TW201325635A - 用以製備微膠囊的組合物及以其所製得的藥物 - Google Patents

Abstract

本發明關於一種用以製備微膠囊的組合物及以其所製得的藥物。該組合物包含：具羧酸官能基的親水性聚合物；硬化劑；甲殼素；及多胺類化合物。以此組合物所製得之藥物具有優異的包埋率及快速的釋放率，因此該組合物特別適用使用於以口服給藥的藥物。

Description

用以製備微膠囊的組合物及以其所製得的藥物

本發明關於一種用於製備微膠囊的組合物，尤指一種適用於口服藥物之用於製備微膠囊的組合物。

經口服用為藥物最常見也最為使用者接受的給藥途徑，但此途徑將經過使用者的消化系統，因此這類藥物通常需要具備良好的包埋率，以保護其中的活性物質不被消化液所破壞。另一方面，在良好包埋率的要求之下，往往造成活性物質的釋放率不佳，而降低活性物質的效率。因此，如何在包埋率及釋放率之間取得平衡，成為領域中難以兼得而亟需克服的難題。

除了人體使用的藥物之外，同樣的問題也發生在水生生物的疫苗領域中。水產養殖業是台灣重要的產業，為了解決高密度養殖所導致的高傳染病風險，疫苗的使用能有效提升水產業者的獲利。一般水產疫苗可概略分為注射、浸泡及口服三種防疫方式。注射型疫苗不僅費時費工，同時也易造成魚蝦緊迫，並且不適用在魚苗的防疫上。浸泡型疫苗雖然使用上較為便利，但並非所有疫苗皆可採用，且其在大規模養殖中無法達到有效防疫。因此，口服型疫苗是水產養殖業最理想的防疫方式。

早期水產養殖業中所使用的微膠囊疫苗係由海藻酸鈉及氯化鈣所組成，其具有不錯的釋放率，但包埋率不佳，因此活性物質容易受到胃液的破壞。目前最常使用於食品或醫藥的微膠囊係由海藻酸鈉、氯化鈣及甲殼素所組成，藉由添加甲殼素來提升疫苗的包埋率，以保護活性物質免於胃液的破壞。然而，由於水產養殖生物通常具有較短的腸道，因此這類疫苗雖然有優異的包埋率，卻犧牲了釋放率，使得活性物質無法在相對而言較短的腸道中釋放完全，而降低活性物質的效果。

綜上所述，目前使用於水產養殖業的疫苗同樣面臨如何在包埋率及釋放率之間取得平衡的難題，並不理想。

爰是，本發明之一目的為提供一種用於製備微膠囊的組合物，其所製得的微膠囊具有優異的包埋率及快速的釋放率。

本發明之又一目的為提供一種藥物，其使用前述組合物所製得之微膠囊來包覆活性物質，因此可避免活性物質遭受消化液(胃液)的破壞，並能使活性物質快速地釋放。

為達上目的，本發明提供一種用於製備微膠囊的組合物，其包含：20~50 wt%的具羧酸官能基的親水性聚合物；30~50 wt%的硬化劑；0.5~5 wt%的甲殼素；及1~20 wt%的多胺類化合物。

本發明提供再提供一種藥物，其包含一活性物質，該活性物質係包覆於前述組合物所製得之微膠囊內。

較佳地，前述多胺類化合物的分子量為100~2000 g/mol。

較佳地，前述多胺類化合物包含四乙基五胺(tetraethylene pentamine)、精胺(spermine)、三乙基四胺(triethylene tetramine)、亞精胺(spermidine)、二乙基三胺(triethylene tetramine)、戊烯二胺(pentylene diamine)、丁烯二胺(butylene diamine)、丙烯二胺(propylene diamine)、乙烯二胺(ethylene diamine)、聚乙烯亞胺(Polyethyleneimine PEI)或其組合。

