TW201439537A - 用於氧氣濃度控制下同步細胞培養的微流體陣列平台 - Google Patents

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Abstract

本發明關於一種微流體陣列平台，包含一基板及將一薄膜夾於之間的兩層狀結構，其中複數個細胞培養孔係構築於該頂層結構中，以及一或多個微流體通道係構築於該底層結構中，其用於進行氧氣清除反應或/及氧氣生成反應以控制該氧氣濃度。該微流體陣列平台能於不同氧氣濃度下同步進行細胞培養，且可與既有之細胞培養器，及與具成本效益的設置及易於操作之高通量設備兼容使用。

Description

用於氧氣濃度控制下同步細胞培養的微流體陣列平台
本發明關於一種用於氧氣濃度控制下同步細胞培養的微流體陣列平台。
本發明享有於2012年10月25日申請之美國臨時專利申請案號61/718,478之優先權，其內容亦全部被引用於本文中。
氧氣在生物系統當中扮演非常重要的角色，並負責調節體內的細胞功能。迄今，在體外的細胞培養研究主要在約氧氣濃度20%的大氣條件下完成。然而，在人體內，細胞會對不同的氧氣濃度有不同的反應(Decaris et al.,Angiogenesis,12：303,2009)。例如，正常大腦的氧氣含量介於5%~10%，而肺泡中的氧氣含量則約14%(McCord et al.,Mol.Cancer Res.,7：489,2009)。氧氣以各種方式影響細胞反應，包括代謝途徑和細胞膜完整性。因此，氧氣濃度對調節各種細胞在正常生理和疾病狀態下的功能扮演重要的角色(Allen & Bhatia,Biotechnol.Bioeng.,82：253-262,2003)。例如，缺氧誘導基因調節多種生物性過程，包括細胞增殖、血管生成、細胞代謝、細胞凋亡、細胞不朽化以及遷移。缺氧誘導因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)在正常胚胎發育對於一早期正常血管發育是必要的(Harris,Nat.Rev.Cancer,2：38,2002)。血管新生作用已被認為是在腫瘤生長的必要 要素。強力的血管新生刺激物一血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表現量，會因缺氧而上調。由此可見，氧氣梯度是腫瘤的生長和發展的一個關鍵因素(Rice & Huang,Cancer Manage.Res.,3：9,2011；Giordano & Johnson,Curr.Opin.Genet.Dev.,11：35,2001)。
以往，用於細胞培養的氧氣濃度是藉由直接將氧氣或氮氣灌入培養基中來控制以創造含有不同氧氣濃度的環境(Allen & Bhatia,Biotechnol.Bioeng.,82：253-262,2003)。然而，這些方法常常需要複雜的儀器和大量的氣體供給。後來，直接加入氧氣清除劑於細胞培養基中因其簡單又有效率，也被用來控制氧氣濃度。但是，化學添加物會改變培養基的組成，並進一步影響細胞反應(Reist et al.,J.Neurochem.,71：2431,1998)。上述的傳統方法無法實現具高空間解析度的氧氣梯度生成。為了產生用於細胞培養所需的氧氣梯度，一些微流體裝置已被開發。例如，已開發出一種可產生軸向氧含量梯度的彈性體生物反應器，係透過利用微流體通道內的細胞吸收氧氣來達成(Mehta et al.,Biomed.Microdevices,9：123,2007)。