TW201035322A - Methods for identification and quantification of Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc - Google Patents

Description

201035322 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明提供一種冬蟲夏草牿 夂平特有的核酸序列，其可用 定真正的冬蟲夏草菌體並建立 、用於鑑 並標準化冬蟲夏草產品品質。 乂確保 【先前技術】

;蟲夏草-詞首見於清朝^所著本草備要中，為Μ 特f ’主產於四川、西藏、雲南、青海等地4_公尺以上 的而山上’尤其多見於具有積雪但排水良好的高寒草句區 。冬蟲夏草之學名為。咖印则❿（Μ ) 又 名夏草冬蟲、&草、冬蟲草，係麥角科蟲草真菌 。咖-*_|生於编竭蛾科昆蟲編竭蛾~心 s幼蟲的子座和幼蟲屍體的蟲菌複合物。夏季 ，蝙蝠蛾印產於地面’經過一個月左右孵化變成幼蟲後鑽 入潮濕鬆軟的土層，而後，中國被毛孢阳匕收以 sinensis)感染幼蟲，在幼蟲體内生長，待第二年春天來臨 ’菌絲開始生直到夏天時子座長出地面，幼蟲的軀殼 與菌絲共同組成了一個完整的「冬蟲夏草y依據1996年 Alexopoulos的分類，冬蟲夏草隸屬於真菌界（Fungi)、子 囊菌門（Ascomycota)、核菌綱（Pyrenomycetes)、肉座菌目 (HyP〇creales)、麥角菌科（clavicipUaceae)、冬蟲夏草屬 (CW办Fr.)。蟲草屬對於寄主具有專一性，其寄主可 分為真菌寄生（mycogenous)、昆蟲寄生（ent〇mogenous)及 换蛛寄生（arachnidicolous)三大類，真菌寄生蟲草寄生於 I34280.doc 201035322 C/avz’ce外及f/ap/zomyces屬子實體上，蜘蛛寄生蟲草寄生 於换蛛體上。昆蟲寄生蟲草的寄主包括：雙翅目（Diptera) 、膜翅目（Hymenoptera)、鞘翅目（C〇leoptera)、鱗翅目 (Lepidopter)、半翅目（Hemiptera)、異翅目（Is〇ptera)、直 翅目（Orthoptera)、等翅目（Homoptera)等昆蟲綱之幼蟲、 蛹及成蟲’其中以鱗翅目最多，鞘翅目居次。一般認為昆 蟲寄生與蜘蛛寄生感染寄主的途徑有三：經由寄主的氣孔 q 感染、寄主的消化系統感染或是經由寄主體表較柔軟部位 感染，如：關節部位。在適當的環境時孢子會形成單或數 個發芽管（germ tube)’穿透適當寄主的體表而進入蟲體内 (Mcewen，1963)。當蟲草屬菌絲侵入昆蟲體内後，經金液 • 循環系、统以分節菌絲繁殖，並以内臟及柔軟組織為營養， • 此時受感染的昆蟲會因中毒性反應而停止攝食，並出現痲 痒現象，導致行動遲緩。蟲草屬菌首先會破壞昆蟲的脂肪 體，幼蟲脂肪體被破壞將阻礙蛻皮，特別是阻礙變態丨成 〇 蟲的脂肪體被破壞將明顯抑制性細胞的形成。待蟲體死亡 後，菌絲充滿整個蟲體形成菌核。菌核形成後，在適當環 境下會長出子座，形成完整蟲草。 研究報告顯示，在過去20年有越來越多人使用互補與另 類醫療（_Plementary and alternative 咖仙―；ca⑷， 美國有42%的人使用CAM，男女使用cam的比例分別為 29/。與36/〇彳蚰夏草自古以來即被中醫視為保肺益賢的 珍貴藥材，為傳統補品之-，有強壯、益肺腎、補精髓、 保肺氣、實腠理、補虛、解毒、止血、化瘦之功效。近年 134280.doc 201035322 來的藥理研究發現，冬蟲夏草藥材及冬蟲夏草菌絲體製劑 具有抗遁瘤、抗腎炎、延遲衰老、增強免疫能力等功能。 黎於冬蟲夏草的多種藥理功能，多個國家對它的需要倍增 ，已成為CAM的重要標的之一。 . 目前冬蟲夏草的生活史並不明瞭，所以仍未能在人工條 件下培養形成子座，完成生活史。由於野生冬蟲夏草分佈 f區狹f、自然寄生率低、對生活環境條件要求苛刻，產 0 S有限°近年來又由於冬蟲夏草主產地生態環境遭到人為 嚴重破壞，大量盲目不合理採挖致使資源曰趨減少，產量 逐年下降，而價格曰益上揚，甚至每台斤售價高達數十萬 疋台幣。由於冬蟲夏草的形態鑑定必須根據成熟的子座、 . 子冑Λ又？囊抱子’迄今對於冬轰夏草的加工製品、未成 » 熟冬蟲夏草標本的鑑定仍無法鑑定，因此開發冬蟲夏草的 鑑定系統以保障食品衛生安全是當前最重要的課題。

