ES2862950T3 - Anticuerpos anti-CD4 modificados con glicanos para la prevención y terapia del VIH - Google Patents

Abstract

Una forma de anticuerpo ibalizumab modificado con glicanos, que comprende un sitio de glicosilación ligado a N modificado en la región variable de la cadena ligera, seleccionado del grupo que consiste de (i) un sitio de glicosilación ligado a N modificado Asn-Ala-Thr localizado en una posición de aminoácidos de la cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de 30EGln, 53Thr, 54Arg, 65Ser y 67Ser; y (ii) un sitio de glicosilación ligado a N modificado Asn-Ser-Thr localizado en una posición de aminoácidos 52Ser como se identifica en la Seq ID No. 3 en base a la versión madura de la cadena ligera sin la secuencia señal de 19 aminoácidos y siguiendo el Esquema de Numeración de Kabat y Chothia.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-CD4 modificados con glicanos para la prevención y terapia del VIH

CAMPO DE LA DIVULGACIÓN

Esta divulgación se refiere de manera generalmente a la prevención y el tratamiento del VIH. Esta divulgación también se refiere de manera general a la modificación con glicanos de anticuerpos. En particular, esta divulgación se refiere a anticuerpos anti-CD4 modificados con glicanos útiles para la prevención y la terapia del VIH. ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

La entrada del VIH-1 se desencadena por la interacción de la glicoproteína gp120 de la envoltura viral (Env) con el dominio 1 (D1) del receptor de células T CD4. El ibalizumab (iMab) es un Ab potente y ampliamente neutralizante del VIH-1 (Jacobson et al., Antimicrob. Agents Chemother. 53:450-457, 2009; Kuritzkes et al., J. Infect. Dis. 189:286-291, 2004), que neutraliza el VIH uniéndose principalmente al dominio 2 (D2) del receptor de CD4 en las células T del huésped, bloqueando de este modo la capacidad del VIH para usar estos receptores de CD4 para introducirse en las células T y producir una infección (Burkly et al.., J. Immunol. 149:1779-178, 1992). En un panel grande de aislados primarios (118 virus pseudotipados de Env) probados recientemente, ibalizumab neutralizó el 92% de todos los virus como se define por el 50% de inhibición de la infección y el 47,4% de los virus como se define por el 90% de inhibición de la infección. Aunque el ibalizumab puede inhibir de manera potente una amplia variedad de aislados del VIH, una fracción significativa de las variantes del VIH aún puede escapar de la actividad inhibidora del ibalizumab. Recientemente se ha informado que la pérdida de sitios de glicosilación ligados a asparagina en la región variable 5 de la envoltura del VIH tipo 1 está asociada con resistencia a ibalizumab (Toma et al., J. Virology 85(8): 3872-2880, 2011; Pace et al., J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Epubantes de la impresión: septiembre de 2012).

Los anticuerpos se glicosilan en posiciones conservadas en sus regiones constantes, y la presencia y estructura del carbohidrato unido a la región constante pueden afectar a la actividad del anticuerpo (ver la revisión de Wright y Morrison, TIBTECH 15: 26-32, 1997).

Se ha informado que la introducción de un carbohidrato ligado a N en la cadena pesada, no en la cadena ligera, dio como resultado una solubilidad mejorada (Pepinsky et al., Protein Sci 19, 954-966, 2010; Wu, et al., Protein Eng Des Sel 23, 643-651, 2010). En Pepinsky, la modificación estaba en la región constante, no en la región variable.

La EP2377886 A1 divulga un anticuerpo anti-beta-amiloide que comprende un Asn glicosilado en la región variable de la cadena pesada. Este anticuerpo muestra una actividad mejorada en comparación con el anticuerpo no glicosilado, es decir, una capacidad aumentada para cruzar la barrera hematoencefálica y una capacidad aumentada para reducir la carga de placa. Wright (EMBO, 1991) divulga un anticuerpo en el que la glicosilación ligada a N dentro de la parte de la VH aumentaría la afinidad. Tachibana et al. (Cytotechnology, 1997) divulga una afinidad mejorada de un anticuerpo modificando el sitio de glicosilación en la región variable de la cadena ligera. La WO 2006/125207 A2 divulga un sitio de N-glicano en la región variable de la cadena ligera o pesada. Wu et al. (Protein Eng Des Sel, 2010) divulga la introducción de un sitio de N-glicosilación de consenso en H-CDR2 que lleva a una solubilidad mejorada. Leung et al. (J Immunol, 1995) divulga la introducción de un sitio de glicosilación ligado a N dentro del segmento FR-1 del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-CEA. Endo et al. (Mol Immunol, 1995) divulga anticuerpos con sitios de glicosilación dentro de CDR2.

Sin embargo, ninguno de los estudios anteriores proporciona el efecto de un glicano colocado estratégicamente en la región variable de un anticuerpo.

SUMARIO DE LA DIVULGACIÓN

La presente invención proporciona un nuevo enfoque para mejorar la actividad de los anticuerpos monoclonales mediante la modificación de glicanos en la región variable de la cadena ligera. En varias realizaciones, la invención proporciona los anticuerpos monoclonales anti-CD4 modificados con glicanos, los vectores de expresión y las líneas celulares útiles para la producción de tales anticuerpos y el uso de tales anticuerpos para la prevención y la terapia del VIH.

En un aspecto, la presente invención proporciona una forma modificada con glicanos del anticuerpo ibalizumab, que comprende un sitio de glicosilación ligado a N modificado en la región variable de la cadena ligera, seleccionado del grupo que consiste de (i) un sitio de glicosilación ligado a N modificada Asn-Ala-Thr localizado en una posición de aminoácidos de la cadena ligera seleccionado del grupo que consiste de 30EGln, 53Thr, 54Arg, 65Ser y 67Ser; y (ii) un sitio de glicosilación ligado a N modificado Asn-Ser-Thr localizado en una posición de aminoácido 52Ser como se identifica en la SEQ ID NO: 3.

En una realización de la invención, el anticuerpo modificado con glicano es un ibalizumab de tipo salvaje (WT) o modificado, mutante de ibalizumab. En la presente invención, el sitio de glicosilación está en la posición de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las posiciones 30E Gln, 52Ser, 53Thr, 54Arg, 65Ser y 67Ser. En algunos ejemplos, el sitio de glicosilación en 30E Gln, 52Ser, 53Thr, 54Arg, 65Ser o 67Ser proporciona una actividad mejorada. En un ejemplo particular de la invención, el sitio de glicosilación está en la posición 52Ser como se identifica en la SEQ ID NO: 3.

Un ejemplo particular de la invención proporcionó un anticuerpo anti-CD4 modificado con glicano, denominado LM52, que se prepara como un anticuerpo IgG 1 con afinidad para CD4 (anticuerpo IgG 1 anti-CD4) modificado mediante la introducción de un glicano ligado a N en la posición 52.

En otro ejemplo particular de la invención, se proporciona un anticuerpo anti-CD4 modificado con glicano con reciclado mejorado de dicho anticuerpo, que tiene la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera como se expone en la SEQ ID NO: 4, y la cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 5.

En algunas realizaciones, los glicanos ligados a N unidos al anticuerpo están compuestos por al menos 7 unidades de carbohidratos. En otras realizaciones, los glicanos ligados a N se componen de 10-11 unidades de carbohidratos.

En realizaciones adicionales de la invención, se proporcionan vectores de expresión y células huésped, que son útiles para expresar el anticuerpo modificado con glicanos de la presente invención.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal modificado con glicanos que tiene una actividad mejorada, en el que el anticuerpo anti-CD4 modificado con glicanos tiene glicanos ligados a N unidos a la región variable como se ha definido anteriormente. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la invención es eficaz para inhibir, tratar o/y prevenir la infección de las células objetivo por el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 ("VIH-1'').

En un aspecto más, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD4 modificado con glicanos de la invención y por lo menos un portador farmacéuticamente aceptable.

La presente invención también divulga un método para inhibir, tratar y/o prevenir la infección y la transmisión del VIH, que comprende administrar a un sujeto con necesidad de ello una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD4 modificado con glicanos de la invención, y por lo menos un portador farmacéuticamente aceptable.

En el último aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal modificado con glicanos con actividad mejorada que comprende glicanos ligados a N unidos a la región variable de dicho anticuerpo, particularmente en la región variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

El resumen anterior, así como la siguiente descripción detallada de la divulgación, se comprenderán mejor cuando se lean junto con los dibujos adjuntos. Con el propósito de ilustrar la divulgación, se muestran en los dibujos las realizaciones que se prefieren actualmente. Debe entenderse, sin embargo, que la divulgación no se limita a las realizaciones.

En los dibujos:

La Figura 1 muestra el número de sitios de glicosilación potenciales ligados a N (PNGS) V5 asociados con la resistencia a ibalizumab (la barra indica la mediana).

La Figura 2 muestra la pérdida de PNGS V5 N-terminales que confiere resistencia del VIH a ibalizumab.

La Figura 3 muestra el efecto de la introducción de un PNGS V5 N-terminal sobre la sensibilidad del VIH al ibalizumab.

La Figura 4 proporciona una imagen que muestra la estructura cristalina del complejo ibalizumab-CD4 como se representa, indicando varios sitios en la cadena ligera de ibalizumab que fueron mutados para introducir un sitio de glicosilación ligado a N basado en su cercana distancia a la V5 de gp120.

La Figura 5 proporciona el modelo de glicosilación en V5 de gp120 de VIH-1, en el contexto tanto de CD4 como de ibalizumab (usando PyMOL); en donde el complejo se modeló superponiendo la estructura de D1 y D2 de CD4 en complejo con gp 120 (número de registro de Protein Data Bank 2NXY) en los mismos dominios de CD4 en complejo con ibalizumab (PDB 302D); y el glicano (azul) se introdujo en la asparagina relevante superponiendo la asparagina con la de una asparagina enlazada a glicano de PDB 3TYG; y las cadenas pesada y L de ibalizumab se muestran como tiras cian y magenta, respectivamente. Los dos primeros dominios del CD4 humano son verdes, mientras que la gp120 del VIH-1 es de color tostado; en donde la Figura 5A muestra Man5GlcNaC2 en la posición 459 de gp120 en el giro V5 (N-terminal); y la Figura 5B muestra Man5GlcNac2 en la posición 463 de gp120 en el giro V5 (C-terminal).