部份聚合物具有低氧氣擴散性係被應用於構築硬頂軟底的微流體裝置以進一步消耗微流體通道內的氧氣(Mehta et al.,Anal.Chem.,81：3714,2009)。同樣的，彈性體微流體裝置內的防滲毛細管係應用於產生包括氧氣大量轉移梯度。(Pinelis et al.,Biomed.Microdevices,10：807,2008)。藉由電極模組以控制水電解的氧氣微梯度陣列(oxygen microgradient array，OMA)裝置被開發用於動態控制氧氣圖譜(Park et al.,Lab Chip,6：611,2006)。此外，一氣體滲透薄膜和一電腦控制的多通道氣體混合器被用來構築一多層微流體裝置。該裝置可以在微流體裝置內產生任意形狀的氧氣梯度(Adler et al.,Lab Chip,10：388,2010)。最近，首次有報告指出，氧氣清除液體及氣體滲透膜被用於控制氧氣梯度而不改變細胞培養基的組成(Skolimowski et al., Lab Chip,10：2162,2010)。然而，現有的微流體細胞培養裝置與氧氣梯度面臨一些挑戰，阻礙了在生物實驗室中的實際使用。例如，使用氧氣和氮氣以產生氧氣梯度需要精確的流量控制儀器、繁瑣的連接及以笨重的氣瓶儲存壓縮氣體。因為氣體能很容易地通過滲透薄膜而可能導致培養基蒸發和細胞培養通道內氣泡生成，因此該整體設置對長期研究是不可靠的，且無法直接建置在傳統的細胞培養箱中。
一具有單層結構模組的微流體裝置用於產生通過一微流體通道的細胞培養氧氣梯度已被開發(Chen et al.,Lab Chip,11：3626-3633,2011)。該單層結構使細胞顯微鏡的觀察更直接且裝置製造更容易。藉由限縮化學反應的範圍，該裝置能在不改變周圍的氣體組成的情況下利用最少的化學藥品有效地控制氧氣濃度。該裝置利用空間上限制的化學反應方法之優勢同步產生多種用於細胞培養的氧氣濃度。局部的化學反應可消除細胞培養區域之間的干擾，並提供該裝置為具有良好兼容性的細胞培養器。
然而，開發一個能同步在不同的氧氣濃度下進行細胞培養的裝置仍然是有需求的。
在本發明中，提供出一新的微流體陣列平台，其能同步在不同的氧氣濃度控制下進行細胞培養。
因此，在一方面中，本發明提供一種用於氧氣濃度控制下同步細胞培養的微流體陣列平台。該微流體陣列平台包含：一基板；一薄膜；該基板上有兩層狀結構，包括一頂層結構，係於該薄膜上方用於細胞培養，以及一底層結構，係於該薄膜下方用於氧氣濃度控制；其中該薄膜係夾於該頂層結構及底層結構之間； 複數個細胞培養孔構築於該頂層結構中；一或多個微流體通道構築於該底層結構中，其係應用於氧氣清除反應或/及氧氣生成反應以控制該等細胞培養孔中之氧氣濃度，其中每個微流體通道具有兩個或多個個別的入口以引入用於氧氣清除反應或/及氧氣生成反應之化學物質。
在另一方面，本發明提供一種依據本發明使用微流體陣列平台在氧氣濃度控制下同步進行細胞培養的方法。
在本發明裡所呈現的較佳具體實施例圖示係以闡述本發明為目的。應被理解的是，本發明並不侷限於所示之較佳具體實施例。
在附圖中：圖1(a)為根據本發明提出以聚二甲基矽氧烷(Poly(dimethylsiloxane)，PDMS)層作為微流體細胞培養陣列平台的示意圖。
圖1(b)提供一圖像顯示該所製備的平台填充食用染料，包括該化學反應物混合區以及該氣體交換區；其中該具有不同食用染料顏色的氣體交換區代表具有不同的氧氣濃度的細胞培養孔。
圖2(a)顯示針對氧氣濃度特徵基於一氧氣敏感染料的相對螢光壽命測量的實驗設置。