中華民國第192356號專利提供未成熟冬蟲夏草標本的鑑 ◎ 疋系、先其内谷主要係收集樣品、分離與培養後均質，萃 取DNA，以引子組]^3爪86擴增出一段約9〇() bpl8S rRNA 基因後，分兩部份鑑定以C/〇I進行截切，此菌株如為令國 被毛孢，以NS3/NS6擴增出的核糖體基因將載切為三段大 小分別為570、300與50 bp將NS3/NS6擴增出的核糖體基因 疋序’比對後如比對出兩個C/bl切位（GCGC)，則判定此菌 株為中國被毛抱。 但市售產品品質良莠不齊，其中冬蟲夏草的含量尚無標 準方法可準確定量，因此開發快速準確的冬蟲夏草定量系 134280.doc 201035322 統，為保障製造商、零售商和消費者權益的重要課題。 【發明内容】 市售的冬蟲夏草產品多以人工培養無性世代的冬蟲夏草 菌絲體取代野生的子實體。然而，冬蟲夏草無性世代菌種 中國被毛孢 菌絲體的生長緩慢，導致 來源有限且成本昂貴，故市售產品常以其他真菌菌絲體摻 雜或替代冬蟲夏草。本發明發現冬蟲夏草特有的核酸序列 ，其可用於鑑定真正的冬蟲夏草菌體並建立其含量的檢測 系統，以確保並標準化冬蟲夏草產品品質。 本發明提供一種經分離的核酸，其具有如序列辨識編號 :1(SEQ ID ΝΟ:1)所示之序列或其簡併序列。該序列辨識 編號：1之序列如下所示：

