TW201439535A

TW201439535A - 利用脈衝雷射光源產生的聲學信號之造影系統

Info

Publication number: TW201439535A
Application number: TW102113270A
Authority: TW
Inventors: Chi-Kuang Sun; Yu-Hung Lai; Chieh-Feng Chang; Szu-Yu Lee
Original assignee: Univ Nat Taiwan
Priority date: 2013-04-15
Filing date: 2013-04-15
Publication date: 2014-10-16
Also published as: TWI467169B

Abstract

本發明是一種利用脈衝雷射光源產生的聲學信號之造影系統，其包含：(a)一脈衝雷射光源，其用以發射至少一光源；(b)至少一光調製模組，其調變該脈衝雷射光源之波形訊號，使該脈衝雷射光源產生一具有高純度振幅正弦曲線調製的光束；(c)一物鏡元件，其將該光束匯聚於一具有一光聲特性或經過光聲染劑處理之待測樣本，並藉由該光束激發該待測樣本以獲得一超音波信號；及(d)一掃描裝置，其包含一超音波接收器，其用以接收該超音波信號之一頻率信號，並藉此掃描該待測樣本之影像。

Description

利用脈衝雷射光源產生的聲學信號之造影系統

本發明是關於一種造影系統，其特別是將經調變後的雷射光源激發具有光聲染劑的樣品後，以獲得雙光子吸收產生的聲學信號，使影像同時達到次微米解析度及超音波穿透深度的效果。

傳統的光學顯微鏡具有微米尺寸的解析度，光子在組織中自由行徑長度極短，因此無法達成體內深層成像；而雙光子螢光顯微鏡能同時達成一毫米穿透深度並具備光學顯微鏡解析度；另一方面，超音波顯微鏡雖具有次米等級的穿透深度，但因波長因素，空間解析度僅有毫米等級。而雙光子螢光顯微鏡能同時達成一毫米穿透深度並具備光學顯微鏡解析度。

單光子聲光顯微鏡結合光學顯微鏡的高解析度及聲學顯微鏡的高穿透度，利用光子吸收所引發的超音波進行成像，由於經過光學路徑上的光訊號皆會引發超音波，故解析度會受限於超音波波長，而穿透深度則受限於光學散射與衰減，故僅能達到光學穿透深度，單光子聲光顯微鏡的最佳空間解析度與造影深度的比例為1/200，故次微米縱向/橫向解析度及釐米穿透深度並無法同時實現；而多光子誘發的光聲造影雖能夠同時達成深層掃描的高解析度影像，並克服單光子光聲顯微鏡的缺點，然其技術上最大的困難點在於如何從單光子的光聲訊號分離出多光子誘發的超音波訊號。

為解決上述的困難點，目前的解決方式係利用具低重複率及高脈衝能量(mJ/pluse)的奈秒雷射用來激發樣品，並於時域上進行分析，利用帶通濾波元件(1-10MHz)以增加訊號對比；然而，高脈衝能量可能會傷害生物組織，且低重複率的激發雖提供時域上的解析，但卻造成頻域上的寬頻激發，無法提供頻譜偵測所需要之選擇性與靈敏度。此外，由於該技術不具備任何調變手段，當線性吸收及非線性吸收同時存在於組織時，在聲學頻譜上並無法分辨此訊號的來源，因此無法達成高解析度深層影像的目標。

另一方面，牽涉本案技術的相關文獻如下：

文獻1：“Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences” (Warren et al., Nature Biotechnology, Vol. 21, No. 11, 2003)揭示脈衝雷射可用於激發生物樣品之非線性吸收並產生螢光，並用於倍頻螢光顯微術。

文獻2：“Ultrafast measurement of two-photon absorption by loss modulation” (Tian et al., Opt. Lett. Vol. 27, No. 18, 2002)，其揭示耗損調變架構，用以精確量測雙光子吸收之效率。