圖2(b)顯示於細胞培養孔中所培養的細胞其表面在使用1M氫氧化鈉(NaOH)及各種濃度的鄰苯三酚(pyrogallol)在20μl min-1的流速下所生成的氧氣濃度實驗估計值。
圖3(a)提供一圖像顯示所製備的經藥物處理後之細胞培養的微流體陣列平台以及於單一晶片上各種氧氣濃度下PrestoBlue細胞存活檢測。
圖3(b)顯示使用本發明的陣列平台，該A549細胞在各種氧氣濃度下以缺氧活化抗癌藥物(triapazamine，TPZ)處理12小時後的相對細胞存活率(在常氧環境下細胞於生長培養基中培養12小時的結果進行標 準化換算)；其中實驗數據以mean±SD表示。
圖4顯示使用本發明的細胞培養陣列以及傳統的96孔盤在常氧及缺氧環境下各種藥物治療對細胞存活率的比較；其中實驗數據以mean±S.E.M表示。(n=4用於進行該裝置實驗；n=8用於進行該孔盤實驗)。
圖5顯示使用本發明所述的裝置以不同的藥物治療及氧基進行細胞實驗後該標準化的PrestoBlue細胞存活率檢測結果(於多種氧氣濃度下進行控制處理及藥物處理)；其顯示細胞培養基與不同的存活細胞群反應後Presto試劑顏色的變化。
除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語和本發明所屬技術領域中具有通常知識者所通常理解的術語意義相同。
除非文中另有明確指出，本文所使用的「一」及「該」等單數冠詞包括複數的意義。因此，例如文中提及「一個樣本」包括了複數個樣本及在本技術領域中熟知的等同物。
本發明提供一種用於氧氣濃度控制下同步細胞培養的微流體陣列平台。該微流體陣列平台包含：一基板；一薄膜；該基板上有兩層狀結構，包括一頂層結構，係於該薄膜上方用於細胞培養，以及一底層結構，係於該薄膜下方用於控制氧氣濃度；其中該薄膜係夾於該頂層結構及底層結構之間；複數個細胞培養孔構築於該頂層結構中；一或多個微流體通道構築於該底層結構中，其係應用於氧氣清除反應或/及氧氣生成反應以控制該等細胞培養孔中之氧氣濃度，其中每個微流體通道具有兩個或多個個別的入口用於引入用於氧氣清除反應或/及氧氣生成 反應之化學物質。
根據本發明，該微流體陣列平台能在不同的氧氣濃度控制下同步進行細胞培養。該微流體陣列平台利用了微流體現象之優點，以展示藉由微陣列可達成組合的多樣性。重要的是，該微流體陣列平台兼容現有的細胞培養器和高通量儀器以符合成本效益設置和簡單的操作性。
在本發明的一具體實施例中，該基板是由玻璃製成的。該薄膜或層狀結構可由一種具有優異的光學透明性、可製造性和高氣體透氣性的彈性材料所製成。一較佳的彈性體材料例子係聚二甲基矽氧烷(PDMS)，其已被廣泛應用於構築微流體平台，包括細胞培養孔，以及用於氧氣清除反應或/及氧氣生成反應以控制氧氣濃度的微流體通道。
依據本發明，該微流體陣列平台係設計為具有兩層狀結構，包括一用於細胞培養的頂層結構及一用於氧氣濃度控制之底層結構。該兩層狀結構係被一薄膜所分隔。亦即，該薄膜係夾於該兩層狀結構間。該薄膜之厚度可介於20μm到1000μm，較佳為50μm至500μm。在一該微流體陣列平台之較佳實施例，該兩層狀結構係由一厚度約為200μm的薄膜所分隔。本發明之陣列平台可為適合及方便於製造及使用該平台之任何形式。在本發明之一具體實施例中，該陣列係置於一晶片上。
以圖1(a)、圖1(b)及圖1(c)作為微流體細胞培養陣列平台的一具體實施例，頂層結構可被設計為用於細胞培養的一或多個任何形式的微容器，例如孔洞。如圖1(c)所示，在頂層結構中構築複數個以矩陣排列的細胞培養孔，如同生物實驗室常用的標準96孔盤(每一個孔間隔9mm)的尺寸。每一個細胞培養孔的直徑大約是4mm。
