TW201219784A - Method for identifying a compound having an antiarrhythmic effect as well as uses relating thereto - Google Patents

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201219784 六、發明說明： 【發明所屬之技術領蜮】 本發明係關於4監定農 方法及腺¥二磷酸核糠琿=心律不整作用的化合物： 有該作用的化合物之用途％(心臟ADPRC)用於鑑定具 【先前技術】 在過去的4十年間，心▲管疾病 f齊和社會重要性。事實上，在西方國家中:二 官疾病在比例上囊括了死亡因素表上的第_位。最具威 脅性疾病的實例之—為^律轉，亦稱為心節 二律不整係關於在—對象中特徵為顯示二臟的 电/ ’、书之症狀。因此，心臟可能不規則或以延遽戒 加速的頻率跳動。麵去㈣十年間，已有描述許多不 同類f和強度的心律不整。然而許多的心律不整可能被 認為是人π群族中正常的變異，其他則代表嚴重的疾病 或甚至威脅生命之醫療緊急狀況，其可導致心_停和 猝死。心臟節律過快可能是心、房纖維顫動、心房撲動、 心室性心搏過速及心室纖維顫動。值得注意地，即使無 症狀，心律不整可能使病患潛在處於威脅生命的中風或 栓塞之傾向。有不同的分子因素可引起節律不整，而確 定能提供用於診斷及/或治療目的之新穎試劑幾定相當 困難。 .田 由於與治療上控制節律不整或診斷上偵测節律不敕 相關，已開發出數種抑制心臟節律過快之抗心律不敕= 201219784 藥劑。通常，抗心律不種整藥劑係就其有關的分子目標 分為四類。第I類的藥劑係干擾鈉通道而因此具有提升 心臟作用潛在性之效應，第II類藥劑係干擾P腎上腺素 受體且因此拮抗兒茶酚胺降低心臟之交感神經性活動， 第III類的藥劑係干擾鉀通道且因此延長了再極化，而第 IV類的藥劑係干擾鈣通道。再者，數種其他的藥劑可能 具有，心律不整效用。腺苷與八广腺苷受體相互作用並2 此調節了鉀通道。心糖苷抑制了心肌鈉/鉀-ATP酶。副交 感神經抑制劑阻斷了蕈毒鹼M2_及M4·受體，而擬交残 神經藥物係活化心肌βΐ-受體。 广 總言之，本項技術中已知的心律不整藥劑主要為具 有限制選擇性之離子通道阻斷劑且與安全議題有關^ 具有嚴重的副作用，因受體並非完全為心臟專一性且^ 可能甚至具有引發藥物性心律不整效應之風險。此外/，、 a午多藥劑會與其他藥相互作用。因此，仍需要開發已知 抗心律不整藥劑之替代藥劑。這些替代藥劑不僅應為以 已知目標為標的之改善藥劑，更應針對其他分子目彳票 如其他離子通道或受體。 令人驚訝地，吾等發現心腺苷二磷酸核糖環化酶(心 ADPRC)之拮抗劑亦可能具有抗心律不整效用。 雖然最近已經證明聯苯化合物一般可抑制腺苷二 酸核糖環化酶(ADPRCs)(WO 08/82169)，但在本項技術中 一般尚未揭示ADPRC抑制劑，特言之心ADpRC抑制添 之抗心律不整作用。 Μ 201219784 因此’令人驚言牙地，在本發明中發現心A 可用於心律不整作用。在太 、、C抑制劑 量心ADPRC的酵辛、、J 抑制劑係以測

里ADPRC的酵素，舌性為基礎之方法來鑑定 貝J 庸RC抑制劑之樣本與無添加抑制劑之樣本相=潛在 者，以電生理學紀錄確認這些結果。 奴。再 除了適用心律不整外，心ADPRC抑制劑可於有 之對象中用作供治療或預防心衰竭、缺血性心臟疾匕品要 死之方法’或於患病或可能患誠具有患 之 2 作供診斷心衰竭、缺血性心臟疾病及心猝死之方用 據顯示心ADPRC可能涉及肺動脈高血壓 f 心廳RC抑制劑之另一適應症。因此 心:為 可於有此需要之對象中謎_ m _ RC抑制劑 、 作供/σ療或預防肺動脈高血壓之 卜及/或於患病或可能患病或具有患賴險 作供診斷肺動脈高血壓之方法。 丁豕中用 由二乏適合的試驗系統和筛選分析，測試-般 之抗心律不整性質及試驗特別是以心ADPRC Α = ^抗心律不整化合物仍受限之故，至今，可供上述用^ 有用的ADPRC抑制在本項技射尚未韻或揭示出^ 因此腺皆—鱗酸核糖環化酶(ADPRC)之生理學上、、广 理學上及生化上的角色並未完全的鑑定出，雖然其可能為= 度有利的治療標的，關此希望開發、較及/或定性與: 相互作用之試劑，特別是將其活化或去活化之試劑。因^， 用於研究腺脊二磷酸核糖環化酶(ADPRC)作用和控制之方 法及調節彼等之物質為必需的，亦需要避免或規避-或多種 201219784 其他藥物之缺點。所制’試驗方法係適合高通量_選，以 便可對(例如）貧料庫進行試驗，而谓測出可能為潛在治 之新的心ADPRC抑制劑或活化劑。 、 因缺乏可用的薛選和鑑定抗心律不整的心、ADpRC抑制 劑之適合方法’至今’財項技彳㈣已知的方法無法鑑定心 ADPRC抑·之抗心律不整㈣。因此，開發供測定心肌 漿網膜中ADPRC活性之新穎的方法及篩選化合物庫可意外 地偵測出抗心律不整心ADPRC抑制劑。 【發明内容】 令人驚訝地，已發現一種在活性心ADpRC的存在下測 定化合物之^律不整活性和物質轉化，以及鑑定具有抗心 律不整作用的化合物之方法。 因此’在本發明第—方面係關於駭具有抗心、律不整作 用的化合物之方法，該方法包括： -提供心腺苦二«核糠環化酶(心AD·)， _將心ADPRC與化合物接觸& -在化合物的存在下測定心撕此之活性， 其：，於對照組，，活性降低係象徵該化合物具抗 心律不整作用。 m吐/又*而S ’腺皆一鱗酸核糖環化酶（心ADPRC)催化了終

f ADPR二7 — ^^ (NAD)形成環狀腺苦二填酸核糖 Η α再者’其亦_示催化各種其他反應，例如CADPR 5、’二由驗父換反應由菸醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸

S 6 201219784 (NADP)形成菸鹼酸腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAADP)。在哺乳 動物中’已辨識出二種不同的ADpRC: CD38和CD157。最 近’已攸腦、腎臟、血管和心臟中分離出另外的ADPRc。 有利地’已發現其性質與CD38和CD157不同，而這些活性 上之分子相關性則尚未辨識出。心ADPRC已知為一種在心 臟，特別是脊椎動物，特別是哺乳動物之心臟中，所發現的 ADPRC。分離心ADPRC之方法係詳述於本發明說明書中迷 另外於實例中說明。已發現心ADPRC係調節心細胞的肌漿 網中鈣的釋放。 β 在本發明内文中，術語「心腺苷二磷酸核糖環化酶」或 「心ADPRC」特別係關於哺乳動物來源之心ADpRC，更特 別係關於人類、豬、大鼠或天竺鼠之心ADPRC，又更特別 係關於人類或豬之心ADPRC,最特別係關於人類或豬心臟 之心ADPRC。在本發明内文中，術語「心ADpRC」、「腺苷 二磷酸核糖環化酶」、「腺苷二磷酸核糖基環化酶」、「ADp_ 核糖環化酶」、「ADP核糖基環化酶」及相應的名稱應視為可 相互交換。 術語「心ADPRC」可指從心臟分離出、催化菸醯胺腺 嘌呤二核苷酸(NAD)形成環狀腺苷二磷酸核糖(cADpR)之任 何酵素。 心ADPRC亦可包括其所有的功能衍生物。術語「功能 衍生物」在心ADPRC之内容中係指具6〇0/〇以上，較佳地8〇0/〇 以上，更佳地85°/。以上，甚佳地9〇%以上，甚佳地95%以上， 最佳地97%以上的ACPRc序列一致性之蛋白 ，及至少5% 201219784 以上，10%以上，20%以上，30%以上，40%以上，50%以上， 60%以上，70%以上，80%以上，90%以上，95%以上，97% 以上的各別野生型蛋白之酵素活性。 另一種選擇或另外地，心ADPRC或其功能化衍生物可 與一或多個其他的分子接合、結合或稠合。這些與心ADPRC 接合、結合或稠合之分子亦可稱為「標記」。心ADPRC之功 能衍生物可理解為接合或結合其他分子之心ADPRC，其較 佳地係指（但不限於）與一或多個蛋白（例如螢光蛋白例如綠 色螢光蛋白（GFP)或結合蛋白例如鏈黴親和素 (streptavidin)(StpA)或二氫葉酸還原酶(DHFR))、一或多個脂 質或類脂質（lipidoid)、一或多個小分子染劑（例如螢光染劑如 Cy 染劑（例如 Cy3、Cy5、Cy5)、Alexa 染劑（例如 Alexa488、 Alexa 546、Alexa 647)、S染劑（S0387)、螢光素及其功能衍 生物（例如FITC)、羅丹明（rhodamine)、H0ECHST染劑等， 或UV/Vis染劑，例如對墙基苯基基團、庫馬西（Coomassie) 亮藍G-250)、一或多個量子點、一或多個結合分子（例如生 物素、甲胺蝶吟(methotrexate)、糖皮質激素或包括例如一或 多個活性酯、異硫氰酸酯、馬來醯亞胺或其組合物之基團）、 一或多個可溶及/或不可溶聚合物(例如聚乙二醇(PEG)、曱基 丙烯酸羥丙基酯（Η Ρ Μ A ))、功能化界面活性劑（例如胺基反應 性或馬來醯亞胺微陣列晶片）、一或多個抗體或其衍生物(例 如Fab片段 '單鏈抗體、雙聚抗體、三聚抗體、柔韌抗體、 單株抗體）、一或多個自旋標記、一或多個酵素標記(例如青 徽素酶、辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶）、微米或奈米微珠(例 201219784 如功能化矽氧微珠、糖微珠）、聚合物微囊及/或微脂體接合、 結合或裯合之心ADPRC。 再者’心ADPRC之功能衍生物亦可指放射性標定之心 ADPRC ’例如經適合閃爍分析、電腦斷層成像(CT)之3H、 32P、35S、14c或鑭系元素標定，或帶有適合正子攝影(pet) 之標記。心ADPRC可以重同位素標定，例如以質譜（例如 ESI-MS或MALDI-MS)或核磁共振(NMR)可偵測的2H、13C 來標定。 再者’心ADPRC之功能衍生物亦可為轉譯後修飾之功 能產物、心ADPRC之功能衍生物或與其他分子接合之心 ADPRC功能接合物及/或放射性標定的心ADPRC。轉譯後 修飾已為本項技術所熟知並可包括（但不限於）脂化、磷酸 化、硫酸化、糖基化、截斷、數個胺基酸之環化、多肽股環 化、氧化、還原、去羧化、乙醯化、醯胺化、去醯胺化、形 成二硫鍵、形成焦麵胺酸酯、胺基酸加成、共因子加成（例 如生物素化、血基質加成）及金屬離子、非金屬離子、胜肽 或小分子之錯合及硫化鐵團簇之加成。明顯地，與共因子非 共價鍵結，例如與 ATP、ADP、NAD+、NADH+H+、NADP+、 NADPH+H+、離子等鍵結合之心ADpRc亦可理解為心 ADPRC之功能衍生物，而與這些共因子之生物影響無關。 心ADPRC亦可含有酵素活性所需及承麟素活性之特定複 合的共因子，及/或承载或抑制心ADpRC或對心ADpRC的 酵素活性無影響之複合或連接鹽類、離子及不帶電分子。 此外’心ADPRC之功能衍生物亦可與心aDPRc之突 9 201219784 變形式有關。這些CR(：e㈣ 可指（但不限於）由改變的DNa ^ ^ ^ ADPrc ADPRC、心ADPRC之剪 ^NA序列所編碼的心 -RC(例如病毒A峻、細二 之改變的DNA或腿八序列可為整個試驗群Ϊ = =RC 或可為人工來源。於群族中天钬 砰兵中天然生成， 變的疆序列可能具特別的；：=t的編碼心撕狀之改 中亦可為有利的。 I療利妓且因此在本發明内文 心AI^C或其魏衍生物可^何方 中，術語「提供」可以最廣泛定義 、。文 於)如本項技術中已知，可用於得到心ADpRc二何3 生物技術方法。另外，所需的心ADPRC2量可從冷束的ς 物解珠及/或可由市面上購得或由非商業供貨處取得。、= 心ADPRC可從宰殺的動物(不包括人類)直接萃 活體或屍體（包括人類）之檢體樣本、使用非用於手術或吟斷 過程之動物（包括人類）組織、由細胞培養、組織培養及/或使 用生技技術來取得。 若ADPRC係得自宰殺的動物（不包括人類）或檢體樣 本，則係將所欲的器官或組織，較佳地心臟或心臟組織移出 並將所欲的部分例如整顆心臟、心室及/或乳頭肌或其組織 提取出。樣本可裝架好’用於與作用潛在性有關的方法中。 再者，膜’特別是肌漿網膜’可如Kranias等人所揭示作丨〇比丨111· Biophys. Acta, 709, 28-37, 1982)，由心臟中萃取出。萃取的 生物物質可清除脂肪及結締纟且織並可於適合的緩衝液，較佳 201219784 地冷的水性緩衝液’更佳地_性pH之冷的水性緩衝液 質化。缓衝液較佳地可保持心ADPRC之活化形式，並_ 擇以避免酵錢性且__免化合物及/錢質沉殿= 可離心且上清液可過濾、。較佳地，樣本係經離心並過慮^ 次。所產生的團塊可再懸浮於水性緩衝液中，較佳地中性 之水性緩衝液，較佳地保持心ADPRc之活性。這些離心 再懸浮步驟可重複數次。最後，適合用於所欲測量:蛋^ σ 濃度可調整。較佳地，蛋白質濃度可介於〇1至ι〇〇毫克/ 毫升，更佳地介於0.5至50毫克/毫升，甚佳地介於至 25毫克/毫升，最佳地介於5至1G毫克/毫升。視需要，縣 浮液可冷凍並儲存於冷凍狀態，較佳地溫度係從_2〇qc ^ -80oC。 視需要，ADPRC蛋白可以任何本項技術中已知的方法 來純化。較佳地，ADPRC蛋白係以層析法（包括但不限於） 親和層析法、離子交換層析法、粒徑排阻層析法、Ηριχ、 FPLC及/或UPLC或其組合來純化。更佳的，adprc蛋白 係以親和層析法及/或FPLC純化。甚佳的，所用的層析微珠 係具有適合選擇性及蛋白結合之表面功能化。文中，術語「選 擇性」並未排除微小程度上緊密地與相關蛋白纟士 A及其他香 白及/或其他分子結構之非專一性結合’但較佳地可理解為 與ADPRC蛋白結合。在本内文中，「適合結合之表面功能化」 可包括ADPRC蛋白之固定配體。這些配體可共價性或祚共 價性與表面連結’較佳地其係以共價連結。在本内文中，術 語「連結」和「結合」可相互交換。視需要，配體係經由本 201219784 項技術中已知的連結劑與層析微珠表面相結合(例如PEG連 結劑、烧基連結劑、脂肪酸連結劑或警胜肽連結劑）。該配 體可為已知的或未知的ADPRC之交互作用對象。較佳地， 該配體可為已知的ADPRC之交互作用對象。更佳地，該配 體為菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、菸鹼醯胺鳥嘌呤二核 苷酸(NGD)、菸鹼醯胺次黃嘌呤二核苷酸(NHD)、2589或 4825。可將含ADPRC蛋白之粗溶液加到含前述微珠之管柱 中’調整流速使ADPRC蛋白結合得以進行。然後，在不會 擾動ADPRC蛋白與微珠結合但降低其他蛋白及其他類的分 子含量下’以適合的緩衝溶液清洗管柱。最後，以適合溶離 ADPRC蛋白之緩衝液溶離ADPRC。 另外’ ADPRC蛋白可以凝膠電泳加以純化，較佳地聚 丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)’更佳地以PAGE-為基底的電泳預 防蛋白質降解及/或變性，例如本項技術中已知的藍色非變 性電泳(Blue Native Electrophoresis)。再者，特異化的電泳法 例如2D電泳(例如2D-PAGE)、毛細管電泳(CE)及/或等電聚 焦（EF)可用於純化ADPRC蛋白。 另外’ ADPRC蛋白可以沉澱來純化。其可藉由缓慢地 增加添加到緩衝溶液含溶解的ADPRC蛋白之添加物濃度。 此添加物可包括(但不限於）無機和有機鹽類、乙醇、曱醇或 丙酮或其混合物。另外，沉澱可藉由減少鹽濃度（例如透析 樣本）、加熱或冷卻溶液或使用剪切應力。 另外，ADPRC蛋白可以微珠沉澱加以純化。本處係使 用帶有適合與蛋白選擇性結合的表面功能化之承載微珠。文 201219784 中’術語「選擇性」並未排除微小程度上緊密地與相關蛋白 結合及其他蛋白及/或其他分子結構之非專一性結合，但較 佳地可理解為與ADPRC蛋白結合。在本内文中，「適合結合 之表面功能化」可包括ADPRC蛋白之固定配體。這些配體 可共彳貝性或非共價性與表面連結’較佳地其係以共價連结。 在本内文中，術语「連結」和「結合」可相互交換。視需要， 配體係經由本項技術中已知的連結劑與層析微珠表面相結 合(例如PEG連結劑、烷基連結劑、脂肪酸連結劑或警胜肽 連結劑）。該配體可為已知的或未知的ADPRC之交互作用對 象。較佳地’該配體可為已知的ADPRC之交互作用對象。 更佳地，該配體為菸醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、於酸胺鳥 嘌呤二核苷酸(NGD)、菸醯胺次黃嘌呤二核苷酸(NHD)、2589 或4825。這些微珠可加到含ADPRC蛋白之粗溶液中。微珠 和ADPRC蛋白可在能使ADPRC蛋白與微珠結合的條件下 培養。隨後’將微珠清洗一或多次。較佳地，清洗係以離心 來進行。最後’使用本項技術中已知的適合緩衝液，將 ADPRC蛋白從微珠中分離出。 視需要’上述的純化方法可彼此相互組合或與本項技術 中已知的其他純化方法組合。含純化蛋白之溶液可視需要脫 鹽，或缓衝液可以任何本項技術中已知的方法來改變（例如 以透析、自旋管柱、交叉流動系統、離子交換層析等）。再 者，蛋白可以熟習本項技術者已知的方法加以濃縮（例如透 析、自旋管柱、父又流動系統、離子交換層析等）。溶液之 鹽含量及蛋白含量可視所希望的進一步用途來調整。 13 201219784 純化的ADPRC蛋白可用於分析中及/或如申請書中所 述功能分析中分析。再者，純化的ADPRC蛋白可用於胺基 酸定序。許多用於胺基酸定序之方法已為熟習本項技術者所 熟知’其包括(但不限於)化學定序法(例如埃德曼降解、柏格 曼降解）質量指紋圖譜（MALDI-MS)或質譜定序（esi_ms， MALDI-MS)。視需要，質譜定序係以熟習本項技術者已知 的MS-MS或MSn實驗來進行。本處，係將蛋白或其片段離 子化(較佳地以ESI或MALDI離子來源）。選擇特定質量範 圍的離子並分離。然後將離子化的胜肽片段部分降解並分析 降解產物。此可進行一次(MS-MS)或η次(MSn)。典型地， MSn定序係使用離子阱(IT)或FTICR系統來進行。辨識出蛋 白或其胜肽片段的胺基酸序列。 ADPRC蛋白的胺基酸序列或其胜肽片段的胺基酸序列 可用於找尋熟習本項技術者已知的蛋白及/或基因體資料庫 (例如PubMed、SwissProt等）中各別的胺基酸序列及/或核酸 序列（如此，DNA及/或RNA序列）。 另外，心ADPRC可從細胞或組織培養來取得。細胞培 養可源自所欲的生物體，較佳地係來自該生物體所欲的組 織。同樣的，組織培養可源自所欲的生物體，較佳地係來自 该生物體所欲的組織。此等細胞或組織亦可勝任表現所欲的 蛋白，如，功能性心ADPRC蛋白。細胞可為能增生的或不 能增生的。在本發明内文中，術語「細胞培養」係指本項技 術中所揭示用於活體外培養細胞之所有方法。就此，細胞可 於培養基中及於適合的溫度下培養。培養基可含有營養素 201219784 (例如糖、鹽類、胺基酸和脂質）、緩衝系統（通常包含— 或多種化學緩衝物質例如磷酸鹽、磷酸氫鹽及/或低或無毒 的Tris’及/或放入二氧化碳(C〇2)氣體)及/或視需要一或多種 抗生素。許多適合的細胞培養基可從市面上購得。

為了提供足量的營養素及/或移除代謝物，當需要時可 更換培養基’权佳地係以疋期的方式。細胞通常係於包含5% (體積/體積)C〇2及相當高的相對溼度(例如9〇%溼度)之適合 的，氣下及適合細胞的溫度下培養。溫度可依細胞而變（二 如哺孔動物和昆蟲細胞\約37〇C，酵菌 分的細菌：介於20至W間）。 大。P 咬里f外，心ADPRC可表現或過度表現於有利的細胞及/ 貝表現。在本内文中，術語「細胞」可指細菌細胞或真 旦、田胞。術語「過度表現」係指相較於各細胞之天然的表現 ^由其中功能性ADDRC之表現量較高之情況。過度表現可 添加刺激心ADPRC表現之化合物或其前驅物或藉由一 ^種^項技術中已知的生技技術法來進行。術語「異質表 現之生物體中的表現。 驅物不為天然表 編喝生物技術方法可關於以使用-或多種 息之八/心之=子為主的任何方法。較佳地，編碼基因訊 發明二可為去氡核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。在本 ㈣^中’術語「歷」亦包括亀之功能衍生物或取 ⑽化舰、狀核酸(PNA)、嗎福琳基或鎖核酸 木d、胜肽、脂質或小分子等接合之DNa)。同 201219784 樣地，在本發明内文中，術語「RNA」亦包括其功能衍生物 或取代物(例如甲基化RNA、肽核酸(PNA)、嗎福琳基或鎖 核酸(LNA)、與染劑、胜肽、脂質或小分子等接合之rna)。 最佳地，編碼基因訊息之分子為DNA。有利的Dna可得自 天然來源，特別是由有利的細胞中萃取，更特別是心臟肌肉 細胞，或可用化學合成。如本項技術中所揭示的及熟習本項 技術者所熟知的’其可得自基因體或cDNA庫。所得到的 DN A可不經過增幅或可以一或多種本項技術中所熟知的生 物技術來增幅(例如聚合酶連鎖反應(PCR)、於細菌中增幅， 較佳地增生細菌、反轉錄或於真核細胞中增幅，較佳地增生 真核細胞）。 編碼心ADPRC之核酸或其前驅物，特別是DNA，可以 本項技術中已知的任何方法投予有利的細胞，其包括（但不 限於）電穿孔、與幫助吸收的分子錯合（例如轉染劑 (lipofectamine)、陽離子脂質或類脂質、疏水性脂質或類脂 質、陽離子合成聚合物(例如聚乙稀亞胺(PEI))、疏水性聚合 物、細胞穿透肽(CPP)、抗微生物胜肽、蛋白質轉導區（PTD)、 多糖(例如幾丁聚糖）、類病毒粒子、DNA-或RNA-相互作用 蛋白）、與幫助吸收的分子接合(例如脂質體(lip〇fectamine)、 陽離子脂質或類脂質、疏水性脂質或類脂質、陽離子合成聚 合物（例如聚乙稀亞胺(PEI))、細胞穿透肽(CPP)、抗微生物 胜肽、蛋白質轉導區(PTD)、其他轉染劑或其組合物）、插入 病毒及/或病毒的噬菌體基因體及/或可感染有利細胞之噬菌 體(例如桿狀病毒、腺病毒或牛痘病毒）、微米或奈米珠、聚 201219784 f 及/或微脂體、冷决侧環及/或基因搶系統(例 二孟ί為基底）。核酸，特別是⑽A或其功能衍生物，可 為直鏈或環狀(例如質體、細祕_或病毒基因體）。 、扁石馬所欲基因机息之分子，特別是DNA，可插入宿主 細胞基因體中或可為染色體外的(例如質體）。術語「宿主細 I」係&該基g表現於其巾之細胞，無論是細_細胞或真核 細胞，且不論該細胞為本質上表現心、ADpRC <不表現心 ADPRC。較佳地’異質宿主細胞可為細菌細胞或細胞株之細 胞。適合的細胞株之實例包括(但不限於)ΗΕΚ 293、745·Α、 Α-431、BxPC3、C5N、Caco-2、Capan-1、CC531、CFPAC、 CHO、CHO lU、COS-1、COS-7、CV]、EAHY、EAHY 926、 F98、GH3、H-295 R、H-4-II-E、HACAT、HACAT A131、 HEK、HEL、HeLa、Hep G2、High Five、Hs 766T、HT29、 HUV-EC R24、HUV-EC-C、IEC 17、IEC 18、Jurkat、K 562、 KARPAS-299、L 929、LIN 175、MAt-LYLU、MCF_7、MNEL、 MRC-5、MT4、N64、NCTC 2544、NDCK II、Neuro 2A、 NIH 3T3、NT2/D1、P19、SF9、SK-UT-卜 ST、SW 480、SWU-2 OS、U-373、U-937及Y-l。其他適合的細胞為該等熟習技 術者已知的細胞。 較佳地，編碼所欲基因訊息之分子，較佳地DNA，包 括有利的基因、啟動子區域、起始禮、碼子和終止密碼子。基 因訊息可永久或在抑制子及/或啟動子區域的控制下表現。 所得到的細胞可直接使用或用於組織培養或可收集該等細 胞並藉由破壞該等細胞得到包含心ADPRC之樣本。細胞可 17 201219784 藉由任何本項技術中已知的方法來破壞，其包括(但不限於) 超音波處理、低張破細胞緩衝液、清潔液、ultraTurrax、法 式屬遽亞、冷;東-解康猶環、機器均質及刮下。 另外，DNA或RNA可用於細胞或無細胞表現的系統 中，例如微陣列系統，其中DNA或RNA係經固定化並藉由 添加包含轉#及/或轉錄所需因子（酵素、核糖體、觀A、胺 基酸、核芽酸、ATP等)之功能性細胞解離液來轉譯及/或轉 另外 C AJJ亂亦可表現在_培射。術語「組織 培養」係指其中培養形成三維網路之細胞群族的方法 。該組 ^在培養中由細胞本身形成或可形成由細胞產生的胞外 ^占培養可在天然或人卫的胞外基質（例如膠原蛋白、彈 苯乙烯、尼龍、聚離胺酸)上進料此組織可從 =包括人雖得。培養基可含有營養素（例如糖、鹽類、 月;r、緩衝系統(通常包含-或多種化學缓衝物 貝^魏鹽、魏氫鹽及/或低或無毒的加，及/或放入 -氧化奴(C02)氣體)及/或視需要—或多 或移除代謝物，當需*時可更气一 t要’組織培養可灌注培養基。該灌注可為怪定性或脈衝 士 Γ、* ::节ADPRC之需要1可以任何方式來提供，你 生==!、，心ADPRC’或(ii〜 生物科技方法來提供。心ADprc可:& j *於溶液，例如溶於海 衝液或於膜中或細胞、組織、器官或生物體中。心ADpR| 201219784 的示例來源之it-步詳情係顺本 _ 者應能連結現行方法調整所需 *中。熟驾技術 適應所希望之蚊紐設^的生姊化學㈣之來源，以 整個發明中，術語「化合物」可指任何化學性質之任何 试驗物質。名稱「化合物」可與「試劑」、「物質」或「化學 物質」相互交換。其可指分子量低於5 〇 〇道爾頓大小之小分 子或其鹽，高分子量化合物例如蛋白f、多肽、去氧核糖核 酉夂(DNA)、核糖核酸(RNA)、合成的聚合物、抗體及/或抗體 衍生物(例如Fab片段、單鏈抗體、雙聚抗體、三聚抗體、 柔勃抗體、早株抗體）。化合物可帶電或不帶電。再者，化 合物可為親水性、疏水性或兩性。化合物可為一或多種無機 鹽、一或多種鹽離子或一或多種金屬、一或多種無機鹽或離 子之一或多種錯合物及/或一或多種金屬之錯合物，較佳地 係與一或多個有機分子錯合。另外’化合物可為氣體。較佳 地’化合物可溶於水性缓衝液或水性溶劑中。化合物可為已 用作藥物或醫藥品。另外，化合物亦可為治療用途未知的化 學物質或甚至用於分析中化學性質未知的物質。再者，術語 「化合物」亦可包括可用於此方法中作為分子前驅物之物 質。特言之，其可用作需要在測量前立即合成之不穩定物 質。本處，可施用本項技術中熟知的偶合酵素分析。此外， 其可用作如常用於藥學中之前藥，如必須先代謝之後展現其 作用的分子（例如活性化合物之乙醯化、脂化(lapidated)或氧 化前驅物）。 另一種選擇或另外地，化合物可與一或多個其他的分子 201219784 例如小分子、胜肽、蛋白質、多糖或合成的聚合物接合或結 合。較佳地，其可與一或多個小分子染劑（例如螢光染劑如