La Figura 6 muestra la glicosilación ligada a N en la cadena L de ibalizumab; en donde:

La Figura 6A muestra los mutantes de la cadena L de ibalizumab (LM) construidos, cotransfectados en células 293A con el plásmido de la cadena H de ibalizumab WT, purificados en una columna de agarosa de proteína A, y analizados por SDS-PAGE (el ibalizumab WT se analizó de la misma manera).

La Figura 6B muestra los anticuerpos WT, LM30E, LM53 y LM52 purificados que se trataron con o sin PNGasa F en condiciones desnaturalizantes y se analizaron mediante SDS-PAGE.

La Figura 6C muestra las glicoformas ligadas a N en la cadena L de LM52 producidas en células 293A que fueron analizadas por espectrometría de masas.

La Figue 6D muestra que se observó una correlación positiva entre el tamaño del glicano y la actividad de neutralización.

La Figura 7 muestra las actividades de neutralización de ibalizumab WT y sus LM; en donde se midió la neutralización contra un panel de pseudovirus resistentes a ibalizumab o parcialmente resistentes a ibalizumab o cepas de VIH-1 competentes para replicación mediante el ensayo TZM-bl; 96USHIPs9, BK132/GS009 y 96USHIPs7 eran competentes en replicación; CAAN5342.A2-dd y AC10.0.29-dd eran mutantes de Env dirigidos al sitio sin ningún PNGS en V5 y eran resistentes o parcialmente resistentes a la neutralización por ibalizumab de tipo salvaje; 9015-07 A1 y 1051-D927 eran virus fundadores transmitidos por el clado B (los datos representan tres experimentos independientes).

La Figura 8 muestra la influencia del tamaño del glicano sobre la actividad de neutralización del VIH-1 de LM52, en donde:

La Figura 8A muestra que LM52 se produjo en células HEK293A con o sin tunicamicina (LM52-T) o kifunensina (LM52-K); alternativamente, LM52 se produjo en células HEK293S GnT1(-) negativas para N-acetilglucosaminiltransferasa I (LM52-G); las proteínas LM52 purificadas, junto con LM52 sin modificar e ibalizumab WT, se analizaron mediante SDS-PAGE.

La Figura 8B muestra las actividades de neutralización de ibalizumab y diferentes variantes de glicanos de LM52 contra tres pseudovirus resistentes a ibalizumab, medidos en células TZM-bl.

La Figura 8C muestra la representación (utilizando PyMOL) del espacio llenado por glicanos de conformaciones y tamaños representativos, cuando se etiqueta en el residuo 52 de ibalizumab. La representación se basa en el modelo generado en la Figura 5y los colores eran los mismos; en donde el N-glicano de 7 anillos, MansGlcNac2, se extrajo de la entrada 3TYG de PDB. Se extrajo un N-glicano de 11 anillos, Man3GlcNacsFuc, de la entrada 3QUM de PDB (estos resultados representan tres experimentos independientes).

La Figura 9 muestra la neutralización de un panel de 118 pseudovirus Env del VIH-1; en donde se midió la neutralización por LM52 e ibalizumab WT en un ensayo TZM-bl; en donde para cada virus, barras negras indican el porcentaje de inhibición máxima (MPI) cuando se probó a concentraciones de Ab de hasta 10 pg/ml, y la IC50 (pg/ml) o IC80 (pg/ml) correspondientes; los virus se ordenaron por MPI descendente para ibalizumab; dado el gran número de virus que se están probando, este experimento se realizó solo una vez.

La Figura 10 muestra la cobertura de la cepa del VIH-1 de LM52. Cobertura viral de los bnAb ibalizumab WT, LM52 y PG9, 10E8, VRC01 y NIH45-46G54W VIH-1. Se analizaron LM52 e ibalizumab hasta 10 pg/ml, mientras que los otros anticuerpos monoclonales se analizaron hasta 50 pg/ml.

La Figura 11 proporciona el resumen de la actividad de neutralización de LM52 e ibalizumab contra un panel diverso de 118 pseudovirus Env del VIH-1, como se refleja en su IC50 (pg/ml) y IC80 (pg/ml); en donde las líneas rojas mostraban los valores medios geométricos y el intervalo de confianza del 95% (cada punto representa una cepa viral individual).

La Figura 12 muestra los valores de IC80 de LM52 e ibalizumab frente a virus sensibles a ibalizumab o resistentes a ibalizumab (resistencia definida como IC80 > 10 pg/ml).

La Figura 13A muestra los tamaños de la cadena H y la cadena L de ibalizumab y sus variantes de glicano simple, doble y triple analizadas por SDS-PAGE.

La Figura 13B muestra las actividades de neutralización de ibalizumab, LM52 y varios mutantes de glicano dobles o triples contra dos pseudovirus resistentes a ibalizumab en células TZM-bl.

La Figura 14 proporciona los resultados del análisis de polirreactividad de LM52; en donde

La Figura 14A muestra la reactividad de HEp-2 de LM52 e ibalizumab medida por ELISA usando el kit Quanta Lite ANA ELISA (INOVA Diagnostics); en donde el control negativo fue un suero humano sin anticuerpos contra antígenos nucleares y citoplasmáticos; y los controles positivos fuertes y débiles eran sueros humanos que se sabía que tenían cantidades abundantes y pequeñas, respectivamente, de anticuerpos contra antígenos nucleares y citoplasmáticos.

La Figura 14B muestra la reactividad de LM52 e ibalizumab con ADN de cadena sencilla, ADN de cadena doble, insulina, lipopolisacárido, KLH y CD4, medido mediante ensayo ELISA; donde estos resultados se derivaron de tres experimentos independientes.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención ha demostrado por primera vez que la función de un anticuerpo monoclonal puede mejorarse mediante la modificación de glicanos en la región variable. En particular, se ha descubierto en la presente invención que el injerto de glicanos en la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal anti-CD4 ibalizumab puede restaurar una interacción mediada por glicanos entre el anticuerpo y el VIH, de tal manera que el anticuerpo con una modificación de glicano inhibe de potentemente la infección de aislados virales que normalmente escapan a la actividad de la molécula de anticuerpo original (sin la modificación de glicano).

Por consiguiente, la presente invención proporciona formas modificadas con glicanos del anticuerpo monoclonal anti-CD4 ibalizumab, componentes como vectores de expresión y líneas celulares útiles para la producción de tales anticuerpos y el uso de tales anticuerpos para la prevención y terapia del VIH.

Definiciones

Un "antígeno" se refiere a una molécula que contiene uno o más epítopos y que es capaz de provocar una respuesta inmunológica. Las "moléculas antigénicas" también se usan en un sentido general para referirse a moléculas que son objetivos de unión de las proteínas modificadas con glicanos divulgadas en la presente.

Un "epítopo", también conocido como determinante antigénico, es la porción de una molécula o moléculas antigénicas que es reconocida por el sistema inmune, es decir, células B, células T o anticuerpos. Un epítopo puede ser un epítopo conformacional o un epítopo lineal. Un epítopo conformacional está formado por secciones discontinuas de una molécula antigénica, o está formado por múltiples moléculas. En el caso de que el antígeno sea una proteína, puede formarse un epítopo conformacional por residuos de aminoácidos discontinuos de la misma molécula de proteína, o por residuos de aminoácidos en diferentes moléculas de la proteína (por ejemplo, un epítopo cuaternario formado por un multímero de la proteína). Un epítopo lineal está formado por secciones continuas de un antígeno, por ejemplo, una secuencia continua de aminoácidos de un antígeno de proteína.

El término "anticuerpo" se usa en la presente de manera amplia y abarca moléculas de anticuerpos intactos, que incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, monoespecíficos, poliespecíficos, quiméricos, humanizados, humanos, primatizados, de cadena sencilla, de dominio único, sintéticos y recombinantes intactos y fragmentos de anticuerpos que tienen una actividad o función deseada.

El término "fragmentos de anticuerpo", como se usa en la presente, incluye particularmente fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de unión a antígeno incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab (que consisten en los dominios VL, VH, CL y CH1), fragmentos Fab' (que difieren de los fragmentos Fab por tener unos pocos residuos adicionales en el extremo C-terminal). del dominio CH1 que incluyen una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo), fragmentos (Fab')2 (formados por dos fragmentos Fab' enlazados por un puente disulfuro en la región bisagra), fragmentos Fd (que consisten de los dominios VH y CH1), fragmentos Fv (que se refieren a un dímero de un dominio variable de una cadena pesada y una ligera apretados, asociación no covalente que contiene un sitio de unión y reconocimiento de antígenos completo), fragmentos dAb (que consisten en un dominio VH), fragmentos de dominio único (dominio VH, dominio VL, dominio VHH o dominio VNAR), regiones CDR aisladas, scFv (o "Fv de cadena sencilla", que se refiere a una fusión de los dominios VL y VH, enlazados entre sí mediante un conector), y otros fragmentos de anticuerpos que retienen la función de unión al antígeno.

El término "región variable" se refiere a la región de unión al antígeno de un anticuerpo, que varía enormemente entre diferentes moléculas de anticuerpos. La región de un anticuerpo que no varía de la misma manera y generalmente se involucra en funciones efectoras del sistema inmunológico se denomina "región constante". Aproximadamente los primeros 110 aminoácidos de una cadena de inmunoglobulina (forma madura) constituyen su dominio variable. Los dos dominios variables de la cadena pesada (VH) y los dos dominios variables de la cadena ligera (VL) constituyen la región variable de un anticuerpo. Los seis dominios constantes de la cadena pesada (CH1, CH2 y CH3) y los dos dominios constantes de la cadena ligera (CL) constituyen la región constante de un anticuerpo.

El término "CDR" o "región determinante de la complementariedad" se refiere a las regiones hipervariables dentro del dominio variable de un anticuerpo. Hay 3 CDR en cada uno de los dominios variables de cadena pesada y cadena ligera, y están compuestos por residuos de aminoácidos responsables de la unión al antígeno. El término "región marco" o "FR" se refiere a las porciones más conservadas de los dominios variables y está compuesta por residuos distintos de los residuos de la región hipervariable.