文獻3：“High-Resolution Confocal Microscopy by Saturated Excitation of Fluorescence” (Fujita et al., Phys. Rev. Lett. 99, 228105, 2007)，其揭示利用耗損調變架構應用在螢光顯微鏡上(倍頻顯微術)，然而，其接收訊號為螢光，故與本發明的目的不同，而造成應用上的差異。

文獻4：“Fine depth resolution of two-photon absorption-induced photoacoustic microscopy using low-frequency bandpass filtering” (Yoshihisa Yamaoka, et al. Opt. Express, Vol. 19, No. 14, 2011)；文獻5：“Frequency-selective multiphoton- excitation-induced photoacoustic microscopy (MEPAM) to visualize the cross sections of dense object” (Yoshihisa Yamaoka, et al., Proc. of SPIE Vol. 7564, 2010)；以及文獻6：“Enhancement of multiphoton excitation-induced photoacoustic signals by using gold nanoparticles surrounded by fluorescent dyes” (Yoshihisa Yamaoka, et al., Proc. of SPIE Vol. 7177, 2009)；第4-6篇前案則揭示多光子吸收之聲光效應，但其所使用的偵測方式(寬頻帶偵測、時域分析)和本發明(窄頻偵測)有本質上的不同，無法達成頻域解析的靈敏度與選擇性。

文獻7：“Determining two photon absorption cross section via non resonant multiphoton photoacoustic spectroscopy” (Kiser et al., Proceeding of SPIE Vol. 6759, 2007)，該文獻利用雙光子吸收激發之超聲波信號強度來反推螢光染劑橫截面(cross section)之大小，雖然產生信號的物理機制相同，但其所使用為奈秒雷射，且未施加任何調變手段，其也非應用在光聲顯微鏡上。

文獻8：“Depth and resolution characteristic of two photon photoacoustic spectroscopy for noninvasive subsurface chemical diagnostics” (Sudhir Dahal et al., Proc. of SPIE Vol. 8025, 2011)，該文獻揭示使用物鏡聚焦使螢光染劑Rhodamine產生多光子激發聲光信號，但其研究使用奈秒雷射並非飛秒雷射，且並未針對光源進行振幅調制，而直接針對總信號強度，進行信號處理，與本案的窄頻偵測不同，且其研究標的是聲光現象，卻以螢光信號作為解析度之依據，失去分析上的可信度。

文獻9：“Ultrahigh resolution photoacoustic microscopy via transient absorption” (Ryan L. Shelton et al., 2010, Vol. 1, No. 2 BIOMEDICAL OPTICS EXPRESS)，該文獻使用的光源調製方式為方波調變，係利用兩個單光模式(Chopping/ Normal Mode)的調變器調製兩道Pump/ Probe Beam，並透過物鏡聚焦於樣本上，以超音波探頭接收光聲信號，並針對差頻(Difference Frequency)與和頻(Sum Frequency)進行積分。然其調變信號與本發明的純正弦調變不同，且架構上亦非本文使用的耗損調變方法之頻率調變模式。該文獻忽略方波調製引發的問題，尤其是光聲調製器在Chopping/Normal Mode以方波操作時，本身的非線性效應可引發出偶數次之多倍頻。

文獻10：“Thermoacoustic microscopy” (Allan Rosencwaig et al., US Patent, US4255971, 1981)，該篇專利前案是為針對光聲效應採取調變手段最早的專利，但是其僅單純提出包含各種調變手段的抽象概念，並未說明如何實施調變手段；此外，該篇專利也沒有提到鎖模雷射(mode-locked laser)，亦未提及飛秒雷射所具備的高峰值、高重複率的好處。甚至也未提到雙光子吸收激發之光聲效應，亦未提到可以透過施加染劑來增加對比度，純粹以一廣泛的抽象概念宣稱了一個大範圍，失去了可應用之實際性。

文獻11：“Femtosecond photoacoustics integrated two-photon fluorescence and photoacoustic microscopy” (Martijn E. van Raaij et al., Proc. of SPIE Vol. 7564, 2010)，該篇文獻所研究的物理機制為單光子激發之光聲效應，且所接收聲學信號的方式為以超音波探頭針頭針對頻譜上的雷射重複率80MHz去做偵測，並沒有對光源本身有任何振幅調制，也並未提及施加染劑，只是超音波探頭直接加裝在商業用螢光顯微鏡上，同時接收光信號以及聲學信號。

