TW200930401A - Streptococcus m protein, immunogenic fragments, nucleic acids and methods of use - Google Patents

Description

200930401 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於特定蛋白及核酸。更明確而言，本 發明係關於魚型鏈球菌（Streptococcus iniae)的分 離蛋白和核酸及其用於動物之診斷及/或治療的= 途，特別指用於魚類。 【先前技術】 魚型鏈球菌近十年來已成為造成溫帶海水養殖 ❹和淡水鰭魚大量損失的最嚴重水生動物病原菌之 一。魚型鏈球菌於1 976年首先被分離自捕獲的亞馬 遜淡水河豚而命名’其廣泛分佈於全球的溫水鰭魚水 產養瘦場。一篇目前被鑑定為感染魚型鏈球菌之魚類 的報告被發表於Agnew & Barnes, 2007， Vet

Microbiol. \22 \ 。 魚型鏈球菌亦具有動物傳染潛力，經鑑定的人類 ❹ 感染遍佈美國、加拿大和亞洲。在人類中，目前全部 感杂病例均為在處理污染魚類過程中隨機感染，通常 為老年人或免疫缺陷個體的穿剌傷口有關（Agnew &

Barnes, 2007，如上文）。 已顯示抗生素可有效治療一些魚類感染。雖然隨 著種類的不同各有其差異性，但是已發現恩諾沙星 (enrofloxacin)、氧四環素（oxytetracycline)、富 來頓（furazol idone)和阿莫西林（amoxici 11 in)可有 效用於治療魚類的魚型鏈球菌感染。然而，使用此制 200930401 殖環境時仍存有-些限制和顧慮。第-藥物殘留的問題。 帛-為食用養殖魚類 =發展一種控制魚型鏈球菌的方法為藉由 鹿：1 995至1 997年在以色列的養殖縛魚場 内利用腹腔注射全％胎短1 勿 自體疫當“ / 化魚型鏈球菌的 Α功地進行一項免疫計劃（Ber⑽〜等

❹ 九，’細菌抗原的免疫：鏈球菌和相關細菌的感 木。第一次國際魚疫苗學研討會第153 6〇頁； Ε1ί^Γ# 人 1997，如./飾姐 /卿㈣〇/. 56 1^5)。魚類可獲得4個月的保護期，其在以色列可涵 蓋鱒魚紐生產循環期的大部分時間（BerC0Vier等人， 1 996,如J：文）。在Upper GalUee的大規模疫苗計劃 每年可使魚型鏈球菌感染的死亡率從5〇%降至低於 5%(Eldar等人，1997，如_^)。證據顯示該基本的 保護機制係抗原的測定，可能為產生熱穩定性蛋白之 故（Bercovier等人，1 996,如上又）。 以抗魚型鏈球菌血清被動免疫吳郭魚獲得的資 料可支持此項抗體在保護作用上所扮演角色的證據 (Shelby 等人.，2002, 乂 /7妫.25 υ。然而， 疫苗計劃的成功為期極為短暫。在199?年由於細菌 產生新變異株而再一次發生大規模的爆發。不似先前 的分離株’此變異株為精胺酸二水解酶和核糖陰性， 及似乎轉移其笑膜組成物（Bachrach等人，2001年4 200930401 月，心67 3756;zl〇tkin 等人， 1 998 年 4 月，64 4〇65)。在 以色列的疫苗計劃中顯示魚和環境中仍存在有一些 病原菌而因此無法分辨其主要的血清型（Bachrach等 人，2001，如2文）。 最近，亞洲的部分地區已有供應對抗魚型鏈球菌 感染的兩種新型疫苗。一種為可用於浸泡或注射的單 價不活化疫苗（Norvaxl Strep Si)。先靈寶雅公司已 發展可浸泡或投予飼料之對抗魚型鏈球菌和格氏乳 球菌 U. 的疫苗 AquavacTM、GarvetilTM。 儘管已有魚型鏈球菌疫苗’此病原菌仍困擾著声 類和其他動物。因此仍亟需錐定和分離魚型鍵球菌的、 分子成分以有效診斷及/或治療動物的魚型鍵球菌感 【發明内容】

本發明係關於一種魚型鏈球菌經分離Μ蛋白或M 樣蛋白，特別指非限制型及編碼該 幕 之經分離核酸，而可能且右相㈣,、M 4 M樣蛋白 此具有相對減少纖維蛋白原結合 本發明亦係關於用 鏈球菌感染的組成物和 於治療及/或診斷動物之魚型 方法》 在一態樣t 蛋白或Μ樣蛋白 本發明提供魚型鏈球菌的經分離Μ 200930401 在一具體實施例中’該經分離Μ蛋白或Μ樣蛋白 包含選自由RLTLEEKMEALRKVVT (序列辨識編號·· ^ 和KMAEIQEEANKKIAAC序列辨識編號：2)所構成群組 的胺基酸序列。 在特定具體實施例中，該魚型鏈球菌的經分離Μ 蛋白或Μ樣蛋白包含根據序列辨識編號：3或序列辨 識編號：4的胺基酸序列。 在另一態樣中’本發明提供一種經分離蛋白，其 ❹係與包含根據序列辨識編號：3或序列辨識編號：4 之胺基酸序列的經分離蛋白比較，具有降低或減少纖 維蛋白原結合力，該經分離蛋白包含魚型鏈球菌Μ蛋 白或Μ樣蛋白的胺基酸序列，但其不包含選自由 RLTLEEKMEALRKVVT(序列辨識編號：丨）、 KMAEIQEEANKKIAAC序列辨識編號·· 2)，以及一或多種 序列辨識編號：3或序列辨識編號：4之殘基19〇〜22〇 g 所構成群組的胺基酸序列。 該具有降低纖維蛋白原結合力的經分離蛋白包 含選自由序列辨識編號：5、序列辨識編號：6和序 列辨識編號：7所構成群組的胺基酸序列。 在另一態樣中，本發明提供經分離蛋白，係包含 選自由序列辨識編號··丨、序列辨識編號：2、序列辨 識編號：3、序列辨識編號·· 4、序列辨識編號：5、 序列辨識編號：6、和序列辨識編號：7所構成群組 的胺基酸序列。 ’ 200930401 ,在另一態樣中，本發明提供根據上述任—熊 經分離蛋白的片段、變異型或其衍化物。… μ f另—態樣中，本發明提供經分離核酸，係編碼

