TW201130809A - Pharmaceutical compositions containing brazilin for inhibiting expression of cytokines of T helper cell type II and/or inhibiting expression of chemokines and uses of the same - Google Patents

Description

201130809 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於蘇木素（brazilin)於抑制第二型τ輔助細胞之細 胞激素之生成及/或抑制趨化激素（chem〇kine)之生成之應用。 【先前技術】 〜 過敏症係普遍性之疾病，程度較輕者包括由食物或昆蟲叮咬所 引起的過敏，較嚴重者則包括異位性皮膚炎、過敏性鼻炎、氣喘 等過敏性疾病。近數十年來，由於工業化與文明的進步，造成環 u染與人類飲食習慣改變’故全世界之過敏性疾病的發生率及 嚴重私度皆有日益增加之趨勢。 就過敏性疾病之治療而言，目前仍以藥物控制的方式為主。儘 官市面上已有抗過敏藥物，例如皮質類固醇（c〇rtic〇ster〇ids)、抗 組織胺劑（anti-histamines )及抗白三晞素（)等， 但仍有大約百分之五的過敏症病患無法經由使用該等藥物而有效 控制病情。此外’該等藥物各具不同副作用，例如：皮質類固醇 會造成體重增加、水腫 '高血壓、鉀流失等；抗組織胺劑會引起 «睡、頭痛、視力模糊等；抗白三烯素則會導致腸胃不適等等。 再者，該等藥物的最大問題在於，一旦停止用藥，過敏症狀（例 如發炎反應等）便會快速地復發’故無法用於長效性或持久性之 治療。 另一方面，過敏性疾病亦可經由服用中藥來進行治療。然而， 目前市面上用於治療過敏性疾病之中藥多為複方，故於藥物之製 備及藥量與藥效之控制上，仍存在許多問題。 201130809 鑒於西醫與中醫對於過敏症之治療方法，仍有前述缺點，是故， 對於可有效治療過敏性疾病、副作用低、且易於製備之物質或醫 藥組合物之需求仍持續存在。 本發明係針對上述需求所為之研究，本案發明人經由活體内（〜 VZVO)及活體外（h 之相關實驗，確認蘇木素可抑制第二型 T辅助細胞（ThelperceiitypeII，Th2cell)之細胞激素之生成， 以及抑制趨化激素（chemokine)之生成，且可經由調控根本之免 疫機制’達成長效性控制或治療過敏性疾病之效果。 【發明内容】 本發明之一目的在於提供一種用於抑制第二型τ輔助細胞 helper cell type II，Th2 cell)之細胞激素之生成及/或抑制趨化激 素（chemokine)之生成的醫藥組合物’其係包含一有效量之活性 成分，其中該活性成分係選自以下群組：式（1)化合物、其醫藥 可接受鹽及酯、或前述之組合：

本發明之另一目的在於提供一種使用式（I)化合物及/或其醫藥 可接受鹽及/或酯在製造藥劑之應用，其中該藥劑係用於抑制第二 型T辅助細胞之細胞激素之生成及/或抑制趨化激素之生成。 本發明之又一目的在於提供一種抑制第二型T輔助細胞之細胞 201130809 激素之生成及/或抑制趨化激素之生成的方法，其係包含對於有此 需求之標的投以有效量之式（I)化合物及/或其醫藥可接受越及/ 或酯。 本發明之技術及較佳實施態樣，將描述於以下内容中，以供本 發明所屬領域具通常知識者據以明瞭本發明之特徵。 【實施方式】 除非文中有另外說明’於本說明書中（尤其是在後述專利申請 範圍中）所使用之「一」、「該」及類似用語應理解為包含單數及 複數形式。此外，「細胞激素之生成」一語係包含細胞激素之產生、 表現及釋放，且「趨化激素之生成」一語係包含趨化激素之產生、 表現及釋放。 T細胞在免疫機制中扮演關鍵之角色，且依據其分泌之細胞激 素種類而定’可分化成二類細胞：第一型T辅助細胞（即Thl細 胞）’可產生干擾素-γ( interferon-γ，IFN-γ )及介白素_2 (interleukin-2 ’ IL-2 );第二型Τ輔助細胞（即Th2細胞）則可 產生介白素-4(IL-4)、介白素-5(IL-5)、介白素-6(IL-6)及 介白素-10 (IL-10)。其中’ Thl細胞可幫助殺手細胞，並藉由分 泌IFN-γ來活化巨嗟細胞，以促進細胞性免疫反應，而Th2細胞則 可協助B細胞產生過敏性抗體IgE，並藉由分泌IL-4與IL-5來活 化肥大細胞（mast cell)或嗜酸性白血球（eosinophil)，使其分 泌發炎介質，包括組織胺（histamine )、白三烯素（leukotriene )、 前列腺素（postaglandine )等。Th 1細胞與Th2細胞具有互相拮抗 之關係，Thl細胞釋放之IFN-γ會抑制Th2細胞，而Th2細胞釋放 201130809 之IL-4或IL-10則會抑制Thl細胞產生IFN-γ。 因此’ Thl細胞與Th2細胞之間的交互作用會影響生理免疫反 應，且與許多疾病有極大之相關性。舉例言之，已知過高的Th2 細胞活性會導致過敏，進而引起過敏性疾病，例如呼吸道過敏， 導致過敏性咳嗽或過敏性氣喘；此外，已有文獻證明，Th2細胞 之免疫反應的提升，會促進致癌物誘導大腸癌形成的作用（此可 參見 Osawa e/ a/. Predominant T helper type 2-inflammatory responses promote murine colon cancers. Int J Cancer. 2006. 118(9): 2232-6，其全文倂於此處以供參考）。另一方面，若rph i細胞之活 性過南’則會引起自體免疫功能異常。是故’若能調控Thl細胞 與Th2細胞之間的免疫平衡，使二者活性維持於正常狀態，則可 治療自體免疫疾病、改善過敏（包括過敏性咳嗽或過敏性氣喘） 及抑制大腸癌。 此外’於免疫機制中，免疫細胞所分泌之細胞激素亦包含趨化 激素（chemokine)，其依分子結構可分為〜趨化激素（cxc趨化 激素）、β-趨化激素（CC趨化激素）、γ_趨化激 截素（C趨化激素） 及δ-趨化激素（CXf趨化激素）。趨化、、紅主 〜化/敫素具有趨化性 (chemotactic )，其可選擇性（或專一性）地％ 号丨不同的免疫細胞 至特定部位進行免疫反t舉例言之，最普遍的兩_化激素， 趨化激素與β-趨化激素會分別吸引嗜中性白如丑 % C neutrophil)與 嗜酸性白血球等 已知治療過敏性疾病之藥物包含皮質類固酸 ， 畔、抗組織胺劑及抗 白三烯素等，其作用對象皆係肥大細胞或嗜酸 以生白血球所分泌之 201130809 發炎介質；換言之， 該等藥物係針對Th2細胞之後段（或下游） 免疫反應進行抑制調控，而非自過敏症之病源處進行治療。 本案發明人發現，蘇木素（brazilin)具有抑制Th2細胞之細胞 激素之生成的活性，故可用以抑制Th2細胞之細胞激素之生成， 自Th2細胞之免疫反應的初期階段即進行抑制調控，達成抑制過

