201244642 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種藉由對妊娠期及視情況母乳餵養期及 斷乳後的嬰兒母親投與益生素來改善嬰兒骨骼健康、骨骼 強度及骨骼成型之方法。本發明之方法可改善自胎兒期至 青春期的嬰兒之骨骼健康、骨骼強度及骨骼成型。 【先前技術】 骨骼為在生長過程中經歷形狀及結構重大變化之重要器 官且在生命過程巾經受連續移除及更新過b兒童的骨路 需要具有適合其年齡之尺寸及形狀，及具有足以支樓當時 活動性之強度。除了該等直接需要之外，^，在生長完 成時’骨絡必須可滿足成人期—生的負载需求。老化骨路 之過度脆性極大部分上係歸因於表觀骨骼密度不充分地增 加，及至少在脊柱中，無法達到足夠的尺寸。發生在兒童 期及青春期期間之骨質增加及骨路成型為尖峰骨質之主要 決定子。因此，在該等期間最高化ff可為預防日後生活 中之骨質疏鬆及相關骨折之重要因素。 -些嬰兒在出生時骨骼發育不全以致其骨骼健康、骨骼 強度及骨路成型受損。隨著該等嬰兒長大成兒童及青少 年’其總體骨骼健康及強度可能限制其活動性以及隨著1 長大成人及自然老化過程的進行而影響他們的生活。在= 生時骨㈣統發f不全之情況下，嬰兒在-些情況下極難 克服一生中之相關挑戰。此外，骨路發育不全亦可增加包 括例如骨質疏鬆之成人骨骼問題之可能性。 163205.doc 201244642 因此’仍需求可有效改善自胎兒期至青春期的嬰兒之骨 路健康《路強度及骨路成型之營養途徑。假若該等途徑 包括可持續投與給自受胎期至分舰母㈣養嬰兒之紅娘 母親’及視情況投與給斷乳後的嬰兒之組份，將獲得有益 效果。 【發明内容】 本揭不内容係關於-種藉由對㈣期及視情況母乳飯養 期之嬰兒母親投與益生素來改善嬰兒骨骼健康、骨骼強度 及骨骼成型之方法。本揭示内容之方法可改善自胎兒期至 月春期的嬰兒骨骼健康、骨骼強度及骨骼成型。於一些實 施例中，該嬰兒可在斷乳之後繼續接受益生素。 本揭示内容之一實施例係關於一種改善嬰兒骨骼健康之 方法。該方法包括，對妊娠期婦女投與含有至少一種益生素 之營養調配物。 另一實施例係有關於一種增強嬰兒骨骼強度之方法。該 方法包括對妊娠期婦女投與含有至少一種益生素之營養調 配物。 另一實施例係有關於一種促進嬰兒骨骼成型之方法。該 方法包括對妊娠期婦女投與含有益生素之營養調配物及對 分娩嬰兒後及母乳餵養嬰兒期的婦女投與營養調配物。該 營養調配物包含有效促進嬰兒骨骼成型之用量之至少一種 益生素。 已發現利用益生素強化妊娠期及視情況泌乳期及母乳餵 養期之母親飲食可獲得改善自胎兒期至青春期的嬰兒之骨 163205.(j〇c 201244642 骼健康、骨骼強度及骨骼成型之結果。已顯示該等益生素 (及明確言之菊粉類果聚糖及半乳寡糖）可改善包括鈣、鎂 及鋅之骨礦物質之吸收’以改善嬰兒骨礦物質密度及骨骼 結構。已顯示其他益生素可在骨骼發育早期調節骨髓間葉 幹細胞（MSC)分化及誘導成熟礦物化成骨細胞表現型。 藉以有效量之益生素補充妊娠期及視情況泌乳期婦女的 飲食，將提高嬰兒的尖峰骨質及骨質密度，但條件為該嬰 兒具有為整個青春期及成人期所需求之足夠骨骼質量及強 度。該等效果可進-步預防日後生活中之疏鬆及相關 之骨折。可#由以益生素補充斷乳後的嬰兒飲♦來增進效 【實施方式】 用於本揭#内容之方法中之該等營養調配物含有至少一 種益生素以改善自嬰兒胎兒期至青春期嬰兒之骨路健康、 骨路強度及骨路成型（包括骨質增積及架構後文中詳細 描述本揭示内容之方法之基本特徵及用於本文中之營養調 配物，以及許多選用變化及添加中之一此。 或「營養組合物」可互換 本文所用術語「營養調配物 使用，及除非另外指定，否則是 、 疋知s養液、營養粉、營卷 棒、營養補充劑及悉知於技蓺》 叉篇界之任何其他營養食物產 等營養粉可復水形成營養液。該營養調配物或營養 組合物可包含脂肪、蛋白質及碳水化合物中之至少―： 及適於人經口攝取。 在 除非另外指指定 否則本文所用術語「營養液 係指呈 163205.doc 201244642 即飲液體形式、濃縮形式之營 本文所述之營養粉製得之營養液。°。，及在使用之前復水 除非另外指定，否則本 攝取之前與水^ # 術語營養粉」係指可在 〜別畀水或另一種水性液 態營養調配物且包括喷霧水 广可流動態或可吾取 兩者。 ’、及乾炻混合/乾燥摻合粉末 除非另外指定，否則本文所用術語 大或更小的兒童。 妥兒」係扣12個月 除非另外指定，否則本文所 為12歲之生命階段。 帛紅月春期」係指最大 ^非另外指定’否則本文所用術語「嬰兒配方食 日適於嬰兒攝取之液體及固體營養調配物。 」’、 。除=指定，否則本文所用術語「較大嬰 及固體營養調配物。 