Cy 染劑（例如 Cy3、Cy5、Cy5)、Alexa 染劑（例如 Alexa488、

Alexa 546、Alexa 647)、S染劑（S0387)、螢光素及其功能衍 生物(例如FITC)、羅丹明（rhodamine)、HOECHST染劑等， 或UV/Vis染劑）、一或多個量子點、一或多個結合分子（例如 生物素、糖皮質激素或包括例如一或多個活性酯、異硫氰酸 酯、馬來醯亞胺或其組合物之基團）、一或多個可溶及/或不 可溶聚合物（例如聚乙二醇（PEG)、曱基丙稀酸經丙基酯 (HPMA))、一或多個自旋標記、一或多個及/或微米或奈米微 珠(例如功能化矽氧微珠、糖微珠、聚合物微囊)接合。再者， 該化合物可經放射線標定，例如經適合閃爍分析、電腦斷層 成像(CT)之3h、32p、35s、i4c或鑭系元素標定，或帶有適 合正子攝影(PET)之標記。心ADPRC可以重同位素標定，例 如以質譜(例如ESI-MS或MALDI-MS)或核磁共振(NMR)可 偵測的、13c來標定。 如文中所用’術語「方法」以最廣泛的定義可理解為實 驗活動或製程。其較佳地係指化學、生化、生物、藥學、生 生理學、電生理學、病理學、毒物學、醫藥及/或治療程序。 、：如文中所用，術語「分析」，與其名稱「分析」無關， 以最廣，的定義可理解為「試驗系統」、「篩選」、「篩選程 序^、「4選方法」、「篩選技術」、「實驗處理」、「實驗程序」 或類f名稱。其應可理解為可用於檢定含特定性質或用於定 性特疋化合物之所有方法。其可包括試驗一或多種樣本以及 篩檢含許多樣本之資料庫。 20 201219784 當進行該方法時，所接 、 觸。在本發明内文中五ADPRC可與化合物接 為讓心ADPRC與-v 」以最廣泛的定義可理解 方法。較佳地，此可/由的化合物相互作用之任何 -或多種化合物於適二：心―C之溶液與 合。此混合較佳地係以移液來進行，更= 2中混 :言:了C及另1含化合物的溶液來:行:：:= 的貫_中，可以自動移液來進行接觸。 物。二乂此方去可用於鑑定具有抗心律不整作用之化合 係护，二12文中，術語「鑑定化合物」以最廣泛的定義 二人：時，找出對心ADPRC酵素活性顯現效用 1 ° 特別疋，當與其接觸時，對心ADPRC酵素活性 顯現抑制效用之具有抗心律不整效用的化合物。 術，「抑制劑」可與「拮抗劑」、「去活化劑」、「作用藥 ii、枯tt制作用之化合物」&「去活化化合物」及其他使 外，、' 已知的酵素活性去活化之物質的名稱通用。另 ADP^驗系統應使用功能性心ADPRC酵素或包括功能性心 ts樹之分子組成物。酵素可從組織或從細胞中萃取，或 可異質上表現在真餘胞或Μ細胞。 制劑結合降低了與抑制劑結合的酵素之活性。抑 !!=5逆或不可逆。不可逆的抑_通常係與生物 W新兩用並於化學上將其改變。這些抑制劑可例如修改活 '〶之主要胺基酸殘基。反之，可逆的抑制劑為非共價 2] 201219784 結合且不同種類的抑制作用係依照這些抑制 分子結合所產生。 ，、生物 若化合物對^ ADPRC具有專—和顯㈣降低效用 該化合物經妓為- ADPRC之抑制劑，且因此為I奸1 律不整效用之化合物。在本發㈣文巾，ADpRc之抑= 係指與對照_比較’降低心ADpRC酵素活性之化— 熟習本項技術者了解以學生t_檢定伽_，“姻)或；方产 定(chi-sq職㈣分析二個值間是否相互具顯著差異之统^ 程序。 在-較佳的實施例中，酵素活性總計為對照組 90%，較佳地最多75%，更佳地衫观或嫣， 最多30%及最佳地最多20%。 較佳地，係由一群化合物(較佳地由化合物庫）中鎅定一 或多種化合物。如文中所用，術語「鑑定化合物」可^「横 測化合物」或「找尋化合物」通用。術語「鑑定」於文中可 理解為相對術語，因明顯地對於熟習本項技術者必須仏予一 特定閥值，其中抗心律不整及/或對心ADpRC2酵/素二性的 抑制效用須夠強而得以指出該化合物稱為「鑑定」。應/了解， 閥值係大大地依實驗設定而定且可依照此方法之目^或鑑 定的抗心律不整化合物之希望用途作調整。 3 如本發明内文中，抗心律不整作用較佳地係測量為化合 物對心ADPRC酵素活性之抑制效果，該閥值較佳地可以二 定的IC%值來表示。如一般本項技術所知的，圯以值係指酵 素活性之半數最大抑制作用需要的化合物濃度。顯然

S 22 201219784 值為一相對值，係 素的活化狀態、北'因列的因素而定，其包括酵素量、酵 化劑和抑子的存在例如共活化劑或共抑制劑、活 等。在本發；內：Ϊ及環境條件例如鹽滚度、溫度、PH值

llM，千，化合物較佳地，當IC5〇值係低於50 μΜ，低於2〇 M 於㈣，低於2 寧’低於5μΜ，低於4μΜ，低 ^ 、 _’低於 1 μΜ，低於 〇.5μΜ，低於 〇.4μΜ， 供 η n ’低於 〇.2 μΜ，低於 Ο.1 μΜ，低於 0.05 μΜ， 闲^养^μΜ或低於〇,01 μ]ν^^ ’可鑑定為具抗心律不整作 用之化合物。 士 /抗心律不整作用」係如本項技術所知來使用。特 :2 士其係描述抑制與稱為心律不整之心臟節律的頻率和規 ’。有關的障礙或由心臟不正常的電活性所造成的其他作 、律不整在數種疾病中扮演著重要角色，例如心室性心 專過速^心室纖維性顫動、心房纖維顫動及心房撲動。 s ^ σ物之抗心律不整效用可藉由測定腺苷二磷酸核糖 衣化酶（心ADPRC)之活性來測量。結果可以心臟細胞、心臟 組織或心臟之電生理學紀錄來確認。 正個發明中，術語「測定活性」以最廣泛的定義可理解 為~Γ用於疋出心ADPRC功能性之特性的任何方法。較佳 地，其係關於心ADPRC酵素活性之定性。酵素活性可能分 別與於醯胺腺嘌呤二核苷酸(N A D)形成環狀腺苷二磷酸核 糖（cADPR)有關之催化活性或與代用物例如nad及/或 cADPR之代謝有關之催化活性相關。較佳地該adprc因 與抑制化合物培養而顯現酵素活性下降。示例的，酵素活性 23 201219784 之測：係如本發明之實例中所示。術 ==為可代替天然受質例如格醯：；:最， 酸(NAD)被代謝及/或酵素性轉化之分？。脲ο—核苦 為工仙化*物之抗心律不整作用’。A ，化合物的存在下相對於對照 ， 文中可指正對照，如不含 ^對照」在 完整樣本。因添加帶有抑制效用之:::轉化率之化合物的 樣本可顯現對照組更低_化率二外，，化合物的 ADPRC活性無_受質轉化可藉由 =’因此與 的個別緩衝液巾之樣本來測量 於缺乏酵素 無受質之轉化。熟f本項技術者^景樣本中將無或幾乎 景樣本分別可根據實驗的設;;*對照組組合物及背 :實驗設定應了解係為示二揭示 圍。 η、丨民剌本發明之範 再者，本發明方法可用 之活性和功能，特= ::: =， 可用於酵素動力學研究。抑制 ：化口物之存在下。其 與心ADPRC相互作用而直接用，之化*合物可藉由本身

