TW201441258A - 用於ｈｉｖ預防及治療的醣修飾抗ｃｄ４抗體 - Google Patents

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Abstract

本發明係揭示具有N-連結醣類連接至可變區之醣修飾抗CD4單株抗體。本發明亦揭示用於生產此類抗體之表現載體及細胞株，以及此類抗體於HIV預防及治療之用途。

Description

用於HIV預防及治療的醣修飾抗CD4抗體
本發明一般而言係有關HIV預防及治療。本發明一般而言亦有關抗體之醣修飾。具體而言，本發明係有關用於HIV預防及治療之醣修飾抗CD4抗體。
HIV-1藉由病毒套膜(Env)醣蛋白gp120與T細胞受體CD4結構域1(D1)交互作用之驅使進入體內。Ibalizumab(iMab)是一種有效及廣域之HIV-1中和性Ab(Jacobson et al.,Antimicrob.Agents Chemother.53：450-457,2009；Kuritzkes et al.,J.Infect.Dis.189：286-291,2004)，其主要藉由與宿主T細胞CD4受體結構域2(D2)結合以中和HIV，因而阻斷HIV利用這些CD4受體進入T細胞並產生感染之能力(Burkly et al.,J.Immunol.149：1779-178,1992)。在最近的一大組基礎分離株(118株套膜假型病毒)之檢測中，以抑制50%感染為定義時，ibalizumab中和所有病毒之92%，而以抑制90%感染為定義時，中和47.4%之病毒。雖然ibalizumab可有效抑制大範圍的HIV分離株，但是有明顯一部分的HIV變體仍可逃脫ibalizumab的抑制。近來的報告指出，HIV第一型套膜可變區5之天門冬醯胺酸連結醣化作用位置之喪失與ibalizumab之抗性有關(Toma et al.,J.Virology 85(8)：3872-2880,2011；Pace et al.,J.Acquir.Immune Defic.Syndr.出版前之電子版 本：2012年9月)。
抗體恆定區之保留位置會被醣化，而連接至該恆定區之醣類的存在及結構可影響抗體活性(請見Wright and Morrison,TIBTECH 15：26-32,1997之回顧)。
有報告指出，以N-連結醣導入重鏈而非輕鏈造成改進之溶解度(Pepinsky et al.,Protein Sci 19,954-966,2010；Wu,et al.,Protein Eng Des Sel 23,643-651,2010)。在Pepinsky之文獻中，修飾位於恆定區而非可變區。然而，先前的研究並未提供以醣策略性地置於抗體可變區之功效。
本發明提供一種經由輕鏈可變區之醣修飾以增強單株抗體活性之新穎方法。在本發明之各具體實施例中，提供適於生產此類抗體之醣修飾抗CD4單株抗體、表現載體及細胞株，以及此類抗體於HIV預防及治療之用途。
在一方面，本發明提供一種醣修飾抗CD4抗體，其具有一或多個N-連結醣類連接至該抗體之可變區。在本發明之部份具體實施例中，該N-連結醣類係連接至抗體之輕鏈可變區。該醣類之連接係經由在該抗體可變區之一或多個工程化N-連結醣化作用位置而達成。
在本發明之一具體實施例中，該醣修飾抗CD4抗體為一種其可變區具有一工程化N-連結醣化作用位置的抗CD4抗體之修飾型。在部分具體實施例中，該工程化N-連結醣化作用位置係位於抗CD4抗體之輕鏈可變區，該抗體諸如ibalizumab之野生型(WT)或修飾型、ibalizumab突變株或抗CD4抗體之修飾型。在部分特定之具體實施例中，該工程化N-連結醣 化作用位置係位於ibalizumab輕鏈之胺基酸位置或其相對應之位置，該胺基酸位置係選自於由殘基30E、52、53、54、60、65、67、76及其組合所組成之群組。在本發明中，該醣化作用位置係位於選自由30E Gln、52Ser、53Thr、54Arg、60Asp、65Ser、67Ser及76Ser所組成群組之胺基酸位置。在部分實施例中，該位於30E Gln、52Ser、53Thr、54Arg、65Ser或67Ser之醣化作用位置提供改進之活性。在本發明之一具體實例中，該醣化作用位置係位於位置52Ser。
在本發明之一特定實例中，該抗CD4抗體為ibalizumab之修飾型其包含在輕鏈可變區一工程化N-連結醣化作用位置。
在本發明之另一特定實例中，該醣修飾抗CD4抗體為MV1之修飾型，其包含在輕鏈可變區一工程化N-連結醣化作用位置。
本發明之一具體實例提供一醣修飾抗CD4抗體，稱作LM52，其係製備成具有CD4(抗CD4 IgG 1抗體)親和性之IgG 1抗體，並藉由在位置52導入N-連結醣而修飾。
在本發明之另一具體實例中，提供一種具有改進抗體再利用性(recycling)之醣修飾抗CD4抗體，其具有如SEQ ID NO：4所述之輕鏈胺基酸序列，以及具有如SEQ ID NO：5所述之重鏈胺基酸序列。
在一些具體實施例中，該連接至抗體之N-連結醣類係由至少7個醣單元組成。在其他具體實施例中，該N-連結醣類係由10至11個醣單元組成。
在本發明之其他具體實施例中，提供表現載體及宿主細胞，其係適合用於表現在可變區具有一工程化N-連結醣化作用位置之抗CD4免 疫球蛋白鏈。
在另一方面，本發明提供一種具有改進活性的醣修飾單株抗體，其中該醣修飾抗CD4抗體具有如前面所定義連接之可變區的N-連結醣類。本發明之抗體或抗原結合片段係有效抑制、治療或/及預防標的細胞受人類免疫缺乏病毒第一型(human immunodeficiency virus type 1，「HIV-1」)之感染。
在又一方面，本發明提供一種醫藥組合物其包含一治療有效量之本發明醣修飾抗CD4抗體及至少一醫藥上可接受載體。
在又另一方面，本發明提供一種用於抑制、治療及/或預防HIV感染及傳輸之方法，其包含投予一醫藥組合物於一有需求之個體，其醫藥組合物包含一治療有效量之本發明的醣修飾抗CD4抗體及至少一醫藥上可接受載體。
在最後方面，本發明提供一種具有改進活性的醣修飾單株抗體，其包含連接至該抗體可變區的N-連結醣類，具體而言為該抗體之輕鏈可變區。
本發明之前述摘要及下列詳盡說明將因配合附圖閱讀而能有更佳的理解。為了闡釋本發明，圖式具體實施例中所示之內容為較佳之呈現。然而，應理解的是，本發明未侷限於該等具體實施例。
在圖式中：圖1顯示與Ibalizumab抗性相關聯之V5潛在性N-連結醣化作用位置(potential N-linked glycosylation sites，PNGS)的數目(橫條代表中位數)。
圖2顯示V5 N端PNGS之缺少賦予HIV具有ibalizumab抗性。
圖3顯示V5 N端PNGS導入後對於HIV之ibalizumab敏感性的影響。
圖4提供一圖像顯示所描繪的ibalizumab-CD4複合體之晶體結構，其顯示數個ibalizumab輕鏈之胺基酸位置係基於與gp120 V5之接近距離進行突變以導入一N-連結醣化作用位置。
圖5提供HIV-1 gp120 V5之醣基化模型，其結合於CD4及ibalizumab(使用PyMOL)；其中該複合體模型係藉由CD4之D1與D2結合於gp120結構(蛋白質資料庫登錄號2NXY)及CD4結合於ibalizumab之相同結構域(PDB 3O2D)之重疊而產生；以及藉由相對應之天門冬醯胺酸與取自PDB 3TYG之醣結合型天門冬醯胺酸之重疊而將醣(藍色)導入天門冬醯胺酸；以及ibalizumab之重鏈及輕鏈分別以青綠色及洋紅色條帶表示。人類CD4的前兩個結構域為綠色，而HIV-1 gp120為棕褐色；其中圖5A顯示Man5GlcNac2位於gp120 V5環狀結構(N端)之位置459；以及圖5B顯示Man5GlcNac2位於gp120 V5環狀結構(C端)之位置463。
圖6顯示ibalizumab輕鏈(L鏈)之N-連結醣化作用，其中：圖6A顯示該構築之ibalizumab L鏈突變體(LMs)、與WT ibalizumab重鏈(H鏈)質體共同轉染至293A細胞、於蛋白質-A瓊脂糖管柱純化，以及藉由SDS-PAGE分析(WT ibalizumab以相同方法分析)。