具有抑制趨化激素之生成的活性，尤其可抑制P趨化激素之生 成。如上所述，β-趨化激素會吸引嗜酸性白血球，而嗜酸性白血 球與Th2細胞之免疫反應有關，是故，可使用蘇木素及/或其醫藥 可接受之鹽及/或酯，經由抑制β_趨化激素之生成，來抑制Th2細 胞之免疫反應’達成治療過敏性疾病之效果。 因此，本發明提供一種用於抑制Jh2細胞之細胞激素之生成及/ 或抑制趨化激素之生成之醫藥組合物，其係包含一有效量之活性 成分，其中該活性成分係選自以下群組：式（〖）化合物、其醫藥 可接受鹽及酯、及前述之組合：

其中’式（I)化合物即蘇木素，其係來自蘇木科（the Cae扣狀 family)植物，常用於布料染色及細胞染色等。 本發明之醫藥組合物可抑制Th2細胞之IL-4及IL-5細胞激素之 至少一者的生成及/或抑制卜趨化激素之生成。其中，蘇木素可抑 201130809 制IL-4之轉錄因子c-maf及IL-5之轉錄因子GATA結合蛋白3 (GATA-3 ’ GATA binding protein 3 )的表現，進而抑制 IL_4 及江_5 之蛋白質與mRNA的表現。尤其，蘇木素可抑制eGtaxin(ccui) 之生成。eotaxin係-種β-趨化激素，相較於其他β趨化激素（例 如CCL5)，其對嗜酸性白血球具有更強之選擇性。因此，經由抑 制eotaxin之生成，本發明醫藥組入札 、且口物可更專一性地抑制過敏性免 疫反應。 由於本發明之醫藥組合物具右 ^ 、抑制Th2細胞之細胞激素及/或β- 趨化激素之生成的功效，故可鳋 、'由調節Th2細胞之免疫反應，以 治療過敏性疾病。其中，經由翁 乂而小鼠之動物試驗模式證實，蘇 木素可有效減輕呼吸道過敏症狀

