TW201225974A - Derivative of a glp-1 analogue or its pharmaceutical salts and their use - Google Patents
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201225974 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 &本發明ί及人類之類升糖素肽](GUM)類似物的衍 生物或其醫樂用鹽，本發明提供的GLp_M似物的衍生物 具有人類GUM的功能，並且與人類GUM相比在體内呈 有更長時_半衰期。本發明鮮及GLP-1類似物的射 物或其醫藥用鹽或含#GLIM類似物的衍生物或其醫藥用 鹽的醫藥組成物用於治療非騰島素依賴性糖尿病、騰島素 依賴性糖尿病、肥胖症的用途。 ’、 【先前技術】 糖尿病是-種全球性流行病，是由於體内騰島素絕對 或相對不足而導致的葡萄糖、蛋白質、脂質代謝紊亂的综 合症（陳睿傑·糖尿病治療藥物的研究現狀廣東藥學院學 報，2G01，7(2) . 13卜133)，根據發病機理可分為第工型 和第 Π 型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM，下 同）。在所有確診的糖尿病患者中，90至95%病人患有T2M， 並且病人往往伴隨著肥胖、體能活動不足（physical inactivity)、年齡偏大、家族糖尿病史、葡萄糖代謝損傷 以及有家族糖尿病史等。T2DM也是一種進行性疾病 (progressive disease)。2000年，世界衛生組織統計資料 估計全球約有1.71億人患有糖尿病；2005年，美國疾病控 制和預防中心（Centers for Disease Control and
Prevention)估計約有0.208億美國人患有糖尿病，約占美 國人口的7% ; 2006年據國際糖尿病聯盟統計，全球糖尿病 95094 4 201225974 '患病人數約為2. 46億（約占全球總人口的5. 9%)並且46%的 患者年齡在40-59歲之間。研究表明，正常人和T2DM患者對 葡萄糖反應有著非常重要的區別。正常人在飯後對血糖升 高的反應屬於早期腺島素反應（early insulin response)。 T2DM特徵是胰島素抑制和胰腺冷-細胞功能損傷，導 致騰島素缺乏和高血糖（Ferrannini E. Insulin resistance versus insulin deficiency in non-insulin-dependent diabetes mellitus： problems φ and prospects. Endocr Rev. 1998， 19(4) : 477-490)。 T2DM病人一般會出現飯後以及空腹高血糖（空腹血糖〉 125mg/dL)，而高血糖主要是由於胰腺冷-細胞不能分泌足 夠的膜島素來補償周邊組織中的膜島素抑制造成的（Weyer C. , Bogardus C., Mott DM. , et al. The natural history of insulin secretory dysfunction and insulin resistance in the pathogenesis of type 2 diabetes mellitus. J. Clin. Invest. 1999，104(6): 787-794)。 鲁 T2DM的主要危險因素是肥胖，它對人類健康具有非常 大的危害。患者患上心血管疾病和非正常死亡的危險會變 大，同時T2DM往往與其他一些高危險性疾病如高血壓、血 脂障礙和肥胖等同時存在；60%的T2DM病人伴隨著微血管併 發症者包括視網膜病變（retinopathy)和神經病變 (neuropathy)以及與T2DM有關的心血管病狀 (cardiovascular morbidities)如冠狀動脈心臟病、心肌 梗塞和休克等。在美國，心血管疾病（cardiovascuiar 5 95094 201225974 disease, CVD)是導致發病和死亡的主要因素，而T2DM是大 血管（macrovascu 1 ar)併發症如動脈粥樣硬化 (atherosclerosis)、心肌梗塞（myocardial infarction)、 休克和外周血管病的發生的主要危險因素（major risk f a c t o r )。患糖尿病的成人發生心臟病和休克導致死亡的機 率是非糖尿病人的2至4倍，此外，接近65%的糖尿病人死於 心臟病和休克。 除了對患者生理和身體的傷害之外，T2DM還會給社會 造成很大的經濟負擔’據統計’在美國每年用於治療糖尿 | 病併發症的費用大約229億美元，每年用於T2DM及其併發症 的總費用接近5 71億美元，不列入預算的花費總額超過8 〇 億美元。 T2DM治療藥物向來是人們關注的焦點，從早期的續醯 類、雙胍類口服降糖藥物到近期的膜島素增敏劑和α _糖 苦酶抑制劑’從動物胰島素到人胰島素及各種新劑型的開 發’從單純的增加胰島素出發的藥物治療機理到作用於更 早產生騰島素的新途徑。體重增加是這類口服或注射降糖 _ 藥用藥後常見的不良反應，這一點可能降低順從性，並且 可能增加發生心血管病的風險。因此開發安全性高，病人 順從性好’不良反應低的新型T2DM治療藥物成為眾多研究 機構和制藥企業爭相研製的熱點。 早在100多年前，Moore就提出十二指腸能分泌刺激胰 腺分泌的“化學興奮劑”，並試圖注射腸道提取物來治療 糖尿病。隨後發現腸道分泌的體液因數能增強騰腺的内分 6
.S 95094 201225974 泌功能，無論靜脈還是口服葡萄糖所引發的胰島素分泌， 約50%源於腸道所產生的肽類的刺激作用，為此Zunz和 Labarre長:出腸降血糖素（incretin)”的概念。至今已分 離出2種腸降血糖素’即葡萄糖依賴性胰島素釋放肽 (glucose-dependent insulinotropic polypeptide, GIP) 和類升糖素肽-l(glucag0n_like pephdeq，GLpq)。Gip 和G L P -1都是在營養吸收時由特定的腸神經分泌細胞分 /必’其中GIP由十二指腸和鄰近空腸κ細胞（proximai φ jejunal K cells)分泌’ GLP-1則在L細胞中合成且主要存 在於返端小腸和結腸中（Drucker DJ. Enhancing incretin action for the treatment of type 2 diabetes. Diabetes
Care. 2003， 26(10) : 2929-2940)。 GLP-1在血漿中以GLP-l(7-37)和GLP-l(7-36)醯胺兩 種生物活性形式存在，這兩個多肽僅有一個胺基酸差異， 而且它們的生物作用和體内半衰期是相同的（Drucker DJ. Enhancing incretin action for the treatment of type m w 2 diabetes. Diabetes Care. 2003, 26(10) : 2929-2940)。 通常所說的 GLP-1 是對 GLP-K7-37)和 GLP-l(7-36) 醯胺的統稱。GIP和GLP-1在胃腸道釋放出來後會很快被 體内的二肽基肽酶-1\^((^?6卩1^(171?6?1^(1856-1¥，0??-1\〇 降解為沒有活性的形式，從而使GIP和GLP-1在體内的半 衰期非常低（GIP體内半衰期約5至7min，GLP-1體内半衰 期約 2min)(Drucker DJ. Enhancing incretin action for the treatment of type 2 diabetes. Diabetes Care. 2003, 7 95094 201225974 26(10) : 2929-2940)。研究表明，大多數降解過程發生在 GIP和GLP-1進入含有DPP-1V的血管時發生，少量沒有被 降解的GLP-1和GIP會進入胰腺並跟其結合位點結合而刺 激冷-細胞釋放胰島素。與續醯脲（sulfonylureas)通過直 接促進功能石-細胞釋放胰島素機制不同，腸促胰島素效 應大部分都是葡萄糖依賴型。此外，一些動物和人體體外 試驗表明GLP-1還具有α-細胞抑制和降低升糖素過度分 泌（glucagon hypersecretion)等作用。 雖然T2DM患者體内血漿GIP濃度正常但其腸促胰島素 作用顯著下降或喪失，而GLP-1在T2DM患者體内濃度則是降 低’因此研究基於GLP-1的藥物更有助於治療T2DM。雖然飯 後幾分鐘内GLP-1醯胺（7-37)和GLP-l(7-36)醯胺濃度均會 提高’但GLP-1 (7-36)醯胺含量更多些，因此内分泌和神經 信號傳遞的雙重作用可能在被消化的食物從消化道下端進 入小腸和結腸前已經大大提高了 GLP-1的分泌。空腹狀態下 企聚中GLP-1濃度是很低的（約5至1 〇pmo 1 /L)，而在進食後 其濃度迅速增加（達到。在Dpp—卩和腎清除 雙重作用下’體内循環的GLP-1濃度迅速降低，而其他的酶 如人體中性肽鏈内切酶24. (human neutral endopept idase 24 · 11)等是否也對GLP-1活性的喪失起決 定性的作用的研究工作正在進行中。由於乩卜丨在？位胺基 酸是丙胺酸’是DPP__IV的良好的基質，更容易降解為無活 性的狀段。實際上，體内Dpp_IV才是腸促胰島素活性喪失 的主要原因’實驗表明DPP-IV基因被靜默化的小鼠體内 s 95094 201225974 GLP-1濃度顯著提高，增加了胰島素的分泌。正是在DPP-IV 作用下，體内完整且具有生物活性的GLP-1僅僅為血漿 GLP-1 總含量的 10至 20%(Deacon CF，Nauck MA，
Toft-Nielsen M, et al. Both subcutaneously and intravenously administered glucagon-like peptide 1 are rapidly degraded from the NH2-terminus in type 2-diabetic patients and in healthy subjects. Diabetes. 1995，44(9) : 1126-1131)。 GLP-1和GIP經由與結構完全不同的G-蛋白偶聯受體 (G-protein-coupled receptors, GPCRs)結合而發揮各自 作用。GIP受體大部分是由胰島石-細胞表達，少部分在脂 肪組織和中樞神經系統表達。與此相反，GLP-1受體則主 要是在胰島α-和点-細胞以及周緣組織包括中樞和周園 神經系統、腦、腎、肺和胃腸道等中表達。兩個腸促胰島 素在細胞中的啟動會導致cAMP和胞内鈣濃度的迅速增 加，從而導致其以葡萄糖依賴方式向胞外分泌，持續的腸 促胰島素受體信號傳遞跟蛋白激酶A相關，會導致基因轉 錄、增加胰島素的生物合成並且刺激点—細胞的增殖 (Gallwitz B. Glucagon-like peptide-l-based therapies for the treatment of type 2 diabetes mellitus. Treat
Endocrinol. 2005，4(6) : 361-370)。GLP-1 和 GIP 受體 的啟動也可以抑制嚙齒目動物和人類胰島中0_細胞凋亡 同時增加其存活率（1^丫，1^1^〇1^8 1'，丫113七3 6,6131·
Glucagon like peptide-l receptor signaling modulates 9 95094 201225974 beta cell apoptosis. J Bi〇i Chem 2003， 278(1): 471 478)。與GLP-1受體表達相一致的是glpj也可以抑 制升糖素分泌、胃排空和食物攝人，同時通過神經機制 (Jieural mechanism)增強對葡萄糖的降解。需要注意的 是’跟其他胰島素分泌反應相同，GUM對葡萄糖分泌的 作用疋升糖素依賴性的’而由於低血糖作用而引起升糖素 ^^f#^(c〇unter-regulat〇ry release of glucagon) 的升糖素作用即使在GLP-1藥理學濃度下仍然得到了完全 保留。 内源性GLP-1和GIP在葡萄糖體内平衡中發揮的重要 生理學作用已經藉由使用受體拮抗劑或在基因剔除小鼠中 進行了深入研究。急性GLP4或以？的拮抗作用減少了嚙 齒目動物體内胰島素的分泌並且增加了血漿葡萄糖含量。 同樣，GIP或GLP-1受體失活突變小鼠同樣有缺陷型葡萄 糖刺激膜島素分泌和損傷性葡萄糖耐受性。GLP_l還具有 空腹血糖調節功能，因為GLP-丨作用的急性拮抗或遺傳破 壞會導致嚙齒目動物空腹葡萄糖濃度的提高；同時，GLPH 疋人體内葡萄糖控制的基礎，對拮抗Exendin(9—39)的研 究表明GLP-1作用被破壞後會造成缺陷性葡萄糖刺激胰島 素分泌（defective glucose-stimulated insulin secretion)、減少葡萄糖廓清率、增加升糖素濃度和加快 胃排空作用。此外，GLP-1的生理作用（Deacon CF. Therapeutic strategies based on glucagon-1 ike peptide 1. Diabetes. 2004，53(9) : 2181-2189)還包括： 95094 10 201225974 ⑴幫助組織血糖吸收’介導葡萄糖依賴型跋島素分泌；⑵ 抑制養後升糖素分泌，降低肝搪釋放；（3)調節胃排空，防 止食物在腸道吸收時葡萄糖的過度循環；（4)抑制食物攝入 (如艮欲）。此外動物试驗還表明1的一個生理學作用 是穩定體内胰腺沒-細胞數量。 因為GLP-1和GIP在控制血糖等多方面具有良好作 用，特別是其不產生低血糖和延緩胃排空控制體重的特點 引起了眾多科學家的興趣。人們開始嘗試研究基於GLP4 Φ 和GIP藥物治療T2DM。眾所周知，T2DM病人缺乏或喪失了 腸促胰島素效應，其中一個原因是T2DM病人體内GIP的腸 促胰島素作用大大減弱；同時，T2DM患者體内GLP-1濃度 很低’且因飲食刺激產生的GLP-1濃度顯著減少 (Toft-Nielsen MB, Damholt MB, Madsbad S, et al Determinants of the impaired secretion of glucagon-like peptide-1 in type 2 diabetic patients. J Clin Endocrinol Metab. 2001，86(8) : 3717-3723)。 鲁因為T2DM患者體内GLP-1作用得到了部分保留，旨在增強 T2DM患者體内腸促胰島素效應的藥物研究方向之一就是 GLP-1增效劑。 GLP-1類似物與内源性GLP或GIP —樣，可以以葡萄 糖依賴型的方式刺激體内胰島素的分泌，同時抑制升糖t 的體内釋放。此外GLP-1類似物對以下症狀具有作用：（1) 低血糖。與其他促分泌藥物不同，GLP-1類似物由於以_ 種葡萄糖依賴方式促進體内胰島素分泌，因此其降血糖作 95094 11 201225974 用具有自限性，在大劑量時一般不會引起嚴重的低血糖。 儘管有文獻報告GLP-1可以將血糖降低到正常濃度以下， 但該效應短暫，而且被認為是（?〇)_1促胰島素分泌作用的 自然結果。由於胰島素的失活需要一定時間，因此當因血 糖濃度降低，GLP-1的刺激作用減弱而沒有新胰島素分泌 的時候，原有的胰島素仍產生作用。總之，GLP4可以使 血糖暫時降低到正常濃度之下，但不會引起嚴重和持久的 低血糖。（2)對飽食和體重的作用。除了直接降低血糖之 外’ GLP-1還可以降低食物的攝入量，這在齧齒類動物和 人身上都得到了驗證。這樣可以經由降低體重間接控制血 糖》辰度。GLP_ 1還有潛在的抑制胃泌素和進食刺激的胃酸 分泌的作用’這些效果表明GLP-1可能還具有預防消化道 潰瘍的作用。GLP-1的作用機制使其不但可以成為理想的2 型糖尿病患者的治療藥物，還可以成為肥胖型糖尿病患省· 的治療藥物。GLP-1可以增強病人的飽食感、減少食物攝 入和保持體重或減肥；（3)維持石-細胞健康。一些研究提 示GLP-1可以預防由糖财受異常到糖尿病的轉化，還有一 些文獻報告了 GLP-1類化合物對實驗動物騰島/3細胞的生 長和增殖具有直接的作用，而且有實驗發現GLP-1可以促 進胰腺幹細胞向功能性万細胞的分化。這些結果暗示 GLP-1具有保護胰島及延缓糖尿病進展的功能，可以保持 召-細胞的形態和功能，同時減少其凋亡；（4)對餐後高血 糖的作用。這一現象代表了 T2DM治療的一種新方向。由於 一些口服藥物和外源胰島素不能抑制或減少T2DM患者升
S 95094 12 201225974 糖素的過鬲分泌，GLP-l類似物可以可能經由直接抑制升 糖素釋放或因促進膜島素分泌而產生旁分泌抑制作用而對 升糖素尚分泌產生影響。經由這兩個機制可以有效減少餐 後高血糖現象；同時，保持沒-細胞功能也可能對長期控 制餐後高jk糖有作用。 同時GLP-1類似物是經由皮下注射服用，不需要計算 石厌水化合物的量來估計最佳的藥物用量，也不需要對血糖 進行自行監測，使這類藥物的使用比胰島素更加方便。 • 天然GLP—1多種功效的證實為T2DM的治療帶來了新希 望，但是，人體天然的GLP-1很不穩定，可被二肽基肽酶 IV(DPP-IV)降解，半衰期僅為1至211^]1。若採用天然GLpy 來降低血糖，需持續靜脈輸注或持續皮下注射，臨床可行 性較差。面對這種情況，人們不斷探索，希望能找到延長 GLP-1作用時間的方法。因此開發長效的GLpq類似物或其 衍生物’成為醫藥界關注的重要領域。