有鑑於過去各種光學顯微鏡或聲光顯微鏡的缺點，本發明提供一種造影系統，其係一種將非線性光學效應限制於光學系統的焦點上。藉由飛秒雷射或皮秒雷射提供高重複率的脈衝光源進行窄頻激發，並利用光學聚焦達成高峰值強度(High Peak Power)的光源，而該高峰值強度的光源會引發出非線性吸收的信號。另一方面，本發明亦透過高效率的顯影劑(contrast agent)大幅提升訊號強度及信雜比，該顯影劑具有寬能隙(wide energy band)結構、共振能隙結構，或載子轉移越遷機制，有效地將非線性吸收信號有效地轉換成超音波(聲波)信號。由於超音波在傳遞的過程中，不易隨著傳播距離而衰減，故可穿透具有公分厚度的組織以達成深層影像。因此，本發明透過非線性的光學效應、超音波偵測及染劑的使用，可同時達到毫米等級以上的高穿透深度及光學解析度影像，而軸向及側向解析度可達到次微米等級。

是以，本發明提供了種利用脈衝雷射光源產生的聲學信號之造影系統，其包含：(a)一脈衝雷射光源，其用以發射至少一光源；(b)至少一光調製模組，其調變該脈衝雷射光源之波形訊號，使該脈衝雷射光源產生一具有高純度振幅正弦曲線調製的光束；(c)一物鏡元件，其將該光束匯聚於一具有一光聲特性或經過光聲染劑處理之待測樣本，並藉由該光束激發該待測樣本以獲得一超音波信號；及(d)一掃描裝置，其包含一超音波接收器，其用以接收該超音波信號之一頻率信號，並藉由該頻率信號進行信號強度的偵測以掃描該待測樣本之影像。

在一具體實施例中，本發明之脈衝雷射光源係一種具有低脈衝能量和高速脈衝的光源，其可包含一飛秒雷射或一皮秒雷射，可降低生物組織的傷害，並縮短掃描的時間。

本發明中所使用的光調製模組係用以調製脈衝雷射光源的頻率或振幅，在一具體實施例中，本發明之造影系統可使用一個或兩個光調製模組來調變振幅或頻率，其中該光調製模組包含電吸收調變器、電光調變器、磁光調變器、液晶空間調變器或其組合。

在一具體實施例中，本發明調變該脈衝雷射光源之方法可使用一單光振幅調製方法(single light amplitude modulation)或一耗損調變方法(loss modulation technique)。在單光振幅調製方法中，其光調製模組將外加一高純度外源輸入訊號，則此高純度振幅正弦調變之頻率即為外源輸入信號之頻率。

在耗損調變的方法中，可透過改變衍射級(diffraction order)或光調製模組的調製頻率來調整拍頻。此高純度的正弦曲線調變雷射光源拍頻的方程式為Min(|f₁*Orderl-f₂*Order2+n*fr|)，而調變頻率的計算方法係第一道光的調變頻率f₁乘上其階數，減去第二道光f₂的調變頻率乘上其階數，該差值和雷射光源的重複率f_r倍數差的最小值。

本文所述之「f₁」指的是第一光調製模組的調變頻率；「f₂」指的是第二光調製模組的調變頻率。

在一具體實施例中，具有高純度振幅正弦曲線調製的光束透過該物鏡元件合併調製後的光束，仍具有高純度振幅正弦曲線的特性(amplitude modulation)，其中該物鏡元件包含顯微鏡物鏡、透鏡、球面鏡、拋物面鏡、相位調變光柵、梯度折射率棒(GRIN Rod)或光纖端點之弧面。

