TW201144327A - Single unit antibody purification - Google Patents

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201144327 . 六、發明說明： 【發明戶斤屬之技術領域】 發明領域 本發明是有關於一用於抗體的單一單元純化的方法以 及有關於可被使用於此方法中的裝置。 I[先前技冬好;3 發明背景 供用於藥學應用中之單株抗體（藉由細胞培養物所生 成）的純化是一涉及許多步驟的方法。該等抗體實質上是要 從所有潛在地有害汙染物中被釋放，該等汙染物是：諸如 源自於會生成該等抗體的細胞的蛋白質與DNA、培養基組 分[諸如胰島素]、PEG醚類與消泡劑，以及任何潛在地存在 : 的傳染媒介物[諸如病毒與病原性蛋白顆粒(prions)]。 用於從一會生成這些蛋白質的細胞培養物中純化出抗 體的典型方法被描述於BioPharm International Jun 1, 2005, Downstream Processing of Monoclonal Antibodies: from High Dilution to High Purity 中。

由於抗體是藉由諸如融合瘤細胞或經轉形的宿主細胞 [例如中國倉鼠卵巢(CH0)細胞、老鼠骨髓瘤-衍生的NS0細 胞、幼倉鼠腎（BHK)細胞以及人類視網膜-衍生的PER.C6® 細胞]之細胞而被生成，微粒的細胞物質將必須從細胞培養 液中被移除(較佳地在純化方法的初期）。該方法的此部分於 此處被意指為“淨化，，。隨後或作為該淨化步驟的一部分， 該等抗體通常使用一結合附加洗提的層析步驟（當是IgG 201144327 時’通常使用經固定的蛋白質A)而被粗略地純化到至少大 約80%。此步驟，於此處被意指為“捕獲”，不僅致使該抗體 的一最初始相當大的純化’亦可能致使體積的一相當大的 減少，因而濃縮該產物。用於捕獲之另擇的方法有，例如： 經擴張的床吸附(Expanded Bed Adsorption)(EBA)、2-相液 體分離(2-phase liquid separation)[使用例如，聚乙二醇]或者 使用易溶鹽類[諸如，硫酸敍]之分級沉澱。 在淨化以及捕獲之後，s亥專抗體被進一步純化。一般 而§ ,在捕獲之後至少有2個層析步驟被需要以充分移除殘 餘的雜質。在捕獲之後的層析步驟通常被稱為中度純化步 驟以及最後的層析步驟一般被稱為精純化步驟。這些步驟 中的母一者一般在批次模式(batch mode)中被執行有如單 一單元操作，並且這些步驟中至少有一者在該結合附加洗 提的模式中被執行。此外，各個層析步驟需要特定的裝填 條件[有關於’例如pH值、導電度等等]〇因此，額外的處 理必須在各個層析步驟之前被執行，俾以將裝填調整至所 需要的條件》於此所提及的一切會使該方法變得複雜以及 耗時。在這些步驟的期間實質上被移除的雜質通常是方法 所衍生的汙染物，諸如：宿主細胞蛋白質、宿主細胞核酸、 培養基組分(若存在的話）、蛋白質A(若存在的話）、内毒素 (若存在的話）以及微生物(若存在的話）。 許多用於該等純化抗體的方法已被描述於下列先前技 藝中： -W02007/076032描述一用於純化抗體(CTLA4-Ig以及它 4 201144327 的义異體）的n其巾—細胞培養物在親和性層析法 之後所獲得的上澄液或它的一分離部分被進行陰離子 交換層析法續得—經洗提的蛋自質產物，並且該經洗 提的蛋白質產物被進行疏水性交互作用層析法，俾以獲 得-經增富的蛋白質產物。在此方法中該經洗提的蛋白 質產物藉由-如下之方法而被獲得··其中該等抗體首先 被捕獲至龍離子交換層析法物#上，該交換層析法物 夤接著使用一洗；；條緩衝液而被洗滌，之後，該等抗體藉 由改變該等方法條件而從該交換層析法物質中被洗提 出（使用一洗提緩衝液來洗提）。 -US2008/0167450是有關於藉由將蛋白質結合至一蛋白 質A管柱以及洗提以一 p H梯度洗提系統來純化出含有 Fc的蛋白質（諸如，抗體）。此文件描述在溢流道模式 (flow-through mode)中去應用疏水性交互作用層析法以 及陰離子交換層析法的好處(par 005 8-0064)。 -W02008/025747是有關於在一包含有蛋白質A或G層析 法、陽離子交換層析法、陰離子交換層析法以及羥磷石 灰層析法（hydroxyapatite chromatography)(特別地以此 順序而被使用）的方法中，純化Fc-融合蛋白質。在此方 法中，該陰離子交換層析法以及該羥磷石灰層析法這兩 者在溢流道模式中被應用。 . -US2007/0167612是有關於蛋白質（諸如抗體）的純化，該 等蛋白質首先被捕獲至一親和性管柱（例如一蛋白質A 管柱）上。來自於該親和性管柱的洗提液隨後被接觸以 5 陰離子父換物質（抗體會結合於其之上並且隨後被洗提 出來）。為了進一步的純化’額外的層析管柱以及純化 步驟可以被使用，包括：額外的陽離子_交換層析法、 陰離子-交換層析法、尺寸排除層析法、親和性層析法、 羥磷石灰層析法以及疏水性交互作用層析法。 W02001/072769描述高度陰離子蛋白質（例如經硫酸化 的蛋白質）的純化。為此目的，隨後陰離子交換以及疏 水性交互作用層析法這兩者在結合與洗提 (bind-and-elute)的模式中皆被使用。 W02009/058769是有關於從抗體製品中移除雜質的方 法。特別地，它是有關於一種純化含有疏水性變異體之 抗體的方法。為此目的，一樣品被裝填至一蛋白質A管 柱上；使用一適當的洗提溶液從該蛋白質A管杈中被洗 提，被裝填至一陽離子和/或陰離子交換管柱上；從該 離子交換管柱中被洗提，被裝填至一疏水性交互作用層 析(HIC)管柱上’其中該HIC管柱是在一溢流道模式中， 於其之後經純化的物質被收集。要注意到的是：只有該 HIC管柱在溢流道模式中被應用。 EP1614694是有關於免疫球蛋白的純化以及分離。特別 地，它是有關於從一細胞培養物在隨後的蛋白質A、陰 離子交換以及陽離子交換管柱步驟（選擇性地，繼而為 一疏水性交互作用管柱步驟）中純化出抗體。在這些步 驟中’該陰離子交換管柱步驟在溢流道模式中被操作， 所有其它的步驟在結合與洗提模式中。 201144327 W02008/051448是有關於在使用蛋白質A親和性層析法 所純化的抗體製品中減少蛋白質A的汙染。已被建議的 是：該蛋白質A汙染可使用一電荷改變深度過濾器 (charge modified depth filter)而被移除。該移除步驟可在 慣用於抗體製品的純化步驟之前或之後。 EP0530447描述藉由結合以一特定滅菌步驟的陰離子、 陽離子以及疏水性交互作用層析法的抗體純化。該等層 析步驟的順序可以呈多樣化。各個層析步驟在結合與洗 提模式中被操作。

Kuczewski, M. et al. (2009)[Biotechn. Bioengn. 105, 296-305]，其描述疏水性交互作用膜吸收器供用於精純 化抗體的用途。

Chen, J. et al· (2008)[J. Chrom. A 1177, 272-281]，其比 較在抗體的純化中傳統以及新一代的疏水性交互作用 層析樹脂(例如經混合的模式）。

Zhou，J.X· et al. (2006)[J. Chrom. A 1134 66-73] ’ 其描述 疏水性交互作用膜吸收器作為針對疏水性交互作用管 柱層析法之等效物的用途。

Gottschalk，U. (2008)[Biotechnol. Prog. 24, 496-503]，其 討論管柱層析法在抗體純化中的缺點更多於使用膜吸 附器。

Wang, C. et al· (2007)[J. Chrom. A 1155, 74-84]。在—、、爸 /ίί, 流道方法中使用核心的陰離子-交換層析法供用於移除 來自於抗體物質中之微量汙染物(精純化）。與非核心Ζ

fcf、J 7 201144327 陰離子交換物質做比較。 -Azevedo, A. et al. (2008)[J· Chrom. A. 1213，154-161]。 用於純化抗體之經整合的方法，其結合有水性二-相萃 取、疏水性交互作用層析法以及尺寸-排除層析法。 —Boi，C. (2007)[J. Chrom. B. 848, 19-27]。此篇回顧文獻 考量使用膜吸附器作為一另擇的技術供用於用以純化 單株抗體的捕獲以及精純化步驟。 上面所描述的該等方法的缺點是長的操作時間、高的 變動成本(例如，由於大的管柱容量的必要性，該容量對於 一結合附加洗提步驟而言本質上是被需要的，並且因而需 要大量的昂貴樹脂）以及高的固定成本（由於人工成本）。 依據本發明，從細胞培養物所生成的抗體中非常有效 率的移除殘餘雜質可藉由在溢流道模式中使用串列直插式 陰離子交換層析法(AEX)以及疏水性交互作用層析法(HIc) 這兩者以及較佳地操作有如一單一單元操作而被達成。在 該AEX之後以及在該HIC之前，一易溶鹽類的直插式混合可 被用來調整供用於該疏水性交互作用層析法的正確條件。 此種利用被分開串列連接的直插式AEX以及裝置 (這兩者在溢流道模式巾被使用）之方法的優點是：操作時間 與人力之相當大的減少以及較低的經營成本。此外較小 的（而因此較不責的)層析單元被需要，因為所有單元在溢流 I模式中操作’ $模式僅需要針對該等雜質而非針對該產 物之充足的結合效能。 【考务明内】 8 201144327 . 發明概要 因此’本發明可被界定為一用於從一在一生物反應器 中所生成的細胞培養液中純化出抗體的方法，該方法至少 包含中度純化以及精純化的步驟’其中該新穎的純化步驟 包含：串列直插式陰離子交換層析法(AEX)處理，產生有如 一溢流道分離部分（一分離混合物），繼而為疏水性交互作用 層析法(HIC)處理’產生有如一溢流道分離部分（一經純化的 抗體製品），以及其中該經純化的抗體製品被進行至少一進 一步的純化步驟。 在本發明的文章中，該“分離混合物，’是從依據本發明 的首次離子交換步驟而生成的溶液，而該“經純化的抗體製 品”是從依據本發明的第二離子交換步驟而生成的溶液。被 : 意欲的是：在整篇說明書當中要堅持此術語。 關於“串列直插式AEX以及HIC，’，我們意指的是：aEX 以及HIC是以一如下的方式而被串列連接：該ΑΕχ裝置的流 出物被直接地進料至該HIC裝置中，而沒有中間的儲存。 關於“溢流道模式”，於此處被意指的是：要被純化的 該等抗體通經該層析裝置。這與經常被使用於抗體純化中 的“捕獲模式”相反，其中該等抗體首先結合至該層析物質 上以及在一隨後的步驟中被洗提（亦即藉由改變介質條件 或組成物而被釋出）。 在一特定的具體例中，依據本發明的方法涉及：使用 ΑΕΧ以及HIC的處理被執行有如一單一單元操作。 關於一“單單元操作”，於此處被意指的是：該兩個 201144327 被串列連接的層析裝置（AEX以及HIC)被使用於一單一操 作步驟中。 在首次的離子交換層析步驟之前，在該生物反應器中 所生成的該細胞培養液通常將會被淨化[亦即從所有細胞 物質（諸如完整的細胞以及細胞殘骸）中被釋放]。 此外，在首次的離子交換層析步驟之前，一調節溶液 可以被添加（至該細胞培養液或者從該細胞物質中被釋放 之含有抗體的溶液中），俾以確保針對該首次的離子交換步 驟在pH值以及導電度上的最佳條件。 關於“溢流道分離部分”，於此處被意指的是：至少一 部分被裝填之含有抗體的分離部分，它離開該層析管柱而 沒有被實質上地結合和/或實質上呈與該洗提液體相同的 速度而離開該層析管柱。較佳地，此分離部分在洗提期間 實質地不會被保留在該管柱上。因此該等條件被選擇，藉 此不是該等抗體而是該等雜質被結合至該陰離子交換物質 以及該疏水性交互作用物質上。 使用隨後以陰離子交換以及疏水性交互作用層析法來 處理該蛋白質混合物之蛋白質的分離已被揭示於 W02006/020622中。然而，在此公開案中，AEX以及HIC 層析管柱這兩者被用於結合附加洗提模式中。此外，此處 理被描述有如在藉由2 D電泳來分析該蛋白質混合物之前的 一預-純化。因此，它是一種（非常）小規模的分離。 已被發現到的是：為了大規模生成目的，依據本發明 的方法(使用溢流道模式）提供一與先前所揭示的方法(使用 10 201144327 - 結合以及洗提出所欲的抗體)相較之下更為快速的分離。 有益地’在HIC處理之前含有該抗體的分離混合物被補 充乂 足夠量的易溶的/水成結構的（lyotropic/kosmotropic) 鹽類。較佳地’該鹽類的陰離子可以是選自於由下列所構 成的群組：磷酸鹽、硫酸鹽、乙酸鹽、氣化物、溴化物、 石肖酸鹽、氣酸鹽、碘化物以及硫氰酸鹽離子。較佳地，該 鹽類的陽離子可以是選自於由下列所構成的群組：銨、铷、 鉀、鈉、鋰、鎂、鈣以及鋇離子。較佳的鹽類是：硫酸銨、 硫酸鈉、硫酸鉀、磷酸銨、磷酸鈉、磷酸鉀、氣化鉀以及 氣化鈉。 較佳地，將該分離混合物補充以一足夠量的易溶鹽類 疋°亥單一單元操作的一部分，例如在該HIC步驟之前在該處 ' 自w動(例如在—齡财）帽㈣龍的直插式混合。 目於足夠量H容麵”，於此處被意指的是： 足夠的易/合鹽類來造成大多數相關的雜質吸附至該疏水性 交互作用物質上，但一夠低的數量不會造成該產物的結合 或沉澱。針對各個純化方法，最佳的數量與較佳的鹽類種 類必須被確立。當硫酸錄被使用時，在直插式混合之後的 濃度將最有可能是在介於〇·1以及1〇M之間。 依據本發明’ AEX處理可以發生在—ΑΕχ單元中，該 單元可以藉由-含有-樹脂的典型填充床管柱一含有單 $物質的管柱、—含錢合的層析介質的放射狀管柱、— 吸附膜單元’或者任何其它本技藝中所知曉之具有適當的 介質以及配位子以供作用有如一陰離子交換器的層析裝置 11 201144327 而被具體化。錢AEX技巾，科析物質可以存在有如 被附著有強或弱的陽離子配位子的微粒支持物質。該膜類 型的陰離子乂換益由-呈—或更多被附著有強或弱的陽離 子配位子的薄片形式的支持㈣所構成。該支持物質可以 是由下列所構成：有機物質或無機物質，或者一具有有機 以及無機物質的混合物。適合的有機物質是以瓊脂糖為基 礎的介質以及甲基丙稀酸鹽。適合的無機物質是石夕石、石夕 石、陶及金屬。-膜_形柄_子交㈣可以是由含 有陽離子配位子的親水性聚苯_ (pQiyethe⑽ifQne)所構 成。適合的㈣離子配位子是叫如，四級胺基團為基礎。 適合的弱陽離子配位子是以例如，—級、二級或三級胺基 團或者任何其它本技藝中所知曉之適合的配位子為基礎。 依據本發明，HIC處理可以發生在一HIC單元中，該單 元可以藉由一含有一樹脂的典型管柱、一以單石物質為基 礎的管柱、一含有適合的層析介質的放射狀管柱、一吸附 膜單元，或者任何其它本技藝中所知曉之具有適當的配位 子以供作用有如一疏水性交互作用物質的層析裝置而被具 體化。在該HIC管柱中，該層析物質可以存在有如被附著有 疏水性配位子的微粒支持物質。該類膜的層析裝置由一呈 一或更多被附著有疏水性配位子的薄片形式的支持物質所 構成。該支持物質可以是由下列所構成：有機物質或無機 物質，或者一具有有機以及無機物質的混合物。適合的有 機支持物質是由例如下列所構成：親水性碳水化合物[諸 如，經交聯的瓊脂糖、纖維素，或者聚葡萄糖]或合成的共 12 201144327 聚物物質{諸如，聚财天冬醯胺 以及乙稀二甲基㈣酸的共聚物，或者經酰化的多胺 合的無機支持物質是例如：⑦石、及金屬一膜形 式跳可以是由含有疏水性配位子的親水性聚苯㈣所構 成°適合的疏水性配位子的實例有：直或分支鍵烧類（諸 如’甲f、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基，或者 辛基）芳族基團（諸如’一苯基基團）、喊類，或者聚醚類[諸 如，聚丙二醇。 依據本發明的方法而可以被純化出的抗體是具有一為