f據上述態樣之經分離蛋白或片段、變異型或其衍化 物0 、 J iU

的任一序列辨識編 該經分離核酸， •號8至11和39的核苷酸 ❹ 在另一態樣中，本發明提供基因構築質體，係 3根據上述任一態樣之經分離核酸。 在另一態樣中，本發明提供宿主細胞’係 據上述態樣之基因構築質體。 在另一態樣中，本發明提供抗體，係結合 球菌之經分離Μ蛋白或Μ樣蛋白、片段、變異型、 衍化物。 一、 ❹ 在另-態樣中，本發明提供組成物’係包 上述態樣之魚型鏈球菌經分㈣蛋白或Μ 型或其衍化物’或其抗體與適當稀釋劑或賦 該組成物為能誘發對抗魚型 的免疫治療組成物。 圉之免疫反應 該組成物為能誘發對抗魚型 疫反應的疫苗。 ㈣球菌之保護性免 在另一態樣中，本發明提供-種治療動物之备型 鍵球菌感染的方法’該方法的步驟包括投予組成物與 200930401 .或賦形劑载體至感染魚型鏈球菌的動物 離染’而該組成物係包含魚型鏈球菌之經分 樣蛋白、片段、變異型或其衍化物，或 .㈣Ϊ另態樣中，本發明提供—種令動物對抗魚型 鏈球ΐ而免疫的方法’該方法的步驟包括將包含备楚 鏈:表菌之經分離Μ蛋白或Μ樣蛋白、片段、變異型或 ’、何化物’或其抗體與適當稀釋劑或賦形劑載體的組 ° 成物投予至一動物而令該動物免疫。 在另一態樣中，本發明提供一種測定動物是否已 或曾經暴露於魚型鏈球菌或其成分的方法，該方法的 步驟包括測定獲得自該動物的生物樣本是否包含經 分離蛋白或片段、變異型或其衍化物，其中若存在該 經分離蛋白或片段、變異型或其衍化物時表示該動物 已或曾經暴露於魚型鏈球菌或其分子成分。 ❹ 在另一態樣中’本發明提供一種測定動物是否已 或曾經暴露於魚型鏈球菌或其成分的方法，該方法的 步驟包括測定獲得自該動物的生物樣本是否包含根 據上述任一態樣的經分離核酸，其中若存在該經分離 核酸片段時表示該動物已或曾經暴露於魚型鏈球菌 或其分子成分。 在另一態樣中’本發明提供一種測定動物是否已 或曾經暴露於魚型鏈球菌或其成分的方法，該方法的 步驟包括測定獲得自該動物的生物樣本是否包含結 200930401 •合魚型鏈球菌之經分離Μ蛋白或Μ樣蛋白的抗體或抗 若存在該抗體或抗體片段時表示該動物 已或曰、！暴露於魚型鏈球菌或其分子成分。 -斷明的另一態樣中提供一種診斷套組及/或 • c係包含-或多種用於偵測魚型鏈球菌、 其刀子成分或抗體之偵測劑。 ο 體、物包含一或多種_劑及抗 蛋白式二1 偵測劑係適用於核酸式或 編碼魚型鏈球菌Μ蛋白或7蛋及^子係便於谓測 全部說明書中，核或其片段。 ,Α 于'非另有明述，否則"含右”、” 匕δ η和"包含有”的使用 所陳述的整數或一群整數為而非侷限性’因而 述的整數或一群整數。I《多個其他非陳 ❹ 和定：發型鏈球菌Μ蛋白異形體的分離 侷二：：：診斷及/或治療動物，包括但不 感染、類和哺乳類，例如人和海脉之魚型鏈球菌的 在—態樣中，本發明描 離^蛋白或Μ樣蛋白。 種魚型鏈球菌的經分 就本發明的目的而古，，， 然狀態中被移除或者進：为離”-詞指已從其天 質可實質上或其太人工處理的物質。經分離物 分，或可被人:卢‘、、，、通常在天然狀態下伴隨的組 处理成與通常在天然狀態下伴隨組分 200930401 化學合成或重組 的加工狀態。經分離物質可為天然 型。 :處;士型鏈球菌的Μ蛋白"或”魚型鏈球菌的^ f糸—種獲得自魚型鏈球菌的蛋白及/或包含 獲得自魚型鏈球g之蛋白的胺基酸序列，該蛋白在構 泣上和功迠上為直系同源，或至少纟Μ樣蛋白與另一 Α群鏈球菌的μ蛋白具有相關性。 〇 w Μ蛋白係一種一般發現於細菌細胞壁延伸入周 圍英膜的Α群鏈球菌蛋白。該Μ蛋白視不同血清型而 不同該Μ蛋白藉由避免菌細胞被吞噬的保護作用而 具有鏈球菌毒力。 蛋白質忍扣一種胺基酸聚合物。該胺基酸可為 習知技術中的天然或非天然胺基酸、D-或L-胺基酸。 肽為一種具有低於五十（5〇)個胺基酸的蛋 白0 "多肽"為一種具有五十（5〇)或更多個胺基酸的 蛋白。 本發明的各種態樣提供一種魚型鏈球菌的經分 離Μ蛋白’包括該μ蛋白的片段、變異型和衍化物。 乂在特定態樣中，該魚型鏈球菌的經分離Μ蛋白包 3月j述序列辨識編號：3或序列辨識編號：4的胺基 酸序列。 本發明亦提供魚型鏈球菌M蛋白異形體’其推斷 為源自插入40個核苷酸於一 Μ蛋白基因，該Μ蛋白 13 200930401 • 基因不包含至少一 rltleekmealrkvvt (序列辨識編 號：1)和KMAEIQEEANKKIAA(序列辨識編號：2)胺基 酸序列。 這些蛋白的實例在此處為序列辨識編號：6和 7。其後提供的資料顯示這些M蛋白具有降低的纖維 蛋白原結合力。 另外’包含前述序列辨識編號·· 5之胺基酸序列 的Μ蛋白，係不具有任一胺基酸序列 ❹RLTLEEKMEALRKVVT(序列辨識編號：D和 KMAEIQEEANKKIAA(序列辨識編號：2) ’以及具有降低 纖維蛋白原結合力。 此外，或者，缺少一或多個殘基190至220之序 列辨識編號·· 3或序列辨識編號：4 @ Μ蛋白可減少 或降低纖維蛋白原的結合力。 雖然缺少RLTLE則EALRKVVT(序列辨識編號：υ， ❹ :聊織KIAA(om識編號：2)及 4 :::二序列辨識編號:4的-或多個殘基二 •1 Μ減J或降低纖維蛋白原結合力之M蛋白 或Μ樣蛋白的特徵曰β 可構成纖維蛋白塔一非何這些胺基酸序列均 合力。、、’ 原結合位點或助長纖維蛋白原的結 較佳為與包含選自由 識編號：4所播士 # 】辨識編唬.3和序列辨 成群組之胺基酸序列的錄八魅If jo 比較可降低其纖維蛋白原結合力㈣軌刀離M蛋白 200930401 在本文中”降低或減少”意指具有序列辨識編 號：3或序列辨識編號：4的胺基酸序列之Μ蛋白， 其分子對分子之間’結合的纖維蛋白原數量係低於 99%，或在一態樣中為低於95%，在一態樣中為低 於90%，在一態樣中為低於75%，及在另一態樣中 為低於 50% 或低於 40%、30%、25%、20%、15%、 '10%、5%、3%、2% 或 1%。 在不拘泥於任何特定理論之下，一般認為纖維蛋 ❹白原可能遮蓋對魚型鏈球菌Μ蛋白的免疫反應，因而 具有降低纖維蛋白原結合力的經分離蛋白特別適合 作投給動物的免疫抗原。 此處"動物"包括和涵蓋易感染魚型鏈球菌的任 何動物，包括但不侷限於魚類和哺乳類，例如人和海 豚。 此處本發明範圍内的”魚類"一詞包括：無頜綱 ❹ （乂口7(9 Ma)的無頜魚例如盲鰻和八目鳗；軟骨魚網 (“Γ⑽介，以軟骨構成骨骼的魚類；以及 硬骨魚綱（ίM s)，大部分以硬骨構成骨骼的 魚類。硬骨魚綱包含兩種主要族群：條鰭魚 (ray-finned fish)和肉鰭魚（1〇be finned fish)“。、、 在本發明的一態樣中，其魚類為條鰭魚。 本發明可應用魚類的非全制性實例包括市售的 進口魚類例如鮭魚（Salmon)、紅目鱸（barramundi)、 石斑魚（Seabass)、比目魚（flounder)、鱒烏 15 200930401 (trout)、網魚（bream)、笛網（snapper)、尼羅魚（Ni 1 e perch)、吳郭魚（tilapia)、烏魚（muiiet)、鳕魚（cod) 和金搶魚（yel lowtai 1 )。 在另一態樣中’本發明提供包括經分離蛋白的魚 型鏈球菌經分離Μ蛋白的片段、變異型或其衍化物， 其係具有降低纖維蛋白原結合力。 "蛋白片段"為蛋白的片段、功能區、部分或區 域’其由低於100%之蛋白的胺基酸序列所構成。 〇 例如’蛋白片段可包含高至的該蛋白的99%、 95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60 %、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、 20%、15%、10%、5%、3%、2% 或 1%。 在特定態樣中，一蛋白片段可包含，例如，至少 5 、 10 、 20 、 30 、 40 、 50 、 60 、 70 、 80 、 90 、 1〇〇 、 120 、 140 、 150 、 200 、 250 、 300 、 350 、 400 、 450 或 & 500個魚型鏈球菌μ蛋白的連續胺基酸。 一胜肽可為一蛋白片段，例如包含至少6、1 〇、 12 '15、20、30、40和高至50個連續的胺基酸。 2009/1/15 12:03 可藉由標準重組核酸技術或利用習知液或固相 合成技術的合成獲得包括胜肽片段在内的蛋白片 段。例如，可參考例如C〇 1 i gan等人編輯之「蛋白質 科學現行計劃」（j〇hn Wiley & Sons，1995〜 第18章的溶液合成法或固相合成法。或者，藉由例 16 200930401 如 end〇LyS—C、end〇Arg一C，endoGlu-W V8_pr〇tease 的蛋白酶消化本發明多肽而產生該胜肽。該經消化片 奴可藉由技術中習知的層析法被純化。 在本發明的各種態樣中，該蛋白片段可為一"生 物活性蛋白片段，，，並展現至少25%，更佳為至少5〇 %及又更佳為至少70%、75%、8〇%、85%、9〇%、 95%或高至100%全長魚型鏈球菌M蛋白之生物活 性。生物活性在無限制之下可以免疫原性、抗原性及 ❹ /或纖維蛋白結合力表示。 此類蛋白片段的非限制性實例包括的經分離M 蛋白片段，係不包含rltleekmealrkvvt(序列辨識編 號·· 1)和KMAEIQEEANKKIAAC序列辨識編號：2)的胺 基酸序列或缺乏其中之一。 此類片段的特定實例包含前述序列辨識編號：6 和7的胺基酸序列，係分別顯示相對降低纖維蛋白原 結合力。 或者，該生物活性蛋白片段與全長魚型鏈球菌Μ 蛋白比較具有較強的活性。 蛋白片段包含前述序列辨識編號：6和7之胺基 酸序列，係分別與全長魚型鏈球菌Μ蛋白比較具有增 加或強化的免疫原性。 在其他具體實施例中，生物活性片段可含有成 熟、修飾型的本發明Μ蛋白。 Ν-端信號序列。 例如，生物活性片段可能缺少 200930401 =限制性實例包括缺少胺基酸卜41的ν—端修飾μ蛋 本發明亦提供本發明之經分離蛋白的變。 ^ "變異型”的範圍包括天然變異株例如等位其田 變異型、直系同源和同源以及例 土 型。 』职入工產生的變異 此處"變異型"、，，變異"和”突變 ❹ 留或非保留胺基酸的取代、刪除及/或插入 入一經分離蛋白或其片段。 导 通常，蛋白變異型具有與前述任—序列辨識編 ^ Λ 經分離蛋白至少8 0 %的胺基酸序 7-致性。纟本發明的某些態樣中’蛋白 述任二序列辨識編號：1至7的本發明經分離蛋 % ^7 90%、91%、92%、93%、94%、95 。、96/、97%、98%或99%的胺基酸序列—致性。 此處描述個別核酸或蛋白之間關係 較窗"、:序列-致性"、”序列-致性= t 質上致。由於各自核苷酸或胺基酸序列 :;二別包含:⑴僅一或多個部分的完整序列被各 蛋白所共用；以及⑵一或多個部分被分散 ★--，蛋白之間，因此序列比對通常在，I比較窗" 2打序列的比較以鑑定和比較局部區域的序類相似 度。一"比較窗”㈣參考序列相比較之通常至少6、 12 20或更多個連續殘基的一概念區段。當比 200930401 較參考序列（其不包含添加或刪除）以最適比對各自 序列時，該比較窗可包含約20%或更少（例如5、1〇 或15%)的添加或刪除（即序列間隙）。可藉由任何各 種選取方法所產生的電腦執行演算法（例如 GCG’ 2DAngisGCG 和 GeneDoc 程式提供的 eclustalw 和BESTFIT，併入於此以供參考）或藉由檢視及最佳 比對（即在該比較窗產生最高百分比的一致性）進行 對齊比較窗的序列最適比對。 ❹ 此處衍化蛋白"係一種包含魚型鏈球菌天然Μ 蛋白或夕種化學及/或結構性修飾或改變胺基酸序 列的蛋白。 藉由實例，衍化蛋白係包含連同胺基酸側鏈修 飾、非天然胺基酸、糖基化胺基酸殘基、交聯胺基酸 殘基及/或附加胺基酸殘基的一或多種修飾。 本發明所涵蓋之修飾胺基酸側鏈的實例包括例 ❹ 如藉由醋酸酐醯化胺基；以琥珀酸酐和四氫酞酸酐醯 化胺基；以曱基醯亞胺鹽醯胺基化；以氰酸鹽胺幾基 化胺基；以啦哆醛_5_磷酸接著藉由？^3114的還原吡 °多基化離胺酸；藉由與醛的反應接著藉由NaBH4的還 原進行還原性氧化作用；及以2,4,6-三硝基苯磺酸 (TNBS)三硝基苯化胺基的修飾作用。 羧基的修飾可藉由經形成鄰醯基異尿素接著藉 由其後的衍化作用例如變成對應醯胺進行羰二亞胺 的活化作用。 200930401 精胺酸殘基之胍基（guanidine)的修飾可藉由 利用例如2, 3-丁二酮、苯基乙二醛和乙二醛的試劑 形成雜環縮合產物。 疏基的修飾方法可藉由例如利用過甲酸將其氧 化成續基丙胺酸（cysteic acid);利用4-氯汞苯續 酸、4-氯汞苯甲酸、2-氯汞-4-硝基苯酚、苯基氯化 采和其他材料形成汞衍生物；與其他巯基化合物形成 /tt*合一硫化物；與馬來醯亞胺、馬來酐或其他經取代 ❹ 馬來酿亞胺的反應；與蛾醋酸或蛾乙酿胺的竣曱基化 作用，以及與氰酸鹽在驗性pH的胺幾基化作用。 色胺酸殘基的修飾可藉由例如以2-經基—5-硝基 漠化苄酯或磺醯基鹵化物的烷基化吲哚環，或藉由與 N》臭破轴酿亞胺的氧化作用。 酪胺酸殘基的修飾可藉由與四硝基甲烷的硝化 作用而形成3 -硝基酷胺酸衍生物。 ❹ 組胺酸殘基之咪唑環的修飾可藉由與焦碳酸二 乙脂的N-羧基化作用或藉由與碘乙酸衍生物的烷基 化作用。 在胜肽合成過程中併入非天然胺基酸和衍化物 的實例包括但不侷限於使用4-胺基丁酸、6_胺基己 酸、4-胺基-3-羥基-5_苯基戊酸、4胺基_3_羥基_6一 甲基庚酸、第三丁基甘胺酸、正亮胺酸、去甲線胺酸 (norvaline)、苯基甘胺酸、鳥胺酸、肌胺酸、2_噻 吩基丙胺自文及/或胺基酸的D —異構物。 20 200930401 本發明範圍内的衍化物亦包括含有附加胺基酸 :列例如N-或c-端融合蛋白偶配體序列的經分離融 蛋白融a偶配體有助於包含該融合偶配體之融合 蛋白的鑑定及/或純化。 融δ蛋白偶配體的習知實例包括，但不侷限於麩 胱3肽-S-轉移酶(GST)、人類IgG的Fc和欽鍵區、 麥芽糖、’合蛋白(Μβρ)和六聚組胺酸(His6)，其藉由

G 親和層析法特別被用㈣合蛋白的分離。就藉由親和 層析法純化融合蛋白的目的而言，用於親和層析法的 相關基質分別為麩胱苷肽一、直鏈澱粉及鎳或鈷— 共軛樹脂。許多此類基質以，，套組” $式被供應例 如配合（HIS6)融合蛋白偶配體及Pharmacia GST純化 系統的 QIAexpressT«系統（Qiagen)。 在一些例子中，融合蛋白偶配體亦具有蛋白酶剪 刀位點例> Xa因子或凝血酶，其可允許該相關蛋白 酶參與此處所述融合蛋白的消化及因而產生本發明 所述的蛋白。藉由其後的層析分離法可從該融合偶配 體分離該產生的蛋白。 ^，，融合偶配體的範圍亦包括，，抗原決定基標 圮，其通常為可供應特定抗體的短胜肽序列。可輕 易獲得特定單株抗體之胜肽標記的習知實例包括 c-myc、流感病毒凝集素和FUG標記。 本發明的經分離魚型鏈球菌Μ蛋白連同其片 段、變異型和衍化物可被製成重組或化學合成型。 200930401 通常’熟習本領域之技術者可利用技術中習知的 標準方法輕易地製造該重組蛋白。 長度不超過60至80個連續胺基酸的胜肽和其他 蛋白片段最適合利用化學合成法。 在正常培養條件下魚型鏈球菌的Μ蛋白可利用 才示準實驗培養基誘發其表現及至少部分阻止其表 現。因此在細菌細胞培養的過程中可方便地藉由加入 誘發劑而誘發Μ蛋白的表現。可誘發或最大化細菌表 © 現魚型鏈球菌Μ蛋白的非限制性實例為金屬、螯合 劑、血清蛋白及/或其他衍化物。 本發明的一態樣亦包括可結合、辨識及/或對抗 本發明經分離蛋白、片段、變異型或其衍化物的抗 體。抗體亦包括抗體片段例如FC片段、Fab和Fab，2 片段、雙抗體、Fv和scFv片段。抗體可為單株或多 株抗體。可在適當繁殖動物體内製造抗體，例如小白 ❹ 鼠、大鼠、兔、羊、雞或山羊。 或者，抗體可被分離自魚類或在自然環境中曾經 暴露於魚型鏈球菌或其Μ蛋白的其他動物。 單株抗體的製造可藉由標準方法例如述於