El término "sitio de unión al antígeno" de un anticuerpo significa una conformación y/o configuración formada por aminoácidos del anticuerpo al que se une un antígeno. Por ejemplo, las tres CDR de cada uno de los dominios VH y VL interactúan para definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Juntas, las seis CDR confieren especificidad de unión al antígeno al anticuerpo. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que un único dominio variable (es decir, VH o VL) también puede reconocer y unirse al antígeno, aunque a menudo con menos eficacia que el sitio de unión completo con las seis CDR.

El término "anticuerpo quimérico" se refiere a anticuerpos que contienen polipéptidos de diferentes fuentes, por ejemplo, diferentes especies o diferentes clases o subclases de anticuerpos. Los ejemplos de anticuerpos quiméricos incluyen una porción de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal murino fusionado con un fragmento Fc de una inmunoglobulina humana. Los métodos para elaborar anticuerpos quiméricos se conocen en la técnica; por ejemplo, métodos descritos en patentes por la Patente de Estados Unidos 4.816.397 de Boss et al. y la Patente de Estados Unidos 4.816.567 de Cabilly et al.

El término "anticuerpo humanizado" se refiere a anticuerpos que contienen elementos de secuencia no humanos en una estructura principal o marco de inmunoglobulina humana. Generalmente, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región hipervariable (CDR) del receptor se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene una especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región marco (FR) de la inmunoglobulina humana también se reemplazan por residuos no humanos. Los anticuerpos humanizados también pueden, en algunos casos, contener residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donante y que se introducen para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, un anticuerpo humanizado contiene sustancialmente la totalidad de por lo menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones hipervariables corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones marco son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. Un anticuerpo humanizado también contiene opcionalmente por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Los métodos para elaborar anticuerpos humanizados están documentados en la técnica; ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 5.225.539 de Winter y la Patente de Estados Unidos 4.816.397 de Boss et al.

El término "anticuerpo primatizado no humano" se refiere a anticuerpos que contienen elementos de secuencias humanas o elementos de secuencias que no son de primates en una estructura principal o marco de inmunoglobulina de primates no humanos. Por ejemplo, pueden elaborarse anticuerpos primatizados no humanos a partir de una inmunoglobulina de primates no humanos (anticuerpo receptor) reemplazando residuos en una región hipervariable (CDR) del anticuerpo receptor con residuos de una región hipervariable de un anticuerpo donante de un humano o especies que no son primates como ratón, rata o conejo que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. Alternativamente, los anticuerpos primatizados no humanos pueden hacerse adecuados para la administración a una especie de primate deseable mediante el uso de una inmunoglobulina receptora que tenga secuencias humanas o que no sean de primate o secuencias de una especie de primate diferente e introduciendo el fragmento Fc, y/o residuos, incluyendo particularmente residuos de la región marco, del primate deseable, en la inmunoglobulina receptora. Los ejemplos de anticuerpos primatizados no humanos incluyen anticuerpos "monizados" divulgados en la presente en la sección de Ejemplos.

El término "anticuerpo monoespecífico" se refiere a anticuerpos que reconocen y se unen a un epítopo.

El término "anticuerpo poliespecífico" se refiere a anticuerpos formados a partir de por lo menos dos anticuerpos separados y que se unen a múltiples (es decir, dos o más) epítopos separados.

El término "anticuerpo neutralizante" se refiere a un anticuerpo que inhibe, reduce o previene completamente la infección por VIH-1. Puede determinarse si un anticuerpo es un anticuerpo neutralizante mediante los ensayos in vitro descritos en la sección de Ejemplos a continuación.

El término "anticuerpo neutralizante potente" se refiere a un anticuerpo que, cuando se usa en una concentración baja, reduce la infección por VIH-1 en por lo menos un 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más.. Las concentraciones por debajo de 50 pg/ml, entre 1 y 50 pg/ml, o incluso por debajo de 1 pg/ml, se consideran "concentraciones bajas". En algunas realizaciones, las concentraciones bajas son concentraciones en el intervalo picomolar, como 10-900 ng/ml, e incluyen cualquier concentración en ese intervalo, como 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 75, 50, 25, 10 ng/ml o incluso menos de 10 ng/ml.

El término "anticuerpo neutralizante amplio" se refiere a un anticuerpo que inhibe la infección por VIH-1, como se define por una inhibición del 50% de la infección in vitro, en más del 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más, de un panel grande de (más de 100) virus pseudotipados de la envoltura del VIH-1 y aislamientos virales; por ejemplo, un gran panel de aislados que representan la diversidad de la envoltura por geografía, clado, tropismo y etapa de la infección.

El término "fragmento" como se usa en la presente se refiere a una porción físicamente contigua de la estructura primaria de una biomolécula. En el caso de las proteínas, un fragmento puede estar definido por una porción contigua de la secuencia de aminoácidos de una proteína y puede tener por lo menos 3-5 aminoácidos, por lo menos 6-10 aminoácidos, por lo menos 11-15 aminoácidos, por lo menos 16-24 aminoácidos, por lo menos 25-30 aminoácidos, por lo menos 30-45 aminoácidos y hasta la longitud total de la proteína menos unos pocos aminoácidos. En el caso de los polinucleótidos, un fragmento se define por una porción contigua de la secuencia de ácidos nucleicos de un polinucleótido y puede tener por lo menos 9-15 nucleótidos, por lo menos 15-30 nucleótidos, por lo menos 31-45 nucleótidos, por lo menos 46- 74 nucleótidos, por lo menos 75-90 nucleótidos y por lo menos 90­ 130 nucleótidos. En algunas realizaciones, los fragmentos de biomoléculas son fragmentos inmunogénicos.

Una "proteína de fusión" se refiere a dos o más péptidos de diferentes orígenes conectados entre sí mediante un conector o conectores. Por ejemplo, una proteína de fusión puede incluir una proteína conjugada con un anticuerpo. Otros ejemplos incluyen, un anticuerpo conjugado con un anticuerpo diferente o un anticuerpo conjugado con un fragmento Fab. El fragmento Fab puede conjugarse con el extremo N terminal o el extremo C terminal de la cadena pesada o ligera del anticuerpo, u otras regiones dentro del anticuerpo.

Un "péptido" es cualquier compuesto formado por el enlace de dos o más aminoácidos mediante enlaces amida (péptido), habitualmente un polímero de alfa-aminoácidos en el que el grupo alfa-amino de cada residuo de aminoácidos (excepto el extremo terminal NH2) está enlazado al grupo alfa-carboxilo del siguiente residuo en una cadena lineal. Los términos péptido, polipéptido y poli(aminoácido) se usan en la presente como sinónimos para referirse a esta clase de compuestos sin restricción de tamaño, a menos que se indique lo contrario. Los miembros de esta clase que tienen un gran tamaño también se denominan proteínas e incluyen anticuerpos.

Anticuerpos monoclonales anti-CD4 modificados con glicanos

Esta estrategia de modificación de glicanos divulgada en la presente es aplicable al anticuerpo monoclonal anti-CD4 ibalizumab. El presente enfoque también es aplicable a fragmentos del anticuerpo monoclonal anti-CD4, especialmente fragmentos de unión al antígeno de ibalizumab.

En la técnica se han descrito anticuerpos anti-CD4 y también pueden generarse fácilmente ya que la secuencia de proteínas del receptor de CD4 está disponible para los expertos en la técnica. CD4 tiene cuatro dominios de inmunoglobulina (D1 a D4) que están localizados en la superficie extracelular de la célula y usa su dominio D1 para interactuar con el dominio p2 de moléculas MHC de clase II. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD4 se une a uno o más de D1, unión D1-D2, D2, el giro BC o FG de D2, o cualquier combinación de los mismos. En realizaciones específicas, los anticuerpos anti-CD4 usados en esta divulgación se dirigen principalmente al segundo dominio similar a inmunoglobulina (D2) (posiciones de aminoácidos 98-180) del receptor de CD4. Los anticuerpos dirigidos al dominio D2 de CD4 tienen la propiedad deseable de bloquear la infección por VIH sin interferir con las funciones inmunitarias mediadas por la interacción de CD4 con las moléculas de clase II del complejo principal de histocompatibilidad (MHC). El anticuerpo anti-CD4 usado en la presente invención se une a un epítopo localizado en el giro BC de D2 cerca de la unión D1-D2 del receptor de CD4 (aminoácidos 121-127). En otras realizaciones más, el anticuerpo anti-CD4 usado en la presente invención se une al giro FG de D2 (aminoácidos 163-165) y parte de D1 (aminoácidos 77-96). La numeración de los aminoácidos corresponde a las posiciones de la forma madura del receptor de CD4, sin incluir el péptido señal. La secuencia de aminoácidos del receptor de CD4 humano se expone en la SEQ ID NO: 1, en la que los aminoácidos 1-25 representan un péptido señal, los aminoácidos 26-122 constituyen D1 y los aminoácidos 123-205 constituyen D2.

El anticuerpo monoclonal anti-CD4 de la invención es el anticuerpo humanizado, ibalizumab o "iMab" (anteriormente conocido como TNX-355 o hu5A8). El ibalizumab bloquea de manera potente la infección por un amplio espectro de aislados de VIH-1 y se dirige a un epítopo localizado en el giro BC de D2 cerca de la unión D1-D2 del receptor de CD4, sin interferir con las funciones inmunitarias mediadas por la interacción de CD4 con las moléculas de clase II del complejo de histocompatibilidad principal (MHC). Un ejemplo de anticuerpo anti-CD4 es el proporcionado en Patente de Estados Unidos N° 5.871.732.

En otra realización, el anticuerpo anti-CD4 o un fragmento del mismo es un mutante de ibalizumab con estabilidad mejorada. Un ejemplo es el anticuerpo anti-CD4 que tiene una o más sustituciones en la región bisagra que evitan la formación de enlaces disulfuro intracadena dando como resultado moléculas de anticuerpo con estabilidad bivalente sorprendentemente mejorada, por ejemplo, las proporcionadas en la WO2008134046 (A1), publicada el 27 de abril de 2007.

