TW201321504A - 產生香料化合物之酵母菌株 - Google Patents

Abstract

本發明描述一種用於香料化合物生產之酵母菌株及其相關微生物高溫培養以提升芳香族醇類與酯類香料化合物的產量。

Description

產生香料化合物之酵母菌株

本發明係揭露一種用於香料化合物生產的新穎酵母菌株及其應用，其應用包括生產香料化合物。

香料在全球食物添加物市場佔超過四分之一。大多數的香料化合物係經由化學合成或係自天然材料萃取得來。然而，由於種種原因，這些方法效率不佳或是不環保。另一種生產香料化合物的方法是利用微生物的合成或轉化。微生物生產的香料化合物在市場上可視為「天然」的香料，可以謀求更好的價格。

本發明至少在一部分上是基於一種新分離出的酵母菌株，命名為馬克斯克魯維酵母菌KY3(Kluyveromyces marxianus KY3)，該菌株已寄存於台灣食品工業發展研究所菌種寄存中心，寄存編號BCRC 920076。

本發明發現這種新穎的酵母菌株是一種耐熱的酵母菌株，可以用於自廉價又富含胺基酸及脂肪酸前驅物的基質，例如生乳，來進行芳香高級醇類及酯類香料化合物的生產。具體而言，該菌株具有以下的特徵：可以生長在25℃-45℃的環境下；其18S rRNA部分序列如SEQ ID NO: 3所示之序列；具有可以將生乳發酵的能力；具有蛋白酶的活性；具有吸收一個或多個葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、棉子糖、甘油、纖維雙糖、乳糖與蔗糖的能力；及具有將基質如苯丙氨酸(phenylalanine)、辛酸(octanic acid)或癸酸(decanoic acid)轉化成香料化合物的能力。香料化合物的例子包括但不限於辛酸乙酯(ethyl octanoate)化合物，癸酸乙酯(ethyl decanoate)化合物，乙酸苯乙醇(2-phenylethylalcohol)化合物及乙酸苯乙酯(2-phenylethylacetate)化合物。在一實例中，於25℃或以上的培養條件下，該菌株具有將生乳轉化成一香料化合物的能力。在另一實例中，於30℃或以上的培養條件下，該菌株具有將生乳轉化成一香料化合物的能力。在較高溫度的培養條件下，該菌株生產香料化合物的生產能力也較佳。在一具體實施例中，於37℃-40℃的培養條件下，該菌株具有將生乳轉化成香料化合物的能力。

因此，在一方面，本發明的特點為一種經分離出的酵母菌株，其與台灣食品工業發展研究所菌種寄存中心寄存編號BCRC 920076之馬克斯克魯維酵母菌株KY3具有相同之特徵。一實例之酵母菌株為馬克斯克魯維酵母菌株KY3(BCRC 920076)。

在另一方面，本發明的特徵為一種生產香料化合物的方法。該方法包含在適合合成香料化合物的培養條件下培養上述之酵母菌株細胞於一培養基；及從該培養細胞或該培養基純化該香料化合物。其中該培養基可含有生乳或其他相似材料。較佳地是培養該菌株於25℃或以上，例如30-40℃或37-40℃之培養條件以達到較佳的生產量。以上描述之酵母菌株還可用作其他用途，包括基因工程、生產各種代謝產物(如乙醇、1-丁醇、異丁醇、高級醇、酯類和香料化合物)、酵素、發酵食物、食物添加物、酒精性飲品(包括啤酒、烈酒、甜酒和葡萄酒)及與其他生物體共同培養。在一實例中，上述菌株之突變株係所屬技藝中通常技術者利用基因工程學和基因重組技術所產生。該突變菌株可具有一個或多個上述KY3菌株的特性，例如具有將苯丙氨酸(phenylalanine)、辛酸(octanic acid)或癸酸(decanoic acid)轉化成香料化合物的能力。

本發明之一或多個具體實施例之細節描述於其下的圖式及說明中。本發明之其他特徵、目的及優點將由本文的說明、圖式及申請專利範圍而清楚呈現。

除非另有指明，所有在此處使用的技術性和科學性術語具有如同本發明所屬技藝中之通常技術者一般所瞭解的意義。此處提及之所有刊物均被納入本文之參考文獻中以揭露及描述與所引用刊物相關之方法和/或材料。

此處所使用的「一」和「該」乙詞，包含複數的用法，除非上下文另有特殊說明。因此，例如，「一樣品」乙詞是指一個或多個此類樣品及所屬技藝中之通常技術者一般所瞭解的等值樣品。