月大的兒里攝取之液體 除非另外指定，否則本文所用術語「兒童族 。 係指適於大於36個月大至 … β 口口」 養調配物。 “兒-攝取之液體及固體營 除非另外指定，㈣本文利之所有百㈣ 率係依總體產品之重量钟。 々數及比 重量係美於龍物人θ ° -有關所列成分之所有該等 量知基於活性物含量’因此’除非另外指定否 括可包含於市售材料中之溶劑或副產物。 ^ 除非另外指定或與參考之内容明確 容之單數特徵或限制之所有㈣包括對應之 163205.doc 201244642 限制，反之亦然。 除非另外指定或與參k㈣ 中之方法或製程步驟之盾，否則用於本文 用於本揭示内容之方二/以任何順序進行。 例亦可實質不含本文所述之：營養調配物之不同實施 或特徵，其限制條件為=選用或所選擇的必需成分 有該等必需成分或特徵物仍包含本文所述之所 a此内谷中，及除非另外指定，否 則術語「實質不含」意指所選擇的調配物包含功能量以下 之選用成分，通常小於料選I頓選擇的必需成分之重 量的1%’包括小於〇.5%，包括小於請，及亦包括〇%。 該等營養誠物及方法可包括本文所述產品之該等必需 組刀’以及述於本文中或以其他方式用於營養調配物應用 中之任何其他或選用組分，由其或基本上由其組成。 產品形式 用於本揭示内容之方法中之該等營養調配物可呈任何已 知或以其他方式適於口服之產品之形式予以調配或投與。 任何固體、液體或粉末形式（包括其組合或變化）均適用於 本文中’其限制條件為該等形式使得亦如本文所定義之該 等必需成分安全且有效地經口遞送至個體。該等營養調配 物可經調配以僅含有本文所述之必需成分，或可經由選用 成分改質以形成許多不同產品形式。 用於本揭示内容之方法中之該等營養調配物可經調配以 含有脂肪、蛋白質及碳水化合物中之至少一者，及較佳亦 含有維生素、礦物質或其組合。該調配物亦包含至少一種 163205.doc 201244642 益生素。 該等營養調配物可經由足夠種類及用量之營養素調配以 提供營養之唯一、主要或補充來源或提供專用營養調配 物。 產品形式之特定非限制性實例包括供妊娠期及泌乳期婦 女用之營養調配物及嬰兒配方食品（包括早產及足月嬰兒 配方食品兩者）。產品形式之其他實例包括人乳增強劑、 較大嬰兒配方食品、兒童族配方食品及成年人營養調配 物〇 營養固體 營養固體可呈任何形式’包括營養棒、營養錠劑等，然 L吊呈〃IL動J或實質上流動態顆粒調配物或至少顆粒調配 物之形式。特別適宜之營養固體產品形式包括喷霧乾燥、 結塊或乾掺合粉末組合物1等調配物可㈣自取且利用 匙或其他類似裝置量測’其中可輕易由預期使用者利用適 且之水/A體（通常係指水）復水該等調配物，形成直接經 口或經腸用之營養調配物。此内容中，「直接」使用大致 上意指於復水後約48小時内，最通f於㈣小時内，較佳 即刻於復水後。 營養液 營養液包括濃縮及即食型營養液兩者。該等營養液最通 常係調配為懸汙液、乳液或透明或實質透明液體。 •;使用之營養乳液可為含有蛋白質、月旨肪及碳水化合 尺性/合液。该等乳液一般而言在約rc至約251下為 163205.doc 201244642 流動態或可飲用之液體及通常呈水包油、油包水或複合水 性乳液之形式，然而該等乳液最通常係呈具有連續水相及 不連續油相之水包油型乳液之形式。 該等營養乳液可能及通常具儲存穩定性。依該等營養乳 液之重量計’該等營養乳液通常含有至高95重量％之水， 包括約50%至95%，亦包括約60%至約90%，亦及包括約 70%至約85%之水。該等營養乳液可具有多種產品密度， 然最通常具有大於1.03 g/ml(包括大於丨〇4 g/ml ,包括大 於1_〇55 g/ml ’包括約ι·〇6 g/mi至約丨12 g/mi，亦及包括 約 1.085 g/ml至約 1.1〇 g/mi)之密度。 δ玄營養乳液可具有範圍自約3.5至約8之pH值，然pH值最 適且介於約4.5至約7.5(包括約5.5至約7.3，包括約0.2至約 7)範圍内。 益生素 用於本揭示内容之方法中之該等營養調配物包含至少一 種应生素。如本文所用，術語「益生素」係指可藉由選擇 性地刺激結腸中有限量細菌之生長及/或活性而有益影響 主體之實質不可消化的食物成分。現已顯示益生素可刺激 骨相關礦物質’諸如鈣' 鎂及辞自飲食之吸收，從而改善 總體骨骼健康、骨骼強度、骨骼礦物質密度、骨骼結構及 月路成型。以下所述為可用作本文所述營養調配物中之益 生素的一些寡糖之例示非限制性實例。 果寡糖（FOS)係指由D_果糖與D·葡萄糖組成之短鍵寡 糖，其含有3至5個單糖翠元。F〇s(亦稱為新糖）及短鍵 163205.doc 201244642 FOS係使用真菌果糖基轉移酶藉由薦糖以商業規模生產。 剛針對上胃腸道中之消化具抗性。其可刺激大腸中雙又 桿菌师—咖"·叫物種之生長。