較佳地，前述具羧酸官能基的親水性聚合物為海藻酸鈉、明膠、海藻萃取物或其組合。

較佳地，前述硬化劑係指氯化鈣、碳酸鈣、氯化鈉、醋酸鈣、葡萄糖鈣、硫酸鈣、檸檬酸鈣、氫氧化鈉或其組合。

較佳地，前述藥物的包埋率為85~100%。

較佳地，前述藥物的前述活性物質於鹼性環境中4小時的釋放率為70~100%。

較佳地，前述藥物進一步包含一佐劑。

較佳地，前述微膠囊的平均粒徑為10~1000μm，更佳20~250μm。

較佳地，前述藥物為口服疫苗。

較佳地，前述口服疫苗可以為第一代疫苗、第二代疫苗或第三代疫苗。

較佳地，前述口服疫苗中的前述活性物質為減毒病原體、不活化病原體、死亡病原體、病原體之表面抗原、重組蛋白、免疫球蛋白、抗原決定基或其組合。

綜上所述，有鑑於習用藥物難以兼顧包埋率及釋放率的缺點，本發明之組合物所製得之微膠囊同時具有優異的包埋率和快速的釋放率，因此使用該微膠囊的藥物不僅可避免胃液破壞其活性物質，更可使活性物質於適當環境下快速地釋出，特別適用於消化道較短的水產生物。

本發明關於一種用於製備微膠囊的組合物，該組合物可與活性物質混合後製成微膠囊形式的藥物。本發明之用於製備微膠囊的組合物提供藥物優異的包埋率和快速的釋放率，可保護活性物質免於消化液的破壞，並可使活性物質於適當環境下快速釋放。因此，本發明之藥物特別適合口服給藥方式，也特別適合供消化道較短的水產生物來使用。

本發明所稱「藥物」泛指使用本發明之組合物所製得之微膠囊來包覆活性物質的產品，其中並可以包含前述活性物質與前述微膠囊以外的添加劑。

前述藥物可為，但不限於：藥品、保健食品、疫苗或其組合，而前述活性物質即為前述藥品、前述保健食品、或前述疫苗中的有效成分。該活性物質包含具有預防疾病、治療疾病、增進健康的微生物、蛋白質或他種物質。

本發明之藥物的一個具體的例子為疫苗，其活性物質包含減毒病原體、不活化病原體、死亡病原體、病原體之表面抗原、重組蛋白、免疫球蛋白、抗原決定基或其組合。

本發明之微膠囊的平均粒徑較佳為10~1000μm，更佳20~250μm。若未特別提及，計算平均粒徑時的微膠囊可處於包埋有前述活性物質的狀態，也可處於未包埋有前述活性物質的狀態。

本發明之用於製備微膠囊的組合物至少包含以下成分：海藻酸鈉、氯化鈣、甲殼素及多胺類化合物；更明確地，包含20~50 wt%的具羧酸官能基的親水性聚合物；30~50 wt%的硬化劑；0.5~5 wt%的甲殼素；及1~20 wt%的多胺類化合物。

本發明之「具羧酸官能基的親水性聚合物」係用於與前述活性物質混合，並藉著其所具有之前述羧酸官能基與前述甲殼素形成交聯反應。較佳地，前述具羧酸官能基的親水性聚合物係具有高生物相容性者，包括，但不限於海藻酸鈉、明膠、海藻萃取物或其組合。

本發明之「硬化劑」係用於提供本發明之藥物的結構穩定性。原則上可採用解離後會產生正電荷陽離子的離子性化合物，包括，但不限於氯化鈣、碳酸鈣、氯化鈉、醋酸鈣、葡萄糖鈣、硫酸鈣、檸檬酸鈣、氫氧化鈉或其組合。

在本發明的較佳實施態樣中，前述具羧酸官能基的親水性聚合物為海藻酸鈉，而前述硬化劑為氯化鈣。海藻酸鈉和氯化鈣是習用於製備微膠囊的主要成分，然而以這兩種成分所製得的微膠囊因具有多孔性而包埋率不佳，使得活性物質容易被胃液所破壞。甲殼素，又稱幾丁胺醣，是一種天然的聚合物，其具有高度的生物相容性，因此逐漸被廣泛運用於生醫材料。本發明添加甲殼素與具有羧酸官能基的海藻酸鈉形成交聯反應，因此提升微膠囊的包埋率。