以圖1(b)作為微流體陣列平台的一具體實施例，該微流體通道構築在細胞培養孔中。該氧氣濃度係藉由氧氣清除反應或/及氧氣生成反應所控制。該氧氣清除反應可藉由發明人先前開發及揭示的一種空間侷限的化學反應方法(Chen et al.,Lab Chip,11：3626-3636,2011)，其全文內容在此引用作為參考。另一方面，該氧氣濃度也可以藉由氧氣生成來控制。 為了有效的清除氧氣，任何可以清除氧氣的化學物質，例如鄰苯三酚(或稱為苯-1,2,3-三酚，C6H6O3)及氫氧化鈉(NaOH)都可以被使用。另一方面，為了能有效的生成氧氣，任何可以產生氧氣的化學物質，或是可以分解過氧化氫(H2O2)的化學物質，如具有鈷鹽(cobalt salt)之亞硫酸鈉(sodium sulfite)，都可以被使用。該化學物質可由兩個或多個個別的入口引入微流體陣列。當流經曲折通道時，化學物質開始彼此混合及反應。增加細胞培養孔下面的微流體通道的寬度以擴大氣體交換區域為有效的氧氣濃度控制。夾於該兩層狀結構之間的薄膜則防止該細胞培養基直接接觸該化學物質，同時保持優異的氧氣滲透性。
根據本發明所提出之陣列平台的一具體實施例中，在細胞培養孔中的氧氣濃度藉由測量氧敏螢光染料-氯化三(2,2'-雙吡啶)釕(III)(tris(2,2'-bypyridyl)ruthenium(III)chloride)的相對螢光壽命來校準；而流經下方通道的各種濃度的化學物質則使用圖2所示的實驗設置。該校準結果如圖3和圖5，其顯示該陣列平台的氧氣濃度可控制性。該平台可在不干擾細胞培養器中氣體含量的情況下在單一平台上達到由少於2%到常氧狀態的氧氣濃度。在一測試本發明陣列平台性能的實驗中，使用一缺氧活化抗癌藥物(TPZ)對人肺泡上皮細胞(A549)進行試驗，該實驗結果顯示於圖4(b)，其結果顯示該藥物治療的A549細胞的細胞存活率在低氧濃度下較常氧減少20%以上。
下面實施例僅用於說明，並非以任何方式用於限制本發明的其他部分。該領域具有通常技藝者，不需進一步闡述，應可依據本文的描述，充分利用本發明至其最廣範圍。本文中所引用的所有著作都以引用的方式併入本文。
實施例
實施例1：微流體細胞培養陣列設計及製備
該微流體細胞培養陣列包含一玻璃基板及兩聚二甲基矽氧烷(PDMS)層狀結構：一用於細胞培養之頂層結構，以及一用於進行化學 反應以控制氧氣濃度之底層結構。如圖1(a)所示，該兩層狀結構係由一厚度為200μm之PDMS薄膜所分開。於該頂層結構上，該細胞培養孔係以常用於生物性實驗室中標準96孔盤之相同尺寸所配置。該頂層結構含有4行及4列之直徑為4mm之細胞培養孔且有9個微流體通道構築於該底層結構上係應用於進行氧氣清除化學反應以控制在細胞培養孔中之氧氣濃度。為有效地清除氧氣，該化學反應物係由兩個個別的入口引入平台中，並當其流經曲折形狀之通道時即開始進行混合及反應(如圖1(b)所示)。增加細胞培養孔下方之微流體通道之寬度以擴大氣體交換之區域為有效的氧氣濃度控制。再者，位於細胞培養孔下方底層結構上之微流體通道係設計為蜂巢狀於該細胞培養於薄膜上時提供該薄膜一機械性支撐。當維持優異氧氣通透性時(在25℃純的PDMS中之氧氣擴散係數D=3.55 x 10-5cm2 s-1)，夾於該等PDMS層狀結構間之薄膜可防止該細胞培養基直接接觸化學反應物。
