摻雜的二氧化矽殼層的碳矽莫耳百分比係為9%至27%之間。
  4. 如請求項3所述之具有螢光放射性與近紅外光光感性的複合奈米粒子，其中該經摻雜的二氧化矽殼層係由碳摻雜的二氧化矽所構成，該經摻雜的二氧化矽殼層的碳矽莫耳百分比係為12%至21%之間。
  5. 如請求項1至4中之任一項所述之具有螢光放射性與近紅外光光感性的複合奈米粒子，其中經摻雜的二氧化矽殼層的厚度與該六硼化鑭核心粒子的平均半徑之比例為1：3至1：5。
  6. 如請求項5所述之具有螢光放射性與近紅外光光感性的複合奈米粒子，其具有一特性吸收峰介於1000 nm至1100 nm之間，並且具有特性放射波長介於400 nm至500 nm之間。
  7. 一種如請求項1所述之具有螢光放射性與近紅外光光感性的複合奈米粒子之製造方法，其包含： 提供一六硼化鑭核心粒子，以及於該六硼化鑭核心粒子之表面形成一經摻雜的二氧化矽殼層，藉以取得所述之兼具螢光放射與近紅外光光感性複合奈米粒子。
  8. 如請求項7所述之具有螢光放射性與近紅外光光感性的複合奈米粒子之製造方法，其中該於該六硼化鑭核心粒子之表面形成一經摻雜的二氧化矽殼層之步驟係包括：提供一含矽前趨物與一摻雜成分，其中摻雜成分與含矽前趨物的莫耳比為0.01%至20%；以及，令含矽前趨物與摻雜成分進行溶凝膠法反應以及熱處理，藉以於該六硼化鑭核心粒子之表面形成該經摻雜的二氧化矽殼層。
  9. 如請求項8所述之具有螢光放射性與近紅外光光感性的複合奈米粒子之製造方法，其中令含矽前趨物與摻雜成分進行溶凝膠法反應係包含於鹼性環境下令含矽前趨物與摻雜成分進行溶凝膠法反應。
  10. 如請求項8所述之具有螢光放射性與近紅外光光感性的複合奈米粒子之製造方法，其中含矽前趨物係為四甲氧矽烷(tetramethoxysilane,TMOS)、矽酸四乙酯(tetraethyl orthosilicate,TEOS)、四丁氧矽烷(tetrabutoxylsilane,TBOS)或氨基丙基三乙氧基矽烷(3-aminopropyl triethoxy silane,APTES)。
  11. 如請求項8所述之具有螢光放射性與近紅外光光感性的複合奈米粒子之製造方法，其中摻雜成分與含矽前趨物的莫耳比為3%至9%。
  12. 如請求項8所述之具有螢光放射性與近紅外光光感性的複合奈米粒子之製造方法，其中摻雜成分與含矽前趨物的莫耳比為5%至7%。
  13. 如請求項7至12中之任一項所述之具有螢光放射性與近紅外光光感性的複合奈米粒子之製造方法，其中經摻雜的二氧化矽殼層的厚度與該六硼化鑭核心粒子的平均半徑之比例為1：3至1：5。
  14. 如請求項7至12中之任一項所述之具有螢光放射性與近紅外光光感性的複合奈米粒子之製造方法，其中熱處理是以200至500℃溫度下進行。
  15. 如請求項7至12中之任一項所述之具有螢光放射性與近紅外光光感性的複合奈米粒子之製造方法，其中熱處理是以250至400℃溫度下進行。
TW102116346A 2013-05-08 2013-05-08 具有螢光放射性與近紅外光光感性的複合奈米粒子及其製備方法 TWI476015B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW102116346A TWI476015B (zh) 2013-05-08 2013-05-08 具有螢光放射性與近紅外光光感性的複合奈米粒子及其製備方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW102116346A TWI476015B (zh) 2013-05-08 2013-05-08 具有螢光放射性與近紅外光光感性的複合奈米粒子及其製備方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201442740A true TW201442740A (zh) 2014-11-16
TWI476015B TWI476015B (zh) 2015-03-11

Family

ID=52423147

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW102116346A TWI476015B (zh) 2013-05-08 2013-05-08 具有螢光放射性與近紅外光光感性的複合奈米粒子及其製備方法

