TW201313898A

TW201313898A - 同時增加芽孢桿菌之脂胜肽ｉｔｕｒｉｎＡ與ｓｕｒｆａｃｔｉｎ產量的生產方法

Info

Publication number: TW201313898A
Application number: TW100135437A
Authority: TW
Inventors: Chien-Yan Hsieh
Original assignee: Univ Nat Kaohsiung Normal
Priority date: 2011-09-30
Filing date: 2011-09-30
Publication date: 2013-04-01

Abstract

本發明係有關於一種同時增加芽孢桿菌之脂胜肽ｉｔｕｒｉｎ　Ａ與ｓｕｒｆａｃｔｉｎ產量的生產方法，係將經榨汁後的甘蔗纖維洗清、瀝乾後，浸泡於逆滲透水８－１２小時，再予以瀝乾，接著將該甘蔗纖維置於烘箱中烘至完全乾燥，乾燥後之甘蔗纖維素以研磨機磨碎，並以篩網過篩，取得適當顆粒大小之甘蔗纖維素，將取得之甘蔗纖維素顆粒於ＭＹＩ培養基滅菌後進行芽孢桿菌培養；據此，即能增加芽孢桿菌之脂胜肽的伊枯草菌素Ａ【ｉｔｕｒｉｎ　Ａ】與表面素【ｓｕｒｆａｃｔｉｎ】的產量。

Description

同時增加芽孢桿菌之脂胜肽ｉｔｕｒｉｎ　Ａ與ｓｕｒｆａｃｔｉｎ產量的生產方法

　　本發明係有關於一種同時增加芽孢桿菌之脂胜肽ｉｔｕｒｉｎ　Ａ與ｓｕｒｆａｃｔｉｎ產量的生產方法，尤其是指一種利用經榨汁後的甘蔗纖維於清洗、乾燥、研磨等處理之後，再進行芽孢桿菌之接種，以達到增加其脂胜肽的伊枯草菌素Ａ【ｉｔｕｒｉｎ　Ａ】與表面素【ｓｕｒｆａｃｔｉｎ】之產量的目的。

　　查，液化澱粉芽孢桿菌對植物病害有不錯的抑制效果，且其產生的表面素【ｓｕｒｆａｃｔｉｎ，參第一圖】及伊枯草菌素Ａ【ｉｔｕｒｉｎ，參第二圖】等二次代謝產物－脂胜肽化合物（抗生物質）也具有促進其抑制真菌及細菌的作用。此外，近來研究發現這些脂胜肽化合物不只在抑制病源菌生長上扮演了”殺手”及”競爭者”的角色，也扮演了促進根部菌落的生長以及增強寄主抵抗力的角色（Ｏｎｇｅｎａ　ａｎｄ　Ｊａｃｑｕｅｓ﹐２００８）。

　　芽孢桿菌【Ｂａｃｉｌｌｕｓ】的脂胜肽化合物生合成途徑是屬於非核醣體胜肽合成路徑【ｎｏｎｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＮＲＳＰ】；其脂胜肽化合物依據其氨基酸序列分成：伊枯草菌素【ｉｔｕｒｉｎｓ】以及表面素【ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ】；其中，表面素【ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ】具有很強的表面活性並具有抗細菌及抗病毒的效果，而伊枯草菌素【ｉｔｕｒｉｎｓ】則是強力的抗真菌劑。脂胜肽化合物也因為所具有的表面活性劑的特性，因此被認為可應用於生物科技及生物製藥上。

　　這些脂胜肽化合物（抗生物質）產生於微生物生長週期的靜止期【ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ　ｐｈａｓｅ】且生長速率下降後開始產生，但若是處於環境壓力下，為了競爭以取得生長優勢便會在進入到靜止期前就開始合成（林﹐１９９９），且表面素【ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ】合成於細胞大量增長的指數生長期【ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ　ｐｈａｓｅ】到靜止期之間，伊枯草菌素【ｉｔｕｒｉｎｓ】及豐原素【ｆｅｎｇｙｃｉｎ】則合成於靜止期的後期（Ｒａａｉｊｍａｋｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ﹒﹐２０１０），此外孢子的形成基因Ｓｐｏ０Ａ也會影響並調節胜肽類抗生物質的合成（Ｍａｒａｈｉｅｌ　ｅｔ　ａｌ﹒﹐１９９３）。脂胜肽化合物的生化合成有部分是僅限於某特定的芽胞桿菌種類【Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐｅｃｉｅｓ】，像是伊枯草菌素Ａ僅限於枯草桿菌【Ｂ﹒ｓｕｂｔｉｌｉｓ】、液化澱粉芽孢桿菌【Ｂ﹒ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ】及短小芽孢杆菌【Ｂ﹒ｐｕｍｉｌｕｓ】；表面素及豐原素則產於較多不同的物種【ｓｐｅｃｉｅｓ】，如芽孢乳酸菌【Ｂ﹒ｃｏａｇｕｌａｎｓ】（Ｈｕｓｚｃｚａ　ａｎｄ　Ｂｕｒｃｚｙｋ﹐２００６）、地衣桿菌【Ｂ﹒ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ】（Ｌｉ　ｅｔ　ａｌ﹒﹐２００８）、巨大芽孢桿菌【Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ】（Ｐｕｅｙｏ　ｅｔ　ａｌ﹒﹐２００９）、仙人掌桿菌【Ｂ﹒ｃｅｒｅｕｓ】（Ｔｓｕｇｅ　ｅｔ　ａｌ﹒﹐１９９９）、蘇力菌【Ｂ﹒ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ】（Ｋｉｍ　ｅｔ　ａｌ﹒﹐２００４；Ｒａａｉｊｍａｋｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ﹒﹐２０１０）等等。