K ’包括抑制呼吸道發炎及降低呼 吸道阻力，說明本發明醫藥組A D物可用於抗過敏性氣喘。 本發明另提供一種使用式（n力 化合物及/或其醫藥可接受鹽及/ 或自日在製造藥劑之應用，其中該姐土 二片丨係用於抑制Th2細胞之細胞 激素之生成及/或抑制趨化激素 ^ 生成。特定言之，該藥劑係用於 抑制IL-4及IL-5細胞激素之至小 夕〜者的生成、以及抑制β-趨化激 素的生成’故具有治療過敏性痂 ^ 1 、病、抑制呼吸道發炎、降低呼吸 道阻力、以及抗過敏性氣喘等功效。 可以任何合宜之方式施用本發 、 月邊藥組合物’舉例言之，但不 以此為限，可以口服、皮下或籍 — 内等投藥方式施用之。該醫筚 組合物可使用於獸醫與人類醫藥 ’、 /、上’單獨或與醫藥佐劑一起使用。 以製備適於口服投藥之藥劑开彡 夕巧為例’可於本發明醫藥組合物 中含有不會不利影響式（I)化入 〇物活性之佐劑，例如：溶劑、油 201130809 性溶劑、稀釋劑、安定劑、吸收延遲劑、崩散劑、乳化劑、μ 劑、潤滑劑、吸濕劑等。舉例言之，溶劑可選自水㈣糖溶液: 稀釋劑可選自乳糖、《及微晶纖維素，吸收延遲财選自幾丁 聚醣及葡萄胺基《，潤滑劑可選自碳酸鎂，油性溶劑可選: 物或動物油類，如橄欖油、葵花油及魚肝油等。可利用習知方去 將該組合物製成合宜的口服投藥形式，例如：_、膠囊劑法顆 粒劑、散劑、流浸膏劑、溶液劑、糖聚劑、懸液劑 劑等等。 0丁 至於具適於皮下或靜脈内投藥之藥劑形式，則可於本發明醫藥 組合物中含有一或多種例如增溶劑、乳化劑、以及其他佐劑等成 分，以製成如靜脈輸注液、乳劑靜脈輸注液、注射劑、乾粉注射 劑、懸液注射劑、或乾粉懸液注射劑等。可能㈣之溶劑例如： 水、生理食鹽溶液、醇類（例如：乙醇、丙醇'或甘油等）、糖溶 液（例如：葡萄糖或甘露糖溶液）、或前述之組合。 . 本發明醫藥組合物可視需要另含有調味劑、調色劑、著色劑等 :加劑’以提高所得藥劑服用時的口適感及視覺感受；另可添加 合理用量之保存劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑等， 藥劑的儲存性。 '、者可視而要於本發明醫藥組合物中併含一或多種其他活性 成分’進—步加強本發明醫藥組合物之功效或增加製劑配方的運 夕靈/舌n與調配度。舉例言之，可於本發明醫藥組合物含有一或 多種如下活性成分：皮質類固醇、抗組織胺劑及抗白三烯素，以 及其他活性成分等，只要該其他活性成分對式⑴化合物之效益 201130809 沒有不利的影響即可。 可以一日一次 9多次、或數日一次等不同投藥頻率施用本 發明醫藥組合物’端視将早 予k的之需求而異。舉例言之，當使用 於人體以抗過敏性氣喘時， 也 藥劑之用罝，以式（I)化合物計，為 每天約0.25微克/公斤體舌石/ ®至約2.5微克/公斤體重，其中，該單位 『微克/公斤體重』係指卷八匕 母々斤體重所須之投藥量。較佳地，該藥 劑之用量，以式（I )化人私 σ物叶，為每天約0.30微克/公斤體重至

約2.5微克/公斤體重。惟 / Α ρ 、 到'於急性病患（如急性氣喘病患）而 言，其用量可視實際需要_增至數倍或數十倍。 纽以下列具體實施態樣以進—步例示說明本發明。其中該些實 施態樣僅提供作為說明，而& ^ 而非用以限制本發明之範疇。 [實施例1] /rt VlY/O試驗 實驗A、細胞培養 於此實知例中’ 估蘇木素對於Th2細胞之細胞激素的影響。 籲所使用之藥品與試劑為：蘇木素，購自EMD chemical Inc.， Darmstadt，德國，脂多醣（Lps，邱叩叫弧咖似以，來自 办咖Wc/^co" 055:B5)、卵白蛋白（〇VA，〇valbumin)、巴豆醇 -12-肉豆寇 g义鹽 13-醋酸鹽（PMA，phorbol-12-myristate 13-acetate)、及％腺。票吟核皆單填酸（camp，cyclic adenosine monophosphate)，購自 Sigma Chemical ’ St. Louis ’ 密蘇里州，美 國；RPMI-1640培養基、DMEM培養基、漢克斯平衡鹽溶液（HBSS Hank’s balanced salt solution)、盤尼西林、鏈黴素、l-麵胺酸、及 201130809 胎牛血清（FBS，fetal bovine serum ) ’ 購自 Invitrogen，Carlsbad， 加州，美國e 首先，於37°C之含有5體積％二氧化碳之培養箱中，將EL-4 小鼠T淋巴瘤細胞（lymphoma cell，購自ATCC，Manassas，維吉 尼亞州，美國）培養於DMEM培養基（含有10重量％經熱去活之 胎牛血清）中，並以1 : 3之比率繼代培養。 接著，以5χ105細胞/毫升之密度，將T淋巴瘤細胞種至六孔培 養皿内，並於零分鐘時，以1微升/每毫升細胞培養液之添加量， 將不同濃度（0.3、1、3、10、或30毫莫耳濃度）的蘇木素添加至 細胞培養液中，再將細胞置入培養箱中培養。30分鐘後，以1微 升/每毫升細胞培養液之添加量，將5微克/毫升ΡΜΑ和250毫莫 耳濃度cAMP添加至細胞培養液中，以刺激Τ淋巴瘤細胞之IL-4 及IL-5表現。於細胞培養過程中，利用錐藍排除分析法（trypan blue exclusion assay)觀察蘇木素對細胞存活率之影響，結果如表1及 第1圖所示。

表1 蘇木素濃度 (微莫耳濃度） *細胞存活率(°/〇) 0 100.0 ±5.738 0.3 102.8 ±6_895 1 106.5 ± 1.190 3 101.5 ±4.226 10 111.5±5.126 30 98.17 土 8.439 PMA + cAMP 102.0 ±3.416 0.3 115.9 ±6.968 1 107.4 ±3.829 3 109.0 ±3.764 10 100.8 ±3.257 12 201130809

1 30 1 ~i〇4jl2495~ ~~I *平均值士標準誤差，取樣數23。 自表1及第1圖可看出，蘇木素對EL_4 τ淋巴瘤細胞之生長沒 有影響，故說明其不具細胞毒性。 實驗B、蛋白質分析 於 4°C 下’以填酸鹽緩衝液（PBS，phosphate buffer saline)清 洗由實驗A得到的T淋巴瘤細胞’再添加200微升溶胞緩衝液（包 含50毫莫耳濃度三羥甲基氨基甲烷-鹽酸（Tris_HCl)緩衝液、1 φ 重量％ Np-4〇、15〇毫莫耳濃度氣化鈉、1毫莫耳濃度乙二醇雙（2_ 氨乙基醚）四乙酸（EGTA )、1毫莫耳濃度苯基曱基磺醯化氟 (PMSF ’ phenylmethylsulfonyl fluoride )、1 毫克/毫升 ieupeptin( N_ 乙醯基-白胺醯基-白胺醯基-精胺酸基）、1毫克/毫升pepStatin (胃 蛋白酶抑制劑）、pH 7.4之0.5莫耳濃度NaV04)，靜置於4°C下 達30分鐘後，於12,000轉/分鐘之轉速及4°C之溫度下進行離心 20分鐘，並收集上清液。 φ 以BCA蛋白質測試套組（Pierce ’ Rockford，伊利諾州，美國） 定量上述上清液中之蛋白質。細胞核蛋白質之製備則係利用 NE-PERTM套組（Pierce，Rockford，伊利諾州，美國），並參照 製造商之產品說明進行萃取而取得。 接著，進行西方點墨法（western blotting )。將蛋白質與4X蛋 白質樣品緩衝液（包含ρΗ6·8之31.25毫莫耳濃度Tris_HCl、1% 十二烷基磺酸鈉（SDS )、25%巯乙醇（mercaptoethanol )、0.00625% 漠盼藍（bromophenol blue )、及 50 體積 ％甘油（glycerol ))以 3 : 13 201130809 1體積比之比例混合後，以95°C之水浴加熱5分鐘。將蛋白質樣 品加入至10% SDS-PAGE膠體中，以80伏特至150伏特電壓進行 電泳後，再轉印至聚偏二氟乙稀膜（PVDF membrane， polyvinlyidene fluoride microporous membrane)上，隨後將轉潰膜 浸置於阻隔緩衝液（blocking blocking，包含5%脫脂牛奶、10毫 莫耳濃度Tirs-base、100毫莫耳濃度氣化鈉、pH 7.5之0.1°/。吐溫 -20 ( Tween 20))中。30分鐘後，以TBST緩衝液（包含10毫莫 耳濃度Tirs-base' 100毫莫耳濃度氣化鈉、PH 7.5之0.1% Tween 20) 清洗轉潰膜，再添加GATA-3、c-maf及T-bet之一級抗體（購自 Santa Cruz Biotechnology，Inc.，加州，美國），並於室溫下作用2 小時。接著，清洗轉潰膜，再添加經山葵過氧化酵素標定 (horseradish peroxidase-labeled)之二級抗體，並於室溫下作用 1 小時。最後，使用化學勞光（chemiluminescence )試劑（購自 PerkinElmer Life Science, Inc.，波士頓，麻薩諸塞州，美國）使底 片感光，以偵測GATA-3、c-maf及T-bet蛋白質的表現。 另一方面，利用酵素連結免疫吸附（ELISA，enzyme-linked immunosorbent assay)套組（R&D Systems, Inc.，美國）分析上述 細胞上清液中IFN-γ、IL-4、IL-5、及eotaxin等細胞激素的表現， 結果係如表2、表3、第2圖及第3圖所示。 於實驗B及以下實驗C中，所有實驗數據皆以『平均值土標準誤 差』呈現，並利用one-way ANOVA及Newman-keuls事後檢定方 法分析統計差異，且p<〇.05係視為有統計差異。 201130809 表2 蘇木素濃度 (微莫耳濃度） IL-4濃度（微微克/毫升） 控制組 4.541 ± 0.3480 0.3 2.569 ±0.1160 1 5.353 士 1.276 3 5.469 ±0.1160 10 7.093 ± 0.3480 30 4.715 ±0.9859 PMA + cAMP控制組 27.42 ± 0.8208 0.3 + PMA + cAMP 23.93 士 2.214 1 + PMA + cAMP 22.49 ± 1.969 3 + PMA + cAMP 23.45 ± 2.693 10 +PMA + cAMP 23.13 ±2.297 30 + PMA + cAMP 18.71 ± 1.206**· 相較於 PMA + cAMP 控制組，*:ρ<0·05，**:ρ<0·01，***:ρ<0·001 ，平均值±標準誤差，取樣數2 3。 表3 蘇木素濃度 (微莫耳濃度） IL-5濃度（微微克/毫升） 控制組 9.881 ±2.473 0.3 5.925 ±3.462 1 0.2422 ± 0.2422 3 0.2422 ± 0.2422 10 1.474 ±0.9891 30 0.0 土 0.0 PMA + cAMP控制組 3179 ± 167.9 0.3 + PMA + cAMP 2480 ±515.9 1 + PMA + cAMP 2580 ±402.8 3 + PMA + cAMP 2345 ± 392.6 10 +PMA + cAMP 1809 ±337.9 * 30 + PMA + cAMP 1292 ±531.6* 相較於 PMA + cAMP 控制組，*:ρ<0.05，**:ρ<0.01，***:ρ<0.001 ，平均值士標準誤差，取樣數S3。 自表2、表3、第2圖及第3圖可看出，蘇木素可抑制Th2細胞 之細胞激素IL-4及IL-5之蛋白質的表現。 15 201130809 實驗C、mRNA分析