的分子共因子相互作用而間接’或可藉由與心ADPRC 改心ADPRC之量。化合物盘在藥理作用之位置修 ADPRC的相互作用，可為共價或、^目標間特別是與心 無競爭性、鮮性、雜爭料變^胃或複合鍵’其可為 作用位置可為組織或細胞，特令夕、在本内文中，藥理 。之心臟細胞或組織，更特言 24 201219784 之〜肌細胞或組織或該細胞之胞内胞器，特言之 肉偷5|，π 胎 —β 更特言之肌漿網或膜，特別是肌漿網膜。化合物^ f樂理作用位置增豐或消耗。再者，此方法可用於開發、: 定及/或定性與其相互作用的化合物，特別是將其活化或= '舌化丄更特言之，將其去活化之化合物。再者，此方法可用 於測定心ADPRC濃度或組織中心ADPRC的酵素活性。再 者’此方法可用於測定心ADPRC之突變形式。再者，此方 法T用於定性心ADPRC之性質及/或心ADPRC之突變形 式。 在-較佳的實施例中，心ADPRC為一胞内膜結合之心 ADPRC，特言之肌漿網膜結合之心ADpRC。 在本發明内文中，術語「膜結合」係指集中於生物膜中 或與生物膜連結。生物膜如熟習本項技術者所知，為脂雙 層。另外，心ADPRC亦可集中於由脂質、磷脂質、類固醇 或有機化合物或其組合物所組成的人工膜中或與其相連 結，或心ADPRC亦可集中於微膠粒、微脂體或聚合物微囊 膜或表面或與其相連結。 術語「肌漿網」可如一般本項技術中所知來解釋。因此 其可視為一種胞器，典型地係在肌肉細胞中並幫助鈣離子二 儲存且因而在肌肉收縮上扮演著重要角色。 在一較佳的實施例中，心ADPRC為哺乳動物來源之" ADPRC ’特言之係來自人類、豬、天竺氧或大鼠特別是; 或人類心臟。 在本發明内文中，術語「來源」僅係關於心adprck 25 201219784 起源的天然來源，亦即所用的多肽之序列係從其所衍生。其 不應視為限制心、ADPRC之實質和物質來源。再者，心 ADPRC村料地從哺乳動物細胞及/料他物種的組織中 /刀離出’但亦可表現在細菌或真核細胞培養或真核組織培養 一系列的試驗設計已為本項技術所知，本發明之方法可 據此做調適。進-步詳細的示例係如實例所示鳴驗可為異 質性或同質性分析。如文中所用，異質性分析為包括—或多 個清洗㈣之分析，而在同質分射此清辭㈣不需要並 合及測量。熟習本項技術者應能調整試 =統，例如猎由添加連結現行方法所f之另外的試劑，使 其適用於所欲的特定試驗設計。 “二Γ㈣’此分析係設計用於測定心adprc或1衍 生物之酵素活性。如上所提，心AD 仃 腺嗓吟二核苷酸(NAD)形㈣狀腺苦缺一催化於驗醯胺 或於驗醯胺鳥$吟二核芽酸(Ngd 广核糖(eADPR)， 糖(cGDPR)，或於顏胺次黄^ 狀鳥*二碟酸核 肌苦二雜核糖(elDPR)之酵素。因形成環狀 質之減少量及/或由c ADPRC催彳卜&此酵素活性可由受 測量。 的反應產物之增加量來 明顯地 ，酵常的活性係受一連串 的量、酵素的活化狀態、共因子的存在因子影響，包括酵素 制劑、活化劑和抑制劑的存在及環子卢例如共活化劑或共抑 度、pH值等。通常，酵素活性係二2條件例如鹽濃度、溫 糸在襟準的實驗室條件下測 26 201219784 量且適於所論及的試驗系統之最適條件。因此，試驗系統可 用於偵測或鑑定改變酵素活化狀態之分子，例如可用作治療 劑之活化劑或抑制劑。 、、 為了得到所欲的酵素活性，測量可在適合心ADpRC酵 境中進行。較佳地，此方法係於中性pH之 緩衝液中進行，更佳地係於約pH7的緩衝液中進行甚 佳地係於PH 7包含Tris-Malat、氣化鉀(KC1)、蔗糖 =轉抑制劑及/或二甲基亞颯(D_)之緩衝液中進行。較 止化在所㈣緩衝液巾鱗活性，及較佳地防 Ϊ中：：，沉澱。視需要’樣本可於適合酵素活性的溫 2〇l；〇 C 1〇 ^ 4〇〇C 5 方法部八^ 最佳賈。所用的方法係詳細描述於 法同樣;能::合應了解，這些方法係為示例性且其他的方 可隨不_批件而變性㈣，所以此濃度 固定:in，用於分析之心龜°可為膜結合性的，可 固疋在表面（例如為微陣 :肌=二_為_，===: —的代用物可由生理化學方法來制，更佳地 27 201219784 以光學方法例如螢光偵測或測量吸光度。 甚佳地，可由光學方法彳貞測之分子可為（i)因被酵素轉化 而改變其螢光譜之分子，（H)因被酵素轉化而形成螢光劑勞 光產物之非螢光前驅物，（iii)可由其光化學性質偵測出之代 用物或分子複合物(例如其UV、IR或可見光譜之特徵吸光度 或其螢光），（iv)因被酵素轉化而可裂解成帶有改變的吸收光 譜之產物的代用物(例如對硝基苯基酯），（v)因被酵素轉化而 發射出光致螢光之前驅物，或(vi)經一或多種染劑標定之分 子（例如可被UV/Vis光譜儀偵測出之染劑、螢光染劑例如 Cy 染劑（例如 Cy3、Cy5、Cy5)、Alexa 染劑（例如 Alexa488、 Alexa 546、Alexa647)、S染劑(例如S0387)、螢光素及其功 能衍生物(例如FITC)、羅丹明、HOECHST染劑）。 較佳地，可偵測的代用物可為因被酵素轉化而改變其螢 光光譜或強度之分子、因被酵素轉化而形成螢光劑螢光產物 之非螢光前驅物，或可裂解成帶有改變的吸收光譜或改變的 吸光強度之產物的代用物，更佳地，因被酵素轉化而改變其 螢光光譜或強度之分子、因被酵素轉化而形成螢光劑螢光產 物之非螢光前驅物，甚佳地菸鹼嘌呤核苷酸衍生物，最佳 地，菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、菸鹼醯胺鳥嘌呤二核 苷酸(NGD)或菸鹼醯胺次黃嘌呤二核苷酸(NHD)。NAD、 NGD及/或NHD分別可轉變為環狀腺苷二磷酸核糖 (cADPR)、環狀鳥苷二磷酸核糖(cGDPR)及環狀肌苷二磷酸 核糖(cIDPR)，其可經由其螢光被偵測出。 另外，可偵測的代用物亦可為經高親和性結合的結合對 象所標定之分子（此結合對象有，例如生物素-鏈黴親和素、