CCCACCGTGAACCGAGTAGCTATGCCGCATCTGTGGCT

GCGCGCTGGTCTCGGCCGATTCCGAGCCCCTTTCCGATT

GTGGTTGCCAATGAAAGCTCTCC 本發明首次自冬蟲夏草發現如序列辨識編號：1所示的 核酸序列，該序列為冬蟲夏草特有的一段核酸序列，其可 作為冬蟲夏草的標記基因並用於鑑定真正的冬蟲夏草菌體 並檢測樣品中冬蟲夏草的含量。 本發明另提供一種引子對，該引子對與序列辨識編號： 1所示的核酸序列具專一性且其分別包含 GTCGCGAGTCTGTCGCTCCTGAGGC(序列辨識編號：2) 及 ATTGGCAACCACAATCGGAAAGG(序列辨識編號：3) 之序列或其簡併序列。根據本發明，該引子對可專一性與 134280.doc 201035322 序列辨識編號：1結合，使用該引子對並利用聚合酶鏈反 應可擴增序列辨識編號：1之序列。根據本發明，只要能 專一性擴增冬蟲夏草的序列辨識編號：1的引子對均能用 於本發明之鑑定方法。根據本發明之一較佳具體實施例， 該專一性擴增冬蟲夏草的序列辨識編號：1的引子對分別 包含 GTCGCGAGTCTGTCGCTCCTGAGGC(序列辨識編號 :2)及 ATTGGCAACCACAATCGGAAAGG(序列辨識編號 :3)之序列或其簡併序列。較佳地，該引子對之序列分別 為 GTCGCGAGTCTGTCGCTCCTGAGGC(序列辨識編號： 2)及 ATTGGCAACCACAATCGGAAAGG(序列辨識編號：3) 或其簡併序列。根據本發明之另一較佳具體實施例，上述 引子對序列的變體，例如，藉由删除（deletion)、取代 (substitution)、插入（insertion)或加入（addition)所產生的變 體，只要彼等可專一性地擴增冬蟲夏草的序列辨識編號： 1，均可用於本發明且包含於本發明之範圍内。 本發明另提供一種標準參考載體，其包含如序列辨識編 號：1所示的核酸序列或其簡併序列。本發明標準參考載 體可作為鑑定冬蟲夏草的標準品，利用該標準參考載體可 比對樣品是否含有如序列辨識編號：1所示的核酸序列或 其簡併序列。根據本發明，任何載體均可用於製備本發明 之標準參考載體。此等載體包括，但不限於，任何商業化 載體及自行構築之載體。例如，yT&A載體、TA載體、 pGEM載體、pUC載體、pET載體及EZ-T載體。本發明標準 參考載體之構築係使用一般的分子生物學技術進行DNA選 134280.doc 201035322 殖、序列剪切及接合。將載體轉入大腸桿菌中，隨菌體繁 殖質體的數量也就增加，因此標準參考载體來源及品質相 當穩定。 本發明另提供一種鑑定冬蟲夏草之方法，其包括使用如 本發明之引子對以聚合酶鏈反應擴增待鑑定物之DNa;如 擴增出約137bp的DNA產物代表該鑑定物為冬蟲夏·草。 ❹ 〇 本發明藉由設計可專一性擴增序列辨識編號：丨所示的 核酸序列或其簡併序列的引子對即可鑑定出冬蟲夏草。根 據本發明，係使用聚合酶連鎖反應（PCR)擴增冬蟲夏草之 獨特的核酸序列，擴增出的DNA產物具有約mbp的大小 ;較佳地，該產物的序列為序列辨識編號：丨。較佳地， e亥PCR為聚合酶連鎖反應和限制片段長度多型性法 (polymerase chain reaction-restriction fragment length poiymorphisms ; PCR_RFLP)法。利用冬蟲夏草的特有核酸 序列來鑑定冬蟲夏草只需在PCR後，經電泳分析，不需酵 素截切以及序列比對即可得知鑑定結果。相對於核糖體基 因，是一種較快速、低成本的分子鑑定方法。 本發明另提供-種定量樣品中冬蟲夏草基因體之方法， 其包括下列步驟：⑷取定量已知的冬蟲夏草菌絲體並萃取 及定量其麗’接著建立所㈣絲體乾重對冬蟲夏草基因 體重量的第i回歸曲線方程式；(b)將序列辨識編號：i之序 列或其簡併序列選殖人載體並轉人宿主中以大量複製包含 序列辨識編號：1或其簡併序列之截 戰體並建立該載体拷貝 數對基因體重量之第2回歸曲線方裎十· “、 程式，（d)抽取並定量未 134280.doc ❹ 〇 201035322 知樣品中之DNA，·（b)將抽取 列辨識編號.