　　其中，表面素係由七個胜肽連接至一個含有１２－１６個碳的β—羥基【β－ｈｙｄｒｏｘｙ】脂肪酸的環狀內脂環結構（如第一圖），其為強效的生物界面活性劑，並具有良好的乳化性及起泡性，不易被蛋白酶水解，並能穩定存在的環狀酯胜肽，可以和細胞磷脂層做緊密的結合，且干擾細胞膜的完整性，使離子孔洞形成，而藉由滲透壓失衡達到抑菌效果，此外，並具有溶血、抗病毒及抗菌活性，其作用效果和劑量成正比（Ｏｎｇｅｎａ　ａｎｄ　Ｊａｃｑｕｅｓ﹐２００８）。其中，伊枯草菌素Ａ【ｉｔｕｒｉｎｓ　Ａ】可與表面素【ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ】形協同作用，伊枯草菌素Ａ【ｉｔｕｒｉｎｓ　Ａ】吸附並滲透到表面素【ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ】分子膜內，二者之間相行交互作用，更可提高抗真菌的效果（曾﹐２００９）。生物體上不同的固醇物組成會使生物胞膜對表面素【ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ】的易感性近而有所不同，有部分存在磷脂層的固醇分子會減弱表面素【ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ】所造成結構不穩定的影響，也因為如此，所以表面素【ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ】對於真菌沒有顯著的毒性（Ｃａｒｒｉｌｌｏ　ｅｔ　ａｌ﹒﹐２００３）。

　　此外微生物為了找到更多的營養源，會在植物根部間以鞭毛做移動，此時表面素【ｓｕｒｆａｃｔｉｔｎ】的生物界面活性則可幫助細菌散布（Ｄａｎｉｅｌｓ　ｅｔ　ａｌ﹒﹐２００４）；並有研究指出鉀離子可刺激表面素分泌，其中表面素【ｓｕｒｆａｃｉｔｎ】對於枯草菌菌株６０５１【Ｂ﹒ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ｓｔｒａｉｎ　６０５１】的移動上扮演了重要的角色，由使用突變株的菌種實驗中可以得知，如果沒有生物界面活性劑【ｂｉｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ】的產生，那微生物就不會有移動現象（Ｋｉｎｓｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ﹒﹐２００３），表面素【ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ】也可幫助修飾微生物表面疏水性質，使之容易附著至固形物表面，然而修飾效果會因為微生物表面疏水性質的不同以及脂胜肽物質的種類及濃度（Ａｈｉｍｏｕ　ｅｔ　ａｌ﹒﹐２０００）而有所不同。在一些研究當中也證實表面素【ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ】和生物膜的形成有關，若去除芽孢桿菌的表面素【ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ】表現基因便會使之無法形成健全的生物膜、菌落生長速度會下降及降低對楊桃細菌性葉斑病【Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｙｒｉｎｇａｅ】的病害抗性。