Exenatide是合成的Exendin-4,由禮來公司和Amylin 籲公司合作開發，商品名Byetta®，FDA和EMEA已經批准其 上市，用於治療T2DM。它在序列上與哺乳動物GLP-1有50% 同源性且其與GLP-1受體親和位點跟GLP-1相似（Drucker DJ, Nauck MA. The incretin system · glucagon-1 ike peptide-1 receptor agonists and dipeptidyl peptidase-4 inhibitors in type 2 diabetes. Lancet. 2006, 368(9548) : 1696-1705)，由蜥蜴特有的基因編碼； 與GLP-1相比，Exenatide將GLP-1第2位丙胺酸替換成 13 95094 201225974 甘胺酸，有效的抑制了 DPP-IV酶解，在體内半衰期約6〇 至 90min(Kolterman OG， Kim DD， Shen L， et al· Pharmacokinetics, pharmacodynamics, and safety 〇f exenatide in patients with type 2 diabetes melllitus
Am Health Syst Pharm. 2005，62(2) : 173-181)，單次 皮下注射後Exenatide在體内濃度持續增加，2h左右可以 在血漿中達到最大濃度，可維持4至6h(NielsenLL，Baron AD. Pharmacology of exenatide (synthetic exendin~4) for the treatment of type 2 diabetes. Curr Opin
Investig Drugs. 2003，4(4) : 401-05)。需要注意的是
Exenatide的代謝不發生在肝臟中，而主要經腎小球過據 後經蛋白酶降解。
Exenatide具有特殊的葡萄糖調節活性，包括葡萄檐 依賴型增強騰島素分泌作用、葡萄糠依賴型抑制不正確過 高升糖素分泌作用、減緩胃排空和減少食物攝入等作用。 體内和體外糖展病模型研究還發現，Exenaf丨de還具有儲存 第一階段（first-phase)胰島素分泌、促進細胞増殖和 胰島素從其前體細胞再生的作用。 為了達到較好的血糖控制，每天需要兩次注射 Exenatide，這給病人帶來了很大的不便。再者Exenatide 還具有輕微至中等反胃（約40%病人會有此反應）、腹瀉和嘔 吐（少於15%的病人會有這兩種反應）；Exenatide治療的病 人中約50%會產生抗體，雖然這些抗體不會影響藥效或引起 其他匕床作用。最近又發現6例服用Byetta後發生出血或壞 201225974 死性胰腺炎症狀的情況。 CJC-1131 是ConjuChem Biotechnologies Inc開發的 一種肽酶抑制型GLP-1類似物，將GLP-1序列中2位的Ala替 換成了 D-Ala’用以增強抵抗DPP-IV酶解的能力，其結構中 包含一個具有反應活性的键結劑（reaC"tive linker)以便 於其經由共價（非可逆）方式結合到血清白蛋白上（Kim JG, Baggio LL, Bridon DP, et al. Development and characterization of a glucagon-like peptide-1 鲁 albumin conjugate · the ability to activate the glucagon-like peptide 1 receptor in vivo. Diabetes. 2003，52(3) : 751-759)，產生的GLP-1-血清白蛋白複合物 保留了 GLP-1的活性，同時增加了對dpp- I v酶解的穩定性， 延長了體内作用時間，其血漿清除半衰期約20天。 已經進行的一項研究發現，CJC-1131-血清白蛋白複 合物與用人類重組胰腺GLP-1受體轉染的中國倉鼠卵巢細 胞結合時Ki約為12nM(GLP-l的L為5.2nM);同時該複合物 _ 活化cAMP的ECso為11至13nM ’ EC5。與GLP-1相似。現有文獻 表明，該結合分子可以降低血糖正常和高血糖小鼠餐後血 糖濃度，而且試驗表明CJC-1131的這一活性作用於GLP-1 某一功能性受體上，同時在小鼠中CJC-1131還具有減緩胃 排空和抑制食物攝入等作用。 CJC-1131已經完成了部分π期臨床試驗。2005年9月， Con juChem對已有的試驗結果分析後認為CJC-1131可能不 適合慢性劑量策略（chronic dosing regimens)，因而暫停 15 95094 201225974 了 CJC-1131的臨床研究。目前CJC-1131臨床試驗仍未重新 啟動。
Albugon(albumin-GLP-l)是由葛蘭素史克在 Human Genome Sciences Inc授權下開發的一種長效T2DM治療藥 物，它是GLP-1 (帶增加對DDP-IV抗性的突變）和白蛋白的 融合體。它在猴子體内的半衰期為3天。其基本的研發思 路是將重組GLP-1與血清白蛋白偶聯後形成一個複合物， 這樣便顯著增加了其體内半衰期。服用Albugon後有效降 低了小鼠血糖濃度、增加了胰島素分泌、減緩了胃排空和 減少食物攝入等（Baggio LL，Huang Q，Brown TJ，et al. A Recombinant Human Glucagon-Like Peptide (GLP)-l-Albumin Protein (Albugon) Mimics Peptidergic Activation of GLP-lReceptor-Dependent Pathways Ccmpled With Satiety, Gastrointestinal Motility, and Glucose Homeostasis. Diabetes. 2004, 53(9) · 2492-2500)。目前Albugon正在進行III期臨床試驗。 WO9808871公開了 一種在GLP-K7-37)的基礎上進行 脂肪酸修飾的GLP-1衍生物，使得GLP-1在體内的半衰期得 到大大增強。W09943705公開了 一種在GLP-1的N端進行化學 修飾的衍生物，但是有文獻報導在N端的胺基酸進行修飾會 造成整個GLP-1衍生物的活性大大降低（J. Med. Chem. 2000，43，1664 1669)。另外CN200680006362、 CN200680006474 > W02007113205 ' CN200480004658 ' CN200810152147、W02006097538等專利也公開 了一系列經 201225974 化學修飾或胺基酸替換得到的GLP-1類似物或其衍生物，其 中最具有代表性的是諾和諾德公司開發的1 i rag 1 ut i de，已 經完成了 ΠI期臨床。L i rag 1 ut i de是一種GLP-1衍生物，其 結構中含有序列與人源GLP-1具有9 7°/❶同源性的GLP-1類似 物’該類似物與棕櫚酸共價連接構成了 Liraglutide[， Liraglut ide結構中的棕櫚酸以非共價形式連接到血清白 蛋白上’這一結構特徵決定了它會缓慢的從注射位點釋 放’在不改變其GLP-1活性基礎上延長了體内循環半衰期； • 同時結構中的棕櫚酸會形成一定空間位阻，從而防止 DPP-IV的降解作用，減少了腎臟清除作用。由於具有以上 特性’Liraglutide在經由皮下注射之後在人體内的半衰期 約10至14h，理論上可以一天給藥一次，每天劑量為〇. 6至 1. 8mg。2009年4月23日，諾和諾德宣佈EMEA下屬的人用藥 物委員會（CHMP，Committee for Medicinal products for
Human Use)對Liraglutide評價積極，並且建議批准其上 市。諾和諾德期待歐盟委員會可以在兩個月以内批准其上 *市申請。 【發明内容】 本發明的目的在於提供一種活性更高、體内半衰期更 長的GLP-1類似物的衍生物，本發明提供的Guq類似物 的衍生物具有人類GLP-1的功能，並且與人_ GLp_i相比 有著較長的體内半衰期。 ，本發明的另一目的在於提供一種含上述GLp_i類似物 的衍生物或其醫藥用鹽的醫藥組成物，用於治療胰島素依 jn Η 95094 17 201225974 賴性糖尿病、非胰島素依賴性糖尿病和肥胖病。 β本發明的目的是經由以下技術方案來達到的。本發明 提供-種含有胺基酸序列通式為⑴的GUM類似物 生物或其醫藥用鹽， '
Xi^-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xn-Ser-X^-X^-x,^
Glu-X16-X17-Ala-X19-X2Q-X21-Phe-Ile_X24_Trp__Leu_X27— -X3〇-X3 丨-Χ32-Χ33-χ34-χ35_χ36_Χ37—χ38—χ39 一 Lys (I) 其中該GLP-1類似物的衍生物具有一個結構通式為 {^(CHA-CO-的親脂性取代基，仏選自CH3_或者H〇〇c_，卩 為 8 至 25 之間的整數，Xl、χ2、Χι。、χΐ2、&、&、L6、、 Χι9、χ2。、χ2〗、χ24、χ27、χ28、χ29、Χ3。、Χ31、Χ32、Χ33、Χ34、 X35、X36、X37、X38、X39各自獨立的選自任意天然的胺基酸或 非天然胺基酸或由其組成的肽段。 該GLP-1類似物是指以人類GLp_1(7_37)狀為母體， 包括GLP-l(7-36)_#a GLP_1(7_37)，進行部分胺基酸的 替換或在C端的延伸得到新的GLP-1肽，該glp-1肽具備 人類GLP-1的功能。 該衍生物是指利用親脂性取代基對GLP-1類似物的胺 基酸殘基進行化學修飾’典型的修飾方式為形成醯胺或醋， 較佳的修飾方式為形成醯胺。 本發明的一個較佳的實施方案是結構通式為 Ri(CH2)n-C0-的親脂性取代基和GLp_i類似物的胺基酸殘 基的胺基藉由_鍵的方式連接，其中Ri選自·或者 18 95094 201225974 _ H00C- ’ η為8至25之間的整數。 本發明的另一較佳的實施方案是結構通式為 R〗（CH2)n-C0-的親脂性取代基和乩卜丨類似物€端的£ 胺基藉由醯胺鍵的方式連接，其中Ri選自CH3—或者h〇〇c_， η為8至25之間的整數。 本發明的另一較佳的實施方案是結構通式為 1KCHA-C0-的親脂性取代基和阢卜丨類似物c端的“ 胺基藉由醯胺鍵的方式連接，其中Ri選自CH3_或者h〇〇c_， • n為8至25之間的整數，較佳為14。 本發明的另一較佳的實施方案是G L P -1類似物的胺基 酸序列中 X,選自 L-fiiS、D-His;x2選自 Ala、D_A：[a、Gly、
Val Leu I le、Lys、Aib，X1Q 選自 Val、Leu ; X12 選自 Ser、
Lys ' Arg ; X13 選自 Tyr、Gln ; 選自 ^、μι 選自
Gly Glu Aib，X17選自 Gln、Glu、Lys、Arg;X19_Ala、 van x2。選自 Lys、Glu、Arg ; X2i 選自—、^ & 選自 Val、Lys;X27選自 Val、Lys;X28選自 X293Si Gly>Aib；X3〇iii ΑΓδ>〇1γ^78；Χ31ϋ^ Gly ^ Ala、Glu、Pro、Lys ; X32 選自 Lys、— ; χ33 選自 Lys、—；
Xs'選自Gly、Aia、Sar ; X35選自叫、—、s肛；-選自
Ser、Tyr。 更進一步的較佳的實施方案是GLP-1類似物的胺基酸 序列選自SEQ ID NO 1至12〇。 本發明的另一較佳的實施方案是結構通式為 95094 19 201225974
Ri(CH2)n-C0-的親脂性取代基與選自序列如SEQ ID No : 1 至120所示的GLP-1類似物的胺基酸殘基的胺基藉由醯胺 鍵的方式連接，其中h選自CH3-或者H00C-，η為8至25 之間的整數。 更進一步較佳的實施方案是結構通式為R! (CH2)n-C0-的親脂性取代基與選自序列如SEQ ID No : 1至120所示 的GLP-1類似物的C端Lys的ε胺基藉由醯胺鍵的方式連 接，其中Ri選自CH3-或者H00C-，n為8至25之間的整數。 更進一步較佳的實施方案是結構通式為R! (CH2)n-C0-的親脂性取代基與選自序列如SEQ ID No : 1至120所示 的GLP-1類似物的C端Lys的α胺基藉由醯胺鍵的方式連 接，其中R〗選自CH3-或者H00C-，n為8至25之間的整數， η 較佳為 8、10、12、14、16、18、20 或 22，η 進一步較 佳為14。 本發明的另一較佳的實施方案是結構通式為 R/CHOn-CO-的親脂性取代基與選自序列如SEQ ID No : 1 至20所示的GLP-1類似物的C端Lys的α:胺基藉由醯胺 鍵的方式連接，其中R!選自CH3-或者H00C-，η為8至25 之間的整數，η較佳為8、10、12、14、16、18、20或22, η進一步較佳為14。 本發明的另一較佳的實施方案是結構通式為 R/CHOn-CO-的親脂性取代基與選自序列如SEQ ID No : 1 至8所示的GLP-1類似物的C端Lys的α胺基藉由酿胺鍵 的方式連接，其中L選自CH3-，η為14。
S 20 95094 201225974 本發明提供的GLP-1類似物的衍生物屬於兩性化合 物，所屬領域技術人員經由公知技術可使用酸性或鹼性化 合物與之反應成鹽，通常採用的形成酸加成鹽的酸為： 鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、磷酸、對甲苯磺酸、 甲％酸、草酸、對溴苯基續酸、碳酸、玻珀酸、檸檬酸、 苯曱酸、乙酸；鹽包括硫酸鹽、焦硫酸鹽、三氟乙酸鹽、 亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、磷酸鹽、磷酸氫鹽、磷酸二氫鹽、 偏磷酸鹽、焦磷酸鹽、鹽酸鹽、溴化物、碘化物、乙酸鹽、 • 丙酸鹽、辛酸鹽、丙烯酸鹽、曱酸鹽、異丁酸鹽、己酸鹽、 庚酸鹽、丙炔酸鹽、草酸鹽、丙二酸鹽、丁二酸鹽、辛二 酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、丁炔_丨，4_二酸鹽、己炔_丨，6_ 二酸鹽、苯T酸鹽、氯苯甲酸鹽、曱基苯甲酸鹽、二硝基 苯甲酸鹽、經基苯曱酸鹽、曱氧基苯甲酸鹽、苯乙酸鹽、 苯丙酸鹽、苯丁酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、7 _羥基丁酸鹽、 甘醇酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽、丙磺酸鹽、萘-1-磺酸鹽、 鲁 $ 2 % g文鹽、扁桃酸鹽等，較佳為三氟乙酸鹽。驗性物質 也可以和GLP-1類似物的衍生物成鹽，這些驗性物質包括 叙驗金屬或驗土金屬的氫氧化物，以及碳酸鹽、碳酸氫 ^ z、里的有氫氧化鈉、氫氧化钟、氫氧化銨、碳酸納、 碳酸鉀等。 根據本發明的含有衍生物的醫藥組成物可以經 由胃腸外、七藥的方式用於治療需要這種治療的病人。胃腸 外給藥途徑可選擇皮下注射、肌肉注射或靜脈注射。本發 明的GLP-1衍生物還可以選擇透皮途徑給藥，如經貼劑頭 21 95094 201225974 皮給藥，可選擇離子透入貼劑；或經透黏膜途徑給藥。 本發明提供的GLP-1衍生物的醫藥組成物可以使用製 藥工業常規的技術製備，這些技術包括適當的溶解和混合 各組分以得到所需的最終組成物。比如將Glpm衍生物溶 解於-定量的水中，其中水的量稍小於所製備的組成物的 最終體積。按需要加入等滲劑、防腐劑、界面活性劑和緩 沖劑，等滲劑例如氣化鈉、甘露醇、甘油、丙二醇、糖或 糖醇。防腐劑例如笨酚、鄰甲酚、對曱酚、間曱酚、甲基 對經基苯曱酸酯、苄醇。適宜的緩衝劑如乙酸鈉、碳酸鈉、 甘胺酸、組胺酸、賴胺酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷 酸納。界面活性劑如泊絡沙姆、泊絡沙姆—188、泊絡沙姆 -407、吐溫-80、吐溫-20。並在需要時用酸如鹽酸、或鹼 如氫氧化鈉水溶液調節溶液的pH值，最後用水調節溶液體 積得到所需的組分濃度。除上述成分外，本發明提供的醫 藥組成物還包括足夠量的鹼性胺基酸或具有相同作用 性試劑用以減少組成物在貯存過程中形成的聚集體，比如 賴胺酸’、組胺酸、精胺酸、味。坐。 本發明供的GLP-1類似物的衍生物採用手工合成的 方法，樹脂為HMPA-AM resin，所用的胺基酸衍生物的α 胺基由Fmoc(芴甲醯羰基）保護，半胱胺酸侧鏈酼基、榖胺 醯胺侧鏈胺基、組胺酸側鏈咪唑基由Trt(;三苯曱基）保護、 精胺酸側鏈胍基由Pbf(2, 2, 4, 6, 7-五曱基二氫化苯並呋 喃-5-續醯基）保護，色胺酸側鏈吲哚基、賴胺酸側鏈胺基 由Boc(叔丁氧羰基）保護，蘇胺酸側鏈羥基、酪胺酸側鏈 22 95094 201225974 苯酚基、絲胺酸侧鏈羥基由tBu(叔丁基）保護。將所要入 成之促紅細胞生成素模擬肽衍生物單體肽肽鏈的C末端胺 基酸的敌基以共價鍵的結構與高分子的不溶性樹脂（^ nk amind resin)相連，然後以此結合在固相載體上的胺基酸 作為胺基組份經過2 0 %六氫π比咬/DMF溶液脫去胺基保護 基’然後和過量的胺基酸衍生物反應，接長肽鏈。重複（縮 .合—洗滌—去保護—洗滌〜下一輪縮合）操作，達到所要入 成的肽鏈長度，最後用三氟乙酸：水：乙二硫醇：三異两 鲁基石夕烧-9 2 · 5 . 2. 5 . 2. 5 ’ 2. 5混合溶液將狀鍵從樹脂上裂 解下來’經乙醚沉降得到GLP-1類似物的衍生物粗品，單 體狀粗品使用C18反相製備柱分離純化’即得所要的1 類似物的衍生物。其中縮合和去保護反應步驟的中間控制 採取的是茚三酮檢測的方法，即當樹脂肽鏈上有游離的胺 基時，經茚三酮試劑檢測會顯藍色，沒有游離胺基時不顯 色（％>二g同試劑本身為育色）。因此在進行縮合反應完畢後, 籲通過茚三酮檢測，如果顯黃色（茚三酮試劑本身的顏色）， 則說明本步驟偶合完畢可以進行下一個胺基酸的偶合前的 脫保護操作，如果顯藍色，則證明肽鏈上還有些游離胺基， 需進一步的重複偶合或改變現有的縮合劑直至樹脂肽^節 三酮檢測為黃色。 【實施方式】 #為了更詳細地說明本發明’給出下列實例。但本發明 的範圍並非限定於此。 實施例一 HS-20001的固相合成方法 95094 23 201225974 1、Fmoc-Lys(Mtt)-HMP-AM 樹脂的製備 (1) HMP-AM樹脂的乾燥及溶脹 稱量真空乾燥24h的HMP-AM樹脂（〇. 6mmol/g) 50g (30mmol)置於2L鼓泡瓶中，加入5〇〇mL N，N-二曱基曱醯 胺（DMF)溶脹樹脂30min，抽掉DMF溶液，加入DMF洗滌 lmin，重複洗條2次。 (2) Fmoc-Lys(Mti:)-HMP-AM 樹脂的製備 ① Fmoc-Lys(Mtt)-〇H與HMP-M樹脂的偶合 用500mL DCM洗務樹脂1次，重複2次，稱取
