TW201122473A - Method for detecting various micro nucleic acids at the same time. - Google Patents

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201122473 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關偵測微小核酸技術之分析技術，尤其是一種可同時 於單一根毛細管中偵測複數個微小核酸之方法。 【先前技術】 微小核膽核酸(microRNAs; miRNAs)為一约22個核皆酸所組成 之短鏈核醣核酸，其雖非為密碼區核醣核酸(non-coding RNA)，且與 轉譯作用(transcription)無直接相關性，由於微小核醣核酸基因的轉譯 後調節(post-transcriptional regulation)中係扮演舉足輕重的角色，因 φ 此在目前為生物醫學相關技術方面，研究人員已經陸續發現微小核醋 核酸和細胞分化、增生、癌化、甚至於病毒感染後在細胞内的調節亦 和微小核醣核酸有關聯性。 隨著微小核醣核酸的生物意義日趨明朗，如何精確地偵測微小核 醣核酸就顯得格外重要，習知偵測微小核醣核酸當屬北方墨點法 (Northern blot)較易進行。主要是因為北方墨點法以凝膠電泳為基礎的 技術對生物研究人員比較沒有儀器或技術方面的技術門檻。然而，由 於在實驗中輻射線的使用具危險性、且不容易自動化及定量精準度等 問題，使得選擇北方墨點法不見得為適當的分析方法。此外，因為不 •同實驗室量化數據之標準化同樣是實驗工作者的一大考量。 近年來，微小核醣核酸相關分析技術以微陣列晶片（microarray)為 主流。微陣列晶片之技術主要優點在於高通量(high-throughput)的特性 -亦即同時對上千種的微小核醣核酸做偵測，然而微陣列晶片的實驗還 是讓熟悉同領域之專業人士存有很多疑慮。 另有一種微小核醣核酸偵測技術，為反轉譯即時定量聚合酶連鎖 反應(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction,

RT_qPCR) ’先削技術已將RT-qPCR為基礎建立一套定量微小核糖核 酸的偵測系統，並有發表於Nucleic Acids Res期刊中。然而，RT-qPCR 201122473 實驗所使用的試劑價格昂貴，導致難以同時對上千種微小核醣核酸作 篩檢，自然也不容易用以檢測臨床上巨量的檢體數。另外，以PCR為 基礎的方法學靈敏度高是因為聚合酶的放大反應所致，可是就統計分 析化學的角度而言，PCR放大的同時，實驗標準偏差亦相對地增加。 因此’設計一個不需酵素放大即可直接精確定量微小核醣核酸的分析 方法是當前所缺少且絕對有必要深入去研發的課題。

在過去二十年間，毛細管電泳(capillary electrophoresic)大幅被廣 泛應用於生物分子的偵測，諸如：蛋白質、胺基酸及去氧核醣核酸 (DNA)，但是將毛細管電泳應用於分析微小核醣核酸的先前技術寥寥 可數，其中如：2003年在Anal Chem期刊，Zhong等人利用毛細管 電泳搭配雷射誘導螢光(capillary electrophoresic with laser induced fluorescence，CE-LIF)的技術直接評估微小核醣核酸在細胞内的表現 量’並且可以區分正常組織及乳癌細胞組織；2004年在Nucleic Acids Res期刊Tian等人也發表了一篇可以同時定量44個基因的論文;2004 年Brain Res Protoc期刊中’ Khan等人則是結合RT-PCR和CE-LIF 一技術將腦中的微小核酿核酸定量；2008年Anal Chem期刊中p.-L Chang等人發表針對偵測鼻咽癌細胞中Epstein-Barr病毒的微小核骑 核酸’提出有關CE-LIF對微小核醣核酸做檢測之技術。 