該微流體細胞培養陣列平台係使用已開發之多層軟性微影(multi-layer soft lithography，MSL)技術所製備。該具有細胞培養孔之頂層結構係使用直徑為4mm之活檢穿孔器於一空白的PDMS層板上製備。將該PDMS前驅物及固化劑以1：10(v/v)之基礎比率於60μC進行固化4小時以上以製備該頂層結構。該具有微流體通道模組之底層結構係藉由軟性微影複製模塑法所製成。該塑模係使用傳統光微影方法在矽晶圓上圖形化一負型光阻劑(SU-82050，MicroChem Co.,Newton,MA)所製成。接著於一乾燥器中將該塑模以1H,1H,2H,2H-全氟辛基三氯矽烷(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyltrichlorosilane)(78560-45-9，Alfa Aesar,Ward Hill,MA)於室溫下進行矽烷化30分鐘以上以防止不需要之PDMS與該塑模結合。將前述PDMS前驅物注入在該塑模上並進行固化4小時以上。此外，該厚度為200μm之PDMS薄膜係藉由將前述PDMS前驅物旋覆於該矽烷化之矽晶圓上所製備。於各層狀結構製備後，首先將該頂層結構與PDMS薄膜層以氧氣等離子表面處理法(90瓦(W)進行40秒(s))結合，並將互連之入口及出口沖壓於結合後之層狀結構上。該結合後之層狀結構接著與該底層結構對齊並 以相同之氧氣等離子表面處理法結合。
該底層結構係藉由將前述PDMS前驅物旋覆於以氧氣等離子(oxygen plasma)(PX-250，Nordson MARCH Co.,Concord,CA)於90瓦進行40秒處理之顯微鏡之玻璃片上或一氧化銦錫(indium tin oxide，ITO)塗佈之玻璃片上所製成。接著，將該PDMS塗佈之玻璃片置於150℃加熱板上固化20分鐘以上。之後，將該PDMS通道層及該底部玻璃片使用氧氣等離子於90瓦進行40秒表面處理並將彼此密封。該結合後之晶片進一步置於150℃加熱板上硬化另外的20分鐘以促進該結合及確保PDMS完全硬化以加強細胞兼容性。
實施例2：數值模擬
根據本發明使用該裝置時，於整個該細胞培養孔中之氧氣濃度係均勻的且其短暫的反應可同步被測量，藉此取得數值模擬以探討該裝置之執行情形。使用市售軟體COMSOL Multiphysics(Ver.4.3，COMSOL Inc.,Burlington,MA)以構築有限元素分析(finite element analysis，FEA)模型。為了簡化該模擬，於此模擬試驗中係製備一組用於氧氣清除之蜂巢狀微流體通道模型。該模型之幾何結構係與該設計的裝置相同。將一耗盡之氧氣流體以與該實驗相同流速引入通道中。該PDMS材料特性及水分別應用於通道結構及流體上。該短暫的氧氣濃度資訊於流體引入後立即進行模擬。於不同時間點之氧氣濃度資訊於流體引入後可被獲得。如模擬結果中顯示，該全部氣體交換區域，包括流體通道及PDMS蜂巢結構，於流體引入後約100s達到均勻的氧氣濃度分佈。整個氣體交換區域之氧氣濃度差異係小於0.5%。該結果顯示該裝置設計可於細胞培養孔中生成均勻之氧氣濃度。再者，該氧氣濃度於模擬中可於一很短的時間內(約5分鐘)達到一恆定的狀態。因此，該化學反應物可重新灌入以用於最小氧氣濃度干擾的長期實驗，其對於多數細胞培養應用是需要的。
實施例3：使用本發明之裝置以進行細胞培養及抗癌藥物測試