Current Protocols in ImmunologyiXQlig^ 專 乂編 輯，John Wiley & Sons· 1 995-2000)及 Harlow，E. & Lane，D.如實驗室手冊（冷泉港c〇ld Spring Harbour，冷泉港實驗室，1988)。此類方法 通常涉及從前述免疫動物取得抗體產生細胞例如脾 22 200930401 臟細胞，及永生化該細胞，例如藉由與永生化融合偶 配體細胞的融合。 几亦可藉由重組方法製造單株抗體或其抗原結合 片#又此類重組方法已為本技術所習知以及可取得各 種市售商品以製造重組抗體。 如同技術中所習知，抗體可被結合至包括選自酵 素蝥光體（fluorophore)、化學發光分子、生物素、 放射性同位素或其他標示物之群組的標示物。 & 用於本發明之適當酵素標示物的實例包括鹼性 磷酸酶、辣根過氧化酶、螢光素酶（luciferase)、点— 半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、溶菌酶、蘋果酸酯脫氫 酶等。該酵素標示物可被單獨使用或結合溶液内的第 二種酵素或與適當的顯色或化學發光基質。 色原質（chromogens)的實例包括但不侷限於二 胺基聯笨胺（DAB)、永固紅（permanent re(j)、3-乙基 》 苯并噻唑啉磺酸（ABTS)、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽 (BCIP)、氮蘭四唑（NBT) 、3,3’ ，5,5’ -四甲基聯苯 胺（TNB)和 4-氣-1-萘酚（4-CN)。 化子發光基質的非限制性實例為Lum i no 1TM，其 在辣根過氧化酶和過氧化氫之下被氧化而形成激發 態產物（3-胺基酞酸酯）。 螢光體可為但不侷限於異硫氰基螢光素 (FITC)、四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC)、別藻藍素 (APC)、德州紅（TR)、Cy5或R-藻紅蛋白（rpe)。 23 200930401 放射線同位素包括但不侷限於mi、U1][、“以和 99Tc。 其他可使用的標示物包括膠體金粒子和毛地黃 配體（digoxigenin)。 、 • 本發明亦提供編碼前述經分離Μ蛋白的經分離 核酸，以及該經分離Μ蛋白的片段、變異型和衍化物。 在特定態樣中，本發明提供一種包含前述任一序 列辨識編號：8至11 # 39之核皆酸序列的經分離核 0酸。特別對於序列辨識編號：11而言，該核苷酸序 列包含殘基1至609和殘基677至16〇6所定義的不 相連開放閱讀框。 此處”核酸”一詞指單—或雙鏈mRMA、RNA、 cRNA、RNAi、siRNA 和 DNA 以及包括 CMA 的 DNA、線 粒體DNA(mtDNA)和基因組DNA。 “多核苷酸”為具有八十（80)或更多個連續核 ❹ 苷酸的核酸’同時”寡核苷酸”則具有少於八十（8〇) 個的連續核苷酸。 表1和表3(序列辨識編號：18〜38)為募核苷酸 的非限制性實例。 本發明亦提供變異型核酸包括同源、直系同源和 突變型核苷酸序列。 在一態樣中’本發明提供與本發明之經分離核酸 比較具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、91 %、92%、93%、94%、95%、96%、96%、98% 或 24 200930401 9 9 %核苷酸序列一致性的變異型核酸。 本發明的變異型核酸在高度嚴格條件下可雜交 本發明的經分離核酸。 嚴格條件已為技術中所習知，例如述於Ausubel 專 k Current Protocols in Molecular Bi〇l〇gy〇Qhn Wiley & Sons 紐約，1995〜2006)的第 2.9 和 2·1〇 章， ' 以及特別指第2. 9. 1至2. 9. 20頁。 通常’嚴格度根據雜交及/或清洗期間的一或多 ❹ 種因素的濃縮而有不同。此類因素包括已為技術中所 習知的離子強度、清潔劑類型及/或濃度、溫度、變 性劑類型及/或濃度。 適用於獲得本發明經分離核酸的高嚴格條件的 特定、非限制實例包括： (i) 以至少釣31% v/v(體積/體積）到至少約 50% v/v的甲醯胺和至少約〇. 〇1 μ(克分子）到至少 ^ 約0· 15 Μ的鹽在42°C進行雜交，及以至少約〇. (π Μ 到至少約0. 15Μ的鹽在42°C進行清洗； (ii) 以 1% BSA、1 mM (毫克分子）的 EDTA、 0. 5M(克分子）的 NaHP〇4(pH 7. 2)、7% SDS 在 65°C 進 行雜交，和（a) 0· 1 X SSC、0. 1% SDS ;或（b) 0. 5 % BSA、1 ιηΜ 的 EDTA、40Mm 的 NaHP〇4(pH 7. 2)、1 % SDS在超過65°C的溫度下清洗約1小時；以及

(iii) 以 0.2xSSC、0.1% SDS 在或高於 68°C 清洗約2 0分鐘。 25 200930401

身又而 5,在 Tm = 69.3 + 0.41(G + c) % -12qC 、/亍π洗 般而δ，錯配驗基數目每增加1 % 則該雙鏈DNA的Tm降低約pc。 因此將瞭解變異型、同源和直系同源的特定實例 匕括仁不侷限於：與任一序列辨識編號：8〜11和 39互補或至少部分互補的核酸；包含將包括任一序 列辨識編號：8至11和39的最佳化密碼子變異型的 密碼子序列重複（redundancy)亦考慮在内的不'同核 ©苷酸序列的核酸；以及任一序列辨識編號：8至i i 和39的天然或等位基因變異型。 本發明亦包括本發明之經分離核酸的片段。 核酸片段”意指本發明經分離核酸之單-或雙 鏈的核酸部分或子序列。該片段包含由至少1 %、2 %、5%、7%、10%、20%、30%、40%、50%、60 %、70%、80%、90%、95%或99%的本發明經分 0 離核酸之連續核芽酸序列所構成。該片段包含至少 6 、 10 、 15 、 20 、 30 、 50 、 80 、 100 、 200 、 300 、 400 、 500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、 1400或1500個本發明經分離核酸之連續核苷酸的連 續核苷酸序列。 核酸片段的非限制性實例為序列辨識編號：11 之殘基1至609和殘基677至1606所定義的開放閱 讀框。 在某些態樣中，該核酸片段可為一引子或一探 26 200930401 針。 引子”通常為單鏈寡核苷酸’較佳為具有9至 的連續核苦酸，係能煉合至互補核酸 ” 及：错由_聚合酶例❿聚合 麗聚合酶或㈣議⑽之模板_依賴性方式延^ 在特定具體實施例中，一引子包含至少1〇、12、 8 20 25、30、35、40、45 或 50 個連續核苷 酸0 ❹ “探針” A可鍊合至與該料至少部分互補的 標的核酸之核苦酸序列的單_或雙鏈寡核㈣或多核 苷酸。 ,探針和引子可被標示以利於偵測。標示物包括技 術中所習知的放射線同位素、包括螢光供體和受體分 子的螢光體以及用於顯色或化學發光偵測的酵素。 “標的”核酸為可被偵測、結合或者藉由本發明 ❹ 的引子或探針進行煉合的任何核酸。 本發明亦提供”差涿祷襄貧邀”，係包含一或多 個本發明之經分離核酸、片段或變異型。 吊被用於此處的”基厲禮赛貧禮，，係一種編碼 本發明經分離Μ蛋白、片段、變異型或衍生物之併入 及/或易使用的人工產生核酸。 在特定具體實施例中，此類構築質體可被用於重 組操作、繁殖、擴增、同源重組及/或表現該經分離 核酸。 27 200930401 此處用於表現蛋白的基因構築質體被稱為，’表 達構築體（〇”，其中該被表現 的經分離核酸可正破地鏈接或連接至表達載體内的 一或多個調節序列。 一”表達載體recior/，可為自體 複製的額外染色體載體例如質粒（plasmid)，或整合 ' 入宿主基因組内的載體。 在本發明的一態樣中’該表達載體為質粒載體。 © “可正確地鏈接”或，’可正確地連接，，意指將 該調節核苷酸序列置於被表現的核酸以啟動、調節或 用於控制該核酸的表現。 調節核苷酸序列通常可在宿主細胞内產生適當 的表現。用於各種宿主細胞的許多類型之適當表達載 體和適合調節序列已為技術中所習知。 一或多種調節核苷酸序列可包括’但不侷限於啟 ❹ 動子序列、前導或信號序列、核糖體結合位點、轉錄 起動和終止序列、轉譯起動和終止序列、剪接供體/ 受體序列和增強子或激活序列。 技術中所習知的組成型或誘生型啟動子係可使 用及包括，例如，四環素可抑制、IpTG誘導、酒精 誘導、酸誘導及/或金屬誘導啟動子。 在一態樣中，該表達載體包含一選擇性標記基 因。選擇性標記可被用於選擇轉化細菌（例如 女和ieM)或轉化哺乳動物細胞（例如潮黴素、 28 200930401 G418和嘌呤黴素）。 用於表現的適合宿主細胞可為原核或真核性，例 如包括但不限於用於桿狀病毒表達系統，或任何各種 哺礼動物或其他動物宿主細胞的魚型鏈球菌、大腸桿 菌（例如DH5)、酵母細胞、sF9細胞。 可將表達載體導入適當宿主細胞的技術包括但 不偈限於已為技術中所習知的電穿透法、熱休克法、 磷酸鈣沈澱法、DEAE葡聚糖介導轉染法、脂質體化 ©轉染法（例如陽性脂質體lipofectin 、 lipofectamine)、原生質融合技術、微注射法或微粒 子轟擊法。 *在特定態樣中，本發明提供用於治療感染魚型鏈 球菌動物的組成物及/或方法。 在特疋恶樣中，本發明提供一種治療感染魚型 鏈球菌動物的方法，該方法的步驟包括將本發明組成 ❹物投予至該動物因而可預防性或治療性地處理該動 物的魚型鏈球菌感染。 在另一特定態樣中，本發明提供一種動物對抗魚 型鏈球菌的免疫方法，該方法的步驟包括將本發明組 成物投予至該動物因而可產生對抗魚型鏈球菌的免 疫力。 本發明之魚型鏈球菌M蛋白或M樣蛋白的一項特 殊特徵為其取自50件經分離樣本的測試中發現僅具 有極低的序列變異。因此，該魚型鏈球菌之&蛋白^ 29 200930401 Μ樣蛋白可被用於誘發許多魚型鏈球菌株的交叉保護 性免疫反應。 ° 本發明之組成物及方法適合被用於任何易感染 魚型鏈球菌的動物包括但不侷限於海豚和魚類。 組成物包含經分離魚型鏈球菌Μ蛋白或其片 •段，結合至魚型鏈球菌Μ蛋白或其片段的抗體；編碼 魚型鏈球菌Μ蛋白或其片段的經分離核酸；及7或被 誘發表現魚型鏈球菌Μ蛋白的減毒或不活化魚型鏈 Ό 球菌。 本發明之組成物可被用於獸醫或醫療用途及包 含一適當載劑、稀釋劑或賦形劑。 ，，在本發明的一態樣中，提供一種，，免疫治療 劑”，係在投予至動物之後在該動物體内可產生、幫 助或誘發對抗魚型鏈球菌的免疫反應。此類組成物可 為疫苗的劑型。 ❹ 可利用任何適合的程序製造該免疫治療組成物 及疫苗。 在一態樣中，本發明提供該動物對抗魚型鏈球菌 感染的被動或主動免疫反應。 提供適當的被動免疫反應係經由投予有效量的 上述抗體或抗體片段。 投予有效量的Μ蛋白或其免疫原性片段可獲得 主動免疫反應。經分離Μ蛋白及其免疫原性片段可為 重組蛋白或化學合成胜肽的形式。 30 200930401 減毒菌苗可被投予至動物，包 例如，減毒菌株可表現—或:類和人類。 菌Μ蛋白或其片段，或被減毒菌株可=魚型鏈球 種内源性的魚型鏈球菌Μ蛋白。誘發表現一或多 細菌之減毒或不活化的方法也 處理等已為技術中所習知。 冑由加熱、化學 ❹ 本發明亦提供編碼一或多種勉八祕Α 蛋白或其片段的核酸疫苗。刀離魚型鏈球菌Μ 此二:：”:，，，’ 一詞在其範圍内包括，，質粒 &田 和 病毋疫备 0 在-態樣中，該核酸疫苗係—種質粒_疫苗。 俗稱的”載劑、稀釋劑或賦形劑，，意指可安全地 被用於投予動物例如魚類或人類的固態或液態充填 劑、稀釋劑或包膜物質。視特定的投藥途徑可使用各 種的载劑已為技術中所習知。這些載劑可被選自包括 糖、瓜粉、纖維素及其衍生物、麥芽糖、凝膠、滑石 粉、硫酸鈣、植物油、合成油、多元醇、褐藻酸、磷 酸鹽緩衝溶液、等張食鹽水、無熱源水、三卡因 (tricaine)、潤濕或乳化劑、填充劑、塗料、黏合劑、 充填劑、分解劑、稀釋劑、潤滑劑、緩衝劑的群組。 就核酸疫苗而言，可裸露輸送該DNA表達載體， 或被藉由但不侷限於陽離子脂質體-DNA複合物、脂 質體、磷酸鈣共沈澱法、吸附於微粒子上。 利用其他核苷酸序列可加強投予本發明核酸疫 31 200930401 苗所誘發的免疫反應。 此類其他核苷酸序列的非限制性實例包括具有 未甲基化CpG雙核苷酸的免疫刺激募核苷酸，或編碼 其他抗原性蛋白或佐劑細胞活素的核苷酸序列。該 DNA可存在裸露型或可與有利於細胞吸收的物質（例 如脂質體或陽離子脂質體）被共同投予（動物）。 就免疫治療組成物及疫苗而言，可包含一種佐 劑。 〇 適當佐劑包括但不偈限於表面活性物質例如十 六烷基胺、十八烷基胺、十八烷基胺基酸酯、溶血印 磷脂（lysolecithin)、溴化二甲基雙十八烷基銨、 N，N-雙十八烧基-N’，N'雙（2-經乙基丙二胺）、甲氧基 十六炫基甘油和聚合乙烯多元醇；聚胺例如吡喃、硫 酸葡聚糖、聚IC carbopol ;胜肽例如胞壁醯二肽及 衍生物、一曱基甘胺酸、促吞嗟素（t u f t s i η);油性 乳劑，及礦物凝膠例如填酸銘、氫氧化紹或明釁；淋 巴激素、QuilA和免疫刺激複合物（ISC0MS)。 組成物或疫苗的有效劑量視動物的體積和品種 及根據投藥模式而不同。醫生、獸醫或水產養殖專家 可藉由嘗試錯誤法測定該最適劑量。 就魚類而言’疫苗在單一劑量内可包含〇. 至 0.5毫克’較佳為0.025至0.25毫克或更佳為約〇 〇5 至0.2毫克的蛋白。 核酸疫苗的適當劑量範圍可低至皮克或高至毫 32 200930401 克劑置，但通常為每單位劑量從約〇 . 〇丨至i 〇 〇微克， 較佳為0·1至50微克，更佳為約i至25微克，以及 最佳為每單位劑量約5至1 〇微克。 由於疫苗注射可能造成魚類的緊迫反應，因此該 疫苗較佳為以單劑量進行單次疫苗注射。 就注射用疫苗而言，單劑量單位的體積較佳為 0.025至0.5毫升，較佳為〇 〇4至〇 2毫升，更佳 為約0.05至0.1毫升。

、在有關魚類的態樣中，該組成物和疫苗可被製備 成用於注射或浸泡於水中投藥之減毒液態溶液乳劑 或懸浮劑。亦可在投藥前被製備成可溶解或懸浮於液 线劑’或混合於固體飼料内的固態（例如粉末）劑 型。該組成物或疫苗可藉由冷壤乾燥、選擇性冷;東乾 燥而製成可被減菌稀釋劑重構的即用·。例如，可利 用0.9%的生理鹽水（選擇性地附於包裝疫苗產品内） 重構該冷;東乾燥疫苗。 別二具有分子的穩定性及長期壽命，因此特 == 東乾燥。或者，該組成物或疫苗可被置於 二水：液内。液態或重構型疫苗當添加入盆'槽 如1至二泡積 =時可進一步被稀釋於少量的水(例 明的卜可利料㈣或緩釋型投予本發 可選擇該 可考慮使 π 1么吸深 双役苗注 被注射魚類的内源性轉錄調節序列 33 200930401 用内源性細胞活素或肌動蛋白基因啟動子，或衍自魚 類DNA病毒的其他調節序列。用於魚類之DNA疫苗的 非限制性實例已述於美國專利案5, 78〇, 448、美國專 利公開案20050163795、美國專利公開案 20060073167和美國專利公開案20050261227。 ❸ 在有關魚類治療及/或免疫化的具體實施例中， 亦可藉由口服組成物投予該魚類或將該魚類浸泡於 包含免疫原性Μ蛋白或其片段的稀釋組成物内。、 魚口服組成物包含其範圍内的魚飼料及/或補充 劑，係為經分離魚型鏈球菌祕蛋白或其免疫原性片段 的球粒、顆粒、液體、碎片或粉末。 本文中有關魚類的組成物、疫苗、治療及/或免 f法特料用於養魚#、魚苗繁殖場及其他商業化漁 %。然而’本發明亦可被用於魚型鍵球菌感染原生或 ο 其他野生魚類族群造成不良影響之野生魚類族群的 保育。 在某些態樣中，本發明提供用於治療除了备類外 之動物之魚型鏈球菌感染的組成物及/或方法’。、 在一特定態樣中，本發明提供用於治療人類㈣ 鍵球菌感染的組成物及/或方法。 就人類而言，可根據人類的年齡、體種、性別和 —般身體狀況憑經驗計算投藥劑量。 為〇 = 每7〇公斤體重的蛋白質有效劑量 *、、、 . 1至1毫克，或較佳為約0. 3至〇· 5毫克。 34 200930401 本發明可利用任何適當的投藥途徑投予人類患 二例如口服、直腸、腸道外、舌下、頰内、靜脈内、 關郎内、肌肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、 大腦腦室内、經皮等。 . 可用的劑型包括錠劑、分散劑、懸浮劑、注射劑、 溶劑：糖漿、喉錠、膠囊、栓劑、噴霧劑、經皮貼片 等這些劑型亦包括用於此目的的注射或植入式控釋 裝置或用於此目的之經改良的其他形式植入物。其可 藉由包覆以產生控釋效果，例如藉由疏水性聚合物包 括丙烯酸樹脂、蠟、高級脂族醇、聚醋酸和聚乙醇酸 以及某些纖維素衍生物例如羥丙基甲基纖維素。此 外，亦可藉由其他聚合基質、脂質體及/或微球產生 控釋效果。 適合用於口服或腸道外投藥的本發明組成物可 利用各含有預設量之本發明一或多種治療劑如粉末 ❹ 或顆粒或水性液體、非水性液體、水包油乳液或油包 水液態乳液内之溶劑或懸浮劑的分散單位例如膠 囊、樂包或鍵劑。 製備適合用於投予人類之組成物和疫苗的程序 述於如新世代疫苗（1997年’ Levine等人，Marcel Dekker公司，紐約、巴塞爾、香港）的實例。 本發明的組成物和疫苗可利用減毒細菌疫苗的 形式被投予至人類，該細菌可表現一或多種重組魚型 鍵球菌Μ蛋白或其片段。減毒細菌的非限制性實例包 35 200930401 括沙門氏桿菌屬例如腸炎沙門氏菌變種、鼠傷寒沙門 氏菌或傷寒沙門氏菌。或者，可使用減毒型的其他腸 道病原菌例如志賀菌屬或大腸桿菌。減毒沙門桿菌株 的構建可藉由在芳族胺基酸生合成徑路内不活化美 因（Alderton 等人，/以’狀 35 435)、在芳 族胺基酸生合成徑路内（例如述於美國專利= 5’770,214)或在其他基因例如力内（例如述於^ ❹ 國專利案5, 980, 907)或在編碼外膜蛋白例如〇句^内 (例如述於美國專利案5, 851，519)藉由將突變株導入 兩種基因。 或者，減毒細菌疫苗包括可誘發表現—或多種内 源性魚型鏈球菌M蛋白或其片段的魚型鏈球菌。 人類組成物及疫苗可進一步包含一載體。 ❹ 載體的非限制性實例包括甲狀腺球蛋白；白蛋白 例如人血清白蛋白、毒素、類毒素或來自破傷風、白 、=日咳、饭單胞菌、大腸桿菌、葡萄球菌和鍵球 _之毒素的任何突變交又反應物質（CRM);聚胺基酸 :如聚⑽胺酸：聚麵胺酸）；流行性感冒；輪狀病毒 ，細小病毒VP1和VP2 ;肝炎B病毒核心蛋白· 病毒重組疫苗等。或者，可使用—載體蛋白或 Μ直ί疫原蛋白的片段或抗原表位。例如，可使用細 、類I素或CRM的T細胞抗原表位。 在人類中，可投予結合連同病原性細菌如流感嗜 桿菌和其他嗜血桿菌屬、卡他微球菌 36 200930401 、淋病雙球菌、大腸桿菌、肺炎鏈球菌 等在内之夕彳貝型生物抗原的本發明組成物及/或疫 苗。 在其他特定態樣中’本發明提供偵測動物内之魚 型鏈球菌感染的診斷方法。 ,在一 樣中，本發明提供一種測定動物是否已或 '曾經暴露於魚型鏈球菌或其成分的方法，該方法的步 驟包括測定獲得自該動物的生物樣本是否包含經分 ©離魚型鏈球菌Μ蛋白或片段、變異型或其衍化物，其 中若存在§亥經分離魚型鏈球菌Μ蛋白或片段、變異型 或其衍化物時表示該動物已或曾經暴露於魚型鏈球 函或其分子成分。 在另一態樣中，本發明提供一種測定動物是否已 或曾經暴露於魚型鏈球菌或其成分的方法，該方法的 步驟包括測定獲得自該動物的生物樣本是否包含本 ❹么明之經分離核酸，其中若存在該經分離核酸時表示 «亥動物已或曾經暴露於魚型鏈球菌或其分子成分。 在又另一態樣中，本發明提供一種測定動物是否 已或曾經暴露於魚型鍵球菌或其成分的方法，該方法 的步驟包括測定獲得自該動物的生物樣本是否包含 結合經分離魚型鏈球菌Μ蛋白或其片段的抗體或抗 體片段，其中若存在該抗體或抗體片段時表示該動物 已或曾經暴露於魚型鏈球菌或其分子成分。 37 200930401 本發明亦提供用於偵測魚型鏈球菌、其分子成分 或結合本發明Μ蛋白或其片段之抗體的診斷套組及/ 或診斷組成物。 Ο 診斷套組及/或組成物適合用於核酸或蛋白式偵 測法以及包含一或多種診斷劑，例如一或多種抗體、 Μ蛋白或其片段、核酸探針及/或引子以便於偵測生 '物樣本内對抗魚型鏈球菌Μ蛋白之抗體、編碼核酸及 /或其片段的魚型鏈球菌Μ蛋白。 可利用技術中習知的技術偵測核酸，包括但不侷 限於北方雜交分析法、南方雜交分析法、核替酸序列 擴增法、核酸陣列雜交法、弓i子延伸產物的質譜法、 DNA定序等。 β π β Ρ夕Π方法的步驟可進—步包括編碼核酸或其片 又之…线球菌Μ蛋白的核苷酸序列擴增法。 ❹ 合酶鏈ί庳(I:序列擴增技術”包括但不侷限於聚 CR)，鏈取代擴增法（SDA) ·，滾輪式擴妗 法（RCR);如實例所、+.展輸式擴增 it # St M ^ ^ ^ a的核酸序列基增幅法（NASBA); 旋酶依賴擴增法。句複製酶擴增法；以及解 PCR 〇 〃 t施例中’該核苷酸序列擴增技術為 因此’在—特定 核酸序列擴增法其步2實施例中’本發明提供一種 八’驟匕括利用熱穩定DNA聚合酶 38 200930401 二ic子以擴增動物核酸樣本内編碼本發明 核成其片段的魚型鏈球菌Μ蛋白。 可用於診斷之PCR引子的非限制實例被列舉於 L丨二而’將可輕易地瞭解技術者可根據前述任- 和製Ί編號.8至11的一或多種核苷酸序列設計 和製化其他的PCR引子。 ❹ 利用標示與任一序列辨識編號：8 腿探針可輕易地谓測出⑽擴增產物。 補的 因此，本發明係指一種診斷套組，其包含： (a)-或多種單鏈DNA引子，係能煉合 型鏈球菌Μ蛋白之核酸或其片段；以及I、 ()DNA探針’係能雜合擴增自編碼核酸 &之魚型鏈球蛋白的—或多種pcR擴增產物。 ο 該套組可進一步包含一種熱穩定嶋聚合酶。 白式=亦係關於經分離魚型鍵球…白的蛋 式：此處所述的抗體或抗㈣段可執行該蛋白 可使用的適當方法為但不揭限於免疫墨點法 疫沈殿法、ELISA、蛋白f陣㈣、免 法、質谱法、蛋白質定序法、放射免疫測定 法和放射性配體結合法。 夂 因此，本發明係關於-種診斷套組，其包含： (a )能結合經分離μ |占士、廿，』 蛋白或其片段的抗體或抗體 39 200930401 片段； (b)便於偵測結合至該經分離μ蛋白或其片段之 抗體或抗體片段的一或多種偵測試劑。 偵測試劑可包括標示用於顯色、螢光測定或冷光 偵測的次級抗體及一適當基質。 或者，可直接標不能結合經分離魚型鏈球菌Μ蛋 白或其片段的該抗體或抗體片段。 抗體標示物的非限制性實例已述於上文。 其亦可偵測動物反應魚型鏈球菌感染所產生的 抗體以作為該動物是否已或曾經暴露於魚型鏈球菌 或其分子成分的指標。 利用任何上述的蛋白質偵測法例如ELISA和免 疫墨點法可偵測是否存在此類抗體。 就診斷的目的而言，取自魚類或其他動物的合適 生物樣本為血液或例如取自腎、脾臟、心臟、腦、肌 肉或其他組織的檢體樣本。 因而熟練技術者在參考下列的非限制性實例之 後可更易於瞭解本發明及使其被實際應用。 【實施方式】 魚型鏈球菌Μ蛋白的分離及定性 實驗方法 魚型鏈球菌株及培養條件 此試驗中係使用取自感染魚（金目鱸魚）的獸醫 實驗室分離之魚型鏈球菌。將儲存於-80 °c的20%甘 200930401 油内菌株於含有5%去纖維羊血的哥倫比亞瓊脂基礎 培養基上在37°C培養隔夜。 重組DNA技術 利用酵素溶解法從新鮮成長細胞萃取魚型鏈球 菌基因組 DNA (Pruksakorn 等人 ’ 2000，/. 67/从 人 38:125)。 魚型鏈球菌emm-樣（Sim)基因及選殖的PCR擴增法 各50微升PCR試管内含有5微升的1〇χ 7Y力加 ❹ 緩衝劑、1微升的NTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP分 別為4 x 2.5毫克分子；澳洲Biotech國際公司）、 2〇〇奈克的ALL MF和ALL MR引子（表1)、〇·5單位 的巧Λ加DNA聚合酶（澳洲Biotech國際公司）、3微 升25毫克分子的氣化鎂，及以滅菌MilH Q水使其 達到平衡。熱循環參數於艾本德螢光定量梯度pcR儀 (德國漢堡，Eppend〇rf公司）内在94。^變性2分鐘， 〇 =著在5(rc進行1分鐘的35次循環，在72。(：進行2 :鐘，及在94°C進行15秒伴隨在5(TC進行1分鐘的 最後延長循環和在72〇C進行10分鐘。獲得的pCR產 物以作為電泳緩衝液之lx TAE内含0.5微升10毫克 /亳升溴乙錠溶液的1%重量/體積瓊脂凝膠上進行顯 影電泳。 :該凝膠切下所欲的電泳帶及以瓊脂 乂％取套組（韓國Intr〇n科技公司）進行瓊脂的萃 。利用市售套組（澳洲Melb〇urne市，Invitr〇gen 41 200930401 公司）藉由選殖將純化PCR產物連接入pCR4_T〇p〇。 用於選殖試驗内的勝任細胞（T〇p 1〇;澳洲Melb〇urne 市）在補充以100微克/毫升安比西林的

Luria-Bertani 凝膠（澳洲 castle Hili 市 sigma 公 司；LB凝膠）上進行培養。將x_gal (2〇毫克/毫升 的40微升）散佈於LB瓊脂平板上以分辨藍白色。將 選殖株在37°C培養隔夜。利用可拋式滅菌接種環挑 取選殖株及塗抹於LB|脂上。這些已確認的白色選

❹殖株亦可被用於藉由直接裂解PCR的篩檢及被儲存。 選殖和定序的直接裂解pCR 以上述相同反應條件將該反應溶液體積按比例 減少至25微升。利用質粒_特異性引子sp6和T7(表 1)擴增s/π嵌入基因。以瓊脂凝膠電泳法測定具有嵌 入基因的選殖株，然後利用市售套組根據製造商（澳 洲Melbourne市，Invitr〇gen公司）指示的質粒引子 ❹SP6和T7(表1)定序法進行質粒的萃取。心基因全 長的定序係由表1的SIM引子協助初始化。 基因組步移和sim基因多樣性 根據製造商的指示（基因組步移套組，加州 Mmmtain View市，cl〇ntech公司）藉由基因組步移 技術獲得以瓜基因的上游和下游序列。用於$“基因 上游之基因組步移的基因特異性引子為SIM翳和sim W^R(表1)及SIM WF和腳（表υ。凝膠純化獲 得的PCR產物及連接入τ〇ρ〇載體pcRn (澳洲 42 200930401

Melbourne市’ lnvitrogen公司）。在重組選殖株上 以SP6和T7引子進行定序。此可從其他菌株設計出 用於擴增57瓜基因和周圍間隔區[利用上述相同反應 組分濃度’但以65°C煉合溫度及使用校對引子STAR DNA聚合酶（曰本，shi ga市，Takara公司）以減少可 能的併入錯誤]的引子（PRE SIM和POST SIM ;表1) • 以檢查基因的多樣性。該PRE SIM引子係位於多 基因調節基因（zz^rj)且包括在擴增子（ampl icons)的 〇 取7"’基因的最初36個核苷酸，而p〇ST SIM引子内 可擴增公認亞碲酸鹽/毒素陰離子抗性基因（化7乃的 最後75個核苷酸。這些pcr產物以下列引子直接定 序·· PRE SIM、SIM R、SIM 2R、SIM F、SIM 2F、SIM 3F、SIM W2R 和 POST SIM(表 1)。此外，利用引子 M141 F和SIM3 F RC係用來產生來自分離菌qMA〇141的序 列資料。 Μ樣蛋白的表現 Μ樣蛋白係根據製造商的指示利用champi〇n ΡΕΤ 系統（澳洲Melbourne市invitrogen公司； pETlOl/D-TOPO)表現及表現於大腸桿菌BL21 Star(DE3)單次注射化學勝任細胞（澳洲Meibourne 市；Invitrogen公司）。根據製造商的指示表現代表 不同的回復的 sim sequevars (A Sequevar includes the strain or strains with a given se(luence.)。 不同的幻游基因QMA0072，QMA0076和QMA0141的代 43 200930401 表性分離（片段）係表現如蛋白。 織維蛋白原結合試驗 利用EZ-鏈接硫—NHS生物素化套組（伊利諾州 Rockford市，Pierce公司）標示人類纖維蛋白原 = castleHill市，Sigma公司）。利用微離心 官柱（澳洲North Ryde市，GE Healthcare生物科技 公司）移除未併入的生物素。將SDS pAGE分離的 IPTG-誘導細胞溶解物係墨潰於pv])F膜上和利用卵 ❹白素-鹼性磷酸酶（伊利諾州Rockford市，pierce公 司）進行偵測以及利用丨―階段NBT_BCIp(伊利諾州

Rockford 市，Pierce 公司）呈色。 頭腎和腹膜細胞的分離 收集酪蛋白刺激腹腔所產生的巨噬細胞，如前述 方法進行純化和維持（D〇 Vale等人，2002)。簡言之， 就腹膜的刺激而言，根據製造商的指示以Aqui-S (澳 〇 '州Wllst〇n市，Aquatic診斷服務中心）麻醉金目鱸 魚Uaies 克），然後在收獲巨噬細 胞24小時之前將丨毫升的12%酪蛋白（於磷酸鹽緩 衝液PBS内滅菌）注射入腹腔。在分離腹腔巨噬細胞 之前’以過量Aqui-S麻醉魚然後藉由切斷腹大動脈 進行放血。利用25G針頭的注射筒將含2%胎牛血清 (澳洲 Melbourne 市 Invitrogen 公司；FBS)、1% 青 黴素/鏈黴素（P/S)(澳洲Melbourne市； Invi trogen 公司）和10微克毫升-ι肝素（澳洲Castie Hill市； 200930401

Sigma公司）的等量（5毫升）L-15介質無菌注射入腹 腔内。將體腔按摩30秒使介質分散然後利用19G針 筒在避免流血之下小心地抽出含白血球的灌洗液。然 後將腹膜細胞懸浮液置於Percoli非連續（34%/51 % )密度梯度上及在4°C的450克離心25分鐘。收集 其中間接觸帶及以含1% FBS和1%青黴素/鏈黴素 ’ （P/S)的L-15介質清洗兩次。藉由錐蟲藍排除法測定 活細胞的濃度。於含1% FBS和1% P/S之L-15介 © 質内以1 〇7個細胞亳升_1的濃度將該細胞接種入微滴 定盤内。使細胞族群在28°c黏附2小時然後以L-15 清洗兩次以移除未附著細胞。將黏附細胞在28°C維 持於含1% FBS和1% p/s的L-15介質内。就本發 明的檢測而言’使用2 4小時的培養。 魯米諾-擴增化學發光的誘導 此試驗係使用魚型鏈球菌株QMA0072、QMA0076 Θ 和QMA014卜在37°C將0D6(m) 1.5的各菌株於PBS内5 微克毫升1 BSA或PBS内5微克毫升_1纖維蛋白原的 PBS預培養30分鐘（Welch，1980)。以HBSS將該細 胞清洗兩次然後懸浮於HBSS内。 利用經改良的上述方法（N i koske 1 a inen等人， 2005)測定吞噬作用後頭腎細胞的氧化殺菌 (respiratory burst)能力。簡言之，以未處理或經 100感染倍率（Μ0Ι)(細菌/噬菌體比為1 : 100)的魚型 鏈球菌處理法刺激一天齡的頭腎細胞。藉由將30微 45 200930401

升的所需細菌懸浮液加入微滴定盤内的巨嗟細胞（每 孔1 X 105個細胞）啟動其氧化殺菌能力。各孔内亦 加入pH 9. 0之〇· 2克分子硼酸鹽緩衝液和PH 7. 4之 280微升HBSS内含10毫克分子魯米諾的1〇微升溶 液而使其終體積為300微升。在27°C下每3分鐘於 發光光度計/螢光光度計（德國〇ffenberg市BMG