S 28 201219784 甲胺蝶吟二氫葉_旨等）紐輯標定之代用物。 之酵素活性可使用上述代用物相量，特今 之’測里-段時間内可偵測分子之訊號改變，更特言之，’ 罝一段時㈣螢光訊號之改變。較佳地，-段時間内之螢光 訊號係於特定相咖後所㈣，更佳地，此科間間隔係 在數分鐘的範圍内。在每次測制隔，樣本可於所欲的條件 下培養。 在一較佳的實施例中，心ADPRC之活性係由測量心 ADPRC f質轉化為產物來測定。受質之轉化係、與酵素、心 ADPRC催化性改變或化合狀代射關。就整個發明，術 語「受質」係關於可被心ADpRC代謝之任何化學物質。較 佳地，此受質為分子量低於5〇〇道爾頓之小分子。 在一較佳的實施例中，此受質為菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷 酸(NAD)、綠醯胺鳥臂呤二核練(NGD)或祕酸胺次黃 嘌呤二核苷酸(NHD)。因此，受質之轉化較佳地係以可被有 效璜取之方法來測量，例如經由酵素分析，較佳地經由螢光 偵測來讀取。此受質，特別是NAD之代用物可⑴添加至可 k其仔到生物物貝之對象中，如動物（不包括人類）、組織或 細胞，（ii)在實驗開始前加到反應混合物中，（m)於樣本培養 期間添加，（iv)於樣本培養後但在測量前添加或(v)於樣本培 養後及測量期間添加。 此外，一或多種本發明化合物可加到反應混合物中。化 合物可(i)添加至可從其得到生物物質之對象中，如動物（不 包括人類）、組織或細胞，（ii)在實驗開始前加到反應混合物 29 201219784 添加添加，（iv)於樣本料後但在測量前 ^ 、樣本培養後及測量期間添加。 更佳料活性細酵素分析來測定。 … PRC謂素时H光來測定。 地，：：「「ϊί」於ΐ中係如本項技術中所知來使用。較佳 發，而^㈣I係指由分子或—群分子被較短波長之光激 效應，! 士父長波長之光。另外，術語螢光亦可包括雙光子 ^了， °由以較長波長的雙光子激發之分子所發射的單光 再者，可包括其他的光物理效應，例如依三重皞 效應如螢光。 心的 如上所述，術語「以螢光測定」，較佳地係指偵測—段 時間内的螢光訊號改變，可藉由（i)於螢光光譜儀或顯微裝置 中價測螢光強度之改變，⑼於螢光光譜儀或顯微裝置中僧 測螢光光譜之改變，（iii)於適合的裝置中例如經由顯微裝 置、經由螢光相關光譜(FCS)、經由螢光交叉相關光— (Fccs) 或經由螢光消偏振分析、經由螢光共振能量轉移(F RE T)之方 法或經由增幅螢光親近同質分析(ALPHA)偵測螢光分子移 動之改變來測量。這些偵測技術已為熟習本項技術者所知。 較佳地’偵測一段時間内的螢光訊號改變可藉由偵測螢光強 度之改變來測量。更佳地，此訊號係於螢光光譜儀中測量， 甚佳地於適合微量滴定盤之螢光光譜儀中測量。較佳地，螢 光係由UV範圍之激發來偵測並以較長波長來偵測發射光， 更佳地，係於250至300 nm間激發，而於380至450 nm間 偵測，甚佳地，係於275 nm激發及於400至420 nm間彳貞測，

S 30 201219784 最佳地，於275 nm激發及於410 nm偵測。所用的方法係詳 述於方法部分。然而，應了解，這些方法係為示例且其他的 方法同樣可能亦適合。熟習項技術者應能針對分子及所戽的 測量方法調整激發和偵測條件。 各樣本之心ADPRC活性可由隨時間改變的螢光加以定 義，亦即螢光對時間之直線的斜率。這些結果可由實例中所 示的線性回歸來取得。添加帶有抑制效用之化合物將會造成 所觀察的受質較慢轉化及較慢生成產物，並因而為較平後的 動力曲線。添加帶有活化效用之化合物將會造成所觀察的受 貝較快轉化及較快生成產物，並因而為較陡的動力曲線。添 加不具效用之化合物將不會影響受質之酵素性轉化及虞物 生成，並因而不會改變動力曲線的陡度。 因此可從這些結果得到濃度反應曲線。這些妹玎以 ίΓίΓ並以不同的模型，特別是以用於藥理“究之 以熟習本項技術者熟知之希爾方程式(薦 eqUat1〇ri)M合來呈現。最後， 飞（ 值)及/料最大抑制濃度(IC5。值Η 度 若個別的化合物係顯示為抑 上、IC5。值。 造成心物雜紐，則可 酵素活性之改變來σ物之效力可糟由測量 專一或顯著的效用、此化合#= 合H驗系統上具有 劑。在本發明内文_ υ卜入疋為心、ADPRC之調節 此，其較佳地係為心ADPRC° =具有抗心律不整效用。因 果作比較，數學方法例如統計 31 201219784 檢定來分析。 螢光偏振(F P)為主的分析為使用偏振來激發螢光受質 或化合物溶液之分析。這些受質或化合物在溶液中為游二 及擾動的，使得發射光變為偏振。當受質化合物與較大分子 結合或其大小因裂解而顯著減小時，其擾動速率會大大降低 而發射的光仍高度偏振。 _ 螢光相關光譜(FCS)為一廣泛使用的方法，其係以測量 溶液中螢光化合物速度的共軛焦光學系統為基礎。因其較2 的斯托克斯半徑(Stokes radius)，化合物與高分子目標結合較 慢’而可偵測到螢光分子之結合及/或裂解。螢光交^關 光譜(FCCS)為與FCS相似之方法，但可偵測二或多個不同 的螢光體。其提供所有得自FCS之結果並另外給予與二個聯 合分散之不同標定的螢光粒子比例有關的資料。因此，FCC^ 係提供二個不同標定的結合對象之結合或二個不同結合勞 光體間化合物裂解的資料。 ALPHA為最初由Packard BioScience所開發的一種溶液 刀析。ALPHA為一種螢光親近分析，其中一作用對象係與 供體微珠相連接’而另一係與受體微珠偶合，二者皆具有僅 約250 nm的直徑。光敏劑化合物係嵌入供體微珠中。此化 合物因以波長約680 nm的雷射光發光，使得環境的氧轉變 為富含能量、壽命短的單態氧。當親近中無受體微珠時，單 態氧衰減而無產生訊號。若供體和受體微珠藉由連附的生物 分子之生物交互作用相合時（約250 nm)，由供體微珠釋放出 的單態氧在受體微珠附近引發發光/螢光聯集，造成訊號在

S 32 201219784 520 nm至620 nm範圍内咼度增幅。於適合的判讀器上積測 此發光訊號。更詳細的ALPHA技術，請參見Ullman等人， 1994, Proc. Natl. Acad. Sci” USA 91，5426-5430。 另外，酵素活性亦可以免疫化學方法來測量，其包括(但 不限於）酵素連結免疫吸附分析（ELISA)，包括三明治 ELISA。本處’酵素反應的轉化產物之受質如本項技術中所 知可作為抗原或半抗原。轉化和非轉化樣本可引起不同的訊 號強度。ELISA分析係由不同的公司所供應。其為用於偵測 樣本t存有抗體或抗原之生化技術。抗原亦可為小分子，例 如受質或心ADPRC受質之連結物，或由心ADPRC所催化 ，反應之產物。再者，受質或轉化產物亦可作為半抗原。施 行elisa涉及至少一具有特定專一性之抗體。一般而言， ，樣本中未知置的抗原係固定在表面。係在表面上沖刷特 2體。此抗體與產生可侧訊號(例如顏色改變或榮光)之 目連接。例如，將含未知抗體量的樣本固定在一固體載 ^常為微量滴定盤），非專ι(經由吸收至表面）或專 抓）。將ί A ’經由另外對相同抗原專—的抗體捕 ° 素連接沾& - + 忒本身可糟由以生物結合與酵 溶液冲測。在各步驟間’係以溫和的清潔劑 驟後，如入酵。合的蛋白或抗體。最後沖洗步 =量切見《。財的’產生賴雜本中抗 的分軒係利用具有較高敏感性二顯色受質，而較新 33 201219784 又另-種選擇，酵素活性亦可藉由層析法(例如，親和 :斤離子交換層析、粒經排阻層析法、及/ =!^)中以測量滯科間改變為基礎之技術來測量。特言 右文質和轉化產物之滞留時間可區分，或未結合的受質 =DPHC之滯留時間可區分，則較佳地可使用層析法 較佳的實施财，此方法制於_化合物庫。在 物暂晰/1、合物庫可由多數種可能由多種來源所組合之化學 理合物庫可包括化學合成的物質、生物技術處 咬且％人生成的Μ或由組合化學技術所生成的產物 物。在本發_文中，化合物雜佳 子化合物，更佳地化學合成之小分子化合物。 分子文中術語「篩選」係關於其中施用標準化的 复有種分子分析之組合於錄個化合物，用以測定 J=質，例如，標結合或生物活性，特別S 中，例i、更特別疋抑制酵素活性之方法。㈣可在溶液 中，在：：燒瓶内、反應管、試管、微量滴定盤及其類似物 (不包括如以微陣列模式或於微珠模式，在活體動物 進==活細胞中進行。較佳地，師選可在溶液中 。_較佳地係以消耗少許化合物及/或小量 中 ’使用微量滴定盤模式為較佳。在此微量滴定盤上 、里例如數微升可能就足以供篩選。 細實關巾，此方法細自動化模式來進行， 係模式。在本發明内文中’術語「自動化模式」 '、曰几王或邛分以一或多種技術裝置來控制及/或進行，較 34 201219784 佳地移液機器人。在本發明内文中，術語 關於在短時間内供快速試驗多數個化合物=^式」= =驗化合物之分析時間最短化。此分析較== 孤中進灯’更佳地6·孔盤、12_孔盤、24_孔盤、％·孔盤或 384-孔盤，甚佳地96-孔盤或384•孔盤。 一 本發明第二方面係關於心ADPRC用於鑑定具有抗心律 不整作用的化合物之用途。 在一較佳的實施例中，心ADPRC為-胞内膜結合的心 ADPRC’特言之賴赌合之^ ADpRC或為哺乳動物來源 之〜ADPRC，特別是來自人類、緒、天竺鼠或大鼠， 是豬或人類心臟。 為了確認由上述方法所測定的抗心律不整效用，可於細 胞' 組織或器官中測定心ADPRC活性或c ADPRC抑制劑 之抗：律不整性質。較佳地，其中來自心臟的細胞或組織^ 該器g為心臟’更佳地為來自，。臟之肌肉細胞或肌肉級織， 甚佳地乳突肌肉細胞或乳突肌肉 組織，最佳地乳突肌肉組 織、。細胞或組織可為從動物（不包括人類）新製備，或得自如 上述之細胞培養及/或組織培養技術。在另外較佳的實施例 中’係使用肌肉來測量’較佳地心臟肌肉’甚佳地乳突肌肉。 在另一較佳的實施例中’係使用新鮮製備或提取的心臟。 較佳地’係於器官中測量作用電位，特言之於心臟、組 織特另】疋〜臟肌肉組織或細胞中，特別是心臟肌肉細胞。 ，本文中，作用電位可理解為流入或流出細胞、組織或器 吕’例如乳突肌肉之離子，所生成的電壓改變及/或心臟之 35 201219784 純量電位通常係以心電圖 隨改變流入及流出交佳地此訊號係伴 壓。在本案例中，作用位二已或、，且織的細胞膜之電 更佳地測量電場戋苴變仆x 土可使用電偵測法來測定， a a m♦化之方法，甚佳地電τ於 架好的乳突肌肉之仙電 U錄。可於 肌肉細胞或乳纽m =驗;，可試驗乳突 法的實驗騎_或於實驗進躲糾加人彳τ前、此方 肉細=:=:，就:=，收縮、乳突肌 :可架在適合偵測收縮之裳置上。架 至2G伏特之矩形脈衝， 也0至10伏特之矩形脈衝，最佳地i至 〇ί；〇^ΤΓ ms更佳地脈衝的時間可為〇 的時間可A… ？間7為0至10阳’甚佳地脈衝 於中進行數秒，較佳地 = ^gHz進ws，更佳地㈣幻咖進行3〇s 也於4 &進行3〇 S。在實驗進行期間，觀察的肌肉、 :織或細胞可置於缓衝溶液中及/或以緩衝性灌注。緩衝溶 液可適合心臟細胞活性之測量。較佳地，緩衝液可為市售的 緩衝液或含氣化鈣(CaCh)之緩衝液。氯化鈣之濃产 討增加至5.5福或更高。較佳地緩衝液係具U心门臟 月己組織或肌肉活性之溫度，更佳地低於4〇。(^之溫产，