本發明所謂「包埋率」係採用領域中所習知的解釋；簡單地說，係指該活性物質被該藥物中其他成分包覆而不與外界環境接觸的程度。進一步地，本發明所稱藥物「包埋率」係指，在本發明的藥物中，活性物質被本發明之微膠囊所包覆的程度。本發明之藥物中活性物質的包埋率為85~100%；其中主要提供良好包埋效果的成分為海藻酸鈉、氯化鈣及甲殼素。

本發明所謂「釋放率」係採用領域中所習知的解釋；簡單地說，係指藥物中活性物質自藥物結構中釋出至環境中的速度。在提升包埋率的同時，可能顯著地影響藥物中活性物質的釋放率。為了使本發明的藥物具有快速的釋放率，本發明添加多胺類化合物，使得本發明之藥物在腸道中4個小時的釋放率達到70~100%。更明確地說，前述多胺類化合物具有在鹼性環境下快速溶解的特性，因此，相較於甲殼素、海藻酸鈉及氯化鈣主要負責保護活性物質免於胃液的破壞，多胺類化合物則會溶解在腸道的鹼性環境中，進而使活性物質快速地釋出。

前述多胺類化合物係分子量為100~2000 g/mol的多胺類化合物，其包括：四乙基五胺(tetraethylene pentamine)、精胺(spermine)、三乙基四胺(triethylene tetramine)、亞精胺(spermidine)、二乙基三胺(triethylene tetramine)、戊烯二胺(pentylene diamine)、丁烯二胺(butylene diamine)、丙烯二胺(propylene diamine)、乙烯二胺(ethylene diamine)、聚乙烯亞胺(Polyethyleneimine PEI)或其組合，但多胺類化合物的選擇並不限於上述種類。

本發明之用於製備微膠囊的組合物更可進一步包含0.5~5 wt%的乳化劑、及/或40~60 wt%的油相物質。前述乳化劑及前述油相物質在本發明之組合物製成微膠囊過程中提供界面活性劑的功能。前述乳化劑及前述油相物質的選擇不須限制，可依據所欲製備之藥物的粒徑大小來做出選擇，以達到所需的HLB值(Hydrophile-Lipophile Balance Number)。前述乳化劑包括：span20、span40、span60、span65、span80、span85、tween20、tween21、tween40、tween60、tween61、tween65、tween80、tween81、tween85或其組合，但不限於上述種類。前述油相物質包括：大豆沙拉油、紅花仔油、葵花油、玉米油、橄欖油、蓬萊米油、花生油等植物性油，烤酥油、清香油、精製豬油等動物性油或其組合，但不限於上述種類。

在本發明的一個實施態樣中，前述藥物係為疫苗。前述疫苗包含第一代疫苗、第二代疫苗或第三代疫苗；而前述活性物質包括：減毒病原體、死亡病原體、病原體之表面抗原、免疫球蛋白、抗原決定基或其組合，但不限於上述種類。前述疫苗可進一步包含一佐劑。前述佐劑可如同前述活性物質一般包埋於前述組合物所製得之微膠囊內，或獨立於前述微膠囊之外，而與含前述活性物質的前述微膠囊一起組成一疫苗套組。所謂佐劑係指用於增強免疫反應的誘發物質，其不僅可以提升疫苗的效率，更可減少活性物質的使用量，在成本和安全考量上都有極大的價值。本發明所稱疫苗佐劑包括：化學功能性佐劑和物理功能性佐劑，舉例來說，包括鋁鹽、乙醯化酪胺酸、乙醯化醣類、陰離子衍生化多醣體、或陽離子衍生化多醣體，但不限於上述種類。所屬領域具有通常知識者可依其需要，選擇的佐劑種類及含量。

以下內容將搭配圖式說明本發明之細節，須注意的是，以下實施例僅用於示例式地說明本發明之特色及優點，而不用於限制本發明之申請專利範圍。

實施例一：本發明之微膠囊形式的藥物(疫苗)的成囊性、包埋率及釋放率

於本實施例中觀察依據本發明之精神所製得之藥物的成囊性和包埋率。本實施例所製藥物為供水產生物使用的疫苗，其活性物質為經不活化處理得鮫弧菌(EMI；Vibrio carchariae)。

[製備]