Labtech 公司；BMG Fluostar Optima)内測定 3 小時 的化學發光（CL)光度。 ❹結果 第1圖為編碼核苷酸序列（序列辨識編號：8)的 魚型鏈球菌株QMA72 Μ蛋白。 第2圖為編碼核苷酸序列（序列辨識編號：9)的 魚型鏈球菌株QMA76 Μ蛋白。 第3圖為編碼核普酸序列（序列辨識編號：1 〇 ) 的魚型鏈球菌株QMA141 Μ蛋白。 ❹第4圖為編碼核苷酸序列（序列辨識編號：丨丨）、 Ν-端片段胺基酸序列（序列辨識編號：6)和c_端片段 胺基酸序列（序列辨識編號：7)的魚型鏈球菌株 QMA136 Μ 蛋白。 第5圖為QMA72 Μ蛋白胺基酸序列（序列辨識編 號：3)、QMA76 Μ蛋白胺基酸序列（序列辨識編號： 4)和QMA141 Μ蛋白胺基酸序列（序列辨識編號广5) 的比對。 第6圖為與基因產物的比對。 46 200930401 第7圖為具有5，和3’端不飽和核苷酸序列和 編碼Μ蛋白的魚型鏈球菌“Μ基因序列（序列辨識編 被· 3 9) 〇 利用ALL Μ引子對（表1)可定序全長的Μ— //7/处 e獅-like)基因。由於該 ALL· Μ引子對係將人造核苷酸（間隔區和在5’端的編碼 胺基酸ΜΑ以及在3，端的KrkeEN(序列辨識編號：13)) 引導至最初的推導序列，因此為基因組步移而設計的 © 引子係用於測定基因最末5’和3，端核苷酸的真實 序列。在大部分菌株中該的全長基因係編碼52 j 個胺基酸蛋白的1566個鹼基對（第4圖），然而，用 於分離菌QMA0 072的蛋白已嵌入一個胺基酸，以及用 於分離菌QMA014K被所編碼）的5·^基因為579 個胺基酸（表2)。用於分離菌qma〇〇72、QMA0076和 QMA0141之蛋白（具有單一胜肽）的各自分子質量分別 ❹ 為57589、57467和63667道耳頓。成熟蛋白分別具 有53416、53303和59446道耳頓的分子質量。其被 改變至編碼KRKEEEC序列辨識編號：14)之3，端核苦 酸序列的胺基酸序列。 具有序列AAGGAG (序列辨識編號：15)的一可能 核糖體結合位點已發現11個基因之起始轉錄上 游的11個驗基（第7圖）。具有45個核苷酸長度的一 公認Mgx結合位點已發現具有一極類似發現於gas内 <?颜和基因之啟動區的識別部位（第7圖 47 200930401 魚型鏈球菌内sim基因的多樣性 QMA0076菌株的基因定序顯示其係不同於來 自化膿鏈球菌、豬鏈球菌、馬鏈球菌亞種、壞乳鏈球 菌（父办叹和乳房鏈球菌（叉的其 他已知Μ和Μ樣蛋白型。來自魚型鏈球菌的不同類型 •s/i基因產物與其來自壞乳鏈球菌^基因產物之 最接近相符副本的序列比對示於第6圖。藉由利用該 PRE SIM和POST SIM的引子對，預期可產生2048個 〇 鹼基對的PCR產物。此為來自已測試的50件分離樣 本中大部分最常見的PCR產物。就具有基因内 插入片段的QMA00 72分離片段而言，一個pcr產物可 產生2051個鹼基對。QMA0141可產生2180個鹼基對 的更大產物。除了插入三個核苷酸（1胺基酸殘基）之 外用於分離菌QMA0076和QMA0072的核苷酸和胺基酸 序列為相同。全部分離片段的基因的兩邊係具 ❹ 有相同長度之基因間的間隔區。最大歧異之用於分離 菌QMA0141的基因序列在初35個殘基具有1〇〇%胺 基酸殘基一致性（identity)以及在初41個殘基具有 100%類似性（similarity)。此亦證實該被切斷信號 序列的理論位置可產生該成熟的Μ蛋白（第7圖）。此 基因約較s/d基因以及s/历万大1 〇%。因此，全部 的分離試驗呈現出相同的基因結構。 Μ蛋白序列分析 取自分離菌QMA0 076的大部分的Μ蛋白型Ν-端 48 200930401 具有一可能信號序列剪切位點，該剪切位點係介於胺 基酸41和42之間且產生〜53仟道耳頓分子質量之 480個胺基酸成熟蛋白（第6圖）。就分離菌qma〇14i 而言，該信號肽鏈剪切位點亦係位於產生具有〜59仟 道耳頓分子質量之538個殘基的成熟蛋白的胺基酸 41和42之間（第6圖）。在全部M蛋白的c端内為保 守革蘭氏陽性細胞壁錨定基序LPSTG(序列辨識編 號· 16，Vasi 等人 2000，//7/ecf /胸_· 68 294)。 ❹該Μ蛋白型的N-端區具有極類似的信號肽鏈，但成 熟蛋白的初殘基則明顯不同於同時在該蛋白c端的 间度保寸區。此表示在暴露該蛋白Ν端部分時將產生 選擇壓力。 藉由用於为離菌QMA〇〇76之Garnier演算法 (Garnier 以 3人，1978，J Mol Bi〇l 120 97)的分 析預測77. 2%的蛋白為α _螺旋。就分離菌qma〇〇72 ◎ 和QMA0141而言，其M蛋白的預測值分別為77. 1% 和 77. 4%。 藉由視窗長度28之COIL程式（Lupas等人，1991， Science 252 1162 ； Lupas, 1996, Methods Enzymol 266 513)的分析，預測了來自分離菌QM〇〇76 (具有 信號序列）的蛋白具有兩條捲曲螺旋片段，各片段來 自殘基79至174和181至454的概率為1 〇〇。此結 果類似於上文中Vasi等人所鑑定壞乳鏈球菌之M樣 蛋白。在七肽重複區域（heptad repeats)内藉由加權 49 200930401 第一和第四殘基時可獲得殘基91至449的概 1.00。同理，來自分離菌QMA0072的殘基79至 和196至455獲兩條捲曲螺旋片段的預測中，各 各具有1.00的概率。 又 在七肽重複區域中加權第一和第四殘基可預 來自殘基91至186和213至450的兩條片段具有J 〇〇 的概率。 來自分離菌QMA0141的Μ蛋白顯示來自具有加權 ©七肽之殘基154至512的捲曲螺旋（c〇Ued c〇n)構 造的概率為1.00,當使用未加權七狀時則為在殘基 151至231和238至512的捲曲螺旋。 土 表達Μ蛋白和蛋白片段的pAGE分析 藉由非還原表達蛋白之SDS-PAGE的分析（第8圖） 顯示存在與含於對照大腸桿菌裂解液内不同的電泳 帶。主要蛋白質帶出現在來自〜23〇仔道耳顿的分離 &菌QMA072和qMA076，但分離菌QMA〇141則否。使用 西方墨點法從這些裂解液偵測纖維蛋白原結合蛋白。 藉由表達Μ蛋白的織維蛋白原結合 接在大腸桿菌裂解液之表現蛋白的西方墨點法 内的卵白素（streptavidin)偵測後的生物素化纖維 蛋白原結合，顯示該來自分離菌qma〇〇72和qma〇〇76 的Μ蛋白，如預期地在〜23〇仟道耳頓和〜57仟道耳頓 出現單聚體和四聚體複合物（僅含qma〇〇?2和 QMA0076)。其他種類的M蛋白已曾發現可形成該四聚 50 200930401 體型（Meehan 等人 1998，144 993) 〇 來自分離菌QMA0141在〜64仟道耳頓的Μ蛋白未出現 強於來自分離菌QMA0072和QMA0076的纖維蛋白原帶 (第8圖）。 表現自分離菌QMA01 36(202胺基酸序列辨識編 號：6和309胺基酸序列辨識編號：7)的兩種胜肽未 結合至纖維蛋白原（未顯示資料）。與分離菌QMA76比 較可能發生纖維蛋白原結合的區域係在具有其各自 ❹插入序列之區域的兩種基因型（72和136)(請看第5 圖）。這些插入物發生在胺基酸殘基19〇至22〇之間 的蛋白。 織維蛋白原結合對活化紅目鱸魚腹腔白血球的效應 為探究纖維蛋白原在結合魚型鏈球菌M蛋白上 所扮演的角色而測定纖維蛋白原内預培養魚型鏈 菌QMA0072在吞噬作用上的效應以及腹腔白血球的 ❾呼吸爆（resPirat〇ry burst)作用。纖維蛋白原在衅 合QMA0072之後當與相同濃度BSA或單獨服預培: 之對照組（第9圖）比動=B主日日& ^ ° u J比菽日守明顯地可降低其後紅目鱸 魚腹腔白血球之吞噬作用所誘發的呼吸爆。 討論 已描述來自魚型鏈球菌的基因和相鄰基因。藉由 表現於大腸桿菌之來自备刑 符田 曰，、、、生鏈球菌重組Μ蛋白的西 方墨點法’可證明來自八触玆4 Λ 术自刀離菌QMA0076的Μ蛋白可仕 合最多的纖維蛋白原，而八雜姑、·ό τ 而刀離菌QMA0072 (其具有一 51 200930401 ❹ 個嵌入胺基酸）則結合極少的纖維蛋白原。來自分離 菌QMA0141的Μ蛋白在轉移至pVDF膜之後結合極少 的纖維蛋白原。已觀察到分離菌qMA〇〇72相對分離菌 QMA0076的表現蛋白稍微降低其與纖維蛋白原的結合 此力，其可旎歸因於螺旋間區（在第二螺旋區）後插入 一個殘基而干擾了該螺旋的最適結合能力。有意思的 是必需指出不論大小或分散度，全部魚型鍵球菌的m 蛋白序列（除了 QMM36的C-端片段）均含有連接該兩 個螺旋的胜肽序列HEA丨RSAGLE (序列辨識編號：丨7 )。 纖維蛋白原之結合能力的差異可能因此歸因於此胜 肽序列任-端螺旋區内的序列差異。保留此胜 J在血液成分例如免疫球蛋白的結合上具有關鍵角 ^ Geyer ^ FEMS I^unol Med Micr〇biol η ο 及i仙需要進一步探究此胜狀序列在結合纖維蛋白原 及其他血液成分中所扮演的角色。 由於已發現纖維蛋白原在結合馬 :白之後具有〜230仟道耳頓的明顯分子 = =體聚集物的能力可能亦歸因於螺二 =需指出具有更大分子量之分有:： 白原或形成聚合地結合纖維蛋 力。 、二蛋白亦不影響與其結合的能 52 200930401 已顯示促成鏈球菌屬之毒力的Μ蛋白家族成員 具有結合除了纖維蛋白原外之血液成分的能力，以及 扮演對抗吞噬作用的角色（Podbielski等人1 996, 19 429 ; Meehan 等人 1998，如上文； Thern 等人 1998，/ 160 860 ; Meehan 等人 2000a，Zeii 190 317 ; Meehan 等 • 人 2000b，146 1 187; Meehan 等人 2001， Microbiology 147: 3311; Courtney 等人 2006， 〇 59 : 936)。本發明的結果證明此觀察，顯 示魚型鏈球菌結合纖維蛋白原可減少吞噬作用及造 成其後在魚巨噬細胞内的呼吸爆活性。此外，一較早 期試驗顯示具有類似此處試驗報導之表觀分子量的 蛋白能在反方向（即藉由Fc區域）結合鱒魚的免疫球 蛋白（Barnes 等人 2003, /Vs/? 15 425)。該Μ蛋白為GAS内的主要毒力因子及候選 疫苗（Hu 等人 2002，/歷"/? 70 21 71 ; Batzlof f ❹ 等人 2006，233 ; Olive, 20 07， 办/刀 #〇/ 77?e/· 9 25 ; Shaila 等人 2007，Vaccine 25 3567)以及進一步的工作為根據這些有趣的蛋白探究 疫苗對抗養殖魚類之魚型鏈球菌感染的潛力。 重組魚型鏈球菌Μ蛋白和DNA疫苗構體的免疫接種 實驗步驟 實驗動物及養殖 從澳洲昆士蘭Caloundra市的Ecof ish Pty有限 53 200930401 A司取彳于平均體重12克的紅目驢稚魚。在含製備自 海鹽（Ocean Nature, Aquasonic，NSW)和 R〇 過濾水 之250升鹹水（51)1)1;)的5隻3〇〇升食品級圓形塑膠桶 内每桶放置80條魚。將八隻塑膠桶連接至具有兩只 生化過濾器和蛋白分液器之500升魚缸的大型循環 系、.先各隻水桶藉由獨立連接至再循環栗之電源的壓 縮機供應氧氣。水以每小時18〇〇升的速度進行再循 %及在放入魚的4週前按裝生物過濾器。魚在接種之 ❿前環境適應14天及在早上6點和晚上6點每天儀飼 兩次市售顆粒飼料（澳洲昆士蘭Narangba市，Ridiey 水產飼料，紅目鱸4毫米懸浮式）。需要時每週約換 水（200升）兩次。試驗期間每天維持約12小時的日 照時間。每天記錄水溫及經由水族室空調維持在29 土 i°c。利用市售套組（Aquasonic，NSW)每天檢測氨、一 亞確酸鹽和确酸鹽，以及取5毫升水樣本和在實驗室 〇 pH計上記錄其酸鹼度（pH值）。 疫苗的製備 檢測兩種疫苗：一為重組疫苗及另一為dna疫 苗。各疫苗内使用的基因為衍生自編碼s i M蛋白之备 型鍵球菌的5/见4、如ann笪Α 、 如1&11〇等人2008年所述的毒 子該基因為PCR擴增自魚型鏈球菌株 QMA0076，其容納來白&+^ ® # ,.具合内來自魚型鏈球菌全球調查分離株的 要基因型及用於製備該兩種疫苗。 重組蛋白疫苗 54 200930401