然而若以CE-LIF直接分離探針(22-nt)與微小核醣核酸(22-bp)需 要濃度極高之聚合物緩衝容易才能分離。另一方面，由於勞光探針合 成及純化過程中還是會有不純物存在於探針中，因此導致以之前的方 法進行樣品堆積，在解析度不夠高或不純物的存在下是極度困難的。 而在2007年Maroney等人於RNA期刊中發表針對微小核醣核酸以夹 板式結合反應(splinted ligation)為基礎的偵測方法，但是如一般北方點 墨法-樣’此法還是以放射制為素標定_為主，而且凝膠電泳 不易用來作為定量及高通量的實驗。 有鑑於此，本發明所揭示的同時偵測多種微小核酸之方法， -根毛細管_侧多種的微小猶，並村 201122473 實行。 【發明内容】 ㈣本要目的係、提供""種__多種微小核酸之方法，僅 核酸^，可達職通量之效果，進社幅減转 2之再目祕提供—翻時侧彡麵小猶之方法，精 確地^射核酸的單-驗基差，其特異性可與定序法相辅。精 命ίίί之又—目的係提供-種同時偵測多種微小核酸之方法，不 需經由酵素放大，品質管輸為單純。為達到

多Γ小核酸之方法，首先提供—具有複數個 子之樣本_，第二步驟係將探針、樣本試_及與上述二者互補且 長度不同的橋樑賊混合；接續Κ板接合方式，使混合之受測液 中核酸分？、麟及_賊断贼，並加人接合賴使核酸分子 與探針接合；將加人接麵之受嫩狀—毛崎内，且施加一電壓 給此毛細管’使受測液中的產物產生電泳現象而分離；最後以雷射 誘發不同脑之螢光’朗量其螢光减，以細雌本試劑 的短核酸分子。 底下藉由具體實施例配合所附的圖式詳加說明，當更容易瞭解本 發明之目的、技術内容、特點及其所達成之功效。 ” 【實施方式】 請參照第1圖，係本發明之同時偵測多種微小核酸之方法的步驟 流程圖。如第1 ® S10所示，首先先提供一樣本試劑，此一樣本試劑 具有複數個未放大（unamplified)的短核酸分子（nudejC acid molecules)，其可為核醣核酸(Ribonucleic acid ; RNA)、去氧核骑核 酸(Deoxyribonucleicacid ; DNA)或其混合物，而這些短核酸分子更包 含複數個種微小核醣核酸(microRNA ; miRNA)，且微小核醣核酸的序 列編碼為Epstein-Barrvirus基因體。其中，本發明所有的短核酸分子 201122473 的序列之資訊從Sanger協會資料庫發行之第ή版本取得β 步驟S12係將至少一探針、複數個橋樑核酸、與樣本試劑混合， 請同時參照如第2(a)圖所示。而探針為3,端-螢光標籤與5’端-鱗酸的 聚核苦酸（3 a fluorescence-labeled and 5’a phosphorylation polynucleotide)，亦即探針為合成螢光分子A丨exa jr丨uo# 532)標幟之 單股核酸探針。而橋樑核酸係為多聚dA鹼基之橋樑核酸(p〇|y dA-tailed bridge DNAs)，其為多聚去氧腺苷聚核苷酸（p〇丨y deoxyadenosine polynucleotides)。將探針、橋樑核酸與樣本試劑混 合後形成一受測液，其中橋樑核酸之序列與探針的序列及短核酸分子 之序列一·者之結合序列完整互補。 接續，將受測液接受夾板式結合反應，如步驟S14所示，將探針、 橋樑核酸與樣本試劑的短核酸分子進行雜交。此技術手段為將探針、 微小核醣核酸、以及橋樑核酸溶解於一具有鎂離子的PCR緩衝受測溶 液，以輕輕旋轉的方式攪拌此受測液，將受測液進行一加熱的程序， 先在一理論融溶溫度，使樣本試劑中的短核酸分子與橋樑核酸進行雜 交，然後讓受測液溫度保持在一低於理論融溶溫度之溫度，以使探針 與橋樑核_交。树關所提供完整的加熱的程序為先將受測液加 熱在溫度70°C加熱15分鐘’接著，將溫度降溫在55。〇持續6〇分鐘， 最後將受測液放置在溫度3〇°C維持60分鐘。 接著，立即加入接合酶與10x接合酶緩衝液於受測液中，如 步驟S16所示，其中接合酶係為Τ4去氧核酿核酸接合酶，在16度c 下30分鐘進行接合反應，促使短核酸分子的缺口與探針連接而其 所生成之完全接合產物在代的離心機巾以70%濃度的乙醇清洗，其 中步驟16所生成之產物包含完全接合錄1。