圖6B顯示在變性條件下使用或不使用PNGase F處理之純化WT、LM30E、LM53與LM52抗體，並以SDS-PAGE分析。
圖6C顯示產生於293A細胞中LM52 L鏈上N-連結醣基之質譜分析。
圖6D顯示於醣類大小與中和活性之間所觀察到的正相關。
圖7顯示WT ibalizumab及其LMs之中和活性；其中對於一組ibalizumab抗性或部分ibalizumab抗性假型病毒株或複製勝任HIV-1病毒株之中和作用係以TZM-bl試驗所測定；96USHIPs9、BK132/GS009與96USHIPs7為複製勝任病毒株；CAAN5342.A2-dd與AC10.0.29-dd為V5中不具任何PNGS之定點套膜突變體並對於野生型ibalizumab之中和作用具有抗性或部分抗性；9015-07 A1與1051-D927為B分支傳染型發現者病毒(數據代表三次獨立實驗)。
圖8顯示醣大小對於LM52之HIV-1中和活性的影響，其中：圖8A顯示LM52係產生於具有或不具衣黴素(tunicamycin)(LM52-T)或kifunensine(LM52-K)之HEK293A細胞中；或者，LM52係產生於N-乙醯基葡萄糖胺轉移酶I陰性GnT1(-)HEK293S細胞(LM52-G)中；該純化的LM52蛋白質以及未修飾之LM52及WT ibalizumab係以SDS-PAGE分析。
圖8B顯示ibalizumab及LM52之不同醣變體對於三種ibalizumab抗性假型病毒之中和活性，如TZM-bl細胞所測定。
圖8C顯示當標記在ibalizumab的殘基52時，空間的描繪(使用PyMOL)係由醣類之代表性構形及大小所填充。根據圖5產生之模型進行描繪且顏色一致；其中該7環N-醣Man5GlcNac2係取自PDB登錄號3TYG。11環N-醣Man3GlcNac5Fuc係取自PDB登錄號3QUM(該等結果代表三次獨立實驗)。
圖9顯示一組118株HIV-1套膜假型病毒之中和作用；其中LM52與WT ibalizumab之中和作用係以TZM-bl試驗所測定；其中針對每株病毒，當Ab之測試濃度達到10μg/mL時，黑色條帶代表最大抑制百分比(maximum percent inhibition，MPI)，及相對應之IC50(μg/mL)或IC80(μg/mL)；病毒係以ibalizumab之MPI遞減順序排列；基於龐大之病毒數量，本實驗僅進行 一次。
圖10顯示LM52之HIV-1病毒株覆蓋率。WT ibalizumab、LM52，以及PG9、10E8、VRC01與NIH45-46G54W HIV-1 mAb之病毒覆蓋率。LM52及ibalizumab之檢測濃度達到10μg/mL，而其他單株抗體之檢測濃度達到50μg/mL。
圖11提供LM52及ibalizumab對於一組118株不同HIV-1套膜假型病毒之中和活性的摘錄，並以其IC50(μg/mL)與IC80(μg/mL)表示；其中紅線代表幾何平均值及95%信賴區間(每個點代表個別之病毒株)。
圖12顯示LM52及ibalizumab對於ibalizumab敏感性或ibalizumab抗性病毒之IC80值(抗性之定義為IC80>10μg/mL)。
圖13A顯示ibalizumab H鏈與L鏈之大小及其單、雙與三醣變體的SDS-PAGE分析。
圖13B顯示在TZM-bl細胞中ibalizumab、LM52及數個雙或三醣突變體對於兩個ibalizumab抗性假型病毒之中和活性。
圖14提供LM52多重反應性(polyreactivity)之分析結果，其中：圖14A顯示LM52及ibalizumab之HEp-2反應性，如同使用Quanta Lite ANA ELISA套組(INOVA Diagnostics)之ELISA測定所示；其中陰性對照組為一不含細胞核與細胞質抗原之抗體的人類血清；以及強與弱陽性對照組為已知分別具有豐富與小量細胞核與細胞質抗原之抗體的人類血清。
圖14B顯示LM52及ibalizumab對於單股DNA、雙股DNA、胰島素、脂多醣、KLH及CD4之反應性，如ELISA試驗之測定；其中該等結果係取自三次獨立實驗。
本發明首次證實經由可變區的醣修飾可改進單株抗體之功能。具體而言，本發明發現醣類移植醣類至一抗CD4單株抗體之輕鏈可變區可復原一抗體與HIV之間的醣媒介交互作用，因此該具有醣修飾之抗體可有效抑制病毒分離株之感染，該病毒分離株於正常情況下可逃脫母體抗體分子活性(無醣修飾)。
據此，本發明提供醣修飾抗CD4單株抗體、用於生產此類抗體之組分如表現載體及細胞株，以及此類抗體於HIV預防及治療之用途。
定義
「抗原」乙詞是指含有一或多個表位的分子，且其可引發免疫反應。「抗原性分子」乙詞之使用在一般意義上是指可作為本發明所揭示之醣修飾蛋白質之結合標的之分子。
「表位」乙詞，亦稱作抗原決定位，係指抗原性分子的一部分或可被免疫系統(亦即，B細胞、T細胞或抗體)所辨識之分子。表位可為一構形表位或一線性表位。一構形表位係由抗原性分子的不連續區段組成，或由多個分子組成。在抗原為蛋白質的情況中，構形表位可由該相同蛋白質分子之不連續胺基酸殘基組成，或由該蛋白質之不同分子之胺基酸殘基組成(例如，由蛋白質多體所組成的四級表位)。一線性表位由抗原之連續區段組成，例如，蛋白質抗原之胺基酸的連續序列。
本文所使用的「抗體」乙詞廣泛地包括完整的抗體分子，其包括具有所欲活性或功能之完整的多株、單株、單特異性、多特異性、嵌合、人源化、人類、靈長類、單鏈、單結構域、合成型與重組型抗體以及 抗體片段。
本文所使用的「抗體片段」乙詞具體而言包括完整抗體之抗原結合片段。抗原結合片段之實例包括但不限於Fab片段(由VL、VH、CL與CH1結構域組成)、Fab'片段(其不同於Fab片段之處為CH1結構域之C端具有額外少數殘基，包括抗體鉸鏈區(hinge region)的一或多個半胱胺酸)、(Fab')2片段(由二個Fab'片段組成，其中鉸鏈區以雙硫鍵相連接)、Fd片段(由VH與CH1結構域組成)、Fv片段(是指一重鏈與一輕鏈之可變結構域之雙體，其以緊密、非共價方式連接，並含有完整的抗原辨識及結合位置)、dAb片段(由VH結構域組成)、單一結構域片段(VH結構域、VL結構域、VHH結構域、或VNAR結構域)、分離的CDR區、scFv(或「單鏈Fv」，係指VL與VH結構域之融合物，其經由一連接子連接)，以及其他保留抗原結合功能之抗體片段。
「可變區」乙詞係指抗體的抗原結合區，其不同的抗體分子間具有很大的差異。未以相同方式變化之抗體區域且通常具有免疫系統效應子(effector)的功能者，稱作「恆定區」。免疫球蛋白鏈(成熟型)的大約前面110個胺基酸構成其可變結構域。重鏈的二個可變結構域(variable domains of the heavy chain，VH)及輕鏈的二個可變結構域(variable domains of the light chain，VL)構成抗體可變區。重鏈的六個恆定結構域(constant domains of the heavy chain，CH1、CH2與CH3)及輕鏈的二個恆定結構域(constant domains of the light chain，CL)構成抗體恆定區。
「CDR」或「互補性決定區」乙詞係指抗體可變結構域內的高度可變區。重鏈及輕鏈可變結構域各有三個CDRs，並由負責抗原結合 的胺基酸殘基所組成。「框架區」或「FR(framework region)」乙詞是指可變結構域之更具保留性部位，且係由高度可變區殘基以外的殘基組成。
抗體的「抗原結合位置」乙詞係指由一結合至抗原之抗體的胺基酸組成的構形及/或構造。舉例而言，每一VH與VL結構域之三個CDRs可交互作用以在VH-VL雙體(dimer)表面上定義一抗原結合位置。總之，該六個CDRs使抗體具有抗原結合特異性。然而，應注意的是，一單一可變結構域(亦即，VH或VL)亦可辨識及結合抗原，儘管其功效低於全部六個CDRs位置的結合。
「嵌合抗體」乙詞係指含有取自不同來源之多胜肽的抗體，例如，不同物種或不同抗體類型或子類型。嵌合抗體之實例包括以鼠科單株抗體之抗原結合部位融合至人類免疫球蛋白之Fc片段。嵌合抗體之製造方法為本領域所習知；例如，Boss等人於美國專利號4,816,397及Cabilly等人於美國專利號4,816,567所揭示之方法。