在一具體實施例中，本發明的掃描裝置進一步包含：(i)一樣本空腔，其用於裝載該待測樣本；(ii)一三維移動裝置，其用於移動該待測樣本，以掃描該待測樣本；(iii)一第一放大器，其用於放大該超音波接收器所獲得的一初級超音波信號；(iv)一第二放大器，其接收該初級超音波信號(ω或2ω)或第一放大器放大之信號，並針對該頻率信號進行一窄頻信號偵測；及(v)一控制分析裝置，其用以控制該三維移動裝置，並記錄該第二放大器之信號強度。

另一具體實施例中，本發明之掃描裝置進一步連接一頻譜分析儀，其用以分析該頻率信號之一基頻信號(ω)、一倍頻信號(2ω)或/及一多倍頻信號(nω，n>=3)。

本文所述之「三維移動裝置」可為一雙軸移動平台、一三軸移動平台、一微奈米機電系統或一雷射掃描振鏡(Galovo mirror)。

本文所述之「第一放大器」可包含低雜訊前置放大器、高線性前置放大器或光譜分析裝置；而第二放大器包含鎖相放大器、頻率分析裝置或示波器裝置。

本文所述之「窄頻信號」係偵測其單脈衝反應(Pulse Response)之窄頻頻譜訊號，或一長時間積分訊號，其為針對某特定頻率進行時間軸上長時間之積分平均。

在本文中所述「調變」亦可稱為「調製」。在一具體實施例中，當脈衝雷射光源使用單光振幅調製方法或耗損調變方法調變後，脈衝雷射光源在頻譜上所呈現的頻段，如圖1(a)所示，該頻段為本文所述的高純度弦波，其中該頻段並不會出現高階頻段，如2ω、3ω或4ω等。當調製後的光束聚焦於樣本上，若光聲染劑分子一次吸收雙光子並透過光聲效應產生超音波信號(聲學信號)，染劑分子的聲學信號在頻譜上所呈現的頻段，如圖1(b)所示，頻譜上則出現2ω，其為倍頻信號，故本發明可透過雙光子吸收所產生的聲學信號而產生2ω頻率信號，其為本案之根本物理機制。

本文所述之聲學信號之頻率範圍於20kHz至200MHz。在一具體施例中，本發明使用1MHz進行實測。低頻段200kHz~2MHz屬於長波長超音波，其光學激發效率較低，但超音波衰減小，適合超深層影像掃描；高頻段2MHz~20MHz屬於短波長超音波，儘管超音波衰減較大，但光學激發效率較高，更適合中淺層精密掃描。

另一方面，本文所述之「頻率信號」為單光子吸收信號、雙光子吸收信號或多光子吸收信號。針對單純單光子吸收信號，該頻率信號係一線吸收訊號(信號強度和輸入能量呈一次正比)或非線性飽和信號(信號強度和輸入能量呈根號正比)；針對單純雙光子或多光子吸收信號，該頻率信號係一非線吸收訊號(信號強度和輸入能量呈二次或多次正比)；若光子吸收信號已達飽和，該頻率信號係一非線性飽和信號(信號強度和輸入能量呈根號正比)。

在一具體實施例中，本發明所使用的該超音波接收器包含超音波偵測器、超音波探頭、超音波陣列、壓電陶瓷材料(PZT)、光學共振腔或圓環。在另一具體實施例中，該物鏡與該超音波探頭之配置方式係物鏡和超音波接收器在同一側(Reflection mode)、物鏡和超音波接收器在對側(Transmissive mode)或/及超音波接收器在物鏡側邊(Orthogonal mode)。

本文所述之「光聲染劑」是用以做為外源性或內源性的顯影劑(contrast agent)以產生雙光子吸收光聲效應，其可包含螢光染劑、有機染劑、奈米粒子、微米粒子、生物標定核酸分子或/及其組合。另一方面，若特定組織本身已具備雙光子光聲效應，亦可直接做為內源性的顯影劑。本發明可選擇內源性或外源性的顯影劑，以掃描不同組織，其可增加本發明造影系統的專一性及靈敏度。