Un anticuerpo anti-CD4 puede generarse mediante IgG 4 o IgG 1. En un ejemplo de la divulgación, se preparó un anticuerpo anti-CD4 IgG 1 con afinidad de unión para CD4, designado como MV1. El MV1 tiene un cambio de leucina a fenilalanina en la posición 234, un cambio de leucina a ácido glutámico en la posición 235 y un cambio de prolina a serina en la posición 331 de la región constante de IgG 1. El MV1 tiene las secuencias de aminoácidos para la cadena pesada y la cadena ligera como se expone en las SEQ ID NO: 2-3, respectivamente.

En algunos ejemplos de la divulgación, el anticuerpo anti-CD4 puede comprender una o más modificaciones en la región Fc o región FcRn de la cadena pesada para mejorar el reciclado del anticuerpo anti-CD4. Un ejemplo particular es el anticuerpo anti-CD4 que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada como se expone en la SEQ ID NO: 5.

La modificación de glicanos divulgada en la presente implica la adición de glicanos a un sitio de glicosilación ligado a N modificado dentro de la región variable del anticuerpo anti-CD4 ibalizumab. En células eucariotas, los glicanos se unen a residuos de asparagina dentro de la secuencia de consenso Asn-X-Ser/Thr de los polipéptidos recién sintetizados a medida que emergen del ribosoma. Este proceso de glicosilación ligado a N es un proceso dirigido por enzimas que se produce en el RE y el aparato de Golgi. Para los propósitos de la presente invención, el residuo Asn dentro de una secuencia de consenso Asn-X-Ser/Thr se denomina "sitio de glicosilación ligado a N". El experto en la técnica puede emplear una variedad de técnicas de clonación molecular para modificar un sitio de glicosilación ligado a N dentro de la región variable de un anticuerpo monoclonal anti-CD4, que puede incluir una o más inserciones, deleciones y/o sustituciones de aminoácidos para obtener una secuencia de glicosilación ligada a N de consenso Asn-X-Ser/Thr.

Puede modificarse un sitio de glicosilación ligado a N dentro del dominio V de la cadena ligera (VL) de un anticuerpo monoclonal anti-CD4. Se puede considerar realizar un análisis de modelado 3-D de los anticuerpos relevantes, el receptor de CD4 y la proteína gp120 del VIH para facilitar la determinación de una localización adecuada o más deseable dentro del anticuerpo para un sitio de glicosilación ligado a N. Como se ilustra, la presente divulgación demuestra que para ibalizumab u otro anticuerpo anti-CD4, puede introducirse un sitio de glicosilación ligado a N en una localización cercana al giro V5 de la proteína gp120 del VIH unida al dominio 1 de CD4 en un análisis de modelado 3-D.

De acuerdo con la invención, un sitio de glicosilación ligado a N se modifica en una posición de aminoácidos de la cadena ligera de ibalizumab o posiciones correspondientes de la misma, seleccionada de los residuos 30E, 52, 53, 54, 60, 65 y 67 y 76, y una combinación de los mismos. En particular, la posición del aminoácido se selecciona del grupo que consiste de las posiciones 30E Gln, 52Ser, 53Thr, 54Arg, 65Ser y 67Ser. De acuerdo con la divulgación, se proporcionan a continuación cada uno de los cambios de aminoácidos realizados en la secuencia representada por "30E Gln", "52Ser", "53Thr", "54Arg", "65Ser" y "67Ser" para introducir un nuevo sitio de glicosilación ligado a N:

30E Gln: 30E Gln, 31 Lys, 32Asn cambiado a 30E Asn, 31 Ala, 32Thr

52Ser: 52Ser, 53Thr, 54Arg cambiado a 52Asn, 53Ser, 54Thr

53Thr: 53Thr, 54Arg, 55Glu cambiado a 53Asn, 54Ala, 55Thr

54Arg: 54Arg, 55Glu, 56Ser cambiado a 54Asn, 55Ala, 56Thr

65Ser: 65Ser, 66Gly, 67Ser cambiado a 65Asn, 66Ala, 67Thr

67Ser: 67Ser, 68Gly, 69Thr cambiado a 67Asn, 68Ala, 69Thr

En los ejemplos de la invención, una glicosilación ligada a N en cualquiera de las posiciones 30EGln, 52Ser, 53Thr, 54Arg, 65Ser y 67Ser puede proporcionar una actividad mejorada. En un ejemplo específico, la posición es la posición 52Ser identificada en la SEQ ID NO: 3. La numeración de estas posiciones se basa en la forma madura de la cadena ligera (desprovista de la primera secuencia señal de 16 aminoácidos) de ibalizumab, o las posiciones correspondientes de la misma. En realizaciones específicas, el sitio de glicosilación ligado a N se modifica en uno de 30E Gln, 52Ser o 53Thr de la cadena ligera de ibalizumab. En un ejemplo particular, el sitio de glicosilación ligado a N se modifica en la posición 52Ser como se identifica en la SEQ ID NO: 3.

En un ejemplo particular de la divulgación, se usó una versión derivada de IgG1 de ibalizumab con modificaciones para mejorar la estabilidad, denominada MV1, para generar el anticuerpo anti-CD4 modificado con glicanos. La cadena pesada y la cadena ligera de MV1 tienen las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 2 y 3, respectivamente. La cadena ligera tiene un sitio de glicosilación ligado a N modificado en la posición 52, que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4. El MV1 puede tener una modificación adicional en la región Fc o región FcRn de la cadena pesada para mejorar el reciclaje del anticuerpo. Un ejemplo particular de la presente divulgación proporciona un anticuerpo anti-CD4 modificado con glicanos con actividad y estabilidad mejoradas que comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera como se expone en la SEQ ID NO: 4 y la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada como se expone en la SEQ ID NO: 5.

Una vez que se ha modificado un sitio de glicosilación ligado a N dentro de la región variable de un anticuerpo monoclonal anti-CD4, pueden producirse fácilmente formas modificadas con glicanos de tal anticuerpo usando sistemas de expresión recombinantes adecuados. Por ejemplo, una línea celular adecuada para la expresión recombinante de moléculas de anticuerpos y capaz de glicosilación ligada a N puede transfectarse con vector o vectores de expresión que codifican la cadena ligera de un anticuerpo anti-CD4, en donde por lo menos un dominio variable de la cadena ligera se ha modificado para incluir un sitio de glicosilación ligado a N. Los sobrenadantes de cultivos que contienen anticuerpos pueden recogerse y someterse a cualquier cromatografía apropiada para obtener una preparación de anticuerpos sustancialmente purificada.

Las líneas celulares adecuadas para la expresión recombinante de moléculas de anticuerpos están fácilmente disponibles para los expertos en la técnica, y generalmente son capaces de glicosilación ligada a N. En eucariotas, el proceso de glicosilación ligado a N se produce co-traduccionalmente y el paso inicial tiene lugar en el lado luminal de la membrana de RE, lo que implica la transferencia de un oligosacárido de Glc3MangGlcNAc2 a cadenas polipeptídicas nacientes. Esta estructura precursora luego se modifica adicionalmente mediante una serie de glicosidasas y glicosiltransferasas. Después de la eliminación de los tres residuos de glucosa por la glucosidasa I y II, se elimina una a-1,2-manosa terminal específica por manosidasa I. Estas reacciones están bien conservadas entre la mayoría de los eucariotas inferiores y superiores. En este punto, las proteínas glicosiladas ligadas a N de Man8GlcNAc2 correctamente plegadas pueden salir de la maquinaria de glicosilación; como alternativa, pueden continuar y experimentar un procesamiento adicional específico de tipo celular y especie, catalizado por una serie de enzimas, para producir glicanos de tipo híbrido y/o complejo. Ver Figura 7A. Ver también la revisión de Wright y Morrison, TIBTECH 15: 26-32 (1997); la Patente de Estados Unidos 6.602.684; y la Patente de Estados Unidos 7.029.872, por ejemplo. En eucariotas superiores, las estructuras de Man8GlcNAc2 se recortan adicionalmente mediante varias a-1,2-manosidasas. Los glicanos ligados a N de Man5GlcNAc2 resultantes se modifican posteriormente mediante la adición de un residuo GlcNAc ligado a p-1,2 en una reacción catalizada por GlcNAc transferasa I (GnT-I), la estructura de GlcNAcM8GlcNAc2 resultante que lleva en última instancia a la formación de glicanos ligados a N de "tipo híbrido". Alternativamente, la estructura de GlcNAcM8GlcNAc2 es activada en la manosidasa II (Man-II) para mover dos manosas, y luego por GnT-II para añadir una segunda p-1,2-GlcNAc. Los glicanos con la estructura resultante en la que ambos residuos del núcleo-a-manosa están modificados por al menos un residuo de GlcNAc, se denominan glicanos ligados a N de "tipo complejo". La ramificación adicional puede iniciarse mediante GnT-IV, GnT-V y GnT-VI. Los residuos de galactosa y ácido siálico se añaden adicionalmente mediante galactosiltransferasas y sialiltransferasas, respectivamente.

De acuerdo con esta divulgación, los glicanos ligados a N añadidos a la región variable de un anticuerpo anti-CD4 deben incluir por lo menos 7, 8, 9, 10, 11 o 12 unidades de carbohidratos o "anillos". El término "unidades de carbohidratos" se refiere a moléculas de sacáridos individuales que están enlazadas entre sí para formar los N-glicanos nativos en las células eucariotas; es decir, incluyen glucosa, manosa, N-acetilglucosamina, galactosa y ácido siálico. La estructura precisa (es decir, las composiciones y el enlace en serie) de los N-glicanos en un anticuerpo puede no ser completamente crítica siempre que los N-glicanos incluyan por lo menos 7 unidades. Los ejemplos de glicanos ligados a N incluyen los que se ven típicamente en células de mamíferos, por ejemplo, Man8GlcNAc2 (la GlcNAc en el extremo estando ligada a Asn), Man5GlcNAc2, GlcNAcMan5GlcNAc2, GlcNAc2Man3GlcNAc 2, GakGlcNAc2Man3GlcNAc2, (ácido siálico)2GlcNAc2Man3GlcNAc2, GalGlcNAcMan5GlcNAc2, así como los N-glicanos del complejo bi-antenario bisecado, el complejo tri-antenario, complejo tri’-antenario y el complejo tetra-antenario descritos en la Patente de Estados Unidos 6.602.684 (por ejemplo, Figura 1 en la misma).

