TW201125577A - Use of defensins for treatment of infective endocarditis - Google Patents

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201125577 六、發明說明： 關於序列表 本申請案含有電腦可讀取形式之序列表。電腦可讀取 形式以引用的方式併入本文中。 發明背景 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於用防禦素多肽處理感染性心内膜炎。 【先前技術】 心内膜炎為心臟内層（心内膜）之炎症。其通常涉及 心臟瓣膜（原生或修復瓣膜）。其他可能涉及之結構包括 室間隔（interventricular septum )、腱索（ch〇rdae 化以匕“）、 壁性'。内膜（mural endocardium)或甚至心内裝置。心内膜 炎之特徵在於原型病變（prototype lesi〇n )，亦即增殖體 (vegetation ),其為血小板、血纖維蛋白（仙如）、微生 物之微菌落及少量的發炎性細胞的聚集塊。 有多種方式對心内膜炎進行分類。最簡單之分類係基 於病源學：視微生物是否為炎症之根源而分類為感染性或 非感染性。無論如何，心内膜炎之診斷係基於臨床特徵、 諸如心回波圖（echocardiogram)之研究、以及證明存在引 起心内膜炎之微生物的任何血液培養。 因為心臟瓣膜不接受任何專用血液供應’所以藥物難 以經由血流到達受感染的瓣膜以治癒感染性心内膜炎 (IE)。詳言之，甲氧苯青黴素（methiciHn)抗性金黃色 201125577 葡萄球菌Staphylococcus aureus') ( MRSA )引起之感染 性心内膜炎極難處理。

根據 Fowler 等人 “ Staphylococcus aureus endocarditis.· A consequence of medical progress” J. Am. Med. Assoc, 第293卷（24 )第30^-30^頁（2005 )，金黃色葡萄球菌 為心内膜炎前瞻性定群研究之國際合作中在1 779例確定IE 病例裡最常見的病原體（558名患者，3 1.4% ) 。MRSA IE 在美國（37.2%)及巴西（37.5%)比在歐洲/中東（23.7%) 更常見。 本發明之一目標在於提供可用於處理感染性心内膜炎 之多肽。 【發明内容】 吾人目前已發現合成防禦素抗微生物肽顯示對抗心内 膜炎之極佳活性，且可用於處理感染性心内膜炎。 在第一態樣中’本發明提供具有抗微生物活性之多肽 在製造用於治療性處理感染性心内膜炎之醫藥品的用途， 該多肽包含與SEQ ID ΝΟ:1之胺基酸序列具有至少80% — 致性之胺基酸序列。 在第二態樣中，本發明提供具有抗微生物活性的多 肽，其包含與SEQ ID N〇:l之胺基酸序列具有至少80%一 致性之胺基酸序列，該多肽係用於處理感染性心内膜炎。 在另一態樣中’本發明提供處理感染性心内膜炎之方 法’其包含向需要此處理之個體投予有效量之具有抗微生 201125577 物/舌性之多肽，該多肽包含與SEQ ID NO: 1之胺基酸序列 具有至少80。/。一致性的胺基酸序列。 在一具體實例中，多肽為防禦素多肽，較佳為；9 -防禦 素多肽。 本發明之感染性心内膜炎可為細菌性心内膜炎，較佳 為葡萄球菌性心内膜炎（staphyi〇coccai en(jocarditis )。在 較佳具體實例中，感染性心内膜炎由曱氧笨青黴素抗性 金黃色葡萄球菌（MRSA )引起。 根據本發明使用的多肽或根據本發明用於處理感染性 心内膜炎的多肽在下文中稱為「（根據）本發明之多肽」。 【實施方式】 定義 抗微生物活性：術語「抗微生物活性」在本文中定義 為能夠殺死或抑制微生物細胞之生長的活性。在本發明之 上下文中，術語「抗微生物」欲意謂有殺細菌及/或抑細菌 及/或殺真菌及/或抑真菌作用，其中術「殺細菌」應理解 為能夠殺死細菌細月包。術語「抑細菌」應理解為能夠抑制 細菌生長，亦即抑制正生長之細菌細胞。術語「殺真菌 應理解為能夠殺死真菌έ田始。奸干「&古& 丹囷、..田胞。術语「抑真菌」應理解為 夠抑制真菌生長，亦即抑舍 丨抑制正生長之真函細胞。術語「微 生物細胞」表示細菌或真菌細胞（包括酵母）。 1 在本發明之上下文φ 中術s。 抑制微生物細胞之生長 欲意謂細胞處於非生長妝能介ρ甘 」 土我狀態’亦即其不能繁殖。 201125577 在一較佳具體實例中，術語「抗微生物活性」定義為 殺細菌及/或抑細菌活性。更佳地，「抗微生物活性」定義 為對抗鏈球菌 （Streptococci )，較佳肺炎鏈球菌

I (Streptococcus pneumoniae^之殺細菌及/或抑細菌活性。 出於本發明之目的，抗微生物活性可根據由Lehrer等 人，Journal of Immunological Methods,第 137 卷（2)第 1 67-174頁（1 991 )所述之程序確定。或者，抗微生物活性 可根據CLSI (臨床及實驗室標準協會（Clinical and Laboratory Standards Institute );先前稱為國家臨床及實驗 室標準委員會（National Committee for Clinical and Laboratory Standards))之 NCCLS 準則確定。