本說明書及申請專利範圍中所用之詞語『包含』、『具有』、『包括』或『含有』為包括在內的或開放式的，且其不排除額外未引用之元件或方法步驟。

茲以下列具體實施態樣以進一步例示說明本發明，其中該些實施態樣僅提供作為說明，而非用以限制本發明之範疇。

10‧‧‧本發明之造影系統

101‧‧‧脈衝雷射光源

102‧‧‧光調製模組

103‧‧‧物鏡元件

104‧‧‧第一分光元件

1041‧‧‧第二分光元件

20‧‧‧待測樣本

1042‧‧‧超音波接收器

105‧‧‧掃描裝置

1021‧‧‧延遲平台

1022‧‧‧控制分析裝置

1023‧‧‧控制器

1031‧‧‧光二極體

1044‧‧‧第一放大器

1045‧‧‧第二放大器

1046‧‧‧波形產生器

1051‧‧‧樣本空腔

1052‧‧‧三維移動裝置

106‧‧‧頻譜分析儀

圖1(a)為脈衝雷射光源在頻譜上所呈現的頻段(高純度弦波調變)；圖1(b)為染劑分子的聲學信號在頻譜上所呈現的頻段(透過雙光子吸收產生聲學信號之頻譜)。

圖2係本發明造影系統之基本架構圖。

圖3係利用耗損調變方法產生具有高純度振幅正弦曲線的光源光束。圖3(A)為兩個光調製模組；圖3(B)為一個光調製模組。

圖4係利用單光振幅調製方法產生具有高純度振幅正弦曲線的光源光束。

圖5雷射頻譜與拍頻產生原理。

圖6為雷射光利用耗損調變方法使光束具有高純度的正弦曲線調製。圖6(A)為飛秒雷射的原始重複率的光譜能量分佈圖；圖6(B)為第一階拍頻光譜；圖6(C)為第二階拍頻。

圖7為重合光源的低頻率光譜。圖7(A)為紅光(λ_R=800 nm)的光譜能量分佈圖；圖7(B)為透過BBO晶體產生的藍光(λ_B=400 nm)之光譜能量分佈圖。

圖8(A)顯示碳粒子(奈米粒子)、螢光分子及結合碳粒子與螢光分子的染劑之示意圖；圖8(B)顯示將雙光子螢光轉換為雙光子光聲超音波之能量帶示意圖。

圖9係利用本案造影系統與一般顯微鏡掃描葉片組織的圖像。圖9(A)為本發明造影系統；圖9(B)為一般顯微鏡。

實施例1：造影系統之基本架構

如圖2所示，本發明之造影系統10包含一脈衝雷射光源101 用以發射至少一光源，並透過至少一光調製模組102調變該脈衝雷射光源之波形訊號，將該脈衝雷射光源產生一具有振幅正弦曲線調製的光束，利用該物鏡元件103將該光束匯聚於一具有一光聲染劑之待測樣本20，並藉由該光束激發該待測樣本以獲得一超音波信號，利用包含一超音波接收器1042的掃描裝置105用以接收該聲學信號之一頻率信號，並藉由該頻率信號進行信號強度的偵測以掃描該待測樣本20之影像。

實施例2：產生具有高純度振幅正弦曲線的光源光束 A.耗損調變方法(Loss modulation technique or Beating technique)

本實例中所使用的光調製模組為連續波(continuous wave)模式，其用以頻率調變。光調製模組可改變輸入的射頻(radio frequency,RF)訊號以改變調控頻率，RF訊號源可選擇固定式或可調式。

A-1：兩個光調製模組

實施方式：如圖3A所示，該設計與麥克森干涉儀相似，但分別設置兩個光調變器102在兩道光路上。當雷射光束通過第一個分光鏡104分成兩束子光束後，兩道子光束會分別經過兩個光調變器102，並透過控制器1023調變該些光束的頻率，但調變值略有差異。當這兩道子光束利用第二個分光鏡1041再次合併時，合併的光束會具備弦波振幅調變的特性(amplitude modulation)，且該弦波頻率即是這兩個光調變器頻率調變之差值。