「人源化抗體」乙詞係指在人類免疫球蛋白骨架或框架中含有非人類序列要素之抗體。一般而言，人源化抗體為人類免疫球蛋白(受體抗體)其受體之高度可變區(CDRs)殘基係由非人類物種(供體抗體)之高度可變區殘基取代，該非人類物種包括具有所欲之特異性、親合性及能力之小鼠、大鼠、兔子或非人類之靈長類。在某些情況中，人類免疫球蛋白之框架區(FR)殘基亦可被非人類殘基取代。在某些情況中，人源化抗體亦可含有未出現於受體抗體或供體抗體的殘基，並可導入殘基以進一步調整抗體性能。一般而言，一人源化抗體實質上包含所有至少一個，且典型地二個可變結構域，其中所有或實質上所有的高度可變區相對應於該 等非人類免疫球蛋白及所有或實質上所有的框架區為該等人類免疫球蛋白序列。一人源化抗體亦選擇地含有至少一部分的免疫球蛋白恆定區(Fc)，典型地如人類免疫球蛋白。人源化抗體之製造方法如本領域之文獻所示；請見，例如，Winter之美國專利號5,225,539及Boss等人之美國專利號4,816,397。
「非人類靈長類抗體」乙詞係指在非人類靈長類免疫球蛋白骨架或框架中含有人類序列要素或非靈長類序列要素之抗體。舉例而言，非人類靈長類抗體可由非人類靈長類免疫球蛋白(受體抗體)所製備，其藉由人類或非靈長類物種，例如，具有所欲之特異性、親合性及能力之小鼠、大鼠或兔子的供體抗體高度可變區殘基取代其受體抗體高度可變區(CDRs)殘基。或者，藉由使用具有人類或非靈長類序列或不同靈長類物種序列之受體免疫球蛋白及將所欲之靈長類Fc片段及/或殘基(包括具體而言框架區殘基)導入受體免疫球蛋白，以使非人類靈長類抗體製成適合投予所欲之靈長類物種。非人類靈長類抗體的實例包括本文實施例一節所揭示的「猴源化」抗體。
「單特異性抗體」乙詞係指辨識及結合至一表位之抗體。
「多特異性抗體」乙詞係指由至少二個單獨抗體組成並結合至多個(亦即，二或多個)單獨表位之抗體。
「中和性抗體」乙詞係指抗體可抑制、降低或完全預防HIV-1感染。可藉由以下實施例一節所述之體外試驗測定一抗體是否為中和性抗體。
「有效中和性抗體」乙詞係指一抗體以低濃度使用時，可減 少至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或更多的HIV-1感染。濃度低於50μg/ml、介於1與50μg/ml之間、或甚至低於1μg/ml者，皆視為「低濃度」。在部分具體實施例中，低濃度為濃度位於皮莫耳(picomolar)範圍者，例如10-900ng/ml，並包括此範圍內之任何濃度，例如800、700、600、500、400、300、200、100、75、50、25、10ng/ml，或甚至低於10ng/ml。
「廣域中和性抗體」乙詞係指一抗體對於HIV-1感染的抑制可達到所定義的體外50%感染抑制，甚至可抑制高於50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、或更高之一大組(大於100)HIV-1套膜假型病毒與病毒分離株；舉例而言，一大組分離株代表套膜具有地域、分化、向性及感染階段等多樣性。
本文所使用的「片段」乙詞係指生物分子一級結構的實際連續部分。在蛋白質的情況中，一片段可定義為蛋白質胺基酸序列的連續部分並可為至少3-5個胺基酸、至少6-10個胺基酸、至少11-15個胺基酸、至少16-24個胺基酸、至少25-30個胺基酸、至少30-45個胺基酸及至多為該蛋白質之全長減去數個胺基酸。在多核苷酸的情況中，一片段係定義為多核苷酸之核酸序列的連續部分並可為至少9-15個核苷酸、至少15-30個核苷酸、至少31-45個核苷酸、至少46-74個核苷酸、至少75-90個核苷酸，及至少90-130個核苷酸。在某些具體實施例中，生物分子之片段為免疫原性片段(immunogenic fragments)。
「融合物蛋白質」係指二或多個不同來源之胜肽經由連接子彼此相連。舉例而言，一融合物蛋白質可包括一蛋白質連接至一抗體。其他實例包括一抗體連接至一不同抗體或一抗體連接至一Fab片段。該Fab片 段可連接至抗體之重鏈或輕鏈的N端或C端，或抗體內的其他區域。
「胜肽」係以醯胺(胜肽)鍵連接二或多個胺基酸所組成的任何化合物，通常為α-胺基酸之聚合物，其中每一胺基酸殘基之α-胺基(除了NH2端以外)以直鏈形式連接至下一殘基之α-羧基。本文所使用的胜肽、多胜肽及聚(胺基酸)等詞皆同義地意指此類化合物而未侷限其分子量大小，除非有另外說明。此類別之成員具有大分子量者亦稱作蛋白質並可包括抗體。
醣修飾之抗CD4單株抗體
本文所揭示之醣修飾方法可應用於抗CD4單株抗體，其可為單特異性、多特異性、嵌合、人源化、人類、非人類靈長類、單鏈、及/或單一結構域抗體之單株抗體。本發明之方法亦可應用於抗CD4單株抗體之片段，尤其是抗CD4單株抗體之抗原結合片段。
抗CD4抗體已在本領域中描述且亦可容易產生，係因CD4受體之蛋白質序列為本領域之技術人員所習知。CD4具有四個位於細胞外表面的免疫球蛋白結構域(D1至D4)，並以其D1結構域與主要組織相容性複合體(major histocompatibility complex，MHC)第二型分子之β2結構域交互作用。在某些具體實施例中，該抗CD4抗體結合至一或多個D1、D1-D2連結區、D2、D2之BC或FG環狀結構，或其任何結合物。在特定具體實施例中，本發明所揭示之抗CD4抗體主要針對該CD4受體之類第二免疫球蛋白結構域(D2)(胺基酸位置98-180)。CD4的D2結構域之抗體具有所欲阻斷HIV感染的特性而不會干擾CD4與主要組織相容性複合體(MHC)第二型分子交互作用所媒介之免疫功能。在其他具體實施例中，本發明所使用之抗CD4 抗體結合至位於CD4受體D1-D2連結區附近之D2的BC環狀結構(胺基酸121-127)之表位。在又其他具體實施例中，該抗CD4抗體結合至D2的FG環狀結構(胺基酸163-165)及部分D1(胺基酸77-96)。該胺基酸編號對應於成熟型CD4受體之位置，但不包括訊息胜肽。該人類CD4受體之胺基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其中胺基酸1-25代表一訊息胜肽、胺基酸26-122構成D1，以及胺基酸123-205構成D2。
在一特定具體實施例中，該抗CD4單株抗體為人源化抗體ibalizumab或「iMab」(先前稱作TNX-355或hu5A8)。Ibalizumab有效地阻斷一廣譜(broad spectrum)的HIV-1分離株感染並標靶一位於CD4受體D1-D2連結區附近之D2的BC環狀結構之表位，而不會干擾CD4與主要組織相容性複合體(MHC)第二型分子交互作用所媒介的免疫功能。一該抗CD4抗體之實例係提供於美國專利申請號5,871,732，在此全部併入本案以作為參考資料。
在另一具體實施例中，該抗CD4抗體或其片段為具有改善穩定性之ibalizumab突變體。一實施例為該抗CD4抗體之鉸鏈區具有一或多個取代，其可防止鏈內雙硫鍵形成，而所得之抗體分子具有令人驚訝地增進的二價穩定性，如WO2008134046(A1)所揭示，其於2007年4月27日公開，在此併入本案以作為參考資料。
根據本發明之具體實施例，該抗CD4抗體可由IgG 4或IgG 1所產生。在本發明一實施例中，一具有CD4結合親合性之抗CD4 IgG 1抗體係以製備，並命名為MV1。該MV1具有IgG 1恆定區之位置234之白胺酸(leucine)變更為苯丙胺酸(phenylalanine)、位置235之白胺酸變更為麩胺 酸(glutamic acid)，以及位置331之脯胺酸(proline)變更為絲胺酸(serine)。該MV1之重鏈及輕鏈胺基酸序列分別如SEQ ID NOS：2-3所示。
在本發明部分實施例中，該抗CD4抗體之重鏈Fc區或FcRn區可包含一或多個修飾以改進抗CD4抗體的再利用性。一具體實施例為該抗CD4抗體包含如SEQ ID NO：5所示之重鏈胺基酸序列。