De acuerdo con esta divulgación, las líneas celulares adecuadas para la expresión recombinante de anticuerpos modificados con glicanos son células eucariotas, que incluyen especialmente líneas celulares de mamíferos como células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñón de cría de hámster (BHK), células NSO (mieloma murino), células SP2/0 de mieloma murino, células 293 de riñón embrionario humano (HEK293 o 293), células 3T3 de fibroblasto embrionario de ratón, y líneas celulares derivadas de las mismas siempre que las células derivadas puedan expresar eficazmente un anticuerpo recombinante con glicosilación ligada a N. Muchas de estas células están disponibles de la American Tissue Culture Collection (ATCC) o de fuentes comerciales. También pueden emplearse células modificadas genéticamente que producen glicoproteínas que tienen glicoformas alteradas, por ejemplo, glicoproteínas que tienen una clase particular de glicanos ligados a N (como oligosacáridos ligados a N del complejo bi-antenario) modificadas con N-acetilglucosamina bisecante (GlcNAc), como se describe en la Patente de Estados Unidos 6.602.684), para producir los anticuerpos de esta divulgación. Otras células eucariotas que pueden ser apropiadas incluyen células de insectos y células de levadura, como la levadura de panadería S. cerevisiae y la levadura metilotrófica como Pichia pastoris, incluyendo particularmente cepas de levadura modificadas genéticamente para producir proteínas que tienen formas de N-glicano humano. Ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 7.029.872 y la Patente de Estados Unidos 7.449.308.

De acuerdo con los ejemplos de la divulgación, los glicanos ligados a N se unen a una molécula de anticuerpo producida a partir de células mediante el tratamiento de la molécula de anticuerpo aislada del cultivo celular con enzimas (por ejemplo, PNGasa). Un cambio en el peso molecular aparente del anticuerpo (que puede detectarse en SDS-PAGE, transferencia Western y similares) como resultado del tratamiento indica que los glicanos ligados a N están realmente unidos a la molécula de anticuerpo. El tamaño de los glicanos ligados a N puede estimarse comparándolos con glicanos ligados a N de tamaños conocidos. Para un análisis más detallado, los glicanos ligados a N unidos al anticuerpo pueden analizarse mediante electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforos (FACE) asistida por secuenciador de ADN (DSA), o MALDI-TOF MS, por ejemplo, todas las cuales son técnicas bien documentadas en la técnica. Por ejemplo, en un análisis DSA-FACE, los glicanos ligados a N se liberan de un péptido de anticuerpo glicosilado: W-glicosidasa F (PNGasa F). Los glicanos ligados a N liberados se derivatizan luego con el fluoróforo 8-aminopireno-1,3,6-trisulfonato (APTS) mediante aminación reductora. Después de eliminar el exceso de APTS, los glicanos ligados a N marcados se analizan con un secuenciador de ADN ABI 3130. Ver, por ejemplo, Laroy et al. (Nat Protoc. 1: 397-405 (2006)), Patente de Estados Unidos 6.602.684 para el análisis MALDI-TOF MS de glicanos ligados a N en proteínas producidas de manera recombinante.

Los anticuerpos modificados con glicanos pueden evaluarse en varios ensayos funcionales para confirmar su eficacia en la neutralización del VIH, incluyendo ensayos para determinar la amplitud y la potencia de los anticuerpos contra paneles grandes de aislados virales como se describe en la sección de ejemplos.

En las realizaciones de la divulgación, se confirma que un glicano en el extremo N-terminal de gp120 llena un espacio vacío entre la cadena L de ibalizumab y gp120 V5, y el efecto de ibalizumab sobre la entrada del VIH-1 está mediado estéricamente por el efecto de masa de este glicano. En las pruebas de un panel de mutantes de ibalizumab con PNGS en varias posiciones de la cadena L sobre la capacidad de neutralizar la infectividad del VIH-1 in vitro, se descubrió que los mutantes de ibalizumab que llevaban un glicano localizado muy cerca de V5 en el complejo ibalizumab-CD4-gp120 neutralizaban eficazmente el VIH-1. Estos mutantes de ibalizumab también neutralizaron cepas de VIH-1 que son resistentes al ibalizumab de tipo salvaje. En un ejemplo particular de la divulgación, un ibalizumab mutante, LM52, neutralizó el 100% de los 118 aislados de VIH-1 probados a una potencia más de 10 veces mayor que el ibalizumab de tipo salvaje a juzgar por la media geométrica IC80, la concentración de anticuerpos requerida para neutralizar el 80% de la infección. Se indica que ibalizumab bloquea la entrada del VIH-1 a través de un mecanismo de impedimento estérico y proporciona un ejemplo de cómo puede usarse una localización estratégica de un sitio de glicosilación ligado a N para mejorar la actividad de un anticuerpo monoclonal.

En base a los descubrimientos de la divulgación, se indica que el enfoque de adición de glicanos puede adaptarse para mejorar su actividad funcional de anticuerpos monoclonales. Usando la relación de actividad estructural (SAR), es concebible que el aumento del volumen en posiciones clave sobre el anticuerpo podría llevar a una actividad mejorada para generar un producto de anticuerpo monoclonal superior.

En algunas realizaciones de esta divulgación, puede ser deseable producir anticuerpos con glicanos ligados a N o una clase de glicanos ligados a N sustancialmente homogéneos. Por "sustancialmente homogéneo" se entiende que por lo menos el 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90% o incluso el 95% de los glicanos ligados a N en las moléculas de anticuerpos en una preparación son de la misma estructura, el mismo tamaño (es decir, el mismo peso molecular o, alternativamente, el mismo número de "anillos" de carbohidratos), o el mismo intervalo de tamaño (por ejemplo, "anillos"9-12 o "anillos"10-11) y/o tipo. Esto puede lograrse utilizando líneas celulares modificadas genéticamente para expresar o sobreexpresar un conjunto seleccionado de enzimas implicadas en la N-glicosilación (ver, por ejemplo, Patente de Estados Unidos 6.602.684 y Patente de Estados Unidos 7.029.872), o para interrumpir una enzima en una etapa intermedia en la ruta de N-glicosilación (por ejemplo, cepas knockout de GnT1), o para utilizar uno o más inhibidores que se dirigen a enzimas de procesamiento específicos, o una combinación de los mismos. Los ejemplos de inhibidores incluyen Kifunensina, DMJ (por "desoximannojirimicina") y Swainsonina.

Composición farmacéutica

La composición farmacéutica que comprende un anticuerpo modificado con glicanos divulgada en la presente puede prepararse mezclando el anticuerpo con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables opcionales. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen solventes, medios de dispersión, agentes isotónicos y similares. El portador puede ser líquido, semisólido, por ejemplo, pastas, o portadores sólidos. Los ejemplos de portadores incluyen agua, soluciones salinas u otros tampones (como tampones de fosfato, citrato), aceite, alcohol, proteínas (como albúmina sérica, gelatina), carbohidratos (como monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, sacarosa, trehalosa, manosa, manitol, sorbitol o dextrinas), gel, lípidos, liposomas, resinas, matrices porosas, aglutinantes, cargas, recubrimientos, estabilizantes, conservantes, antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina, agentes quelantes como EDTA; contraiones formadores de sal como sodio; surfactantes no iónicos como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG), o combinaciones de los mismos.

La composición farmacéutica puede contener más de un compuesto activo, por ejemplo, uno o más anticuerpos, en combinación con uno o más compuestos beneficiosos adicionales para inhibir, prevenir y tratar infecciones por VIH.

Los ingredientes activos pueden combinarse con el portador de cualquier manera conveniente y práctica, por ejemplo, mediante mezcla, solución, suspensión, emulsificación, encapsulación, absorción y similares, y pueden elaborarse en formulaciones como comprimidos, cápsulas, polvo (incluyendo polvo liofilizado), jarabe, suspensiones adecuadas para inyecciones, ingestiones, infusiones o similares. También pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida.

Métodos de tratamiento y prevención

En un aspecto adicional, los anticuerpos modificados con glicanos divulgados en la presente, proporcionados opcionalmente en un portador farmacéuticamente aceptable, se emplean para el tratamiento y prevención de la infección por VIH en un sujeto, así como para la prevención de la transmisión del VIH.

El término "tratamiento" de la infección por VIH se refiere a la inhibición eficaz de la infección por VIH para retrasar la aparición, ralentizar la progresión, reducir la carga viral y/o mejorar los síntomas provocados por la infección por VIH.

El término "prevención de la infección por VIH" significa que se retrasa la aparición de la infección por VIH y/o se reduce o elimina la incidencia o probabilidad de infección por VIH.

El término "prevención de la transmisión del VIH" significa que se reduce o se elimina la incidencia o probabilidad de que el VIH se transmita de un individuo a otro (por ejemplo, de una mujer positiva para VIH al niño durante el embarazo, el trabajo de parto o el parto, o la lactancia; o de un sujeto positivo para VIH a una pareja negativa para VIH).

El término "sujeto" se refiere a cualquier sujeto primate, incluyendo sujetos humanos y no humanos (por ejemplo, sujetos rhesus).

Para inhibir, tratar y/o prevenir la infección por VIH, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo modificado con glicano divulgado en la presente a un sujeto con necesidad de ello.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" significa la dosis requerida para efectuar una inhibición de la infección por VIH para tratar y/o prevenir la infección por VIH. La dosificación de un anticuerpo depende del estado de la enfermedad y otros factores clínicos, como el peso y el estado del sujeto, la respuesta del sujeto a la terapia, el tipo de formulaciones y la vía de administración. Los expertos en la técnica pueden determinar la dosificación precisa para que sea terapéuticamente eficaz y no perjudicial. Como regla general, una dosis adecuada de un anticuerpo para la administración a humanos adultos por vía parenteral está en el intervalo de aproximadamente 0,1 a 20 mg/kg de peso corporal del paciente por día, una vez a la semana, o incluso una vez al mes, con el intervalo inicial típico usado estando en el intervalo de aproximadamente 2 a 10 mg/kg. Como los anticuerpos eventualmente se depurarán del torrente sanguíneo, puede requerirse volver a administrarlos. Alternativamente, puede emplearse la implantación o inyección de anticuerpos proporcionados en una matriz de liberación controlada.