一特佳市售剛來源為 Synergy-l®(〇rafti，Belgium)。 菊步““曰天然生成之含果糖寡糖之群。菊粉屬於稱為果 聚糖的碳水化合物類別。其係源自菊苣(菊苣 /―叫）及冑芋（t/e_/ew⑽咖㈣之根。肖粉主要係 由果糖單元構成且通常具有末端㈣糖。菊粉中果糖單元 之間之鍵為β^)糖㈣。作為營養補充劑銷售之菊粉之 平均聚合度為〗0至12。菊粉可刺激大腸中雙又桿菌物種之 生長。 反式-半乳寡糖（t-GOS)為由D-葡萄糖與0_半乳糖組成之 寡糖之混合物。T-G0S係經獲自米麯黴⑷ 之β_半乳糖苷酶作用自D_乳糖生成。t_g〇s針對上 胃腸道中之消化具抗性且可刺激大腸中雙又桿菌之生長。 木寡糖（X0S)係由含β_鍵結之木糖殘基之寡糖組成。 X〇S之聚合度為2至4e則係藉由酶水解多醣聚木糖而獲 得。 適用於該等營養調配物中之其他適宜益生素包括阿拉伯 膠、抗性澱粉及葡聚糖。 本文所述之營養調配物通常欲包含依營養調配物之重量 計約1%至約20%(包括約1%至約15% ’包括約5%至約 12%，包括約7%至約1〇%)之益生素。 就投與給妊娠期婦女或泌乳及母乳餵養期婦女而言，該 I63205.doc •10· 201244642 等營養調配物-般而言提供用量不超過15 g/日（包括不超 過10 g/日，及包括不超過5 g/日）之益生素。明確言之該 等營養調配物可提供用量為約〇观/ 生素。 在對嬰兒提供該營養調配物作為營養之補充、主要或唯 一來源之情況下，該營養調配物包含依該營養調配物之重 量計約1%至約20%(包括約1%至約15%，包括約5%至約 12 /。，包括約7%至約1 〇%)之益生素。類似的用量可適用於 青春期期間。 大量營養素 該營養調配物可進一步包含除本文所述益生素外之一或 多種可選大量營養素。該等可選大量營養素包括蛋白質、 月曰質、碳水化合物及其組合。該等營養組合物可按所期調 配呈同時含有此3種大量營養素之營養調配物之形式。 適用於本文中之大量營養素包括已知或以其他方式適用 於口服營養調配物之任何蛋白質、脂質或碳水化合物或其 來源’其限制條件為該可選大量營養素可安全且有效地用 於口服及此外與該營養調配物中之其他成分相容。 該營養調配物中可選脂質、碳水化合物及蛋白質之濃度 或用量可根據特定產品形式（例如，棒或其他固體劑型、 乳或大豆基液體/乳液或其他透明飲料、可復水粉末等）及 多種其他調配物及標的膳食需要而進行相當大的變化。該 等可選大量營養素最通常係在以下表格中所述之所呈現範 I63205.doc 201244642 圍中之任何範圍内經調配。 營養素(總卡路里％) 實例A 實例B 實例C 碳水化合物 0 至 100 10 至 70 40 至 50 脂質 0 至 100 20 至 65 35 至 55 蛋白質 0 至 100 5至40 15 至 25 各數值前由術語「約」修飾 營養素(佔組合物的重量％) 實例D 實例E 實例F 碳水化合物 0至98 1至50 10 至 30 脂質 0至98 1至30 3至15 蛋白質 0至98 1至30 2至10 各數值前由術語「約」修飾 碳水化合物 適用於該等營養調配物中之可選碳水化合物可為單純、 複合或其變化或組合，所有該等為視情況除本文所述之該 等益生素外可選。適宜碳水化合物之非限制性實例包括水 解或改質或抗性澱粉或玉米澱粉、麥芽糊精、異麥芽酮 糖、蔗糖麥芽糖、葡萄糖聚合物、蔗糖、玉米糖漿、玉米 糖漿固體、稻穀源性碳水化合物、葡萄糖、果糖、乳糖、 高果糖玉米糖漿、蜂蜜、糖醇（例如麥芽糖醇、赤蘚糖 醇、山梨糖醇）及其組合。 適用於本文中之可選碳水化合物亦包括可溶性膳食纖 維，其非限制性實例包括阿拉伯膠、羧甲基纖維素鈉、瓜 爾膠、柑橘果膠、低及高曱氧基果膠、燕麥及大麥葡聚 糖、角叉菜膠、車前草及其組合。不溶性膳食纖維亦適於 163205.doc -12· 201244642 =文中之碳水化合物來源，其非限 双纖、隹、豌豆殼纖維、大 貝^括热麥 纖維、纖維素、玉㈣及其= 葉纖維、甜菜 蛋白質 適用於該等營養調配物中 其他適宜來源,諸如乳(例如，路蛋白或 …、卵〉月蛋白）、穀類(例如，稻榖、玉来）、始私 (例如，大豆 '豌豆 〜、 玆蓉恭“ ’妗薯)或其組合》適用於本文中之 一入吱亦可包括悉知用於營養品中之游離胺基酸(或 二或^由其代替），其非限制性實例包括l•色胺酸、 又醱胺酸' L·路胺酸、L_曱硫胺酸、l•半耽胺酸、牛磺 酸、L-精胺酸、L_肉鹼及其組合。 脂質 適用於該等營養調配物中之可選脂f包括椰子油、經分 餾之椰子油、大豆油、玉米;由、撖欖油、紅花子油、高油 酸紅花子油、高GLA·紅花子油、MCT油（中鏈甘油三醋）、 向日葵油、高油酸向日葵油、棕櫚及棕搁核;由 '棕櫚油 精、菜籽油、亞麻籽油、琉璃苣油、棉籽油、月見草油、 黑醋栗籽油、轉基因油來源、真菌油脂、水產動物油（例 如，鮪魚、沙丁魚）等。 