本發明至少在一部分上是基於意外地發現了一株新穎的耐熱型馬克斯克魯維酵母菌株KY3。該菌株可以用於自廉價又富含胺基酸及脂肪酸前驅物的基質，例如生乳，來進行芳香高級醇類及酯類香料化合物的生產。

本文揭露之耐熱型馬克斯克魯維酵母菌株KY3係分離自一用於純培養之特殊的香料克菲爾(kefir)系統。該微生物有幾項優點，包括培養溫度的廣效性(25～45℃)、碳源利用的廣效性(葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、棉子糖、甘油，纖維雙糖、乳糖與蔗糖)、可在高溫進行酒精發酵(最佳態為43℃)和能生成如乙酸苯乙醇(2-phenylethylalcohol)和乙酸苯乙酯(2-phenylethylacetate)等香料化合物。KY3菌株比文獻中其他菌株有較佳的乙酸苯乙醇(2-phenylethylalcohol)生產能力(468 μg/ml)。因為馬克斯克魯維酵母菌株KY3可以利用乳糖及生乳，這些是廉價又富含胺基酸及脂肪酸的基質，且這些基質可被用作前驅物或碳源來進行香料化合物的生產，進而降低香料生產成本。本發明發現當利用生乳發酵的溫度自25℃提高達至30℃及37℃時，乙酸苯乙酯(2-phenylethylacetate)的產量可以明顯提升2.5倍和4倍。再者，馬克斯克魯維酵母菌株KY3在25℃條件下能自發性地利用生乳進行發酵，並產生辛酸-乙酯(octanoic acid-ethyl ester)與癸酸-乙酯(decanoic acid-ethyl ester)等其他酵母菌株無法利用生乳生產的香料成份。

在食品和飲品行業中，利用生物生成芳香族化合物為生產天然香料的重要工具之一。具有玫瑰香味及蜂蜜香味的芳香族化學化合物2-苯乙醇(2-phenylethanol)和乙酸苯乙酯(2-phenylethylacetate)是香水及化妝品最常用的成份。化合物辛酸乙酯(octanoic acid-ethyl ester)與癸酸乙酯(decanoic acid-ethyl ester)分別具有白蘭地香味與椰子香味且經常用於食品中。這些香料化合物大多用於全球市場且目前主要以化學合成生產。隨著消費者講求天然食品添加物的觀念越來越強，以2-苯乙醇(2-phenylethanol)為例，「天然」香料價格已超過其化學合成的～250倍。我們發現如以馬克斯克魯維酵母菌株KY3作為生產生質燃料之宿主，於生產生質酒精的過程中會產生具高經濟價值的香料化合物作為副產品。

由於克勒勃屈利(Crabtree)效應，馬克斯克魯維酵母菌即使在有氧的條件下亦可於高葡萄糖濃度下生成乙醇(Berry DR,Brown C(1987) Physiology of yeast growth. In: Berry DR,Russel I,Steward GG(eds) Yeast biotechnology. Allen and Uwin,London,pp 159-199)。該酵母菌是對於經由Ehrlich路徑(Etschmann et al. 2002 Appl Microbiol Biotechnol 59:1-8)將L-苯丙氨酸(L-phenylalanine)轉化成2-苯乙醇(2-phenylethanol)效率最高的。馬克斯克魯維酵母菌CBS600(Etschmann et al.,2004 Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 29 :187-193)與馬克斯克魯維酵母菌CBS6432(Fabre et al.,1997 Biotechnology Techniques,11(7): 523-525)兩株菌被證實為2-苯乙醇(2-phenylethanol)的最佳生產菌株且在液態發酵過程可生產芳香族化合物如單萜烯醇(monoterpene alcohols)和乙酸異戊酯(isoamyl acetate)(賦予其水果香味)(Fabre et al.,1997 supra;Etschmann et al.,2004 supra)。芳香族化學物質2-苯乙醇(2-phenylethanol)和乙酸苯乙酯(2-phenylethylacetate)，係化妝品和香水類製品最常用之酒精，其生產方法大部分是利用化學合成。利用微生物生產的2-苯乙醇(2-phenylethanol)，可被市場視為一種「天然」的香料，在製程上極具有經濟吸引力(Longo and Sanromn,2006 Food Technol. Biotechnol. 44(3) 335-353)。

許多技術，例如原位產物移除(ISPR)、吸附、超臨界二氧化碳萃取技術、液-液萃取法及膜過程法，皆被用於研究增加K. marxianus生產香料化合物的產量(Etschmann et al.,2005 Biotechnol Bioeng. 92(5):624-34;Etschmann and Schrader,2006 Appl Microbiol Biotechnol. 71(4):440-3;Medeiros et al.,2001 World J. Microbiol. Biotechnol. 17:767-771)。