具有抗微生物活性之多肽可能夠在37 下在5 〇〇 # g/ml之濃度；較佳250以g/ml之濃度；更佳1〇0以g/ml之濃 度’甚至更佳50/z g/ml之濃度；最佳25 # g/ml之濃度；且 特定言之10 // g/ml之濃度之該具有抗微生物活性的多肽 下，於相關微生物生長基質中培育金黃色葡萄球菌（ATCC 29213 ) 8小時後（較佳4小時後、更佳2小時後、最佳i 小時後，且特定言之30分鐘後）使該細菌之活細胞數目降 至 1/100 〇 當以500 /zg/ml之濃度添加時；較佳當以25(^§/〇1丨之 =度添加時；更佳當以100//g/ml之濃度添加時；甚至更佳 备以50"§/〇11之濃度添加時；最佳當以1〇"*丨之濃度添 加時’且特定言之當以5以g/mi之遭碎天 〆g ，晨度添加時，具有抗微生 勿活性之多肽亦可能夠抑制金黃色葡萄球菌（MCC 292⑴ 201125577 在37°C下於相關微生物.生長基質中之過度生長持續8小時。 本發明之多肽具有由SEQ ID N〇:1之胺基酸序列组成 之多肽之抗微生物活性的至少2〇%、較佳至少4〇%、更佳 至少50%、更佳至少6〇%、更佳至少7()%、更佳至少游。、 甚至更佳至少9G%、最佳至少95%、且甚至最佳至少1〇〇%。 防紫素：如本文所用之術語「防f素」係指熟習此項 技術者認可屬於抗微生物肽之防禦素類別的多肽。為了確 定多肽是否為本發明之防禦素，較佳藉由使用可自由獲得 之HMMER軟體套裝將胺基酸序列與pFAM資料庫之隱式 馬可夫模型分饰（hidden markov m〇del pr〇fUe ) ( hmm 分 佈）相比較。 PFAM防禦素家族包括防紫素-丨或「哺乳動物防紫素」 (寄存編號PF00323 )、防禦素_2或「節肢動物防禦素」」 (寄存編號PF01097 )、防禦素—^或^防禦素」（寄存 編號PF007U)、防紫素_前肽或「防禦素前肽」（寄存編 號PF_79)及[硫堇（⑽邮也―）或「r硫堇家族」 (寄存編號PF00304 )。 」 防禦素可屬於α -防f素類別、沒_防絮素類別、0 ·防 禦素類別、昆蟲或節肢$物防禦素類別或植物防禦素類別。 在-具體實例中’本發明之防紫素之胺基酸序列包二 4、6或8個半胱胺酸殘基、較佳4或6個半胱胺酸殘基: 更佳6個半胱胺酸殘基。 土 、防禦素亦可為共有任何防紫素類別之特徵性特徵之合 201125577 經分離多肽：如本文所用之術語「經分離變異體」或 「經分離多肽」係指自某一來源分離之變異體或多肽。在 一態樣中，如藉由SDS_PA(}E所測定，變異體或多肽為至 少1 %純、較佳至少5%純、更佳至少10%純、更佳至少20% 純、更佳至少40%純、更佳至少6〇%純、甚至更佳至少8〇% 純且最佳至少90%純。 實質上純之多肽：術語「實質上純之多肽」在本文中 表不含有至多1 〇重量％、較佳至多8重量％、更佳至多6 重量％、更佳至多5重量％、更佳至多4重量％、更佳至多 3重量％、甚至更佳至多2重量％、袭佳至多1重量％、且 甚至最佳至多〇 · 5重量％之與其天然或重組締合之其他多肽 物貝的多肽製劑。因此較佳地’實質上純之多肽以製劑中 總多肽物質之重量計，為至少92〇/〇純、較佳至少94〇/〇純、 更佳至少9 5 %純、更佳至少9 6 %純、更佳至少9 6 %純、更 佳至少9 7 %純、更佳至少9 8 %純、甚至更佳至少9 9 %純、 最佳至少99.5%純、且甚至最佳1〇〇%純。本發明之多肽較 佳呈貫質上純形式。此可例如藉由根據熟知重組方法或經 典純化方法製備多肽來完成。 一致性：兩個胺基酸序列之間或兩個核誓酸序列之間 的相關性可利用參數「一致性」來描述。 出於本發明之目的’使用如在emboss套裝 (EMBOSS :歐洲分子生物學開放軟體組（The European

Molecular Biology Open Software Suite) ，Rice 等人，2000,

Trends in Genetics 16: 276-277 ； http：//emhngg Needle 8 201125577 程式，較佳3.0.0版或 '新版中執行之尼德爾曼-文施演算法 (Needleman-Wunsch algorithm) ( Needleman 及 Wunsch, 1970，/. Μοί. 5ζ·ο/. 48: 443-453)來確定兩個胺基酸序列之 間的一致性程度。所用可選參數為1 〇之空隙開放罰分、〇.5 之空隙擴展罰分、及EBLOSUM62 ( BLOSUM62之EMBOSS 版本）取代矩陣。Needle標記之「最長一致性」（使用無 提要（-nobrief)選項獲得）之輸出用作一致性百分比且如 下進行計算： (一致殘基X100) / ί比對長度-比對中之空隙總數）。 出於本發明之目的’使用如在EMBOSS套裝 (EMBOSS :歐洲分子生物學開放軟體組（The European Molecular Biology Open Software Suite) , Rice 等人 2000 前述；http://emboss.org)之 Needle 程式，較佳 3 〇 〇 版或 更新版中執行之尼德爾曼-文施演算法（Needleman及 Wunsch，1970，同上）來確定兩個去氧核糖核苷酸序列之間 的一致性程度。所用可(選參數為10之空隙開放罰分、〇 .5