· 1或J： & 、 σ樣品CWA與包含序 合酶連㈣料時㈣ 包含序列辨識編號:1之載:=未知樣品的拷貝數與 回歸曲線方程式即可求出、$订比對並代入第1 另… 出樣品中冬蟲夏草之基因體重量； 及（f)该所得冬蟲夏草之基因體 式即可求出樣品中冬蟲夏草的乾重。回歸曲線方程 找夏草即時聚合酶鏈反應定量系統前.，必須先 =二冬蟲夏草獨有的基因。因此，本發明使用冬蟲夏 ίΓ列辨識編號：1所示序列或其簡併序列作為建立 疋篁系統的標的，接著建立標準參考物質。將抽取出的樣 品職與如本發明之標準參考載體同時進行即衫量聚合 酶連鎖反應（real_time PCR)以定量出樣品中DNA的量。另 可藉由建立冬蟲夏草菌體乾重與DNA量的方程式關係進 一步得出樣品中冬蟲夏草菌體的量。詳細反應及步驟如下 列實施例所述》 【實施方式】 實例1 冬蟲夏草之鑑定 本發明冬蟲夏草特有核酸序列之選殖 本實例以簡併性引子以PCR(條件：起始變性溫度98。〇、 2分鐘；變性溫度95。(：反應45秒，煉合溫度分別為耗亡、 44°C、42°C反應45秒’延展溫度72°C反應2分鐘，循環12週 期；最後延展溫度72°C反應10分鐘）擴增出冬蟲夏草基因 中的片段HMG box。比對C. 、C. 〔 134280.doc 201035322 chlamydosporia ^ C. cylindrical C. militarist] HMG boxjf-列後，在較保守的序列設計簡併性引子（HMGDPF (ACMGACATACCATTGTGAAGCAGG ;序列辨識編號：4) /HMGDPR (TGCTGCTCGAGGAGAGCTTTC ;序列辨識編 號：5))。以HMGDPF/HMGDPR為引子並以PCR擴增出冬 蟲夏草基因中較保守的序列HMG box，結果擴增出三片段 如圖1所示，分別為200 bp，350 bp與600 bp。其中有一片 段與已知的HMG box序列長度相似，約200 bp。將此200 bp進行定序分析結果如2所示（即序列辨識編號：1)，可得 知由//. ihe如化RS2〜RS6菌株所得的片段序列一致，顯示 各冬蟲夏草菌株均具有該序列。再將此序列與已發表的蟲 草屬HMG box基因進行比對，結果指出其他蟲草屬之序列 與序列辨識編號：1之序列均不相同（如圖3所示）。因此， 序列辨識編號：1之序列為冬蟲夏草特有之序列。 序列辨識編號：1應用於冬蟲夏草分子生物鑑定 接著設計可專一性擴增序列辨識編號：1之引子對 HMGSF (GTCGCGAGTCTGTCGCTCCTGAGGC;序列辨識 編號：2)/HMGSR (ATTGGCAACCACAATCGGAAAGG ； 序列辨識編號：3)，以PCR(起始變性溫度98°C反應2分鐘 ;變性溫度95°C反應45秒，煉合溫度68t反應45秒，延展 溫度72°C反應30秒，循環35週期；最後延展溫度72°C反應 10分鐘）擴增出大小為163 bp之片段。將此引子對不同菌株 與樣本進行專一性測試，結果如表1及2所示。 表1 ·以引子對HMGSPF / HMGSPR對中國被毛孢菌株與 134280.doc -10- 201035322 蟲草屬菌株進行專一性鑑定結果。 菌種 Hirsutella sinensis 序列辨識編號：1 PCR-RFLP** Hirsutella sinensis RS2 V + Hirsutella sinensis RS3 V + Hirsutella sinensis RS4-2 V + Hirsutella sinensis RS5-2 V + Hirsutella sinensis RS6-3 V + Phytocordyceps ninchukispora X — Cordyceps sp. X — Tolypocladium sinensis X — Cordyceps takaomonotana X — Cordyceps sp. X — Cordyceps l iangshanensis * X —