雖然細胞內前驅物的濃度是乙基酯類合成的反應速率決定步驟，但在啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)中發現提高發酵溫度(16~25℃)會增加某些乙基酯類的產量(Saerens et al.,2008 Appl Environ Microbiol. 74(2):454-61)。已有文獻揭露藉由在厭氧環境下將所得發酵液加熱至70℃到99℃，加熱時間為2至20分鐘，可改善產朊假絲酵母菌(Candida utilis)或是其他酵母菌香料蛋白質的產量(Lucas et al.,1991 US Patent No. 5,071,762;Lucas et al.,1993 US Patent No. 5,177,003)。從這個角度看來，耐熱型的馬克斯克魯維酵母菌KY3是一株用於乙基酯類合成的好的候選者。如本文所述，我們研究高溫對於自克菲爾(kefir)菌元分離出的馬克斯克魯維酵母菌KY3在天然前驅物「生乳」中合成高級醇芳香族和酯類化合物的影響。此種產生高經濟價值之副產品的潛力可能會開啟一個以酵母菌生產生物燃料的新方法。

「三叉神經」，分佈在口腔和咽喉偵測化學物質的刺激，該神經有時也決定味道。三個化學感官中，氣味是決定食物味道的主要因素。氣味香料或香料都是以類似於生產工業香料和精緻香水的方式產生。為了生產天然香料，首先必須藉由溶劑萃取、或蒸餾或使用機械力擠壓將香料從源頭物質中萃取出來。粗萃取物通常還需要經過進一步純化，隨後才能添加在食物中以產生味道。人造香料的生產，製造商必須混合適當的芳香族化學化合物以產生一個所需的味道或創造一個新穎、無毒且具特殊風味的人工化合物。

如今，食品和飲品公司都可能需要香料來進行新產品的開發、產品線的擴展(例如，現有產品的低脂產品)或替換目前產品的現有配方。食品的味道可以很輕易地藉由改變它的氣味同時又保有其原有的口感來改變，且商業上生產之食品一般係藉由添加香料而創造。例如，香料的使用重點在於改變或增添天然食物如肉類或蔬菜產品的風味，或創造該食物原先沒有味道。此種最佳的例子在於以具有類似口感之成份組成的人工調味的果凍、軟性飲料和糖果，其因不同氣味或香料的使用而產生顯著不同的味道。雖然工業化香料在食品與香水市場具有很高的商業價值，但大部分的食品和飲品公司並不會自己製造所需的香料，而是聘僱香料公司為他們效力。

眾多化合物係與食品風味的產生息息相關，例如醇、醛、酯、二羰基、短至中鏈的脂肪酸、甲基酮、內酯、酚類化合物和硫化合物。範圍從單一至複合物質的香料化合物係自天然材料中萃取或經由化學合成產生。香料有三種主要類型：(1)天然香料物質：該香料物質係取自植物或動物原料，經由物理、微生物或酵素之過程產生。它們可以其天然狀態或加工狀態為人類所使用，但不能包含任何天然確認之人工香料；(2)天然確認香料物質：該香料物質係藉由合成或經化學製程分離出的物質，在化學上與為人類所使用之天然存在的香料性質相同。它們不能包含任何人工香料物質；(3)人工香料物質：香料物質與為人類所使用之天然存在的香料不同，無論該產物是否被進一步處理。人工香料通常是藉由分餾或從天然化學物質、原油或是煤焦油經額外的化學處理而產生的。由於天然香料萃取成本較高或取得不易，因此大多數的商業化香料係屬於天然確認香料，這意味著它們是天然香料的化學同等物但為化學合成之物質。