SiM重組蛋白被製造以做為紅目鱸魚的疫苗接種 用，其係藉由以引子ESIM 20F和ESIM 1542R(表3) 和利用以表現於大腸桿菌BL21 Star(DE3)的

Champion pET 系、統（澳洲 Melbourne 市 invitr〇gen 么司，ρΕΤΙ01 /D-Τ0Ρ0)選瘦該基因而產生。根 據製造商的指示注射一劑化學勝任細胞（澳洲 * Melbourne市；Invitrogen公司）。簡言之，將正方 向含插入序列的選殖株在3rc於10毫升LB肉汁+ ❹ 100微克/毫升安比西林内培養隔夜。先將1毫升接 種入37C之100毫升LB肉汁+ 1〇〇微克/毫升内及於 180 rpm振盪培養4小時，然後在相同條件下以i毫 克分子IPTG(終濃度）誘發3小時。在4°C下收集細胞 及在冰上於0.5%(體積/體積）終濃度福馬林（37%) 内固定’然後在4°C下培養24小時。在再懸浮於PBS 内以進行腹腔注射之前先粒化細胞及於PBS内清洗 & 兩次。以相同方法利用未轉形BL21細胞製備對照疫 苗。 MA疫苗 利用引子VF和VR將主要历基因型插入一 DNA 疫苗載體内，前述引子VF和VR含用於引導選殖入 DNA載體之限制位點。以如π#/和&//消化該載體 和PCR產物。該構築體被連接及轉形入Τ0Ρ10細胞（澳 洲Melbourne市；Invi trogen公司）。將具有正方向 (以定序決定）插入序列的選殖株在37°C於400毫升 55 200930401 LB肉汁+ 50微克/毫升康黴素内培養隔夜及在ι5〇 rPm下振盪。收集細胞及利用QIAGEN高速質粒套組 進行萃取。 福馬林滅菌疫苗 利用菌株QMA01 5 5製備陽性對照疫苗。從儲備液 取出刀離物及在25C的血液壤脂内培養隔夜。將單 一菌落乳化於1毫升植物蛋白脒肉汁培養基（vpB，澳 洲，維多利亞，Thebarton市，〇x〇id)内及使用5〇〇 ❹微升將50毫升VPB接種入250毫升的三角錐形燒瓶 (Erlenmeyer fiask)内。在 25。〇 的振盪（13〇 rpm)下 將其培養18小時。在以每1 〇〇毫升〇. 5毫升濃度之 福馬林（37%)不活化之前，先於冰上迅速將獲得培養 物冷卻至4 C而獲得〇. 2 %的終福馬林濃度。在4。匸 不活化培養物然後在24及48小時之後藉由等量血液 瓊脂上的培養檢查其不活化程度。 Q 魚的接種 在接種之前讓魚飢餓24小時。於含〇. 〇1 % MS222的清潔養殖水内麻醉魚（每接種8〇隻）然後在 緊鄰尾部前端，藉由腹腔内注射100微升疫苗製備物 (重組疫苗和對照），或藉由肌肉内注射5〇微升滅菌 PBS内含5微克DNA疫苗或載體對照，以進行接種。 魚可在被放回桶内之别進行收獲（rec〇ver )。接種組 和對照組被養殖於不同的桶内以使其產生免疫反 應。在接種一天之後魚開始恢復飼育及在挑戰之前於 56 200930401 29°C之下飼養4週。在接種24和48小時之後，安樂 死兩隻DNA接種組的魚及從注射部位割下約5立方毫 米的肌肉。利用市售套組（Qiagen公司）分離RNA及 藉由DNA酵素（DNase)的消化移除DNA。RNA以 superscript ΠΙ反轉錄酶反轉錄RM，以及利用引 子直接對抗e历游基因而進行pcR以檢查其表現。使用 質粒引子檢查S玄RNA的質粒DNA污染以確認該被表現 的em/o基西。 〇 製備攻毒接種物 此試驗為選擇200 6年分離自澳洲新南威爾斯州 (New South Wales)的紅目鱸魚養殖場的魚型鏈球菌 QMA001 55。於含5%去纖維羊血的c〇lumbia瓊脂基 礎培養基在25°C將取自儲備溶液（_8(rc，植物蛋白 脒肉汁内含20%甘油）的分離物培養隔夜。如前所述 藉由乳酸氧化酶基因的PCR確認其一致性。就攻毒接 ❹ 種物的製備而言，從經確認隔夜填脂培養基選取單一 菌落及將其懸浮於1毫升滅菌蛋白脒大豆肉汁培養 基（TSB;澳洲維多利亞州Thebarton市，Oxoid)内。 使用等量樣本（200微升）接種於5〇毫升燒瓶内的2〇 宅升TSB及在25C的輕微振盡（13〇 rpm)下培養18 小時。於滅菌PBS内清洗這些後指數期的培養基及再 懸浮至於600奈米下1.2的光學密度，先前估計其相 當於約5 X 109菌落形成單位（Cfu)/毫升-1。然後將 此懸浮液於PBS内稀釋10倍及立刻被用於攻毒試驗 57 200930401 中。 注射攻毒法 利用手抄網取出桶内的魚及麻醉於〇. 〇 1 % MS222的清潔水族水内。利用配備25G針頭的！毫升 結核菌素針筒以1〇〇微升（5 X 1〇7 CFU)分別注射入 魚腹内。根據其接撞組或對照組（表4)於滅菌PBS内 利用Pan Jet以飽和阿爾新藍（ai ci an b 1 ue)標示。將 ❹ 接種組或對照組各八隻魚於分開檢疫水族房内分置 入連接至獨立EHEIM泵過濾器的160升塑膠桶内而使 每一桶内具有代表性的各接種/對照組。在第一次觀 察時移除死亡或瀕死魚及採頭腎樣本於TSA上。於 TSA平板上培養隔夜之後接著採樣進行/奴基因的直 接裂解PCR以確認死亡原因。 結果分析 利用麥金塔的Prism第四版軟體（加州以叩⑽以 >公司）藉由Kaplan-Meyer存活分析法分析死亡 料。 貝 結果 試驗開始後的第 大在建議攻擊時間前的1 8小 時由於大停電造成循環泵和空調故障而導致許 :窒息而死亡。在恢復供電之後開始將氧氣打入： 。在第1組⑽A疫苗）中有8隻存活、第 =，有18隻存活、第3組⑽…重」 支田* 19隻存活和第4組（NAV载體對照）中有 58 200930401 隻存活。以福馬林殺死同源菌 ,„ . ^ ^和 得画锫之陽性對照的第5組 中無存活魚。存活魚在從緊迫中 η主的★ a繼綠± ^中敗復及重新餵飼一段 時間之後繼續以較少的魚隻進行攻擊。 疫苗效力 攻擊和標記來自各存活細 w ^ ^ 合仔，古組的八隻魚及將其置入 早一桶内。可能時將各租φ沾甘μ丄 -4β 肝谷汲中的其餘存活魚進行攻擊和 才示記及置於第二桶内以提供禎 捉伢複製數據。因此使用的兩 Ο 個桶中，分別含有32隹备Λ丄 男以又魚（四組中各為8隻）（Λ桶） 帛内為23隻魚(第2和4組各為8隻及第3組 為7隻）。從麻醉恢復的全部魚在攻擊後12小時似乎 仍保持健康。最初死亡出現在攻擊後24小時其大部 分沿著腹部表面具有紅色病灶。繼續死亡直至攻擊後 =小時後為止。無進一步死亡被記錄。死亡率的範 為從0至75%並示於第1〇圖。在㈣重組對照 ο 組中具有最高的死亡率’在BL21 _重組疫苗組（於 兩次重複中0%(0/7)和戰2/8))中則具有最低的 死亡率。PUK21A2-WW之DNA疫苗所計算而得的相 對存活率（_為7.76%，同時表現於大腸桿菌内之 重組疫苗的帆為83篇（第心）。 討論

备在攻擊别夜裡雖然有許多魚死亡，但仍救活一些 魚並減少實驗產生的資料。DNA疫苗和重組蛋白疫苗 二、有保遵作用，但以重組蛋白疫苗較優。對照組在 文擊中可達到75%的死亡率，此可能因為係在25〇C 59 200930401 的指數期中製造接種物而非生長在平板上的37它。 毒力效應因子包括英膜和M蛋白係具有溫度依 相變量性質。由於接種和對照組在相同水桶内一起 攻擊，並且對照組之間具有高可重複性以及重組疫苗 •具有強效性能’因此在某種程度上取消低數目的^ _複。重組蛋白疫苗具有83.3%的RPS。若干DM接種 魚表現於接種後24和48小時。 ¢) 已於此處詳述本發明但不得因此推論為本發明 僅侷限於此處所述的任何態樣。此處所述態樣和說明 可作出各種的變化和改良而不偏離本發明的精神和 範圍。 將此處所參照的全部專利和科學文獻、電腦程式 和演算法完整併入於此以供參考。 200930401 表1.引子