Fmoc-Lys(Mtt)-0H 56. 2g (90minol)和 DIC11. 4g (90mmol)， 加入1L DCM溶解，加入到溶脹後的HMP-AM樹脂中，之後 加入 DMAP 366mg(3mmol)，反應 24h ; ② 樹脂的洗務 反應結束後用DMF、IPA交替洗滌樹脂肽兩次，DMF洗 條3次； ③ 羥基的封閉 稱取乙酸肝 15. 3g (150mmol)和 DIEA 19. 4g (150mmol) 溶解於1L DMF中，加入到樹脂中，反應lOmin ; ④ 樹脂的洗滌 依次用1 L 50% MeOH/DMF、50% DCM/DMF洗滌樹脂兩 次，DCM洗滌樹脂3次，無水乙醇洗滌3次，減壓乾燥’ 得 Fmoc-Lys(Mt1;)-HMP-AM 樹脂。 (3) Fmoc-Lys(Mtt)-HMP-AM 樹脂載量測定
精確稱量5至10 mg樹脂定容在lmL 20%六氫11比咬/DMF 5 24 9^094 201225974 中，攪勻20min後，移液搶取出上清液50uL溶解在2. 5mL DMF 中； 空白樣品：移液槍取出50uL 20%六氫吡啶/DMF溶解 在 2. 5mL DMF 中； 取代度計算公式如下：
Sub=(Ax51)/(7. 8xm) 其中，A為301nm紫外吸光值；m為樹脂品質，單位 mg 0 φ 2、固相合成樹脂的乾燥及溶脹 稱量真空乾燥24h的Fmoc-Lys(Mtt)-HMPA-AM樹脂 (0· 4mmol/g) 50g (20mmol)置於 2L 鼓泡瓶中，加入 5〇〇社 N，N-二甲基甲醯胺（DMF)溶脹樹脂30min，抽掉DMF溶液。 3、 Fmoc-Lys(Mtt)-HMPA-AM 樹脂脫除 4-曱基三苯曱基 保護基 用200mL DCM洗蘇樹脂，重複1次，加入i2〇〇mL 1% TFA/DCM(TFA約8倍過量）脫除Mtt保護基，反應時間lh， 用200inL 5/ό N, —異丙基乙胺（DIEA)/DMF和DMF交又洗 蘇3次，DMF洗務3次。 4、 棕橺酸的縮合 稱量棕櫊酸和3-(二乙氧基磷醯氧基）-i，2, 3-苯並三 嗪-4-酮（DEPBT)各50mmol，加入400mLDMF溶解，再加入 lOOmmol DIEA於室溫攪拌反應3min，將上述溶液加入到樹 脂中，37度水浴下通入沁反應2h。反應結束後抽掉反應液， 依次用DMF、異丙醇（IPA)和DMF洗滌樹脂。 95094 25 201225974 5、 Fmoc-Lys(N-e -棕櫚酸）-HMPA-AM樹脂脫除9-芴曱氧羰 基（Fmoc)保護基 向裝有Fmoc-Lys(Mtt)-HMPA-AM樹脂的鼓泡瓶中加入 200mL 20%六氫°比咬/DMF溶液，反應5min後抽出，再加入 200mL 20%六氫吡啶/DMF溶液室溫反應20min。反應結束後 用DMF 200mL洗滌樹脂4次。 6、 HS-20001肽鏈部分的固相合成
① 縮合 Fmoc-Ser(tBu)-OH 稱量 50mmol Fmoc-Ser(tBu)-〇H，加入 125mL 0.4M 卜 羥基苯並三氮唑（H0Bt)/DMF溶解，再加入125mL 0.4MN，N’ -二異丙基碳二亞胺（DIC)/DCM於室溫活化反應lOmin;將上 述溶液加入到樹脂中，於室溫通入N2反應，採用茚三酮檢 測中控反應進行程度。反應結束後抽掉反應液，依次用 DMF、IPA和DMF洗滌樹脂。 ② 肽鏈的延長 按照HS-20001肽鏈部分從胺基端（N-端）到羧基端（C-端）的順序 (His-(D)-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-L ys-Gln-Nle-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu -Trp-Leu-Lys-Gln-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-P ro-Pro-Ser)，胺基酸和縮合試劑的用量和 Fmoc-Ser(tBu)-0H相同，保護胺基酸分別是 Fmoc-Ser(tBu)-OH 、 Fmoc-Pro-OH 、 Fmoc-Ala-ΟΗ 、 Fmoc-Gly-OH 、 Fmoc-Gln(Trt)-OH 、 Fmoc-Lys(Boc)-0H 、 s 26 95094 201225974
Fmoc-Leu-〇H 、 Fmoc-Trp(Boc)-〇H 、 Fmoc-Glu(0tBu)-0H 、 Fmoc-Ile-OH 、 Fmoc-Phe-OH 、 Fmoc-Arg(Pbf)-OH 、 Fmoc-Val-OH ' Fmoc-Nle-OH ' Fmoc-Asp(0tBu)-0H ' Fmoc-Thr(tBu)-OH 、 Fmoc-D-Ala-OH 和 Fmoc-His(Trt)-OH，重複縮合和脫保護2步反應，合成 HS-20001樹脂肽。 ③ HS-20001樹脂肽的後處理 將②所得到的HS-20001樹脂肽依次用DMF、IPA和DMF • 洗滌樹脂’用無水乙醚洗滌2次後真空乾燥，得HS-20001 樹脂肽。 ④ HS-20001粗品肽的製備 取乾燥後的HS-20001樹脂肽，加入新鮮配製的 10mL/(g樹脂肽）的三氟乙酸（TFA):三異丙基矽烷（TIS): 水=95 : 2. 5 : 2. 5(體積比）的裂解液，於室溫反應4h。反 應結束後過濾，用TFA洗滌樹脂2次，收集併合並濾液， 旋轉蒸發至原體積的1/3，攪拌下加入到大量冰的無水乙 醚析出HS-20001 ’離心後真空乾燥得白色HS_20001粗品。 ⑤ HS-20001的逆相液相色譜製備 取HS-20001粗品i〇g溶於一定量水中，後經〇 45#m 膜過濾後用逆相高效液相色譜（Rp_HpLC)進行分離，流動相 為 A 0. l%TFA/H2〇，B 0· 1%TFA/乙猜， 其中，色δ晋柱為Denal i c~18柱（粒徑8. 3 /z m， 5x30cm)，柱溫45度，檢測波長22〇nm，流速12〇mL/min。 收集產物峰，減壓濃縮除去大部分乙腈後凍乾得HS_2〇〇〇1 27 95094 201225974 成品 2. 25g，純度 98. 5%，收率 22. 5°/〇。 實施例二 HS-20002的固相合成方法 1、 Fmoc-Lys(Mtt)-HMP-AM 樹脂的製備 參見實施例一。 2、 固相合成樹脂的乾燥及溶脹 稱量真空乾燥24h的Fmoc-Lys(Mtt)-HMPA-AM樹脂 (0. 4mmol/g) 50g (20mmol)置於 2L 鼓泡瓶中，加入 50〇此 DMF溶脹樹脂30min，抽掉DMF溶液。 3、 Fmoc-Lys(Mtt)-HMPA-AM 樹脂脫除 Mtt 保護基 用200mL DCM洗滌樹脂，重複一次，加入1200mL 1% ^ TFA/DCM (TFA約8倍過量）脫除Mtt保護基，反應時間lh， 用200mL 5% DIEA/DMF和DMF交叉洗滌3次，DMF洗務3 次。 4、 棕櫚酸的縮合 稱量棕櫚酸和DEPBT各50mmol，加入400mLDMF溶解， 再加入lOOmmol DIEA於室溫攪拌反應3min，將上述溶液加 入到樹脂中，37度水浴下通入N2反應2h。反應結束後抽掉 φ 反應液，依次用DMF、IPA和DMF洗滌樹脂。 5、 Fmoc-Lys(N-e -棕櫚酸）-HMPA-AM 樹脂脫除 Fmoc 保護 基 向裝有Fmoc-Lys(Mtt)-HMPA-AM樹脂的鼓泡瓶中加入 200mL 20%六氫吡啶/dmf溶液，反應5min後抽出，再加入 200mL 20°/。六氫吡啶/MF溶液室溫反應20min。反應結束後 用DMF 200mL洗滌樹脂4次。 28 95094 5 201225974
6、HS-20002肽鏈部分的固相合成 ①縮合 Fmoc-Ser(tBu)-0H
稱量 50mmol Fmoc-Ser(tBu)-〇H，加入 125mL 0.4M HOBt/DMF溶解，再加入125mL 0.4M DIC/DCM室溫下活化 反應lOmin ;將上述溶液加入到樹脂中，於室溫通入]\}2反 應，採用節三酮檢測中控反應進行程度。反應結束後抽掉 反應液，依次用DMF、IPA和DMF洗滌樹脂。 ②肽鏈的延長 按照HS-20002肽鏈部分從胺基端（N-端）到羧基端（c-端）的順序 (His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-G ln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp -Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-P ro-Ser)，胺基酸和縮合試劑的用量和Fmoc-Ser(tBu)-OH 相同，保護胺基酸分別是Fmoc-Ser(tBu)-0H、
Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Asn(Trt)-0H 、 Fmoc-Lys(Boc)-0H 、 Fmoc-Leu-OH 、 Fmoc-Trp(Boc)-0H 、 Fmoc-Glu(0tBu)-0H 、 Fmoc-Ile-OH 、 Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-〇H、Fmoc-Va卜OH、 Fmoc-Met-OH 、 Fmoc-Gln(Trt)-〇H 、 Fmoc-Asp(0tBu)-0H 、 Fmoc-Thr(tBu)-0H 和 Fmoc-His(Trt)-0H，重複縮合和脫保 護兩步反應，合成HS-20002樹脂肽。 ③HS-20002樹脂肽的後處理
將0所得到的HS-20002樹脂肽依次用DMF、IPA和DMF 29 95094 201225974 洗滌樹脂，用無水乙醚洗滌兩次後真空乾燥，得HS-20002 樹脂狀。 ④ HS-20002粗品肤的製備 取乾燥後的HS-20002樹脂肽，加入新鮮配製的 10mL/(g 樹脂肽）的 TFA: TIS:水：1，2-乙二硫醇（EDT)=94 : 1 : 2. 5 : 2· 5(體積比）的裂解液，於室溫反應4h。反應結 束後過濾’用TFA洗滌樹脂2次，收集併合並濾液，旋轉 蒸發至原體積的1/3 ’攪拌下加入到大量冰的無水乙醚析 出HS-20002，離心後真空乾燥得白色HS-20002粗品。 ⑤ HS-20002的逆相液相色譜製備 取HS-20002粗品l〇g溶於一定量的水中，後經 0、 45//m膜過濾後用逆相高效液相色譜（Rp_HPLC)進行分 離，流動相為A 0. l%TFA/H2〇，B 0. 1%TFA/乙腈，其中， 色譜柱為 Denali C-18 柱（粒徑 8. 3μιη，5x30cm)，柱溫 45 度，檢測波長220nm，流速i20mL/miii。收集產物峰，減壓 濃縮除去大部分乙腈後凍乾得HS_2〇〇〇2成品2. lg，純度 98.%，收率 20. 5%。 實施例三HS-20003的固相合成方法 1、 Fmoc-Lys(Mtt)-HMP-AM 樹脂的製備 參見實施例一。 2、 固相合成樹脂的乾燥及溶脹 稱 1 真空乾燥 24h 的 Fmoc_LyS(Mtt)-HMPA-AM 樹脂 (0.4nimol/g) 50g (20随〇1)置於2L鼓泡瓶中，加入 500mLDMF溶脹樹脂30rain，抽掉DMF溶液； 30 95094 201225974 3、 Fmoc-Lys(Mtt)-HMPA-AM 樹脂脫除 Fmoc 保護基 向裝有Fmoc-Lys(Mtt)-HMPA-AM樹脂的鼓泡瓶中加入 200mL 20%六氫吡啶/DMF溶液，反應5min後抽出，再加入 200mL 20%六氫吡啶/DMF溶液室溫反應20min。反應結束後 用DMF 200mL洗條樹脂4次。 4、 棕櫚酸的縮合 稱量棕櫚酸和DEPBT各50mmol，加入400mLDMF溶解， 再加入lOOmmol DIEA於室溫攪拌反應3min，將上述溶液加 • 入到樹脂中’於37度水浴中通入N2反應2h。反應結束後抽 掉反應液’依次用DMF、IPA和DMF洗滌樹脂。 5、 棕櫚酸-Lys(Mtt)-HMPA-AM樹脂脫除Mtt保護基 用20OmL DCM.洗務樹脂，重複一次，加入l200inL 1%TFA/DCM(TFA約8倍過量）脫除Mtt保護基，反應時間 lh ’用200mL 5%DIEA/DMF和DMF交叉洗滌3次，DMF洗滌 3次。 6、 HS-20003肽鏈部分的固相合成
① 縮合 Fmoc-Ser(tBu)-〇H 寿冉置 Finoc_Ser(tBu)-0H 和 DEPBT 各 50ηππο1，加入一 定量DMF溶解，再加入l〇〇mm〇i DIEA於室溫活化3min， 將上述溶液加入到樹脂中，於室溫通入N2反應，採用茚三 酮檢測中控反應進行程度。反應結束後抽掉反應液，依次 用DMF、IPA和DMF洗滌樹脂。 ② 肽鏈的延長 才女照HS-20003狀鍵部分從胺基端（N-端）到叛基端（c- 31 95094 201225974 端）的順序 (His-(D)-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-S er-Tyr-Leu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ala-Lys-Glu-Ph6-11 e-Ala -Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-P ro-Pro-Ser)，胺基酸和縮合試劑的用量和 Fmoc-Ser(tBu)_0H相同，保護胺基酸分別是 Fmoc-Ser(tBu)-0H、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、
Fmoc-Gly-OH 、 Fmoc-Arg(Pbf)-0H 、 Fmoc-Val-〇H 、
Fmoc-Leu-〇H 、 Fmoc-Trp(Boc)-0H 、 Fmoc-Ile-OH 、 籲
Fmoc-Phe-〇H、Fmoc-Glu(0tBu)-0H、Fmoc-Lys(Boc)-0H、 Fmoc-Tyr(tBu)-〇H、Fmoc-Asp(0tBu)-0H、
Fmoc-Thr(tBu)-0H 、 Fmoc-D-Ala-OH 和 Fmoc-His(Trt)-0H，重複縮合和脫保護兩步反應，合成 HS-20003樹脂狀。 ③ HS-20003樹脂肽的後處理 將②所得到的HS-20003樹脂肽依次用DMF、IPA和DMF 洗滌樹脂’用無水乙醚洗滌兩次後真空乾燥，得HS-20003 ⑩ 樹脂肽。 ④ HS-20003粗品肽的製備 取乾燥後的HS-20003樹脂肽，加入新鮮配製的 10mL/(g 樹脂肽）的 TFA : TIS :水=95 : 2.5 : 2.5(體積比） 的裂解液，於室溫反應4h。反應結束後過濾，用TFA洗滌 樹脂2次，收集併合並濾液，旋轉蒸發至原體積的1/3， 攪拌下加入到大量冰的無水乙醚析出HS-20003，離心後真
J 32 95094 201225974 空乾燥得白色HS-20003粗品。 ⑤HS-20003的逆相液相色譜製備 取HS-20003粗品10g溶於一定量的20%乙酸/水中攪 拌不少於4h，後經0.45//m膜過濾後用逆相高效液相色譜 (RP-HPLC)進行分離’流動相為 a 〇. l%TFA/H2〇，B 0. 1VTFA/ 乙腈，其中’色譜柱為Denali C-l 8柱（粒徑8. 3/zm， 5x30cm) ’柱溫45度’檢測波長220nm，流速120mL/min。 收集產物峰’減壓濃縮除去大部分乙腈後凍乾得HS-20003 φ 成品2. 5g，純度98. 5% ’收率25%。 實施例四HS-20004的固相合成方法 1、 Fmoc-Lys(Mtt)-HMP-AM 樹脂的製備 參見實施例一。 2、 固相合成樹脂的乾燥及溶脹 稱量真空乾燥24h的Fmoc-Lys(Mtt)-HMPA-AM樹脂 (0. 4mmol/g) 50g (20mmol)置於 2L 鼓泡瓶中，加入 500mL DMF溶脹樹脂30min，抽掉DMF溶液； ® 3、Fmoc-Lys(Mtt)-HMPA-AM 樹脂脫除 Fmoc 保護基 向裝有Fmoc-Lys(Mtt)-HMPA-AM樹脂的鼓泡瓶中加入 200mL 20%六氫吡啶/DMF溶液，反應5min後抽出，再加入 200mL 20%六氫吡啶/DMF溶液室溫反應20min。反應結束後 用DMF 200mL洗滌樹脂4次。 4、棕櫊酸的縮合 稱量棕撋酸和DEPBT各50mmol，加入400mLDMF溶解， 再加入lOOmmol DIEA於室溫攪拌反應3min，將上述溶液加 33 95094 201225974 入到樹脂中，於37度水浴中通入N2反應2h。反應結束後抽 掉反應液，依次用DMF、IPA和DMF洗滌樹脂。 5、 棕櫚酸-Lys(Mtt)-HMPA-AM樹脂脫除Mtt保護基 用200mL DCM洗滌樹脂’重複一次，加入；[2〇〇mL 1% TFA/DCM(TFA約8倍過量）脫除Mtt保護基，反應時間lh， 用200mL 5%DIEA/DMF和DMF交叉洗滌3次，DMF洗滌3次。 6、 HS-20004肽鏈部分的固相合成
① 縮合 Fmoc-Ser(tBu)-0H 稱里 Fmoc_Ser(tBu)_0H 和 DEPBT 各 50minol，加入· 定量DMF溶解，再加入i〇〇mm〇i dieA於室溫活化3min， 將上述溶液加入到樹脂中，於室溫通入N2反應，採用茚三 酮檢測中控反應進行程度。反應結束後抽掉反應液，依次 用DMF、IPA和DMF洗滌樹脂。 ② 肽鏈的延長 按照HS-20004肽鏈部分從胺基端（N-端）到羧基端（C-端）的順序 (His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-T yr-Leu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp -Leu-Val-Arg-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-P ro-Ser) ’胺基酸和縮合試劑的用量和Fmoc-Ser(tBu)-0H 相同’保護胺基酸分別是Fmoc-Ser(tBu)-0H、
Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Arg(Pbf)-〇H 、 Fmoc-Va卜OH 、 Fmoc-Leu-〇H 、 Fmoc-Trp(Boc)-0H 、 Fmoc-Ile-OH 、 Fmoc-Phe-OH 、 34 95094 201225974
Fmoc-Glu(0tBu)-0H ' Fmoc-Lys(Boc)-0H ' Fmoc-Tyr(tBu)-〇H、Fmoc-Asp(0tBu)-0H、 Fmoc-Thr(tBu)-0H 、 Fmoc-Aib-OH 和 Fmoc-His(Trt)-0H ， 重複縮合和脫保護兩步反應，合成HS-20004樹脂肽。 ③ HS-20004樹脂肽的後處理 將②所得到的HS-20004樹脂肽依次用DMF、IPA和DMF 洗滌樹脂，用無水乙醚洗滌兩次後真空乾燥，得HS-20004 樹脂肽。 ④ HS-20004粗品肽的製備 取乾燥後的HS-20004樹脂肽，加入新鮮配製的 10mL/(g 樹脂肽）的 TFA : TIS :水=95 : 2. 5 : 2. 5(體積比） 的裂解液，於室溫反應4h。反應結束後過濾，用TFA洗滌 樹脂2次，收集併合並濾液，旋轉蒸發至原體積的1/3， 攪拌下加入到大量冰的無水乙醚析出HS-20004,離心後真 空乾燥得白色HS-20004粗品。 ⑤ HS-20004的逆相液相色譜製備 取HS-20004粗品10g溶於一定量的2〇%乙酸/水中攪 拌不少於4h ’後經0. 45//m膜過濾後用逆相高效液相色譜 (RP-HPLC)進行分離’流動相為 a 〇. i%TFA/H2〇，B 0. UTFA/ 乙腈，梯度如下： 其中，色譜柱為Denali C-18柱（粒徑8.3" m， 5x30cm) ’柱溫45度，檢測波長22〇nm，流速i2〇mL/min。 收集產物峰，減壓濃縮除去大部分乙腈後凍乾得HS_2〇〇〇4 成品2· 25g ’純度98· 5%，收率22 5%。 35 95094 201225974 實施例五 HS-20005的固相合成 製備方法同實施例四，不同之處是將胺基酸序列變換 為 SEQ ID N0 : 5，得 HS-20005 成品 2. 5g，純度 98. 5%， 收率25%。 實施例六 HS-20006的固相合成 製備方法同實施例四，不同之處是將胺基酸序列變換 為 SEQ ID N0 : 6，得 HS-20006 成品 2. 25g，純度 98. 5%， 收率22. 5%。 實施例七 HS-20007的固相合成 製備方法同實施例四，不同之處是將胺基酸序列變換 為 SEQ ID N0 : 7，得 HS-20007 成品 2_ lg，純度 98%，收 率 20. 5%。 實施例八 HS-20008的固相合成 製備方法同實施例四，不同之處是將胺基酸序列變換 為 SEQ ID N0 : 8，得 HS-20008 成品 2. 5g，純度 98. 5%， 收率25%。 參考例 Liraglutide的固相合成 1、Fmoc-Lys(Mtt)-HMP-AM 樹脂的製備 (1) HMP-AM樹脂的乾燥及溶脹 稱量真空乾燥24h的HMP-AM樹腊（0.6mmol/g) 50g (30mmol)置於2L鼓泡瓿中，加入500mL N, N-二曱基曱醯 胺（DMF)溶脹樹脂30min，抽掉DMF溶液，加入DMF洗務 lmin，重複洗務2次。 (2) Fmoc-Lys(Mtt)-HMP-AM 樹脂的製備
S 36 95094 201225974 ① Fmoc-Lys(Mtt)-〇H 與 HMP-AM 樹脂的偶合 用500mL DCM洗條樹脂1次，重複2次，稱取 Fmoc-Lys(Mtt)-0H 56. 2g (90mmol)和 DIC11. 4g (9〇酿〇1)， 加入1L DCM溶解，加入到溶脹後的HMP-AM樹脂中，之後 加入 DMAP 366mg (3_〇1)，反應 24h ; 0樹脂的洗滌 反應結束後用DMF、IPA交替洗滌樹脂肽2次，DMF洗 務3次； • ③羥基的封閉 稱取乙酸針 15. 3g (150mmol)和 DIEA 19. 4g (i5〇mm〇i) 溶解於1L DMF中，加入到樹脂中，反應lOmin ; ④樹脂的洗滌 依次用 1 L 50°/〇MeOH/DMF、50%DCM/DMF 洗滌樹月旨 2 二欠， DCM洗條樹脂3次，無水乙醇洗蘇3次，減壓乾燥，得 Fmoc-Lys(Mtt)-HMP-AM 樹脂。
(3)Fmoc-Lys(Mtt)-HMP-AM 樹脂載量測定 泰 精確稱量5〜10 mg樹脂定容在lmL 20%六氫吼咬/DMF 中’攪勻20min後’移液搶取出上清液50uL溶解在2. 5mL DMF 中； 空白樣品：移液槍取出50uL 20%六氫吡啶/DMF溶解 在 2. 5mL DMF 中； 取代度計算公式如下：
Sub=(Ax51)/(7. 8xm) 其中，A為301nm紫外吸光值；m為樹脂品質，單位 37 95094 201225974 mg ° 2、 固相合成樹脂的乾燥及溶脹 稱量真空乾燥24h的Fmoc-Gly-HMP-AM樹脂 (〇.4mmol/g) 50g (20mmol)置於 2L 鼓泡瓶中，加入 5〇〇亂 N，N-二甲基甲醯胺（DMF)溶脹樹脂3〇min，抽掉DMF溶液。 3、 Liraglutide肽鍵部分的固相合成
① 縮合 Fmoc-Arg(Pbf)-0H 稱量 50mmol Fmoc-Arg(Pbf)-〇H，加入 125mL 0.指 1-經基苯並三氮唑（H0Bt)/DMF溶解，再加入i25mL 0. 4M N，N，-二異丙基碳二亞胺（DIC)/DCM於室溫活化反應i〇min;將上 述溶液加入到樹脂中，於室溫通入Nz反應，採用茚三酮檢 測中控反應進行程度。反應結束後抽掉反應液，依次用 DMF、IPA和DMF洗滌樹脂； ② 肽鏈的延長 按照Liraglutide肽鏈部分從羧基端（〇端）到胺基端 (N-端）的順序 (His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-T yr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp -Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly)，胺基酸和縮合試劑的用量和 Fmoc-Arg(Pbf)-OH相同，保護胺基酸分別是 Fmoc-Arg(Pbf)-0H、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、
Fmoc-Trp(Boc)-〇H、Fmoc-Ala-〇H、Fmoc-Ile-OH、 Fraoc-Phe-OH ' Fmoc-Glu(0tBu)-0H ' Fmoc-Lys(Mtt)-OH ' Fmoc-Gln(Trt)-OH 、 Fmoc-Tyr(tBu)-0H 、 s 38 95094 201225974
Fmoc-Ser(tBu)-0H 、 Fmoc-Asp(OtBu)-〇H 、
Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-0H，重複縮合和脫保 護兩步反應，合成Liraglutide前體肽； ③ Liraglutide前體肽中Mtt保護基的脫除 用200mL DCM洗滌樹脂，重複一次，加入1200mL 1% TFA/DCMCTFA約8倍過量）脫除Mtt保護基，反應時間lh， 重複1次，用200mL 5%N，N-二異丙基乙胺（DIEA)/DMF和 DMF交叉洗滌3次，DMF洗滌3次； ④ 棕櫊酸修飾Liraglutide前體肽 稱量 50mmol Fmoc-Glu-OtBu，加入 125mL 0.4M 1-經 基苯並三氮唑（H0Bt)/DMF溶解，再加入125mL 0. 4M N，N，-二異丙基碳二亞胺（DIC)/DCM於室溫活化反應lOmin;將上 述溶液加入到樹脂中，於室溫通入N2反應，採用茚三酮檢 測中控反應進行程度。反應結束後抽掉反應液，依次用 DMF、IPA和DMF洗滌樹脂； 加入1 L 20%PIP/DMF脫除Fmoc保護基5min，抽乾， 再加入1 L 20% PIP/DMF脫除Fmoc保護基20min，抽乾， 用DMF洗務樹脂4次； 稱量棕櫚酸和3-(二乙氧基磷醯氧基）-1，2, 3-苯並三 °秦-4-酮（DEPBT)各50mmol，加入400mLDMF溶解，再加入 lOOmmol DIEA於室溫攪拌反應3min，將上述溶液加入到樹 脂中，於37度水浴中通入N2反應2h。反應結束後抽掉反應 液。 4、Liraglutide樹脂肽的後處理 39 95094 201225974 將（2)所知到的Liraglutide樹脂肽依次用DMF、IPA 和DMF洗滌，用DCM洗滌3次、無水乙醚洗滌2次後真空 乾燥，得Liraglutide樹脂肽。 5、 Liraglutide粗品肽的製備 取乾燥後的Liraglutide樹脂肽，加入新鮮配製的 10mL/(g樹月日肽）的三氟乙酸（TFA):三異丙基矽烷（TIS): 水=95 : 2. 5 : 2.5(體積比）的裂解液，於室溫反應4h。反 應結束後過濾，用TFA洗滌樹脂2次，收集併合並濾液， 旋轉蒸發至原體積的1/3，攪拌下加入到大量冰無水乙醚 析出Liraglutide，離心後真空乾燥得白色Liraglutide 粗品。 6、 Liraglutide的逆相液相色譜製備 取Liraglutide粗品i〇g溶於一定量nh4hc〇3溶液中， 後經0. 45/zm膜過濾後用逆相高效液相色譜（RP-HPLC)進 行分離，流動相為A 〇. l%TFA/H2〇，B 0. 1%TFA/乙腈，其 中’色譜柱為Denali C-18柱（粒徑8. 3/zm，5x30cm)，柱 溫45度’檢測波長220nm’流速120mL/min。收集產物峰， 減屋濃縮除去大部分乙腈後凍乾得Liraglutide成品 1. 25g，純度 98 %，收率 12. 5%。 試驗例一：檢測化合物對類升糖素肽1受體（GLP1R)的激 動活性 GLP1R是與Gs蛋白偶聯的受體，當受體與激動劑結合 時會導致細胞内cAMP濃度升高。本實驗在HEK293細胞中 共轉染GLP1R和cAMP反應元件調控的螢光素酶報告基因質 40 95094 201225974 體’當化合物與受體結合並啟動受體時，冑光素酶表達就 會增加。通過對螢光素酶活性的檢測即可獲知化合物對 GLP1R的激動狀況。 受試藥物：編號 質量（mg) DMSO(ul) $1¾ 度（mM) 利拉魯肽 2 53. 31556 10 HS-20001 2 43. 81871 ___ 10 HS-20002 2 43. 91502 ___10 HS-20003 2 44.99387 ___ 10 HS-20004 2 44.8526 10 HS-20005 2 43.81871 10 HS-20006 2 43.91502 __ 10 HS-20007" 2 44.99387 ___ 10 HS-20008 2 44.8526 10 實驗步驟： 1 ·將穩定轉染GLP1R和pCRE-Luc質體的HEK293細 胞以4萬個/孔/100// 1的密度種入96孔板，在37°C培育 24h。 ' 2 ·加入一定濃度梯度的化合物（每個濃度為3重複 孔）或陽性藥劑’在37°C培育5h。溶劑DMSO為陰性對照。 3 ·每孔取出50//1培養基’加入50//1螢光素酶基 質，振盪lOmin。 4 ·取出80# 1反應液加入到白色的96孔板中，在 Invision酶標儀上檢測。 實驗結果：與陽性化合物利拉魯肽（liraglutide)相 比，本發明化合物HS-20001與其活性相當，而HS-20002 至20008顯示了更好的激動活性。 41 95094 201225974 表1.系列化合物合物ECsd值列表： 化合物 EC5〇(nM) 95%可信度 (nM) 最大反應率 (%) 利拉魯肽 0.014707 9.726e_012 至 2.223e-011 96.84616 HS-20001 0·013552 7.6757e-012 至 2.3963e-011 98.11013 HS-20002 0.0014145 1.2036e-012 至 1.6623e-012 87.99447 HS-20003 0. 00071876 4. 9657e-013 至 1.0404e-012 87. 86082 HS-20004 0.00037259 2.1453e-013 至 6.4710e-013 90.81368 HS-20005 0.00023552 7, 3567e-012 至 2.2346e-011 89. 13468 HS-20006 〇.00064358 1.3581e-012 至 1.4523e-012 87.4281 HS-20007 〇. 00054921 4. 1354e-013 至 1.2514e-012 87.0389 HS-20008 〇.00021002 2.2436e-013 至 6.0245e-013 88.4628 試驗例二、體内活性測試 將2型糠尿病db/db小鼠根據隨機血糖和體重分為6 組’每組8隻，分別皮下單次注射生理鹽水、3或i〇)Llg/kg HS系列新化合物（利拉魯肽、2〇〇〇1、2〇〇〇2、2〇〇〇3、2〇〇〇4、 2005、2006、2007、2008)。於給藥後不同時間測定小鼠隨 機血糖。 又5式動物為db/db小鼠，引種於美國Jacks〇n公司， 由中國科學院上海藥物研究所保種和繁瘦，合格證號： 42 95094 201225974 SCXK(滬）2008-0017，體重：35-50g，性別：雄性 85 隻、 雌性86隻，經SPF級動物房飼養，溫度：22至24°C，濕 度：45至80%，光照：150至300Lx，12h晝夜交替。 受試藥物為 HS-20001、HS-20002、HS-20003、HS-20004、 HS-20005、HS-20006、HS-20007、HS-20008、利拉魯肽 (1 iraglut ide，諾和諾德公司開發，作為陽性對照）。 配製方法：取2mg/瓶的化合物1瓶，用雙重蒸德水完 全溶解，配成2mg/m 1的無色透明溶液，然後用生理鹽水（氯 φ 化鈉注射液，安徽雙鹤藥業有限責任公司，批號：080728 6C) 稀釋至0. 6、2 /z g/m 1。血糖測定使用羅氏優越型血糖儀 ACCU-CHEK® Advantage 。 劑量設置與組別 試驗1組： 空白對照組：生理鹽水 利拉魯肽組：3 // g/kg HS-20001 組：3//g/kg _ HS-2_2 組：3//g/kg HS-20003 組：3/zg/kg HS-20004 組：3#g/kg HS-20005 組：3//g/kg HS-20006 組：3 /z g/kg HS-20007 組：3/zg/kg HS-20008 組：3 // g/kg 43 95094 201225974 試驗2組： 空白對照組：生理鹽水 利拉魯肽組：10#g/kg HS-20001 組：10/zg/kg HS-20002 組：10/zg/kg HS-20003 組：10#g/kg HS-20004 組：10/zg/kg HS-20005 組：10//g/kg HS-20006 組：10//g/kg HS-20007 組：10#g/kg HS-20008 組：lOvg/kg 給藥途徑和容積：單次皮下注射給藥，給藥容積為 5ml/kg ° 試驗方法 2型糖尿病db/db小鼠的篩選、分組和給藥 試驗1組· 171隻db/db小鼠（雄性85隻、雌性86隻），斷奶後 單蘢飼養，以高脂飼料傲養。db/db小鼠滿7周齡後預測 隨機和空腹血糖，挑選發病的80隻db/db小鼠，根據隨機 血糖、空腹血糖和體重將小鼠分為10組。分別為模型對照 組、利拉魯肽-3/zg/kg、HS-20001-3 /zg/kg、HS-20002-3 β g/kg ' HS-20003-3 β g/kg > HS-20004-3 μ g/kg ' HS-20005-3 /zg/kg ' HS-20006-3 /z g/kg ' HS-20007-3 /Z g/kg、HS-20008-3 # g/kg 組。 95094 201225974 试驗2組： db/db小执預測隨機血糖，挑選發病的隻北/北小 鼠，根據隨機血糖、和體重將小鼠分為1〇組。分別為模型 對照組、利拉魯肽-lOyg/kg、HSjOOOl-iOwg/kg HS-20002-10 # g/kg、HS-20003-10 从 g/kg、HS-20004-10 #g/kg、HS-20005-lOpg/kg、HS-20006-10 /zg/kg、 HS-ZOOOMO/zg/kg、HS-20008-10 /zg/kg 組。 每組小鼠8隻，雌雄各半。各組動物分別單次皮下注 • 射給予受試物或溶劑對照，於給藥後1、2、4、8h及24h 測定隨機血糖，並計算血糖下降率； 血糖下降率一（對照組灰糖_給藥組血糖）/對照組金 糖xlOO%。 試驗結果 試驗1:低劑量新化合物單次給藥對db/db小鼠隨機 血糖的影響 癱 結果見表2、3。db/db小鼠單次皮下注射3/ig/kg HS-20002 、 20004 、 20005 、 20006 、 20007 或 20008 後 lh 時，隨機血糖值比空白對照組明顯下降（p<〇. 〇5)，下降率 分別為 24. 51%、15. 00%、14. 〇〇%、14. 25%、13· 98%和 13. 90%;給藥後2h和4h時，隨機血糖值保持較低的濃度， 與空白對照組相比，差異明顯（p<〇. 〇5)，至給藥後8h，隨 機血糖與對照組無顯著差別。小鼠皮下注射3 V g/kg HS-20003後lh，隨機血糖值比空白對照組明顯下降 (P<0. 05)，達17. 33%，給藥2、4和8h時，隨機血糖與對 45 95094 201225974 照組無顯著差別。db/db小鼠單次皮下注射3 // g/kg HS-20001後，隨機血糖值與空白對照組相比有所下降，但 沒有顯著性差異。利拉魯肽組小鼠給藥後，隨機血糖值未 見明顯下降。 表2 :新化合物單次給藥後當天對db/db小鼠隨機血糖的 影響（mmol/L，X±s，n=8) 組別 給藥前 給藥後時間(h) 1 2 4 8 對照 25.14 土 1.09 23. 66±0. 73 22. 63±0. 97 22.00±1.00 25. 39±1.08 利拉魯肽 -3 μ. g/kg 25.11士 2. 33 21.78±2.31 23.15+2. 62 21.56±1.37 23. 93+2. 09 HS-20001-3 β g/kg 25. 21土 1.44 20. 34±2. 29 19. 84+1.76 20. 74±2. 51 24.29+1.60 HS-20002-3 μ g/kg 25. 25土 1.57 17.部±1.90* 19. 56±0. 90* 18.10+0. 79« 24.19±1.79 HS-20003-3 β g/kg 25.16士 1.49 19. 56±1.19* 19. 44±1.48 19.63±1.12 22. 59±1.05 HS-20004-3 β g/kg 25.11土 1.63 20.11±1.2讲 18.81+1.50* 17. 98+1.38^ 23. 30±1.47 HS-20005-3 β g/kg 25. 21土 1.56 20.11±1.19* 18. 96±1. 50* 18. 98±1.48* 22. 36±1.67 HS-20006-3 μ g/kg 25.11士 1.49 20.3611.25* 19.91±1.70* 19. 58±1.54* 24. 30±1.50 HS-20007-3 μ. g/kg 25.16土 1.63 20.43±1.19* 19.81±1.610 氺 20. 98±2. 38* 23. 42+1. 38 HS-20008-3 β g/kg 25.11土 1.58 20.56+1.30* 20.81±1.70* 19. 30±2. 02* 22. 41 土 1.51 *P<0.05，"P<0.01，與空白對照組相比 46 95094 201225974 表3 :新化合物單次給藥後當天db/db小鼠隨機血糖