　　伊枯草菌素【Ｉｔｕｒｉｎ】係由七個胜肽相互連接至一個含有１４－１７個碳的β－羥基【β－ｈｙｄｒｏｘｙ】脂肪酸【參第二圖】，伊枯草菌素Ａ、Ｃ【ｉｔｕｒｉｎ　Ａ、Ｃ】、ｂａｃｉｌｌｏｍｙｃｉｎ　Ｄ、Ｆ、Ｌ【芽孢桿菌黴素Ｄ、Ｆ、Ｌ】及ｍｙｃｏｓｕｂｔｉｌｉｎ【抗霉枯草菌素】為主要的６種變異構型，分子量約介於１０４４－１０８１之間（Ｍａｇｅｔ－Ｄａｎａ　ａｎｄ　Ｐｅｙｐｏｕｘ﹐１９９４），由環胜肽【ｃｙｃｌｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅ】所組成的親水端跟β－胺基酸【β－ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ】所組成的疏水端，使伊枯草菌素【ｉｔｕｒｉｎｓ】具有兩性特性，也屬生物界面活性劑，其伊枯草菌素【ｉｔｕｒｉｎｓ】具有很強的溶血特性，在體外試驗當中具有很強的抗真菌特性可以對抗大部分的酵母菌及真菌，但抗菌效果則有限且無法抗病毒（Ｍｏｙｎｅ　ｅｔ　ａｌ﹒﹐２００１；Ｈｉｒａｄａｔｅ　ｅｔ　ａｌ﹒﹐２００２），其主要作用機制為與病原真菌胞膜的固醇分子形成複合體，使離子傳導孔隙增大鉀離子流出，進而導致菌絲分解並抑制孢子發芽而達防治效果。且由枯草桿菌【Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＲＢ１４】所產的伊枯草菌素Ａ【ｉｔｕｒｉｎｓ　Ａ】可對抗由立枯絲核菌【Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ　ｓｏｌａｎｉ】所導致的蕃茄猝倒病（Ａｓａｋａ　ａｎｄ　Ｓｈｏｄａ﹐１９９６）。

　　目前可透過有機氮的添加促進伊枯草菌素Ａ【ｉｔｕｒｉｎｓ　Ａ】的產量，其中又以大豆分離蛋白效果最佳；其中，１　ｇ大豆分離蛋白的添加可使伊枯草菌素Ａ【ｉｔｕｒｉｎｓ　Ａ】產量達５５９１μｇ（Ｍｉｚｕｍｏｔｏ　ａｎｄ　Ｓｈｏｄａ﹐２００７；曾﹐２００９）。

　　今，發明人即是鑒於伊枯草菌素Ａ【ｉｔｕｒｉｎｓ　Ａ】與表面素【ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ】具有促進抑制真菌、細菌及病毒的作用，且可促進根部菌落的生長以及增強寄主的抵抗力，而能被廣泛應用於農業病害、生物科技及生物製藥上，因此有增加脂胜肽之伊枯草菌素Ａ【ｉｔｕｒｉｎｓ　Ａ】與表面素【ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ】之產量的必要性。

　　即本發明之主要目的，係為提供一種能同時增加芽孢桿菌之脂胜肽伊枯草菌素Ａ【ｉｔｕｒｉｎｓ　Ａ】與表面素【ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ】之產量的生產方法。

　　本發明同時增加芽孢桿菌之脂胜肽伊枯草菌素Ａ【ｉｔｕｒｉｎｓ　Ａ】與表面素【ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ】之產量的生產方法，至少包括以下步驟：

　　（Ａ）先將甘蔗榨汁，並取其經榨汁後的甘蔗纖維；

　　（Ｂ）將選取的甘蔗纖維洗清並瀝乾；

　　（Ｃ）將瀝乾的甘蔗纖維於逆滲透水中浸泡一預設時間，再予以瀝乾；

　　（Ｄ）使再次瀝乾的甘蔗纖維乾燥；

　　（Ｅ）將乾燥後之甘蔗纖維磨碎並過篩，以取得預設顆粒大小之甘蔗纖維素；

　　（Ｆ）將ＭＹＩ培養基滅菌，且將取得之甘蔗纖維素顆粒於該ＭＹＩ培養基中進行芽孢桿菌培養。

　　依此步驟，即能增加芽孢桿菌之脂胜肽的伊枯草菌素Ａ【ｉｔｕｒｉｎ　Ａ】與表面素【ｓｕｒｆａｃｔｉｎ】的產量。

　　為令本發明所運用之技術內容、發明目的及其達成之功效有更完整且清楚的揭露，茲於下詳細說明之，並請一併參閱所揭之圖式及圖號：

　　請參第一圖，為本發明同時增加芽孢桿菌之脂胜肽伊枯草菌素Ａ【ｉｔｕｒｉｎｓ　Ａ】與表面素【ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ】之產量的生產方法流程步驟圖，其步驟為：

　　（Ａ）將甘蔗（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ　ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ）原汁液榨出以得組成分含有３８～４５％（ｗ／ｗ）纖維素、２０～２８％（ｗ／ｗ）半纖維素以及１５～２５％（ｗ／ｗ）木質素的甘蔗纖維；

（Ｂ）將經步驟（Ａ）後所取得之甘蔗纖維以清水洗清，其清洗之次數至少２次，並將清洗後之甘蔗纖維瀝乾；

　　（Ｃ）將經步驟（Ｂ）清洗與瀝乾後的甘蔗纖維浸泡於逆滲透水【ＲＯ】中至少一預設時間，再予以瀝乾；其中浸泡之時間為８－１２小時；

　　（Ｄ）接著將經過步驟（Ｃ）浸泡及瀝乾處理程序後之甘蔗纖維予以乾燥；其乾燥的方式是將甘蔗纖維置於６０～８５℃之烘箱中烘至完全乾燥之狀態；

　　（Ｅ）將經過步驟（Ｄ）之乾燥處理後的甘蔗纖維磨碎且過篩，以取得預設顆粒大小之甘蔗纖維素；其中，甘蔗纖維是以研磨機進行磨碎作業，而研磨後不同顆粒大小之纖維素以篩網孔徑大小分布為２０網目【ｍｅｓｈ】（篩網孔徑大小０﹒８５０ｍｍ）～４０網目【ｍｅｓｈ】（篩網孔徑大小０﹒４２５ｍｍ）篩網過篩，以得到粒徑最大為０﹒８５０ｍｍ之甘蔗纖維素；

　　（Ｆ）將ＭＹＩ培養基滅菌，且將取得之甘蔗纖維素顆粒於該ＭＹＩ培養基中進行芽孢桿菌培養；其中，甘蔗纖維素的添加量為０﹒５～２％（ｗ／ｗ）。且該ＭＹＩ培養基是包含：０﹒１～１﹒５％（ｗ／ｗ）酵母粉【ｙｅａｓｔ　ｐｏｗｄｅｒ】、０﹒１～１﹒０％酵母抽出物【ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ】、０﹒５～１﹒５％（ｗ／ｗ）糖蜜【ｍｏｌａｓｓｅｓ】、０﹒１～０﹒５％（ｗ／ｗ）大豆分離蛋白【ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｓｏｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ】、無機鹽類【ｍｉｎｅｒａｌ　ｓａｌｔｓ】；其中，該無機鹽類是由１﹒５ｍＭ的ＭｇＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ【硫酸鎂】混合０﹒７５ｍＭ的ＫＨ_２ＰＯ_４【磷酸二氫鉀】而成。ＭＹＩ培養基的建立是用來生產高濃度孢子＞１０^１０，並且其具有較高的抗紫外線活性。

　　據此，依上述步驟實施，即能增加芽孢桿菌之脂胜肽的伊枯草菌素Ａ【ｉｔｕｒｉｎ　Ａ】與表面素【ｓｕｒｆａｃｔｉｎ】的產量。

　　其中，在步驟（Ｆ）將甘蔗纖維素顆粒於該ＭＹＩ培養基中進行芽孢桿菌培養前，須先將芽孢桿菌之菌株以ＮＡ培養基活化２０－２４小時後，接著轉以ＬＢ培養基活化２０－２４小時後，才將之做為種源【液態種源】，並以３％（ｖ／ｖ）為接種濃度。

　　而就液化澱粉芽孢桿菌之菌株的菌體保存與種源培養方法進一步說明如下：

＜菌體保存＞

　　將農藥所提供之菌種進行菌種保存，以接種環挑選單一菌落接種至５０ｍｌ的ＬＢ液態培養基中，置於３０℃震盪培養箱，於２００ｒｐｍ轉速下培養２４小時以活化菌株，取４ｍｌ菌液與１ｍｌ已滅菌的９５％甘油均勻混合，取１００μｌ分裝至微量離心管中，並儲存於－７０℃冰箱中保存以供後續實驗使用。

＜種源培養方法＞

　　將上述保存之菌液回溫後，用接種環沾取菌液接種至ＬＢ培養液【Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ】固態斜面培養基，放置於直立式恆溫培養箱３０℃培養活化。

　　將ＬＢ培養液【Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ】及洋菜【Ａｇａｒ】溶於純水中，以微波加熱使粉末完全溶解，並分裝至玻璃試管中，使用硬橡皮塞（中間有直徑４ｍｍ孔洞，孔洞中以棉花填滿）封住瓶口，將試管置入滅菌釜中以１２１℃、１﹒２ｋｇ／ｃｍ^２滅菌１５分鐘，滅菌後將試管口墊高１ｃｍ使液面傾斜；待培養基冷卻凝固後，以接種環勾取菌株由試管底部培養基以Ｚ字型往上方畫，接種完成後置於培養箱３０℃培養２４小時，以成固態種源。

　　將斜面培養基上的菌落，以接種環挑選單一菌落並接種至ＬＢ液態培養基當中，置於３０℃震盪培養箱以２００ｒｐｍ培養２０－２４小時活化做為液態種源。

　　以下再透過實際之試驗，證實本發明所據以訴求之生產方法確實能達到增加芽孢桿菌之脂胜肽伊枯草菌素Ａ【ｉｔｕｒｉｎｓ　Ａ】與表面素【ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ】之產量的效果：

＜選用菌種＞

實施例一：液態澱粉芽孢桿菌【Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ】ＢＣＲＣ　９１０３９５（ＤＳＭ　２１８３６）

實施例二：液態澱粉芽孢桿菌ＢＣＲＣ　９１０４９８

實施例三：液態澱粉芽孢桿菌ＢＣＲＣ　９１０２０３

實施例四：枯草桿菌Ｓ３　６４６７０【Ｈｓｉｅｈ﹐Ｆ﹒Ｃ﹒﹐Ｌｉｎ﹐Ｔ﹒Ｃ﹒﹐Ｍｅｎｇ﹐Ｍ﹒＊﹐ａｎｄ　Ｋａｏ﹐Ｓ﹒Ｓ﹒＊２００８﹒Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｓｔｒａｉｎｓ　ｃａｐａｂｌｅ　ｏｆ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ　ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ　ｉｔｕｒｉｎ　Ａ﹒Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　５６：１－５﹒；Ｈｓｉｅｈ﹐Ｆ﹒Ｃ﹒﹐Ｌｉ﹐Ｍ﹒Ｃ﹒﹐Ｌｉｎ﹐Ｔ﹒Ｃ﹒﹐ａｎｄＫａｏ﹐Ｓ﹒Ｓ﹒＊２００４﹒Ｒａｐｉｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｕｒｆａｃｔｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ａｎｄ　ｃｌｏｓｅｌｙ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ＰＣＲ﹒Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　４９：１８６－１９１﹒】

＜二次代謝物分析方法＞

１、萃取

　　取１０ｍｌ發酵液以９０００ｒｐｍ、４℃離心２０分鐘後，使之分成上清液與菌體兩部份，取上清液並以５Ｎ　ＨＣｌ滴定至ｐＨ值為２﹒０±０﹒０５，此時原本澄清的液體會成混濁狀，再以９０００ｒｐｍ、４℃離心２０分鐘後，取底部之固形物，加入１ｍｌ甲醇溶解固形物，以９０００ｒｐｍ離心１０分鐘取上清液，如此即可得二次代謝物粗萃液，將此粗萃液以０﹒４５μｍ過濾膜過濾後便可以高性能液相層析儀【ＨＰＬＣ】進行分析。

２、高性能液相層析儀分析

　　於高效能液相層析管柱中，以乙腈【ａｃｅｔｏｎｔｒｉｌ】：１０ｍＭ醋酸銨【ａｍｍｏｎｉｕｍ　ａｃｅｔａｔｅ】＝３：２（ｖ／ｖ）為移動相【Ｍｏｂｉｌｅ　ｐｈａｓｅ】，流速為０﹒８ｍＬ／ｍｉｎ，在２２０與２８０ｎｍ波長的條件下進行ＨＰＬＣ分析，並以２００至３６０ｎｍ的波長做全波長掃描，再以ＰＤＡ軟體進行分析鑑定。標準品配置則是將１０μｇ伊枯草菌素Ａ【ｉｔｕｒｉｎｓ　Ａ】及１０μｇ表面素【ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ】分別溶於１ｍＬ甲醇【ｍｅｔｈａｎｏｌ】中，並稀釋成不同的濃度，在２２０與２８０ｎｍ波長的條件下以ＨＰＬＣ分析並以２００至３６０ｎｍ的波長掃描。

＜實施例一＞液態澱粉芽孢桿菌ＢＣＲＣ　９１０３９５（ＤＳＭ　２１８３６）培養基中添加不同顆粒大小之纖維素

　　將榨汁後具有組成分含有４２％纖維素、２５％半纖維素以及２０％木質素的甘蔗纖維以清水清洗２次，瀝亁後，再以逆滲透水浸泡８－１２小時，放置於６５℃烘箱烘至完全乾燥。乾燥後之甘蔗纖維以研磨機磨碎，研磨後之甘蔗纖維素以不同孔徑大小之篩網過篩，取得不同顆粒大小之甘蔗纖維素。添加１％不同顆粒大小之甘蔗纖維素於ＭＹＩ培養基滅菌後進行液化澱粉芽孢桿菌培養。其中，所添加之甘蔗纖維素的顆粒大小分別為４－１２ｍｅｓｈ（篩網孔徑４﹒７５－１﹒７０ｍｍ）、１２－２０ｍｅｓｈ（篩網孔徑１﹒７０－０﹒８５０ｍｍ）、２０－４０ｍｅｓｈ（篩網孔徑０﹒８５０－０﹒４２５ｍｍ）、４０－１００ｍｅｓｈ（篩網孔徑０﹒４２５－０﹒１５０ｍｍ）及１００ｍｅｓｈ以上（篩網孔徑０﹒１５０ｍｍ以上）。

　　請參第四、五圖為顯示本實施例一液化澱粉芽孢桿菌ＢＣＲＣ　９１０３９５（ＤＳＭ　２１８３６）添加１％不同顆粒大小甘蔗纖維素後經ＭＹＩ培養基培養，其伊枯草菌素Ａ【ｉｔｕｒｉｎｓ　Ａ】與表面素【ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ】產量（濃度）時間曲線圖，由該第四、五圖可知，在液化澱粉芽孢桿菌ＢＣＲＣ　９１０３９５（ＤＳＭ　２１８３６）中添加１％不同顆粒大小甘蔗纖維素後，確實能顯著提高液化澱粉芽孢桿菌ＢＣＲＣ　９１０３９５（ＤＳＭ　２１８３６）二次代謝產物中脂胜肽伊枯草菌素Ａ【ｉｔｕｒｉｎｓ　Ａ】與表面素【ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ】的產量，其中並以添加顆粒大小為２０－４０ｍｅｓｈ之甘蔗纖維素有較高的代謝物產量，其伊枯草菌素Ａ【ｉｔｕｒｉｎｓ　Ａ】與表面素【ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ】的濃度分別從５０ｍｇ／Ｌ與７８０ｍｇ／Ｌ提升至１７５ｍｇ／Ｌ與１５５０ｍｇ／Ｌ。

＜實施例二＞液態澱粉芽孢桿菌ＢＣＲＣ　９１０３９５（ＤＳＭ　２１８３６）培養基中添加不同濃度之２０－４０ｍｅｓｈ甘蔗纖維素

　　由＜實施例一＞中得到添加２０－４０ｍｅｓｈ顆粒大小之甘蔗纖維素可使液化澱粉芽孢桿菌ＢＣＲＣ　９１０３９５（ＤＳＭ　２１８３６）有較高的代謝物產量；而本實施例即是進一針對添加２０－４０ｍｅｓｈ顆粒大小之甘蔗纖維素，但添加濃度不同進行觀察二次代謝產物中脂胜肽伊枯草菌素Ａ【ｉｔｕｒｉｎｓ　Ａ】與表面素【ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ】的產量（濃度）。在本實驗當中，添加於ＭＹＩ液態培養基中顆粒大小為２０－４０ｍｅｓｈ的甘蔗纖維素的添加濃度分別為０﹒５％、１％、１﹒５％及２％，培養過程中發酵液的ｐＨ值會隨著培養時間的增加而上升，在菌數量上可觀察到隨培養時間增加各組的菌數量是持續上升的，添加甘蔗纖維素其ｐＨ值與菌數相較於未添加纖維素組並無顯著的差異。

　　請參第六、七圖為顯示本實施例二液化澱粉芽孢桿菌ＢＣＲＣ　９１０３９５（ＤＳＭ　２１８３６）添加不同濃度顆粒大小為２０－４０ｍｅｓｈ之甘蔗纖維素後經ＭＹＩ培養基培養，其伊枯草菌素Ａ【ｉｔｕｒｉｎｓ　Ａ】與表面素【ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ】產量（濃度）時間曲線圖；由該第六、七圖可知，培養時間至第９天其添加２％濃度之２０－４０ｍｅｓｈ的甘蔗纖維素可得液化澱粉芽孢桿菌ＢＣＲＣ　９１０３９５（ＤＳＭ　２１８３６）代謝物產量最高，其伊枯草菌素Ａ【ｉｔｕｒｉｎｓ　Ａ】之產量為２５４﹒３１±２５﹒３５ｍｇ／Ｌ，表面素【ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ】之產量為１８４３﹒２４±３７０﹒０２ｍｇ／Ｌ，各為未添加甘蔗纖維素組的４﹒６及２﹒１倍產量。

＜實施例三＞液態澱粉芽孢桿菌ＢＣＲＣ　９１０４９８培養基中添加２％濃度之２０－４０ｍｅｓｈ甘蔗纖維素

　　請參第八、九圖，其為顯示本實施例三液化澱粉芽孢桿菌ＢＣＲＣ　９１０４９８添加２％濃度、顆粒大小為２０－４０ｍｅｓｈ之甘蔗纖維素後經ＭＹＩ培養基培養７及９天後，其伊枯草菌素Ａ【ｉｔｕｒｉｎｓ　Ａ】與表面素【ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ】產量（濃度）柱形圖。由該第八、九圖可知，培養時間至第７天及第９天其添加２％濃度之２０－４０ｍｅｓｈ的甘蔗纖維素可得液化澱粉芽孢桿菌ＢＣＲＣ　９１０４９８代謝物伊枯草菌素Ａ【ｉｔｕｒｉｎｓ　Ａ】及表面素【ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ】之產量均較未添加甘蔗纖維素之標準品高。

＜實施例四＞液態澱粉芽孢桿菌ＢＣＲＣ　９１０２０３培養基中添加２％濃度之２０－４０ｍｅｓｈ甘蔗纖維素

　　請參第十、十一圖，其為顯示本實施例四液化澱粉芽孢桿菌ＢＣＲＣ　９１０４９８添加２％濃度、顆粒大小為２０－４０ｍｅｓｈ之甘蔗纖維素後經ＭＹＩ培養基培養７及９天後，其伊枯草菌素Ａ【ｉｔｕｒｉｎｓ　Ａ】與表面素【ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ】產量（濃度）柱形圖。由該第十、十一圖可知，培養時間至第７天及第９天其添加２％濃度之２０－４０ｍｅｓｈ的甘蔗纖維素可得液化澱粉芽孢桿菌ＢＣＲＣ　９１０２０３代謝物伊枯草菌素Ａ【ｉｔｕｒｉｎｓ　Ａ】及表面素【ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ】之產量均較未添加甘蔗纖維素之標準品高。

＜實施例五＞ 枯草桿 菌Ｓ３　６４６７０培養基中添加２％濃度之２０－４０ｍｅｓｈ甘蔗纖維素

　　請參第十二、十三圖，其為顯示本實施例五枯草桿菌Ｓ３　６４６７０添加２％濃度、顆粒大小為２０－４０ｍｅｓｈ之甘蔗纖維素後經ＭＹＩ培養基培養７及９天後，其伊枯草菌素Ａ【ｉｔｕｒｉｎｓ　Ａ】與表面素【ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ】產量（濃度）柱形圖。由該第十二、十三圖可知，培養時間至第７天及第９天其添加２％濃度之２０－４０ｍｅｓｈ的甘蔗纖維素可得枯草桿菌Ｓ３　６４６７０代謝物伊枯草菌素Ａ【ｉｔｕｒｉｎｓ　Ａ】及表面素【ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ】之產量均較未添加甘蔗纖維素之標準品高。

　　以上所舉者僅係本發明之部份實施例，並非用以限制本發明，致依本發明之創意精神及特徵，稍加變化修飾而成者，亦應包括在本專利範圍之內。

　　綜上所述，本發明實施例確能達到所預期之使用功效，又其所揭露之具體技術手段，不僅未曾見諸於同類產品中，亦未曾公開於申請前，誠已完全符合專利法之規定與要求，爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便。

無

第一圖：表面素結構圖

第二圖：伊枯草菌素A結構圖

第三圖：本發明之步驟流程圖

第四圖：為顯示本實施例一液化澱粉芽孢桿菌ＢＣＲＣ　９１０３９５（ＤＳＭ　２１８３６）添加１％不同顆粒大小甘蔗纖維素後經ＭＹＩ培養基培養，其伊枯草菌素Ａ產量（濃度）時間曲線圖

第五圖：為顯示本實施例一液化澱粉芽孢桿菌ＢＣＲＣ　９１０３９５（ＤＳＭ　２１８３６）添加１％不同顆粒大小甘蔗纖維素後經ＭＹＩ培養基培養，其表面素產量（濃度）時間曲線圖

第六圖：為顯示本實施例二液化澱粉芽孢桿菌ＢＣＲＣ　９１０３９５（ＤＳＭ　２１８３６）添加不同濃度顆粒大小為２０－４０ｍｅｓｈ之甘蔗纖維素後經ＭＹＩ培養基培養，其伊枯草菌素Ａ產量（濃度）時間曲線圖

第七圖：為顯示本實施例二液化澱粉芽孢桿菌ＢＣＲＣ　９１０３９５（ＤＳＭ　２１８３６）添加不同濃度顆粒大小為２０－４０ｍｅｓｈ之甘蔗纖維素後經ＭＹＩ培養基培養，其表面素產量（濃度）時間曲線圖

第八圖：其為顯示本實施例三液化澱粉芽孢桿菌ＢＣＲＣ　９１０４９８添加２％濃度、顆粒大小為２０－４０ｍｅｓｈ之甘蔗纖維素後經ＭＹＩ培養基培養７及９天後，其伊枯草菌素Ａ產量（濃度）柱形圖

第九圖：其為顯示本實施例三液化澱粉芽孢桿菌ＢＣＲＣ　９１０４９８添加２％濃度、顆粒大小為２０－４０ｍｅｓｈ之甘蔗纖維素後經ＭＹＩ培養基培養７及９天後，其表面素產量（濃度）柱形圖

第十圖：其為顯示本實施例四液化澱粉芽孢桿菌ＢＣＲＣ　９１０４９８添加２％濃度、顆粒大小為２０－４０ｍｅｓｈ之甘蔗纖維素後經ＭＹＩ培養基培養７天後，其伊枯草菌素Ａ與表面素產量（濃度）柱形圖