可選成分 該等營養調配物可進一步包含可改變產品之物理、營 養、化學、特徵或加工特性或用於標的人群體中時充當醫 163205.doc 201244642 藥或額外營養組份之其他可選成分^許多該等可選成分為 吾人所知或以其他方式適用於其他營養品中及亦可用於本 文所述之營養調配物中，其限制條件為該等可選成分可安 全且有效地用於口服及與該調配物中之該等必需及其他成 分相容。 該等其他可選成分之非限制性實例包括防制、抗氧化 劑、緩衝劑、醫藥活性物、甜味劑、著色劑、香料、 LCPUFA、增味劑、稠化劑及穩定劑、乳化劑、潤滑劑及 其組合。 4等營養調配物可進一步包含一或多種礦物質，其非限 制性實例包括峨、鈉、氣離子、鎮 '猛、鐵、銅、辞、 碘、鈣、鉀、鉻、鉬、硒及其組合。 該等營養調配物亦可包含一或多種維生素，其非限制性 實例包括類胡蘿蔔素(例如，卜胡蘿蔔素、玉米黃質、黃體 素番加紅素）、生物素、膽鹼、肌醇、葉酸、泛酸、維 生素A、硫胺素（維生素B1)、核黃素（維生素32)、菸酸（維 生素B3) '吡哆素（維生素B6)、氰鈷胺酸（維生素B12)、抗 壞血維生素c)、維生素D、維生素e、維生素κ及其各 種鹽、酯或其他衍生物、及其組合。 製法 該等營養液^ 由適用於製備營養液（包括乳液，諸如 礼基營養礼液)之住何已知或其他適宜方法製備。 於一適宜盤4 rb 衣古中’使用至少3種不同漿液（包括脂肪包蛋 白質（PIF)漿液、# , 又奴水化合物-礦物質（CHO-MIN)漿液及水 I63205.doc 201244642 包蛋白質（PIW)漿液）製備營養液。該卩吓漿液係藉由加熱 並混。所選擇油（例如，菜籽油、玉米油、魚油（包括 LCPUFA)等）然後在持續加熱及攪拌下添加乳化劑（例如， 卵磷脂）、脂溶性維生素及總蛋白質中之一部分（例如，乳 蛋白濃縮物等）形成。該CHO-MIN漿液係藉由在加熱攪拌 下在水中添加以下各者形成：益生素、礦物質（例如，檸 檬酸鉀、磷酸二鉀、檸檬酸鈉等）、微量及超微量礦物質 (TM/UTM預混物）、稠化劑或懸浮劑（例如微晶纖維素 (cei)、纟。蘭膠、角叉菜膠）。在添加其他礦物質（例如， 氣化鉀、碳酸鎂、碘化鉀等）及/或碳水化合物（例如，蔗 糖、玉米糖聚等）之前，使所得CH〇_MIN梁液維持於持續 加熱及授拌條件歷時1Q分鐘。接著，藉由在加熱及授掉下 將剩餘蛋白質（例如’赂蛋白酸鈉、大豆蛋白濃縮物等）混 入水中形成PIW漿液。 Λ 後在加熱攪拌下將該等所得漿液摻合在-起並將阳調 整至所期範圍（通常6.6至70)，此後，使該組合物經過古 ·:瞬時(HTST)處理，其間該組合物經加熱處理，乳化及均 質化’然後冷卻。添加水溶性維生素及抗壞血酸，視 再將ΡΗ調整至所期範圍，添加香料’然後添加水達 總固體含量。然後無菌包裝該組合物，以形成經無菌包裝 之營養乳液，或將該組合物添加至殺菌爸穩定容器中: 經過殺菌爸滅菌以形成經殺菌釜滅菌之營養乳液。 適用於該等營養《之製法可在残離本揭㈣容 神及範圍下以不同於本文所述彼等之方法進行。本發明= I63205.doc •15· 201244642 施例因此應視為於所有態樣中具例示性及非限制性及所有 變化及等效物亦含於本揭示内容之描述範圍内。 諸如喷霧乾燥營養粉或乾燥混合營養粉之營養固體可藉 由適用於製造及調配營養粉之任何一群已知或其他有效才二 術製得。 例如，當該營養粉為噴霧乾燥營養粉時，喷霧乾燥步驟 亦可包括已知用於或另外適用於產製營養粉之任何喷霧乾 燥技術。已知許多不同的噴霧乾燥方法及技術適用於營養 子員域戶斤有„亥等方法均適用於製造本文中之噴霧乾燥 養粉。 製備該喷霧乾”養粉之—種方法包括形成及均質化水 性漿液或液體’ ^後噴霧乾燥該毀液或液體以製得喷霧乾 燥營養粉。該方法可進一步包括喷霧乾燥、乾燥混合或以 其他方式將其他營養成分（包括本文所述該等成分中之任 何-種或多種)添加至該喷霧乾燥營養粉之步驟。 用法 用於本揭示内容之方法中之該等營養調配物係投盘哈姓 娘期婦女直至分㈣兒及視情況錢來投與給泌乳期及母 礼女及此外視情況投與給斷乳後的嬰兒從而在分 娩别提供給嬰兒益生素。接受該營養調配物之蛀娠期或泌 礼期婦女可為不具有骨路健康問題（包括骨路易碎或骨質 家族史的婦女，或可為具有骨路健康問題(包括脆 展：二或骨質疏鬆)之家族史以致其所有後代可能容易發 健康問題及/或可能處於具有或發展骨骼健康問題 I63205.doc 201244642 (諸如骨質疏鬆、骨骼易碎等）之風險之婦女。本揭示内容 之方法可特別適用於因家族史而處於發展諸如（但不限於） 骨質疏鬆之骨骼健康問題風險之嬰兒。 