本文所揭示之醣修飾涉及將添加醣類於一抗CD4抗體可變區內工程化N-連結醣化作用位置。在真核細胞中，醣類連接至由核糖體離開之新合成多胜肽之該一致(consensus)序列Asn-X-Ser/Thr中之天門冬醯胺酸殘基。此種N-連結醣化過程為一酵素導向過程，其發生於內質網(ER)及高基氏體(Golgi apparatus)。針對本發明之目的，該一致序列Asn-X-Ser/Thr中的Asn殘基指的是「N-連結醣化作用位置」。本領域之技術人員可應用多種分子選殖技術以工程化一抗CD4單株抗體可變區內N-連結醣化作用位置，其可包括一或多個胺基酸之插入、刪除及/或取代以取得一致性之N-連結醣化序列Asn-X-Ser/Thr。
在部分具體實施例中，一工程化N-連結醣化作用位置位於一抗CD4單株抗體之輕鏈(VL)V結構域內。可考慮進行相關抗體、CD4受體及HIV gp120蛋白的三維結構模型分析以輔助確定抗體內之適合或更所需之N-連結醣化作用位置。如所示，本發明證實，針對ibalizumab或其他抗CD4抗體，三維結構模型分析可將一N-連結醣化作用位置導入與CD4結構域1結合之HIV gp120蛋白之V5環狀結構鄰近之位置。
在部分具體實施例中，一N-連結醣化作用位置係工程化於ibalizumab之輕鏈胺基酸位置或其相對應之位置，該等位置選自於殘基 30E、52、53、54、60、65、67與76，及其組合。具體而言，該胺基酸位置係選自於由30E Gln、52Ser、53Thr、54Arg、60Asp、65Ser、67Ser及76Ser所組成群組之位置。根據本發明，藉由「30E Gln」、「52Ser」、「53Thr」、「54Arg」、「60Asp」、「65Ser」、「67Ser」及「76Ser」所代表之序列產生每一胺基酸之改變於該等位置導入新的N-連結醣化作用位置其產生如下：30E Gln：30E Gln、31Lys、32Asn變更為30E Asn、31Ala、32Thr
52Ser：52Ser、53Thr、54Arg變更為52Asn、53Ser、54Thr
53Thr：53Thr、54Arg、55Glu變更為53Asn、54Ala、55Thr
54Arg：54Arg、55Glu、56Ser變更為54Asn、55Ala、56Thr
60Asp：60Asp、61Arg、62Phe變更為60Asn、61Ala、62Thr
65Ser：65Ser、66Gly、67Ser變更為65Asn、66Ala、67Thr
67Ser：67Ser、68Gly、69Thr變更為67Asn、68Ala、69Thr
76Ser：76Ser、77Ser、78Val變更為76Asn、77Ala、78Thr。
在本發明實施例中，胺基酸位置30EGln、52Ser、53Thr、54Arg、65Ser及67Ser之個別或組合之N-連結醣化可提供一改進活性。在一特定實施例中，該胺基酸位置為位置52Ser。該等胺基酸位置之編號係基於ibalizumab之成熟型輕鏈(不含前面16個胺基酸訊息序列)或其相對應之位置為基準。在特定具體實施例中，於該ibalizumab輕鏈之30E Gln、52Ser、或53Thr之一者係工程化N-連結醣化作用位置。在一具體實施例中，該工程化N-連結醣化作用位置係位於胺基酸位置52Ser。
在本發明之一具體實施例中，一經修飾以改進穩定性之ibalizumab衍生性IgG1變體，稱作MV1，係用於產生該醣修飾抗CD4抗體。 該MV1之重鏈及輕鏈分別具有如SEQ ID NOS：2及3所示之胺基酸序列。該輕鏈之胺基酸位置52具有工程化N-連結醣化作用位置，其具有如SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列。該MV1重鏈之Fc區或FcRn區可具有進一步修飾以改善抗體之再利用性。本發明之一具體實施例係提供一具有改進活性及穩定性之醣修飾抗CD4抗體，包含如SEQ ID NO：4所述之輕鏈胺基酸序列及如SEQ ID NO：5所述之重鏈胺基酸序列。
一旦抗CD4單株抗體可變區內之N-連結醣化作用位置進行工程化，利用適當的重組表現系統可輕易產生此類抗體之醣修飾形式。舉例而言，可將編碼抗CD4抗體輕鏈之表現載體轉染至一適合抗體分子重組表現及能產生N-連結醣化之細胞株，其中該輕鏈之至少一可變結構域經工程化以納入N-連結醣化作用位置。可收取含抗體之培養基上清液並進行任何適當之層析法以取得實質上純化的抗體製備物。
本領域之技術人員易取得適合抗體分子重組表現之細胞株，且一般而言能進行N-連結醣化。在真核生物中，該N-連結醣化過程發生於共同轉譯作用之情況且該初始步驟發生於內質網膜自腔面(luminal side)，其涉及將一Glc3Man9GlcNAc2寡醣運送至新生多胜肽鏈。此前驅物結構隨即進一步經一系列之醣苷酶(glycosidases)及醣基轉移酶(glycosyltransferases)所修飾。在以葡萄糖苷酶I與II移除三個葡萄糖殘基後，以甘露糖苷酶I移除一特定之終端α-1,2-甘露糖。該等反應在最低等與最高等真核生物之間具有極佳保留性。此時，正確折疊之Man8GlcNAc2 N-連結醣化蛋白可離開醣化裝置；或者，其可繼續並進行進一步之物種及細胞類型特異性加工，經由一系列之酵素催化以產生雜合體及/或複合體類型之 醣類。請見圖7A。亦請見例如，Wright與Morrison,TIBTECH 15：26-32(1997)之回顧；美國專利號6,602,684；以及美國專利號7,029,872，在此併入本案以作為參考資料。在高等真核生物中，進一步以數個α-1,2-甘露糖苷酶(α-1,2-mannosidases)修整Man8GlcNAc2結構。隨後，於GlcNAc轉移酶I(GlcNAc transferase I，GnT-I)催化之反應中加入β-1,2-連結GlcNAc殘基以修飾所得之Man5GlcNAc2 N-連結醣類，該所得之GlcNAcM8GlcNAc2結構導致最終「雜合體類型」N-連結醣類之形成。或者，以甘露糖苷酶II(mannosidase II，Man-II)作用於GlcNAcM8GlcNAc2結構，移除二個甘露糖，並隨後以GnT-II加入第二個β-1,2-GlcNAc。所得之醣類結構稱作「複合類型」N-連結醣類，其中以至少一GlcNAc殘基修飾兩個核心-α-甘露糖殘基。可藉由GnT-IV、GnT-V及GnT-VIs附加至其他分支。半乳糖及唾液酸殘基進一步分別以半乳糖轉移酶及唾液酸轉移酶所附加。
根據本發明，附加至抗CD4抗體可變區之N-連結醣類應包括至少7、8、9、10、11或12個醣單元或「環」。「醣單元」乙詞係指個別之醣分子彼此連接以於真核細胞形成原始N-醣類；亦即，其包括葡萄糖、甘露糖、N-乙醯基葡萄糖胺、半乳糖及唾液酸。該抗體的N-醣類之確切結構(亦即，組成及一連串連接)未必完全關鍵，只要該N-醣類包括至少7個單元。N-連結醣類之實例包括該等典型可見於哺乳類動物細胞，例如，Man8GlcNAc2(末端之GlcNAc連接至Asn)、Man5GlcNAc2、GlcNAcMan5GlcNAc2、GlcNAc2Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、(唾液酸)2GlcNAc2Man3GlcNAc2、GalGlcNAcMan5GlcNAc2，以及美國專利號6,602,684所揭示之該二等分(bisected)雙鏈複合體、該三鏈複合體、 三’鏈(tri'-antennary)複合體及四鏈複合體N-醣類(例如，請見該說明書之圖1)，在此併入本案以作為參考資料。