Country Status (1)

Country Link
TW (1) TWI476015B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109381344A (zh) * 2018-11-02 2019-02-26 浙江大学 一种改善血液循环的增效型美容面膜的制备方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109303917A (zh) * 2018-11-02 2019-02-05 浙江大学 一种用于治疗皮肤肿瘤及赘生物的制剂及其制备方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI458504B (zh) * 2011-05-02 2014-11-01 Univ Nat Cheng Kung 經皮藥物釋放貼片及利用近紅外光控制其藥物釋放之方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109381344A (zh) * 2018-11-02 2019-02-26 浙江大学 一种改善血液循环的增效型美容面膜的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
TWI476015B (zh) 2015-03-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Huang et al. Upconverting nanocomposites with combined photothermal and photodynamic effects
Hu et al. Double‐Walled Au Nanocage/SiO2 nanorattles: integrating SERS imaging, drug delivery and photothermal therapy
Zhan et al. A study of mesoporous silica-encapsulated gold nanorods as enhanced light scattering probes for cancer cell imaging
Shan et al. Upconverting organic dye doped core-shell nano-composites for dual-modality NIR imaging and photo-thermal therapy
Lai et al. LaB6 nanoparticles with carbon-doped silica coating for fluorescence imaging and near-IR photothermal therapy of cancer cells
US8961825B2 (en) Fluorescent silica nanoparticles through silica densification
Saleh et al. Detection of biotin–avidin affinity binding by exploiting a self-referenced system composed of upconverting luminescent nanoparticles and gold nanoparticles
Manivannan et al. Fabrication of silver seeds and nanoparticle on core-shell Ag@ SiO2 nanohybrids for combined photothermal therapy and bioimaging
Nigoghossian et al. Upconversion nanoparticle-decorated gold nanoshells for near-infrared induced heating and thermometry
Yuan et al. Sensitive development of latent fingerprints using Rhodamine B-diatomaceous earth composites and principle of efficient image enhancement behind their fluorescence characteristics
Zhang et al. 808 nm laser triggered self-monitored photo-thermal therapeutic nano-system Y 2 O 3: Nd 3+/Yb 3+/Er 3+@ SiO 2@ Cu 2 S
Jiang et al. TiN nanoparticles: synthesis and application as near-infrared photothermal agents for cancer therapy
Liu et al. Plasmon-enhanced photoluminescence of carbon dots–silica hybrid mesoporous spheres
CN107418554B (zh) 一种金纳米棒与上转换纳米晶复合纳米材料及其制备方法
Kowalik et al. Upconversion fluorescence imaging of HeLa cells using ROS generating SiO 2-coated lanthanide-doped NaYF 4 nanoconstructs
Ge et al. Mesoporous upconversion nanoparticles modified with a Tb (III) complex to display both green upconversion and downconversion luminescence for in vitro bioimaging and sensing of temperature
Ye et al. Gold nanorod-seeded synthesis of Au@ Ag/Au nanospheres with broad and intense near-infrared absorption for photothermal cancer therapy
CN108165270A (zh) 一种纳米金壳包覆上转换纳米晶复合结构材料及其制备方法
Fanizza et al. Fabrication of photoactive heterostructures based on quantum dots decorated with Au nanoparticles
Vu et al. Gold nanorods conjugated upconversion nanoparticles nanocomposites for simultaneous bioimaging, local temperature sensing and photothermal therapy of OML-1 oral cancer cells
Iqbal et al. Mathematical modeling and experimental analysis of the efficacy of photodynamic therapy in conjunction with photo thermal therapy and PEG-coated Au-doped TiO2 nanostructures to target MCF-7 cancerous cells
Sengar et al. Morphological optimization and (3-aminopropyl) trimethoxy silane surface modification of Y3Al5O12: Pr nanoscintillator for biomedical applications
Sun et al. Silicon nanowires decorated with gold nanoparticles via in situ reduction for photoacoustic imaging-guided photothermal cancer therapy
Lv et al. Plasmonic modulated upconversion fluorescence by adjustable distributed gold nanoparticles
Brennan et al. Spectral drifts in surface textured Fe 3 O 4-Au, core–shell nanoparticles enhance spectra-selective photothermal heating and scatter imaging

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees