201111502 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 [0001] 本發明涉及細胞生物學領域，更具體地說，涉及一種從 人或動物胚胎提取間質性幹細胞及提取其分泌物的方法 〇 [先前技術] [0002] 間質性幹細胞（Mesenchymal stem ce 11 s，MSC )是 一類具有多分化潛能及自我更新能力的組織幹細胞，可 以分化為多種組織細胞：成骨、軟骨、脂肪、神經細胞 〇 等。其最早自骨髓中分離出來，近年已有具有幹/祖細胞 特徵的間質性細胞自骨髄、外周血、密質骨、軟骨、肌 肉等組織分離出來。這些組織的共同特點是由來源於胚 外中胚層的間充質和血管共同構成。間質性幹細胞易於 ...... 1 從骨髓中分離純化，進行有效的體外擴增，具有改善骨 v 髓環境、促進造血重建的作用。在免疫特性方面，間質 性幹細胞不表達或僅表達可忽略水準的MHCII類分子，不 相關供者的間質性幹細胞不引起異體淋巴細胞反應，能 ，
U 下調異體免疫反應。由於具有上述特性，MSC自發現後即 迅速成為細胞治療、基因治療等方面的理想工程細胞， 以及組織工程尤其是骨或軟骨組織損傷修復中重要的種 子細胞。 [0003] 目前報導的間質性幹細胞主要來源於骨髓，採用密度梯 度分離法獲得。供者取髓需要經歷一個比較痛苦的手術 ，而在取材過程中及取材後會有很高的感染幾率；另外 ，由於人體骨髓中間質性幹細胞的含量極其稀少，每 098131724 表單編號A0101 第4頁/共39頁 0982054463-0 201111502 [0004] ❹ [0005] Ο [0006] 105〜106個單個核 —胞中大約只有1個間質性幹細胞，且 隨著年齡的增加，戍人 4σ併4染、腫瘤等疾病，骨髓中間 質性幹細胞的數量 乂及增殖分化能力均顯著下降，使其 在研究和應用尤其县 、疋κ»床應用中受到很大限制。 現有技術中分離間質性幹細胞的常用方法，包括以下步 驟.（1)胎盤從子玄 呂規出後立即放血，得到樣品；（2 )採用持續灌注的方 式’或採用膠原酶消化法，獲得單 細胞懸液；（3) 队 、 平細胞懸液經密度梯度離心法或免疫磁 珠刀 €得間質性幹細胞。該現有技術產出率較低 ，無法快速得到大“_性幹細胞 ，而且純度較低； 此1卜’處理過料細胞，傷程度㈣嚴4，難以保證 間貝性幹細胞的品暂.p 貝’巧外，由於產出率較低，也難以 提取出具有良好應用前景的分泌物。 因此需要一種新的從 攸人或動物胚胎提取間質性幹細胞方 法，能夠迅逮得到女县& J Α重的、高純度且高品質的間質性幹 細胞，還能實現其擴展應用。 【發明内容】 本發明的目的之一在於提供一種從人或動物胚胎提取間 質性幹細胞方法並提取其分泌物的方法，旨在解決現有 技術中存在的產出率、純度較低，且難以保證細胞質量 的問題。 [0007] 098131724 為了實現發明目的，所述從人或動物胚胎提取間質性幹 細胞的方法包括以下步驟：A.基於人或動物胚胎取樣’ 對樣品進行離心處理；B.利用酶類消化液對樣品進行消 化，並製成單細胞懸液，其中所述酶類消化液包括胰酶- 表單編號A0101 第5頁/共39頁 098 201111502 EDTA和IV型膠原酶；C.在分離的單細胞中加入間質性幹 細胞A型培養液，進行細胞接種並培養；D.對細胞進行貼 壁純化處理，並通過磁珠分選得到間質性幹細胞。 [0008] 優選地，所述步驟B中的酶類消化液包括：胰蛋白酶 0. 125g/L〜0.375g/L ; EDTA 0. 075g/L~0.125g/L和IV 膠原酶0. 25g//L〜0. 75 g//L。 [0009] 所述步驟B中的酶類消化液的製備包括：將1 00m 1含 0. 05g胰蛋白酶和0. 02gEDTA · 4Na的D-HBSS與lOOmml 含0. OlglV膠原酶的生理鹽水按照1 : 1的體積比混合。 [0010] 優選地，所述間質性幹細胞A型培養液包括： 驗性成纖維細胞生長因數 1 ng/ml~100 ng/ml基質 表皮生長因數 1 ng/ml〜100 ng/ml基 質 全小板衍生生長因數 1 ng/ml~100 ng/ml基質 其中，所述基質包括下列重量份數的成份： 68%〜97% 1°/〇~30°/〇 1% 1% 0~0. 1 % ° DMEM培養基 腾帶血血聚 抗生素和穀氨醯胺 非必須氨基酸 抗氧化劑 [0011] 優選地，所述步驟D中的貼壁純化處理包括：用移液管將 未貼壁的細胞吸出，加入生理鹽水清洗並換上新的間質 性幹細胞A型培養液繼續培養，待貼壁細胞擴增到培養瓶 的設定容積時用胰酶-EDTA消化，獲得單細胞懸液。 0982054463-0 098131724 表單編號A0101 第6頁/共39頁 201111502 [0012] [0013] [0014]Ο [0015] [0016] Ο [0017] 地’所述步驟D中的磁珠分選包括：採用免疫磁珠分 離法 % ’從所述單細胞中篩選出CD271和CD73雙陽性的細 胞群’即從胚胎分離出的間質性幹細胞。 ’所述步驟D之後還包括：E.將所得的間質性幹細 胞進行增殖和傳代 ;和/或F.提取出間質性幹細胞的分泌 物。 優選地，所述步驟F包括： F1•利用酶類消化液對間質性幹細胞進行消化處理； F2.在枚集的細胞中加八培養基進行接種培養，並加入間 胃&幹細胞B型培養液促進細胞產生分泌因子； F 3 " ’對收集到的培養液離心過濾，得到分泌物。 優選地’所述間質性幹細胞B型培養液中包括鹼性成纖維 細胞生長因數和血小板射生長因數。 本發明的目的之二在於提供一種提取間質性幹細胞的分 必物的方法’所述方法包括以下士驟： A, j j" I •利用酶類消化液對間質性幹細胞進行消化處理； B •在收集的單細胞中加入培養基進行接種培養，並加 入間質性幹細胞8型培養液促進細胞產生分秘因子； 收集到的培養液離心過遽，得到分泌物。 優選地’所述步驟A’進-步包括 A h 利用 1〇〇mL含〇. 〇5g胰蛋白酶和〇. 〇2gEDTA · 4Na 的消化液對間質性幹細胞進行消化處理； Α 2·當間質性幹細胞變圓脫落時，用含有牛血清的丨64〇 培養液終止消化β 098131724 表單編號Α0101 第7頁/共39頁 0982054463-0 201111502 [0018] 優選地，所述間質性幹細胞B型培養液包括： 驗性成纖維細胞生長因數 1 ng/ml~100 ng/ml基質 血小板衍生生長因數 1 ng/ml~100 ng/ml基質 其中，所述基質由下列重量份數的原料配製成： DMEM培養基 96.9% 丙酮酸鈉 1% [0019] 抗生素和穀氨醯胺 1% 非必須氨基酸 1% 抗氧化劑 0.1% 優選地，所述步驟B’中加入間質性幹細胞B型培養液促 進細胞產生分泌因子的步驟包括：當培養瓶中的細胞層 擴增至設定容積時，吸出培養液並用磷酸鹽緩衝液清洗 ;然後加入間質性幹細胞B型培養液，刺激間質性幹細胞 產生分泌因子。
[0020] 優選地，所述步驟B’中加入培養基進行接種培養的步驟 包括： 在分離的單細胞中加入間質性幹細胞培養基，搖勻並調 整到5〜8x104個細胞/ml的細胞密度； 將調整後的細胞溶液接種到多個培養瓶中，置於 5〜10%C02、37°C、飽和濕度的培養箱中培養。
[0021] 本發明的目的之三在於提供根據本發明的上述提取間質 性幹細胞的分泌物的方法所產生的分泌物。 本發明的目的之四在於提供根據本發明的上述提取間質 性幹細胞的分泌物的方法所產生的分泌物在人體美容方 098131724 表單編號A0101 第8頁/共39頁 0982054463-0 [0022] 201111502 [0023] [0024] θ [0025] [0026] 〇 面的應用。 本發明的目的之五在於提供根據本發明的上述提取間質 性幹細胞的分泌物的方法所產生的分泌物在保健品方面 的應用。 本發明的目的之六在於提供一種表皮細胞修復液，包括 下列重量份數的成份·· 溶劑 50〜94% 防腐劑 0〜0.5% 保濕劑 . 0-3% 分泌物 0. 5-25% 膠原蛋白 5〜25%*。 優選地，所述防腐劑包括：咪唑烷基脲、輕苯丙酯和/或 羥苯甲酯；所述保濕劑包括丙三醇和/或透明質酸。 由上可知，本發明從人或動物胚胎提取間質性幹細胞的 過程中，採用混合的酶類讀化液作為消化液，能夠獲得 更多的單細胞，同時將細胞受損程度降至最低；另外通 過貼壁純化和免疫磁珠分離篩選出的間質性幹細胞，提 高了純度。另外，在分離的單細胞中加入間質性幹細胞A 型培養液，進行細胞接種並培養，從而促進了細胞的生 長和增殖。再者’在間質性幹細胞培養的過程中加入間 質性幹細胞B型培養液，能刺激間質性幹細胞產生更多的 分泌因子，因此，從間質性幹細胞中提取出其分泌物含 有更多的細胞分泌因子。 【實施方式】 098131724 表單編號A0101 第9頁/共39頁 0982054463-0 201111502 [0027]為了使本發明的目的、枯併古安s值 、^ 技術方案及優點更加清楚明白， 以下結合_及實施例，對本發明進行進—步詳細說明 …田理解，此處所知述的具體實施例僅僅用以解釋本 發明’並不用於限定本發明。 丁出了本發明的-個實施例中人或動物提取間質性幹 細胞的方法流程圖；包括如下步驟：在步驟sm中基 於人或動物胚胎取樣，對樣品進行離心處理。