為了檢視用於細胞培養之晶片形式上陣列執行情形，係應用入類肺泡基質上皮腫瘤細胞(carcinomic human alveolar basal epithelial cells)(A549，ATCC,Manassas,VA,USA)進行探討。將A549細胞培養於含有10% v/v胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(Gibco 10082，Invitrogen Carlsbad,CA,USA)及1% v/v抗生素-抗真菌(antibiotic-antimycotic)(Gibco 15240，Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)之F-12K培養基中(Gibco 21127，Invitrogen Co.,Carlsbad,CA,USA)。原液在5% CO2下保存於T25細胞培養角瓶中(Nunc 156367，Thermo Scientific Inc.,Rochester,NY,USA)，並藉由0.25%胰蛋白酶-EDTA(trypsin-EDTA)(Gibco 25200，Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)分解以繼代。用於該試驗之細胞懸浮液係藉由將分解後之細胞在室溫下以1000rpm之轉速離心3分鐘所製成。在該細胞懸浮液引入晶片之前，該微流體通道係以細胞外基質(extracellular matrix，ECM)蛋白-纖維連接蛋白(F2006，Sigma-Aldrich Co.,St Louis,MO,USA)以每毫升100mg之濃度於培養器中處理2小時以上。接著將具有於60μl生長培養基中有2000個細胞之細胞密度的細胞懸浮液：引入本發明晶片上陣列平台的細胞培養孔中，並隔夜培養以促進細胞黏著於該晶片之細胞培養孔上。
用於氧氣清除時，鄰苯三酚(87-66-1，Alfa Aesar,Ward Hill,MA,USA)及NaOH(30620，Sigma-Aldrich,St Louis,MO,USA)係被引入該微流體通道中以控制氧氣濃度。當於下方通道中使用如圖2(a)所示試驗設置之不同濃度的流動化學物質時，於細胞培養孔中之氧氣濃度係藉由測量一氧氣敏感之螢光染劑-氯化三(2,2'-雙吡啶)釕(III)(50525-27-4，Acros Organics,Geel,Belgium)之相對螢光存在時間來校準。該設置係基於一倒立螢光顯微鏡分別具有一LED、一作為光源的PIB光電二極體及光子偵測器。當引入不同濃度用於氧氣清除之化學反應物(濃度為1M之NaOH及濃度介於0至500μg/ml之間之鄰苯三酚)於底層結構之微流體通道中時，本發明微流體陣列平台細胞培養孔之氧氣濃度可被測量。該校準結果顯示於圖2(b)。結果表示該平台於單一平台中達到由低於2%至正常含氧之氧氣濃 度而不會干擾細胞培養器中之氣體含量。
為了展示使用本發明晶片上之陣列平台可生成用於細胞研究之氧氣梯度的可能性，在氧氣梯度下，將抗癌藥物培養基連續灌流至細胞培養物中以進行試驗。於本實驗中，使用抗癌藥物-Triapazamine(TPZ，3-胺基-1,2,4-苯并三嗪-1,4-二氧化物)(Toronto Research Chemicals Inc.,North York,Canada)，其僅於非常低含氧時會活化成一毒性自由基，參閱Brown所述方法予以使用(Brown,Cancer Res.,59：5863,1999；Marcu and Olver,Curr.Clin.Pharmacol.,1：71,2006)，該實驗內容皆被引用至本文中。
測量該藥物處理後之A549細胞之相對細胞存活率(與於正常含氧情況下於生長培養基中培養12小時之細胞標準化)。圖3(a)及圖3(b)中所顯示之結果表示相較於正常含氧時，於低氧氣濃度下該藥物處理後之細胞的細胞存活率下降20%以上。
實施例4：在正常含氧及缺氧時不同藥物處理下之細胞存活率比較