下降率（％，n=8) 組別 - 給藥後時間（h) 1 2 4 8 利拉魯肽 -3/z g/kg 7. 98% -2.32% 1· 99% 5. 76% HS-20001-3 β g/kg 14.05% 12·32% 5. 74% 4. 33% HS-20002-3 μ g/kg 24. 51% 13. 54% 17. 73% 4. 73% HS-20003-3// g/kg 17. 33% 14. 09% 10.80% 11.03% HS-20004-3// g/kg 15. 00% 16. 85% 18. 30% 8. 22% HS-20005-3 μ g/kg 14. 00% 12. 87% 10. 53% 8. 02% HS-20006-3/i g/kg 14.25% 13. 12% 10. 86% 8. 14% HS-20007-3 μ g/kg 13. 98% 11.85% 9. 30% 6. 54% HS-20008-3/z g/kg 13. 90% 11.62% 8.90% 6. 25% 試驗2:高劑量新化合物單次給藥對db/db小鼠隨機 血糖的影響 結果見表4、5。db/db小鼠單次皮下注射10 /z g/kg HS-20002後lh時，隨機血糖值比空白對照組明顯下降 (P<0. 01)，給藥後2、4和8h時，隨機血糖值保持較低的 濃度，其中給藥後4h最為明顯，其降幅達40. 67%，與空 白對照組相比，差異明顯（P<0. 001)，至給藥後24h，隨機 47 95094 201225974 血糖與對照組相比，仍明顯較低。小鼠皮下注射10# g/kg HS-20003後lh，隨機血糖值比空白對照組明顯下降 (P<0. 01)，達23. 62%，給藥2、4和8h時，隨機血糖仍保 持在較低的濃度，至給藥後24h與對照組無顯著差別。 db/db小鼠單次皮下注射10#g/kgHS-20001後2h時，隨 機血糖值與空白對照組相比明顯下降，給藥後4和8h時血 糖仍保持在較低的濃度，至給藥後24h，隨機血糖與空白 對照組相比，沒有顯著性差異。HS-20004、20005、20006、 20007、20008-1 Ogg/kg組小鼠給藥後lh時隨機血糖即明 顯下降，其降幅達36. 20%，此後的2、4和8h時，血糖仍 保持在較低的濃度，給藥後24h，隨機血糖與空白對照組 相比，沒有顯著性差異。利拉魯肽組小鼠給藥後，隨機血 糖值未見明顯下降。
S 48 95094 201225974 表4 :新化合物單次給藥後當天對db/db小鼠隨機血糖的 影響（mmol/L ，士S， n=8) 組別 給藥前 給藥後時間（h) 1 2 4 8 24 對照 23. Ofc 27· 15土 28. 49士 30. 76土 29. 96土 27. 75士 1.37 1.51 1.58 1.15 0.88 1.64 利拉魯狀_10 23.1¾ 28. 59土 28. 89土 28. 55土 31.84+ 27. 78士 #g/kg 1.35 1.50 1.17 1.31 0.65 1.14 HS-20001-10 23.16士 23. 90士 20. 94士 20. 20土 23. 86士 24. 60士 //g/kg 1.57 1.79 1.57** 1.78*** 1.87* 1.92 HS-20002-10 23.15土 19. 74土 20. 31土 18. 25土 22. 55士 22. 60土 Aig/kg 1.32 1.16** 2. 01** 1.98*** 2. 20** 1.46* HS-20003-10 23. 20土 20. 74士 21.10土 19. 54土 22.14土 24. 45土 #g/kg 1.36 0. 98** 0. 80*** 1.80* 林 2.16« 1.55 組別 給藥前 給藥後時間（h) 1 2 4 8 24 對照 23. 08士 30. 76士 30. 29土 29. 90土 31. 04土 28. 98士 1.37 1.15 0.98 0.89 0.94 1.62 HS-20004- 23.18土 19. 63土 21.86土 21. 44土 23. 80土 25. 64土 l〇yg/kg 1.65 1.81*** 1.66*** 1. 68林木 1.46*** 1.85 HS-20005- 23. 64土 19. 39士 21.56土 21. 49土 23. 46土 25. 52土 lO^g/kg 1.35 1.61*** 1. 56«* 1. 34«* 1.51*** 1.68 HS-20006- 23. 54土 19. 52土 21.43士 21. 53土 23. 39土 25. 59土 10/zg/kg 1.39 1.72«* 1. 49*** 1.67*** 1 林木 1.74 HS-20007- 23. 56土 19. 41士 21. 84土 21. 64士 23. 81土 25. 51土 10/zg/kg 1.42 1.54*** 1. 57*** 1.56*** 1. 67林氺 1.53 HS-20008- 23. 49土 19. 38土 21.61士 21. 72土 23. 56士 25. 7¾ l〇/zg/kg 1.49 1.83木林 1.68*** 1. 63*** 1.80*** 1.69 *P<0. 05，*1P<0. 01，WP<0. 001 與空白對照組相比 49 95094 201225974 表5 :新化合物單次給藥後當天db/db小鼠隨機血糖 下降率（％，n=8) 組別 給藥後時間（h) 1 2 4 8 24 利拉魯肽-10 #g/kg -5. 29% -1.40% 7.19% -6. 26% -0. 09°/〇 HS-20001-10 //g/kg 11.97% 26.50% 34. 34% 20. 36% 11.35% HS-20002-10 yg/kg 27. 30°/〇 28. 71% 40. 67°/〇 24. 74°/〇 18. 56% HS-20003-10 //g/kg 23. 62% 25. 93% 36. 49% 26.12% 11.89% HS-20004-10 yg/kg 36. 20% 27. 82% 28. 30% 23.32% 11.52% HS-20005-10 eg/kg 37. 58% 28. 32°/〇 29.12% 24.10% 12.46% HS-20006-10 /^g/kg 38.12% 27. 66% 29. 78% 23.72% 13. 66% HS-20007-10 /^g/kg 36. 72% 25. 43% 26. 54% 23.03% 12.16% HS-20008-10 Aig/kg 35.49% 25.79% 27. 33°/〇 22. 57% 14.58% 試驗結論： 系列化合物單次皮下注射後可明顯降低db/db小鼠的 隨機血糖，HS-20002、20003、20004、20005、20006、20007、 20008在劑量為3/zg/kg時即可表現出明顯的降低隨機血 糖作用。其中HS-20002和20004表現出較好的降隨機血糠 作用，單次皮下注射後的降血糖作用維持時間與劑量相 關，3 // g/kg的HS-20002和20004的降隨機血糖作用玎維 50 95094 201225974 持 4h 以上，而劑量為 10//g/kg 時，HS-20001、20002、 20003、20004、20005、20006、20007、20008 的降隨機血 糖作用均可維持8h以上。 【圖式簡單說明】 益 【主要元件符號說明】 無
51 95094 201225974 序列表 <ιιο>江蘇豪森t換集困限公司 <120〉GLP-1類似物的衍生物或其醫換用鹽及其用途 <130> 890086CC <160> 120 <170> Patentln version 3.2 <210〉 1 <211> 42 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <221> misc.feature <222> (2).7(2) <223〉Xaa代表D型Aia <400〉 1
His Xaa Glu Cly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gin Asn Leu Glu 1.5 10 15
Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp Leu Lys Gin Gly Glv 20 25 30
Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Lys 35 40 <210〉 2 <211> 40 <212> PRT <213〉人工序列 <400> 2
His Gly 01υ Gly ThT Phe Thr Sei Asp Leu Ser Lys Gin Met Glu Glu 15 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Lys 35 40
<210> 3 <211〉 40 <212> PRT <213〉人工序列 · <220> <221> roisc^feature <222> (2).7(2) <223〉Xaa代表D型Ala <400> 3
His Xaa Glu Cly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 15 10 15
Glu Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Val Arg Gly Gly Pro Ser 20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Fro Ser Lys 1 95094 s 201225974 35 40 <210> 4 <211〉 40 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <221〉 fflisc_feature <222> (2)..(2) <223〉Xaa代表Aib <400) 4
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Clu 1 5 10 15
Glu Ala Ala Lys Glu Phe He Ala Trp Leu Val Arg Gly Gly Pro Ser 20 2.5 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Lys 35 40 <210〉 5 <211> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <400> 5
His Ala Clu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35
<210〉 6 <211〉 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <221> misc feature <222〉(34)7. (34) <223> Xaa代表Sar <400> 6
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35 <2i0> 7 <211〉 39 <212> PRT <213>人工序列 2 95094 201225974 <400〉 7
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr leu Glu Glu 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210> 8 <211> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <221> oisc_feature <222> (34)7.(34) <223〉Xaa代表Sar <400> 8
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Clu 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Cly Lys Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210〉 9 <211〉 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <221> raise feature <222> (16)7. (16) <223〉Xaa代表Aib <400> 9
His Ala Clu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Clu Xaa 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Cly Arg Cly Lys Lys 20 25 30
Gly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210〉 10 <211> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <221> misc feature <222> (16)7.(16) <223〉Xaa代衮Aib 201225974 <220> <221> misc.feature <222> (34)7. (34) <223〉Xaa代表Sar <400> 10
His Ala Glu Cly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa 15 10 15
Cln Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35
、<210> 11 <211〉 39 <212> PRT <213〉人工序列 <400〉 11
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Met Clu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210> 12 <211> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <400> 12
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Met Glu Clu 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Cly Lys Lys 20 25 30
Gly Cly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210〉 13 <2U> 39 <212> PRT <213>人工序列 <220> <22l> raise feature <222> (34)7. (34) <223〉Xaa代表Sar <400〉 13
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Met Clu Clu 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Cly Lys Lys 20 25 30 4 95094 201225974
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210> 14 <211〉 39 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> disc feature <222> (16)..(16) <223〉Xaa代表Aib <400> 14
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Met Glu Xaa 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe He Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210> 15 <211〉 39 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> misc feature <222> (16)7.(16) <223> Xaa代表Aib <220> <221> raise feature <222> (34)7. (34) <223〉Xaa代表Sar <400〉 15
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Met Glu Xaa 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210〉 16 <211〉 39 <212> PRT <213〉人工序列 <400> 16
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Gin Leu Glu Gly 1 5 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Cly Lys Lys 20 25 30 201225974
Gly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210> 17 <211> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <221> inisc feature <222> (34)7.(34) <223〉Xaa代表Sar <400〉 17
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Gin Leu Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210> 18 <21l> 39 <212> PRT <213>人工序列 <400> 18
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Gin Leu Glu Glu 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Cly Arg Gly Lvs Lys 20 25 30
Gly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210〉 19 <2U> 39 <212> PRT <213〉人工序列
\/ \/ \/ } 0 12 3 2 2 2 2 2 2 2 2 ✓\ /\ /N /X nusc_feature (34).. (34) Xaa代表Sar <400〉 19
His Ala Glu Gly Thr Pbe Thr Ser Asp Val Ser Ser Gin Leu Glu Clu 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35
<210> 20 <211> 39 <212> PRT 6 95094 201225974 <213〉人工序列 <220〉 <221> inisc feature <222〉（16):.(16) <223〉Xaa代表Aib <400〉 20
His Ala Clu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Gin Leu Glu Xaa 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe He Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Cly Cly Pro Pro Pro Ser Lys 35
<210> 21 <211〉 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <221> oisc_feature <222> (16)7. (16) <223〉Xaa代表Aib <220> <221> roisc_feature <222〉（34 厂.（34) <223〉Xaa代表Ser <400> 21
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Gin Leu Clu Xaa 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lvs Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35
<210〉 22 <2U> 39 <212> FRT <213>人工序列 <400> 22
His Ala Clu Cly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Gin Met Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210> 23 <2il> 39 <212> PRT <213〉人工序列 7
95094 S 201225974 <220〉 <221> misc^feature <222> (34)..(34) <223〉Xaa代表Sar <400> 23
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Gin Met Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35
<210〉 24 <211〉 39 <212> PRT <213〉人工序列 <400> 24
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Cln Met Glu Glu 1 5 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Cly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210> 25 <211〉 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <221> raise feature <222> (34)7. (34) <223〉Xaa代表Sar <400〉 25
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Gin Met Glu Glu 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Cly Lys Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210> 26 <211〉 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <221> misc_feature <222〉（16): (16) <223〉Xaa代表Aib <400> 26 201225974
His Ala Clu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Gin Met Glu Xaa 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Cly Lys Lys 20 25 30
Gly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210> 27 <211> 39 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <221〉 raisc_feature <222〉（16).,(16) <223〉Xaa代表Aib <220〉 <221> raise feature <222> (34)7.(34) <223〉Xaa代表Sar <400> 27
His Ala Clu Cly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Gin Met Glu Xaa 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Cly Lys Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210〉 28 <211〉 39 <212> PRT <213〉人工序列 <400> 28
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Leu Clu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Clu Phe lie Val Trp Ιβυ Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210〉 29 <211> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <221〉 misc_feature <222〉（34):(34) <223〉Xaa代表Sar <400> 29
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Leu Glu Gly 9 95094 201225974 1 5 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Xaa Fro Pro Pro Ser Lys 35 <210) 30 <2I1> 39 <212> PRT <213>人工序列 <400> 30
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Leu Glu Glu 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Glv Lys Lys 20 25 30
Gly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210〉 31 <211〉 39 <212> PRT <2Π>人工序列 <220〉 <221> raise feature <222〉（34):. (34) <223> Xaa代表 Sar <400〉 31
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Leu Glu Glu 1 .5 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Cly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys <210〉 32 <211〉 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <221> raisc^feature <222> (16)7.(16) <223〉Xaa代表Aib <400〉 32
His Ala Glu Gly* Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Leu Glu Xaa 1 5 ' 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val lys Gly Arg Gly lys Lys 20 25 30 10 95094 ;.s| 201225974
Gly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210> 33 <2il> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <221> oisc_feature <222> (16)" (16) <223〉Xaa代表Aib <220〉 <221> misc feature <222> (34)7. (34) <223〉Xaa代表Sar <400〉 33
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Leu Clu Xaa 1 5 10 15
Cln Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210〉 34 <211> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <400> 34
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Met Clu Gly 15 10 15
Cln Ala Ala Clu Phe lie Vai Trp leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Cly Gly Pro Pro Pro Ser Lys
<210> 35 <211〉 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <221> raise feature <222> (34)..(34) <223> Xaa代表Sar <400> 35
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Met Clu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Cly Xaa Pro Pro Pro Ser lys 35 11
95094 S 201225974 <210> 36 <211〉 39 <212〉 PRT <213〉人工序列 <400> 36
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Met Clu Glu 15 10 15
Cln Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val lys Cly Arg Gly Lys lys 20 25 30
Gly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35
<210> 37 <211〉 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <221> misc^feature <222〉（34):. (34) <223〉Xaa代表Sar <400> 37
His Ala Glu Cly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Met Glu Glu 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Cly Xaa Pro Pro Fro Ser Lys 35 <210> 38 <2ll> 39 <212> PRT <213〉人工序列
<221> misc_feature <222〉（16)..(16) <223〉Xaa代表Aib <400> 38
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Met Clu Xaa 1 5 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210> 39 <2U> 39 <212> PRT <213〉人工序列 12 95094 201225974 <220〉 <221> nisc_feature <222> (16)..(16) <223〉Xaa代表Aib <220〉 <221> nisc^feature <222〉（34)..(34) <223〉Xaa代表Sar <400> 39
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Met Glu Xaa 15 10 15
Gin Ala Ala Clu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210〉 40 <211> 39 <212〉 PRT <213〉人工序列 ,<400> 40
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Gin Leu Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210> 41 <211〉 39 <212> PRT <2I3>人工序列 <220〉 <22l> oisc feature <222> (34)7. (34) <223〉Xaa代表Sar <400> 41
His Ala Clu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Gin Leu Glu Gly 1 5 10 15.