6.〇或更高(較佳地7·〇或更高，更佳虹5或更高）的等電位pH 值的抗體。這些抗體可以是G、A或Μ類型的免疫球蛋白。 X 4抗體可以疋人類或非_人類（諸如，嚅齒類）或嵌合式 [例如^航的1體，或者可从上面所提及的免疫球蛋 白的-人單元，或者可以是由一免疫球蛋白的部分以及衍生 自或相似於另—個蛋白f (非免疫球蛋自）的-部分所構成 的雜合蛋白質。 令人驚訝地’由經結合的ΑΕχ以及Η〗c處理所產生的該 等抗體物質通常將具有—如下所示之非常高的純度（意指 蛋白夤3 1).至少98%，較佳地至少99%，更佳地至少 99.9%，甚至更佳地至少99 99%。 依據本發明，姆離子交換層析法步驟較佳地是在中 性或微驗性pH值下被勃 例如：舰、宿•胞Γ 除帶負電荷的雜質， 毒(若存在的話）、蛋;^f、蛋白以（若存在的話^病 貝性的培養基組分[諸如，胰島素以 13 201144327 及類胰島素生長因子（若存在的話)]。 在隨㈣疏水性交互作用層析法步驟的期間，該等主 要殘餘的^分子雜質（主要的產物聚集）_ 體產物更^讀的特性以及設定條件為當過 它們會結合至該層㈣置上，而將會被移除。物丄夸 2=高度純化的物質通常將必須被處理以超過 慮以及透㈣4，如祕所㈣餘·分 由最終配錢崎來取倾緩彳叹娜魏的最錢 物濃度。此步驟亦確保該被添加的易溶㈣的移除。 此外，該經高度純化的物質通常將必須被處理，亦以 破保潛在地存在__介物__鱗和崎病原性蛋白 顆粒）的完全移除。 本發明亦有關於-單一操作單元，其包含有一陰離子 交換層析法料(AEX)以及—疏水性交互作用層析法部件 (HIC)這兩者，它們被串列連接。此單一操作單元進一步包 含一在該陰離子交換層析法部件的上游末端處的入口以及 -在该疏水性交互作用層析法部件的下游末端處的出口。 此皁-操作單元亦包含—介於·離子交換層析法部件以 及該疏水性交互作闕析法部件之_連接處，該單元進 一步包含-用於供給-易溶鹽類溶液至後面部件，由此至 5玄分離混合物的入口。 依據本發明，在該方法的期間，該液流可藉由任何商 業上了獲4于的雙栗層析系統，例如一 ΑκΤΑ探測器（GE)、一 BI0PR0CESS (GE)、任何雙栗HpLC系統或任何符合第i圖 201144327 之圖式的定製裝置’而被建立。大部分的這些層析裝置被 设计用來操作一單一層析單元（亦即管枉或膜）。使用一簡單 的改造’一額外的連接可以被形成以在泵A之後以及在該混 合槽之前設置該陰離子交換。 第1圖展不基本的組態。兩個層析裝置的串列直插式連 接附加一位於如在第i圖中所示的位置處之選擇性的預_過 /處器（pre-filter)，可以致使非所欲的壓力增進。因此，在某 些情況下額外的技術改造(例如，在該ΑΕχ單元之後的_額 外的泵以及在該ΑΕΧ單元之前的一壓力降低裝置）可能必 須要被包括在此圖式當中。 圖式簡單說明 第1圖.一單一操作單元，其包含有一陰離子交換層析 法部件以及一疏水性交互作用層析法部件這兩者。缓衝液A 是一適合用於該A E X步驟之最佳操作的調節以及洗滌緩衝 液。緩衝液B含有一易溶鹽類並且呈一比例而被混合至該裝 填/緩衝液A中（對於得到供用於操作該HIC步驟的最佳條件 是必須的）。該混合比例可使用—經固定的體積混合流而被 執行，或者可藉由一回饋迴路[基於例如，導電度輸出]而 被自動地控制。MC是一選擇性的混合槽，它可以含有任何 類型的靜電混合器。