首先，將活性物質和海藻酸鈉水溶液混合均勻，然後加入已和乳化劑(Span80)混合均勻的油相物質(大豆沙拉油)中，並以轉速900 rpm快速使所有成分混合均勻為第一混合物。接著，將甲殼素、多胺類化合物(DETA或PEI)和氯化鈣混合均勻為第二混合物。將前述第二混合物滴入前述第一混合物中，並持續攪拌10分鐘，即得到本實施例之藥物(疫苗微膠囊)。

本實施例之各樣本(包括依據本發明之精神所作之藥物，及比較樣本)的成分及濃度係列於下表一；其中所標示的濃度為扣除活性物質之重量後，各成分所佔的重量百分濃度。

[成囊性及包埋率]

將所製得的藥物放置於秤量紙，以肉眼觀察成囊性，其結果如第一圖所示；其中第一圖所標編號係對應表一中所列英文編號。此外，並以OD540測量各樣本及比較樣本的吸收值並換算成該藥物的包埋率。

比較樣本1E(第一圖C)的成囊性不佳，約有五成比例的藥物係片狀之不成形副產物。比較樣本1E的包埋率也僅有64%，推測係因為鈣離子(氯化鈣)與海藻酸鈉的交聯速度太快，導致活性物質在藥物成形的過程中被擠出微膠囊結構之外。

比較樣本2E(第一圖D)和比較樣本3E(第一圖E)皆無法形成為微膠囊型態的產物，更遑論其包埋率。比較樣本4E(第一圖F)所形成的成囊性極佳，其形態呈現細緻且一致的粉末狀。比較樣本4E的包埋率高達100%，並且，每克藥物中的載藥量可達307毫克。

樣本1E(第一圖A)和樣本2E(第一圖B)的成囊性極佳，其成品的型態均勻且一致。樣本1E和樣本2E的包埋率高達100%，並且，每克藥物中的載藥量可分別達到299毫克及287毫克。

除了上述樣本和比較樣本，本實施例再以同樣方式依據比較樣本1E、4E和樣本1E的配比，改以溶藻弧菌(S4Y；Vibrio alginolyticus)作為活性物質，製得比較樣本1S、4S和樣本1S以進行後續試驗。此外，經量測，樣本1E、2E和1S的平均粒徑皆為70 μm。

實施例二：實施例一所製得之疫苗的活性測試

口服式疫苗估計將於魚體的胃部停留約2個小時，因此該疫苗對於胃酸的耐受度必須達2個小時以上。於本實施例中，將實施例一所製得之藥物置於胃酸中1~3個小時，並測量活性物質的活性剩餘百分比。

依據美國藥典設計此活性測試。簡單地說，取得150 mg的前述樣本或比較樣本，將其放置在線籃中，然後在線籃及旋轉軸的外側包覆250 mesh的濾網，以避免樣本滲出干擾偵測細菌的菌落量。

接著，將此裝置分別放在50 ml的胃酸中1、2或3個小時後，移入去離子水中清洗並凍乾。然後將乾燥的藥物置於破囊液中，以震盪的方式處理2個小時，以將藥物其中的活性物質釋出。接著，以coating buffer將含有活性物質的破囊液調配為懸浮液(菌濃度10⁸cfu/ml)，並分別置於96孔盤中(100 μl/per well)。然後將96孔盤置於4℃。

隔夜後，於每一個well中加入100 μl的1%BSA(或是5%的脫脂奶粉)，並使其於37℃下反應1個小時。接著，於每一個well中加入100 μl的兔抗菌血清，並於37℃下反應2個小時。然後，於每一個well中加入100 μl的羊抗兔血清，並於37℃下反應2個小時。接下來，於每一個well中加入100 μl的呈色劑，並使其反應30分鐘後，以光譜分析儀判讀OD 405 nm的吸光值。最後，將所得數據內插至檢量線中以計算出活性剩餘百分比，即代表各樣本之藥物保護活性物質的能力。

[實驗一]