、未接合產物12及過剩 的探針與橋娜酸之雜交產物彳4，請同時參鮮2(b)圖麻其中完全 接合產物10係為-短魏分子與—探針缺σ接合，且上述二者與一产 樑核酸雜交之絲，未接合魅彳2 __酸分子擁針缺口未^ 合，其二者分別與橋樑核酸雜交之產物，過剩雜交產物14為過剩的探 201122473 針與橋樑猶之·產物；最後，所有在產細雜τ㈣丨ydne緩 衝♦液，以準備進行下一步驟，其為毛細管電泳搭配雷射誘導勞光 (capillary electrophoresic with laser induced fluorescence > CE-LIF) 的技術，如步驟S18與S20所示。 。而步驟S18實施細節如下所述’將上個步驟處理後的受測液注入 單一毛細管進行產物之電泳分離，在進行樣品注射之前，毛細管壁上 塗佈一層PVP(5% ’水溶液）’如步驟S181所示，其中毛細 溶融石英毛細管，其直徑75μπν長度為50公分(有效長度為43公分)； 聚合物溶液溶解在Tris-Glycine-Acetate緩衝溶液(2XTGA，ρΗ7.0)與 • 7Μ尿素中，注射器將上述的液體填滿毛細管，如步驟3182 ;透過電 動注射(electrokinetic injuction)將受測液之產物注射於單一毛細管 内，如步驟S183所示，並且將毛細管兩端插入含有變性劑(denaturant) 與線性聚合物之缓衝溶液内，其中變性劑作用在於當電泳現象發生 時，變性劑使探針與橋樑核酸之雜交發生變異，但不破壞該接合反應 產物。接續進行步驟S184，施加一電壓至此毛細管，使毛細管產生電 泳現象，在陽極端電動注入（能量10kV)，外界施加分離電場為 200V/cm ’進而引出接合反應產物’如步驟S184所示，持續1〇秒鐘 後’產物受到電泳效應會根據橋樑核酸的多聚dA鹼基的長度分離。 ® 最後’使用雷射誘發受測液中產物之螢光，並量測這些螢光之強 度’如第1圖之步驟S20及第2⑹圖所示’而獲得連續偵測螢光訊號 之光強度的遷徙時間(migration time)函數。本實施例以一高壓能源供 應器執行雷射誘導螢光之實驗，以一波長532nm雷射二極體激發固態 雷射(Nd : YV〇4)激發毛細管中分離後之產物，且整個電泳搭配雷射誘 導螢光實驗是在黑箱中進行，在發射光線到達光電管之前，且Alexa Flour 32當作螢光時，使用0G 550截止濾波器阻擋散射之光線。直 接傳輸放大的電流經過10-kQ電阻至，頻率於10Hz的24位元A/D 介面，其由電腦中 Clarity 軟體(DataApex，Prague，Czech Republic) 控制。而被誘發的螢光先集中至2〇χ物鏡(光圈值為0.25)。因此，透 201122473 過分析這些螢光強度及波長，得知待測的短核酸分子的異直性差異。 本發明使用探針、微小核酸及橋樑核酸皆為美國Integrated DNA Technologies公司購買之客製化合成寡核酸，寡核酸序列請參見表1 所示。 表1 序列 ID 名稱 長度 序列 1 城針 10 TCGGTCAGCA 2 短核酸分子BART9 23 TAACACTTCATGGGTCCCGTAGT 3 短核酸分子BART9-T 22 TAACACTTCATGGGTCCCGTAG 4 短核酸分子BART7 22 CATCATAGTCCAGTGTCCAGGG 5 短核酸分子BART7 RNA 22 CAUCAUAGUCCAGUGUCCAGGG 6 短核酸分子BART18 5p 22 TCAAGTTCGCACTTCCTATACA 7 短核酸分子BART2 5p 22 TAT I I TCrGCATTCGCCCTTGC 8 短核酸分子BART4 22 GACCTGATGCTGCTGGTGTGCT 9 橋樑核酸Bridge-BART7 32 TGCTGACCGACCCTGGACACTGGACTATG ATG 10 橋樑核酸 Bridge-BART9+17A 50 TGCTGACCGAACTACGGGACCCATGAAGT