根據本發明，醣修飾抗體重組表現之適用細胞株為真核細胞，尤其是包括哺乳類動物細胞株如中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)細胞、幼倉鼠腎臟(Baby Hamster Kidney，BHK)細胞、(鼠科骨髓瘤)NSO細胞、鼠科骨髓瘤SP2/0細胞、人類胚胎腎臟293(HEK293或293)細胞、小鼠胚胎纖維母細胞3T3，及其衍生之細胞株，只要衍生之細胞可有效表現具有N-連結醣化之重組型抗體。該等細胞有許多可購自美國組織培養保存中心(American Tissue Culture Collection，ATCC)或商業管道。基因改造細胞產生具有醣形式改變之醣蛋白，例如，具有特定類別之N-連結醣類(例如，雙鏈複合體N-連結寡醣)並以二等分N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)修飾之醣蛋白，如美國專利號6,602,684所揭示，在此併入本案以作為參考資料，亦可用於生產本發明之抗體。其他適用之真核細胞可包括昆蟲細胞及酵母菌細胞，例如麵包釀酒酵母菌(S.cerevisiae)及嗜甲醇酵母菌(Pichia pastoris)，包括具體而言基因改造酵母菌株以產生具有人類N-醣類形式之蛋白質。請見，例如，美國專利號7,029,872及美國專利號7,449,308，兩者在此併入本案以作為參考資料。
根據本發明之實施例，以酵素(例如，PNGase)處理分離自細胞培養基之抗體分子可將該N-連結醣類連接至細胞所生產之抗體分子。由於處理酵素所造成之抗體表觀分子量改變(其可由SDS-PAGE、西方墨點法，及其類似物檢測)顯示N-連結醣類確實連接至抗體分子。N-連結醣類之分子量大小可以相較於已知分子量大小之N-連結醣類所估計而得。 在更詳盡之分析方面，可藉由例如DNA定序儀輔助法(DNA sequencer assisted，DSA)、螢光團輔助醣電泳法(fluorophore assisted carbohydrate electrophoresis，FACE)，或MALDI-TOF MS分析連接至抗體之N-連結醣類，所有這些技術於本領域皆有完整文獻。舉例而言，於一DSA-FACE分析中，N-連結醣類係自醣化抗體胜肽釋出：以N-醣苷酶F(PNGase F)處理。該釋出之N-連結醣類隨即於還原胺化反應中以螢光團8-胺基芘-1,3,6-三磺酸鹽(fluorophore 8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate，APTS)進行衍生化。移除多餘的APTS之後，以一ABI 3130 DNA定序儀分析經標記之N-連結醣類。請見，例如，Laroy等人(Nat Protoc.1：397-405(2006))，美國專利號6,602,684揭示之重組所產生之蛋白質之N-連結醣類MALDI-TOF MS分析，在此併入本案以作為參考資料。
可由多種功能性試驗評估醣修飾抗體以確認其中和HIV之功效，包括測定抗體對於一大組病毒分離株之廣度及效力的試驗，如實施例一節所述。
在本發明之具體實施例中，其可確認的是一gp120 N端之醣填補一ibalizumab L鏈與gp120 V5之間空出之空間，且ibalizumab對於HIV-1進入之作用係由此醣之空間上質量效應所媒介。在檢測L鏈不同PNGS位置之一組ibalizumab突變體對於體內中和HIV-1感染性之能力方面，發現在位於ibalizumab-CD4-gp120複合體V5附近之含醣ibalizumab突變體可有效中和HIV-1。該等ibalizumab突變體亦可中和具有野生型ibalizumab抗性之HIV-1病毒株。在本發明之一具體實施例中，一ibalizumab突變體LM52可100%中和受測之118株HIV-1分離株，其效用高於野生型ibalizumab十倍以上，此測 試以IC80幾何平均值判定，亦即該抗體濃度需中和80%之感染。其結果指出，ibalizumab藉由立體障礙機制阻斷HIV-1進入，並提供一策略性置入N-連結醣化作用位置如何可被用於改進單株抗體活性的實例。
基於本發明之發現，其指出醣附加(glycan-addition)方法可用於提升單株抗體之功能活性。利用結構活性關係(structural-activity relationship，SAR)，可想像其增加抗體上關鍵位置的數量可改進活性，以產生更佳的單株抗體產物。
在本發明之部分具體實施例中，其可能需要產生實質上同質之N-連結醣類抗體或同一類型N-連結醣類。「實質上同質」乙詞係指在該抗體分子製備物上有至少50%、60%、75%、80%、85%、90%或甚至95%之N-連結醣類的相同結構、相同大小(亦即，相同分子量，或者，相同數量之醣「環」)，或相同範圍之大小(例如，9-12個「環」、或10-11個「環」)及/或種類。此目的可藉由使用基因工程細胞株以表現或過度表現一組經選取涉及N醣化作用之酵素(請見，例如，美國專利號6,602,684及美國專利號7,029,872，在此併入本案以作為參考資料)，或於N醣化作用途徑之中間階段破壞酵素(例如，GnT1剔除細胞株)，或使用一或多個標靶特定加工酵素之抑制劑，或其組合來達成。抑制劑之實例包括Kifunensine、DMJ(即「deoxymannojirimycin，脫氧甘露糖野尻黴素」)及苦馬豆素(Swainsonine)。
醫藥組合物
可藉由混合抗體與一或多個任擇之醫藥上可接受載體以製備含有本發明所揭示醣修飾抗體之醫藥組合物。醫藥上可接受載體包括溶 劑、分散介質、等張劑及其類似物。載體可為液體、半固體(例如，糊狀物)，或固體載體。載體之實例包括水、鹽類溶液或其他緩衝液(例如，磷酸鹽、檸檬酸鹽緩衝液)、油、醇類、蛋白質(例如，血清白蛋白、明膠)、醣類(例如，單醣、雙醣及其他醣類，包括葡萄糖、蔗糖、海藻糖、甘露糖、甘露糖醇、山梨糖醇或糊精)、凝膠、脂質、微脂體、樹脂、多孔基質、黏合劑、填充劑、塗料、穩定劑、防腐劑、抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸、螯合劑如EDTA；成鹽相反離子(salt forming counter-ions)如鈉離子；非離子型界面活性劑如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)，或其結合物。
醫藥組合物可包含以大於一者之活性化合物(例如，一或多個抗體)結合一或多個額外之有益化合物以抑制、預防及治療HIV感染。
可由任何便利及實際之方式結合活性成分及載體，例如藉由混合物、溶液、懸浮液、乳化、包囊、吸收及其類似物，並可製成適於注射、攝入、輸注或其類似物之製劑，例如錠劑、膠囊、粉末(包括凍乾粉末)、糖漿及懸浮液。亦可製成緩釋製劑。
治療及預防之方法
在另一方面，本文所揭示之醣修飾抗體，可選擇地配合醫藥上可接受載體來供應，係應用於治療及預防個體之HIV感染，以及預防HIV傳輸。
HIV感染之「治療」乙詞係指HIV感染之有效抑制以延遲發病、減緩進展、降低病毒載量，及/或改善HIV感染造成之症狀。
「HIV感染預防」乙詞係指延遲HIV感染的發生，及/或降低 或消除HIV感染的發生率或可能性。
「HIV傳輸預防」乙詞係指降低或消除HIV由一個體傳輸至另一個體之發生率或可能性(例如，懷孕、分娩或生產期間由HIV陽性母體傳輸至胎兒，或母乳哺育；或由HIV陽性個體傳輸至HIV陰性伴侶)。
「個體」乙詞係指任何靈長類動物個體，包括人類及非人類個體(例如，恒河猴個體)。
為抑制、治療及/或預防HIV感染，一本文所揭示醣修飾抗體之治療有效量係投予有需求之個體。
「治療有效量」乙詞係指HIV感染抑制所需之有效劑量以治療及/或預防HIV感染。該抗體劑量取決於疾病狀態及其他臨床因素，例如個體之體重及條件、個體對治療之反應、製劑類型及給藥途徑。治療有效及無害之準確劑量可為本領域之技術人員所決定。常規上，成人之非腸道投予抗體之合適劑量範圍為每日約0.1至20mg/kg病患體重，每週一次或甚至每月一次，其中所使用之典型初始範圍為約2至10mg/kg。由於抗體最終會在血流中清除，再次給藥可能是需要的。或者，可使用控制釋放基質以提供抗體輸注或注射。
抗體可由標準途徑投予至個體，包括口服、經皮或非腸道(例如，靜脈、腹腔、皮內、皮下或肌內)。此外，該抗體可由注射或手術移植或固位(attachment)導入體內，因此一顯著量之所欲抗體係能以控制釋放方式進入血流。
序列表
SEQ ID NO：1：人類CD4受體之胺基酸序列(胺基酸1-25代 表一訊息胜肽、胺基酸26-122構成D1，以及胺基酸123-205構成D2)：
SEQ ID NO：2：MV1重鏈之胺基酸序列(471個胺基酸，包括前面19個胺基酸殘基構成之領導序列)：