v :得到序列辨識編號：1 X :未得到序列辨識編號：1 + 激足為 Hirsutella sinensis —·.篮足不為 Hirsutella sinensis * : Cor办cej:?·? DNA CC1014afb(陳志昇. 1999.冬蟲夏草 Cordyceps sinsisis (Berk.) Sacc.分子生物 鑑定系統之研究；國立台灣大學農業化學研究所碩士論文

:使用18 S rRNA藉PCR-PFLP鑑定（陳志昇.1999.冬 蟲夏草 Cordyceps sinsisis (Berk.) Sacc·分子生物鑑定系統 之研究；國立台灣大學農業化學研究所碩士論文）。 134280.doc -11 - 201035322 表2以專一性引子對HMGSPF / HMGSPR對冬蟲夏草樣 本進行鑑定結果。_

Sample Hirsutella sinensis PCR-RFLP** 序列辨識編號：1

Cordyceps sinensis V + 070315

Cordyceps sinensis 070226 V + H. sinensis 5T02Sg V + //. Wwemb菌絲體 V + 冬蟲夏草子實體 V + 冬蟲夏草頭部 V + 冬蟲夏草蟲體 V + 柯氏冬蟲夏草 V + AE V + LDCM X —

G V :得到序列辨識編號：1 X :未得到序列辨識編號：1 + ·.鑑定為 Hirsutella sinensis 一 ·，银定不為 Hirsutella sinensis :使用18 S rRNA藉PCR-PFLP鑑定（陳志昇· 1999.冬蟲 夏草 Cordyceps sinsisis (Berk·) Sacc.分子生物鑑定系統之 研究；國立台灣大學農業化學研究所碩士論文）。 比較前人建立的鑑定法PCR-PFLP鑑定結果可知， HMGSF/HMGSR對序列辨識編號：1具有專一性，根據此 特性可建立單一步驟的冬蟲夏草分子鑑定生物法，只需以 HMGSF/HMGSR為引子對，待測樣品的基因體為模板，如 果樣品為冬蟲夏草，則可擴增出序列辨識編號：1(約137 134280.doc -12- 201035322 bp的序列）’將此方法與中華民國第ι92356號專利所建立 .的PCR-PFLP方法比較結果如表所示。用序列辨識編號：1 來鑑定冬蟲夏草只需在PCR後，經電泳分析，不需酵素截 切以及序列比對即可得知鑑定結果。相對於核糖體基因， 是一種較快速、低成本的分子鑑定方法。 表3·冬蟲夏草分子鑑定法比較 分子系統學 序列辨識編號：1 18 SrRNA 時間 3小時 2〜3天 PCR 有 有 酵素截切 無 有 定序 無 有 費用 不昂貴 實例2 未知樣品中冬蟲夏草之定量 Ο 一、質體建構： 1_將序列辨識編號：1與載體yT&A接合，此質體稱為 ΗΤΑ。

2.將 ΗΤΑ轉入五•sc/zer/Wa co/z. Top 10，利用五· 系統 大量複製ΗΤΑ。 3·從心co/z· Top 1〇中抽取ΗΤΑ，用以建立即時 PCR(real-time PCR)的標準曲線。 一、建立回歸曲線 I冬蟲夏草菌體乾重對基因體重量回歸曲線（圖4)。 將中國被毛孢菌絲體以及冬蟲夏草子座、菌核分裝20, 40，60，80 mg於微量離心管中分別以CTAB法與 QIAamp ® DNA stool mini kit 萃取 DNA定量，繪製成 134280.doc • 13· 201035322 菌體乾重對DNA濃度的回歸線圖，如圖4所示。 2. ΗΤΑ拷貝數對基因體重量回歸曲線（圖5)。 以含有序列辨識編號：1的yT&A質體為標準品進行 反應，不同含量中國被毛孢RS5 DNA 5 0 ng、5 ng、500 pg、50 pg、5 pg及0.5 pg，進行即時聚合酶鏈反應結果 可得Ct平均值。將不同中國被毛孢DNA重量與平均Ct值 繪製成回歸曲線圖如圖5所示，得回歸方程式y =-3·279χ - 9.2988。 二、樣品定量 1. 用 QIAamp® DNA Stool Mini Kit (QIAGEN，Cat. No· 51504)抽取 60 mg 樣品 genomic DNA。 2. 樣品 Genomic DNA用 DNA Quantitation Kit (SIGMA， DNA-QF)定量。 3. 取5 ng樣品genomic DNA與系列稀釋後的ΗΤΑ，同時 進行real-time PCR定量，得樣品genomic DNA _序 列辨識編號：1的拷貝數。 4. 將real-time PCR比對出之序列辨識編號：1的拷貝數 ，帶入ΗΤΑ拷貝數對基因體重量回歸曲線方程式（例 们’似則b RS5-2 : y = 2χ1(Γ14χ)計算出樣品 中冬蟲夏草基因體總重量。 5. 再將冬蟲夏草基因體總重量帶入菌體乾重對基因體重 量回歸曲線方程式（表4)，計算出60 mg樣品中，冬蟲 夏草實際乾重。 表4·菌體乾重與萃取出核酸濃度回歸曲線方程式與R 平方值 134280.doc -14- 201035322 樣品 校正曲線 Hirsutella sinensis RS2 y: =183.66x- 155.57 r2 = 0.9992 Hirsutella sinensis RS3 y: =7.0237X + 462.04 r2 = 0.9094 Hirsutella sinensis RS4-2 y: = 38.075x +586.35 r2 = 0.9552 Hirsutella sinensis RS5-2 y: = 41.127x-401.12 r2 = 0.9979 Hirsutella sinensis RS6-3 y: =106.93x-1537.5 r2 = 0.9876 Cordyceps sinensis stroma y: = 87.172x-714.37 r2 = 0.9411 Cordyceps sinensis sclerotium y = 30.738x-62.54 r2 = 0.9972 、菌絲樣品定量實例 將//. RS2〜RS6-3與 C. 子座 、菌核精秤