之空隙擴展罰分、及EDNAFULL( NCBI NUC4.4之EMBOSS 版本）取代矩陣。Needle標記之「最長—致性」（使用無 提要選項獲得）之輸出用作一致性百分比且如下進行計管. (一致去氧核糖核苷酸X100) / (比對長度-比對中之空隙總數）。 對偶基因變異體：術語「對偶基因變異體」在本文中 表示佔據相同染色體基因座之基因的兩種或兩種以上替代 形式之任一者。對偶基因變異在天然情形下經由突變發 生，且可導致群體内之多形現象。基因突變可為靜止“……） 201125577 的（所編碼之多肽無變化）< 多肽。多肽之對偶基因變異體 編碼的多欣。 可編碼胺基酸序列已改變之 為由基因之對偶基因變異體 修飾：術語「修飾在太 在本文中意謂對由SEQ ID ΝΟ:1 之胺基酸序列組成之多妝沾紅7 狀的任何化學修飾以及對編碼彼多 肽之DNA的遺傳操作。修雜π * ? ^飾可為胺基酸之取代、缺失及/ 或插入以及胺基酸側键之晋趟.+ a 硬足置換’或使用胺基酸序列特徵類 醯胺化，諸如對 似之非天然胺基酸。特定言之，修飾可為 C-末端之醯胺化。 肽 具有抗微生物活性之多 在第心樣中，本發明係關於胺基酸序列與SEq jd NO. 1 (亦即成熟多肽）之—致性程度為至少議、較佳至 少85%、更佳至少90%、最佳至少9:5%、且特定言之至少 97%之具有抗微生物活性的經分離多肽（下文稱為「同源性 多肽」）。在一較佳態樣中，同源性多肽具有與seqidn〇:i 之胺基酸序列有至乡8個胺基酸、較佳至多7個胺基酸、 更佳至多6個胺基酸、甚至更佳至多、個胺基酸、甚至更 佳至多4個胺基酸、甚至更佳至多3個胺基酸、最佳至多2 個胺基S夂特疋§之！個胺基酸不同的胺基酸序列。 在另態樣中，本發明之多肽相較於SEQ ID NO: 1之 胺基酸序列具有丨或若干個胺基酸變化。 本發明之多肽較佳包含SEQ ID N〇:1之胺基酸序列或 其對偶基因變異體。在一較佳態樣中，多肽包I seq id N〇:l之胺基酸序列。在另一較佳態樣中，多肽由seq⑴ 10 201125577 NO: 1之胺基酸序列或其對偶基因變異體組成。在另一較佳 態樣中，多肽由SEQ ID NO: 1之胺基酸序列組成。 較佳地，胺基酸變化具有次要性質，其為不顯著影響 多肽之摺豐及/或活性之保守性胺基酸取代或插入；單一缺 失；小胺基或羧基末端延伸；至多約2〇_25個殘基之小連接 子肽；或便於藉由改變淨電荷或另一功能進行純化之小延 伸’諸如聚組胺酸標籤、抗原性抗原決定基或結合域。 保守性取代之實例屬於以下群組··鹼性胺基酸（精胺 酸、離胺酸及組胺酸）、酸性胺基酸（麩胺酸及天冬胺酸）、 極性細基酸（麩醯胺酸及天冬醯胺）、疏水性胺基酸（白 胺酸、異白胺酸及纈胺酸）、芳族胺基酸（苯丙胺酸、色 胺酸及酷胺酸）、及小胺基酸（甘胺酸、丙胺酸、絲胺酸、 蘇胺酸及甲硫胺酸）。一般不改變特定活性之胺基酸取代 在此項.技術中為已知的且例如由H. Neurath及R.L. Hill 1979，77ie iVoieiws, Academic Press，New York描述。最常 出現之父換為 Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、

Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Va卜 Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、 Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Va卜 Ala/Glu、及 Asp/Gly。 除20種標準胺基酸以外，亦可用非標準胺基酸（諸如 4-羥基脯胺酸、6-W-甲基離胺酸、2-胺基異丁酸、異绳胺酸、 及α -曱基絲胺酸）取代野生型多肽之胺基酸殘基β可用有 限數目之非保守性胺基酸、不由遺傳密碼編碼之胺基酸及 非天然胺基酸取代胺基酸殘基。「非天然胺基酸」可在蛋 白質合成後經修飾，及/或在其側鏈中具有不同於標準胺基 201125577 酉欠側鏈化學結構的化學結構。非天士胺基酸可化學合成， 且車乂佳可購得’且包括2_0底σ定曱酸、嘆。坐咬曱酸、去氮捕 胺西文、3-甲基脯胺酸及4_曱基脯胺酸、及3,3-二曱基脯胺酸。 親本夕狀中之必需胺基酸可根據此項技術中已知之程 序，諸如定點突變誘發或丙胺酸拇描突變誘發來鑑別 (Cunningham 及 Wells，1989,244: 1〇811〇85)。 在後一技術中，在分子中每一殘基處引入單一丙胺酸突 變，且測試所得突變型分子之生物活性（亦即抗微生物活 性）來鑑別對分子活性關鍵的胺基酸殘基。亦參見Hih〇n 等人，1996, J. Βζ·ο/· CAem. 271: 4699-4708。生物相互作用 亦可藉由結合推定接觸位點胺基酸之突變對如藉由諸如核 磁共振、結晶學、電子繞射、或光親和標記之技術測定之 、会。構進行物理分析來確定。參見例如d e V 〇 s等人，1 9 9 2

Scze/ia 255: 306-3 12 ; Smith 等人，1992,义 MW,仍〇/. 224: 899-904 ; Wlodaver 等人，1992, Le" 309:59-.64。必需 胺基酸之一致性亦可根據對與同本發明多肽相關之多肽的 一致性進行分析來推斷。 可使用已知突變誘發、重組及/或改組之方法，隨後進 行相關師檢程序，諸如Reidhaar-Olson及Sauer，1988 241: 53-57 ; Bowie 及 Sauer, 1989, /Voc. Λ^α"· *Scz·. ί/Μ 86: 2152-2156 ; WO 95/17413 ;或 WO 95/22625 所 揭示者來進行及測試單一或多胺基酸取代。其他可使用之 方法包括易出錯PCR、嗟菌體呈現（例如Lowman等人，1991 所.30:10832-10837;美國專利第 5,223,409 號；w〇 12 201125577 92/06204)、及定區域突變誘發（Derbyshire 等人，1986, Gene 46:145 ; Ner 等人，1988, DAM 7:127 )。 突變誘發/改組方法可與高產量自動篩檢方法組合以偵 測宿主細胞所表現之所選殖經誘變多肽的活性。編碼活性 多肽之經誘變DNA分子可自宿主細胞回收並使用此項技術 中之標準方法快速定序。此等方法允許快速確定所關注多 肽中個別胺基酸殘基之重要性，且可應用於具有未知結構 的多狀。 在一較佳具體實例中，本發明之多肽為防禦素多肽， 較佳為yS -防禦素多肽。 N-末端延伸 本發明多肽之N-末端延伸可適當地由1至50個胺基 k、較佳2 - 2 0個胺基酸、尤其3 -1 5個胺基酸組成。在一具 體實例中’ N-末端肽延伸不含Arg ( R )。在另一具體實例 中’N-末端延伸包含下文將進一步定義之kex2或kex2樣裂 解位點。在一較佳具體實例中，N _末端延伸為肽，其包含 至少兩個Glu ( E )及/或Asp ( D )胺基酸殘基，諸如N-末 端延伸包含以下序列之一：EAE、EE ; DE及DD。

Kex2位點

Kex2 位點（參見例如 Methods in Enzymology 第 185 卷，Goeddel 編，Academic Press Inc. (1990)，San Diego, CA， 「Gene Expression Technology」）及 kex2 樣位點為發 於 些蛋白貝之别狀編碼區與成熟區之間的二元識別位 點（亦即裂解位點）。 13 201125577 插入keX2位點或kex2樣位點在某些情況下顯示改良前 狀裂解位點處之正確内肽酶加工，從而使得蛋白質分泌量 增加。 在本發明之情形中，插入kex2或kex2樣位點使得有可 能獲得在N-末端延伸中某一位置處之裂解，從而使得抗微 生物多肽相較於SEQ ID NO: 1中顯示之成熟多肽經延伸。 融合多肽 本發明之多肽亦包括另一多肽融合於本發明多肽或其 片ί又之N -末^或C -末端的融合多肽或可裂解融合多肽。融 合多肽係藉由將編碼另一多肽之核苷酸序列（或其—部分） 與本發明之核苷酸序列（或其一部分）融合來產生。產生 融合多肽之技術在此項技術中為已知的，且包括連接編碼 多肽之編碼序列以使其在框中且融合多肽之表現受到相同 啟動子及終止子之控制。 方法及用途 本發明係關於本發明多肽用於處理感染性心内骐炎之 用途。因此，本發明之多肽可用作獸醫或人類之治療劑或 預防劑。因此，本發明之多肽可用於製造處理感染性心内 膜炎（諸如細菌性心内膜炎，例如葡萄球菌心内膜炎或金 黃色葡萄球菌心内膜炎）的醫藥品。在一具體實例中，玉 染性心内膜炎由甲氧笨青黴素抗性金黃色葡萄球^ (MRSA )之感染引起。 本發明之多狀不僅有效處理感染性心内腺洛 、又而且亦 有效預防處理感染性心内膜炎後之復發。本發明因此提供 14 201125577 本發明多肽作為處理感染性心内膜炎後預防復發之醫藥品 的方法及用途。 本發明之多肽可以足以殺死或抑制葡萄球菌屬 (sp·)，諸如金黃色葡萄球菌生長之量進行 使用。 ‘ 本發明多肽之調配物係投予罹患或易患感染性心内膜 炎之宿主。 投藥可為局部或全身性的。一般而言，本發明抗微生 物夕狀之d里將足以使微生物群體減少至少1對數，且可 為2或2以上對數之殺死。本發明多肽係以減少微生物群 體同時使任何副作用減至最小之劑量投予。預期組成物將 在醫師關於活體内使用之指導下獲得及使用。 可使用各種投藥方法。多肽調配物可經口給予或可經 血营内、肌肉内、皮下、腹膜、利用氣霧劑、經眼、膀脱 内、局部等注射。治療性調配物之劑量將視欲投予之特定 抗微生物多肽、投藥頻率、投藥方式、藥劑自宿主之清除 率及其類似因素而廣泛變化。初始劑量可較大，隨後為較 維持劑量。在許多情況下，經口投藥將需要比靜脈内投 樂時更高之劑量。醯胺鍵以及胺基及羧基末端可經修飾以 在經口投藥時獲得更高穩定性。舉例而言，敌基末端可瘦 醯胺化。 