在發酵飲品中，即使是很小的次級代謝物濃度的改變，也可能嚴重的影響最後的感官品質。酯類合成於酵母細胞內，並且依據他們鏈長的不同可擴散於其周圍的培養基內(Hilary,1990 J. Inst. Brew. 96:327-331)。然而，酯類有許多種，大致上可分為兩大類。第一大類包含醋酸酯類(acetate esters)(其中酸基來自醋酸鹽以及醇基來自於乙醇或複合醇衍生自胺基酸代謝作用)，例如乙酸乙酯(ethyl acetate)(溶劑般香味)和乙酸苯乙酯(phenyl ethyl acetate)(玫瑰及蜂蜜般香味)。第二大類為乙基酯類(ethyl esters)(其中醇基來自乙醇以及酸基來自中長鏈的脂肪酸)並包括己酸乙酯(ethyl hexanoate)(茴香種子和蘋果般的香味)、辛酸乙酯(ethyl octanoate)(白蘭地味或酸味蘋果香味)與癸酸乙酯(ethyl decanoate)(椰子香味或花香氣味)。這兩大類之中，醋酸酯類(acetate esters)最受關注，因為他們的生產量較高所以很容易被量測。此外，與醋酸酯類合成相關的基因已被確認及分離，例如：醇類乙醯基轉移酶(alcohol acetyl transferase)(AAT)。相反地，儘管乙基酯類具有蘋果般的理想香氣，但其相關知識還未被清楚了解(Saerens et al.,2008 supra)。

如上所述，香料在全球食物添加劑市場佔超過四分之一的份額，且大部分的香料化合物是經由化學合成或萃取自天然的材料。通常原料只含有低濃度的所需化合物，這使得萃取過程變得昂貴。此外，天然材料的使用有其難以控制的因素如氣候條件和植物疾病。最後，在瞭解天然香料的結構組成後，化學合成通常被使用來製造該香料。然而，化學合成的生產過程往往污染環境且缺乏基質選擇性，這可能會導致形成含有對掌性異構物的不可取混合物，進而降低製程效率並增加下游成本(LONGO and SANROMN,2006 supra)。雖然香料物質可藉由天然物質的化學轉換而生成，但其產生的產品不能合法標示為「天然」香料。最近市場調查顯示消費者喜歡可被標示為「天然」的食物，但事實上，一個天然存在的化合物並不一定意味其能安全地被食用(Smitha et al.,2005 Food and Chemical Toxicology 43(3) pages 345-363)。傳統方法的缺點以及大家對天然產品的喜愛已促使許多研究者努力尋找新的方法來生產天然香料。香料合成的替代方法係基於微生物的生物合成或生物轉化。微生物可藉由在營養物如醣和胺基酸的發酵過程所產生的二級代謝產物來合成香料或前驅物分子。由於許多酵素(例如脂肪酶、蛋白酶與葡萄糖苷酶)具有催化自前驅物分子產生芳香相關化合物的能力，微生物生物合成與酵素技術之結合提供了一個非常有前景的選擇(Medeiros et al.,2001 supra)。例如：2-苯乙醇(2-phenylethanol)廣泛用於全球市場中，天然的2-苯乙醇比起化學合成的2-苯乙醇價錢高非常多(Etschmann et al.,2004 supra)。

酵母菌和其共生性細菌夥伴經常在天然生態系統中一同出現，他們經常出現於自然發酵的食物和飲料中如葡萄酒、蘋果酒和優格。許多因素均會影響酯類的生產，包括使用的酵母菌株、發酵培養基的組成以及發酵條件等。酯類具有高度菌株的依賴性，且強烈影響由酵母菌生產的啤酒風味。由於天然的2-苯乙醇(2-phenylethanol)是一種重要的天然香料化合物，有很多研究是以尋找微生物生物合成來生產2-苯乙醇。二十一種酵母菌株，包含酵母菌屬(Saccharomyces)和克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)，培養於含苯丙氨酸(phenylalanine)的培養基以產生2-苯乙醇(2-phenylethanol)，其中苯丙氨酸(phenylalanine)係一種前驅物質，作為增加玫瑰般香氣生產的輔助因子。兩種菌株，馬克斯克魯維酵母菌CBS600(Etschmann et al.,2004 supra)和馬克斯克魯維酵母菌CBS6432(Fabre et al.,1997 supra)被發現在液態發酵條件下具有最佳的2-苯乙醇(2-phenylethanol)生產能力(Fabre et al.,1997 supra;Etschmann et al.,2004 supra)。除了從液態培養基萃取的香料化合物外，8種化合物包括異戊醇(isoamyl alcohol)、乙酸異戊酯(isoamyl acetate)、丙酸乙酯(ethyl propionate)、乙酸丙酯(propyl acetate)、異丁酸乙酯(ethyl isobutyrate)和乙酸丁酯(butyl acetate)被發現存在於培養馬克斯克魯維酵母菌培養槽的上部空間(Medeiros et al.,2001)。