60 mg，以 QIAamp®DNA Stool Mini Kit 萃取 DNA後定量， 結果如表5所示，其中的實測值總DNA量，帶入表4的回歸 方程式中計算出菌絲體乾重，接著將總DNA量稀釋為5 ng 進行real-time PCR，偵測結果得到樣品中的序列辨識編號 :1拷貝數計算出DNA重量後，乘以稀釋倍數，可以算出 總核酸量，再帶入表4回歸方程式中計算出菌絲乾重，比 較菌絲乾重實際值與即時聚合酶鏈反應偵測值，中國被毛 孢RS2與RS4-2偵測值高過實際值，冬蟲夏草菌核則是偵測 值低於實際值，其餘的誤差都在正負1 mg内。 表5.不同冬蟲夏草樣品實測值與即時聚合酶鏈鎖反應偵 測的總核酸量、乾重比較 實測值 Real-time PCR 菌株 總DNA (ng) 菌絲乾重 A (mg) 稀釋倍數 SEQID ΝΟ:1 拷貝數 DNA (ng) 總DNA (ng) 菌絲乾重 B(mg) A/B H. sinensis RS2 11039 60.95 2207.8 304938 6.10 13464.85 74.16 0.82 H. sinensis RS3 801 48.28 160.2 250617 5.01 802.98 48.57 0.99 H. sinensis RS4-2 2960 62.40 592 275309 5.51 3259.65 70.28 0.89 H. sinensis RS5-2 2019 58.84 403.8 249383 4.99 2014.01 58.72 1-00 H. sinensis RS6-3 4723 58.55 944.6 255556 5.11 4827.96 59.53 0.98 C. sinensis stroma 3700 50.64 740 244444 4.89 3617.78 49.70 1.02 C. sinensis sclerotium 1130 58.79 226 198765 3.98 898.42 51.26 1.15 134280.doc -15- 201035322 實測值：

總DNA : 60 mg菌絲粉末的總DNA 菌絲乾重：表 4方程式；total DNA as y，evaluate X· 稀釋倍數：將總DNA稀釋至5 ng.

Real-time PCR : 序列辨識編號：1拷貝數：藉real-time PCR檢測SEQ ID NO: 1的 拷貝數。 DNA :轉換序列辨識編號：1之拷貝數為基因體DNA重 總DNA — DNA X稀釋倍數 菌絲乾重：表 4 方程式；total DNA as y，evaluate X. A/B : < 1代表高估的菌絲乾重；> 1代表低估的菌絲乾重 0 【圖式簡單說明】 圖1為以簡併性引子HMGDPF / HMGDPR對冬蟲夏草進 行HMG box擴增結果之電泳圖。第1道：100 bp標記；第 2 道：Hirsutella sinensis ·，第 3 道：Hirsutella RS3 ;第 4道：RS4-2 ;第 5道 .· Hirsutella sinensis RS5-2 ’，第 6道·. Hirsutella inensis RS6-3。 圖2為以中國被毛孢基因為模板HMGDPF / HMGDPR為 〇 引子擴增出的HMG box基因序列比對結果。 圖3為中國被毛孢與已發表蟲屬菌株HMG box基因序列 比對結果。 圖4為冬蟲夏草菌體乾重對基因體重量之回歸曲線圖。 圖5為ΗΤΑ拷貝數對基因體重量之回歸曲線圖。 134280.doc 16· 201035322 134280Seq list.ST25.txt SEQUENCE LISTING <110>蘑法生物科技股份有限公司 <120>鑑定與定量冬蟲夏草之方法 <130> M52295/134280 <160> 5 <170> Patentln version 3.3