調配物 ^本發明之多肽可併入多種調配物中以用於治療性投 築更特疋§之，本發明之多肽可藉由與適當醫藥學上可 15 201125577 接受之載劑或稀釋劑址合而調配成醫藥組成物，且可調配 成固體、半固體、液體或氣態形式之製劑，諸 囊、散劑、顆粒劑、軟膏、乳膏、泡沐體、溶液'检劑: /主射劑 '吸入劑、凝膠、微球體、洗劑及氣霧劑。因此， 多狀之投予可以多種方式達成，包括經口、”、直腸、 非經腸、腹膜内、皮内'經皮、氣管内等投藥。本發明之 抗微生物多肽在投予後可為全身性的或可為局部的。 本發明之多肽可單獨投予、彼此組 其他已知化合物（例如穿孔夸f . a于，或其可與 素等）組合使用。在 也er〇nn、消炎劑、抗生 不以任何方式進二:下方法及賦形劑僅為㈣ 對於口服製劑，多肽可單獨制或與適* 使用以製備錠劑、散劑、顆粒劑或膠囊，例如：二：； 諸如乳：、甘露糖醇、玉米 ^諸如結晶纖維素、纖維素彳,、-4 4 拉伯膠（acacia)、玉米澱粉或明膠；崩解劑：二二 粉、馬鈐薯澱粉或羧甲基纖維素鈉;’:滑潤劑二、澱 調味劑。、及”時稀釋劑、緩衝劑、濕潤劑、防腐劑及 可藉由將多肽溶解、懸浮或乳化於水性 (諸如植物油或其他類似油、合成脂肪酸甘％ /性溶劑 肪酸或丙二醇之…；且必要時與習知添 溶劑、等張劑、懸浮劑、乳化劑、穩定劑及防：： 16 201125577 調配成注射用製劑。 多狀可以氣霧劑調配物用於經由吸入投予。本發明之 多肽可調配至加壓之 ^ h (了接受推進劑中，諸如二氯二氟甲 烷、丙烷、氮氣及其類似物。 此外’多狀可藉由與吝錄其暫^> .Α ^ ^, 興夕種基負（啫如孔化基質或水溶 性基質）混合製備成栓劑。 不今χ月之夕肽可經由栓劑經直 腸投予。拴劑可包括在體：田 媸/皿下熔以，但在室溫下固化之媒 劑，諸如可可脂、+油碟 、 卞波％ ( carbowax )及聚乙二醇。 可提供用於經口或經直腸投藥之單位 聚、-酉也劑及懸浮液，其中各劑量單位（例如一茶起量、—唐 项匙1、旋劑或栓劑）纟有預定量之含有—或多種本發明 多肽的組成物。類似地，用於注射或靜脈内投藥之單位劑 担可包含本發明多肽於呈無菌水、生理鹽水或另一醫藥學 上可接受之載劑中之溶液形式的組成物中。 用於持續釋放調配物之植人物在此項技術中為熟知 的植入物用生物可降解或非生物可降解聚合物調配成微 球體、塊體等。舉例而言，乳酸及/或乙醇酸之聚合物形成 ，主良好耐受之可侵姓性聚合物。將含有本發明抗微生物 多肽之植入物置於感染部位附近以使活性劑之局部濃度相 對於身體其餘部分較高。 旦如本文所用之術言吾「單位劑型」係'指適合作為單位劑 :用於人類及動物個體之物理個別單元，各單元含有經計 斤足以產生所要作用之量之預定量的本發明多肽以及醫藥 學上可接受之稀釋劑…载劑或媒劑。本發明單位劑型之規 17 201125577 格視所用特定多肽及欲達成之作 „^ m ⑺夂佰主中與多肽相關之 樂效學而定。 ， 諸如媒劑、佐劑、載劑或稀釋劑 ⑷ < 醫樂學上可接受之 賦形劑可易於公開獲得。此外，醫单與 w果予上可接受之助劑物 質，諸如pH值調節劑及緩衝劑、張力 刀5周即劑、穩定劑、濕 潤知1丨及其類似物可易於公開獲得。 全身性投藥之典型劑量在每次投鲦直 仅樂母公斤個體體重0.1 皮克至100毫克之範圍内。典型劑量 — ⑷置J為母天服用2至6 次每次一片錠劑，或i天服用丨次且 3有知：比例增加含量 之活性成分的一片隨時間釋放膠囊成 吵嚴4 k劑。時間-釋放效果 可利用在不同pH值下溶解之膠囊物質、利用受渗透壓作用 而緩慢釋放之膠囊、或藉由任何其他已知控制釋放方式來 獲得。 熟習此項技術者將易於瞭解劑量可隨特定多肽、症狀 嚴重性及個體對副作用之敏感性而變化。一 上符疋爹肽比 其他多肽更有效。$習此項技術者可藉由多種方式容易地 確定指定多肽之較佳劑量。-較佳方式為量測指定多肽之 生理效能。 使用脂質體作為傳遞媒劑為一種受關注之方法。脂質 體與目標部位之細胞融合且細胞内傳遞内腔之内含物。使 用各種維持接觸之方式’諸如分離、結合劑及其類似方式 來使脂質體維持與細胞接觸持續足以融合之時間。在本^ 明之一態樣中，脂質體經設計以經霧化用於肺部投藥。脂 質體可與介導膜融合之經純化蛋白質或肽，諸如仙台病^ 18 201125577 (influenza virus)等一 之脂質（包括陽離子性 )的任何適用組合。其 諸如膽固醇、磷脂醯絲 (Sendai virus )或流行性感冒病毒 起製備°脂質可為已知形成脂質體 或兩性離子脂質，諸如磷脂醯膽鹼 餘脂質將通常為中性或酸性脂質， 胺酸、磷脂醯甘油及其類似物。 為了製備脂質體，可使用Kat〇等人〇991) J扔0/ Gem. 266:336 i描述之程序。簡言之，將脂質及含有肽之内 腔組成物組合於適當水性介質（宜為鹽水介質）中，其中 總固體將在@ 1-1〇重量％範圍β。在劇烈攪拌約5_6〇秒之 較短時期後’將管置於約25_40t之溫水浴中且重複此循環 力5 1 0 -人。接著將組成物音波處理一段適宜時期，通常約 1 -1 〇秒，且可進一步藉由渦旋進行攪拌。接著藉由添加水 性介質擴大體積，通常使體積增加約丨_2倍，隨後進行振盪 及冷卻。此方法允許併入至高分子量分子之内腔中。 