GTTA(17A) 11 橋樑核酸 Bridge-BART7+28A 60 TGCTGACCGACCCTGGACACTGGACTATG AJG(28A) 12 橋樑核酸 Bridge-BART18_5p+38A 70 (19A)TGCTGACCGATGTATAGGAAGTGCG AACTTGA(19A) 13 橋樑核酸 Bridge-BART2_5p+48A 80 (24A)TGCTGACCGAGCAAGGGCGAATGCA GAAAATA(24A) 14 橋樑核酸 Bridge-BART4+58A 90 (29A>TGCTGACCGAAGCACACCAGCAGCA TCAGGTC(29A) 本發明藉由比對最後取得的螢光訊號，來獲得樣本試劑内包含何 種為短核酸分子之資訊。如第3(a)及3(b)圖所示，本發明所偵測出樣 本試劑中具有單一種BART7微小核酸，第3(a)圖内一尖點的訊號為 探針與橋樑核酸雜交產物之螢光訊號；在第3(b)圖中第一個尖點為探 針與橋樑核酸雜交產物的螢光訊號，而第二個尖點顯示受測液中具有 BART7微小核酸與探針、橋樑核酸雜交接合之榮光訊號，因此可知樣 本試劑中内有BART7微小核酸。 請參見第4⑻及4⑼圖所示，本發明偵測出多種微小核酸偵測結 果’第54(a)圖内一尖點的訊號為探針與橋樑核酸雜交產物之螢光訊 號，從第4(b)圖中第一個尖點為探針與橋樑核酸雜交產物的螢光訊 201122473 號’且另外出現 BART9、BART7、BART18-5P、BART2 及 BART4 微小核酸分別與探針、橋樑核酸雜交接合後所產生的螢光訊號，因此 顯不樣本試劑中具有短核酸分子係有BART9、BART7、BART18-5P、 BART2、BART4五種微小核酸。 第5及6圖所示，本發明透過接合反應可辨識出短核酸分子與其 n-1序列之單一核苷酸，在第5圖顯示樣本試劑具有BART9 T cDNA 短核酸分子，糾在帛6时，樣本糊為BART9 gDNA纖酸分子， 其中BART9-T cDNA之序列為BART9 cDNA的n-1序列的核苦酸， 因此利財拥之；5r法村將BART9_T eDNA及BART9 eDNA _

酸分子區別出來。 根據本發騎揭示之同時侧多種微捕酸之方法，分析過程中 以不同長度的橋獅酸先與制核敍探針妨雜交後，並加入接人 酶促使與侧減及探針接合生成接合錄，在毛崎巾以電泳技術 配合雷射誘導螢光之技術來偵_待測核酸，因此_—根毛細管就 可達到多薇小雛_，且_高通量之效果，所以可大幅減少商 業化成本。除此之外，本發明可精確地賴出微小核_單一驗基， 可偵測出微小核酸3，·端核魏短缺或增長之技術，具有高辨識力^優 點’因此本發明不需經由酵素放大，品ff制較為單純，極有潛 展成為微小核酸铺測方法之主流。 以上所述之實施僅係為說明本發明之技術思想及特點，其 在使熟習此項㈣之人士能夠瞭解本發明之内容並據以實施，當炉 以之蚊本_之糊朗，較驗本發騎鮮之精神所作b 等變化或修飾，仍應涵蓋在本發明之專利範圍内。 = 【圖式簡單說明】 第1圖係為本發明之一實施例之步驟流程圖。 第2⑻至2⑹圖係為本發日月之同時偵測多種微小核酸之示音圖。 第3⑻至3_係為侧BART7微小核酸之f光光譜示意肩。 201122473 第4⑻至4(b)圖係為偵測多種微小核酸之螢光光譜示意圖。 第5圖係為偵測BART9-TCDNA微小核酸之螢光光譜示意圖 第6圖係為偵測BART9 cDNA微小核酸之螢光光譜示意圖。 【主要元件符號說明】 10完全接合產物 12無接合產物 14過剩雜交產物

Claims (1)