Los anticuerpos pueden administrarse al sujeto por vías estándar, incluyendo la oral, transdérmica o parenteral (por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea o intramuscular). Además, los anticuerpos pueden introducirse en el cuerpo, mediante inyección o mediante implantación o unión quirúrgica de tal manera que una cantidad significativa de un anticuerpo deseable sea capaz de introducirse en el torrente sanguíneo de una manera de liberación controlada.

Listado de secuencias

SEQ ID NO: 1: la secuencia de aminoácidos del receptor de CD4 humano (los aminoácidos 1-25 representan un péptido señal, los aminoácidos 26-122 constituyen D1 y los aminoácidos 123-205 constituyen D2): MNRGVPFRHLLLVLQLALLPAATQGKKWLGKKGDTVELTCTASQKKSIQFHWKNSNQ IKILGNQGSFLTKGPSKLNDRADSRRSLWDQGNFPLIIKNLKIEDSDTYICEVEDQKEEVQ LLVFGLTANSDTHLLQGQSLTLTLESPPGSSPSYQCRSPRGKNIQGGKTLSVSQLELQDS GTWTCTVLQNQKKVEFKIDIWLAFQKASSIVYKKEGEQVEFSFPLAFTVEKLTGSGEL WW Q AERAS S SKS WITFDLKNKEV S VKRVTQDPKLQMGKKLPLHLTLPQ ALPQ Y AGS G NLTLALEAKTGKLHQEVNLWMRATQLQKNLTCEVWGPTSPKLMLSLKLENKEAKVS KREKAYWVLNPE AGMWQCLLSDS GQ YLLESNIKYLPTWS TPY QPMALIYLGGY AGLLL FIGLGIFFCVRCRHRRRQAERMSQIKRLLSEKKTCQCPHRFQKTCSPI

SEQ ID NO: 2: la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de MV1 (471 aminoácidos, incluyendo los primeros 19 residuos de aminoácidos que constituyen una secuencia líder):

MEWSGVFMFLLSVTAGVHSQVQLQQSGPEWKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIHWVR QKPGQGLDWIGYINPYNDGTDYDEKFKGKATLTSDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC AREKDNYATGAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YN S T Y R W S VLTVLHQDWLN GKEYKCKV SN KALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK*

SEQ ID NO: 3: la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de MV1 (238 aminoácidos, incluyendo los primeros 19 aminoácidos que constituyen una secuencia líder):

MEWSGVFIFL LSVTAGVHSD IVMTQSPDSL AVSLGERVTM NCKSSQSLLY

STNQKNYLAW YQQKPGQSPK LLIYWASTRE SGVPDRFSGS GSGTDFTLTI

SSVQAEDVAV YYCQQYYSYR TFGGGTKLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK

SG TA SW C L L NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS

STLTLSKADY EKHKV Y ACE V THQGLSSPVT KSFNRGEC

SEQ ID NO: 4: la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de LM52:

DIVMTQSPDSLAVSLGERVTMNCKSSQSLLYSTNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWAN STESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQYYSYRTFGGGTKLEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 5: la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de un MV1 modificado con reciclaje mejorado del anticuerpo (452 aminoácidos con dos modificaciones):

QVQLQQSGPEWKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIHWVRQKPGQGLDWIGYINPYNDGT DYDEKFKGKATLTSDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREKDNYATGAWFAYWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF P AVLQ S S GL Y SLS S W T V P S S SLGTQT YICNVNHKP SNTKVDKKVEPKS CDKTHTCPPCP APEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKFTVDKSRWQQGNVFSCSVFHEAFHSHYTQKSFSFSPGK*

La descripción de algunas realizaciones específicas proporciona información suficiente para que otros puedan, aplicando los conocimientos actuales, modificar o adaptar fácilmente para varias aplicaciones tales realizaciones específicas sin apartarse del concepto genérico y, por lo tanto, tales adaptaciones y modificaciones deben y se pretende que estén comprendidas dentro del significado e intervalo de equivalentes de la presente divulgación. Debe entenderse que la fraseología o terminología empleada en la presente tiene el propósito de descripción y no de limitación. En los dibujos y la descripción, se han divulgado realizaciones ejemplares y, aunque pueden haberse empleado términos específicos, a menos que se indique lo contrario se usan solo en un sentido genérico y descriptivo y no con propósitos de limitación, el alcance de las reivindicaciones por lo tanto no siendo tan limitado. Además, un experto en la técnica apreciará que ciertos pasos de los métodos analizados en la presente pueden secuenciarse en orden alternativo o pueden combinarse pasos.

Ejemplos

Materiales y métodos

1. Líneas celulares, reactivos y virus pseudotipados

Se obtuvieron células TZM-bl (N° de catálogo 8129) a través del Programa de Reactivos de Referencia e Investigación del SIDA (ARRRP), División de SIDA, NIAID, NIH. Ésta es una línea celular HeLa modificada genéticamente que expresa CD4, CXCR4 y CCR5 y contiene genes informadores sensibles a Tat para luciferasa y p-galactosidasa bajo el control de una repetición terminal larga del VIH-1. Los paneles de referencia estándar de clones Env de VIH-1 subtipo B de infecciones agudas y tempranas y plásmido de la estructura principal deficiente en Env (SG3AEnv) también se obtuvieron a través del NIH ARRRP. Se prepararon virus pseudotipados env de VIH-1 mediante cotransfección de células 293A (Invitrogen) con un plásmido de expresión de Env y SG3AEnv. La sCD4 recombinante que comprende el dominio extracelular de longitud completa de CD4 humano se obtuvo de Progenics Pharmaceuticals, Inc. (Tarrytown, NY). La proteína de ibalizumab fue proporcionada por TaiMed Biologics (Irvine, CA). Los plásmidos pMV1 y pLC, que codifican la cadena H y la cadena L de ibalizumab, respectivamente, se amplificaron a partir de ADNc y se clonaron en pCDNA3.1 (+) (Invitrogen).Se obtuvieron células 293S de riñón embrionario humano (HEK) GnT1 (-) negativas para W-acetilglucosaminiltransferasa I de la ATCC (N° de catálogo CRL-3022).

2. Adición de sitios de glicosilación ligados a N a la cadena L del anticuerpo anti-CD4

Se introdujeron las secuencias de Asn-Ala-Thr (LM30E, LM53, LM54, LM60, LM65, LM67 y LM76) o Asn-Ser-Thr (LM52) mediante mutagénesis para crear mutantes en la cadena ligera (L) del anticuerpo anti-CD4 como ibalizumab WT o MV1. La mutagénesis se llevó a cabo con el kit de mutagénesis Quikchange (Stratagene, Santa Clara, VA). Los constructos de mutantes de cadena L (ligera) (LM) se generaron a partir de anticuerpos IgG 1 anti-CD4 (como MV1), y luego se secuenciaron y transfectaron transitoriamente en células HEK293A (proporción 1:1 de plásmidos de cadena pesada y L) con polietilenimina complejo (PEI)-ADN. Se recogieron los sobrenadantes el día 5 después de la transfección y las proteínas LM se purificaron con una columna de proteína A agarosa (Thermo Scientific, Rockford, IL). Ibalizumab WT y LM30E, lM52 y LM53 se trataron con PNGasa F (New England Biolabs, Ipswich, MA) en condiciones de desnaturalización, antes del análisis por SDS-PAGE.

3. Ensayo de neutralización del virus con células TZM-bl

El ensayo de neutralización se realizó en base al método de Wei et al. 37 con modificaciones38. Brevemente, se sembraron 10.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos en 100 pl/pocillo de DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% (D10) y se incubaron durante la noche. Al día siguiente, se añadieron a las células ibalizumab o proteínas LM diluido en serie y se incubaron durante 1 h. Luego, se prepararon 200X 50% dosis infecciosas de cultivo de tejidos (TCID50) de VIH-1 competente para la replicación o pseudotipado en D10 que contenía DEAE-Dextrano (Sigma, St. Louis, MO) y se añadieron a las células. Las células se incubaron durante 48 h y se midió la actividad de la p-galactosidasa usando el sistema Galacto-Star (Applied Biosystems, Cedarville, OH). El porcentaje de inhibición de la infectividad viral se calculó como 1 menos la proporción de pocillos tratados con anticuerpos frente a pocillos infectados sin tratar multiplicado por 100. Los valores de IC50 e IC80 (las concentraciones de anticuerpos que confieren el 50% y el 80% de neutralización, respectivamente) se calcularon mediante un análisis de regresión no lineal.

4. Resonancia de plasmones de superficie

Se realizaron análisis de afinidad de unión con un biosensor óptico Biacore T3000 (GE Healthcare, Piscataway, NJ). La inmovilización de ibalizumab y todas las variantes de glicanos se realizaron siguiendo el procedimiento estándar de acoplamiento de aminas. Brevemente, los grupos carboxilo en la superficie del chip sensor se activaron mediante la inyección de 35 pl de una solución que contenía N-(3-dimetilaminopropil)-N-etilcarbodiimida 0,2 M y N-hidroxisuccinimida 0,05 M a un caudal de 5 pl/minuto. Luego, se dejó fluir ibalizumab o su variante mutante, a una concentración de 2 pg/ml en tampón de acetato de sodio 10 mM, pH 4,5, sobre la superficie del chip a un caudal de 10 pl/minuto hasta alcanzar el nivel deseado de unidades de respuesta de proteína reaccionada (150-200 RU). Después de que la proteína sin reaccionar se hubiese lavado, el exceso de grupos éster activos en la superficie del sensor se tapó mediante la inyección de 35 gl de etanolamina 1 M, pH 8,0, a un caudal de 5 gl/minuto. Como antecedente para corregir los artefactos del instrumento y del tampón, se generó una referencia en las mismas condiciones con omisión del ligando de proteína. Los experimentos de unión se realizaron a 25° C en tampón HBS-EP (HEPES 0,01 M, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, surfactante P20 al 0,005% vol/vol (GE Healthcare). La cinética de unión se midió pasando varias concentraciones de analito (proteína de sCD4 humana) sobre la superficie del chip a un caudal de 30 gl/minuto durante 3 minutos. Se controló la disociación de los analitos unidos mientras se lavaba la superficie durante 10 minutos. Los analitos restantes se eliminaron a un caudal de 50 gl/minuto con dos Inyecciones de 30 segundos de glicina-HCl 10 mM, pH 2,0. Para el análisis de datos cinéticos, se determinaron los parámetros cinéticos mediante el ajuste colectivo de los sensogramas superpuestos localmente usando el software BIAevaluation 4.1 al modelo de unión de Langmuir 1:1.