A-2：一個光調製模組

實施方式：如圖3B所示，該該設計與麥克森干涉儀相似，但卻只有一個光調變器102在兩道光路的其中一道上。當雷射光束通過第一個分光鏡分成兩束子光束後，其中一道子光束會經過光調變器102，並透過控制器1023調變該光束的頻率。當兩道子光束利用第二個分光鏡1041再次合併時，合併的光束會具備弦波振幅調變的特性，且該弦波頻率即是光調變器頻率和原本雷射重覆率(repetition rate)之差值。

利用上述耗損調變方式所獲得具有振幅正弦曲線調製的光束，透過顯微鏡物鏡匯聚至樣本上，透過該待測樣本20上之特殊光聲染劑，激發出雙光子吸收所造成之聲學信號，經過超音波探頭1042接收和電信號放大(探頭後設置第一放大器，即前置放大器1044，並於其後設置第二放大器，即鎖相放大器1045)，在頻譜上，信號的頻率具備有兩倍於上述之頻率，稱之為倍頻信號(second harmonic generation,SGH)，針對此倍頻信號進行窄頻偵測(可透過單脈衝偵測或者長時間積分)並完成掃描成像。

B.單光振幅調製方法(Single light amplitude modulation)

如圖4所示，本實例中所使用的光調變製器為單光模式(Chopping/Normal Mode)，其可用以進行弦波振幅調變，該弦波之頻率及強度由任意波形產生器1046(Function generator)輸入決定，可更改頻率。

實施方式：雷射光束直接通過光調變器102後，振幅會被弦波調變，接著透過顯微鏡物鏡103匯聚此合併光束至待測樣本20上，透過該樣本上之特殊光聲染劑，激發出雙光子吸收所造成之聲學信號，經過超音波探頭1042接收和電信號放大(探頭後設置第一放大器，即前置放大器1044，並於其後設置第二放大器，即鎖相放大器1045)，在頻譜上，信號的頻率具備有兩倍於上述之頻率，稱之為倍頻信號(second harmonic generation,SHG)，針對此倍頻信號進行窄頻偵測(可透過單脈衝偵測或者長時間積分)並完成掃描成像。

實施例3：分離線性吸收與非線性吸收

由於線性吸收與非線性吸收同時會存在於系統中，且線性訊號比非線性訊號高出幾個數量級，因此如何將非線性訊號從線性訊號背景分離則相當重要。本實例透過耗損調變方法分離出非線性訊號。

當雷射光束分成兩光束並經過具有不同聲子調變頻率(phonon modulation frequency)的光調變器，假設兩個光調變器的調變頻率各別為f₁及f₂，及飛秒雷射的重複率為f_R，且第一階(order)的拍頻(beating frequency)取決於衍射級，其運算方法如下：Ω(f₁,f₂,f_R)=|f₁-f₂|...(雙光束均為+1或-1階衍射)

Ω(f₁,f₂,f_R)=|f₁-f_R|...(一光束為0階，另一光束為±1階衍射)

Ω(f₁,f₂,f_R)=|f₁+f₂-2f_R|...(每一光束各別具有+1和-1階衍射)

如圖5所示，脈衝雷射會具有類似光頻梳(optical frequency comb)的頻譜，其間隔等同於雷射重複率f_R。當兩道雷射光分別經過不同的AOM之後，兩道光各吸收一顆不同能量的聲子，因此光頻梳的頻譜會偏移，其頻率偏移量等同於聲子的頻率(即光調變器的頻率)；當此兩道光重合時，會因為頻率差而產生第一階拍頻|f₁-f₂|。當此重合的光經過非線性吸收後，若是吸收了兩顆第一道光的光子，則總頻率偏移為2f₁；若是吸收了兩顆第二道光的光子，則總頻率偏移為2f₂。此兩種偏移的吸收會產生出第二階拍頻2*|f₁-f₂|。因此，一旦偵測到第二階以上的拍頻，即能斷定樣品具有非線性吸收或非線性飽和之現象。