具有其他活性劑之調配物 為在標的方法中使用，本發明之抗微生物多肽可與其 他醫藥活性劑’特定言‘之其他抗微生物劑一起調配。所關 注之其他藥劑包括如此項技術中已知的多種抗生素。抗生 素類別包括青黴素（penicillin )，例如青黴素G、青徽素V、 曱氧苯青黴素、苯唑西林（〇xaciUin )、卡本西林 (carbenicillin )、萘夫西林（nafcillin )、安比西林 (ampicillin )等；青黴素與/3 -内醯胺酶抑制劑、頭孢菌素 (cephalosporin)(例如頭孢克洛（cefacl〇r )、頭孢唑林 (cefazolin )、頭孢 α夫辛（cefuroxime )、拉氧頭孢 19 201125577 (moxalactam )專）之組合；碳青黴稀類（carbapenems ); 單環冷-内醯胺類（monobactams );胺基糖苷 (aminoglycoside );四環素（tetracycline );巨環内西旨 (macrolide )，林可黴素（lincomycin );多黏菌素 (polymyxin )，績醯胺（sulfonamide );喧諾®^! ( quinolone ); 氣撤素（cloramphenical );甲石肖 °連。坐（metronidazole )； 壯觀黴素 （spectinomycin ) ，·三甲氧苄二胺0密咬 (trimethoprim);萬古黴素（vancomycin);等。 抗黴菌劑亦適用，包括多烯，例如雙性黴素B (amphotericin B )、製黴菌素（nystatin ) ; 5-氟可辛 (5-flucosyn)，及唾’例如p米康。坐（miconazol)、酮康唾 (ketoconazol )、伊曲康唾（itrac〇naz〇i )及氟康嗤 (fluconazol)。抗結核樂物包括異煙耕（is〇niazid )、乙 胺丁 .（ ethambutol )、鍵徽素（streptomycin )及利福平 (rifampin )。本發明抗微生物多肽之調配物中亦可包括細 胞激素，例如干擾素7、腫瘤壞死因子α、介白素12等。 試管内合成 本發明之多肽可使用如此項技術中已知之習知方法藉 由試官内合成來製備。各種商業合成裝置可獲得，例如 Applied Bio systems公司、Beckman等之自動合成器。藉由 使用合成器，天然存在之胺基酸可經非天然胺基酸（特定 έ之D-異構體（或D-型），例如D-丙胺酸及D-異白胺酸）、 非對映異構體、具有不同長度或官能基之側鏈及其類似物 取代。特定序列及製備方式將由便利性、經濟性、純度要 20 201125577 求及其類似因素來決定。 可向包含適宜於鍵結之官能基之各種肽或蛋白質提供 化學連接，該等官能基諸如用於形成醯胺或經取代胺（例 如還原性胺化）之胺基、用於形成硫醚或二硫化物之硫醇 基用於形成醯胺之羧基及其類似官能基。 必要時，可在合成期間或在表現期間向肽中引入允許 他刀子或表面連接之各種基團。因此，半胱胺酸可用 於製備硫醚，組胺酸用於連接於金屬離子錯合物，羧基用 於形成醯胺或酯，胺基用於形成醯胺，及其類似情形。 ,多肽亦可根據重組合成之習知方法來分離及純化。可 製備表現宿主之溶解產物且使用肌c、排阻層析、凝膠電 ^親和力層析或其他純化技術來純化該溶解產物。對於 大部分而言，相對於與產物製備及其純化之方法相關之污 染物，所用組成物將包含至少2〇重量％、更通常至少約Μ 重里/❹、較佳至少約95重量％、且出於治療目的通常至少 、’’勺99.5重里％的所要產物。通常，百分比將以總蛋白質計。 本發明藉由以下實施例進一步描述’該等實施例不應 理解為對本發明之範疇造成限制。 實施例 實驗中所用之合成防禦素為具有SEQ ID Ν〇:ι中所示 之胺基酸序列的多a。在實施例中，此合成素㈣ 「心内膜炎素（―」。 稱為 實施例1 合成防f素對抗由甲氧苯t黴素抗性金黃色葡萄球菌 21 201125577 (MRSA )引起之感染性心内膜炎（IE )的治療功效 方法 最低抑制濃度（MIC) 根據臨床實驗室標準協會（Clinical Labomory Standards Institute，CLSI )藉由培養液微量稀釋檢定來測 定心内膜炎素、萬古黴素及達托黴素（daptomycin )之MIC。 MIC定義為完全抑制生物體生長之最低藥物濃度。 1 \ 動物心内膜炎模型 在經頸動脈-經主動脈瓣留置插入導管後，在紐西蘭白 兔（New Zealand White rabbits )中利用曱氧苯青黴素抗性 金黃色葡萄球菌（MRSA)菌株ATCC33591誘發實驗性主 動脈感染性心内膜炎模型。 ί ) IE模型中MRSA ATCC33591之固有毒性 在導管插入後24小時，主動脈插有導管之動物以每隻 動物ίο5、ίο6、或107個菌落形成單位（CFU)之mrsa ATCC33591菌株進行靜脈内激發，該接種物範圍涵蓋此模 型中大多數金黃色葡萄球菌之ZD”。接種後24小時，對所 有動物實施安樂死且移除其心臟增殖體、腎及脾，並定量 培養。 