將純活性物質(不活化之鮫弧菌)滴入胃酸中反應1小時，僅剩下1%的活性。比較樣本1E在與胃酸反應3小時後，則僅剩下3%的活性(圖未示)。

此外，此實驗除了以比較樣本1E和4E進行試驗外，另外以比較樣本4E的配比(含0.3wt%的甲殼素，不含多胺類化合物)為基礎，分別添加1wt%或3wt%的DETA取代其中一半的甲殼素，製得樣本1E-1%及樣本1E-3%來進行試驗。

請參第二圖，比較樣本4E與胃酸反應2小時後僅剩下18%的活性。反觀樣本1E-1%及樣本1E-3%與胃酸反應2小時後，則分別保有45%及38%的活性。

[實驗二]

如同實驗一，將純活性物質(不活化之溶藻弧菌)滴入胃酸中反應1小時，即只剩下1%的活性。比較樣本1S在與胃酸反應3小時後，則僅剩下3%的活性(圖未示)。

另外，以比較樣本4S的配比(含0.3wt%的甲殼素，不含多胺類化合物)為基礎，分別添加1wt%或3wt%的DETA取代其中一半的甲殼素，製得樣本1S-1%及樣本1S-3%來進行試驗。

請參第三圖，比較樣本4S與胃酸反應2小時後僅剩下16%的活性。反觀樣本1S-1%及樣本1S-3%與胃酸反應2小時後，則分別保有22%及64%的活性。

[結論]

雖然主要負責包覆活性物質使其免於胃酸破壞的成分是海藻酸鈉、甲殼素和氯化鈣所形成的聚電解質膜和交聯結構，或稱蛋格結構(egg-box structure)。然而，根據以上兩個實驗結果，本發明意外地發現添加多胺類化合物不僅提升釋放率，更超出預期地不會使本發明之藥物被胃酸破壞的程度增加。

實施例三：實施例一所製得之疫苗的釋放率

本實施例以實施例一之比較樣本1E、1S、4E、4S及樣本1E、1S、2E進行模擬腸胃道的釋放率測試。

依據美國藥典設計此腸胃道釋放測試。簡單地說，取得150 mg的前述樣本或比較樣本，將其放置在線籃中，然後在線籃及旋轉軸的外側包覆250 mesh的濾網，以避免樣本滲出干擾偵測細菌的菌落量。

接著，將此裝置放在50 ml的胃酸中2.5個小時後，移入去離子水中清洗10分鐘。將水分吸乾之後，再移入50 ml的腸液中4個小時。於此同時，每1個小時即採集500 μl的腸液，並以OD540偵測。將所得數據換算至檢量線以求得其在腸胃道的釋放率。因樣本和比較樣本在胃酸中皆無釋放，所以僅將其在腸道中的釋放率實驗結果整理如下表二中所列。

由上述實驗結果可知，樣本1E、1S、2E及比較樣本1E、1S，但在腸液中皆具有優異的釋放率。但如果綜合考量成囊性和包埋率，僅有本發明之藥物同時具有優異的成囊性、包埋率和腸道釋放率。

實施例四：實施例一之疫苗之效力的活體試驗

本實施例採用點帶石斑魚苗(購自國立台灣海洋大學水生動物實驗中心，體長為3±2 cm)。魚隻購回前已馴餌成功，可直接以投餵人工飼料的方式飼養。魚隻購回後經1週適應環境後開始進行試驗。將石斑魚分為三個組別：控制組、實驗組一及實驗組二，每一個組別含有30隻石斑魚。

[樣本1E]

每天分別餵食每尾實驗組一及實驗組二之石斑魚相當於含有1.4×10⁸ CFU或2.8×10⁷ CFU菌量的不活化細菌性疫苗1E(即，樣本1E)，持續七天以建立其免疫能力。接著，分別於第八天(第一週)及第十五天(第二週)以腹腔注射的方式，注射每一實驗石斑魚5×10⁷ CFU/ml之具致病活性的鮫弧菌，以進行攻毒試驗。紀錄兩周內魚隻存活率如下表三所列。

由表三所列結果可知，樣本1E於第一週便顯著地使實驗組的石斑魚建立了對鮫弧菌的免疫能力，若延長至第4周才進行攻毒試驗，更能達到使所有石斑魚存活的程度(數據未示)。

[樣本1S]