當重合(collinear)入射光(λ_R=800 nm)經過的偏硼酸鋇晶體(BBO crystal)(λ_B=400 nm)以得到二次諧波產生(SHG)，或當光偵測器(Thorlabs DET200)具有雙光子吸收，如非線性產生二次階拍頻，並產生兩倍拍頻。

如圖6(A)-6(C)的光譜能量分佈圖所示，在本實例中，使用頻譜分析儀(Agilent E4402B)偵測該偵測器的射頻(Radio frequency)光譜(不具有電偏壓或放大作用)，該第一階拍頻在重複率波峰兩側產生一對頻帶(sidebands)，及第二階拍頻產生兩對頻帶；此外，在每個波峰間頻率分離實際上是相等於Ω(f₁,f₂,f_R)。如實驗結果的分佈圖來看，本發明利用耗損調變方法提供高純度的正弦曲線調製，其純度比可超過40dB。

另一方面，本實例量測低頻率頻譜，並且從頻譜分析儀發現拍頻，如紅光(圖七A)與藍光(圖七B)的結果。針對紅光，一倍拍頻波峰具有原始的拍頻，其源自於光偵測器的單光子吸收；然而，因為光偵測器亦會產生非線性吸收，能夠一次吸收兩個紅光光子，因此亦會出現第二拍頻，此事實確保光源的弦波純度極高，並不會產生高階諧波，其純度比可超過60dB。又，本實例使用BBO晶體產生藍光，並獲得第一階拍頻級第二階拍頻，其第二階拍頻源自於BBO晶體本身的非線性效應，故此結果符合理論推導。

本實例亦證實雙光子吸收產生之二次諧波信號強度和入射光強度的平方成正比。

實施例4：非線性光聲效應的染劑

本實例將具有雙光子螢光的螢光染劑(WKP-1)與碳粒子溶液(Wu-Zhu Calligraphy Paints)混合。由於較小的螢光染劑分子會附著在較大的碳粒子上，因此在本實例中，使該粒子則被當作一媒介物，用以將雙光子螢光轉換為雙光子光聲超音波(two-photon photoacoustic ultrasound)信號。當入射光(脈衝雷射光源)誘發螢光染劑的雙光子吸收(two-photo absorption)，而一部分入射光能量仍會產生出螢光。

圖8(A)顯示藉由混合碳粒子和螢光染劑以增強雙光子光聲訊號，當中的「˙」為螢光分子，當雷射光照射後，其能量轉換為雙光子螢光，「◎」為碳粒子，當雷射光照射後，其能量轉換為單光子吸收引發之聲子，而當雷射光照射結合螢光染劑與碳粒子的染劑，染劑分子吸收的能量轉換至碳粒子，並產生雙光子吸收光聲超音波(two-photon absorption acoustics ultrasonic)；圖8(B)顯示將雙光子螢光轉換為雙光子光聲超音波之能量帶示意圖。

實施例5：利用本造影系統(Loss modulation technique)進行掃描待測樣本之詳細流程

本實例使用1MHz倍頻頻率進行實測，1MHz落在20kHz至200MHz間的長超音波波長範圍，其可深層掃描，且使用的脈衝雷射光源必須具備頻率500kHz的波包波形(envelope)之高純度正弦弦波。