在步驛 別2中，湘酶類消化液對樣品進行消化，並製成單細 胞懸液。在步驟S103中，在分離的單細胞中加入間質性 幹細胞A型培養液，進行細胞接種並培養。在步驟§ι 中 ，對細胞進行貼壁純化處理，並通過磁珠分選得到間質 性幹細胞。 、 [0029]在本發明的一個優選實施例中，所述步驟sl〇2進—步包 括： 1、在離心後’吸棄上清液。將〇. 375g胰蛋白酶、 〇.125g EDTA和0.25gIV膠原酶溶解到1L生理鹽水中， 配置成本發明的酶類消化液。然後將配置好的酶類消化 液加入30ml到離心管中於37。〇恒溫水浴搖床中消化 1，5〜2h，獲得的原代細胞貼壁生長情況如圖2所示。在本 發明的另一實施例中，可以先將〇. 375g胰蛋白酶、 〇.125g EDTA溶解到500ml的D-HBSS中，然後再將 〇. 25gIV膠原酶溶解到500ml生理鹽水中，然後將500ml 的D-HBSS和500ml生理鹽水混合，製備成1L本發明的酶 類消化液。在本發明的其他實施例中，本領域技術人員 也可採用其他方法、或緩衝液來配置本發明的酶類消化 098131724 表單編號A0101 第10頁/共39頁 0 201111502 液0 [0031] [0032] Ο [0033]❹ 2、在消化完畢後的溶液中加入3~5倍體積的生理鹽水稀 釋’振盪均句，並用電動移液搶吸取過1〇〇以贝細胞篩網 ，從而製成單細胞懸液。 在本發明的另一實施例中，可將1〇〇1111含〇.()52胰蛋白酶 和0. 02gEDTA · 4Na的D-HBSS與 100_1 含0. OlglV膠原 酶的生理鹽水等體積混合，配置本發明的酶類消*化液。 然後，加入30ml配置好的酶類消化液到離心管中於37t 恒溫水浴搖床中消化1. 5〜2h，獲得的原代細胞貼壁生長 情況如圖3所示。在本發明的其他實施例中，也可採用如 PBS來代替生理鹽水。在本發明的優選實施例中，可將 GIBC0公司生產的胰酶-EDTA ( 〇. 〇5% )與膠原酶消化液 (lmglV膠原酶/ml生理鹽水）按照體積比1 : 1混合來製 備。 在本發明的再一實施例中，可膊0. I25g胰蛋白酶、 0· 075g EDTA和0. 75gIV膠原酶溶解到500ml生理鹽水和 500mlD-HBSS的混合液中，配置成本發明的酶類消化液 。然後將配置好的酶類消化液加入30ml到離心管中於37 °C恒溫水浴搖床中消化1. 5〜2h，獲得的原代細胞貼壁生 長情況如圖4所示。 [0034] 在本發明的其他實施例中，還可按照其他配比、緩衝液 或方法來配置本發明的酶類消化液。例如，將〇. 2g胰蛋 白酶、0. 05g EDTA · 4Na溶解到5〇〇mlD-HBSS中，同時 將0.5gIV膠原酶溶解到500ml生理鹽水或pbs中，然後將 098131724 表單編號A0101 第11頁/共39頁 0982054463-0 201111502 製備成1L本發 500ml的D-HBSS和500ml生理鹽水混合， 明的酶類消化液。 [0035] [0036] [0037] 經反復實驗表明，將GIBCO公司生產的陆 DTΛ (Ο πr % )與膠原酶消化液（lmglV膠原酶. 積混合，消化時間（ l.5~2h)，能使酶理鹽水）等體 傷程度降至最低，同時又能獲得最多 跑的’肖化知 ^ I細胞，因此在 消北過程中掌握好兩種酶的配置和消彳卜分 間對成功的從 人胎盤中分離間質性幹細胞至關重要。 在本發明的一個優選實施例中，所述間 養液包括基質、驗性成纖維細胞生長因數^胞儿型*° 數和血小板衍生生長因數。基質中餘^皮生長因 ^ ^^ ^ , 成纖維細胞生長 因數的/辰度為1 ng /ml、表皮生長因數· ml、血小板衍生生長因數的濃度為 讀為1 ng/ ug/ml。力姑杏# 例中，基質中含97%重量分數的DMEM蝽養義，:貝 數的臍帶血4漿’ 1%4量分數的青、土 1/0重量刀 醯胺溶液’ 1%重量分數的非必須氨錢（^素穀乱 essential amin〇 acids)。採用上