SEQ ID NO：3：MV1輕鏈之胺基酸序列(238個胺基酸，包 括前面19個胺基酸構成之領導序列)：
SEQ ID NO：4：LM52輕鏈之胺基酸序列：
SEQ ID NO：5：具有抗體改進再利用性之經修飾MV1重鏈的胺基酸序列(452個胺基酸，其中有二個修飾位置)：
部分特定具體實施例之說明旨在提供足夠之資訊，使他人可利用現今之知識而易於變更或修改並進行各種應用，該等特定具體實施例未背離通用概念，因此該等修改或變更應該且旨在於所揭示之具體實施例之相當意義及範圍內能充分理解。應理解的是，本文所使用之用語或術語旨在說明而非侷限。在圖示及說明中，揭示了示例性具體實施例，雖然可能使用特定術語，除非有特別指明，僅為通用及描述意圖且非旨在有所侷限，因此本發明主張之範疇未受侷限。此外，本領域之技藝人士將理解的是本文所論及方法之某些步驟可能會以另一順序編排或步驟可能重新組合。因此，本發明所附主張未旨在侷限於所揭示之具體實施例。
實施例
材料及方法
1.細胞株、試劑、及假型病毒
TZM-bl細胞(目錄編號8129)係取自美國國家衛生研究院(NIH)過敏與傳染性疾病國家研究所(NIAID)AIDS部門的AIDS研究與參考試劑計畫(AIDS Research and Reference Reagent Program，ARRRP)。此細胞為經基因工程之HeLa細胞株，其表現CD4、CXCR4及CCR5並含有Tat反應性報導子(Tat-responsive reporter)基因以用於HIV-1長末端重複序列之控制下啟動螢光素酶和β-半乳糖苷酶。來自急性及早期感染之B亞型HIV-1套膜選殖株及套膜缺失骨架質體(SG3△Env)之標準參考規模(Standard Reference Panels)亦取自NIH ARRRP。HIV-1套膜假型病毒係以具有套膜表 現質體及SG3△env之293A細胞(Invitrogen)共同轉染所製備。含有人類CD4之全長細胞外結構域之重組型sCD4係獲自於Progenics Pharmaceuticals,Inc.(Tarrytown,NY)。Ibalizumab蛋白質係由TaiMed Biologics(Irvine,CA)所提供。質體pMV1及pLC，分別編碼ibalizumab H鏈及L鏈，係由cDNA所放大(amplified)並選殖至pCDNA3.1(+)(Invitrogen)。N-乙醯基葡萄糖胺轉移酶I-陰性GnT1(-)人類胚胎腎臟(HEK)293S細胞係取自ATCC(目錄編號CRL-3022)。
2.將N-連結醣化作用位置加至抗CD4抗體L鏈
藉由突變作用導入Asn-Ala-Thr(LM30E、LM53、LM54、LM60、LM65、LM67與LM76)或Asn-Ser-Thr(LM52)序列以在抗CD4抗體之輕(L)鏈建立突變體如WT ibalizumab或MV1。突變作用係以Quikchange突變作用套組(Stratagene,Santa Clara,VA)所進行。該L(輕)鏈突變體(LM)構築體係由抗CD4 IgG1抗體(例如，MV1)所產生，且隨即進行定序並利用聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)-DNA複合體短暫轉染至HEK293A細胞(重鏈與輕鏈質體之比例為1：1)。在轉染後第5天收取上清液並以蛋白質-A瓊脂糖(protein-A agarose)(Thermo Scientific,Rockford,IL)管柱純化LM蛋白。在進行SDS-PAGE分析之前，於變性條件下以PNGase F(New England Biolabs,Ipswich,MA)處理WT ibalizumab及LM30E、LM52與LM53。
3.利用TZM-bl細胞之病毒中和試驗
中和試驗係根據Wei等人的方法(Wei et al.,Nature 422,307-312，2003)並加以修改以進行。簡單而言，細胞以每孔10,000個的數量種植於96孔盤，各孔內含補充有10%胎牛血清(D10)之100μL DMEM並 整夜培養。隔日，將連續稀釋之ibalizumab或LM蛋白加入該細胞培養基中並培養1小時。隨後，以含DEAE-聚葡萄糖(DEAE-Dextran)之D10(Sigma,St.Louis,MO)製備200X 50%-組織-培養-感染-劑量(50%-tissue-culture-infective-doses，TCID50)之複製勝任或假型HIV-1，並加入該細胞。細胞培養48小時，並以Galacto-Star系統(Applied Biosystems,Cedarville,OH)測定β半乳糖苷酶活性。病毒感染力抑制百分比係以1減去抗體處理孔與未處理感染孔之比例再乘以100所計算。利用非線性迴歸分析計算IC50及IC80值(分別為具備50%及80%中和作用之抗體濃度)。
4.表面電漿共振
利用Biacore T3000光學生物感測儀(GE Healthcare,Piscataway,NJ)進行結合親合性分析。根據標準胺耦合(amine coupling)流程進行ibalizumab及所有醣變體之固定化。簡而言之，以每分鐘5μL之流速將含有0.2M N-(3-二甲基胺基丙基)-N-乙基碳二亞胺(N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide)與0.05M N-羥基琥珀醯亞胺(N-hydroxysuccinimide)之35μL溶液注入以活化感測晶片表面上的羧基。接著，將ibalizumab或其突變體以pH 4.5之10mM醋酸鈉緩衝液配製成2μg/mL濃度，並以每分鐘10μL之速度流過晶片表面直到反應蛋白質之反應單位達到所欲之程度(150-200RU)。將未反應之蛋白質洗去之後，以每分鐘5μL流速將35μL之pH 8.0的1M乙醇胺注入，以將感測表面上的過多活化酯基加蓋(capped)。在相同條件下產生省略蛋白質配體的參考物以作為背景值校正儀器及緩衝液假數值。結合實驗係在25℃下於HBS-EP緩衝液(0.01M HEPES、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005% vol/vol界面活性劑 P20(GE Healthcare))所進行。結合動力學係以每分鐘30μL流速將各濃度之分析物(人類sCD4蛋白)流過晶片表面3分鐘以測定。晶片表面於10分鐘之清洗步驟時，可偵測結合分析物之解離。以每分鐘50μL流速將pH 2.0之10mM甘胺酸-HCl(glycine-HCl)進行二次30秒之注入以移除殘存之分析物。在動力學數據分析方面，利用BIAevaluation 4.1軟體將局部覆蓋之感應圖集體擬合至1：1朗謬結合模型(Langmuir binding model)以測定動力學參數。
5. LM52上N-連結醣化之鑑定
將3微克LM52蛋白質溶於50mM碳酸氫銨(ammonium bicarbonate，ABC)/50%四氟乙烯(tetrafluoroethylene)，並加入40mM二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)以進行還原反應。在65℃下培養1小時後，加入40mM碘乙醯胺(iodoacetamide)，並於室溫下避光反應1小時以進行蛋白質樣本的烷化。該反應係以加入40mM DTT並接著培養1小時所終止。接著，進行胰蛋白酶分解之前加入25mM ABC。蛋白質樣本隨即以0.2μg胰蛋白酶(Promega)處理整夜。在進行LC-MS/MS分析前，將該分解之蛋白質樣本乾燥並再溶解於20μL水。在抗體上N-醣類指派方面，將胰蛋白酶分解之抗體所測得之質量與一結合預測胰蛋白酶分解胜肽及N-連結醣類之數據庫比對。以MS/MS光譜上出現的醣片段確認所指派之醣胜肽。在PNGase分解方面，LM52以PNGase F(New England Biolabs)處理整夜。
6.統計學分析
圖S2與S3所示之抗體功效差異評估係利用GraphPad Prism v5.03軟體進行50%與80%抑制濃度之參數(Students配對t檢定)分析。若P 0.05，代表具有統計學上顯著差異。
結果
實施例1.