又如圖2所示，本實例以800 nm飛秒雷射(Ti-Sapphire Laser)為光源101。將兩個光調變器102分別在兩道光路上。當雷射光束通過第一分光鏡104分成兩束子光束後，兩道子光束會分別經過兩個光調變器102，兩道光的頻率均會被調變，但調變值略有差異(80.5 MHz以及81 MHz)。其中一道光路利用延遲平台(delay stage)1021作調整，使兩道光路的光程差完全相同。當這兩道子光束利用第二個分光鏡1041再次合併時，合併的光束會具備弦波振幅調變的特性(amplitude modulation)，且該弦波頻率即是這兩個光調變器頻率調變之差值(500 kHz)，接著透過顯微鏡物鏡103(Olympus SLMPlan 50X,15mm WD,0.45NA)匯聚此合併光束至待測樣本20上，透過該待測樣本上的特殊光聲染劑，其為混合螢光染劑與碳奈米粒子的顯影劑，有效率的激發出雙光子吸收所造成之聲學信號。其中該顯影劑會產生兩種吸收信號，一種為含單光子吸收，碳粒子一次吸收一個光子，並發出具有500kHz聲學訊號，其為線性吸收；另一種為雙光子吸收，螢光染劑分子一次吸收兩個光子，並發出具有500kHz及1MHz的聲學訊號，其為非線性吸收；透過信號與能量關係曲線的量測，證實在本實例中，所偵測的1MHz倍頻頻率確實來自於雙光子吸收。

接著，利用物鏡和超音波接收器在對側模式(Transmissive mode)的配置，透過浸泡式超音波探頭(Olympus V303)進行窄頻超音波偵測(倍頻信號為1 MHz，即500kHz的兩倍)。在超音波探頭後端接上低噪音放大器以避免來自電子儀器的非線性效應，最後在放大器後再接上鎖相放大器來針對倍頻信號(1 MHz)進行窄頻長積分時間偵測(以消除隨機噪音)。

實施例6：組織測試

本實例將樣本放置於一三維移動裝置1052，如馬達驅動的三維平移台上。待測樣本20是洋菜膠(2.5~4wt%)上製作圖案，並於空隙中加入具有光聲效應的顯影劑(螢光染劑與碳粒子的混合物)。由於洋菜膠的強散射可阻絕光線，故本實例使用物鏡和超音波接收器在對側模式(Transmissive mode)的擺置，但仍可防止光源照射於超音波探頭上。

本實例同時以實際生物組織作樣本測試，將葉片組織先以染劑處理，再將葉片組織埋入洋菜膠之間，其中，容器底層和葉片組織間填充1mm厚的洋菜膠，以模擬實際的組織散射。接著於組織上再鋪上10mm厚的洋菜膠，隔絕光源照射在超音波探頭上。

接著記錄每一點的倍頻信號積分強度，並掃描影像，而在葉片細胞的邊緣具有高對比度，如圖9(A)所示，這是由於葉片的細胞壁會吸收較多的染劑，因此具有較強的雙光子光聲信號。此外，亦可利用油脂包覆技術將染劑送進細胞內，故能對細胞胞器進行成像。最後，分析所獲得的影像，本發明之造影系統的穿透深度約可達到1毫米，空間解析度約為10微米等級。此外，本實例利用一般顯微鏡拍攝葉片組織(如圖9(B)所示)，並與本案的造影系統做比較。

本發明利用高重複率雷射達成有效的雙光子吸收(TPA)，其非線性吸收信號確實侷限於光束聚焦處，故可改善軸向(縱向)解析度與徑向(橫向)解析度至次微米程度。另一方面，本發明透過在頻域上進行超高純度的正弦調變(Loss-Modulation或Amplitude Modulation)，並利用頻域解析的方式，有效分離出雙光子非線性訊號，且其單光子比雙光子之訊號解析度可超過1000比1。最後，由於激發出的超音波頻率可落在20kHz~20MHz之間，故驗證最後的訊號可達成超音波穿透深度。亦即，解析度可達成光學解析度，且穿透可達超音波深度。

所有引證及參考文獻已全部併入本專利說明書中。在本發明中敘述的具體實施例是為了說明及描述本發明，並不代表這些具體實施例就已詳述或侷限本發明於一定的形式或內容。從上述教導中可做出許多可能的修改及變化。

選擇上述的事實與例子僅為了用於解釋本發明之原理及其實際用途，俾使熟悉本領域或專業之人士能夠運用或實施本發明，甚至於修改而適用於其他各種狀況。熟悉本領域或專業之人士亦可因而啟發出另外的應用，只要不悖離本發明之宗旨，均屬於本發明之內容。因此本發明的範圍係定義於申請專利範圍中，而非這些敘述及範例中。

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