Cln Ala Ala Clu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Cly Arg Cly Lys lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser lys 35 <210> 42 <211〉 39 <212> FRT .<213>人工序列 <400〉 42 13 95094 s 201225974
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Gin Leu Glu Glu 1 5 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <2i0> 43 <211> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <221) misc_feature <222> (34)7. (34) <223〉Xaa代表Sar
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Gin Leu Glu Glu 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val lys Cly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210〉 44 <211> 39 <212〉 PRT <2i3>人工序列 <220> <221> raise feature <222〉（16)..(16) <223〉Xaa代表Aib <400〉 44
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Gin Leu Glu Xaa 1 5 10 15
Oln Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Cly Lys Lys 20 25 30
Cly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210> 45 <2U> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <221〉 misc feature <222> ⑽:·⑽ <223> Xaa代表Aib <220> <221> misc_feature <222> (34)" (34) 14 95094 201225974 <223〉Xaa代表Sar <400〉 45
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Gin Leu Glu Xaa 15 10 15
Gin Ala Ala Clu Phe He Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210〉 46 <2U> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <400> 46
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Gin Met Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Cly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210> 47 <2ll> 39 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <221> misc feature <222〉（34):. (34) <223〉Xaa代表Sar <400> 47
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Gin Met Glu Gly 15 LO 15
Gin Ala Ala Clu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210〉 48 <211> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <400> 48
His Ala Clu Gly Thr Phe Hir Ser Asp Val Ser Lys Gin Met Glu Glu 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 15
95094 S 35 201225974 <210> 49 <211> 39 <212> FRT <213〉人工序列 <220> <221> niisc feature <222> (34)7. (34) <223〉Xaa代表Sar <400> 49
His Ala Clu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Gin Met Glu Glu 15 10 15
Cln Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210> 50 <211〉 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <221> raise feature <222> (16)..(16) <223〉Xaa代表Aib <400> 50
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lvs Cln Met Clu Xaa 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210〉 51 <2U> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <221> misc feature <222> (16)..(16) <223〉Xaa代表Aib <220〉 <221> misc feature <222> (34)..(34) <223〉Xaa代表Sar <400> 51
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Gin Met Clu Xaa L 5 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp leu Val Lys Gly Avg Gly Lys Lys 16 95094 201225974 20 25 30
Gly Xaa Fro Pro Pro Ser Lys 35 <210〉 52 <211〉 39 <212> PRT <213〉人工序列 <400〉 52
His Ala Glu Cly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Cln Leu Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Cly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210〉 53 <211〉 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <221> Disc feature <222〉（34)..(34) <223〉Xaa代表Sar <400〉 53
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gin Leu Glu Cly 15 10 15
Cln Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lvs Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35
<210〉 54 <2U> 39 <212〉 PRT <213〉人工序列 <400〉 54
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Cln Leu Glp Clu 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Cly Lys Lys 20 25 30
Gly Gly Pro Pro Pro Ser lys 35 <210> 55 <21i> 39 <212> PRT <213>人工序列 17
95094 S 201225974 <220〉 <221> niisc.feature <222〉（34)..(34) <223〉Xaa代表Sar <400> 55
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp leu Ser Lys Gin Leu Clu Glu 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Glv Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35
<210〉 56 <2ll> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <221> «Disc feature <222> (16)7. (16) <223〉Xaa代表Aib <400〉 56
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gin Leu Clu Xaa 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <2i0> 57 <2ll> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <22l> misc feature <222〉(16)7. (16) <223> Xaa代表Aib <220〉 <221> misc_feature <222> (34)7.(34) <223〉Xaa代表Sar <400> 57
His Ala Giu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gin Leu Glu Xaa 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210> 58 <211〉 39 18 95094 201225974 <212〉 PRT <213〉人工序列 <400> 58
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gin Met Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe He Val Trp Leu Val lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Cly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210> 59 <2U> 39 <212> PRT <213〉人工序列
<220> <22l> misc feature <222> (34)7. (34) <223〉Xaa代表Sar <400> 59
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp leu Ser Lys Gin Met Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210> 60 <211> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <400> 60
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Tyr Leu Glu Gly
Gin Ala Ala Clu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Cly Cly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210〉 61 <211〉 39 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <221> roisc_feature <222> (34)' (34) <223〉Xaa代表Sar <400> 61
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 19 95094 s 201225974
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Glv Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210〉 62 <211> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <400> 62
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Tyr Met Clu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210> 63 <211> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <221> raise feature <222> (34)7.(34) <223〉Xaa代表Sar <400> 63
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Tyr Met Glu Glv 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys <210> 64 <211> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <400> 64
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Ser Cln Leu Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Clu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30 GLy Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35
<210> 65 <211〉 39 <212> PRT 20 95094 201225974 <213〉人工序列 <220〉 <221> Biisc_feature <222> (34)7.(34) <223〉Xaa代表Sar <400> 65
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Ser Gin Leu Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Cly Lys Lys 20 25 30
Cly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35
<210> 66 <211〉 39 <212> PRT <213〉人工序列 <400> 66
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Ser Gin Met Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ale Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210〉 67 <211> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <221> uisc feature <222〉（34):(34)
<223〉Xaa代表Sar <400> 67
His Ala Glu Cly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Ser Gin Met Glu Cly 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Cly Lys Lys 20 25 30 *
Cly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210> 68 <211> 39 <212〉 PRT <213〉人工序列 <400〉 68
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 15 10 15 21
95094 S 201225974
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Cly Lys Lys 20 25 30
Gly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210〉 69 <211> 39 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221> misc feature <222> (34)7. (34) <223〉Xaa代表Sar <400〉 69
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Cly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210> 70 <211> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <400> 70
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Ser Tyr Met Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Cly Arg Civ Lys Lys 20 25 30
Gly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <211> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <221> niisc_feature 〈222〉（34)..(34) <223〉Xaa代表Sar <400> 71
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Ser Tyr Met Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35 22 95094 201225974 <210〉 72 <211〉 39 <212> PRT <213〉人工序列 <400> 72
His Lys Clu Cly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Clu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Cly Lys Lys 20 25 30
Gly Cly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210> 73 <2ll> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <221> misc.feature <222> (34)..(34) <223〉Xaa代表Sar <400> 73
His Lys Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Clu Cly 15 10 15
Gin Ala Ala Giu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210〉 74 <2U> 39 <212〉 PRT <213〉人工序列 <400> 74
His Lys Clu Cly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 15 10 15
Cln Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Cly Arg Gly Lys Lys 20 25 30 ·
Gly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210〉 75 <2ll> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <221> misc feature <222> (34)..(34) <223〉Xaa代表Sar 23
95094 S 201225974 <400〉 75
His Leu Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Clu Glu 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210> 76 <211> 39 <212> PRT <213>人工序列 <220〉
<221> oiisc feature <222> (16)..(16) <223> Xaa代表Aib <400〉 76
His Leu Clu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Cly Lys Lys 20 25 30
Gly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210〉 77 <211> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <221> misc^feature <222) (16)7. (16) <223〉Xaa代表Aib <220〉 <221> misc_feature <222> (34)7. (34) <223〉Xaa代表Sar <400> 77
His Lys Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa 1 5 10 15.