一組118株病毒分離株之序列分析顯示ibalizumab抗性與gp120 V5環狀結構之潛在性N-連結醣化作用位置(potential N-linked glycosylation sites，PNGS)的數目有關(Pace et al.,J.Acquir.Immune Defic.Syndr.Epub ahead of print：Sept.2012)。如圖1所示，V5中具有兩個N-連結醣化作用位置之病毒對於ibalizumab有敏感性，而V5中不具N-連結醣化作用位置之病毒則具有抗性。橫條代表中位數。有趣的是，因ibalizumab單一藥物治療而發展出抗性之臨床病毒分離株亦顯示缺少潛在性V5醣化作用位置(Toma et al.,J.Virology 85(8)：3872-2880,2011)。
在該組之一株野生型病毒(AC10.0.29)其V5中具有二個N-連結醣化作用位置並自然對於ibalizumab有敏感性。利用定點突變有系統地刪除此病毒之V5 N-連結醣化作用位置，所得之突變體病毒對於ibalizumab變得有抗性(見圖2)。
在該組之另一野生型病毒(RHPA4259.7)其V5中不具N-連結醣化作用位置並自然對於ibalizumab有抗性。該病毒係有系統地將N-連結醣化作用位置加入V5以進行修飾。如圖3所示，所得之突變體病毒對於ibalizumab變得有敏感性。
Ibalizumab、CD4及HIV gp120之重疊晶體結構分析顯示該gp120 V5環狀結構係相鄰於ibalizumab輕鏈與CD4之間的交互作用位置。其他模型分析顯示ibalizumab可經由立體障礙正常抑制HIV，且gp120 V5上缺 少醣可允許病毒繞過此立體障礙並躲避該ibalizumab之抗HIV活性。本發明假設在ibalizumab上接近gp120 V5之位置(例如，V5 N端附近)附加N-連結醣位置可使經修飾之ibalizumab能中和正常情況下具有ibalizumab抗性的病毒。下列實驗係為了驗證此假設所進行。
根據ibalizumab-CD4複合體之晶體結構，基於其與gp120 V5之假定接近距離選擇數個ibalizumab輕鏈之胺基酸位置。該等胺基酸位置包括30E、67、65、52、53、54、60及76，其編號係根據不具19個胺基酸訊息序列(亦即，一前導序列(leader sequence))之成熟型輕鏈，並遵照Kabat與Chothia編號方法其以胺基酸殘基起算而非以原始編號起算。舉例而言，位置「30E」是指原始位置編號為30與31之間的一段胺基酸(30A、30B、30C、30D、30E、...)中的第5個胺基酸。將潛在性N-連結醣化作用位置導入這些位置之每一者(圖4A)。如圖4B所示，突變體輕鏈之分子量皆高於野生型輕鏈(上面部分)，顯示這些突變體存在附加之醣。當以去醣基化試劑PNGase F處理突變體輕鏈時(下面部分)，其分子量降至正常ibalizumab野生型輕鏈之大小。這些數據證實，N-連結醣化作用位置確實附加至突變體輕鏈。
實施例2. Ibalizumab變體之設計
Ibalizumab抗性HIV-1病毒株之研究顯示其抗性主要係來自HIV-1套膜gp120 V5環狀結構醣類的缺少。為了進一步探究V5醣基化於ibalizumab易感受性之角色，本發明利用蛋白質資料庫(登錄號2NXY與3O2D)所報告之結構模擬gp120、CD4與ibalizumab之間的交互作用。該V5 N端醣之位置係最靠近ibalizumab L鏈(圖5A)，而該V5 C端醣則較遠離 ibalizumab(圖5B)。此模型提供一可能性，亦即將N端醣置入gp120與ibalizumab之間的空間會對gp120施加質量效應，因此破壞其構形變化(扭型及彎曲)，其為HIV-1進入標的細胞所必需。此模型亦顯示將類似大小之醣導入ibalizumab L鏈可提升其能力以抑制缺少V5 N端醣之HIV-1病毒株的進入。
因此本發明將PNGS導入ibalizumab L鏈可變區之殘基(30E、52、53、54、60、65、67及76)，該等殘基係靠近gp120 V5環狀結構。該等ibalizumab L鏈突變體(LMs)係經構築、定序及轉染至293A細胞以產生突變體蛋白質。本發明以蛋白質-A瓊脂糖層析法純化變體mAbs，並以SDS-PAGE分析(圖6A)。於293A細胞短暫表現LMs之產率係可相較於野生型ibalizumab(數據未顯示)。每一LMs相較於野生型L鏈可觀察到稍大之L鏈。為了證實分子量變大係因於醣基化，在變性條件下以PNGase F處理LMs 30E、52與53並以SDS-PAGE分析(圖6B)。如所預期，該等變體之L鏈於PNGase F處理後其分子量減少成野生型之大小。本發明接著以質譜鑑定於293A細胞常規產生之LM52 L鏈所導入之N-醣類形式。在L鏈上鑑定出超過六種形式之具有8-12個環之複雜型N-醣類，該等形式中有80%為9-11個環(圖6C)。該LM52突變體係以中和試驗檢測，突變體差異在於其醣之大小。在所有三種受測病毒中，具有較大N-連結醣類之LM52突變體蛋白質觀察到較高的中和活性(圖6D)。總之，該等數據證實N-連結醣類導入所欲之ibalizumab L鏈殘基。
實施例3. LMs之CD4結合作用及HIV-1中和作用
本發明接著以表面電漿共振評估該等ibalizumab LMs對於 人類可溶性CD4(sCD4)之結合動力學。在一使用sCD4作為分析物之Biacore試驗中，WT ibalizumab及LMs兩者與sCD4之結合作用具有類似之結合動力學。該等LMs之六者與sCD4之結合作用KD範圍為0.19nM至0.8nM(表1)，而該等數字位於野生型ibalizumab KD之2倍以內(0.43nM)。該等數據顯示在ibalizumab L鏈的該等選取位置附加N-連結醣不會明顯影響其結合CD4之能力。
本發明接著探究該LMs相較於WT ibalizumab之HIV-1中和性能力。為此，本發明檢測該LMs對一組HIV-1病毒的中和能力，該等病毒對於ibalizumab具有抗性或部分抗性，包括3種複製勝任型HIV-1病毒株(圖7)。利用此組ibalizumab抗性病毒，當WT ibalizumab之測試濃度達到2μg/mL時，觀察到平均MPI為75%及IC80為1.43μg/mL。四種LMs(LM30E、LM52、LM53與LM67)觀察到明顯改進之中和活性，其平均MPI為91-99%及IC80為0.05-0.14μg/mL(圖7及表2)。其中，LM52似乎有最好的HIV-1中和功效。 相較於ibalizumab，兩個其他變體(LM54與LM65)產生更輕微改進之病毒中和活性。有趣的是，該具有改進HIV-1中和活性之六個LMs的PNGS亦比LM60與LM76之PNGS更靠近gp120 V5(459)(表2)，其顯示HIV-1中和活性可相較於該等WT ibalizumab。因此，將N-醣類置於靠近V5似乎能改進ibalizumab變體之中和作用情況。然而，本發明人注意到除了與V5之距離以外，醣的方向亦可扮演關鍵角色。
實施例4. 醣之大小影響LM52活性
本發明研究是否醣之大小影響LMs之改進HIV-1中和活性。此研究針對LM52，因其具有優異的HIV-1中和作用情況(圖7)。欲產生一缺少任何N-連結醣之LM52型，293A細胞以LM52構築體短暫轉染之後，立即加入衣黴素(tunicamycin)，其抑制GlcNAc磷酸轉移酶。同樣地，為產生一標記有10-11環醣(高Man型之N-醣Man8GlcNAc2(Man8)或Man9GlcNAc2(Man9))之LM52型，本發明將kifunensine加入293A細胞。最後，為產生 一具有7環醣(高甘露糖(Man)型N-醣Man5GlcNAc2(Man5))之LM52型，使用N-乙醯基葡萄糖胺轉移酶I-陰性GnT1(-)HEK293S細胞。如SDS-PAGE所示，雖然加入kifunensine不會明顯改變L鏈的大小，而加入衣黴素或生長於GnT1(-)細胞明顯減少L鏈的大小(圖8A)。同樣地，相較於kifunensine存在下所產生之抗體，於衣黴素存在下或生長於GnT1(-)細胞所產生之抗體對於三種HIV-1病毒株之中和活性更嚴重降低(圖8B)。因此，當L鏈殘基52存在較大之醣類時，其觀察到較強之HIV-1中和活性。模擬結果顯示較大醣類較易置入L鏈與gp120之間的空間(圖4C)，然而醣之支鏈本質亦可影響LM52之HIV-1中和活性。
實施例5. LM52之中和廣度及功效
本發明接著檢測LM52對於一組涵蓋11個分支之118株不同HIV-1病毒株的HIV-1中和活性。在此單循環TZM-bl試驗中，相較於WT ibalizumab，LM52顯示明顯改進之中和廣度及功效(圖9及表3)。LM52對於陰性對照組病毒(鼠科白血病病毒)不具中和活性(表3)，不過其中和(其定義為50%之抑制作用)所有受測之HIV-1病毒株，對比於WT ibalizumab的92%病毒株中和能力。事實上，LM52中和97%之病毒並達到95%抑制，對比於WT ibalizumab僅31%有此結果(圖5，上面部分)。針對所有118株病毒，LM52亦具有IC50值<0.1μg/mL，對比於WT ibalizumab75%病毒有此結果(圖9，中間部分)。的確，LM52中和所有的病毒且IC80<0.3μg/mL，而有36%的病毒即使以濃度10μg/mL之WT ibalizumab中和仍未達80%之抑制功效(圖9，下面部分)。
整體而言，LM52之IC50幾何平均值為14ng/mL，對比於WT ibalizumab的74ng/mL，以及LM52之IC80幾何平均值為37ng/mL，對比於WT ibalizumab的510ng/mL(圖11)。當病毒分為ibalizumab敏感性病毒株(MPI>80%)與ibalizumab抗性病毒株(MPI80%)時，其明顯發現LM52之提升功效在ibalizumab抗性病毒株最顯著(圖12)。在ibalizumab抗性病毒方面，LM52之IC80幾何平均值為50ng/mL，對比於WT ibalizumab的幾乎10,000ng/mL。即使是在ibalizumab敏感性病毒，LM52之功效係提升約3倍。