1. 201122473 七、申請專利範圍： 1·種同時偵測多種微小核酸之方法，包括下列步驟： 提供一樣品試劑，其具有複數個未放大之短核酸分子； 混合該樣品試劑、複數個探針及複數個橋樑核酸，形成一受測液， 其中每該探針係為一螢光標籤的核苷酸（p〇|ynude〇t|.de)，該等 橋標核酸之序列係與該等探針與該等短核酸分子接合之序列完 整互補； 對該樣品試劑、該等探針及該等橋樑核酸進行雜交程序，並加入複 數個接合酶進行接合反應，以形成複數個產物； I 分離該等產物；以及 使用雷射誘發該等產物之螢光，並測量等產物之螢光。 2_如申請專利範圍第1項所述之同時偵測多種微小核酸之方法，其中 對該樣品試劑、該探等針及該等橋樑核酸進行該雜交程序，並加入 該接合酶進行該接合反應，以形成該等產物之步驟，更包括下列步 驟： 加熱該受測液，以使該受測液分離變異；以及 冷卻該受測液，以使該樣本試劑、該等探針及該橋樑核酸再度結 合，並完成該雜交程序。 • 3.如申請專利範圍第2項所述之同時偵測多種微小核酸之方法，其中 該雜交程序之溫度包括在一理論融溶溫度，以使該等短核酸分子與 該橋標核酸雜交。 4. 如申請專利範圍第2項所述之同時偵測多種微小核酸之方法，其中 該雜交程序之溫度包括在低於該理論融溶溫度之溫度，以使該等探 針與該等橋樑核酸雜交。 5. 如申請專利範圍第1項所述之同時偵測多種微小核酸之方法，其中 該等接合酶為T4去氧核醣核酸接合酶，以使該短核酸分子缺口連 接該探針。 6. 如申請專利範圍第5項所述之同時偵測多種微小核酸之方法，其中 201122473 透過該接合反應綱^纽鱗短核酸 列之單一核苷酸〇 分子其中之一與其rvj序 7.如申請專利範圍第1 該等產物包括至少一 與該探針缺口接合，j 物。 1項所述之同時伯測多種微小核酸之方法，其中 •完全接合產物，其為料短核酸分子其中之一 且上述二者與該等橋樑核酸其中之一雜交之產 8.如申請專利範圍第】 分離該等產物之步驟，更包括： 項所述之同時偵測多種微小核酸之方法，其中 將該等產物注射入-毛細管，該毛細管係置放於一緩衝溶液内； 施加一電駐該毛細管，使該毛細管產生·現象； ’ 維持該電麼一預定時間；以及 根據該等橋樑滅之驗基的長度，分軸該等產物。 9. 如申請專利範圍第8項所述之同時伯測多種微小核酸之方法，其中 δ亥緩衝溶液係包含一變性劑（扣的山阳咁）。 10. 如申請專利範圍第9項所述之同時伽多種微小核酸之方法，其中 在該電泳現象時，該變性劑使該等探針與該等橋樑核酸之雜交發生 變異’但不破壞該接合反應產物。 11. 如申請專利細^ 1項所述之同時_多繼小減之方法，其中 該等短核酸分子係選自複數個微小核醣核酸。 12. 如申請專利範圍第11項所述之同時偵測多種微小核酸之方法，其 中該專微小核酶核酸之序列係編碼為Epstein-Barrvirus基因體。 13. 如申請專利範圍第1項所述之同時偵測多種微小核酸之方法，其中 該探針係為長度10的核苷酸去氧核醣核酸(序列編號1)，其序列為 TCGGTCAGCA。 14. 如申請專利範圍第1項所述之同時偵測多種微小核酸之方法，其中 該等短核酸分子係為長度22或23之核苷酸去氧核醣核酸(序列編 號 2 至 8) ’ 例如：BART9、BART9-T、BART7、BART7 RNA、 BART18_5p、BART2_5p 及 BART4。 12 201122473 15. ^申請專利範圍第1項所述之同時偵測多種微小核酸之方法，其中 母該螢光之光強度係連續憤測而作為遷徙時間（mjgratjori time) 的函數。 16. 如申請專利範圍第1項所述之同時偵測多種微小核酸之方法，其中 該等橋樑核酸係不同種類的多聚dA鹼基之橋樑去氧核醣核酸 (poly dA-tailed bridge DNAs)。 17. 如申請專利範圍第16項所述之同時偵測多種微小核酸之方法，其 中每該橋樑核酸之長度與每該多聚dA鹼基的長度有關》 、 18·如申請專利範圍第1項所述之同時偵測多種微小核酸之方法，其中 φ 該等橋樑核酸係為具有不同長度的多聚去氧腺苷聚核努酸(P〇|y deoxyadenosine polynucleotides)» 19.如申請專利範圍第1項所述之同時偵測多種微小核酸之方法，其中 該等橋標核酸係為序列編號9-14之核酸分子，例如·· Bridge-BART7、Bridge-BART9+17A、Bridge-BART18_5p+38A、 Bridge-BART2_5p+48A、Bridge-BART4+58A。 13