每天分別餵食每尾實驗組一及實驗組二之石斑魚相當於含有1.4×10⁸ CFU或2.8×10⁷ CFU菌量的不活化細菌性疫苗1S(即，樣本1S)，持續七天以建立其免疫能力。接著，分別於第八天(第一週)、第十五天(第二週)、第二十九天(第四週)、第五十七天(第八週)和第八十五天(第十二週)以腹腔注射的方式，注射每一實驗石斑魚5×10⁷ CFU/ml之具致病活性的溶藻弧菌，以進行攻毒試驗。紀錄存活率如下表四所列。

由表四所列結果可知，相較於以鮫弧菌進行的試驗，以溶藻弧菌進行的攻毒試驗在第一週和第二週時，攻毒劑量未能引發實際感染，控制組的魚隻也未有明顯的死亡狀況發生，判斷這是溶藻弧菌本身之特性所產生的差異，溶藻弧菌之攻毒試驗因攻毒劑量未達致病劑量，結果在第一週和第二週的控制組未有明顯之死亡情況。然而，於第四週時則明確地顯示出實驗組的魚隻已藉由樣本1S建立了免疫能力，而分別具有100%及80%的存活率。進一步延長試驗時間到第八週和第十二週的結果，則更明確顯示出實驗組一和實驗組二與控制組的差異。

第一圖顯示本發明實施例一各樣本的成囊性；(A)樣本1E；(B)樣本2E；(C)比較樣本1E；(D)比較樣本2E；(E)比較樣本3E；(F)比較樣本4E；

第二圖顯示本發明樣本1E-1%、樣本1E-3%及比較樣本4E經胃酸處理過後的活性測試。

第三圖顯示本發明樣本1S-1%、樣本1S-3%及比較樣本4S經胃酸處理過後的活性測試。

Claims (15)

1. 一種用以製備微膠囊的組合物，其包含：20~50 wt%的具羧酸官能基的親水性聚合物；30~50 wt%的硬化劑；0.5~5 wt%的甲殼素；及1~20 wt%的多胺類化合物。
2. 如申請專利範圍第1項所述之組合物，其中前述多胺類化合物的分子量為100~2000 g/mol。
3. 如申請專利範圍第1項所述之組合物，其中前述多胺類化合物包含四乙基五胺、精胺、三乙基四胺、亞精胺、二乙基三胺、戊烯二胺、丁烯二胺、丙烯二胺、乙烯二胺、聚乙烯亞胺或其組合。
4. 如申請專利範圍第1項所述之組合物，其中前述具羧酸官能基的親水性聚合物為海藻酸鈉、明膠、海藻萃取物或其組合。
5. 如申請專利範圍第1項所述之組合物，其中前述硬化劑係指氯化鈣、碳酸鈣、氯化鈉、醋酸鈣、葡萄糖鈣、硫酸鈣、檸檬酸鈣、醋酸鈣、葡萄糖鈣、硫酸鈣、檸檬酸鈣、氫氧化鈉或其組合。
6. 一種藥物，其包含一活性物質，該活性物質係包覆於如申請專利範圍第1項所述之組合物所製得之微膠囊內。
7. 如申請專利範圍第6項所述之藥物，其包埋率為85~100%。
8. 如申請專利範圍第6或7項所述之藥物，其於鹼性環境中4小時的釋放率為70~100%。
9. 如申請專利範圍第6項所述之藥物，其中前述多胺類化合物的分子量為100~2000 g/mol。
10. 如申請專利範圍第6項所述之藥物，其中前述多胺類化合物包含四乙基五胺、精胺、三乙基四胺、亞精胺、二乙基三胺、戊烯二胺、丁烯二胺、丙烯二胺、乙烯二胺、聚乙烯亞胺或其組合。
11. 如申請專利範圍第6項所述之藥物，其進一步包含一佐劑。
12. 如申請專利範圍第6項所述之藥物，其中前述微膠囊的平均粒徑為10~1000 μm。
13. 如申請專利範圍第6項所述之藥物，其中前述微膠囊的平均粒徑為20~250 μm。
14. 如申請專利範圍第6項所述之藥物，其係為口服疫苗
15. 如申請專利範圍第6項所述之藥物，其係為第一代疫苗、第二代疫苗或第三代疫苗。