利用即時聚合酶連鎖反應（real-time PCR )定量分析IL-4、IL-5、 GATA-3、c-jnaf、及T-bet之mRNA的表現，其係於萃取出實驗a 之細胞中之RNA(利用RNA純化套組）後，將其反轉錄成cDNA， 再使用 ABI PRISM 7700 序列偵測儀（Applied Biosystems，Foster City，加州，美國）分析mRNA之基因表現。PCR之條件為：50°C， 2分鐘；95°C ’ 10分鐘；60°C ’ 1分鐘；重覆循環四十次。以門檻 循環（threshold cycle，或稱閾值（Ct))表示每個基因的表現量， 並以内生性控制組（endogenous control)之次黃嗓吟鳥嗓呤構酸 核糖轉移 S# ( HPRT ’ hypoxanthine-guanine phosphoribosy transferase)基因之表現量做為mRNA表現量之校正《結果係如表 4至表8、第4圖至第8圖所示。 表4 蘇木素濃度 (微莫耳濃度） IL-4 mRNA表現程度 控制組 1.066 ±0.04998 PMA + cAMP 2.662 ±0.1964 0.3 2.228 ± 0.4786 1 2.028 ±0.1794 3 2.136 ±0.2671 10 1.835 ±0.2712 30 1.478 ±0.1441**

表5 相較於 PMA + cAMP 控制組，*:ρ<〇_〇5，**:ρ<〇·〇ι，***:ρ<〇·〇〇ι， 平均值±標準誤差，取樣數23。 蘇木素濃度 (微莫耳濃度） IL-5 mRNA表現程度 控制組 1.053 ±0.08942 PMA + cAMP 1261 ±97.18 16 201130809 0.3 1397 ± 172.2 1 1225 ±47.23 3 1009 ±77.66 10 926.2 ± 40.70 * 30 594.8 士 252.9 *** 相較於 PMA + cAMP 控制組，*:p<0.05，**:ρ<0·01，***:ρ<0·001， 平均值±標準誤差，取樣數2 3。 表6 蘇木素濃度 (微莫耳濃度） GATA-3 mRNA表現程度 控制組 1.018 ±0.07240 PMA + cAMP 3.699 ±0.2105 0.3 3.960 ±0.1234 1 3.036 ± 0.5622 3 2.663 ± 0.6056 10 1.812±0.1538 ** 30 1.434 ±0.2530 ***

相較於 PMA + cAMP 控制組，*: ρ<0·05，**: ρ<0·01，***: ρ<0.001， 平均值±標準誤差，取樣數$3。 表7 蘇木素濃度 (微莫耳濃度） c-maf mRNA表現程度 控制組 1.004 ±0.02337 PMA + cAMP 2.913 ±0.1499 0.3 3.388 ±0.2410 1 3·318±0.1177 3 2.846 ±0.2632 10 1.826 ±0.6278 ** 30 1.302 ±0.1868 …

相較於 PMA + cAMP 控制組，*:ρ<0·05，**:ρ<0.01，***:ρ<0.001， 平均值±標準誤差，取樣數23。 表8 蘇木素濃度 (微莫耳濃度） T-bet mRNA表現程度 控制組 1.017 ±0.06221 PMA + cAMP 1.084 ±0.09578 0.3 1.073 ±0.1762 17 201130809 1 1.036 ±0.1666 3 1.052 ±0.09226 10 1.068 士 0.1171 30 1.054 ±0.05147 相較於 PMA + cAMP 控制組，*:p<0 05，**:p<0 0卜 *** 〇 〇〇卜 平均值±標準誤差’取樣數23。

由表4至表8、第4圖至第8圖可看出，蘇木素可抑制Th2細 胞之細胞激素IL_4及IL-5之mRNA的表現。此外，蘇木素抑制 IL-4之轉錄因子c-maf及IL-5之轉錄因子GATA-3之mRNA的表 現，但不抑制INF-γ之轉錄因子T-bet之mRNA的表現，顯示蘇木 素係抑制Th2細胞之細胞激素之生成，而不抑制Th 1細胞之細胞激 素之生成。因此，此結果說明蘇木素於Thl/Th2細胞之免疫平衡 中，可抑制過高的Th2細胞之免疫反應，故可用於治療過敏性疾 病0 [實施例2] i/i vivo試驗 實驗D、氣喘小鼠之動物模式試驗 於實施例2中，利用以卵白蛋白（OVA)作為過敏原之氣喘小 鼠模式，進行Wvo試驗。 修 小鼠致敏之實驗步驟係如第9圖所示（此可參見Lee d α/·,

Lenti viral-mediated GATA-3 RNAi decreases allergic airway inflammation and hyperresponsiveness. Molecular Therapy 2008; 16:60-65 ’該文獻全文倂於此處以供參考）。首先，將50微克卵白 蛋白（以 2 毫克銘暮（Alum，Alumlmuject，Pierce Chemical，

Rockford ’伊利諾州，美國）作為佐劑）以腹腔注射（intraperitoneal injection ’ i.p.)方式注射至6至8週大之BALB/c雌鼠（國家實驗 18 201130809 動物中心）體内。分別於第〇、14、及28天，以相同劑量之卵白 蛋白注射小鼠。於第41天及第42天之卵白蛋白投藥前，以腹腔 注射或氣管滴入（intratracheal instillation，i.t.)之方式給予小鼠 不同劑量之蘇木素（高劑量：430微克/小鼠；低劑量：43微克/ 小鼠）。於第42至44天，將10Q微克卵白蛋白溶於40微升PBS， 並以鼻腔滴入（intranasal instillation，i.η.)方式將其投予小鼠（1 天1次’連續3天）。於第45天，觀察小鼠呼吸道反應（airway hyperresponsiveness)。於第46天，犧牲小鼠並進行以下實驗E至 ® G。於上述實驗過程中，注意投予小鼠蘇木素後，是否會引起毒性 反應。於此試驗中，以經投予OVA之小鼠作為正控制組，且以未 經投予OVA之小鼠作為負控制組。 實驗E、組織病理試驗 於實驗D中，最後一次將卵白蛋白滴入小鼠鼻腔中達24小時 後，犧牲小鼠，並自小鼠眼窩採血。接著，立即自小鼠支氣管插 管，並以1毫升不含鈣鎂離子之HBSS緩衝液灌洗小鼠肺部三次 • 後，收集肺泡沖洗液。將肺泡沖洗液以400g之轉速，於4°C下離 心10分鐘。將離心後所得到之細胞再次懸浮於1毫升HBSS緩衝 液中，再以企球計（hemocytometer)計算細胞總數。 接著，以細胞離心製備（cytocentrifuged preparations)之方式將 細胞固定於玻璃片上，再進行劉氏染色（Liu’s stain，此可參見Lee et al., Lentiviral-mediated GATA-3 RNAi decreases allergic airway inflammation and hyperresponsiveness. Molecular Therapy 2008; 16:60-65，該文獻全文倂於此處以供參考）以計算各種細胞之數 201130809 目。細胞數目係以300顆細胞中，巨噬細胞、淋巴細胞、嗜中性 白血球及嗜酸性白血球各自所佔之數目來計算，並根據其標準型 態來分類，以及觀察發炎細胞入侵肺部的情形。結果係如係如表9 至表12及第10圖所示。 組織病理實驗之部分，即係於取得肺泡沖洗液後，立即取下肺 臟，並以中性福馬林固定。以石蠟包埋肺臟組織後，將其切成5 微米厚之切片，此切片以蘇木紫/伊紅（H&E，hematoxylin/eosin) 染色，並在顯微鏡下觀察發炎細胞（或免疫細胞）入侵之情形，

結果係如第11圖（原始顯微鏡圖放大200倍）所示。 表9 蘇木素濃度 (微莫耳濃度） 巨噬細胞數目（χΙΟ4) 負控制組 5.381 ±2.053 正控制組 38.46 ±6.110 低劑量 41_67 士 6.885 高劑量 34.25 士 4.970 表10 蘇木素濃度 (微莫耳濃度） 嗜酸性白血球數目（χΙΟ4) 負控制組 1.351 ± 1.101 正控制組 32.36 ±2.800 低劑量 21.39 ± 1.491 * 高劑量 10.52 ± 4.543 "

相較於正控制組 ’ *:ρ<0·05 ’ **:p<0.01 ’ ***:p<0.001， 平均值士標準誤差，取樣數g 10。 表11 蘇木素濃度 (微莫耳濃度） 淋巴細胞數目（xl〇4) 負控制組 0.09375 ± 0.03786 正控制組 0.8951 ±0.4381 20 201130809 低劑量 0.7421 ±0.2902 高劑量 0.8106 ±0.3015 表12 蘇木素濃度 (微莫耳濃度） 嗜中性白血球數目(xlO4) 負控制組 0.0500 ±0.03371 正控制組 0.3248 ±0.1675 低劑量 0.6476 ± 0.2759 高劑量 0.2178 ±0.1799 自表10及第10圖可看出，蘇木素可降低小鼠肺部中嗜酸性白 血球的數量，故說明其可抑制Th2細胞之免疫反應。此外，由第 11圖可看出蘇木素可減輕發炎細胞之浸潤/侵入，故可抑制發炎反 應。 實驗F、細胞激素分析