於一些實施例中，含有益生素之該等營養調配物另外係 投與給分娩後及泌乳期及母乳餵養嬰兒的婦女以致在分娩 後該嬰兒繼續實現該等益生素所提供之骨骼徤康效益。該 等營養調配物可按需以口服方式投與給婦女以提供所期含 置程度之營養，然而，一般而言希望包含益生素之該營養 調配物之投藥係在妊娠期及泌乳期及母乳餵養嬰兒期間以 每日至少1次（包括每日2次，包括每日3次或更多次）投與。 於一些實施例中，含有益生素之該等營養調配物亦可直 接投與給斷乳後的嬰兒以進一步提供益生素給該生長中及 發育中的嬰兒。通常地，於該實施例中，該等營養調配物 可在斷乳至青春期期間及其中所包括之任何時期以每曰至 少1次（包括每日2次，包括每日3次或更多次）進行投與。斷 乳後，根據嬰兒年齡，提供給嬰兒且包括益生素之該營養 調配物彳呈嬰兒配方食品及可能係較大嬰兒配方食品 '兒 童族配方食品等之形式。根據本揭示内容之一些實施例， 該嬰兒可在斷乳後至青春期期間繼續接受該營養調配物。 用於本揭示内容之方法中之該等營養調配物中益生素之 使用提供胎兒期至青春期（包括胎兒期至嬰兒期）嬰兒經改 善的骨骼健康、經改善的骨骼強度、經改善的骨質增積及 架構、及經改善的骨骼成型。此外，用於本揭示内容之方 法中之该等營養言周配物令益纟素之使用可在4《骨縣發育 I63205.doc 17 201244642 早期调却骨髓間葉幹纟田胎f M 、、 胞(MSG分化及誘冑成熟礦物化成 骨細胞表現型。另外，用於， 7'本揭不内容之方法中之該等營 養調配物中益生素之使用可 文《嬰兒骨礦物質之吸收及提 高骨礦物質密度。明確古夕，〜&朴 〇 4等營養調配物_益生素之 使用可增進自母體腸之礦物皙 勿質及收，此專可增加胎盤及母 乳中礦物質之生物可利用性月、，普 注及濃度，因而改善嬰兒骨化過 程。 實例 以下實例例示本揭示內交+士.+ 内今之方法之特定實施例及/或特 徵。出示該等實例僅為遠例 一 Θ硬例不之目的，然因可在不脫離本 揭丁内合之精神及圍下作出其許多變化而不應視為對本 揭丁内令之限制。除非另外指定，否則所有例示用量為依 產品總重量計之重量百分比。 該等料產品為依據營養學產#中熟知用於製備營養乳 液及粉末之製法製得之營養調配物。 實例1 於該實例中’分析補充⑴益生素；或⑺LCPUFA;或 (3)鈣，或（4)維生素D之母親飲食對胎兒及出生後骨骼發育 之影響。 a將50隻1G週域㈣孕11天的絲期Sprague-Dawley大 鼠（Charles Rivers Lab〇rat〇ries，〇rleans。心乂，卜扣。匀養 在標準環境條件（22t，相對濕度為5G% m維持12 小時/天)且在試驗期間允許自由獲取去離子水。將該等大 鼠隨機分成5個飼養組（η=1〇/組）··（1)對照組（「對照」）， 163205.doc • 18· 201244642 其接受標準純化嚙齒動物膳食（SPRD) ; (2)鈣組（「鈣」）， 其接受經0.5%碳酸鈣增強之SPRD(膳食中之最終濃度為1.0 g Ca2+/100 g產品）；（3)益生素組（「益生素」），其接受含 有 7.5%呈菊粉型果聚糖（Synergy-1®，Orafti, Belgium)形式 之總碳水化合物之SPRD ; (4) LCPUFA組（「LCPUFAj )， 其接受含有50%呈n-3長鏈聚不飽和脂肪酸（Eupoly-DHA®， 10% EPA and 1 8°/。DHA, Puleva Biotech, Spain)形式之總脂 肪之SPRD ;及（5)維生素D組（「維生素D」），其接受經最 終濃度為1200 IU維生素D/100 g產品增強之SPRD(維生素 D，DSM Nutritional Products Europe LTD, Spain)。 分娩後，將自相同組之幼崽混合且隨機將8隻幼崽（5隻 雌崽及3隻雄崽）與一母畜養在一起。其乳兒期間，該等幼 崽僅接受母乳。母畜之營養處理係在斷乳時（幼崽，25天 大）結束及在生長期至青春期（後代，90天大）利用SPRD餵 養該等斷乳幼崽。 在出生、斷乳及青春期結束時殺死大鼠幼崽。藉由使用 pDEXA密度計（Norland Corp·，Fort Atkinson，WI，USA)量 測出生及斷乳時骨骼之全身骨礦物質密度（BMD)及骨礦物 質含量（BMC)。於青春期後代中，對單獨的骨骼（腿骨、脛 骨及椎骨）分析測定BMC及BMD。藉由微計算機斷層攝影 術（微-CT)分析測定小梁架構參數（小梁厚度、間隔及數 量）、骨骼長度及骨骼體積分率（BV/TV)。微-CT分析係由 Bone & Joint研究組（University of Southampton, UK)進行 及皮質參數係由 SCANCO Medical AG(Briittisellen，Switzerland) 163205.doc -19- 201244642 進行測定。 