Gin Ala Ala Clu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Cly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210〉 78 <2U> 39 <212〉 PRT <213〉人工序列 <400> 78 24 95094 201225974
His Lys Clu Cly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Met Glu Gly l 5 10 15
Cln Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Cly Lys Lys 20 25 30
Gly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210〉 79 〈211〉 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <221> misc feature <222〉（34)7. (34) <223〉Xaa代表Sar
<400> 79
His lie Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Met Glu Gly 1 5 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pi'〇 Pro Ser Lys 35 <210> 80 <211〉 39 <212> PRT <213〉人工序列 <400> 80
His lie Clu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Met Glu Clu 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe He Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Cly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210> 81 <211〉 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <221> misc feature <222> (34)7. (34) <223〉Xaa代表Sar <400> 81
His lie Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Met Glu Glu 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30 25
95094 S 201225974
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210> 82 <2ll> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <221> mi$c feature <222〉 （16)..(16) <223〉Xaa代表A ib <400> 82
His Leu Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Met Glu Xaa 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210〉 83 <2U> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <221> nisc_feature <222〉 (2).7(2) <223〉Xaa代表Aib <220〉 <221> raise feature <222> (34)7. (34) <223〉Xaa代表Sar <400〉 83
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Ser Tyr Met Glu Gly 1 5 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Cly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210> 84 <211〉 39 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <221> misc_feature <222> (16)7,(16) <223〉Xaa代表A ib <220> <221> raise feature <222> (34)7.(34) <223〉Xaa代表Sar 26 95094 201225974 <400> 84
His lys Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Met Clu Xaa 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210〉 85 <211〉 39 <212> PRT <213〉人工序列 <400〉 85
His lie Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Gin Leu Clu Gly 1 5 10 15
Cln Ala Ale Clu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Cly Arg Cly Lys Lys 20 25 30
Gly Cly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210> 86 <211> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <221> raise feature <222〉（34): (34) <223〉Xaa代表Sar <400> 86
His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Gin Leu Clu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210〉 87 . <211〉 39 <212> PRT <213〉人工序列 <400〉 87
His Val Glu Cly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Gin Leu Glu Glu 1 5 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 '30
Gly Cly Pro Pro Pro Ser Lys 35 27 95094 s 201225974 <210> 88 <211> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <221> misc feature <222〉（34):. (34) <223〉Xaa代表Sar <400〉 88
His Val Clu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Gin Leu Glu Glu 15 10 15
Gin Ala Ala Clu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg G1y Lys Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210> 89 <211> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <221> misc_feature <222> (16)7. (16) <223> Xaa代表Aib <400> 89
His Leu Clu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Gin Leu Glu Xaa 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35
<210> 90 <211> 39 <212> PRT <2i3>人工序列 <220〉 <221> raise feature ， <222〉（16):(16) <223〉Xaa代表A ib <220〉 <221〉 raise feature <222> (34)7. (34) <223> Xaa代表Sar <400> 90
His lys Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Gin Leu Clu Xaa 1 5 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30 28 95094 201225974
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210> 91 <211〉 39 <212> PRT <213〉人工序列 <400〉 91
His Lys Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Gin Met Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210> 92 <2ll> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <221> misc feature <222> (34)7.(34) <223〉Xaa代表Sar 〈400〉 92
His Val Glu Cly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Gin Met Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210〉 93 <211〉 39 <212> PRT <213〉人工序列 <400> 93
His Val Glu Cly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Gin Met Glu Glu l 5 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Yal lys Gly Arg Gly lys Lys 20 25 30
Gly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210> 94 <211〉 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <22l> misc_feature 29
95094 S 201225974 <222> (34)..(34) <223〉Xaa代表Sar <400> 94
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Gin Met Glu Clu 15 10 15
Gin Ala Ala Clu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lvs Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210> 95 <2U> 39 <212> PRT <213〉人工序列
<220> <221> misc feature <222> (16)7.(16) <223〉Xaa代表Aib <400> 95
His Gly Clu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Gin Met Glu Xaa 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210) 96 <21t> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <221> misc_feature <222> (16)7. (16) <223> Xaa代表Aib <220〉 <221> raise feature <222> (34)7.(34) <223〉Xaa代表 Sar . <400> 96
His lie Clu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Gin Met Glu Xaa 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Cly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Fro Pro Ser Lys 35 <210> 97 <211〉 39 <212> PRT <213〉人工序列 30 95094 201225974 <400〉 97
His lie Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Leu Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210〉 98 <2il> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <221> misc_feature <222〉（34),.(34) <223〉Xaa代表Sar <400> 98
His Lys Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Leu Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210> 99 <211〉 39 <212> PRT <213〉人工序列 <400> 99
His Lys Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Leu Glu Glu 1 5 10 15
Cln Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210〉 100 <211〉 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <221> misc feature <222> (34)7.(34) <223> Xaa代表Sar <400> 100
His lie Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Leu Glu Glu 15 10 15 31 95094 為 201225974
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Cly Arg Gly Lvs Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210> 101 <21i> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <221> misc feature <222> (16)7.(16) <223> Xaa代表Aib <400〉 101
His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Leu Glu Xaa 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210〉 102 <211〉 39 <212> FRT <213〉人工序列 <220 <221> misc feature <222〉 （16)7.(16) <223〉Xaa代表Aib <220〉 <221> Diisc^feature <222〉(34)7. (34) <223〉Xaa代表Sar <400> 102
His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Leu Glu Xaa 15 10 15
Gin Ala Ala Clu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Cly Arg Gly Lys Lvs 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210〉 103 <211〉 39 <212> PRT <213〉人工序列 <400> 103
His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Met Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Clu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Cly Arg Gly Lys tys 20 25 30 32 95094 201225974
Gly Gly Pro Pro Fro Ser Lys 35 <210〉 104 <2U> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <221> inisc feature <222〉 (34).. (34) <223> Xaa代表Sar <400> 104
His lie Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Met Glu Gly 15 10 15
Cln Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210> 105 <211> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <400> 105
His Lys Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Met Glu Glu 1 5 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210〉 106 <2U> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <221〉 misc-feature <222〉(34).. (34) . <223〉Xaa代表 Sar <400> 106
His lie Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Met Glu Glu 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210> 107 33 95094 s 201225974 <211〉 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <221〉 raise feature <222> (16)7.(16) <223〉Xaa代表Aib <400> 107
His Lys Glu Cly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Met Glu Xaa 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe He Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Cly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35
<210〉 108 <211〉 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <22l> nisc_feature <222> (16)7.(16) <223〉Xaa代表Aib <220> <221> Disc feature 〈222〉 （34)二（34) <223〉3(aa代表Sar <400〉 108
His Val Glu Cly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Met Glu Xaa 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Cly Lys Lys 20 25 30
Cly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210〉 109 <211〉 39 <212〉 PRT <213〉人工序列 <400> 109
His Lys Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Gin Leu Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val lys Cly Arg Cly Lys Lys 20 25 30
Gly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35
<210> 110 <211〉 39 <212> PRT 34 95094 201225974 <2i3>人工序列 <220〉 <221〉 raise feature <222> (34)7.(34) <223> Xaa 代表 Sar <400> 110
His lie Glu Cly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Cln Leu Glu Gly 1 5 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe He Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser lys 35 <210〉 111 <211〉 39 <212> PRT <213〉人工序列 <400〉 111
His Lys Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Cln Leu Glu Clu 15 10 15
Cln Ala Ala Clu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210) 112 <211〉 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <221> misc feature <222〉（2).:(2) <223〉Xaa代表Aib <220> <221〉 misc feature <222〉（34)7.(34) <223〉Xaa代表Sar <400> 112
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Gin Leu Glu Clu 15 10 15
Gin Ala Ala Clu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35 > > > > 0 12 3 2 2 oz 2 y\ /\ c c 113 39
PRT 人工序列 35 95094 5 201225974 <220> <221> raise feature <222> (16)7. (16) <223〉Xaa代表Aib <400> Π3
His Lys Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Gin Leu Glu Xaa 15 10 15
Gin Ala Ala Clu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Cly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35
<210> 114 <21l> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <221> raisc^feature <222> (2).7(2) <223〉Xaa代表Aib <220〉 <221> rnisc_feature <222> (16)..(16) <223〉Xaa代表Aib <220〉 <221> misc_feature <222> (34)" (34) <223〉Xaa代表Sar <400> 114
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Gin Leu Glu Xaa 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Cly Arg Cly Lys Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35
<210> 115 <2U> 39 <212> PRT <213〉人工序列 . <400> 115
His lie Glu Cly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Gin Met Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Clu Fhe lie Val Trp Leu Val Lys Cly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210> 116 <211〉 39 36 95094 201225974 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <22l> ®isc_feature <222> (2).7(2) <223〉Xaa代表Aib <220> <221> misc.feature <222> (34)..(34) <223〉Xaa代表Sar <400> 116
His Kaa Giu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Gin Met Glu Gly 15 10 15
Cln Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Cly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Fro Pro Ser Lys 35
<210〉 117 <2U> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <400〉 117
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Gin Met Glu Glu 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Cly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Gly Pro Pro Pro Ser Lys 35 <210> 118 <211> 39 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <221> misc feature <222〉（2).:(2) <223〉Xaa代表Aib <220> . <221> Bisc feature <222> (34)7. (34) <223〉Xaa代表Sar <400> 118
His Xaa Glu Cly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Gin Met Glu Glu 1 5 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Cly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35 37 95094 s 201225974 f <210> 119 <211> 39 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <221> niisc_feature <222> (16)..(16) <223〉Xaa代表Aib <400〉 119
His Lys Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Gin Met GIu Xaa 15 10 15
Gin Ala Ala Glu Phe lie Val Trp Leu Val Lys Cly Arg Gly Lys Lys 20 25 30
Cly Gly Pro Pro Pro Ser Lys <210〉 120 <211〉 39 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <221> misc feature <222) (2).7(2) <223〉Xaa代表Aib <220〉 <221> raise feature <222〉 （16)..(16) <223〉Xaa代表Aib <220〉 <221> raise feature <222> (34)..(34) <223〉Xaa代表Sar <400> 120
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Gin Met Glu Xaa 15 10 15
Gin Ala Ala Clu Phe He Val Trp Leu Val Lys Cly Arg Cly Lvs Lys 20 25 30
Gly Xaa Pro Pro Pro Ser Lys 35 38 95094
Claims (1)
- 201225974 七、申請專利範圍·· 1. 一種含有胺基酸序列通式為（I)的GLP-1類似物的衍生 物或其醫藥用鹽： Xi-Xz-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xio-Ser-Xiz-Xia- Xi4-Glu~Xi6-Xi7-Ala-Xi9-X2〇-X2i-Phe-11 e~X24-Trp-Leu- X27-X28-X29-X30~*X31-X32-X33-X34 - X35-X36-X37"~X38-X39-LyS (I) 其特徵在於所述GLP-1類似物的衍生物具有一個 結構通式為MCHA-CO-的親脂性取代基，R,選自CH3_ 或者H00C-，n為8至25之間的整數， 乂丨3、X14、Xie、X17、X丨9、Χ2。、χ2丨、χ24、χ27、χ28、χ29、χ3。、 Χ31、χ32、χ33、χ34、χ35、χ36、χ37、χ38、χ39 各自獨立的選 自任意天然的胺基酸或非天然胺基酸或由其組成的肽 段。 2. 如申請專利範圍第1項所述的GLP4類似物的衍生物或 其醫藥用鹽’其特徵在於結構通式為R1(CH2)n_co_的親 脂性取代基和GLP-1類似物的胺基酸殘基的胺基是藉 由醯胺鍵的方式連接，其中L選自CH3-或者H00C-，η 為8至25之間的整數。 3. 如申請專利範圍第2項所述的GLpq類似物的衍生物或 其醫藥用鹽，其特徵在於結構通式為 脂性取代基和GLP-1類似物C端Lys的ε胺基通過醯 胺鍵的方式連接，其中匕選自CH3_或者肋沉…^為8—25 之間的整數。 1 95094 201225974 •如申請專利範圍第2項所述的GLP—丨類似物的衍生物或 其醫藥用鹽，其特徵在於結構通式為Ri(CH2)n_c〇_的親 脂性取代基和GLP-1類似物C端LyS的α胺基藉由醯 胺鍵的方式連接，其中Ri選自CH3-或者H00C-，η為8 至25之間的整數。 5. 如申請專利範圍第4項所述的〇1^_1類似物的衍生物或 其醫藥用鹽，其特徵在於Rl選自CH3_，n選自整數8、 iO 、 12 、 14 、 16 、 18 、 20 或 22 。 6. 如申請專利範圍第5項所述的GLP-1類似物的衍生物或 其醫藥用鹽，其特徵在於R!選自CH3-，η選自整數14。 7·如申請專利範圍第4項所述的GLP-1類似物的衍生物或 其醫藥用鹽，其特徵在於Rl選自H〇〇c_，n選自整數14、 16、18、20 或 22。 8. 如申請專利範圍第7項所述的GLP-丨類似物的衍生物或 其醫藥用鹽，其特徵在於Rl選自H〇〇c-，n選自整數14。 9. 如申請專利範圍第1至8項中任一項所述的Glp-i類似 物的衍生物或其醫藥用鹽’其特徵在於X!選自L-His、 D His，X2 選自 Ala、D-Ala、Gly、Val、Leu、I le、Lys、 Aib ; Xle選自 yal、Leu ; Xi2選自 Ser、Lys、Arg ; Xi3 選自 Tyr、Gin ; X14 選自 Leu、Met ; X16 選自 Gly、Glu、 Aib ; X17 選自 Gin、Glu、Lys、Arg ; X19 選自 Ala、Val ; 乂2°選自1^3、01114^;义21選自〇111、1^11;乂24選自¥3卜 Lys; χ27選自 Val、Lys; X28 選自 Lys、Glu、Asn、Arg ; X29選自 Gly、Aib;X3。選自 Arg、Gly、Lys;X31 選自 Gly、 2 95094 201225974 Ala、Glu、pr〇、Lys ; χ32 選自 Lys、Ser ; X33 選自 Lys、 Ser ; X34選自 Gly、Ala、Sar ; X35 選自 Gly'Ala、Sar ; X36選自 Pr〇、Giy;x37選自 Pro、Gly，X38選自 X39 選自 Ser、Tyr 〇 10·如申請專利範圍第9頊所述的GLP-1類似物的衍生物或 其醫藥用鹽，其特徵在於GLP-1類似物的胺基酸序列選 自 SEQ ID N0:；[至 sEQ ID N0: 120。 11 ·如申請專利範圍第1 〇項所述的GLP-1類似物的衍生物 或其醫藥用鹽，其特徵在於結構通式為Rl(CH2)n-C〇—的 親脂性取代基和選自序列如SEQ ID NO: 1至120所示 的GLP 1類似物的胺基酸殘基的胺基是藉由醯胺鍵的 方式連接，其中h選自CHr或者H00C-，η為8至25 之間的整數。 12. 如申請專利範圍第11項所述的GLP-1類似物的衍生物 及其醫藥用鹽’其特徵在於結構通式為MCHA-CO-的 親脂性取代基和選自序列如SEQ ID NO : 1至120所示 的GLP_1類似物C端Lys的ε胺基藉由醯胺鍵的方式 連接’其中Rl選自CH3-或者H00C-，η為8至25之間 的整數。 13. 如申明專利範圍第12項所述的GLP-1類似物的衍生物 及其醫藥用鹽，其特徵在於選自CH3-或者匿_，η 選自整數 8、】〇、、j6、18、2〇 或 ^。 14·如申利範圍冑12項所述的⑽爿類似物的衍生物 及其醫藥用鹽，其特徵在於Ri選自CIh” η選自整數 95094 3 201225974 14 ° 15. 如申請專利範圍第14項所述的GLP-1類似物的衍生物 戈其醫樂用鹽，其特徵在於GLP_ 1類似物的序列選自 SEQ ID NO:1 至 SEQ ID N0:20 。 16. 如申請專利範圍第11項所述的GLP-1類似物的衍生物 或其醫藥用鹽，其特徵在於結構通式為Rl(CH2)n_c〇一的 親脂性取代基和選自序列如SEq ID NO 1至20所示的 GLP-1類似物c端Lys的α胺基藉由醯胺鍵的方式連 接’其中Ri選自CH3-或者H00C-，η為8至25之間的 整數。 17. 如申請專利範圍第16項所述的GLP-1類似物的衍生物 及其醫藥用鹽，其特徵在於R,選自CH3-或者H00C-，η 選自整數 8、10、12、14、16、18、20 或 22。 如申請專利範圍第17項所述的GLp—丨類似物的衍生物 及其醫藥用鹽，其特徵在於h選自CH3-，η選自整數 14 〇 19.如申請專利範圍第18項所述的GLP-1類似物的衍生物 及其醫藥用鹽，其特徵在於GLP-1類似物的序列選自 SEQ ID N(hl 至 SEQ ID Ν0:8，其中 R!選自 CH3-，η 選 自整數14。 C\ Λ .如申請專利範圍第19項所述的GLP-1類似物的衍生物 及其醫藥用鹽，其特徵在於GLP-1類似物的序列選自 SEQ ID N0:4 ° 21· 一種醫藥組成物，包含： 4 95094 201225974 (1) 治療量的申請專利範圍第1至20項中任一項所 述的GLP-1類似物的衍生物或其醫藥用鹽，和 (2) 藥學可接受的賦形劑或藥物載體。 22. —種申請專利範圍第1至20項中任一項所述的GLP-1 的類似物的衍生物或其醫藥用鹽或者申請專利範圍第 21項所述的醫藥組成物的用途，其係用於製備治療非 膜島素依賴性糖尿病、膜島素依賴性糖尿病或肥胖症的 藥物。 5 95094 201225974 四、指定代表圖：本案無圖式 (一) 本案指定代表圖為：第（）圖。 (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： 五、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： Xi-X2-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-S6r_Asp_Xi〇_Ser-Xi2-Xi3-Xi4-Glu_Xi6-Xi7-Ala_Xi9-X2〇-X2i_Phe-Il e_X24-Trp-Leu_X27_X28- X29-X30-X31 -X32_X33-X34-X35~X36-X37-X38-X39-Ly S (I)3 95094 til
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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2010
- 2010-12-30 TW TW099146857A patent/TWI494122B/zh active
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| WO2021142736A1 (en) * | 2020-01-16 | 2021-07-22 | Shanghai Benemae Pharmaceutical Corporation | Dosing regimen of glp-1 |
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| TWI494122B (zh) | 2015-08-01 |
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