該LM52改進活性亦可在其抗體濃度漸增之HIV-1病毒株覆蓋率比較圖中所觀察(圖10)。針對WT ibalizumab之活性改進顯而易見，並優於已知具有廣域及有效HIV-1中和活性的mAbs(PG9、VRC01、10E8及NIH45-46G54W)。LM52在所有濃度>0.01μg/mL之情況下具有最大病毒覆蓋率，並於濃度低於0.1μg/mL時達到100%。只有在濃度低於0.01μg/mL時，LM52之覆蓋率不如NIH45-46G54W，一gp120上CD4結合位置之人類mAb修飾型。然而，應注意的是，ibalizumab藉由結合至CD4以抑制HIV-1感染，而VRC01、PG9、10E8及NIH45-46 G54W藉由直接結合至病毒以抑制HIV-1感染。儘管如此，無論是否該等mAbs結合於病毒套膜或CD4，其皆以阻斷病毒進入之方式中和HIV-1感染。
實施例6. 多重醣類之效用
本發明接著測定於ibalizumab L鏈之感興趣區域附加二或三種醣類之效用。本發明於293A細胞產生LM30E-52、LM30E-53與LM52-67雙突變體，及LM30E-52-67與LM30E-53-67三突變體，且隨即純化並以SDS-PAGE分析抗體(圖13A)。相較於WT ibalizumab或單突變體LMs，雙 突變體之每一者可觀察到稍大的L鏈，且三突變體之每一者可觀察到更大的L鏈。本發明接著探究該等變體mAbs對於一組已知完全或部分具有ibalizumab抗性之HIV-1病毒株之HIV-1中和情況。一般而言，該雙與三突變體所顯示之中和活性可相較於LM52之活性(表4；圖13B，左邊部分)。事實上，IC80幾何平均值顯示相較於LM52，三突變體之功效稍低。唯一的例外在於SHIVsf162P3N病毒，一種對於雙與三突變體之敏感性高於LM52之病毒(表4；圖13B，右邊部分)。整體而言，本發明發現沒有任何證據顯示附加一個以上之醣可進一步改進LM52對於ibalizumab敏感性病毒之HIV-1中和情況。藉由附加第二種醣之LM52活性改進可能僅顯見於具有LM52抗性或部分抗性之病毒。
實施例7. LM52多重反應性之分析
部分HIV-1中和性mAbs之常見特性為其與自體抗原之交叉反應性。即使在濃度為10μg/mL，LM52及ibalizumab皆無法結合至HEp-2上皮細胞萃取物(圖14A)。此外，LM52及ibalizumab皆未顯示與單股DNA、雙股DNA、胰島素、脂多醣或鑰孔蟲戚血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)具有反應性(圖14B)。人類CD4蛋白質為ibalizumab之預期標的，為LM52僅能辨識之受測自體抗原。因此，本發明發現沒有證據顯示LM52對於自體抗原具有多重反應性。
結論
在本發明中，提供一種由MV1產生之優異型HIV-1進入阻斷性mAb產物，稱作變體LM52，其於相對低之濃度下能中和所有受測之HIV-1病毒株。LM52之病毒中和特性明顯優於野生型ibalizumab及現今許多據報告最好的抗套膜mAbs，例如，VRC01、PG9、10E8及NIH45-46G54W。結合已建立的ibalizumab人體安全記錄，該等觀察顯示LM52應是發展臨床上HIV-1治療或預防的良好選項。考量預期的(根據習知母型ibalizumab之藥物動力學特性)每月給藥時間表，此修飾之抗體可具體而言適合作為長效型PrEP試劑。
該等發現亦提供對於ibalizumab作用機制之洞悉。亦即，HIV-1於gp120 V5之N端失去一個醣以變成具有ibalizumab抗性。結果顯示由醣媒介之ibalizumab作用機制導致抗體L鏈與病毒套膜醣蛋白之間的空間衝 突(steric clash)，從而於空間上破壞HIV-1進入之步驟。本發明指出L鏈上的醣恢復ibalizumab對於ibalizumab抗性病毒株之抗病毒活性，其中將此醣置於空間上最接近V5之關鍵殘基造成最大的抗病毒效用，以及較大之醣類具有較大之病毒中和效用，其共同支持但非證明，ibalizumab經由立體障礙機制阻斷HIV-1感染。
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<210> 2
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<213> 人工序列
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<223> 合成型或重組型多胜肽(MVI之重鏈)
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<213> 人工序列
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<223> 合成型或重組型多胜肽(MVI之輕鏈)
<400> 3
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<212> PRT
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<223> 合成型或重組型多胜肽LM52之輕鏈
<400> 4
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成型或重組型多胜肽(經修飾之MVI重鏈)
<400> 5

Claims (27)

  1. 一種醣修飾抗CD4抗體，其包含一或多個N-連結醣類連接於該抗體之可變區。
  2. 如申請專利範圍第1項之抗體，其中該一或多個N-連結醣類係連接至該抗體之輕鏈可變區。
  3. 如申請專利範圍第1項之抗體，其中該抗CD4抗體為一ibalizumab修飾型，其包含在輕鏈可變區一工程化N-連結醣化作用位置。
  4. 如申請專利範圍第1項之抗體，其中該抗CD4抗體為一MV1修飾型，其包含在輕鏈可變區一工程化N-連結醣化作用位置。
  5. 如申請專利範圍第4項之抗體，其中該MV1為一抗CD4 IgG 1抗體，其具有如SEQ ID NO：2所述之重鏈胺基酸序列，及如SEQ ID NO：3所述之輕鏈胺基酸序列。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之抗體，其包含在該重鏈Fc區或FcRn區之一或多個修飾。
  7. 如申請專利範圍第1至6項中任一項之抗體，其中該工程化N-連結醣化作用位置係位於該輕鏈之胺基酸位置，其中該胺基酸位置係選自於由30E、52、53、54、60、65、67、76及其組合所組成之群組。
    8.如申請專利範圍第7項之抗體，其中該工程化N-連結醣化作用位置係位於該輕鏈之胺基酸位置，其中該胺基酸位置選自於由30EGln、52Ser、53Thr、54Arg、60Asp、65Ser、67Ser、76Ser及其組合所組成之群組。
  8. 如申請專利範圍第8項之抗體，其中該工程化N-連結醣化作用位置係位於該輕鏈之胺基酸位置，其中該胺基酸位置選自於由30EGln、52Ser、 53Thr、54Arg、65Ser及67Ser組成之群組。
  9. 如申請專利範圍第9項之抗體，其中該工程化N-連結醣化作用位置係位於52Ser。
  10. 如申請專利範圍第10項之抗體，其包含如SEQ ID NO：4所述之輕鏈胺基酸序列。
  11. 如申請專利範圍第11項之抗體，其包含如SEQ ID NO：4所述之輕鏈胺基酸序列及如SEQ ID NO：5所述之重鏈胺基酸序列。
  12. 一種醣修飾抗CD4抗體，其包含如SEQ ID NO：4所述之輕鏈胺基酸序列，及如SEQ ID NO：5所述之重鏈胺基酸序列。
  13. 如申請專利範圍第1至10項中任一項之抗體，其中該N-連結醣類包含至少7個醣單元。
  14. 如申請專利範圍第14項中任一項之抗體，其中該N-連結醣類包含10-11個醣單元。
  15. 一種包含編碼抗CD4免疫球蛋白鏈之核酸序列的表現載體，其輕鏈可變區具有如申請專利範圍第1至13項中任一項所定義之工程化N-連結醣化作用位置。
  16. 如申請專利範圍第16項之表現載體，其中該抗CD4免疫球蛋白鏈為ibalizumab之輕鏈。
  17. 如申請專利範圍第16項之表現載體，其中該抗CD4免疫球蛋白鏈為MV1之輕鏈。
  18. 如申請專利範圍第16項之表現載體，其包含編碼抗CD4免疫球蛋白鏈之核酸序列，其輕鏈可變區具有如申請專利範圍第11項所定義之工程 化N-連結醣化作用位置。
  19. 一種宿主細胞，其以申請專利範圍第16至19項中任一項之表現載體進行轉形。
  20. 一種醫藥組合物，其包含如申請專利範圍第1至15項中任一項之抗體及至少一醫藥上可接受載體。
  21. 一種抑制個體HIV感染之方法，其包含投予該個體一治療有效量之如申請專利範圍第1至15項中任一項之抗體。
  22. 一種治療感染HIV之個體的方法，其包含投予該個體一治療有效量之如申請專利範圍第1至15項中任一項之抗體。
  23. 一種預防個體HIV感染之方法，其包含投予該個體一治療有效量之如申請專利範圍第1至15項中任一項之抗體。
  24. 一種預防HIV陽性懷孕個體傳染HIV病毒至胎兒之方法，其包含投予該個體一治療有效量之如申請專利範圍第1至15項中任一項之抗體。
  25. 一種預防HIV陽性個體傳染HIV病毒至HIV陰性伴侶之方法，其包含投予該HIV陽性個體或該HIV陰性伴侶一治療有效量之如申請專利範圍第1至15項中任一項之抗體。
  26. 一種具有改進活性的醣修飾單株抗體，其包含以N-連結醣類連接至該抗體之可變區。
  27. 如申請專利範圍第27項之抗體，其中該N-連結醣類係連接至該抗體之輕鏈可變區。
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