雙能X-射線吸收測量法（DEXA) DEXA掃描為在臨床操作中用於分析骨骼健康之技術。 可藉由該技術測得此兩種主要骨骼性能：骨礦物質含量 (BMC)及區域骨礦物質密度（BMD)。BMC測定存於全身骨 骼及所選擇骨骼區域中之礦物質之質量。BMC改變反映骨 骼成型與骨質破壞之間的代謝「質量」平衡之結果。相對 投影骨骼區域面積所表示之BMC係指BMD。BMD表示存 於所研究骨骼區域中之礦物質之總質量。 於該實例中，BMC(單位為克）及BMD(單位為g/cm2)之測 量係藉由pDEXA密度計評定且由同一技術員操作。適用於 研究小動物之製造商軟體可針對分開的骨骼計算BMC及 BMD。自股骨頸至膝關節量測腿骨。自膝關節至介於脛骨 與根骨之間之關節（亦包括腓骨）量測脛骨。自腰椎3之下位 至腰椎5之上位（LV3-LV5)量測脊椎。
微-CT 微計算機斷層攝影術（微-CT)為用於非破壞性評.估及分 析三維小梁及皮質骨結構性能之技術。 利用微-CT之掃描可在低至5 μηι之解析度下完成，可測 得骨組織之孔隙度及微塑型及重塑事件。此外真三維影像 重建可呈三維結構評估骨微架構，提供經由組織形態測定 術所收集之影像之關鍵資訊。 於該實例中，使用 Metris(XTek)Benchtop 160Xi CT 掃描 儀（University of Southampton)評估股骨、脛骨及脊椎疏鬆 163205.doc -20- 201244642 骨及使用MicroT-40計算機斷層攝影系統（Scanc〇 Medical， Basserdorf，Switzerland)評估脊椎皮質骨。將微-ct成像與 立體測量方法聯合，來估算骨骼體積分率（BV/τν，為有 關每單位總體積之小梁骨組織（礦質化及非礦質化組織）之 3-D參數及為表示疏鬆骨架構形態特徵之最重要參數之_) 及小梁架構之3-D參數，其包括：小梁數量（Tb.N)、小梁 厚度（Tb.Th，單位μιη，小梁之平均厚度）及小梁間隔 (Tb.Sp ’單位μπι ’小梁之間之平均距離，表示骨髓間隙之 量）。 微-CT分析亦可量測皮質骨之不同品質性能。骨骼脆性 不僅受該架構影響而且受組織「品質」影響。作為器官之 骨骼之強度取決於作為組織之骨骼之物質性能。剛度或全 身骨骼因負荷而變形之抗性為主要物質性能及假若在活體 内進行量測則需要採用破壞性機械技術。以微CT非破壞性 分析皮質骨之容積骨礦物質密度（皮質vBMD)具有與皮質 骨之剛度近似線性的關係◦皮質厚度（C Th)為有助於評價 因生長所激發之塑型源性變化之變數中之一者。皮質孔隙 度（C.Sp)反映骨骼之皮質内重塑。假若孔徑變大，則可增 進發生於骨骼表面之重塑，因此，增加皮質孔隙度。皮質 孔隙度之增量弱化骨骼並降低骨骼強度。 統計分析 結果係表示為平均值±標準平均偏差，且認為差異顯著 之概率水平設為]?<〇 〇5。單向an〇va係用以評價可歸因於 先刖藉由Levene檢驗方差齊性之不同標記物中膳食之差 163205.doc 21 201244642 異。藉由鄧恩（Dunnet)檢定進行後驗事後檢定 結果 分娩 分挽時，只有其母親接受㈣強膳食之幼崽具有相較對 照組明顯較低之體重（鈣組：8 24±〇1〇吕；對照組： 8.65士0.12 g ;相對於對照組p<〇.〇5)。該組亦顯示基'於四肢 骨、腿骨及脛骨之小梁參數而言之各別對對照組之顯著差 異，其具有較小的小梁厚度然較大的小梁數量。此點顯示 小梁間隔減少’然未達到統計學差異。於小梁參數所見之 差異主要係歸因於該鈣組中羔崽之體型較小。事實上當 相對於體重表示腿骨長度時未觀察到各別對對照組之差 異，此表明鈣組具有正常構造（鈣組：〇 572±〇〇4 ;對照 組：〇.552进05)。此期間’基於腰椎之小梁參數未觀察到 組之間存有差異。 斷乳 斷乳期間，其母親接受鈣增強膳食或益生素補充膳食之 幼崽顯示相較對照組統計上更低的體重（鈣組：62 〇±〇 9 g，益生素組：67.6±1.〇 g ;對照組：72.2±1.3 g ;對對照 組p<0.05)。相比之下，其母親接受n_3 LCpuFA-補充膳食 之幼崽顯示更高的體重（LCpUFA組：76 8±1 4吕；對照 組：72.2±1.3 g ;對對照組p<0.05)。 於此期間，幼崽之全身BMD及BMC示於圖以與⑺中。 只有其母親接受維生素D強化膳食之幼崽顯示相對對照組 更低的全身BMC。 163205.doc •22· 201244642 於脊椎小梁架構中觀察到因營養干預達成之有益效果。 就鈣及LCPUFA組各別對對照組而言，小梁間隔及]bV/TV 比率具有統計上差異。