^ ^ ^間質性幹細胞A 么培養液進仃細胞接種並培養，獲得 如圖5所示。 胞貼壁生長情況 在本發明中’除特別說明外，上述間 液和上述間質性幹細胞B型培養 、，胞A型培養 講自美國GIBC0公司。 土質中的各個組分均 在本發明的另-個優選實施例中，所述 與卷滿白杯冀陆 質陵幹細胞A型 培養液包括基質、鹼性成纖維細胞生長因數 '表皮生長 098131724 表單編號A0101 第12頁/共39頁 0982054463-0 [0038] 201111502 ❹ [0039] 因數和血枝衍生生長隨。基質中雜成纖維細胞生 長因數的濃度為25 ng /mi、表皮生長因數的濃声為 25ng/mi、血小板衍生生長因數的濃度為巧 該實施例中’基質中含77. 9%重量分數的在 2〇%重量分數的臍帶金也聚，1%重量分數的青衡幸二鍵 黴素一榖氨醯胺溶液，1%重量分數的非必須氨旯酸— 重量分數的厂祕乙醇。採用上述間f ,^·細戲 型培養液進行細胞接種並培養，獲得細胞貼壁生产、 如圖6所示。 在本發明的另-個優選實施例中，所述間質性幹細胞A型 培養液包括基寶、鹼性成纖維細胞生長因數、表皮生長 因數和血核衍生生長因數4質中驗性錢維細= 長因數的濃度為100 ng /ml、表皮生長因數的濃度為 100 ng/ml、血小板衍生生長因數的濃度為1〇〇叫 。在該實施例中’基質中含67. 9%重量分數的咖培養 基’ 20%重量分數的臍帶灰血衆’ 1%重量分數的青徽素 G 一鏈黴素_穀氨醯胺溶液，1%重量分數的非必須氨基酸 ’ 0. 1%重量分數的石-疏基乙醇。採用上述間質性幹細 胞A型培養液進行細胞接種並培養，獲得細胞貼壁生長情 況如圖7所示。 [0040] 圖8是採用現有技術的培養液進行細胞接種並培養，獲得 細胞貼壁生長情況示意圖。從圖5~8示出的細胞貼壁生長 情況對比可以看出，當採用了間質性幹細胞A型培養液進 行培養以後，明顯促進了細胞的生長。 [0041] 098131724 圖9是本發明的一個實施例的從人或動物胚胎提取間質性 表單編號A0101 第13頁/共39頁 〇98< 098131724 表單編號A0101 201111502 幹細胞的方法流程圖。如圖9所示，在步驟S901中，基於 動物胎盤和/或臍帶取樣，對樣品進行離心處理。在本發 明的一個實施例中，所述步驟具體實現過程是： [0042] 1、將新鮮的胎盤用剪刀去掉外面的膜，取内部暗紅的組 織塊，最好取血管密集部位的組織，此處血管交織如樹 根狀，用生理鹽水（加肝素，500ml鹽水加2支肝素， 1 2500 IU/支，終濃度為：50單位肝素/ml生理鹽水）洗 淨組織中的血液，用不含肝素的生理鹽水洗一遍，然後 用剪刀將組織塊剪碎（越碎越好）。對臍帶的處理方式 是：將臍帶剪成約2cm每段，用含肝素的鹽水洗淨血液， 縱向剪破，洗淨内部的血液，再用不含肝素的生理鹽水 洗一次，用剪刀將臍帶剪碎。當然，本發明並不限定於 上述方式，也可選取胚胎的其他部分作為本發明的原料 〇 [0043] 2、將樣品轉入裝有生理鹽水的離心管中，進行離心處理 。在一個優選實施例中，將收集到的樣品置入裝有生理 鹽水的50ml離心管中，1200 r.pm、lOmin離心。 [0044] 在步驟S 9 0 2中，利用酶類消化液對樣品進行消化，並製 成單細胞懸液。在本發明的一個實施例中，所述步驟具 體實現過程是：1、離心後，吸棄上清液，按體積比1 : 1 混合胰酶-EDT A (0.05%)和IV型膠原酶（1 mg/ml)， 加入30ml到離心管中於37°C恒溫水浴搖床中消化1. 5~2h 。當然，在消化處理的步驟中還可以採用其他的配備方 案，具體可參見前文所述；2、在消化完畢後的溶液中加 入3〜5倍生理鹽水稀釋，振盪均勻，並用電動移液槍吸取 098131724 表單編號A0101 第14頁/共39頁 0982054463-0 201111502 [0045] Ο [0046] [0047] [0048] [0049] ❹ [0050] 098131724 過100心細胞篩網，從而製成單細胞懸液。 在步驟S903中，通過單細胞懸液得到分離的單細胞，並 在分離的單細胞中加人„性幹細齡型培養液進行細 胞接種並鱗。在本發實施财，所述步驟具 體實現過程是： 1、 單細胞懸液經1 600聊、1〇_離心後去上清； 2、 加入間質性幹細胞A型培養 1η/ίΛπ 货成，搖勻並調整到5〜8χ 〇 4個細胞/ m 1的細胞密度； =將調整後的溶液接種於多孔板（如6孔板）中置於 %C02、37C、飽和濕度的培養箱 、 „ 相f培養。當然，本發明 竹板取其他㈣料配置，上述外財式並不用以限 疋本發明的保護範圍。其中所述間f < 可選用上述實施例中的任意—種。' &胞㈣培養液 在步驟S9G4中，對細胞進行貼壁从處理 分選得到間質性幹細胞。在本發_ 並通過磁珠 、+-止 Θ的·'個實施例中，所 迷步驟具體實現過程是： 1、貼壁純化處理，具體包括： 用移液管將未貼壁的細胞吸出，加 , 生理鹽水清洗並換 上新的間質性幹細胞A型培養液繼續 $增養，待貼壁細胞擴 曰到培養瓶容積的70%時用胰酶-edta ^ 從, UU (0.05%)消化， 獲得單細胞。 在本發明中’通過胰酶-EDTA (〇. 