L=裝填 PA=泵 A

PB=泵 B AEX=陰離子交換單元 15 201144327 HIC=疏水性交互作用層析法單元 pH=pH感應器 σ=導電度感應器 PF=選擇性的預、過濾器 【實施冷式】 較佳實施例之詳細說明 材料與方法： 所有實驗使用一藉由人類細胞-株PER.C6的選殖株 P419所生成的1gG 1而被執行。 培養是在使用一經化學界定的培養基的進料-批次 (fed-batch)中被執行，並且之後該等細胞藉由一種3步驟的 冰度過滤過據器系列（depth filtration filter train) : ZetaPlus 10M02P、ZetaPlus 60ZA05 以及SterAssure PSA020 [全部來 自於Cuno (3M)]而被移除。 此經淨化的收穫物含有7.5 g/L IgG並且被儲存於2-8 〇C。 首先’一藉由標準蛋白質A層析法的初始純化以標準程 序（裝填經淨化的收穫物、第一次洗條以20 inM Tris + 150 mM NaCl、第二次洗滌以呈pH 5.5的緩衝液以及洗提以呈 pH 3.0的緩衝液)使用MabSelect (GE)而被執行。為了找到供 用於隨後的純化之最佳的緩衝液條件，該第二次洗條以及 洗提使用100 mM醋酸鹽緩衝液或使用100 mM擰檬酸鹽緩 衝液而被執行。 在MabSelect洗提之後，經洗提的波峰被收集並且被保 16 201144327 ‘ 持在pH 3.5下歷時1小時。於其之後，該樣品使用2 Μ (pH 9.0)而被中和至PH 7.4，並且被稀釋以去礦物質水俾以 將導電度校正至5.0mS,以及被過濾通過〇22μΜ。 由此所得到的物質是配於醋酸鹽Tri s緩衝液中或配於 檸檬酸鹽Tris緩衝液中之經預_純化的IgG。利用此物質，3 系列的實驗被執行：1.以確立供用於在溢流道模式中的 AEX層析法的最佳條件（實驗1) ; 2以確立在溢流道模式中 使用HI-層析法的最佳條件（實驗2) ; 3.在一單一單元操作實 驗中結合最佳的A E X以及ΗIC條件這兩者（實施例！）。 HCP藉由使用多株抗-PER.C6HCP的ELIZA而被測量。 單體的IgG以及聚集物濃度依據標準程序藉由尺寸排 除層析法(ΗΡ-SEC)而被測定。 - 實驗1. • 確立供用於在溢流道模式中的陰離子交換層析法的最佳條 件 在溢流道模式t的AEX層析法是使用配於醋酸鹽Tris 緩衝液中或配於擰檬酸鹽Tris緩衝液中之上面所提及的經 預-純化的IgG而被執行。下列的AEX介質被測試：Mustang Q 硬幣型膜過遽器（Mustang Q coins)(0.35 ml)(Pall)、 Sartobind Q囊式膜吸附器（Sartobind Q capsule)(l ml)、 ChromaSorb 囊式膜吸附器（ChromaSorb capsule)(0.08 ml)(Millipore)(全部是膜吸附器）以及利用填充床管柱（使用 Poros 50 HQ樹脂）(applied Biosystems)(l ml填充床）〇 所有AEX介質以40柱床體積/小時在使用一 ΑΚΤΑ探測 17 201144327 器的溢流道中被進行。