為了分離出經濟價值高的香料化合物，許多技術被研究供工業應用。固態發酵(SSF)已被使用來生產芳香族化合物，其係藉由使用預糊化的米、味噌、纖維素纖維和瓊脂來培養酵母菌和其他真菌如鏈孢霉(Neurospora)、接合酵母菌(Zygosaccharomyces)、曲霉(Aspergillus)和木霉(Trichoderma)(Medeiros et al.,2001 supra)。例如，開發生產強烈水果香味如香蕉氣味的化合物(乙酸異戊酯)，其係利用麥麩、木薯蔗渣和甘蔗蔗渣作為基質，以固態發酵方式培養甘薯黑斑病菌(Ceratocystis fimbriata)(Christen et al. 1997 Mycological Research 101,911-919)或以液態發酵方式培養姆拉克漢遜酵母菌(Hansenula mrakii)(Janssens et al. 1988 Medical Faculteit Landbouww. Rijksuniversiteit Gent.53,2071-2077)。馬克斯克魯維酵母菌是產生克菲爾(kefir)特殊風味的重要貢獻者，也是天然香料生物合成的好候選者(Dimitrellou et al.,2008 Process Biochemistry 43:1323-1329;Sarkar,2007 British Food Journal. 109(4): 280-290)。在以往的研究中，發酵溫度是改善香料生產策略的重要參數之一(Saerens et al.,2008 supra;Lucas et al.,1991 supra;Lucas et al.,1993 supra)。從這個角度來看，熱穩定型馬克斯克魯維酵母菌是一個供生產乙基酯(ethyl ester)和醋酸酯(acetate ester)的好候選者。

下述實例僅係舉例說明而非以任何方式限制揭示內容之其餘部分。無須進一步的闡述，咸相信本發明所屬技術領域中具有通常知識者基於此處說明即可利用本發明至最廣的程度。在本揭示內容引述之任何刊物均完整併入本文以供參考。再者，以下提出的任何機制非以任何方式限制本發明之範圍。

實例1：細菌類浮游生物群落檢測和微生物分離

特殊風味的克菲爾(kefir)生態系統包括酵母菌和與其共生(syntrophic)的微生物被認為可當成健康或是生病的成年人及嬰兒的營養飲品(Dimitrellou et al.,2008 supra;Sarkar,2007 supra)。本發明藉由使用變性梯度凝膠電泳(DGGE)和其他分子生物學技術來分析微生物群落而發現特殊風味的重要貢獻者。我們的研究透露乳酸桿菌(Lactobacillus kefieanofaciens)、馬克斯克魯維酵母菌和啤酒酵母菌(Saccharomyces exiguus)並存於此系統中。馬克斯克魯維酵母菌為群落之主導的事實暗示著它對於克菲爾(kefir)特殊風味的貢獻。

根據藉由DGGE所得之克菲爾(kefir)的微生物菌相，並利用YPAD培養基供微生物分離，我們從克菲爾(kefir)系統分離出KY3酵母菌株。自KY3菌株純化出該染色體DNA後，藉引子對(NL1:5'-GCCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'(SEQ ID NO: 4)和SL2:5'-ATTCCCAAACAACTCGACTC-3'(SEQ ID NO: 5))及(18s F　5'-GCCACGAGCCGCGGT-3'(SEQ ID NO: 6)和18sR5'-ACGGGCGGTGTGTAC-3'(SEQ ID NO: 7))增幅26S和18S核糖體RNA基因。所使用的PCR條件如下：95℃，5分鐘；95℃，1分鐘，52-55℃，2分鐘，72℃，2分鐘作用30週期；最後再於72℃作用7分鐘完成增幅程序。該增幅所得的DNA片段大小分別為300和800個鹼基對並純化該PCR片段及進行定序分析。將所得的DNA序列利用BLAST在GenBank資料庫進行序列相似搜索。結果顯示KY3菌株的18S和26S部分序列與馬克斯克魯維酵母菌有高度的同源性，分別為92%和74%。