使用本發明之細胞培養陣列平台及傳統96孔盤(167008，Nunclon DELTA Surface，Nunc)及一具有氧氣濃度控制的細胞培養器(Heracell 240i，Thermo Scientific)於正常含氧及缺氧時不同藥物處理下之細胞存活率比較。在該孔盤實驗中，約5000個A549細胞被接種於每個孔中。該等細胞以80μl培養基隔夜培養於細胞培養箱中以確保於藥物處理前細胞附著於孔上，接著將含有不同濃度TPZ之20μl藥物溶液加入孔中。該等細胞係以含有藥物之培養基培養48小時。試驗後，使用螢光細胞存活分析法估計細胞存活率，並藉由讀盤機讀值。如圖4所示，兩者之表現情形於正常含氧及缺氧情況時表現相似。於孔盤實驗中略低之存活率可能係因用於製造孔盤之聚苯乙烯的低氧氣滲透性所造成。因此，細胞所經歷之真實氧氣濃度應低於細胞培養箱之設定。結果顯示，相較於使用本發明裝置者，未使用者之A549細胞會對於該藥物有較高之缺氧活化之TPZ細胞毒性。細胞型態差異顯示使用本發明裝置可成功地控制氧氣濃度，該結果係以缺氧 活化TPZ細胞毒性所表示。
實施例5：使用本發明裝置之細胞培養及抗癌藥物試驗
在該實驗中，1M NaOH及濃度為0、190及500μg ml-1之鄰苯三酚溶液於流速為20μl ml-1係用於設定細胞培養孔中之氧氣濃度分別為正常含氧(~20%)、7.0%及1.4%之氧氣濃度，且使用濃度為0、10、25、50及100mM之TPZ藥物。該等細胞培養於不同條件下，包括：20%氧氣及0mM TPZ；20%氧氣及50mM TPZ；以及1.4%氧氣及50mM TPZ；作用48小時。吾人發現於控制條件(~20%氧氣及0mM TPZ)下，細胞可長滿且良好附著至培養孔中PDMS薄膜基板。再者，使用來自LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity套組(L3224,Invitrogen)中含有鈣黃綠素AM(calcein AM)(1mM)及乙錠二聚體-1(ethidium homodimer-1)(2mM)的活/死染色溶液確認該細胞存活率。該等細胞於控制條件下培養48小時之良好存活率(>95%，藉由使用一來自Molecular Devices,Sunnyvale,CA的影像分析軟體MetaMorph分析不同細胞培養孔中之四個螢光影像)係確認本發明多層PDMS微流體裝置有良好的細胞兼容性。相對的，在20%氧氣及50mM TPZ之細胞培養結果顯示因TPZ之細胞毒性使細胞形狀變圓且部分細胞由基板上脫離。再者，在1.4%氧氣及50mM TPZ之細胞培養結果顯示更多的細胞變圓且由基板上脫離。為了量化A549細胞經TPZ於不同氧氣濃度下處理後之細胞存活率，本試驗使用PrestoBlue細胞存活率分析。該已開發之微流體陣列平台可直接置於常用於生物性實驗室之微盤讀取器進行讀值分析。不同氧氣濃度下之細胞培養測量結果顯示於圖5。為了最小化試驗間之變異數，各孔中所測得之螢光強度係與細胞培養於正常含氧且無TPZ處理(如0mM TPZ)的細胞培養孔之平均強度進行標準化。為了比較於不同氧氣濃度下經標準化之細胞存活率差異，於本研究中係以獨立的、雙尾Student’s t-檢定進行統計分析。如圖5所示，該等細胞培養於無TPZ處理的不同氧氣濃度下(~20%至1.4%)具有相似的標準化細胞存活率。該結果顯示應用在該已開發裝置之方法控制氧氣濃度係不具細胞毒性的。因此，該已開發之陣列 平台具有良好的細胞兼容性且可利用於不同細胞研究。再者，針對濃度超過25mM以上之TPZ處理時，在正常含氧培養條件之標準化細胞存活率係比以低氧氣濃度培養(7.0%及1.4%)高出20%以上之細胞存活率。此外，該統計分析亦顯示於正常含氧及低氧氣濃度條件之間具有顯著差異。當該TPZ濃度增加至100mM，於1.4%氧氣濃度條件之標準化細胞存活率統計上係比7.0%氧氣濃度條件更低。該藥物試驗結果進一步與該等使用傳統孔盤及具有一控制氧氣濃度之細胞培養設備完成試驗者進行比較。