調節以及洗滌緩衝液是使用1〇〇 mM 醋酸鹽Tris (pH 7·4)(供用於該產物在醋酸鹽緩衝液中運行) 或使用100 mM檸檬酸鹽Tris (pH 7_4)(供用於該產物在檸檬 酸鹽緩衝液中運行）。被裝填在各個ΑΕΧ介質上的產物的數 量為1.5 g/ml膜或管柱床體積。 HCP在該等層析步驟之前以及之後被測量^ HCP移除 對於該AEX層析性能而言被認為是最關鍵性的。針對前面 所提及的陰離子交換器（全部單一實驗），有關HCP的對數轉 換分別是1.9、1.7、1.8以及2.1。使用檸檬酸鹽基質，所有 AEX介質相當糟地執行’致使針對Mustang Q、Chromasorb 以及Poros 50 HQ分別有一為1.2、0.2以及1.3的HCP對數轉 換。這些結果顯示：所有經測試的AEX層析介質是適合供 用於使用一醋酸鹽緩衝液之大量的HCP移除，以及顯示出 在這些條件下近乎可比較的HCP對數轉換。 實驗2. 確立在溢流道模式中使用疏水性交互作用層析法的最佳條 件 針對該HIC步驟，下面4種樹脂被測試：苯基瓊脂糖凝 膠FF低分辨率（Phenyl Sepharose FF lowsub)(GE)、Toyopearl PPG 600 (Tosoh)、Toyopearl 苯基 600 (Toyopearl phenyl 600)(Tosoh) 、Toyopearl 丁基 600 (Toyopearl butyl 600)(Tosoh)。 針對這些實驗，該經預-純化的IgG是配於100 mM醋酸 鹽Tris緩衝液(pH 7.4，導電度5.0 mS)中。此外，該含有 18 201144327 ‘ MabSelect經預-純化的IgG的物質在pH 4以及50°C下被培育 歷時40分鐘，俾以將聚集物的數量增加至大約20%。 有關調節以及洗滌，100 mM醋酸鹽Tris緩衝液（pH 7.4，導電度5.0 mS)(緩衝液A)被使用（直插式混合以一特定 體積百分比的緩衝液B)。緩衝液B含有配於100 mM醋酸鹽 Tris緩衝液(pH 7.4)中的2 Μ硫酸銨。所有樹脂在產物裝填的 期間使用直插式混合以緩衝液Β (在體積的基礎上）而被測 試。數個有關裝填/緩衝液Α以及緩衝液Β的百分比比例針對 各個樹脂而被測試。所有管柱容積為1 nu，流速為1〇〇 ml/ 小時’以及用於裝填的IgG數量是0.29 g/1並且100 ml被裝 填。 該裝填以及該溢流道這兩者均被取樣以及被分析。 已經呈 0% B 的 Toyopearl 苯基 600、Toyopearl 丁基 600這 兩者結合大多數的IgG以及該等聚集物。因此被推論的是： 這些樹脂不適合供用於在該等被應用的條件下於使用該 P419 IgG的溢流道模式中之聚集物移除。 苯基瓊脂糖凝膠FF低分辨率（未被顯示）、Toyopearl PPG 600 (參見表1)這兩者在該溢流道（使用呈一特定比例 之含有硫酸銨的緩衝液B之直插式混合）中給予一好的聚集 物清除。 表1.使用不同體積比例之含有硫酸銨的緩衝液B之直插 式混合的聚集物清除(使用Toyopearl PPG 600) %緩衝液Β 起始物質 0 聚集物(％) IgG單體(％) 19.8 79 7 20.9 78.4 A280 0.29 0.28 19 201144327 5101520