〇5〇/、Α Λ υί)%)來消化後獲得 的單細胞懸液通過普通離心（ 1600r/inin)獲得的單細 表單編號A0101 第15頁/共39頁 0982054463-0 [0051] 201111502 胞，在這種單細胞群體裏面含有多種不同生物學特性的 細胞，也混雜一些死細胞。然後用培養間質性幹細胞的 培養液進行篩選，能存活並能貼壁生長的細胞大部分是 間質性幹細胞，通過貼壁純化可以去掉大量非間質性幹 細胞。 [0052] 2、磁珠分選，具體包括： [0053] 採用免疫磁珠分離法，從所述單細胞中篩選出CD271和 CD73雙陽性的細胞群，即從胎盤分離出的間質性幹細胞 。磁珠分選可在最短時間内獲得大量活的、高純度的間 質性幹細胞。 [0054] 在步驟S905中，將所得的間質性幹細胞進行增殖和傳代 ，其具體實現過程是： [0055] 1、用移液槍吸去瓶内的培養基。 2、 加入少量磷酸鹽緩衝液輕輕洗一遍，吸棄，從而平衡 PH值。 3、 加入胰酶-EDTA(0.05%)，.酶液沒過瓶底即可，在 1| 顯微鏡下觀察，至大部分細胞變圓脫落即可用含有胎牛 血清的1 6 4 0培養液終止消化。 4、 用移液搶吸取瓶内培養液反復吹打細胞層，收集細胞 懸液至一個5 0 m 1離心管，再用P B S洗培養瓶一次。5、經 1 200rpm、8min離心細胞懸液，去上清，加入間質性幹 細胞A型培養液，打勻細胞，按1 : η的比例進行傳代擴瓶 。從而獲得大量的胎盤間質性幹細胞。其中η > 1，例如η 典型的可取值為4。 098131724 表單編號Α0101 第16頁/共39頁 0982054463-0 201111502 [0056] 圖10是本發明其中一個實施例中間質性幹細胞表面蛋白 表達鑒定的示意圖。本發明用流式細胞儀檢測胎盤間質 性幹細胞表明細胞因數的表達，可見分離培養的胎盤間 質性幹細胞表達CD9、CD29、CD105、CD166表面蛋白， 不表達CD34、CD13、CD14、CD45表面蛋白，這群細胞 生物特性穩定，擴增一代和兩代後的細胞同質性分別達 到95%和98%。在該圖中，空心的淺色曲線是代表一種 細胞因數表達的陰性對照，實心黑顏色圖案表示細胞群 體中表達相應細胞因數陽性率的高低。如果實心黑顏色 〇 圖案離空心的淺色曲線越遠，這種細胞因數的陽性率就 越高。 [0057] 圖11是本發明其中一個實施例中細胞化學方法誘導胎盤 間質性幹細胞分化為脂肪、軟骨及成骨細胞的示意圖。 胎盤間質性幹細胞 （PDMSC)連續傳代培養和冷凍保存 後仍能具有多向分化潛能，而且保持正常的核型核端粒 • ί. I i 酶活性，但不易自發分化，在體外特定的誘導條件下， q PDMSC可以分化為骨、軟骨、脂肪、肌腱、肌肉、神經等 多種細胞。其中：圖Α顯示在加入成脂誘導劑後，會導致 胎盤間質性幹細胞分化為脂肪細胞且油紅染色為陽性， 漿内可見橙紅色脂滴。圖B顯示加入成骨誘導劑後，胎盤 間質性幹細胞分化為成骨細胞，Von Kossa進行成骨細 胞鑒定。Von Kossa染色可見細胞深棕色，間佈滿黑色顆 粒，提示有礦化基質沉積。圖C顯示加入軟骨誘導劑對細 胞進行誘導，用阿爾新藍染色顯示有蛋白多糖表達。圖D 免疫組化方法檢測顯示誘導分化後表達軟骨細胞特有膠 098131724 表單編號A0101 第17頁/共39頁 0982054463-0 201111502 原蛋白ιι—軟骨細胞。 [0058] 需要進行擴充說明的是，胎盤間質性幹細胞作為人類胚 胎幹細胞（hESC)和老鼠胚胎幹細胞（mESC)滋養層的應用 。胎盤間質性幹細胞（PDMSC)作為細胞滋養層為人類胚 胎幹細胞（hESC)和老鼠胚胎幹細胞（mESC)提供生長支援 ，並保持胚胎幹細胞處於未分化狀態。目前使用小鼠的 胚胎纖維原細胞（MEF)作為人類胚胎幹細胞（hESC)和老 鼠胚胎幹細胞（mESC)的滋養層。但是，使用小鼠的胚胎 纖維原細胞（MEF)作為幹細胞的生長滋養層受到諸多限制 :1.存在動物源性污染的風險；2.提取大量小鼠的胚胎 纖維原細胞（MEF)需要殺死許多小鼠。使用健康人來源的 胎盤間質性幹細胞（PDMSC)作為胚胎幹細胞的滋養層有 獨特的優勢：1.避免犧牲很多小鼠，取材於丟棄的健康 人來源的胎盤組織；2.避免了動物源性污染的風險；3. 使用人體的胎盤間質性幹細胞（PDMSC)作為人體胚胎幹 細胞的滋養層對培養人體胚胎幹細胞更有利。因此，作 為人類胚胎幹細胞（hESC)滋養層的來源，PDMSC是比小 鼠的胚胎纖維原細胞（MEF)更理想的選擇。 [0059] 圖12是本發明其中一個實施例中提取間質性幹細胞的分 泌物的方法流程圖。