將馬克斯克魯維酵母菌KY3菌株複印於選擇性培養基上，該培養為含有抗生素之豐富培養基YPAD，或是營養限制的合成完整(SC)培養基，以供基因型檢測分析(圖1)。

實例2：基因定序分析和親緣關係重建

克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)被發現具有多態性，因此分子學資料比起型態學資料更應使用於決定一個新菌種的親源位置(Kurtzman and Robnett 2003)。利用26S rRNA與18S rRNA的部分序列和鄰接法(neighbor-joining method)，我們重新建構了克魯維酵母菌屬26S rRNA和18S rRNA之親緣樹狀圖。以26S rRNA部分序列為例，大部分的菌株相同，因其500鹼基對區域為高度保守。此外，將KY3菌株之18S rRNA部分序列與所有已知的馬克斯克魯維酵母菌菌株進行序列比對，結果指出有一段一致序列為所有已知的馬克斯克魯維酵母菌菌株都含有的高度保守區域，而馬克斯克魯維酵母菌KY3最近似於加拿大起司分離出的克魯維酵母菌CW3-8、CW3-4和CW4-3，它們的18S rRNA部分序列是相同的；的確，NCBI資料庫中BLAST搜尋的結果顯示KY3序列最近似於CW3-8的序列。圖2為CW3-8與KY3序列與上述所有已知的馬克斯克魯維酵母菌菌株間18S rRNA之一致序列的比對圖。值得注意的是，CW3-8序列與18S rRNA一致序列完全相同，而在1051個比對位置中，KY3有10個核苷酸與8個序列的插入或缺失(indels)不同於CW3-8與一致序列。此外，圖3的18S rRNA的親緣樹狀圖顯示比起其他馬克斯克魯維酵母菌菌株，馬克斯克魯維酵母菌KY3有一個較長的分支。因此，可推知台灣的克菲爾(kefir)分離株馬克斯克魯維酵母菌KY3可視為一種新的菌株。

實例3：熱適應性與基質利用性測試

為了比較溫度適應性與乙醇生產的潛力，將馬克斯克魯維酵母菌菌株KY3、乳酸克魯維酵母菌(K. latics)GG799及啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)BY培養於添加2%的葡萄糖的YPAD培養基，並於22℃、30℃、37℃、40℃、42℃及45℃下檢測生長程度。經過60小時的培養後，所有酵母菌株生長於低於37℃下但唯有KY3菌株可以在42℃和45℃下生長良好(圖4a)。為了比較蛋白酶的能力，將三種酵母菌株培養於含有20 g/L脫脂牛奶與20 g/L LB的培養基。培養基上透明區域(clear zone)結果顯示馬克斯克魯維酵母菌KY3比起另兩株酵母菌有更能分解蛋白質，表示其具較高的蛋白酶活性(圖4b)。

測試各種碳源之利用性。將馬克斯克魯維酵母菌菌株KY3培養於液態SC培養基(合成完整)輔添加2%的測試碳源，生長試驗結果指出馬克斯克魯維酵母菌菌株KY3可利用葡萄糖、纖維雙糖、乳糖與木糖作為生長所需之碳源(圖5)。

實例4：乙酸苯乙醇(2-phenylethylalcohol)與乙酸苯乙酯(2-phenylethylacetate)的生產能力

酵母菌發酵的主要代謝產物中，高級醇例如乙酸苯乙醇(2-phenylethylalcohol)與乙酸苯乙酯(2-phenylethylacetate)為揮發性成份中含量最大的族群且它們的存在對整體香料品質非常重要。將三種克魯維酵母菌菌株，CBS600(Etschmann et al.,2004 supra)、CBS6432(Fabre et al.,1997 supra)與KY3，培養於添加苯丙氨酸之葡萄糖培養基，該苯丙氨酸係作為提升玫瑰般和水果般香味的香料化合物之貢獻因子的前驅物。這三種菌株均可在SC培養基生長並經過192小時在30℃有氧或略微缺氧的條件下可自苯丙氨酸(phenylalanine)(2.4 g/l)生成乙酸苯乙醇(2-phenylethylalcohol)或乙酸苯乙酯(2-phenylethylacetate)。在有氧培養條件下，KY3菌株的乙酸苯乙醇(2-phenylethylalcohol)產量(0.4686 g/ml)較其他兩種株菌高(表格1)。在略微缺氧氧培養條件下，KY3菌株可產生0.964 g的乙酸苯乙醇(2-phenylethylalcohol)與0.435 g的乙酸苯乙酯(2-phenylethylacetate)，代表其自苯丙氨酸(phenylalanine)可生成產量優於其他兩種馬克斯克魯維酵母菌菌株的乙酸苯乙酯(2-phenylethylacetate)(表格1)。

表格1：酵母菌培養於有氧環境與略微缺氧環境下，經192小時後所生成之乙酸苯乙醇(2-phenylethylalcohol)與乙酸苯乙酯(2-phenylethylacetate)的產量。