將實驗E中所收集之肺泡沖洗液以400g之轉速，於4°C下離心 10分鐘。收集上清液後，利用ELISA套組（R&D Systems, Inc.， 美國）分析eotaxin、IL-4、IL-5、及IFN-γ之表現。結果係如表 13至表16及第12圖至第15圖所示。 表13 蘇木素濃度 (微莫耳濃度） IL-4濃度(微微克/毫升） 負控制組 9.302 ±3.918 正控制組 75.60 ± 19.04 低劑量 36.76 ± 5.490 * 高劑量 23.01 ±2.327 * 相較於正控制組，*:ρ<0·05，**:ρ<0.01，***:ρ<0·001， 平均值土標準誤差，取樣數-10。 21 201130809 表14 蘇木素濃度 (微莫耳濃度） IL-5濃度(微微克/毫升） 負控制組 23.68 ±4.254 正控制組 100.4 ± 12.38 低劑量 70.65 ±6.510 * 高劑量 52.10 ± 6.223 *** 相較於正控制組，*:ρ<0·05，**:ρ<0·01，***:ρ<0·001， 平均值±標準誤差，取樣數2 10。 表15 蘇木素濃度 (微莫耳濃度） Eotaxin濃度(微微克/毫升） 負控制組 4.140 ± 1.204 正控制組 32_35± 2.635 低劑量 18.64 士 3.784 *** 高劑量 12.61 ± 1.334 *** 相較於正控制組，*:ρ<0·05，**:ρ<0·01，***:ρ<0·001， 平均值士標準誤差，取樣數2 10。 表16 蘇木素濃度 (微莫耳濃度） IFN-γ濃度(微微克/毫升） 負控制組 4.719 ± 1.398 正控制組 4.967 ± 1.695 低劑量 3.598 ± 1.218 高劑量 4.288 ±0.868 相較於正控制組，*:p<0.05，**:p<0.01，***:p<0.001， 平均值±標準誤差，取樣數2 10。

自表13至表16及第12圖至第15圖可看出，蘇木素可抑制Th2 細胞之細胞激素IL-4及IL-5之生成，但對Thl細胞之細胞激素 IFN-γ沒有影響，此實驗結果說明蘇木素於Thl/Th2細胞之免疫平 衡中，可抑制過高的Th2免疫反應，故可用於治療過敏性疾病。 此外，蘇木素可抑制β-趨化激素eotaxin之生成，說明其可經由抑 22 201130809 制β-趨化激素之生成來抑制Th2細胞之免疫反應，進而達成治療 過敏性疾病之效果。 實驗G、呼吸阻力測定

呼吸阻力測定係參考Glaab等人的方法來進行侵入式身體體積 測量（invasive body plethysmography)，此可參見 Glaab <a/.， Repetitive measurements of pulmonary mechanics to inhaled cholinergic challenge in spontaneously breathing mice. J Appl 2004;97:1104-1111，該文獻全文倂於此處以供參考。此方 法係觀察經投予甲基膽素（methacholine )之小鼠，其肺部呼吸阻 力的增加情形。 首先，以70至90毫克/公斤體重之戊巴比妥納（pentobarbital sodium，購自Sigma)麻醉BALB/c小鼠，將小鼠氣管切出開口， 並利用以電腦控制的小動物呼吸器（ventilator，Harvard Rodent Ventilator，model 683，Southnatick，麻薩諸塞州，美國）讓小鼠 進行體外換氣（150呼吸/分鐘），維持潮氣量（tidal volume)於 0.3毫升，及終端吐氣正壓為3至4公分-H20。將PE-50管子插入 小鼠食道至胸部位置，連接至一壓力傳感器（pressure transducer， LDS GOULD，Valley View，俄亥俄州，美國），並紀錄肺部壓力、 流速、容積改變。使用軟體（Model PNM-PCT100W，LDS PONEMAH Physiology Platform，LDS GOULD)分析呼吸阻力。利用霧化器 製造甲基膽素喷霧，並將其送至呼吸器再投予小鼠，實驗數據則 係扣除接入氣管切口管子的呼吸阻力（0_45公分I^O.s.ml·1)。其 中’呼吸阻力（pulmonary resistance) RL值之比例=進行甲基膽素 23 201130809 喷霧投藥後之RL值/進行磷酸鹽緩衝液喷霧投藥後之RL值。實驗 結果係如表17至表20及第16圖所示。 表17 蘇木素濃度 甲基膽素3.125(毫克/毫升） (微莫耳濃度） 呼吸道阻力Rrs (公分H20/毫升） 負控制組 1.720± 0.2131 正控制組 3.205 ± 0.3745 低劑量 2.237 ±0.1567 高劑量 2.535 ±0.1251 相較於正控制組 ，*:p<0.05，**:卩<0.01，***:ρ<0·001， 平均值士標準誤差，取樣數2 5。 表18 蘇木素濃度 甲基膽素6.25(毫克/毫升） (微莫耳濃度） 呼吸道阻力Rrs (公分H20/毫升） 負控制組 1.930 ±0.2508 正控制組 3.319 士 0.4910 低劑量 2.206 ± 0.06650 高劑量 2.680 ±0.1676 相較於正控制組 *:ρ<0.05，**:ρ<0.01，***:ρ<0·001， 平均值±標準誤差，取樣數2 5。 表19 蘇木素濃度 甲基膽素12.5(毫克/毫升） (微莫耳濃度） 呼吸道阻力Rxs (公分H20/毫升） 負控制組 2.118 ±0.2981 正控制組 3.806 ±0.4552 低劑量 2.432 ±0.1259 高劑量 3.247 ±0.1368 相較於正控制組 *:ρ<0·05，**:p<0.01，***:p<0.001， 平均值±標準誤差，取樣數2 5。 表20 蘇木素濃度 甲基膽素25(毫克/毫升） (微莫耳濃度） 呼吸道阻力Rrs (公分H20/毫升） 負控制組 2.306 ±0.3270 正控制組 4.120 ±0.5254