S 36 201219784 更佳地10至40oC之溫度，最佳地約37〇c之溫度。可於不 同的時間記錄作用電位。其可直接記錄或於數秒後及/或數 分鐘後記錄。 在上述安射，個電位可以任何本項技術中已知用於 摘測作用f位之方絲記錄，例如分子影像法或電生理法。 地可使用電生理法’更佳地_作用電位係經由電極來 進订。違電極可為任何導電物質例如金屬或填充導電溶液之 非導電物質。較佳地，此電極為填充水性緩衝液之玻璃電 極’更佳地此電極為填充氣化鉀(KC1)水溶液之玻璃電極， 充3M KC1溶液。由作用電位產生的電訊號若需要 P幅並可以電腦系統_及/或儲存。較佳地，測量的數 據係以電腦系統來分析。 或另外地，作用電位可經由分子影像法及/ t式細胞個接制。在本文中，例如可使用f壓敏k 木劑或以躲感性_記錄流人及/錢出㈣。這些毕劑 =為熟習本項技術者所熟知。由作用電位所產生的偵測吼 旎，例如影像、訊號或圖，特別是 :=:r系統_或倚存。二== 2陣列日日片以便能更高通量的分析細胞數目及/或自動顒 微鏡。較佳地’所得到的顯微影像可以自動或半 處 Γ:析，以便能定量及比較纟，亮度及/或特二 化合:=:=:，著效用之情況，該 層队之調即劑。在本發明内文中，此 37 201219784 化合物具有抗心律不整效用。因此，其較佳地係為心ADPRC 之抑制劑。可藉由數學方法例如統計方法，如學生t_檢定或 卡方來檢定來比較及分析數個測量結果。 除了使用器官、組織和細胞外，抗心律不整作用可於以 活體系統為基礎的試管内研究中（分別可視為試管内或活體 外）偵測。在這些研究中，觀察的細胞、組織或器官之收縮 可以自動影像處理或測量收縮所產生的物理力或以電生理 記錄，目視觀察。術語「視為試管内或活體外之活體系統」 可指用於測定作用電位及/或肌肉收縮力之提取的器官例如 心臟或廣泛用作模型系統之蛙腿，或其可指卵系統，特別是 胚胎研究，更特別是以廣泛用於醫藥研究的雞蛋之胚胎研究 為基礎。 另-種選擇或另外地，抗^律不整作用可使用動物（不 包括人類）於活體内研究中偵測。此化合物可以任何方法投 予動物，其包括（但不限於）注射、吸入及經由皮膚或黏膜及 經口攝入來投予。在本發明内文中，動物模型中的方法不可 視為治療方法或診斷方法，而僅係作為鑑定一或多種化合物 或試驗化合物的抗心律不整效用之方法。此不應排除特定化 合物在治療及/或診斷方法中抑制或促進心ADpRC活性之 潛在效用。可5己錄及分析動物的心搏及/或心電圖（ECG)訊 號。另外’可全身性測量受質之轉化，如可侧血液或其他 體液中的受質及/或其代謝受質，或於原位偵測轉化如藉由 活體内影像技術，例如本項技術中已知的活體内螢光偵測。 進一步以下列實例及圖示來解釋本發明，而該實例及圖

S 38 201219784 示希望係作為說明而非限制本發明之範圍。 【實施方式】 實例 實例1 :測量腺苷二磷酸核糖環化酶活性

實驗方法。如 Kranias 等人(m〇chim.Bi〇phys Acta709, 28-37, 1982)所述，作些許的修改，製備豬心之肌漿網膜。將 新鮮分離出的小豬心臟之左心室清除脂肪和結締組織並切 成小塊(約1 cm3)。將豬心塊簡單地以冰冷的媒劑丨清洗(3〇 mM Tris-Malat，pH 7.0, 0.3 Μ嚴糖，5毫克/毫升亮抑酶肽，〇] mM PMSF) ’並使用Waring攪拌器於冰冷的媒劑(5毫升/克 組織）中均質（全速60秒，分成四次每次秒，中間間隔冷 卻30秒）。將均質液以5,5〇〇克離心1〇分鐘。將上清液通過 四層的神奇濾布(Miradoth)(德國達姆斯塔特，默克生科公司） 並以12,000克離心25分鐘。將上清液再次經由四層的神奇 滤布過滤’及然後以143,000克離心分鐘。將生成的團 塊使用Ultra-Turrax裝置再懸浮於媒劑π中（2〇 mM

Tns-Malat，pH 7·0, 0·6Μ KC1，0·3 ]V[蔗糖，5 毫克/毫升亮抑酶 肽，0.1 mMPMSF)，及將懸浮液再次以143,〇〇〇克離心6〇分 鐘。將團塊再懸浮於媒劑I中並再次以143，_克離心6〇分