<210> 1 <211> 100 <212> DNA <213> Hi rsutella sinensis <400> 1 cccaccgtga accgagtagc tatgccgcat ctgtggctgc gcgctggtct cggccgattc cgagcccctt tccgattgtg gttgccaatg aaagctctcc 赢 <210〉O <211> <212> <213>

2SAAX <220> <223>引子 <400> 2 gtcgcgagtc tgtcgctcct gaggc <210> <211> <212> <213>

SAAX <220> <223>引子 <400> 3 attggcaacc acaatcggaa agg <210> <211> 0<212> <213> 4srx <220> <223> 弓 <400〉 4 acmgacatac cattgtgaag cagg <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213>人工 <220> <223>引子 <400〉 5 tgctgctcga ggagagcttt c 分頁(1)

Claims (1)

1. 201035322 七、申請專利範圍： 1 · 一種經分離的核酸，其具有如序列辨識編號：ι(序列辨 識編號：1)所示之序列或其簡併序列。 - 2. 一種引子對，其與序列辨識編號：1所示的核酸序列具專 一性且其分別包含 GTCGCGAGTCTGTCGCTCCTGAGGC(序 列辨識編號：2)及 ATTGGCAACCACAATCGGAAAGG(序 列辨識編號：3)之序列或其簡併序列。 3. 如請求項1之引子對，其中該引子對分別具有 O GTCGCGAGTCTGTCGCTCCTGAGGCC序列辨識編號：2) 及 ATTGGCAACCACAATCGGAAAGG(序列辨識編號：3) 之序列或其簡併序列。 4. 一種標準參考載體，其包含如序列辨識編號：-1所禾的 核酸序列或其簡併序列。 ' 5.如請求項4之載體，其為包含如序列辨識編號：1所示的 核酸序列的yT&A載體、TA載體、pGEM載體、pUC載體 、pET載體及EZ-T載體。 ^ 6. 一種鑑定冬蟲夏草之方法，其包括使用如請求項2之引 子對以聚合酶鏈反應擴增待鑑定物之DNA ;如擴增出約 137 bp大小的DNA產物代表該鑑定物為冬蟲夏草。 7. 如請求項6之方法，其中該DNA產物包含序列辨識編號： 1所示的核酸序列或其簡併序列。 8. 如請求項6之方法，其中該DNA產物具有序列辨識編號： 1所示的核酸序列或其簡併序列。 9. 如請求項6之方法，其中該PCR為PCR-RFLP。 134280.doc 201035322 i〇. —種定量樣品中冬蟲夏草基因體之方法，其包括下列步 驟：（a)取定量已知的冬蟲夏草菌絲體並萃取及定量其 DNA，接著建立所得菌絲體乾重對冬蟲夏草基因體重量 的第1回歸曲線方程式；（b)將序列辨識編號：1之序列或 其簡併序列選殖入載體並轉入宿主中以大量複製包含序 列辨識編號：1或其簡併序列之載體並建立該载体拷貝 數對基因體重量之第2回歸曲線方程式；（d)抽取並定量 未知樣品中之DNA ; (b)將抽取出的未知樣$DNA與包含 序列辨識編號：1或其簡併序列之载體同時進行即時定 量聚合酶連鎖反應（real-time PCR) ; (e)將未知樣品的拷 貝數與包含序列辨識編號：丨或其簡併序列之載體之拷 貝數進行比對並代入第1回歸曲線方程式即可求出樣品 中冬蟲夏草之基因體重量；及（f)該所得冬蟲夏草之基= 體重量代入第2回歸曲線方程式即可求出樣品中冬= 草的乾重。

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