引子 序列(5’-3’） 識別碼 ALLMF GGGGGGGGATCCATAAGGAGCATAAAAATGGCT 序列辨識編號：18 ALL MR GGGGGGGAATTCAGCTTAGTTTTCTTCTTTGCG 序列辨識編號：19 SP6 GCTATTTAGGTGACACTATAGAAT 序列辨識編號：20 T7 GTAATACGACTCACTATAGGG 序列辨識編號：21 SIMF AATTAATGAAGCTGGAGTGCTCT 序列辨識編號：22 SIM WF GGGAGGCTTCGCTGACATTTATTTCC 序列辨識編號：23 SIM W3F TACGGCCGTAAACGCAAAGAGGAAGAA 序列辨識編號：24 SIMR GCTTCCACAAGTTTTTCTTTGTCA 序列辨識編號：25 SIM2R GTAGATAGGCTTTGATTTTCACTA 序列辨識編號：26 SIM 2F GATACGCTTCAAAGTTCTTACTAT 序列辨識編號：27 SIM3F GCTGCTAAGATCAACATGCC 序列辨識編號：28 SIM WR ACCTATAATCAGGTTCTAAATTCGTGGC 序列辨識編號：29 SIM W2R GGAAGATGTGTCCATTGTTTGATGAGATG 序列辨識編號：30 PRE SIM TTGTTGGGTGGAAAAAAGATC 序列辨識編號：31 POST SIM AAACTCAGGGACCAAAAAATTG 序列辨識編號：32 SIM3F RC GGCATGTTGATCTTAGCAGC 序列辨識編號：33 M141 F CAAAATGATCACATCAGC 序列辨識編號：34 ESIM 20F CACCATGGCTAAACAAATCAAAGC 序列辨識編號：35 ESIM TTCTTCCTCTTTGCGTTTACGG 序列辨識編號：36 1542R 61 200930401 «•«A^Ilbds s IV ΊΝ ο ο 回蝴 q(％)si-莛媒 „(％)ii«(丨 <垅d-Hsvla f 龙涸 趄荽媒««0!咖#έ§-^涸资敢華秫孤^嫁^^^丨^咖艺备^^客面^^^^涸赛鸾剌，#·^·^ ymjs 6寸 ysfs mulfs 010 8寸 ie (Νε (Νε Φ 6fogl 一寸 lovsa 13SVO9SI 9ΖΌ0νΝα (N3SOC9SI(Nr'ooYsa 絮 φ dlsvllm鳍靼 ％ - e 200930401 表3.用於構建重組蛋白疫苗的引子 引子 序列(5’-3，） ESIM 20F CACCATGGCTAAACAAATCAAAGC 序列辨識編號：35 ESIM 1542R TTCTTCCTCTTTGCGTTTACGG 序列辨識編號：36 VF AAGGATCCATATGGCTAAACAAATCAAAGC 序列辨識編號：37 VR TTGTCGACTTATTCTTCCTCTTTGCGTTTAC 序列辨識編號：38 5 10 表4.攻擊時的疫苗群組和水桶配置 組 疫苗 標不 A桶 B桶 1 pUK21A2 simA (5 咽喉 8 0 2 BL21 star 前胸 8 8 3 BL21 star pET-5/rn^ 後胸 8 7 4 pUK21A2(5 微克） 肛門 8 8 5 QMA0165 死菌 無資料 0 0 63 200930401 【圖式簡單說明】 第1圖係魚型鏈球菌株QMA72 Μ蛋白一編碼核苷 酸序列（序列辨識編號：8) 〇 " 第2圖係魚型鏈球菌株QMA76M蛋白—編碼核苷 酸序列（序列辨識編號：9 第3圖係魚型鏈球菌株QMA141 Μ蛋白—編碼核 皆酸序列（序列辨識編號：1 〇 )。 第4Α圖係魚型鏈球菌株QMA136M蛋白—編碼核 ❹苷酸序列（序列辨識編號：1〇。該核苷酸序列係包^ 分別編碼QMA136 Μ蛋白N-端胺基酸序列（序列辨識 編號：6)和QMA136 Μ蛋白〇端胺基酸序列（序列辨 識編號：7)的不相連開放閱讀框（殘基和殘基 677〜1606) 。 1 第4B圖係魚型鏈球菌株qMA136 μ蛋白N-端胺 基酸序列（序列辨識編號：6)。 ❹第4C圖係魚型鏈球菌株QMA136 Μ蛋白C-端胺 基酸序列（序列辨識編號：7)。 第5圖係魚型鏈球菌Μ蛋白胺基酸序列（序列辨 識編號：3〜7)的胺基酸比對。 第6圖亦係胺基酸序列比對，係取自qMA〇〇72(序 列辨識編號：3)、QMA0076(序列辨識編號：4)和 QMA0141C序列辨識編號：5)與壞乳鏈球菌（叉 办见4)基因產物（CAB65411 ;序列辨識 編號：12)分離物之Μ蛋白。 200930401 第7圖係壞乳鏈球菌基因（序列辨識編號：39 ) 和Μ蛋白（序列辨識編號·· 3)的核苷酸及胺基酸序 列。陰影部分為推定Mgx蛋白；框内為推定啟動子序 列（-10和-35框及核糖體結合位點—RBS—序列）；斜體 為膜錨；粗體為終止密碼子及藉由星號表示。 第8圖係Μ蛋白的表現和西方墨點。a嵌板：取 自大腸桿菌表現溶解物的考馬斯藍染色蛋白。第1 行—分子量標示；第2行一對照溶解物；第3 行一QMA0072 ;第 4 行一QMA0076 ;第 5 行一QMA0141。 B嵌板.具生物素化纖維蛋白原之％蛋白的西方墨點 偵測。第1〜5行對應考馬斯藍染色的各行。 第9圖係纖維蛋白原對藉由魚型鏈球菌活化紅 目鱸巨噬細胞的效應。在對數期收獲的魚型鏈球菌分 離物QMA0072係與纖維蛋白原、BSA或HBSS共同培 養，及係藉由魯米諾（lumin〇1)增強化學發光的氧化 0 殺菌作用來測量。 第ίο圖係魚型鏈球菌疫苗試驗的Kaplan Meyer 存活曲線。 第11圖係根據2次重複（BL21 simA)或單一試驗 (PUK21 simA)之兩種疫苗的相對存活百分比。針對適 當對照組（大腸桿菌虬21或空白pUK21載體）計算立 RPS。 ’、 【主要元件符號說明】 無 65

Claims (1)

1. 200930401 七、申請專利範圍： 1. 一種魚型鏈球菌的經分離Μ蛋白或Μ樣蛋白。 2. 如申請專利範圍第1項所述之魚型鏈球菌的經 分離Μ蛋白或μ樣蛋白，係包含選自由序列辨識編號： 1和序列辨識編號：2所構成群組的胺基酸序列。 3. 如申請專利範圍第1項所述之魚型鏈球菌的經 分離Μ蛋白或μ樣蛋白，係包含根據序列辨識編號：3 或序列辨識編號：4的胺基酸序列。 4. 一種經分離蛋白，係與申請專利範圍第3項所 述之魚型鏈球菌的經分離蛋白比較具有減少或降低 纖維蛋白原結合力，該經分離蛋白包含魚型鏈球菌Μ 蛋白或Μ樣蛋白的胺基酸序列但其不包含選自由序列 辨識編號：1、序列辨識編號：2，以及一或多種序列 辨識編號：3或序列辨識編號：4之殘基190至220所構 成群組的胺基酸序列。 〇 5.如申請專利範圍第4項所述之經分離蛋白，係 包含選自由序列辨識編號：5、序列辨識編號：6和序 列辨識編號：7所構成群組的胺基酸序列。 6· —種經分離蛋白，包含選自由序列辨識編號： 1、序列辨識編號：2、序列辨識編號：3、序列辨識 編號：4、序列辨識編號：5、序列辨識編號：6、和 序列辨識編號：7所構成群組之胺基酸序列。 7. —種如申請專利範圍第1項至第6項中任一項 之經分離蛋白的片段、變異型或衍化物。 66 200930401 8. 如申請專利範圍第7項所述之片段，其具有免 疫原性及包含選自由序列辨識編號：丨、序列辨識編 號.2、序列辨識編號：3、序列辨識編號：4、序列 辨識編號：5、序列辨識編號：6和序列辨識編號：7 所構成群組之胺基酸序列的2〇至2〇〇個連續胺基酸。 Ο 9. 如申請專利範圍第7項所述之變異型，其包含 與選自由序列辨識編號：丨、序列辨識編號：21'序列 辨識編號：3、序列辨識編號：4、序列辨識編號：5、 序列辨識編號：6和序列辨識編號：7所構成群組之胺 基酸序列具有至少75%相同的胺基酸序列。 10. 種抗體或抗體片段，係結合如申請專利範 圍第1項至第6項中任一項之經分離蛋白，或如申請專 利範圍第7項至第9項中任一項之片段、變異型或衍化 物。 11. 種纪刀離核酸，係編碼如申請專利範圍第1 ❹ 項中任項之經分離蛋白，或如申請專利範圍第7 至9項中任一項之片段、變異型或衍化物。 ,I2.如申請專利範圍第Π項所述之經分離核酸， 係包含選自由序列辨識編號：8、序列辨識編號：9、 序列辨識編號：1 〇、序列辨識編號：丨丨和 號：39所構成群組的核努酸序列。 则編 •—種基因構築質體，係包含如申請專利範圍 第項或第12項之經分離核酸。 14.如申請專利範圍第13項所述之基因構築質 67 200930401 體，其適合用於細菌表達魚型鍵球菌的重組Μ蛋白。 15.如申請專利範圍第13項所述之基因構築質 體，其適合用於魚類的DNA接種疫苗。 1 6. —種宿主細胞’係包含如申請專利範圍第 13-15項中任一項之基因構築質體。 17. 如申β青專利範圍第16項所述之宿主細胞其 係一種細菌細胞。 18. 如申請專利範圍第16項所述之宿主細胞其 © 係一種魚細胞。 1 9. 一種組成物，係包含：如申請專利範圍第i 項至第6項中任一項之至少一種經分離蛋白；如申請 專利範圍第7項至第9項中任一項之片段、變異型或衍 化如申請專利範圍第1〇項之抗體或抗體片段；如 ^明專利乾圍第丨丨項或第丨2項之經分離核酸；或如申 明專利範圍第13項之基因構築質體；以及一種可接受 Q 載劑、稀釋劑或賦形劑。 20.如申請專利範圍第19項所述之組成物其為 :誘發動物對抗魚型鏈球菌之保護性免疫反應的疫 苗型。 # ^ j1.如申請專利範圍第20項所述之組成物，其中 該動物係魚類。 &办如申請專利範圍第20項所述之組成物，其中 該動物係人類。 23. — μ ^ 理b療動物之魚型鏈球菌感染的方法，該 68 200930401 方法的步驟句扭脸 成物投予請專利範圍第19項所述之組 二亥動物因而治療該魚型鏈球菌的感染。 動物係魚類專利範圍第23項所述之方法，其中該 動物:二申睛專利範圍第24項所述之方法，其中該 ❹ ❹ 法，詨：：種令動物對魚型鏈球菌感染免疫的方 之组：物、的步驟包括將如申請專利範圍第20項所述 感染^予至該動物，以令該動物對魚型鏈球菌的 動物二:申請專利範圍第%項所述之方法’其中該 从28.如申請專利範圍第26項所述之方法，其中該 動物係人類。 29. —種下列物的用途，該用途係用於治療動物 之魚型鏈球菌感染，而物係：如申請專利範圍第工至6 項中任項之至少一種經分離蛋白；或如申請專利範 圍第7項至第9項中任—項之片段變異型或衍化物； 或如申請專利範圍第1〇項之抗體或抗體片段；或如申 請專㈣圍第11項或第12項之經分離核酸；或如申請 專利範圍第13項之基因構築質體。 30·如申請專利範圍第29項所述之用途其中該 動物係魚類。 31·如申請專利範圍第29項所述之用途，其中該 69 200930401 動物係人類。 32· 一種測定動物是否已哎涵 球菌或其成分的方法，該方法的步;，、;== = 該動物的生物樣本是否包含如申二包括測疋獲仔自 第6頊Φ权 s ^ τ°月專利範圍第1項至 弗D項中任一項之經分離蛋白 頊至篦^如申睛專利範圍第7 項至弟9項中任一項之片段 '變 若在名跫異型或衍化物，其中 右存在時表不該動物已或曾經 其成分。 1暴露於魚型鏈球菌或

   Ο 33· —種測定動物是否已 你结々* a 4 θ經暴露於魚型鏈 球i或其成分的方法，該方法 β & π λλ , 扪步驟包括測定獲得自 該動物的生物樣本是否包含如 10 s s如申睛專利範圍第11或 12項之經分離核酸，其中若存 ,一 θ办 、丁石仔在時表示該動物已或曾 經暴露於魚型鏈球菌或其成分。 34. —種測定動物是否ρ + ^ ^ 疋货巳或曾經暴露於魚型鏈 球函或其成分的方法，該方、本_ 长4万去的步驟包括測定獲得自 該動物的生物樣本是否句合‘由 +疋货巴3如申請專利範圍第1 0項 之抗體或抗體片段，盆中芒左*Ddt ± ，、甲右存在時表示該動物已或曾 經暴露於魚型鏈球菌或其成分。 35. 如申請專利範圍第32項至第34項中任一項 之方法’其中該動物係魚類。 36. 如申請專利範圍第32項至第34項中任一項 之方法，其中該動物係人類。 37. —種用於偵测魚型鏈球菌、其分子成分及/ 或其抗體的診斷套組或組成物，該套組或組成物包含 200930401 一或多種偵測劑，其中偵測劑係獲得自動物生物樣本 中含有選自：由如申請專利範圍第丨項至第6項中任— 項之經分離蛋白；如申請專利範圍第7項至第9項中任 一項之片段、變異型或衍化物；如申請專利範圍第1〇 項之抗體或抗體片段；如申請專利範圍第u項或第12 項之經分離核酸所構成群組者。 、 • 38*如申請專利範圍第37項之診斷套組或組成 物，其進一步包含一或多種偵測試劑。 ❹

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