第十一圖：其為顯示本實施例四液化澱粉芽孢桿菌ＢＣＲＣ　９１０４９８添加２％濃度、顆粒大小為２０－４０ｍｅｓｈ之甘蔗纖維素後經ＭＹＩ培養基培養９天後，其伊枯草菌素Ａ與表面素產量（濃度）柱形圖

第十二圖：其為顯示本實施例五枯草桿菌Ｓ３　６４６７０添加２％濃度、顆粒大小為２０－４０ｍｅｓｈ之甘蔗纖維素後經ＭＹＩ培養基培養７天後，其伊枯草菌素Ａ與表面素產量（濃度）柱形圖

第十三圖：其為顯示本實施例五枯草桿菌Ｓ３　６４６７０添加２％濃度、顆粒大小為２０－４０ｍｅｓｈ之甘蔗纖維素後經ＭＹＩ培養基培養９天後，其伊枯草菌素Ａ與表面素產量（濃度）柱形圖

無

Claims

一種同時增加芽孢桿菌之脂胜肽伊枯草菌素Ａ【ｉｔｕｒｉｎｓ　Ａ】與表面素【ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ】之產量的生產方法，該方法為於ＭＹＩ培養基中進行芽孢桿菌培養時，加入組成分含有３８～４５％（ｗ／ｗ）纖維素、２０～２８％（ｗ／ｗ）半纖維素以及１５～２５％（ｗ／ｗ）木質素的甘蔗纖維於ＭＹＩ培養基中。
一種同時增加芽孢桿菌之脂胜肽伊枯草菌素Ａ【ｉｔｕｒｉｎｓ　Ａ】與表面素【ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ】之產量的生產方法，該方法至少包括以下步驟：
（Ａ）將甘蔗（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ　ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ）原汁液榨出以得組成分含有３８～４５％（ｗ／ｗ）纖維素、２０～２８％（ｗ／ｗ）半纖維素以及１５～２５％（ｗ／ｗ）木質素的甘蔗纖維；
（Ｂ）將經步驟（Ａ）所得之甘蔗纖維以清水洗清並瀝乾；
（Ｃ）將經步驟（Ｂ）的甘蔗纖維浸泡於溶液中，再予以瀝乾；
（Ｄ）將經過步驟（Ｃ）之甘蔗纖維予以乾燥；
（Ｅ）將經過步驟（Ｄ）之甘蔗纖維磨碎且過篩，以得到顆粒狀之甘蔗纖維素；
（Ｆ）將ＭＹＩ培養基滅菌，且將經過步驟（Ｅ）取得之甘蔗纖維素添加於該ＭＹＩ培養基中進行芽孢桿菌培養。
如申請專利範圍第2項所述之方法，其中於步驟（Ｂ）中，該甘蔗纖維清洗之次數至少２次。
如申請專利範圍第2項所述之方法，其中於步驟（Ｃ），該甘蔗纖維是浸泡於逆滲透水【ＲＯ】中。
如申請專利範圍第4項所述之方法，其中於步驟（Ｃ），該甘蔗纖維浸泡的時間為８－１２小時。
如申請專利範圍第2項所述之方法，其中於步驟（Ｄ），該甘蔗纖維是置於６０～８５℃之烘箱中烘至完全乾燥。
如申請專利範圍第2項所述之方法，其中於步驟（Ｅ），該甘蔗纖維研磨後所得之甘蔗纖維素的粒徑為２０網目【ｍｅｓｈ】（篩網孔徑大小０﹒８５０ｍｍ）～４０網目【ｍｅｓｈ】（篩網孔徑大小０﹒４２５ｍｍ）。
如申請專利範圍第2項所述之方法，其中於步驟（Ｆ），甘蔗纖維素的添加量為０﹒５～２％。
如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其中，該ＭＹＩ培養基是包含：０﹒１～１﹒５％（ｗ／ｗ）酵母粉【ｙｅａｓｔ　ｐｏｗｄｅｒ】、０﹒１～１﹒０％酵母抽出物【ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ】、０﹒５～１﹒５％（ｗ／ｗ）糖蜜【ｍｏｌａｓｓｅｓ】、０﹒１～０﹒５％（ｗ／ｗ）大豆分離蛋白【ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｓｏｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ】及無機鹽類【ｍｉｎｅｒａｌ　ｓａｌｔｓ】。
如申請專利範圍第8項所述之方法，其中，該無機鹽類是由１﹒５ｍＭ的ＭｇＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ【硫酸鎂】混合０﹒７５ｍＭ的ＫＨ_２ＰＯ_４【磷酸二氫鉀】而成。