在步驟S1 201中，利用酶類消化液對 間質性幹細胞進行消化處理，其具體過程包括：1、細胞 大量擴增後，在175cm2培養瓶中長到80%左右時，加入 胰酶-EDTA (0. 05%)進行消化處理。2、當所述間質性 幹細胞變圓脫落時，用含有牛血清的1640培養液終止消 化° 098131724 表單編號A0101 第18頁/共39頁 0982054463-0 201111502 [0060] 在步驟S1 202中，在收集的細胞中加入培養基進行接種培 養，並加入間質性幹細胞Β型培養液促進細胞產生更多的 分泌因子，其具體過程包括： [0061] Ο [0062] 1、 在收集的細胞中加入培養基進行接種培養。在一個優 選實施例中，上述步驟的具體過程是··在收集的細胞中 加入間質性幹細胞培養基，搖勻並調整到5~8χ 104個細胞 /ml的細胞密度；將調整後的溶液接種到培養瓶中，置於 5%C02、37°C、飽和濕度的培養箱中培養。在本發明的其 他實施例中，也可按照需要調節5%C02的濃度，比如10% ，8%，6% 等等。 2、 加入間質性幹細胞B型培養液促進細胞產生更多的分 泌因子。在一個優選實施例中，上述步驟的具體過程是 :當培養瓶中的細胞層擴增至80%時，吸出培養液並用磷 酸鹽緩衝液清洗。 [0063] Ο 在本發明的第一優選實施例中，所述間質性幹細胞B型培 養液包括基質、驗性成纖維細胞生長因數和血小板衍生 生長因數。基質中鹼性成纖維細胞生長因數的濃度為1 ng /ml、血小板衍生生長因數的濃度為1 ng/ml。在該 實施例中，基質中含96. 8%重量分數的DMEM培養基，1 %重量分數的青黴素一鏈黴素一榖氨醯胺溶液，1%重量 分數的非必須氨基酸，0. 1%重量分數的万-毓基乙醇和1 %重量分數的丙酮酸鈉。 在本發明的第二優選實施例中，所述間質性幹細胞B型培 養液包括基質、驗性成纖維細胞生長因數和血小板衍生 098131724 表單編號A0101 第19頁/共39頁 0982054463-0 [0064] 201111502 生長因數。基質中鹼性成纖維細胞生長因數的濃度為25 ng /ml、血小板衍生生長因數的濃度為25 ng/ml。在該 實施例中，基質中含96. 8%重量分數的DMEM培養基，1 %重量分數的青黴素一鏈黴素一穀氨醯胺溶液，1%重量 分數的非必須氨基酸，0. 1%重量分數的;锍基乙醇和1 %重量分數的丙酮酸鈉。 [0065] 在本發明的第三優選實施例中，所述間質性幹細胞B型培 養液包括基質、驗性成纖維細胞生長因數和血小板衍生 生長因數。基質中含鹼性成纖維細胞生長因數的濃度為 100 ng /ml、血小板衍生生長因數的濃度為100 ng/ml 。在該實施例中，基質中含96. 8%重量分數的DMEM培養 基，1%重量分數的青黴素一鏈黴素一榖氨醯胺溶液，1 %重量分數的非必須氨基酸，0. 1%重量分數的/5-巯基 乙醇和1%重量分數的丙酮酸鈉。 [0066] 在步驟S1203中，對收集到的培養液離心過濾，得到分泌 物。上述步驟的具體過程是：1、收集培養液，經2000 rpm、8mi η離心後收集上清液。在一個優選實施例中，上 述步驟的具體過程是：培養3天后收集培養液。經2000G 、8miη離心收穫液，去除細胞碎片，並收集上清液。2、 用0. 22um的篩檢程式過濾，得到分泌物。在一個優選實 施例中，上述步驟的具體過程是：用0. 22u的篩檢程式過 濾，過濾液收集在-20°C的條件下儲存2天，然後放到-80 °C的條件下長期保存備用。 [0067] 在本發明優選實施例中，所述提取間質性幹細胞的分泌 物的方法進一步包括對所述分泌物進行濃縮。在一個實 098131724 表單編號A0101 第20頁/共39頁 0982054463-0 201111502 施例中，濃縮步驟的具體執行過程包括首先準備超濾膜 :先用75%酒精沖洗超濾膜並浸泡lOmin ;用鑷子夾住膜 片邊緣，拿注射用水沖洗3遍，再放入乾淨容器盛裝的注 射用水中浸泡過夜備用。 [0068] 1、將收穫液加入超遽杯至工作體積，完成裝配。在一個 優選實施例中，上述步驟的具體過程是：按超濾杯說明 書裝好膜片、杯體、攪拌系統，加入收穫液至工作體積 ，再裝上杯蓋、保護套。 0 [0069] 2、接入氮氣進行過濾，並收集過濾後的濃縮液。在一個 優選實施例中，上述步驟的具體過程是：接上氮氣開始 過濾，要注意的是在過濾開始時應緩慢地加壓，有壓力 後再打開磁力攪拌器；過濾中氮氣壓力不能超過55PSI ; 過濾結束後應緩慢降壓。最後，當超濾杯中的收穫液濃 縮至25倍時停止濃縮，在超淨台中收集濃縮液，儲存到-80°C冰箱備用。 [0070] 〇 當未採用間質性幹細胞B型培養液時，濃縮後的分泌物中 含蛋白濃度為0. 2rag/ml。當採用上述第一實施的間質性 幹細胞B型培養液時，濃縮後的分泌物中含蛋白濃度為 0.3mg/ml ;當採用上述第二實施的間質性幹細胞B型培 養液時，濃縮後的分泌物中含蛋白濃度為1. 5mg/ml ;當 採用上述第三實施的間質性幹細胞B型培養液時，濃縮後 的分泌物中含蛋白濃度為2mg/ml。 [0071] 圖13是本發明其中一個實施例中鑒定間質性幹細胞的分 泌因子的示意圖。胎盤間質性幹細胞分泌因子產物中含 098131724 表單編號A0101 第21頁/共39頁 0982054463-0 201111502 有大量的蛋白分子。在胎盤間質性幹細胞培養增殖過程 中，胎盤間質性幹細胞會分泌出許多生長因數、蛋白質 、活性多肽等促進細胞生長、組織再生的物質。在該附 圖中，通過銀染顯示胎盤間質性幹細胞分泌的細胞因數 與對照組有顯著的差異，胎盤間質性幹細胞分泌物中含 有大量的特有的蛋白分子。 [0072] 圖14是本發明其中一個實施例中經檢測發現間質性幹細 胞的分泌物中含有大量的細胞生長因數群和膠原蛋白分 子群。利用細胞活素抗體陣列對胎盤間質性幹細胞分泌 因子蛋白質組進行了測評。發現了大量胎盤間質幹性細 胞分泌獨特的基因產物.這些基因產物中含有大量與細胞 生長和代謝相關的生長因數群，例如：BDNF、EGF、FGF 、FGF17、FGF4、FGF6、FGF7、FGF9、GDNF、HGF、 IGFBp 、 PDGFB 、 PIGF 、 TGFB1 、 TGFb2 、 TNFRSF11B ' VEGF、IGF1和LEP等；以及大量的膠原蛋白分子群，例 如：COL11A1 、 COL12A1 、 COL16A1 、 COL1A 、 COL3A1 、（:0L4A1、COL5A和COL6A等。這些蛋白分子群對促進 細胞的生長和代謝具有重要的作用。在該圖中，經檢測 發現胎盤間質性幹細胞分泌物中含有大量的細胞生長因 數群和膠原蛋白分子群，如圖中箭頭所指示。 [0073] 在此需要說明間質性幹細胞的分泌物的功能，主要闡述 其在以下幾個方面的作用：表皮修復、人體美容、再生 醫學、保健品。 [0074] 本發明還提供了一種表皮細胞修復液，包括下列重量份 數的成份：水71 %，防腐劑0. 5 %，保濕劑3 %，分泌物 098131724 表單編號A0101 .第22頁/共39頁 201111502 [0075] ^ 5’5%，膠原蛋白20%。其中，防腐劑可包括咪嗤烧基脲 0.15%，羥苯丙酯0.2%和羥苯甲酯0·15%，保濕劑包 括丙三醇2%和透明質酸1%。其中分泌物可通過前述方 法來獲得。 在本發明的另一實施例中，該表皮細胞修復液，包括下 列重量份數的成份：水—，保濕劑〇. 5%，分泌物〇. 5% ，膠原蛋白5%。其中，保濕劑包括丙三醇〇.25%和透明 質酸0. 25%。 0 [0076] 在本發明的另一實施例中，該表皮細胞修復液，包括下 列重量份數的成份：水88%，味嗔終基厚Ρ. 1%，羥笨丙 酯〇. 2%，羥苯曱酯〇. 1%，芮三醇’遂明質酸， 分泌物2%，膠原蛋白7. 5%。 [0077] 在本發明的另一實施例中，該表皮細胞修復液，包括下 列重量份數的成份：水50%，分泌物25%，膠原蛋白25 %。 八 [0078] Ο 在本發明的再一實施例中，該細胞修復液，包括下列重 量份數的成份：水68. 5%，咪唑烷基脲〇· 3%，羥苯丙醋 0.2%，丙三醇1%，透明質酸1%，分泌物15%，膠原蛋 白 14%。 [0079] 由於本發明的間質性幹細胞分泌物對皮膚纖維幼細胞有 098131724 顯著的保護作用。在對抗過氧化氫的損傷和修復纖維幼 細胞的試驗中顯示，將培養液加入胎盤間質性幹細胞物 (CM)後能顯著降低過氡化氫損傷導致的細胞死亡率， 進而提高存活的纖維幼細胞的存活率。在對抗過氡化氫 表單編號A0101 第23頁/共39頁 0982054463-0 201111502 的損傷和修復纖維幼細胞的試驗中，在培養液加入胎盤 間質性幹細胞分泌物後能顯著降低過氧化氫損傷導致的 細胞死亡率，而且隨著CM量的增加，其纖維幼細胞的存 活率也明顯增高（見圖15所示）。 [0080] 使用本發明的表皮細胞修復液，能促進成纖維細胞、血 管内皮細胞的分裂繁殖及促進細胞外基質的合成分泌， 從而促進肉芽組織的生長，使竇道變淺；促進上皮細胞 的分裂繁殖，從而促進創面上皮化。將其應用到燒傷創 面，能促進成纖維細胞、血管内皮細胞的分裂繁殖及促 進細胞外基質的合成分泌，從而促進肉芽組織的生長， 使創面變淺；促進殘存毛囊、汗腺及傷口周圍上皮細胞 的分裂繁殖，從而促進創面上皮，參見圖16所示。 [0081] 關於本發明的分泌物在人體美容方面的應用，說明如下 胎盤間質性幹細胞分泌物的美容作用就是利用胎盤間質 性幹細胞分泌的因數能夠增加膠原蛋_白的生成量和促進 皮膚纖維原細胞的生長來實現的。皮膚之所以富有彈性 ，主要是因為皮膚真皮層内成纖維細胞分泌的膠原蛋白 形成了皮膚的支架，這種分泌物使皮膚纖維原細胞製造 的膠原蛋白的體積增加數倍，同時纖維原細胞的體積增 加也超過百分之三十。所以源源不斷產生自體膠原蛋白 ，就會使皮膚真皮層的厚度和密度增加，填平皺紋、消 除症痕、恢復皮膚彈性和光澤。 [0082] 通常將間質性幹細胞分泌物加到化妝品的配方中，這些 分泌物含有的多種活性成份，尤其是細胞生長因數群和 098131724 表單編號A0101 第24頁/共39頁 0982054463-0 201111502 膠原蛋白群，可促進羥脯氨酸的合成，促使膠原及膠原 酶合成’分泌膠原物質、透明質酸和糖蛋白，調節膠原 纖維’故具有滋潤皮膚’增強皮膚彈性，減少皮膚皺致 和防止皮膚衰老的作用。本發明上述的表皮細胞修復液 也可用於減少皮膚皺紋和防止皮膚衰老，其效果參見圖 17所示，明顯改善皮膚彈性、皮膚變緊；眼角及額頭皺 紋變淺’皮膚細腻柔嫩，且色素沉著有所改善。 [0083]關於分泌物在保健品方面的應用，說明如下： 0 目前修復受損皮膚及紅血絲外露皮膚最理想的高科技口 服美容品通常富含各類活性因數，如鹼性纖維細胞生長 因數（FGF)和表皮生長因數（EGF)。而胎盤間質性幹細胞 能分泌大量的這些生長因數，這些生長因數不僅能調節 ' "-'iff. r^! " 表皮細胞的分化、增殖和促進皮膚的更新，還能增加皮 膚的彈性、恢復皮膚滋潤。它蘊含甘草等鎮靜修復的成 分’對角質層進行修復，此外，豐富的葡萄籽OPC是抗氧 化、抗自由基的有效成分，它能修復細胞，強化角質修 〇 復’還能保護角質層，避免兔質丨層氧化發黃。因此，將 本發明的間質性幹細胞分泌物和έ萄籽OPC添加到一般的 美容保養品中’必然會功效倍增。根據本發明的教導， 本領域技術人員知悉各種將本發明的分泌物應用到現有 的化妝品、保養品和樂品中的方涂，並能夠通過這些方 法獲得各種所需的化妝品、保養品和藥品，在此就不再 累述。 [0〇84] 以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制 本發明，凡在本發明的精神和原則之内所作的任何修改 峋131724 表單編號Α0101 第25頁/共39頁 0982054463-0 201111502 、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍之 内。 【圖式簡單說明】 [0085] 圖1是本發明的一個實施例中人或動物提取間質性幹細胞 的方法流程圖。 圖2是本發明的一個實施例中採用酶類消化液消化後，原 代細胞貼壁生長示意圖。 圖3是本發明的另一實施例中採用酶類消化液消化後，原 代細胞貼壁生長示意圖。 圖4是本發明的再一實施例中採用酶類消化液消化後，原 代細胞貼壁生長示意圖。 圖5是本發明的一個實施例中採用間質性幹細胞A型培養 液進行細胞接種並培養，獲得細胞貼壁生長情況示意圖 〇 圖6是本發明的另一個實施例中採用間質性幹細胞A型培 養液進行細胞接種並培養，獲得細胞貼壁生長情況示意 圖。 圖7是本發明的再一個實施例中採用間質性幹細胞A型培 養液進行細胞接種並培養，獲得細胞貼壁生長情況示意 圖。 圖8是採用現有技術的培養液進行細胞接種並培養，獲得 細胞貼壁生長情況示意圖。 圖9是本發明的又一個實施例的從人或動物胚胎提取間質 性幹細胞的方法流程圖。 圖10是本發明的一個實施例中間質性幹細胞表面蛋白表 達鑒定的示意圖； 098131724 表單編號A0101 第26頁/共39頁 201111502 圖11是本發明的一個實施例中細胞化學方法誘導胎盤間 質性幹細胞分化為脂肪、軟骨及成骨細胞的示意圖。 圖12是本發明的一個實施例中提取間質性幹細胞的分泌 物的方法流程圖。 圖13是本發明的一個實施例中鑒定間質性幹細胞的分泌 因子的示意圖。 圖14是本發明的一個實施例中經檢測發現間質性幹細胞 的分泌物中含有大量的細胞生長因數群和膝原蛋白分子 群。
圖15是本發明的一個實施例中間質性幹細胞分泌物在表 皮修復中的作用的示意圖。 圖16是本發明的一個實施例的表皮細胞修愎液對於燒傷 創面的修復示意圖。 圖17是本發明的一個實施例的表皮細胞修復液在人體美 容方面的應用示意圖。 【主要元件符號說明】
098131724 表單編號A0101 第27頁/共39頁 0982054463-0