5. Identificación de glicosilación ligada a N en LM52

Se disolvieron tres microgramos de proteína LM52 en bicarbonato de amonio (ABC) 50 mM/tetrafluoroetileno al 50% y se redujeron añadiendo ditiotreitol (DTT) 40 mM. Después de la incubación a 65° C durante 1 h, las muestras de proteína se procesaron para alquilación añadiendo yodoacetamida 40 mM e incubando a temperatura ambiente durante 1 h en la oscuridad. La reacción se inactivó añadiendo DTT 40 mM seguido de 1 hora de incubación. Luego se añadió ABC 25 mM antes de la digestión con tripsina. Las muestras de proteína se trataron luego con 0,2 gg de tripsina (Promega) durante la noche. Las muestras de proteína digeridas se secaron y se volvieron a disolver con 20 gl de agua antes del análisis LC-MS/MS. Para la asignación de N-glicanos en anticuerpos, las masas medidas de anticuerpo digerido con tripsina se compararon con una base de datos que combinaba péptidos trípticos predichos y glicanos ligados a N. Los glicopéptidos asignados se confirmaron mediante la aparición de fragmentos de glicanos en los espectros MS/MS. Para la digestión con PNGasa, se trató LM52 con PNGasa F (New England Biolabs) durante la noche.

6. Análisis estadísticos

Las diferencias en las potencias de los anticuerpos mostradas en las Figuras S2 y S3 se evaluaron mediante análisis paramétricos (prueba t de Student pareada) de concentraciones inhibidoras del 50% y 80%, usando el software GraphPad Prism v5.03. Se alcanzó significación estadística si P < 0,05.

Resultados

Ejemplo 1.

El análisis de secuencia de un panel de 118 aislados virales sugiere que la resistencia a ibalizumab estaba asociada con el número de sitios potenciales de glicosilación ligados a N (PNGS) en el giro V5 de gp120 (Pace et al., J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Epub antes de impresión: septiembre de 2012). Como se muestra en la Figura 1, los virus que tenían dos sitios de glicosilación ligados a N en V5 eran sensibles a ibalizumab, mientras que los virus que no tenían sitio de glicosilación ligado a N en V5 eran resistentes. La barra indica la mediana. Curiosamente, los aislados virales clínicos que han desarrollado resistencia a la monoterapia con ibalizumab también muestran una pérdida en un sitio potencial de glicosilación de V5 (Toma et al., J. Virology 85 (8): 3872-2880, 2011).

Un virus de tipo salvaje (AC10.0.29) en el panel tiene dos sitios de glicosilación ligados a N en V5 y es sensible de manera natural al ibalizumab. Los sitios de glicosilación ligados a N en V5 en este virus se eliminaron sistemáticamente mediante mutagénesis dirigida al sitio, y los virus mutantes resultantes se volvieron resistentes a ibalizumab (ver la Figura 2).

Otro virus de tipo salvaje (RHPA4259.7) en el panel no tiene un sitio de glicosilación ligado a N en V5 y es resistente de manera natural al ibalizumab. Este virus se modificó para añadir sistemáticamente sitios de glicosilación ligados a N en V5. Como se muestra en la Figura 3, los virus mutantes resultantes se volvieron sensibles al ibalizumab.

El análisis de las estructuras cristalinas superpuestas de ibalizumab, CD4 y gp120 del VIH reveló que el giro V5 de gp120 es adyacente al sitio de interacción entre la cadena ligera de ibalizumab y CD4. El análisis de modelos adicionales sugirió que ibalizumab normalmente puede inhibir el VIH a través de un impedimento estérico, y que la pérdida de un glicano en V5 de gp120 puede permitir que un virus eluda este impedimento estérico y escape de la actividad anti-VIH del ibalizumab. En la presente divulgación se formuló la hipótesis de que la adición de sitios de glicanos ligados a N en ibalizumab en una región cercana a V5 de gp120 (por ejemplo, cerca del extremo N terminal de V5) puede permitir que el ibalizumab modificado neutralice virus que normalmente son resistentes a ibalizumab. Se realizaron los siguientes experimentos para verificar esta hipótesis.

En base a la estructura cristalina del complejo ibalizumab-CD4, se seleccionaron varios sitios de la cadena ligera de ibalizumab en base a su supuesta distancia cercana a la V5 de gp120. Estos incluyen las posiciones de aminoácidos 30E, 67, 65, 52, 53, 54, 60 y 76 - la numeración se basa en la versión madura de la cadena ligera sin la secuencia señal de 19 aminoácidos (es decir, una secuencia líder) y siguientes el esquema de numeración de Kabat y Chothia, que tiene en cuenta de los residuos de aminoácidos no contabilizados en la numeración original. Por ejemplo, la posición "30E" se refiere al 5° amino ácido en un tramo de aminoácidos (30A, 30B, 30C, 30D, 30E,...) entre las posiciones numeradas originalmente como 30 y 31. Los sitios de glicosilación ligada a N potenciales se introdujeron en cada una de estas posiciones (Figura 4A). Como se muestra en la Figura 4B, todas las cadenas ligeras mutantes tenían pesos moleculares más altos que la cadena ligera de tipo salvaje (panel superior), lo que sugiere la presencia de un glicano añadido en estos mutantes. Cuando las cadenas ligeras mutantes se trataron con el agente de desglicosilación, PNGasa F (panel inferior), sus pesos moleculares cayeron al de una cadena ligera de ibalizumab de tipo salvaje normal. Estos datos confirmaron que los sitios de glicosilación ligada a N se añadieron de hecho a las cadenas ligeras mutantes.

Ejemplo 2. Diseño de variantes de ibalizumab

Los estudios de cepas de VIH-1 resistentes a ibalizumab revelaron que la resistencia se confiere principalmente por la pérdida de glicanos del giro V5 de gp120 de Env del VIH-1. Para explorar adicionalmente el papel de la glicosilación de V5 en la susceptibilidad a ibalizumab, modelamos las interacciones entre gp120, CD4 e ibalizumab usando las estructuras informadas al Protein Data Bank (número de acceso 2NXY y 3O2D). El glicano N-terminal de V5 está situado más cerca de la cadena L de ibalizumab (Figura 5A), mientras que el glicano C-terminal de V5 está más alejado del ibalizumab (Figura 5B). Este modelo plantea la posibilidad de que el ajuste del glicano N-terminal en el espacio entre la gp120 y el ibalizumab ejerce un efecto de masa sobre gp120, interrumpiendo de este modo sus cambios conformacionales (giros y vueltas) que son esenciales para la entrada del VIH-1 en la célula objetivo. Este modelo también sugiere que la introducción de un glicano de tamaño similar en la cadena L de ibalizumab puede potenciar su capacidad para inhibir la entrada de cepas de VIH-1 que han perdido su glicano N-terminal de V5.

Por lo tanto, introdujimos PNGS en los residuos (30E, 52, 53, 54, 60, 65, 67 y 76) en la región variable de la cadena L de ibalizumab que están proximales al giro V5 de gp120. Estos mutantes de la cadena L (LM) de ibalizumab se construyeron, secuenciaron y transfectaron en células 293A para producir proteínas mutantes. Purificamos los mAb variantes mediante cromatografía de agarosa de proteína A y los analizamos mediante SDS-PAGE (Figura 6A). Los rendimientos de los LM de la expresión transitoria en células 293A fueron comparables a los del ibalizumab de tipo salvaje (datos no mostrados). Se observó una cadena L ligeramente más grande en cada uno de los LM en comparación con la cadena L de tipo salvaje. Para confirmar que los tamaños más grandes se deben a la glicosilación, las LM 30E, 52 y 53 se trataron con PNGasa F en condiciones de desnaturalización y se analizaron mediante SDS-PAGE (Figura 6B). Como se esperaba, los tamaños de las cadenas L de estas variantes después del tratamiento con PNGasa F se redujeron al tamaño del tipo salvaje. Luego, usamos espectrometría de masas para identificar la forma de N-glicanos introducidos en la cadena L de LM52 producida de manera rutinaria en las células 293A. Se identificaron más de seis formas de N-glicanos de tipo complejo con 8-12 anillos en la cadena L, y el 80% de estas formas tienen anillos 9-11 (Figura 6C). Los mutantes LM52, que solo difieren en sus tamaños de glicanos, se probaron en ensayos de neutralización. Se observaron actividades de neutralización más altas con proteínas mutantes de LM52 con glicanos ligados a N más grandes en los tres virus probados (Figura 6D). Tomados en conjunto, estos datos confirmaron que se introdujeron glicanos ligados a N en los residuos deseados de la cadena L de ibalizumab.

Ejemplo 3. Unión de CD4 y neutralización del VIH-1 por LM

Luego, evaluamos la cinética de unión de estos LM de ibalizumab a CD4 soluble humano (sCD4) mediante resonancia de plasmones de superficie. En un ensayo de Biacore usando sCD4 como analito, el ibalizumab WT y los LM se unieron a sCD4 con cinéticas de unión similares. La K^d de seis de estos LM unidos a sCD4 estaba en el intervalo de 0,19 nM a 0,8 nM (Tabla 1), y estos números estaban dentro del doble de la K^d del ibalizumab de tipo salvaje (0,43 nM). Estos datos mostraron que la adición de un glicano ligado a N en estas localizaciones seleccionadas de la cadena L de ibalizumab no afectó de manera significativa su capacidad para unirse a CD4.