24 201130809 低劑量 2.869 ±0.1831*** 南劑量 3.691 ±0.1542*** 相較於正控制组 ’ *:P<〇 〇5，**:ρ<〇〇1，*** 平均值土標準誤差，取樣數g5。 ·ρ αυϋ1 由表17至表20及第16圖可看出，蘇木素可減輕小鼠呼吸道之 阻力，故可用於治療過敏性氣喘。 上述實施例僅係用以例示說明本發明之原理及功效，而非用於 限制本發明。任何熟於此項技藝之人士均可在不違背本發明之技 φ 術原理及精神的情況下，對上述實施例進行修改及變化》因此， 本發明之權利保護範圍應如後述之申請專利範圍所列者。 【圖式簡單說明】 第1圖所示為EL-4 Τ淋巴瘤細胞之細胞存活率的直條圖； 第2圖所示為el-4 Τ淋巴瘤細胞内之IL-4濃度的直條圖； 第3圖所示為el-4 Τ淋巴瘤細胞内之IL-5濃度的直條圖； # 第4圖所示為EL-4 Τ淋巴瘤細胞内之GATA-3之mRNA濃度的 直條圖； 第5圖所示為el-4 T淋巴瘤細胞内之c-maf之mRNA濃度的直 條圖； 第6圖所示為el-4 T淋巴瘤細胞内之T-bet之mRNA濃度的直 條圖； 第7圖所示為el-4 T淋巴瘤細胞内之IL-4之mRNA濃度的直 條圖； 25 201130809 第8圖所示為EL-4 T淋巴瘤細胞内之IL-5之mRNA濃度的直 條圖； 第9圖所不為氣喘小鼠之動物模式試驗的流程圖； 第10圖所示為BALB/c小鼠之肺泡沖洗液内各種免疫細胞的統 計直條圖； 第11圖所不為BALB/c小鼠之肺臟組織切片的H&E染色圖； 第12圖所不為BALB/c小鼠之肺泡沖洗液内IL_4濃度的直條 圖； 第13圖所不為BALB/c小鼠之肺泡沖洗液内u濃度的直條 圖； 第 14圖所示為 BALB/c I鼠之肺泡沖洗液内 濃度的直條圖； 第15圖所示為BALB/c小 圖；以及 eotaxin趨化激素 鼠之肺泡沖洗液内IFN-γ濃度的直條

第16圖所示為BALB/c小氣之晚 〜卞吸道阻力測定的曲線圖。 【主要元件符號說明】 無0 26

Claims (1)

1. 201130809 七、申請專利範圍： 1. 一種用於抑制第二型T輔助細胞（T helper cell type II，Th2 cell)之細胞激素之生成及/或抑制趨化激素（chern〇kine)之 生成之醫藥組合物，其係包含一有效量之活性成分，其中該 活性成分係選自以下群組：式（I)化合物、其醫藥可接受鹽 及醋、及前述之組合：

   如咕求項1所述之醫藥組合物，其中該細胞激素係介白素_4 Interleukin-4)及介白素_5 (il-5，Interleukin-5)之 至^ —者，且該趨化激素係卩_趨化激素。 月求項2所述之醫藥組合物，其中該趨化激素係eotaxin (CCL11)。 1 · 如請求項1 Φ 2 rl·» / 、主3中任一項所述之醫藥組合物，其係用於治療 過敏性疾病。 Μ

   27 201130809

   其中該藥劑制於抑制第二型了輔助細胞之細胞激素之生成 及/或抑制趨化激素之生成。 8. 如請求項7所述之應用，其中該細胞激素係介白素_4及介白 素_5之至少—者’且該趨化激素係、β·趨化激素。

   9. 如請求項8所述之應用，其中該趨化激素係⑽㈣饥⑴。 10·如請求項7至9中任一項所述之應用，其中該藥劑係用於治 療過敏性疾病。 如6月求項10所述之應用，其中該藥劑係用於抑制呼吸道發炎 或降低啤吸道阻力。

   12.如請求項η所述之應用，其中該藥劑係用於抗過敏性氣喘。 士。月求項7所述之應用，其中該藥劑之用量，以式（【）化合 物汁，為每天約〇_25微克/公斤體重至約2 5微克/公斤體重。 14.如請求項13所述之應用，其中該藥劑之用量，以式⑴化 π物。十，為每天約0.30微克/公斤體重至約2 5微克/公斤體重。 28