8 9 5 2 11 11 οο 8 9 9 9 6 3 9 1 2 2 11 0.0·0·0· 實施例1.

在一單一單元操作中之在最佳的AEX以及HIC條件下純化 出IgG 一 AEX單元以及一HIC單元是如在第1圖的圖式中所描 述的而被串列直插式地結合。針對該AEX，一Mustang Q硬 幣型膜過濾器被使用；以及針對該HIC，一含有3 mi Toyopearl PPG 600樹脂的管柱被使用。 針對在產物裝填之前的樹脂調節，一為100 mM的醋酸 鹽丁1^緩衝液化1^.4，導電度5.〇1115)(緩衝液八)被使用。同 時地’緩衝液B呈一為22%的體積比例而被直插式混合。緩 衝液B含有2 Μ硫酸銨[配於1〇〇 mM醋酸鹽Tris緩衝液(pH 7·4)中]。 該經預-純化之IgG的裝填藉由在一與缓衝液Α相似的 流動下泵送(pumping)該IgG而被起始，而緩衝液A泵送被停 止。一為362 ml (含有4.37 g的IgG)的總數量被裝填。在完 成該裝填之後’該泵被轉換回復至緩衝液A，俾以從該系統 中回收所有產物。於其之後，該HIC單元藉由停止緩衝液B 的直插式混合而被卸除並且因而使用100%緩衝液A (被分 開地收集）。在整個運行的期間，通過該HIC的流動是185 ml/ 小時。總時間（包括調節、洗滌以及卸除）為3.5小時。該裝 填以及該溢流道這兩者針對IgG聚集物比例、DNA含量、 HCP含量以及蛋白質（產物）含量（Α·)而被分析。HCP轉換 20 201144327 是>log 2.3 (HCP在該溢流道中的數量是低於LoD)。聚集物 的數量在該裝填中是5.8%，而在該溢流道中是1.2%。以A28Q 為基礎的總產物回收為86.7% (沒有卸除）以及90.1% (包括 卸除）。 被使用的縮寫 A280 AEX BHK細胞 CHO細胞 EBA HCP HIC HPLC IgG LoD TFF Tris 在280 nm下的（光）吸收值 陰離子交換 幼倉鼠腎細胞 中國倉鼠卵巢細胞 經擴張的床吸附 宿主細胞蛋白質 疏水性交互作用層析法 高壓液相層析法 免疫球蛋白G 偵測的限度 切向流過濾 三（羥曱基）曱胺 【圖式簡單說明】 第1圖：一單一操作單元，其包含有一陰離子交換層析 法部件以及一疏水性交互作用層析法部件這兩者。緩衝液A 是一適合用於該A E X步驟之最佳操作的調節以及洗滌緩衝 液。緩衝液B含有一易溶鹽類並且呈一比例而被混合至該裝 填/緩衝液A中（對於得到供用於操作該ΗIC步驟的最佳條件 是必須的）。該混合比例可使用一經固定的體積混合流而被 執行，或者可藉由一回館迴路[基於例如，導電度輸出而被 自動地控制。MC是一選擇性的混合槽，它可以含有任何類 型的靜電混合器。 L=裝填

PA=泵 A 21 201144327

PB=泵 B AEX=陰離子交換單元 HIC=疏水性交互作用層析法單元 pH=pH感應器 σ=導電度感應器 PF=選擇性的預-過濾器 【主要元件符號說明】 (無） 22

Claims (1)

1. 201144327 七、申請專利範圍： 1· 一種用於從一在一生物反應器中所生成的蛋白質混合物 中純化出抗體的方法，其至少包含中度純化以及精純化 的步驟，其中該等中度純化以及精純化步驟包含有：串 列直插式陰離子交換層析法（AEX),產生有如一溢流道 刀離部分（一分離混合物），繼而為疏水性交互作用層析 法(HIC) ’產生有如一溢流道分離部分（一經純化的抗體 製品）’以及其中該經純化的抗體製品被進行至少一進一 步的純化步驟。 2·如申請專利範圍第旧的方法，其中陰離子交換層析法以 及疏水性交互作用層析法發生在二個被串列連接之分開 的裝置中。 3. 如申β月專利範圍第1項的方法，其中該串列直插式ΑΕχ 以及HIC被執行有如一單一單元操作。 4. 如申請專利範圍第⑴項中任—項的方法，其中該分離 混合物在HIC之前被補充以_足夠量的易溶鹽類。 5. 如申請專利範圍第⑴項中任—項的方法，其中該分離 混合物在HIC之前被補充以—足夠量的硫酸錄、硫酸 鈉、硫酸鉀、餐敍、魏鈉、·_、氣切以及氣 化納。 6. -種可被使用於-如巾請專利範圍第⑴項中任一項的 方法中的單-操作單元’該操作單元包含1離子交換 層析法部件以及-疏水性交互作用層析法部件這兩者， 該等部件被㈣連接，其㈣_子錢騎法部件的 23 201144327 出口被連接至該疏水性交互作用層析法部件的入口，其 中該單元包含一在該陰離子交換層析法部件的上游末端 處的入口以及一在該疏水性交互作用層析法部件的下游 末端處的出口，以及其中該單元亦包含一介於該陰離子 交換層析法部件以及該疏水性交互作用層析法部件之間 的入口。 24