Tabla 1 La cinética de unión de ibalizumab sus LM a CD4 humano

Luego exploramos la capacidad neutralizante del VIH-1 de los LM en comparación con el ibalizumab WT. Con este fin, probamos los LM contra un panel de virus del VIH-1 que son resistentes o parcialmente resistentes al ibalizumab, incluyendo 3 cepas de VIH-1 con capacidad de replicación (Figura 7). Usando este panel de virus resistentes a ibalizumab, se observó un MPI medio de 75% y una IC80 de 1,43 gg/ml cuando se probó el ibalizumab WT hasta 2 gg/ml. Observamos actividades de neutralización notablemente mejoradas para cuatro LM (LM30E, LM52, LM53 y LM67), con un MPI medio de 91-99% e IC80 de 0,05-0,14 gg/ml (Figura 7 y Tabla 2). Entre estos, LM52 parece tener la mejor potencia de neutralización del VIH-1. Otras dos variantes (LM54 y LM65) produjeron una mejora más modesta en las actividades de neutralización de virus en comparación con ibalizumab. Curiosamente, los PNGS en los seis LM que mostraron una actividad neutralizante del VIH-1 mejorada también están más cerca de V5 (459) de gp120 (Tabla 2) que los PNGS en LM60 y LM76, que mostraron una actividad neutralizante del VIH-1 comparable a las del ibalizumab WT. Por tanto, parece que colocar el N-glicano más cerca de V5 mejora el perfil de neutralización de las variantes de ibalizumab. Sin embargo, observamos que la orientación del glicano, además de la distancia a V5, también puede desempeñar un papel crítico.

Ejemplo 4. El tamaño del glicano influye en la actividad de LM52

Se estudió si el tamaño del glicano influye en la actividad de neutralización del VIH-1 mejorada de los LM. El estudio se centró en LM52 debido a su perfil de neutralización del VIH-1 superior (Figura 7). Para producir una versión de LM52 que carece de cualquier glicano ligadoa N, se añadió tunicamicina, que inhibió la GlcNAc fosfotransferasa, a las células 293A inmediatamente después de la transfección transitoria con el constructo LM52. De manera similar, para producir una versión de LM52 etiquetada con glicanos de anillos 10-11 (el N-glicano alto de tipo Man Man8GlcNAc2 (Man8) o Man9GlcNAc2 (Man9)) añadimos kifunensina a las células 293A. Por último, para producir una versión de LM52 que contenga un glicano de 7 anillos (N-glicano tipo (Man) con alto contenido de manosa MansGlcNAc2 (Man5)), se usaron células HEK293S GnT1 (-) negativas para W-acetilglucosaminiltransferasa I. Como se muestra por SDS-PAGE, aunque la adición de kifunensina no cambió notablemente el tamaño de la cadena L, la adición de tunicamicina o el crecimiento en células GnT1(-) redujeron notablemente el tamaño de la cadena L (Figura 8A). De manera similar, las actividades de neutralización contra tres cepas de VIH-1 se redujeron más severamente para los anticuerpos producidos en presencia de tunicamicina o en células GnT1(-) que para el anticuerpo producido en presencia de kifunensina (Figura 8B). Por tanto, se observó una actividad neutralizante del VIH-1 más fuerte cuando estaban presentes glicanos más grandes en la cadena L en el residuo 52. El modelado sugiere que los glicanos más grandes llenan mejor el espacio entre la cadena L y gp120 (Fig. 4C), pero la naturaleza de la ramificación del glicano también puede afectar también a la actividad neutralizante del VIH-1 de LM52.

Ejemplo 5. Amplitud y potencia de neutralización de LM52

Luego probamos la actividad de neutralización del VIH-1 de LM52 contra un panel de 118 cepas virales de VIH-1 diversas que cubren 11 clados. LM52 mostró una amplitud y potencia de neutralización significativamente mejoradas en comparación con ibalizumab WT en este ensayo de TZM-bl de ciclo único (Figura 9 y Tabla 3). El LM52 no tenía actividad neutralizante contra el virus de control negativo (virus de la leucemia murina) (Tabla 3), pero neutralizó (como se define por >50% de inhibición) todas las cepas de VIH-1 probadas, en comparación con el 92% de las cepas para ibalizumab WT. De hecho, LM52 neutralizó el 97% de los virus hasta una inhibición >95%, en comparación con solo el 31% para el ibalizumab WT (Figura 5, paneles superiores). LM52 también mostró valores de IC50 de <0,1 g/ml para los 118 virus, en comparación con el 75% de los virus para ibalizumab WT (Figura 9, paneles intermedios). De hecho, todos los virus fueron neutralizados por LM52 con una IC80 <0,3 pg/ml, mientras que el 36% de los virus no fueron neutralizados por el 80% con ibalizumab WT incluso a una concentración de 10 pg/ml (Figura 9, paneles inferiores).

Tabla 3 Perfiles de neutralización in vitro de ibalizumab LM52 exresados or IC50 /ml, IC80 /ml MPI %

continuación

continuación

continuación

En general, el valor de IC50 de media geométrica para LM52 fue de 14 ng/ml, en comparación con 74 ng/ml para ibalizumab WT, y el valor de IC80 de media geométrica para LM52 fue de 37 ng/ml, en comparación con 510 ng/ml para ibalizumab WT (Figura 11). Cuando los virus se separaron en cepas sensibles a ibalizumab (MPI>80%) y resistentes a ibalizumab (MPI<80%), fue evidente que la potencia mejorada de LM52 era más obvia en los virus resistentes a ibalizumab (Figura 12). En los virus resistentes a ibalizumab, la media geométrica del valor de IC80 para LM52 fue de 50 ng/ml, en comparación con casi 10.000 ng/ml para el ibalizumab WT. La potencia de LM52 se incrementó aproximadamente 3 veces incluso en virus sensibles a ibalizumab.

La actividad mejorada de LM52 también fue evidente en un gráfico que compara su cobertura de cepa de VIH-1 a través de concentraciones crecientes de anticuerpos (Figura 10). La mejora sobre el ibalizumab WT fue evidente, al igual que su superioridad sobre los mAb (PG9, VRC01, 10E8 y NIH45-46G54W) conocidos por su amplia y potente actividad neutralizante del VIH-1. LM52 tuvo la mayor cobertura viral en todas las concentraciones >0,01 gg/ml y alcanzó el 100% a una concentración menor de 0,1 gg/ml. Sólo a concentraciones por debajo de 0,01 gg/ml la cobertura de LM52 fue inferior a NIH45-46G54W, una versión modificada de un mAb humano dirigido al sitio de unión a CD4 en gp120. Sin embargo, cabe señalar que ibalizumab inhibe la infección por VIH-1 al unirse a CD4, mientras que VRC01, PG9, 10E8 y NIH45-46 G54W inhiben la infección por VIH-1 al unirse directamente al virus. No obstante, independientemente de si estos mAb se unen a la envoltura viral o al CD4, todos neutralizan la infección por VIH-1 al bloquear la entrada del virus.

Ejemplo 6. Efectos de múltiples glicanos

Luego examinamos el efecto de colocar dos o tres glicanos en la región de interés en la cadena L de ibalizumab. Producimos mutantes dobles LM30E-52, LM30E-53 y LM52-67, así como mutantes triples LM30E-52-67 y LM30E-53-67 en células 293A y luego purificamos y analizamos los anticuerpos mediante SDS-PAGE (Figura 13A). En comparación con el ibalizumab WT o los LM de un solo mutante, se observó una cadena L ligeramente más grande en cada uno de los mutantes dobles, y se observó una cadena L incluso más grande en cada uno de los mutantes triples. Luego exploramos el perfil de neutralización del VIH-1 de estas variantes de mAb contra un panel de cepas de VIH-1 que se sabe que son total o parcialmente resistentes a ibalizumab. En general, los mutantes dobles y triples mostraron una actividad neutralizante comparable a la de LM52 (Tabla 4; Figura 13B, panel izquierdo). De hecho, los valores de IC80 de la media geométrica sugieren que los mutantes triples pueden ser ligeramente menos potentes en comparación con LM52. La única excepción observada fue para SHIVsf162P3N, un virus más sensible a los mutantes dobles y triples que a LM52 (Tabla 4; Figura 13B, panel derecho). En general, no encontramos evidencia de que la adición de más de un glicano mejore más el perfil de neutralización del VIH-1 de

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Una forma de anticuerpo ibalizumab modificado con glicanos, que comprende un sitio de glicosilación ligado a N modificado en la región variable de la cadena ligera, seleccionado del grupo que consiste de

(i) un sitio de glicosilación ligado a N modificado Asn-Ala-Thr localizado en una posición de aminoácidos de la cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de 30EGln, 53Thr, 54Arg, 65Ser y 67Ser; y

(ii) un sitio de glicosilación ligado a N modificado Asn-Ser-Thr localizado en una posición de aminoácidos 52Ser como se identifica en la Seq ID No. 3 en base a la versión madura de la cadena ligera sin la secuencia señal de 19 aminoácidos y siguiendo el Esquema de Numeración de Kabat y Chothia.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el sitio de glicosilación ligado a N modificado está localizado en una posición de aminoácidos 52Ser.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 4.

4. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que los glicanos ligados a N comprenden por lo menos 7 unidades de carbohidrato.

5. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 2 y 4, en el que los glicanos ligados a N comprenden 10-11 unidades de carbohidratos.

6. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y por lo menos un portador farmacéuticamente aceptable.

7. Un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para su uso en la inhibición de la infección por VIH en un sujeto.

8. Un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para su uso en el tratamiento de un sujeto infectado por el VIH.

9. Un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para su uso en la prevención de una infección por VIH en un sujeto.

10. Un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, para su uso en la prevención de que una mujer embarazada positiva para el VIH transmita el virus del VIH al niño.

11. Un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para su uso en la prevención de que un sujeto positivo para el VIH transmita el virus del VIH a una pareja negativa para el VIH.