實例5：馬克斯克魯維酵母菌菌株KY3利用生乳為原料基質生產乙基酯類化合物

自富含胺基酸和脂肪酸前驅物之原料基質來進行酯類的微生物生物合成可能是一種供天然香料化合物工業的理想製程。由於馬克斯克魯維酵母菌可利用乳糖和半乳糖作為碳源且具有蛋白酶活性，生乳，其富含胺基酸和脂肪酸且價格低廉，遂被選擇作為醇類及酯類香料生成的基質。當發酵在第10天完成時，馬克斯克魯維酵母菌菌株KY3被發現能夠在25℃下發酵生乳並產生一些能被人類嗅覺感受的「特殊香味」。這些香味成份是其他酵母菌包括馬克斯克魯維酵母菌菌株SSSJ-0、馬克斯克魯維酵母菌菌株CBS600、馬克斯克魯維酵母菌菌株CBS6432、啤酒酵母菌及乳酸克魯維酵母菌被培養於生乳時所無法生產的。

在香料的化學分析中，樣品係於發酵完成時供揮發性化合物的檢測。可惜的是僅有少數溶劑可用來萃取香料化合物以供生乳之感官分析。一替代方法，固相微萃取法(SPME)搭配PDMS纖維被應用來分析香料化合物。該香料化合物的濃度係以具HP-5MX管柱的氣相層析質譜分析儀(GC/Mass)進行檢測與定量。每回的發酵實驗與其後的分析各重複三次。我們的數據顯示在馬克斯克魯維酵母菌菌株KY3樣品中有五個明顯的分析峰；它們被預測為苯乙醇(phenylethyl alcohol)(峰1)、未定義的化合物(峰2)、辛酸乙酯(octanoic acid-ethyl ester)(峰3)、乙酸-2-苯基乙酯(acetic acid-2-phenylethyl ester)(峰4)和癸酸乙酯(decanoic acid-ethyl ester)(峰5)(圖6a)(表格2)。無可否認地，其中有三個獨特的化合物：辛酸乙酯(峰3)、癸酸乙酯(峰5)與未定義的化合物(峰2)，係藉由馬克斯克魯維酵母菌菌株KY3於25℃下與生乳共同培養而產生。由於峰2目前無法從資料庫中比對出來，它可能是混合化合物或是一種新的化合物。這三個獨特的化合物可能是產生讓人類嗅覺感受到的特殊氣味的成份。

表格2：以資料庫預測氣相層析質譜分析數據。

實例6：溫度對香料化合物生產力的影響

KY3菌株分別於25℃、30℃及37℃下與生乳培養六天。我們的SPME數據顯示自生乳生成乙酸苯乙酯(2-phenylethylacetate)的產量在30℃和37℃下為在25℃下的2.5倍與4倍(圖7)。同樣地，馬克斯克魯維酵母菌菌株SSSJ-0在30℃和37℃下，其乙酸苯乙酯(2-phenylethylacetate)的產量為25℃的6倍和8倍(圖7)。有趣的是，乳酸克魯維酵母菌係一種不能生長於高溫下菌株，其在30℃和37℃下自生乳生成乙酸苯乙酯(2-phenylethylacetate)的生產力(2-phenylethylacetate)也提升為25℃的1.7倍和2.2倍(圖7)。因此，對於提高微生物生產天然香料之產量而言，提升溫度似乎是一種好策略。

為了進一步研究KY3菌株的酯化能力，本發明利用純胺基酸和脂肪酸前驅物，例如苯丙氨酸(phenylalanine)、辛酸(octanoic acid)及癸酸(decanoic acid)，作為酵母菌培養時的基質。數據顯示KY3菌株可將這些前驅物於兩天內轉化成乙酸苯乙酯(phenyl ethyl acetate)(玫瑰及蜂蜜香味)、辛酸乙酯(似白蘭地香味)和癸酸乙酯(似椰子香味)(圖8)。乙酸苯乙酯(2-phenylethylacetate)之生產力在30℃和37℃下也顯著優於25℃之生產力(數據未顯示)。

在本說明書中所揭露的所有特徵都可能與其他方法結合，且所揭露的每一特徵都可能被其他具有相同、相等或相似目的的特徵所取代。因此，除了特別顯著的特徵之外，本說明書所揭露的所有特徵皆僅為相等或相似特徵中的一個例子。

一些較佳實施例已揭露於本發明中。然而，需了解在不背離本發明之精神和範圍內可作各種修改。據此，其他實施例亦包含於下列的申請專利範圍中。

為了描述本發明，以下圖式係本發明較佳的實施例。因此，可以理解的是，本發明不限於所示較佳實施例。

圖式：

圖1為一照片顯示馬克斯克魯維酵母菌菌株KY3複印於添加抗生素的YPAD培養基或營養限制的合成完整(SC)培養基上，該營養限制的培養基個別缺乏不同種類的胺基酸供基因型的檢測分析。(a)YPAD；(b)YPAD；(c)G418；(d)甘油；(e)氯化鈉；(f)亮氨酸(Leu)缺陷；(g)尿嘧啶(Ura)缺陷；(h)組胺酸(His)缺陷；(i)賴胺酸(Lys)缺陷；(j)甲硫胺酸(Met)缺陷；(k)與啤酒酵母菌(S. cerevisiae)YTC39[A]之菌苔複印交配和(1)與啤酒酵母菌(S. cerevisiae)YTC40[α]之菌苔複印交配。