儘管未達到統計上顯著差異，然其 母親接受益生素之幼崽相較於對照組之幼崽顯示脊椎之 BV/TV高出7%。此外，於其母親接受鈣強化或lcpuFA-補 充膳食之幼崽之脊椎小梁厚度實現各別對對照組之約3〇0/〇 之增量。益生素組之小梁厚度增加丨1%及其小梁間隔減小 21%(圖 2A至 D)。 青春期 不考慮母親所攝取之膳食，後代組於生長期間接受 SPRD膳食。此時期結束時，研究組之間後代體重無差 異。 營養干預組之間全身骨骼及四肢分離骨骼（腿骨及脛骨） 之pDEXA檢查無差異。 於其母親接受益生素或LCPUFA-補充膳食之後代中，腰 椎具有相較對照組顯著更高的BMD及BMC(針對兩個參 數，益生素組中為近20。/。及1^?1^八組為大於20〇/。)（圖3八與 3B)。明顯可見，此關鍵時期，在其母親已接受強化鈣或 維生素D-膳食之後代中，相對對照組未觀察到差異。 於該實例中，僅檢查青春期後代之腰椎，而非腿骨或脛 骨，以判定骨微架構之變化。原因為在四肢骨骼中未觀察 到對BMC或BMD之影響。 利用㈣化、LCPUFA或益生素.補充之腊食，然而不是 利用維生素D-強化之膳食，對於妊娠期及泌乳期的母親之 163205.doc -23· 201244642 干預產生對其後代中脊椎之小梁架構之正影響。分別相較 於對照組，有關疏鬆骨骼品質' BV/TV及小梁厚度之兩種 主要結構標記物於鈣組中增加22%及17%，於益生素組中 增加11%及13%及於LCPUFA組中增加1〇%及13%。弼組亦 顯示小梁間隔相對對照組顯著減小。（圖4八至於其母 親接受維生素D-強化膳食之後代中，未觀察到針對任一結 構參數之影響。小梁厚度之增量可歸因於各個重塑循環中 成型過程之正平衡，此致使小梁BMD增加。 後代之脊椎之皮質參數亦受針對妊娠期及泌乳期母親進 行之LCPUFA或益生素營養干預之正影響。以LCpuFA或 益生素之補充致使皮質vBMD及皮質厚度增加然皮質孔隙 度減小。此兩組中，皮質vBMD與皮質厚度增加約13%及 9%，其中皮質孔隙度平行減小約6%。以鈣之母體補充亦 致使皮質vBMD增加及皮質孔隙度減小，而對椎骨皮質厚 度影響不明顯。以及對於小梁參數而言，維生素D組並未 顯示皮質特徵之任何改善。（圖5A至D) 〇 由實例1之數據得出的結論 以上所論述之結果顯示在斷乳期，LCPUFA組相較於對 照組顯示BV/TV比率、小梁間隔及脊椎小梁厚度之明顯改 善。另外，在青春期，LCPUFA組相較於對照組顯示BMD 與BMC明顯更高，以及對小梁架構及皮質參數具正影響。 該等結果表明以LCPUFA之母體致使在斷乳及青春期對骨 路生長及成型產生相較於對照組之正影響。 另外，該等結果顯示於斷乳期，益生素組相較於對照組 163205.doc -24- 201244642 頁示脊椎之B V/TV比率尚出7¾，相較於對照組小梁厚度增 加11 /〇’及相較於對照組小梁間隔減小。於青春期， 益生素組相較於對照組顯示BMD與BMC明顯更高，以及對 小市架構及皮質參數具正影響。該等結果表明以益生素之 母體補充亦對骨骼生長及成型產生正影響。 經益生素或LCPUFA補充之組中骨骼健康及架構之驚人 效益可表明其母親攝取益生素或LCPUFA之幼崽中骨骼之 等級及骨化較高。因此’相較於對照組，益生素或 LCPUFA母親飲食補充提供重大的骨骼好處。 實例2 於該實例中’經由特定成骨標記物（膠原蛋白I型（1型 Col)、骨鈣素（〇CN)及鹼性磷酸酶（Ap))之調節，研究短鏈 脂肪酸（SCFA)之兩種混合物對於多能間葉幹細胞分化為成 骨細胞之影響（具有類似藉由大腸中益生素發酵所獲得之 特徵之分佈特徵）。 據信’活體外使用短鏈脂肪酸之組合對人間葉幹細胞 (hBMC)分化之影響類似於藉由特定益生素之活體内大腸 發酵所獲得之彼等針對hBMC成骨活性之影響。藉由分析 與骨髓間葉幹細胞分化為成骨系細胞之調節相關之機制， 評價短鏈脂肪酸對活體外成人成骨細胞之生長、分化及功 成之功效。人骨髓細胞生長於基礎或成骨培養基中作為對 照組。在第7及2 1天’使用qPCR技術將該等對照組培養物 與生長在含短鏈脂肪酸之基礎培養基（0.1、1或丨〇 μΜ之乙 酸鹽/丙酸鹽（ΑΡ)或乙酸鹽/丙酸鹽/丁酸鹽混合物中 I63205.doc -25· 201244642 之細胞進行比較。如圊6A與6B所示，在第7天，相較於基 礎對照組培養物之彼等，在補充ΑΡ之培養基中生長之細胞 中觀察到ALP之表現顯著更高。隨著ΑΡ濃度增加，表現呈 下降趨勢。 至第21天，ALP表現接近基礎水平，然而，相較於 ΑΡ(0.1 μΜ)與 ΑΡ(1 μΜ)，ΑΡ(10 μΜ)補充致使 OCN及 1型膠 原蛋白表現顯著更高。 如圖6C與6D所示，在第7天，相較於生長在基礎培養基 中之對照組細胞，在補充ΑΡΒ之培養基中生長之細胞中觀 察到ALP及1型膠原蛋白之表現顯著更高。自生長在ΑρΒ補 充之培養基中之細胞之ALP及1型膠原蛋白表現與自生長 在成骨培養基中之彼等差異不顯著。 至第21天，所有3種標記物（〇cN、八^及！型膠原蛋白） 之表現均已降至基線水平。 由實例2之數據得出的結論 以上所論述之結果顯示包含類似於自大腸中之益生素 酵所獲得之彼等之SCFA比率之骨誘導性培養基中之分 強力激活成骨標記物.該等結果表明益生素對平2