2 )样微生物劑處理之功效 在主動脈插入導管後，且在感染後24小時，動物_ 機化以接受： i)無療法（對照）； ")〜内膜炎素，40 mg/kg，靜脈内，每天兩次； 22 201125577 U1)萬古徽素’ 15 mg/kg，靜脈内，每天兩次；或 lv)達托黴素’ 12 mg/kg,靜脈内，每天一次（後兩個 劑量策略模擬人類樣pK)。 處理持續3天。在最後-次抗生素劑量後24小時，半 數動物用致死劑量之戊巴比妥鈉（—iUm pent()barbital )處 死以測-式處理功效。其餘動物在無藥物下再存留3天以用 於復發研究。在處死時，移除增殖體、腎及脾並進行定量 培養。為了監測活體内抗性形成’在含有心内膜炎素（1χ MIC = G.5#g/ml) <則壤脂盤上並行培養句漿組織。培 養結果表示為每公克組織之平均l〇g10CFU(± SD)。 結果 最低抑制濃度（MIC) 内膜k素、萬古黴素及達托黴素對於研究菌株 (MRSA ATCC33591 )之 MIC 分別為 0.5、2 〇 及 〇」 r·^ g/ml。 IE模型中MRSA ATCC33591之固有毒性 在1〇5 CFU激發下，僅60%插入導管之動物產生感染 性心内膜炎。在106 CFU& 107 CFU之接種物激發下，= 有插入導管之動物皆產生IE (表n。然而，肖33%之經 1〇7 cfu接種物之MRSA ATCC33591菌株感染的動物在感 染後不超過24小時死亡。因此，選擇丨〇6 CFU進行以下功 效研究。 抗微生物劑處理之功效 不同療法及復發組中之MRS A密度展示於表2中。相 23 201125577 較於未處理對照，以所冑3種抗微生物劑進行之療法在處 理結束時皆顯著降低所有3個目標組織中之MRSA密度(： 2; P< 0.002 )。此外，心内膜炎素處理顯示相較於萬又古黴 素療法，所有目標組織中MRSA密度降低方面的功效顯著 較尚（表2 ; /><0.001)。相較於心内膜炎素，達托黴素在 IE模型t具有類似、治療功效（表2)。重要的是，心内膜炎 素方案在預防復發方面最有效（表3>。此外，未分離出心 内膜炎素抗性菌株（資料未示）。 結論 此等結果證實相較於萬古黴素處理組，心内膜炎素在 減小所有3個目標組織中之MRSA密度方面具有顯著較佳 之功效’且相較於達托黴素方案，在重度MRsa IE模型中 具有類似治療功效。 目標組織中之金黃色葡萄球菌密度。 感染接種物 金黃色葡萄球菌 密度（每公克組織之l〇g1()CFU) 增殖體 腎 脾 105CFU 6.51+/-3.61 4.02+/-2.72 3.85+/-2.05 io6cfu 8.08+/-0.85 6.13+/-0.88 5.49+/-0.43 io7cfu 8.83+/-0.91 6.46+/-0.77 5.90+/-0.51 24 201125577 表2.在實驗性兔心内膜炎模型中心内膜炎素、萬古黴 素及達托黴素對抗MRS A ATCC33 59 1之功效。 * P < 0.001，相對於萬古黴素處理。 處理 金黃色葡萄球髮 密度(每公克組織之丨〇g1() CFU ) 增殖體 腎 脾 無處理之對照 8.08+/-0.85 6.13+/-0.88 5.49+/-0.43 心内膜炎素 (40mg/kg ’靜脈内，每天兩次） 2.41 +/-1.50* 1.18+/-0.75 * 1.02+/-0.65 * 萬古黴素 S (15 mg/kg，靜脈内，每天兩次） 5.60+/-1.47 3.07+/-0.53 3.02+/- 0.51 達托黴素 (12 mg/kg ’靜脈内，每天一次） 1.90+/-0.82* 0.76+/-0.52* 0.91 +/-0.53* 表3.在實驗性兔心内膜炎模型中心内膜炎素、萬古黴 素及達托黴素對抗MRS A ATCC33 59 1之功效。 * P < 0.001，相對於萬古黴素復發；** P < 0.01，相對 於萬古黴素復發。 復發 金黃色葡萄球菌密度（每公克組織之丨〇g1〇 CFU) 增殖體 腎 脾 心内膜炎素 (40 mg/kg，靜脈内，每天兩次） 1.45+/-0.64* 0.75+/-0.79* 1.17+/-0.70* 萬古黴素 (15 mg/kg，靜脈内，每天兩次） 6.36+/-1.57 4.69+/-1.63 3.98+/-1.27 達托黴素 (12 mg/kg，靜脈内，每天一次） 2.46+Λ2.36** 1.68+/-2.24** 1.30+/-1.48** 25 5 201125577 實施例2 合成防禦素對抗感染性心内臈炎（IE )之治療功效 方法 在經頸動脈-經主動脈瓣留置插入導管後誘發兔IE。在 以l〇6cfUMRSAATCC33591 (ID95接種物）靜脈内感染後 24小時，動物接受： i)無療法（對照）； U )〜内膜炎素，5、10或2〇 mg/kg ,靜脈内，每天兩 次； ιη)萬古黴素，15 mg/kg，靜脈内，每天兩次；或 111 )達托黴素，12 mg/kg ,靜脈内，每天一次； 所有方案皆持續3 A。在最後-次抗生素劑量之後24 小時’移除目標組織並進行定量培養』。 結果 相對於未處理對照，各方案皆顯著減小3個主要目標 組織中之MRSA密度（尸<0.05)，但最低劑量之心内膜炎 素使脾MRSA計數降低除外。