圖2為所有已知的馬克斯克魯維酵母菌菌株的一致序列(SEQ ID NO：1)、馬克斯克魯維酵母菌菌株CW3-8(SEQ ID NO：2)和馬克斯克魯維酵母菌菌株KY3(SEQ ID NO：3)之18S rRNA部分序列比對圖。

圖3為所有可獲得的馬克斯克魯維酵母菌菌株之18S rRNA部分序列的親緣樹狀圖，其係藉由鄰接法(neighbor-joining method)建構而來。

圖4為圖片及照片顯示各酵母菌株(Pichia stabilus GS115、馬克斯克魯維酵母菌KY3、乳酸克魯維酵母菌GG799與啤酒酵母菌BY)的耐熱性生長之測定結果(a)與蛋白酶分析結果(b)。

圖5為一圖表顯示馬克斯克魯維酵母菌KY3於添加不同碳源之液態基本培養基(MM)中的生長情形。

圖6為質譜分析結果圖，其顯示藉由HP-5MX管柱的質譜技術所分析的數據。(a)KY3菌株於25℃；(b)SC菌株於25℃；(c)KL菌株於25℃;(d)SSSJ菌株於25℃；(e)CBS 6432菌株於25℃與(f)CBS 600菌株於25℃。

圖7為一圖表顯示酵母菌於不同溫度下之乙酸苯乙酯(2-phenylethylacetate)的相對生產力。

圖8為質譜分析結果圖組，其顯示馬克斯克魯維酵母菌菌株KY3於添加足夠濃度前驅物的培養基中培養兩天，並藉由HP-5MX管柱的質譜技術分析其產生的香料化合物，其中(a)指苯丙氨酸(phenylalanine)前驅物；(b)指辛酸(octanoic acid)前驅物；及(c)指癸酸(decanoic acid)前驅物。

圖9顯示(a)所有已知的馬克斯克魯維酵母菌菌株之一致序列中(SEQ ID NO：1)的18S rRNA部分序列，(b)馬克斯克魯維酵母菌CW3-8的18S rRNA的部分序列(SEQ ID NO: 2)和(c)馬克斯克魯維酵母菌KY3的18S rRNA的部分序列(SEQ ID NO: 3)，該序列載列於圖2。

<110>　中央研究院

<120>　產生香料化合物之酵母菌株

<130>　ACA0044TW

<160>　3

<170>　PatentIn version 3.5

<210>　1

<211>　1059

<212>　RNA

<213>　馬克斯克魯維酵母菌KY3

<400>　1

<210>　2

<211>　1650

<212>　RNA

<213>　馬克斯克魯維酵母菌CW3-8

<400>　2

<210>　3

<211>　1053

<212>　RNA

<213>　馬克斯克魯維酵母菌KY3

<400>　3

<210>　4

<211>　25

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　引子

<400>　4

<210>　5

<211>　20

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　引子

<400>　5

<210>　6

<211>　15

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　引子

<400>　6

<210>　7

<211>　15

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　引子

<400>　7

Claims (7)

1. 一種分離的酵母菌株，其與寄存於台灣食品工業發展研究所菌種寄存中心寄存編號BCRC 920076之馬克斯克魯維酵母菌(Kluyveromyces marxianus)菌株KY3具有相同之特徵。
2. 一種分離的馬克斯克魯維酵母菌(Kluyveromyces marxianus)菌株KY3，該菌株係寄存於台灣食品工業發展研究所菌種寄存中心，寄存編號為BCRC 920076。
3. 一種生產香料化合物的方法，其方法包含在允許合成香料化合物的條件下培養如申請專利範圍第1項或第2項所述的菌株之細胞於一培養基；及從該培養細胞或該培養基純化該香料化合物。
4. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該培養基含有生乳。
5. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該香料化合物為辛酸乙酯(ethyl octanoate)化合物、癸酸乙酯(ethyl decanoate)化合物、乙酸苯乙醇(2-phenylethylalcohol)化合物或乙酸苯乙酯(2-phenylethylacetate)化合物。
6. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該培養步驟係於25℃或以上進行。
7. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該培養步驟係於37-40℃進行。