hMSC之骨骼形成具成骨潛能且對於理解該等特定“FA 骨路發育早期作為提高胎兒期至t春期嬰兒骨質増積之 略之效果具重要意義。 曰. 實例3至7例示本揭示内容之營養粉， 具成分列於下表 中。該等產品係藉由噴霧乾燥法以分批 八製传’在使用 163205.doc -26- 201244642 之前利用水復水至所期標的成分濃度。除非另外指定，否 則所有成分用量以公斤Π 〇〇〇公斤產品批料例示。 成分 一~~° 實例3 女例4 實例5 實例6 實例7 脫脂乳粉 792.03 748.27 655.5 582.0 519.65 短鏈FOS 10.0 50.0 100.0 150.0 200.0 超精細白糖 81.1 81.1 81.1 81.1 81.1 全脂乳粉 44.8 44.8 44.8 44.8 44.8 二鹼式磷酸鈣 24.1 24.1 24.1 24.1 24.1 二鹼式磷酸鎂 19.1 19.1 19.1 19.1 19.1 膽鹼預混物 10.3 10.3 10.3 10.3 103 維生素/破物質預混物 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0 香料 6.0 6.0 6.0 6.0 60 DHA粉(11重量％。11八） 0.47 4.7 47.0 70.5 82.85 抗壞血酸鈉 3.78 3.78 3.78 3.78 3 78 乳香粉 1.5 1.5 1.5 __L5 1.5 實例8至12 實例8至12例示本揭示内容之營養粉，其成分列於下表 中。該等產品係藉由噴霧乾燥法以分批方式製得，在使用 之前利用水復水至所期標的成分濃度。除非另外指定，否 則所有成分用量以公斤/1 000公斤產品批料例示。 成分 實例8 實例9 實例10 實例11 實例12丨 脫脂乳粉 750.8 696.085 628.84 688.51 599.75 短鏈FOS 95.855 105.945 90.81 110.99 110.99 超精細白糖 81.1 81.1 81.1 81.1 81 1 全脂乳粉 44.8 44.8 44.8 44.8 44 8 二鹼式磷酸鈣 24.1 24.1 24.1 24.1 24 1 二鹼式磷酸鎂 19.1 19.1 19.1 19.1 19 1 膽鹼預混物 10.3 10.3 10.3 10.3 103 維生素/礦物質預混物 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0 香料 6.0 6.0 6.0 6.0 60 DHA粉(11重量％011八） 4.7 0.47 82.85 0 〇 〇}1^^>八(10重量％ ΕΡΑ，18重量％0只八） 0 0 0 r 3 2.75 抗壞血酸鈉 3.78 3.78 3.78 3.78 3 78 乳香粉 1.5 — 1.5 1.5 L 1.5 1.5 163205.doc -27- 201244642 【圖式簡單說明】 圖1A繪示如實例1所分析，母體營養干預對斷乳期的大 鼠後代之全身骨骼質量密度（BMD)之影響。 圖1B繪示如實例1所分析，母體營養干預對斷乳期的大 鼠後代之骨礦物質含量（BMC)之影響。 圖2A至2D繪示如實例1所分析，母體營養干預對斷乳期 的大鼠後代之脊椎小梁架構之影響。 圖3 A繪示如實例1所分析母體營養干預對青春期的大鼠 後代之全身骨骼質量密度（BMD)之影響。 圖3B繪示如實例1所分析母體營養干預對青春期的大鼠 後代之骨礦物質含量（BMC)之影響。 圖4A至4D繪示如實例1所分析，母體營養干預對青春期 的大鼠後代之脊椎小梁架構之影響。 圖5A至5C繪示如實例1所分析，母體營養干預對青春期 的大鼠後代之脊椎小梁架構之影響。 圖6A與6B繪示如實例2所分析，相較基礎對照細胞之彼 等，生長於補充乙酸鹽/丙酸鹽（AP)之培養基中之人骨髓 細胞之OCN、ALP及1型膠原蛋白之表現。 圖6C與6D繪示如實例2所分析，相較於基礎對照細胞之 彼等，生長於補充乙酸鹽/丙酸鹽/丁酸鹽混合物（APB)之培 養基中之人骨隨細胞之OCN、ALP及1型膠原蛋白之表 現0 163205.doc -28-