如上所述，該比較結果顯示根據本發明之方法所得之結果與該標準96孔盤相似。因此，該實驗結果顯示氧氣濃度可簡易地藉由該已開發之微流體細胞培養陣列來控制，並顯示TPZ缺氧活化之細胞毒性。再者，該實驗結果亦顯示氧氣濃度扮演一重要角色，其不僅調控細胞行為亦影響根據該等藥物作用模式之藥物效用。

Claims (17)

  1. 一種用於氧氣濃度控制下同步細胞培養的微流體陣列平台，其包含：一基板；一薄膜；該基板上有兩層狀結構，包括一頂層結構於該薄膜上方用於細胞培養，及一底層結構於該薄膜下方用於氧氣濃度控制；其中該薄膜係夾於該頂層結構及底層結構之間；複數個細胞培養孔構築於該頂層結構中；一或多個微流體通道構築於該底層結構中，其係應用於氧氣清除反應或/及氧氣生成反應以控制該等細胞培養孔中之氧氣濃度，其中每個微流體通道具有兩個或多個個別入口以引入用於氧氣清除反應或/及氧氣生成反應之化學物質。
  2. 如申請專利範圍第1項之微流體陣列平台，其中該基板係以玻璃製成。
  3. 如申請專利範圍第1項之微流體陣列平台，其中該兩層狀結構及薄膜係由一具有光學透明性、可製造性、及高度氣體透氣性之彈性材料所製成。
  4. 如申請專利範圍第3項之微流體陣列平台，其中該兩層狀結構及薄膜係由聚二甲基矽氧烷(Poly(dimethylsiloxane)，PDMS)所製成。
  5. 如申請專利範圍第1項之微流體陣列平台，其中夾於該兩層狀結構間之薄膜係具有一厚度為20μm至1000μm。
  6. 如申請專利範圍第5項之微流體陣列平台，其中夾於該兩層狀結構間之薄膜係具有一厚度為50μm至500μm。
  7. 如申請專利範圍第6項之微流體陣列平台，其中夾於該兩層狀結構間之薄膜係具有一厚度為200μm。
  8. 如申請專利範圍第1項之微流體陣列平台，其為一晶片形式。
  9. 如申請專利範圍第1項之微流體陣列平台，其中該細胞培養孔係以矩陣形式排列。
  10. 如申請專利範圍第1項之微流體陣列平台，其中該細胞培養孔中之氧氣濃度係以一空間侷限的化學反應方法來控制。
  11. 如申請專利範圍第10項之微流體陣列平台，其中用於氧氣清除反應或/及氧氣生成反應之該化學物質係由個別入口引入平台內。
  12. 如申請專利範圍第11項之微流體陣列平台，其中用於氧氣清除反應之該化學物質係為鄰苯三酚(pyrogallol)及氫氧化鈉(NaOH)。
  13. 如申請專利範圍第11項之微流體陣列平台，其中用於氧氣生成反應之該化學物質係為一種可分解過氧化氫之化學物質。
  14. 如申請專利範圍第11項之微流體陣列平台，其中用於氧氣生成反應之該化學物質係為具有鈷鹽(cobalt salt)之亞硫酸鈉(sodium sulfite)。
  15. 如申請專利範圍第1項之微流體陣列平台，其中該微流體通道為曲折形狀。
  16. 如申請專利範圍第1項之微流體陣列平台，其中當該化學物質流經該通道時開始互相混合及反應。
  17. 一種用於在氧氣濃度下同步細胞培養之方法，其係使用如申請專利範圍第1項所述之微流體陣列平台同步培養細胞。
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