鈿。將此最後離心步驟之團塊再懸浮於媒劑ΠΙ中口〇 mM

Tds-M執pH 7.〇, 〇·1Μ KC1，〇.3M嚴糖，完全蛋白酶抑制劑 (德國潘茨堡’羅氏公司）無EDTA)，得到最後介於5至1〇 毫克/毫升之蛋白濃度。㈣浮液分成等份，於液態氮中急 速冷凍並儲存於_8〇。〇：。 39 201219784 取菸鹼醯胺鳥嘌呤二核苷酸(N G D)及菸鹼醯胺次黃嘌 呤二核苷酸(NHD)作為菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)之代 用物，如 Graeff 等人(Biochemistry 35, 379-386, 1996)所述用 以測量心ADPRC活性。在由環化酶催化的反應中，NGd和 NHD分別轉化為環狀鳥苷二磷酸核糖(cGDpR)及環狀肌苷 二磷酸核糖(cIDPR) ’此可經由其可見光譜中的螢光來偵 測。此方法係如下進行： 將試驗化合物（1 μΐ儲存溶液，3 mM於DMSO中之溶液) 以含2% DMSO之99 μΐ反應緩衝液稀釋(2〇 mM Tris-Malat， pH 7.0, 0·1 M KC1，0·3 Μ蔗糖，完全蛋白抑制劑無EDTA)， 得到30 μΜ試驗化合物溶於含3% DMSO反應緩衝液中的溶 液。將如上述製備的心肌漿網膜置於反應緩衝液中稀釋成一 定濃度’使其在觀察期間有足夠的受質週轉。適當的稀釋液 需個別地供各批的心SR膜作測定。隨後，將受質(NGD或 NHD，10 mM之水中儲存溶液)於反應緩衝液中稀釋成750 μΜ之濃度。將2 μΐ的化合物溶液轉置於384-孔小量的微量 滴定盤中（德國弗里肯豪森，Greiner Bio-One公司）。加入2 μΐ 稀釋的SR膜，並加入2 μΐ受質溶液，使反應開始。各盤包 括正對照（含3% DMSO取代化合物溶液之反應緩衝液)及背 景樣本(含3% DMSO取代化合物溶液之反應緩衝液，反應緩 衝液取代心SR膜之反應緩衝溶液）。然後，加入受質後(t〇 測量)及數個培養時間（例如30、60、90分鐘)後，直接測量 反應混合物之螢光(激發波長275 nm，發射波長410 nm)。各 測量間隔之間，測定盤係於37°C培養。 201219784 分析。各反應混合物之環化酶活性係以隨時間變化的榮 光來定義’亦即如圖1所示，由線性回歸所得㈣螢光對時 間作圖之直_斜率。抑制百分比值(1%)係使用下列方程式 所獲得： ( /% = !00· 1-. 斜率（樣本)-斜率（負對照） 斜率（正對照)-斜率（負對照） 濃度反應曲線係由不同濃度範圍之試驗化合物所得 來。使用IC5〇值作為試驗化合物之效力測量值，其係將數據 點與下列方程式（參數c)擬合所計算。參數A為低化合物濃 度時1%之下限。其係設定為〇。參數B &高化合物濃度時 1/〇之上限。參數D即是所謂的希爾係數(mu c〇efflcient)， 其係定義在狀_時濃度反應肖線之斜率。 /% = A-h — B ~~ A_ 1+[一 C Ϋ U [化合物]j 結果。篩選約16,00()個化合物之資料庫及鑑定數個心 ADPRC抑制劑，其顯示，由心' ADpRc所催化的受質轉化動 力曲線之陡度顯著下降(實例係如圖1所示）。示例地，2種 不同的=ADPRC抑制劑之結果係如本處所示。酵素動力值 係以劑里反應曲線3)陳述，從此圖推斷仏值。化合物 2589之IC50值約為i 3 化合物4825之％〇值約為〇 13 μΜ °令人驚㈣’這些結果與下述之化合物抗△、律不整性 質密切相關。 實例2 :測定活體外心ADPRC抑制劑之抗心律不整特性 201219784 以上述分析所鑑定的心ADPRC抑制劑之抗心律不整特 性係藉由於天竺鼠乳突肌肉細胞中在高頻率電刺激後，測定 其防止延遲性後去極化發生之能力來探測。實驗方法如下： 組織製備。天竺鼠(Dunkin Hardley Pirbright)重約 400 克，以撞擊宰殺後，接著放血。打開胸腔後立即移除心臟並 於室溫浸入Tyrode溶液中（毫莫耳/公升）：i36NaCl, 3.3 KC1， 1.2 KH2P04，l.l MgS04, 2.5 CaCl2, 5 葡萄糖，1〇 HEPES，及 pH= 7.4，充入氧氣）。最後，移出右乳突肌並放置在含加熱 至37°C的Tyrode溶液之測量槽中。從移除心臟到將乳突肌 置入測量槽之時間約為3分鐘。 電生理紀錄。置放好乳突肌後立即藉由電腦程式（德國 尼登豪森，MFK公司）’以1 Hz頻率，以1至4伏特的矩形 脈衝刺激並作用1至3 ms。用滾軸栗(TL，德國博文登Meredos 公司）’以每分鐘4毫升的速率持續以Tyrode溶液灌注。溶 液預先加熱至37°C。以填充3MKC1溶液的玻璃微電極記錄 作用電位(AP)。電極係由硼矽酸鹽玻璃（品項編號：1B150F-4, 美國薩拉索塔，World Precision儀器公司）’以微電極拉製器 (DMZ-Universal Puller，德國馬丁雷德Zeitz儀器公司）所製 造。電極具有5至10百萬歐姆之電阻。以增幅器（Model 309, 德國 March-Hugstetten，Harvard Apparatus 公司）記錄電訊 號，並儲存於電腦系統中。 實驗方法。30分鐘的平衡時間後’記錄AP並將化合物 或對照物加到灌注溶液中。15分鐘後，記錄AP並修改灌注 溶液：省略KC1及KH2P〇4並將CaCl2增加到5.5 mM。15

42 201219784 分鐘後，記錄AP廿破^ μ

搏並發生縣自^織以4 ΗΖ鱗3G秒。錢停止起 ^t，a 發性AP。起搏停止後ό秒計算自發的AP t， 有背景樣本的存在下，ό秒期間自發性AP之 ‘ 3人。含對照物和化合物之測量數目各為10次。 以學f/檢定比較各組中自發性AP數目。 、°果去極化貫驗之結果係概述於圖4和5中。10 μΜ BS . , _ 至6秒内平均4.4次去極化，而DMSO對 y ’’、、貞7Γ 6 t内約14次去極化(圖4)。在另外的實驗中， ^刀析心adPRc抑制劑節之效用。3 _的心ADpRc 2劑4825顯著地降低快速起搏後6秒内之延遲性後去極 目而DMSO對照組則顯示6秒内約131次去極化（圖 強效的心ADPRC抑制劑彻降低去極化數目至6秒内 平均2.9次去極化。 令人驚詩地，這些結果整體上與如上射_ ADPRC 之酵素活性抑制作用所發現的結果密切相關。 實例3 :測定活體内心ADPR_酶抑·之抗轉不整性 質 實驗方法。於麻醉的天竺鼠中測量活體内心ADpR環化 酶抑制劑之抗心律不整性質。就此目的，係將天竺鼠以巴比 妥(pentobarbitalXlOO *克/公斤i.p.)麻醉並通入4〇% (體積/ 體積）的氧(〇2)。30分鐘後，以團注注射施予化合物。5分 鐘後，以每分鐘30吨/kg之速度輸;主鳥巴苦，使得收縮力強 烈持續的增加。在背景樣本的存在下’心室纖維性顫動於灌 43 201219784 注鳥巴苷約12分鐘後發作，而心臟驟停於約15分鐘後發生。 結果。在心ADPRC抑制劑的存在下，心室纖維性顫動 (VF)及心臟驟停之時間顯著的延長。此等結果係說明於圖6 中。心ADPRC抑制劑4825顯著地延長因輸注鳥巴苷至麻醉 的天竺鼠中所造成的心室纖維性顫動和心臟驟停時間。 參考文獻 1. Graeff 等人，Biochemistry 35, 379-386, 1996 2. Kranias 等人，Biochim. Biophys. Acta 709, 28-37, 1982 3· WO 08/82169, Chonbuk University, S. Korea 4.Ullman 等人，Proc. Natl. Acad. Sci” USA 91，5426-5430 199 ， ， 【圖式簡單說明】 圖1係顯不由豬的心肌漿網膜所催化之時間依賴的 NHD轉化為ciDPR^藉由追蹤分別於2乃和4i〇nm激發和 發「射波長的螢光變化’監測cIDpR形成。數據係顯示正“ (「南」）、背景樣本（「低」）及47%抑制作用之試驗化合物 (咖」）。取與點擬合的直線之斜率作為酵素活性之量值。 圖2係說明經鐘定為心ADpRC抑制劑之2589的結構。 圖3係顯示抑制劑化合物2589(空心圓）及彻 對大鼠心ADPRC環化酶之濃度反應曲線。1(：5 別為 1_3±0.2μΜ 及 〇.ΐ3±〇 〇2μΜ。 I’UU 刀 圖4係驗證於天竺鼠乳突肌肉之高 =一C抑制劑2㈣著地降低延二 44 201219784 圖5係驗證與2589(A)不同結構種類之另外的心ADPRC 抑制劑4825(B)，其於天竺鼠乳突肌肉之高頻率起搏後6秒 内觀察到延遲性後去極化之數目下降。化合物的濃度為3 μΜ而DMSO樣本係代表〇 〇3% dmSO。化合物4825顯著 地降低延遲性後去極化之數目。 毫克7公斤的化合物後，試驗化合物4825 3 ，6係顯不，在鳥巴皆(ouabain)輸液及靜脈(i.v·)輸液各 對心臟驟停的時 KA)及心室纖維性顫動的時間(b)之影響。 的結構 圖7係說明經鑑定為心ADPRC抑制劑之4幻5 45

Claims (1)

1. 201219784 七、申請專利範圍： 1. 一種鑑定具有抗心律不整作用的化合物之方法，該方法 包括： -提供心腺苷二磷酸核糖環化酶（心ADPRC)， -將心ADPRC與化合物接觸，及 -在化合物的存在下測定心ADPRC之活性， 其中相對於對照組，ADPRC活性降低係象徵該化合物具抗 心律不整作用。 2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該心ADPRC為一胞 内膜結合之心ADPRC，特言之為肌漿網膜結合之心 ADPRC。 3. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該心ADPRC為 哺乳動物來源之心ADPRC，特言之係來自人類、豬或大 鼠，特別是豬或人類心臟。 4. 如申請專利範圍第1至3項任一項中之方法，其中該心 ADPRC之活性係藉由測量心ADPRC受質轉化為產物所 測定。 5. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該受質為菸鹼醯胺 腺嘌呤二核苷酸(N A D)、菸鹼醯胺鳥嘌呤二核苷酸(N G D) 或於驗醯胺次黄σ票吟二核苷酸(NHD)。 6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之方法，其中心 ADPRC之活性係以螢光來測定。 7. 如申請專利範圍第1至6項中任一項之方法，其中該方 法係用於篩選化合物庫。

   46 201219784 8. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之方法，其中該方 法係以自動化模式，特別是高通量模式來進行。 9. 一種心ADPRC供鑑定具有抗心律不整作用的化合物之 用途。 10. 如申請專利範圍第9項之用途，其中該心ADPRC係進 一步如申請專利範圍第2或3項中所定義。 47