此外，在1£模型中在所有目 枯組織中皆觀测到心内膜炎素之劑量依賴性治療功效。重 要的疋，20 mg/kg之心内膜炎素顯示相較於萬古黴素療法， 降低所有目標組織中之MRSA密度的功效顯著較高，且與 達托黴素之功效類似。 26 201125577 ' 表4.在實驗性兔心内膜炎模型中心内膜炎素、萬古黴 素及達托黴素對抗MRS A ATCC33 59 1之功效。 處理 金黃色葡萄球菌密度（每公克組織之l〇g1() CFU) 增殖體 腎 脾 無處理之對照 8.15+/-0.73 5.82+/-0.85 5.28+/-0.55 心内膜炎素 (20mg/kg，靜脈内，每天兩次） 1.57+/-0.75 0.61+/-0.21 0.61+/-0.12 心内膜炎素 (10 mg/kg，靜脈内，每天兩次） 4.74+/-1.84 3.19+/-1.06 2.62+/-0.60 心内膜炎素 (5 mg/kg，靜脈内，每天兩次） 6.44+/-1.70 4.33+/-1.27 4.61+/-1.11 萬古黴素 (15 mg/kg，靜脈内，每天兩次） 5.60+/-1.47 3.07+/-0.53 3.02+/-0.51 達托黴素 (12 mg/kg，靜脈内，每天一次） 1.90+/-0.82 0.76+/-0.53 0.91+/-0.53 結論 在此重度多系統MRSA感染模型中，心内膜炎素相對 於萬古黴素優越之功效，及與達托黴素等效之功效表明進 一步開發此化合物用於處理臨床症候群之潛力。 【圖式簡單說明】 無 【主要元件符號說明】 無 27 201125577 序列表 <1!0> 諾佛酵素公司 <]20>防禦素用於處理感染性心内膜炎之用途 <130> 11696-W0-PCT <]60> 1 <i70> Patent In version 3.5 <2!0> 1 <21l> 40 <212> PRT <2Π>人工 <220> <D3>合成抗微生物肽 <220> <221> mai_pept ide <222> (1)7.(40) <400> ] G ) G ,e G Π s A 5 s cy s V TI V pl

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Claims (1)

1. 201125577 七、申請專利範圍： 1. 一種具有抗微生物活性之多肽的用途，該多肽包含與 SEQ ID ΝΟ··1之胺基酸序列具有至¥ 8〇%一致性之胺基酸 序列’其係用於製造治療性處理感染性心内膜炎之醫藥品。 2. —種具有抗微生物活性之多肽的用途，該多肽包含與 SEQ ID ΝΟ:1之胺基酸序列具有至少8〇%一致性之胺基酸 岸列’其係用於製造預防感染性心内膜炎處理後之復發的 醫藥品。 3. 如申請專利範圍第1至2項中任一項之用途，其中該 多肽包含與SEQ ID ΝΟ:1之該胺基酸序列具有至少9〇%一 致性的胺基酸序列。 4 ·如申請專利範圍第丨至2項中任一項之用途，其中該 多肽包含SEQ ID ΝΟ:1之該胺基酸序列或由SEQ m N〇:1 之該胺基酸序列組成。 ^ 5.如申請專利範圍第丨至2項中任一項之用途，其中該 感染f生’。内膜义由葡萄球菌屬（&叩办sp.)引起。 6·如申請專利範圍第丨至2項中任一項之用途，其中該 感染性心内膜炎由金黃色葡萄球菌（&叩紗) 引起。 7·如申請專利範圍第丨至2項中任一項之用途，其中該 感采丨生〜内膜炙由甲氧苯青黴素（methiciiin )抗性金黃色 葡萄球菌（MRSA)引起。 8· —種具有抗微生物活性的多肽’該多肽包含與SEq ID NO: 1之胺基酸序列具有至少8〇% 一致性之胺基酸序 201125577 列，其係用於處理感染性心内膜炎。 9. 如申請專利範圍第8項使用之多肽，其中該多肽包含 與SEQ ID NO: 1之該胺基酸序列具有至少90% —致性的胺 基酸序列。 10. 如申清專利範圍第8項使用之多狀，其中該多狀包 含SEQ ID ΝΟ:1之該胺基酸序列或由SEQ ID ΝΟ:1之該胺 基酸序列組成。 1 1·如申請專利範圍第8項使用之多肽，其中該感染性 心内膜炎由葡萄球菌屬引起。 12. 如申請專利範圍第8項使用之多肽，其中該感染性 心内膜炎由金黃色葡萄球菌引起。 13. 如申s青專利範圍第8項使用之多肽，其中該感染性 心内膜炎由甲氧苯青黴素抗性金黃色葡萄球菌（MRSA )引 起。 14. 一種處理感染性心内膜炎之方法，其包含向需要此 處理之個體投予有效量之具有抗微生物活性之多肽，該多 肽包含與SEQ ID NO: 1之胺基酸序列具有至少8〇%一致性 的胺基酸序列。 15;—種預防感染性心内膜炎處理後之復發的方法，其 包含向需要此處理之個體投予有效量之具有抗微生物活性 之多肽，該多肽包含與SEQ ID N〇:1之胺基酸序列具有至 少80% —致性的胺基酸序列。 1 6 ·如申睛專利範圍第14至15項中任一項之方法，其 中該多肽包含與SEQ ID ΝΟ··1之該胺基酸序列具有至少 2 201125577 90% —致性的胺基酸序列。 1 7.如申請專利範圍第14至1 5項中任一項之方法，其 中該感染性心内膜炎由葡萄球菌屬引起。 八、圖式· 無 3